WO2020145426A1 - 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법 및 이로부터 제조된 약독화 생균 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법 및 이로부터 제조된 약독화 생균 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 병원성 미생물에 회 당 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하는 단계를 포함하는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법; 및 방사선 조사에 의해 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 결실 중 적어도 하나의 돌연변이가 발생하여 야생형으로 복귀(revertant)되지 않도록 약독화된 병원성 미생물을 포함하는 약독화 생균 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법 및 이로부터 제조된 약독화 생균 백신 조성물
본 발명은 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법 및 이로부터 제조된 약독화 생균 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 방사선을 이용하여 비-침입성(non-invasive)의 약독화 생균 백신을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 백신 조성물에 관한 것이다.
온혈 동물이 미생물의 병인 유발을 극복하는 방법은 복잡한 공정이다. 미생물에 의한 병인 유발에 대한 면역은 미리 온혈 동물이 병원성 상태를 약하게 발현하도록 하여 획득될 수 있다.
일반적으로, 살아있지만 약독화된 미생물을 주성분으로 하는 백신은 약독화 백신 또는 생균 백신 등으로 지칭되며, 이들은 사균 백신에 비해 매우 효과적인 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 백신은 동물 숙주가 백신 예방 접종을 받은 후 숙주 내로 미생물 병원균이 도입되면, 조기 면역, 세포 매개 면역 또는 체액 면역의 회복을 가속화시켜 임상적으로 유의적인 감염률을 나타내기 전에 유기체의 추가 증식을 제어할 수 있도록 한다. 사멸 병원균을 주성분으로 하는 백신, 즉 사균 백신은 이와 같은 유형의 반응을 유도할 수 없는 것으로 알려져 있다.
그러나, 약독화된 생병원균을 포함하는 백신은 약독화 정도에 따라 예방접종 시 예방 접종된 숙주가 예방하고자 하는 질병에 걸릴 수 있는 위험성을 배제할 수 없는 문제가 있다. 따라서, 면역화 속성은 있지만 예방접종 시 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 없는 백신이 요구되며, 약독화 생백신 균주는 실질적으로 독성의 야생형 균주로 복귀될 가능성이 없어야 한다.
종래의 약독화 생균 백신(live attenuated vaccine) 제조 기술은 자연돌연변이 방식에 의해 병원성 미생물의 독성을 약화시키거나 없애기 위하여 배지에 장기간 계대 배양하는 방법, 인공돌연변이 방식으로 유전자 변이율(mutation rate)을 증가시키기 위하여 돌연변이원(mutagen)으로 독성화학물질 혹은 자외선(UV)을 활용하는 방식 등이 있었으나, 전자의 경우 자발적 유전자 변이(spontaneous DNA mutation) 발생에 의한 것으로 백신 균주 확보에 5년 내지 10년의 장기간이 소요되고, 후자의 경우 자연돌연변이 방식에 비하여 개발기간이 2년 내지 3년 정도로 단축되긴 하나 종래 약독화 생균 백신 제조 기술은 대부분 염기 치환(base substitution)으로 인한 점돌연변이(point mutation)만을 유도하기 때문에 변이된 염기가 원형으로 돌아오면(back mutation) 병원성이 회복되어 약독화 백신이 병원성을 가진 균주(revertant)로 변화되는 문제가 발생하는 문제가 있었으며, 이와 관련하여 1998년 보급된 브루셀라 백신 균주가 고병원체로 복귀하여 2만 두 소가 폐사한 사건을 예로 들 수 있다.
방사선 조사를 이용한 백신의 제조는 US2016-0089430 A1에 명시된 바와 같이 미생물을 불활성화시킨 사균 백신의 제조에 적용되고 있으나, 이를 이용하여 약독화 생균 백신을 제조한 기술은 알려진 바 없으며, 방사선을 이용하여 독성이 감소된 병원성 미생물 돌연변이체(attenuated strain)를 단시간 내에 대량으로 확보할 수 있다면, 약독화 백신 개발 기간의 단축에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 독성이 감소된 병원성 미생물 돌연변이체(attenuated strain)를 단시간 내에 대량으로 확보할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 야생형 균주로 복귀될 가능성이 없는, 독성이 감소된 병원성 미생물 돌연변이체(attenuated strain)를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 병원성 미생물에 회 당 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하는 단계를 포함하는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 방사선 조사에 의해 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 결실 중 적어도 하나의 돌연변이가 발생하여 야생형으로 복귀(revertant)되지 않도록 약독화된 병원성 미생물을 포함하는 약독화 생균 백신 조성물이 제공된다.
본 발명에 의하면 방사선 반복 조사를 통하여 기존의 돌연변이 유도 방식에서는 발생되지 않는 염기 삽입(nucleotide insertion) 및 결실(nucleotide deletion)을 유도하여 복귀(revertant) 발생의 문제를 해결할 수 있는 안전한 약독화 생균 백신을 단시간 내에 대량으로 확보할 수 있어 약독화 백신 개발 기간을 단축할 수 있다.
도 1은 방사선 조사 횟수에 따른 동물 세포로의 칩입능 및 증식 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2(a)는 방사선 조사 선량에 따른 대식세포 감염 비율을 나타낸 것이고, 도 2(b)는 방사선 조사 선량에 따른 살모넬라의 사균 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 제조예 1에서 획득된 10개의 콜로니를 LB 배지에 배양하여 침입능 및 증식 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제조예 1에서 획득된 10개의 콜로니에서 획득된 균주를 마우스에 감염시켜 마우스의 생존 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 제조예 1에서 획득된 10개의 콜로니에서 획득된 균주의 장내 정착 능력을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 백신 투여 여부에 따른 혈청 내 IgM 및 IgG의 형성율을 나타낸 것이다.
도 7은 백신 투여 여부에 따른 변 내 IgA의 형성율을 나타낸 것이다.
도 8은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)의 공격감염 실험을 통한 마우스 생존율 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)의 공격감염 실험을 통한 마우스 생존율 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 의 공격감염 실험을 통한 마우스 생존율 비교 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 방사선을 이용하여 비-침입성(non-invasive)의 약독화 생균 백신을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 백신 조성물이 제공된다.
보다 상세하게, 본 발명의 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법은 병원성 미생물에 회 당 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하는 단계를 포함하는 것이며, 바람직하게는 0.5 kGy 이상 2 kGy 미만 선량, 예를 들어 1 kGy 내지 1.5 kGy 선량, 더욱 바람직하게는 약 1 kGy 선량으로 방사선을 조사한다.
상기 회 당 방사선 선량이 0.5kGy 미만인 경우에는 충분한 돌연변이가 형성이 되지 않아 약독화가 획득되지 않고, 반면 회 당 방사선 선량이 2kGy를 초과하는 경우에는 병원성 미생물의 사균이 되어 약독화 생균 백신이 획득되지 않는 문제가 있다.
본 발명의 상기 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법은 병원성 미생물에 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 조사하는 단계; 및 방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 상기 방사선을 조사하는 단계 및 병원성 미생물을 배양하는 단계가 총 6회 내지 15회 반복되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 방사선은 총 6회 내지 15회 반복될 수 있고, 총 10회 내지 12회 반복 조사되는 것이 바람직하다. 상기 방사선의 반복 조사 횟수가 6회 미만인 경우에는 도 1(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 병원균의 세포 침입능이 충분히 낮아지지 않아 안정성 확보가 불충분해지는 문제가 있고, 상기 방사선의 반복 조사 횟수가 15회 초과인 경우에는 돌연변이에 의한 성장억제 효과가 나타나서 백신 균주로 사용을 할 수 없다.
본 발명이 적용될 수 있는 상기 병원성 미생물은 에쉐리히아(Escherichia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 비브리오(Vibrio)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 마이코박테리아(Mycobacteria)속, 스타필로코커스(Staphylococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어 본 발명이 적용될 수 있는 병원성 미생물은 특히 진핵세포에 침입하여 증식하는 것이 바람직하다. 그 예로는 살모넬라 (Salmonella)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 비브리오(Vibrio)속, 마이코박테리아(Mycobacteria)속, 해모필러스(Haemophilus)속 및 에세리히아(Escherichia) 속 등을 포함한다.
구체적으로는 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S.typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 살모넬라 콜레라에수이스(S. choleraesuis), 보르데텔라 퍼튜시스(Bordetella, pertussis), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae) 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등일 수 있다.
바람직하게는 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나륨 (Salmonella gallinarum), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 일 수 있으며, 예를 들어 상기 병원성 미생물은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569 (KCTC 13193BP)일 수 있다.
상기 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569 균주는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 2017년 2월 10일자로 기탁번호 KCTC 13193BP로 기탁되었다.
방사선을 조사하는 단계와 방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계를 번갈아 반복 수행하는 과정에 있어서 상기 방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계는 6 시간 내지 48 시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 12 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것으로, 상기 배양이 6 시간 미만으로 수행되는 경우에는 방사선에 의한 세포 DNA 변화 회복이 완벽하게 되지 않아, 성장에 문제가 있고, 48 시간을 초과하여 수행되는 경우에는 자가사멸의 문제가 있다.
이때 배양은 각각의 병원성 미생물의 배양에 적합한 조건에서 수행될 수 있는 것으로 특히 제한되는 것은 아니며, 병원성 미생물의 영양 성분 등을 포함하여 적합한 것으로 알려진 배지를 사용하여 포함하여 적합한 것으로 알려진 조건에서 수행할 수 있다.
예를 들어 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium)를 배양하기 위해 사용되는 영양 배지는 저염 LB(Bacto-trypton 10 g/L, Bacto-yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)으로 37, 180 rpm의 조건으로 배양할 수 있다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 방사선 조사에 의해 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 결실 중 적어도 하나의 돌연변이가 발생하여 야생형으로 복귀(revertant)되지 않도록 약독화된 병원성 미생물을 포함하는 약독화 생균 백신 조성물이 제공되며, 이때 적용될 수 있는 방사선 조사 방식은 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법과 관련하여 상술한 바와 같다.
즉, 상기 방사선 조사는 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하여 수행될 수 있고, 예를 들어 상기와 같은 방사선을 조사하는 단계와 방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계를 번갈아서 총 6회 내지 15회 반복되는 것일 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 상기 병원성 미생물은 에쉐리히아(Escherichia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 비브리오(Vibrio)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 보르데텔라(Bordetella), 마이코박테리아(Mycobacteria)속, 스타필로코커스(Staphylococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어 본 발명이 적용될 수 있는 병원성 미생물은 특히 진핵세포에 침입하여 증식하는 것이 바람직하다. 그 예로는 살모넬라 (Salmonella)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 비브리오(Vibrio)속, 해모필러스(Haemophilus)속 및 에세리히아(Escherichia) 속 등이 해당된다.
구체적으로는 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S.typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 살모넬라 콜레라에수이스(S. Choleraesuis), 보르데텔라 퍼튜시스(Bordetella, pertussis), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 네이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae), 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등일 수 있다.
바람직하게는 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나륨 (Salmonella gallinarum), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으며, 예를 들어 상기 병원성 미생물은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569 (KCTC 13193BP)일 수 있다.
상기 본 발명의 약독화 생균 백신 조성물은 상기 병원성 미생물에 의해 발생하는 어떠한 질병의 예방을 위해서도 사용될 수 있으며, 예를 들어 상기 약독화 생균 백신 조성물은 장티푸스, 살모넬라증, 식중독, 백일해, 뇌막염, 임질 등의 질병 예방용일 수 있으며, 장티푸스와 같은 증세를 나타내는 패혈증형과 식중독인 급성위장염형 살모넬라증을 포함하는 살모넬라증 질병 예방용일 수 있다.
또는, 상기 약독화 생균 백신 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 질병의 예방용일 수 있으며, 보다 상세하게, 뇌막염, 패혈증, 농흉 및 복막염과 같은 그 외의 많은 장액성, 급성 화농성 질환 등의 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 유래 질병 예방용이거나, 또는 포도구균성열상피부증후군, 포도구균 식중독, 독성쇼크증후군외 다양한 감염증, 예를 들어 피부감염증, 심내막염, 폐렴, 농흉, 골수염, 감염관절염, 척추골수염 등의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 질병 예방용일 수 있다.
숙주(특히 사람 숙주)는 본 발명에 따른 백신을 유효량으로 투여하면 미생물에 의해 유발되는 감염에 대해 예방적으로 치료될 수 있다. 이와 같은 치료 방법에 사용되는 백신의 용량은 숙주의 키와 체중, 제조된 백신의 형태를 포함한 다양한 임상적 요인들에 따라 좌우된다. 예컨대, 약독화된 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569(KCTC13193BP)의 경우 체중 70kg인 성인 숙주에 대해 일반적으로 투여량당 109 내지 1011의 유기체를 함유하는 용량을 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 상기와 같은 제조방법에 의해 제조된 약독화 생균을 포함하는 관련 질병 치료 또는 예방용 약학 조성물이 제공될 수 있다.
상기 본 발명의 백신 조성물 및 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물은 본 발명에 의해 획득된 약독화 생균 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이때 상기 본 발명의 약독화 생균은 유효 농도로 포함된다.
본 명세서에 '유효 농도' 또는 '유효 성분으로 함유'라는 용어는 예를 들어 약독화 생균을 통하여 원하는 효과, 예를 들면 이들 약독화 생균이 주입되지 않은 상태와 비교해서 이들을 숙주 세포의 내부로 주입(transfection)시킨 경우에는 원하는 면역 반응을 유도할 수 있을 정도의 항체를 생성시키기에 충분한 양이라는 의미이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 유효 농도는 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에서 '약제학적으로 허용 가능한 담체라는 용어는 당업계에서 알려진 다양한 담체를 의미한다. 통상적으로 사용되는 약제학적 담체를 채택하는 운반 시스템이 사용될 수 있다. 유입되는 약품 운반 시스템으로는 용액, 서스펜션, 겔, 마이크로스피어, 고분자 물질로서, 용해도-변성 물질(에탄올, 프로필렌글리콜, 수크로오스), 폴리머(폴리카프릴락톤, PLGA) 등을 포함한다.
본 발명에 따라 약제학적 조성물에 함유되는 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 사용되는 물질을 사용할 수 있다.
예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 아르기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 부형제는 기술분야에 알려져 있으며 약학적 활성 물질의 투여를 용이하게 해주는 비교적 불활성인 물질이다. 예컨대, 부형제는 형상이나 점도를 부여할 수 있고 또는 희석제 역할도 할 수 있다. 적절한 부형제로는 안정화제, 보습제, 및 유화제, 오스몰 농도를 변화시킬 수 있는 염류, 캡슐화제제, 완충액, 피부침투 촉진제를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액(suspension) 또는 유화액(emulsion) 형태는 물론이고, 엑스제, 분말제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
만약, 본 발명의 약제학적 조성물은 종래 알려진 제제 방법으로 제제화한 약품의 형태로 직접 투여할 수 있다. 이때, 약제학적 조성물에는 살균수, 생리식염수, 인산완충액 및 배양액과 같은 담체 등을 적절하게 추가로 포함할 수 있다. 그 외 필요에 따라 완충액, 현탁액, 저장액, 계면 활성제 등을 포함할 수 있다.
이때, 약제학적 조성물로 투여하는 경우 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 반응성 등과 같은 요인들에 의해 조정될 수 있으며 단일 투여 방법에 의하거나 여러 번 투여될 수 있다.
다만, 본 발명의 상기 백신 조성물은 비강 투여용 조성물, 근육 주사용 조성물 또는 경우 투여용 조성물일 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 방사선에 의한 약독화 생균 백신은 환자에게 경구 투여하기 위해서 동결 건조된 형태, 예를 들면 캡슐 형태로 제공될 수 있다. 이와 같은 캡슐은 예를 들면 유드라게이트(Eudragate) S, 유드라게이트 L 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프탈레이트 또는 히드록시 프로필메틸 셀룰로오스를 함유하는 장용 코팅으로 제공할 수도 있다. 이러한 캡슐을 그대로 사용하거나 또는 대안적으로 동결건조된 물질을 투여하기 전에, 예를 들면 현탁액과 같은 것으로 복원시켜 사용할 수도 있다. 복원은 적절한 pH를 갖는 완충액으로 실시하여 유지체의 생육성을 안전하게 보장하는 것이 바람직하다. 위장의 산도로부터 약독화된 박테리아 및 백신을 보호하기 위하여 백신을 각각 투여하기 전에 중탄산나트륨 제제를 투여하는 것이 좋다. 대안적으로, 백신은 비경구 투여, 비강내 투여 또는 유선내 투여용으로 제조할 수도 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각각의 약독화 생균이 야기하는 임의의 질병을 방지, 치료하기 위해서 사용될 수 있으며 바람직하게는 백신으로 사용될 수 있으며, 이와 같은 약제학적 조성물은 인간은 물론이고 마우스, 랫트, 토끼, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말 등을 포함하는 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물에는 항염증 물질, 진통제 등과 같은 다른 치료제를 함유할 수 있다.
생균 백신의 형태로 사용하기 위한 약독화된 병원성 미생물은 독성 상태로 복귀되지 않는 것이 가장 중요하며, 본 발명에 의해 제공되는 약독화 생균 백신에서 획득된 비복귀성 돌연변이는 결실 및 삽입 돌연변이를 포함하는 것으로, 1 단계로 수복될 수 없는 것이다.
이는 안정성과 직결과는 것으로, 본 발명의 약독화 생균은 실험예 3의 마우스 생존 실험에서 확인한 바와 같이 일반적인 생존 실험이 102 CFU 내지 103 CFU의 병원균을 투여하여 수행되는 점에 비하여 상기 실험에서는 약 1000배 이상의 병원균을 투여하여 2주 이상의 생존을 확인함으로써 안정성을 더욱 확실하게 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 의하면 방사선 반복 조사를 통하여 기존의 돌연변이 유도 방식에서는 발생되지 않는 염기 삽입(nucleotide insertion) 및 결실(nucleotide deletion)을 유도하여 복귀(revertant) 발생의 문제를 해결할 수 있는 안전한 약독화 생균 백신을 단시간 내에 대량으로 확보할 수 있어 약독화 백신 개발 기간을 단축할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험예 1: 방사선 조사 횟수에 따른 동물 세포로의 칩입능 및 증식 정도 확인
병원성 미생물인 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) LT2 균주(ATCC 700720D-5)를 12 시간 배양 후 감마선을 1 kGy/30 min 선량으로 조사한 후 24 시간 재배양하였고, 이와 같은 감마선 조사와 재배양 과정을 추가로 반복하면서 방사선에 1회 노출된 살모넬라 배양액부터 10회 노출된 배양액에 대한 동물 세포로의 침입능(invasion) 및 증식 정도 (intracellular replication )를 확인하였다.
이때, 침입능은 마우스 대식세포에 야생형 살모넬라 LT2 혹은 방사선을 반복 조사후 분리한 약독화 예상 균주를 103 CFU의 동일한 양으로 감염시킨 뒤 2시간 동안 37도에서 배양 후 인산화완충액으로 대식세포에 부착하지 않은 살모넬라를 제거 후 대식세포를 용해(lysis)시켜 감염된 살모넬라의 수를 LB 아가(agar) 배지에서 측정하였고, 그 결과를 도 1(a)에 나타내었다.
한편, 증식 정도는 마우스 대식세포에 야생형 살모넬라 LT2 혹은 방사선을 반복 조사 후 분리한 약독화 예상 균주를 103 CFU의 동일한 양으로 감염시킨 뒤 2시간동안 37℃에서 배양 후 10ug의 겐타마이신(Gentamycin)을 1시간 동안 처리하여 대식세포 외부의 살모넬라를 모두 제거한 후 추가적으로 37℃에서 15시간 배양한다. 대식세포는 용해(lysis)시켜 증식된 살모넬라의 수를 LB 아가(agar) 배지에서 측정하였고, 그 결과를 도 1(b)에 나타내었다.
도 1(a) 및 도 1(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 감마선 조사 횟수가 증가함에 따라 살모넬라 병원성의 지표가 되는 두 가지 능력인 침입능 및 증식 비례하여 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 특히, 총 6회 반복 조사 후부터 돌연변이체의 침입능이 야생형 균주에 비하여 5% 이하로 비약적으로 감소되고 10회 반복 조사 시 약 100배 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 방사선 조사 선량에 따른 영향 확인
(1) 방사선 조사 선량에 따른 대식세포 감염 비율
병원성 미생물인 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) LT2 균주(ATCC 700720D-5)를 12 시간 배양 후 감마선을 각각 0.25 kGy/30 min, 0.5 kGy/30 min 및 1 kGy/30 min 선량으로 조사한 후 24 시간 재배양하였고, 이와 같은 감마선 조사와 재배양 과정을 추가로 반복하면서 방사선에 10회 노출된 경우 대식세포 감염비율을 방사선을 조사하지 않은 동일 균주와 비교하여 확인하였다.
그 결과, 도 2(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 회 당 선량을 0.5 kGy 으로 10회 조사 후 대식세포 감염 비율을 측정하였을 경우에는 대식세포 감염율이 약 30% 정도만 감소하였으나, 1.0kGy로 10회 조사하였을 경우는 99.2% 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 방사선 조사 선량에 따른 살모넬라의 사균 정도
병원성 미생물인 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) LT2 균주(ATCC 700720D-5)를 12 시간 배양 후 감마선을 각각 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0 kGy/30 min 선량으로 조사한 후 24 시간 재배양하였고, 이와 같은 감마선 조사와 재배양 과정을 추가로 반복하면서 방사선에 10회 노출된 경우 살모넬라의 사균정도를 방사선을 조사하지 않은 동일 균주와 비교하여 확인하였다.
그 결과 도 2(b)에 나타난 바와 같이 1 kGy/30 min으로 조사하였을 경우 10^8 CFU의 살모넬라가 10^6 CFU로 감소하였으나, 2.0kGy을 조사하였을 경우 500CFU로 대부분의 살모넬라가 사멸되었음을 확인할 수 있었다.
(3) 방사선 조사 선량에 따른 스트렙토코커스의 돌연변이 정도
스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia, TIGR4)에 다양한 선량의 방사선을 조사하여 돌연변이 정도를 확인하였다. 이를 위해 스트렙토코커스 뉴모니아 (10^8 CFU)에 감마선을 0.25 내지 5.0 kGy을 조사한 후 앰피실린(Ampicillin) 항생제가 들어있는 배지에서 생존하는 돌연변이 균주의 수를 측정하였다.
그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 1.0 kGy 에서 돌연변이가 가장 많이 나타난 것을 확인할 수 있었다.
선량 0 kGy 0.25 kGy 0.5 kGy 1.0 kGy 1.5 kGy 2.0 kGy 3.0 kGy 4.0 kGy 5.0 kGy
돌연변이 수 (CFU) 0 0 1200 3800 800 32 5 0 0
(4) 방사선 조사 선량에 따른 스타필로코커스의 돌연변이 정도
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, USA300)에 다양한 선량의 방사선을 조사하여 돌연변이 정도를 확인하였다. 이를 위해 스타필로코커스 아우레우스(10^8 CFU)에 감마선을 0.25 내지 5.0 kGy을 조사한 후 앰피실린(Ampicillin) 항생제가 들어있는 배지에서 생존하는 돌연변이 균주의 수를 측정하였다.
그 결과 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 1.5 kGy 에서 돌연변이가 가장 많이 나타난 것을 확인할 수 있었다.
선량 0 kGy 0.25 kGy 0.5 kGy 1.0 kGy 1.5 kGy 2.0 kGy 3.0 kGy 4.0 kGy 5.0 kGy
돌연변이 수 (CFU) 0 3 38 2800 8300 230 3 0 0
제조예 1: 약독화 백신의 제조- 살모넬라 티피무륨
병원성 미생물인 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) LT2 균주(ATCC 700720D-5)를 37℃에서 12 시간 배양 후 감마선을 1 kGy/30 min 선량으로 조사한 후 24 시간 재배양하였고, 이와 같은 감마선 조사와 재배양 과정을 추가로 10회, 즉 총 11회가 되도록 반복하였다.
이렇게 획득된 배양액 플레이트(LT2IR11)에서 10개의 콜로니를 선발하였으며, 이를 각각 LT2IR11-1 내지 LT2IR11-10으로 명명하였다.
제조예 2: 약독화 백신의 제조- 살모넬라 갈리나륨
병원성 미생물인 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum) 균주를 30℃에서 12 시간 배양 후 감마선을 0.8 kGy/30 min 선량으로 조사한 후 12 시간 30℃에서 재배양하였고, 이와 같은 감마선 조사와 재배양 과정을 추가로 10회, 즉 총 11회가 되도록 반복하였다.
이렇게 획득된 배양액 플레이트(SGIR11)에서 30개의 콜로니를 선발하였으며, 이를 각각 SGIR11-1 내지 SGIR11-30으로 명명하였다.
제조예 3: 약독화 백신의 제조- 스트렙토코커스 뉴모니아
스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)에 1.0 kGy을 10 회 반복 조사 후 3개의 균주 선별하여 108CFU 를 마우스 5마리의 비강으로 투여하여 14일간 마우스 5마리의 평균 생존률을 측정하였다.
그 결과 하기 표 3에 나타난 바와 같이 3개 균주에서 모두 야생형에 비하여 마우스 생존률이 현저하게 길어지는 것을 확인할 수 있었고, 특히 3번의 경우 14일 후에도 모든 마우스가 생존하는 것으로 나타났다.
시간(day) 0 2 4 6 8 10 12 14
야생형 (WT) 5 5 3 1 0 0 0 0
1번 5 5 5 5 4 3 0 0
2번 5 5 5 3 3 1 0 0
3번 5 5 5 5 5 5 5 5
도 9는 상기 균주 3번을 마우스 5마리의 비강을 통하여 108CFU로 2주 간격으로 2회 투여 후 야생형 폐렴구균(107CFU) 을 복강으로 투여시 보호 면역을 확인한 결과로써, 백신을 투여하지 않은 그룹(WT)은 30시간 내에 모든 마우스가 사망하였으나, 백신을 투여한 그룹(IR)의 경우 생존 시간이 12시간 이상 증가하는 것을 확인할 수 있어, 통계적으로 유의미함을 알 수 있었다.
제조예 4: 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus )
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 1.5 kGy을 10 회 반복 조사 후 4개의 균주 선별하여 108CFU 를 마우스 5마리의 비강으로 투여하여 14일간 마우스 5마리의 평균 생존률을 측정하였다. 그 결과 4개 균주에서 모두 야생형에 비하여 마우스 생존률이 현저하게 길어지는 것을 확인할 수 있었다.
도 10은 상기 균주 중 10일 후에도 모든 마우스가 생존한 결과를 도출한 균주를 마우스 5마리의 비강을 통하여 108CFU을 2주 간격으로 2회 투여 후 야생형 폐렴구균(107CFU)을 복강으로 투여 시 보호면역 확인한 결과로써, 백신을 투여하지 않은 그룹(WT)은 18시간 내에 모든 마우스가 사망하였으나, 백신을 투여한 그룹(IR)의 경우 생존 시간이 18시간 이상 증가하였고, 한 마리는 42시간 이후에도 생존한 것을 확인할 수 있어, 통계적으로 유의미함을 알 수 있었다.
실험예 3: 백신 효능 분석
(1) 침입능 및 증식 정도 확인
제조예 1에서 획득된 10개의 콜로니를 LB 배지에 배양하여 실험예 1과 동일한 방식으로 침입능 및 증식 정도(IC survival, replication)를 확인하였으며, 그 결과 도 3(a) 및 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 10개 콜로니에서 획득된 균주 모두 야생형 균주(wt) 대비 침입능이 감소되었고, 증식 정도 역시 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
무작위적으로 선발한 10개 콜로니의 균주 모두 병원성이 감소하는 것으로 보아 병원성 미생물에 방사선을 반복 조사하였을 경우 생균 백신으로 활용이 가능한 약독화 변이 균주가 제조될 수 있음을 확인할 수 있었다.
(2) 마우스 생존 실험
제조예 1에서 획득된 10개의 콜로니에서 획득된 균주 106 CFU를 각각 마우스에 감염시켜 마우스의 생존 정도를 확인하였으며, 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 야생형 균주(WT)의 경우 마우스가 48시간(2일) 내에 사망하였으나 LT2IR11 균주로 감염된 모든 마우스의 경우 WT 경우보다 생존시간이 긴 것을 확인할 수 있었다.
특히 5번(LT2IR11-5)과 8(LT2IR11-8)번으로 감염된 마우스의 경우 7일 이상(174 시간) 생존하는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 일반적인 생존 실험은 102CFU 내지 103CFU의 병원균을 투여하여 수행되나, 본 실험에서는 약 1000배 이상의 병원균을 투여하여 2주 이상의 생존을 확인함으로써 안정성을 더욱 확실하게 확인할 수 있었다.
나아가, 이들 균주를 각각 마우스에 경구 투여하여 균주가 장내에 정착(colonization)되는 정도를 측정한 결과 도 5에 나타난 바와 같이 8(LT2IR11-8)번 균주의 장내 정착 능력은 야생형 균주에 비하여 약 1,000배 이상 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 LT2IR11-8에서 획득된 균주는 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569으로, KCTC에 2017년 2월2일에 기탁번호 KCTC13193BP로 기탁하였다.
(3) 항체 형성율 확인
LT2IR11-8에서 획득된 균주를 구강을 통하여 2주 간격으로 마우스에 2회 백신 투여 후 혈청과 변(Feces)에서 항체형성을 확인하였다.
그 결과 도 6 (a) 및 도 6 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 헐청 내 IgM 및 IgG의 형성이 백신을 투여하지 않고 PBS를 투여한 마우스에 비하여 유의미하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 변 (Feces)에서 IgA 형성율 역시 도 7에 나타난 바와 같이 백신을 투여하지 않고 PBS를 투여한 마우스에 비하여 유의미하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 공격 감염 실험을 통한 마우스 생존율 확인
LT2IR11-8에서 획득된 균주를 구강을 통하여 2주 간격으로 마우스에 2회 백신 투여 후 야생형 살모넬라(S.typhimurium) UK1(ATCC68169) 108 CFU을 구강을 통하여 공격 감염 후 마우스 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 백신을 투여하지 않은 마우스는 10일 이내에 모두 사망하였으나, 백신 투여한 마우스는 3주 후에도 모든 마우스가 생존함을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 게놈의 염기 서열 분석
실시예 3에 의해 백신으로서의 효능이 입증 된 LT2IR11-8에서 획득된 본 발명의 약독화 생균 백신 균주의 유전자 염기 서열 분석을 분석하였다.
이때 서열 분석은 마크로젠 회사의 MiSeq 기기를 사용하여 수행하였다.
그 결과 아래 표 4에 나타난 바와 같이 기존의 화학적 혹은 UV를 이용하여 돌연변이를 유도하였을 경우와는 다르게 게놈 상에서 복구가 어려운 염기 결실(DNA deletion) 및 염기 삽입 (DNA insertion)이 발생한 것을 확인할 수 있었다.
변이(Variant) 형태 변이 수 변이 길이(bp)
삽입(Insertion) 30 +37bp
결실(Deletion) 10 -88bp
단일 염기 다 형성(SNP) 65 (39)
총 105
보다 상세하게, 삽입은 30 군데에서 발생하여 총 37 bp의 뉴클레오티드가 게놈상으로 삽입되었고, 결실은 10 군데에서 발생하여 총 88 bp의 뉴클레오티드가 게놈에서 사라진 것을 확인하였다.
이와 같은 삽입 및 결실 변이는 야생형(wild type) 형태로 복원이 불가능한 변이이므로, 본 발명에 의하면 종래 방식으로 제조된 약독화 생균 백신에서 발생할 수 있는 병원성 회복된 백신 균주(revertant)의 발생 문제 해결할 수 있을 것으로 기대된다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Figure PCTKR2019000298-appb-I000001

Claims (14)

  1. 병원성 미생물에 회 당 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하는 단계를 포함하는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법은
    병원성 미생물에 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 조사하는 단계; 및
    방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 방사선을 조사하는 단계 및 병원성 미생물을 배양하는 단계가 총 6회 내지 15회 반복되는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방사선은 총 10회 내지 12회 반복 조사되는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 에쉐리히아(Escherichia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 비브리오(Vibrio)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 마이코박테리아(Mycobacteria)속 및 스타필로코커스(Staphylococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나륨 (Salmonella gallinarum), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방사선이 조사된 병원성 미생물을 배양하는 단계는 6 시간 내지 48 시간 동안 수행되는, 방사선에 의한 약독화 생균 백신의 제조 방법.
  7. 방사선 조사에 의해 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 결실 중 적어도 하나의 돌연변이가 발생하여 야생형으로 복귀(revertant)되지 않도록 약독화된 병원성 미생물을 포함하는, 약독화 생균 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방사선 조사는 0.5 내지 2kGy 선량의 방사선을 6회 내지 15회 반복 조사하여 수행된, 약독화 생균 백신 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 에쉐리히아(Escherichia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 비브리오(Vibrio)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 보르데텔라(Bordetella)속, 마이코박테리아(Mycobacteria)속 및 스타필로코커스(Staphylococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약독화 생균 백신 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나륨 (Salmonella gallinarum), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)인, 약독화 생균 백신 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium) KST0569 (KCTC13193BP)인, 약독화 생균 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약독화 생균 백신 조성물은 살모넬라증 예방용인, 약독화 생균 백신 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 약독화 생균 백신 조성물은 장티푸스, 살모넬라증, 식중독, 백일해, 뇌막염 및 임질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 질병 예방용인, 약독화 생균 백신 조성물.
  14. 제7항에 있어서, 상기 약독화 생균 백신 조성물은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래 질병의 예방용인, 약독화 생균 백신 조성물.
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