WO2020136292A1 - Compuestos de interés farmacéutico - Google Patents

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WO2020136292A1
WO2020136292A1 PCT/ES2019/070865 ES2019070865W WO2020136292A1 WO 2020136292 A1 WO2020136292 A1 WO 2020136292A1 ES 2019070865 W ES2019070865 W ES 2019070865W WO 2020136292 A1 WO2020136292 A1 WO 2020136292A1
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formula
compounds
compound
hydrogen
cyclopenta
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Application number
PCT/ES2019/070865
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ewa MARCINKOWSKA
Klaudia BERKOWSKA
Antonio MOURIÑO MOSQUERA
Rita SIGÜEIRO PONTE
Sunil GAIKWAD
Original Assignee
Universidade De Santiago De Compostela
University Of Wroclaw
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention is directed to compounds of pharmaceutical interest. More particularly, it is directed to compounds derived from lithocolic acid, to the processes for obtaining the same, to intermediate compounds of their synthesis, and to their applications.
  • 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25D) is the most active metabolite of vitamin D. It exerts its biological actions by specifically binding to its nuclear receptor, the vitamin D receptor (VDR).
  • VDR vitamin D receptor
  • the endocrine system of vitamin D plays a fundamental role in the regulation of phosphorous-calcium metabolism, stimulating the intestinal absorption of these essential minerals and their mobilization in bone tissue.
  • epidemiological, biochemical, cellular, or molecular genetic studies have shown their involvement in other physiological processes, by inhibiting proliferation and inducing cellular differentiation, and pathological, such as psoriasis, diabetes, osteoporosis, autoimmune, degenerative, endocrine, cardiovascular, infectious, or tumor diseases.
  • VDR also functions as a receptor for lithocolic acid (ACL), a hepatotoxic and potentially carcinogenic secondary bile acid (Masuno, et al., Journal of Lipid Research, 2013, volume 54, 2206-2213; Deluca, et al., PNAS, 2007, volume 104, 10006-10009; Belorusova, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, 4710-4719).
  • ACL lithocolic acid
  • PNAS 2007, volume 104, 10006-10009
  • Belorusova et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, 4710-4719
  • VDR is an order of magnitude more sensitive to LCA and its metabolites than other nuclear receptors.
  • Activation of VDR by ACL or 1,25D induces in vivo expression of the enzyme cytochrome P450 CYP3 A, which detoxifies ACL in the liver and intestine.
  • ACL a secondary bile acid.
  • fecal bile acids the most toxic of which is ACL, a secondary bile acid.
  • ACL is poorly reabsorbed in the enterohepatic circulation and enters the colon.
  • ACL breaks DNA strands, forming adducts with DNA and inhibiting enzymes responsible for DNA repair.
  • ACL can also promote colon cancer in animals, and its concentration is higher than other secondary bile acids in patients with colorectal cancer.
  • vitamin D In contrast to the direct correlation between diets high in fat, ACL, and colon cancer, intake of vitamin D and calcium reduces the incidence of colorectal cancer. Furthermore, the administration of vitamin D inhibits carcinogenesis of the colon induced by diets rich in fat or by the action of the accumulation of intrarectal ACL.
  • One way to eliminate ACL is through its catabolism by the action of the enterohepatic cytochrome P450, CYP3 A, a target gene for vitamin D.
  • the authors of the present invention have designed and obtained compounds derived from lithocolic acid that have affinity for the vitamin D receptor and also have activity in cell differentiation. This would allow its use for the treatment of certain diseases, in particular cancer and more specifically breast, colon and prostate cancer.
  • a further advantage of the invention is that, although the compounds of the invention are highly functionalized, the process for their preparation consists of few synthesis steps.
  • Another additional advantage is that the intermediates obtained in this synthetic route have a high versatility regarding the nature of the substituents. More specifically, the functionality in C-3 and C-20 allows to easily prepare derivatives of lithocolic acid with a wide variety of substituents.
  • the compounds of the invention have substituents in the C-3 and C-20 position, so versatile that they can be tailored to the needs of your application and thus can also have R configuration or in said positions as required.
  • the functionality in C-3 and C-20 also makes it possible to prepare isotopically labeled derivatives in a simple and fast way.
  • the invention is directed to a compound of formula (I), its shallow diastereoi or its enantiomers
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently selected from hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, heteroalkynyl, ardo, heteroaryl, arylalkyl, alkylalkyl, arylazyl, alkoxy, aryloxy, alkylcarboxy, arylcarboxy, heterocycle, -OSiR a R b R c , where each of R a , R b and R c are selected from alkyl, aryl, arylalkyl, and heterocycle, and R1 and R2 can together form a methylene group substituted by a group selected from between hydroxyalkyl, hydroxyalkenyl and alkylcarboxy.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I).
  • Another aspect of the invention relates to the compound of formula (I) for use in medicine.
  • the invention is directed to the compounds of formula (I) for use in the treatment of disorders of calcium and phosphorus metabolism, osteoporosis, renal osteodystrophy, osteomalacia, hyperproliferative skin diseases, eczema, dermatitis, myopathy, leukemia, osteosarcomas, squamous carcinomas, melanomas, immunological disorders and in the rejection of transplants.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) for use for the treatment of cancer. More particularly, breast, colon and prostate cancer.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) for use for the treatment of diseases of the immune system. In a more particular aspect, for use for the treatment of psoriasis.
  • Figure 1 Shows the dose-response curves of the affinity of the VDR analogues. Serial dilutions of the compounds were prepared in 384-well plates. The VDR / Fluormone TM VDR Red complex was then added to each sample well and the components to be tested were incubated for 4 hours at room temperature to reach equilibrium. The fluorescence polarization of each well was determined. Concentration-response curves were plotted using GraphPad Prism 7.
  • FIG. 1 Shows the nuclear location of the VDR protein in HL60 exposed to 1,25D or to the compounds of the invention tested.
  • HL60 cells were exposed for 24 hours to lOOnM 1.25D or the compounds of the invention tested.
  • Nuclear extracts were separated by SDS-PAGE and electrodeposited on a PVDF membrane. The membrane was tested against VDR and HDAC2.
  • Figure 3 Shows the dose-response curves of the expression of CD14 (Figure 3A) and of CD1 Ib ( Figure 3B) induced by 1,25D or by the tested compounds of the invention.
  • HL60 cells were exposed to 1,25D or to the compounds of the invention tested in a wide range of concentrations for 96h.
  • the expression of the cell surface markers CD14 (A) and CDl lb (B) were then determined by flow cytometry.
  • the mean values ( ⁇ SEM) of the percentages of antigen positive cells have been represented.
  • Figure 4 Shows the expression of CYP24A1 in HL60 cells induced by 1,25D or by the tested compounds of the invention.
  • HL60 cells were exposed to 1,25D or the compounds of the invention tested at concentrations of InM (figure 4 A), lOnM (figure 4B) or lOOnM (C) and after 96 h the expression of CYP24A1 mRNA was determined by Real-time PCR.
  • the bars in the plots show the average values ( ⁇ SEM) of the orders of magnitude in mRNA levels relative to GAPDH mRNA levels. Values that are significantly higher for those obtained by the respective control cells are marked with asterisks (* p ⁇ 0.05;
  • Figure 5 Shows the expression of CD14 in HL60 cells induced by 1,25D or by tested compounds of the invention.
  • HL60 cells were exposed to 1,25D or compounds of the invention at concentrations of InM (figure 5 A), lOnM (figure 5B) or lOOnM (figure 5C) and after 96 h the expression of CD14 mRNA was determined by PCR in real time.
  • the bars in the plots show the average values ( ⁇ SEM) of the orders of magnitude in mRNA levels relative to GAPDH mRNA levels. Values that are significantly higher for those obtained by the respective control cells are marked with asterisks (* p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01). Expressions that were significantly higher in cells exposed to 1.25D are marked with a hash ( ## p ⁇ 0.01).
  • FIG. 6 Shows the expression of TRPV6 in HT-29 cells induced by lOnM 1,25D or the compounds of the invention.
  • HT-29 cells were exposed to 1,25D or the compounds of the invention at concentrations of lOnM (figure 6 A) or lOOnM (figure 6B) and after 96 h TRPV6 mRNA expression was measured by real-time PCR .
  • Bar graphs show mean values ( ⁇ SEM) of mRNA levels relative to GAPDH mRNA levels. Values that are significantly higher than those obtained for the respective control cells are marked with asterisks (** p ⁇ 0.01). Expression that was significantly higher than in cells exposed to 1.25D is pad-marked (## p ⁇ 0.01).
  • Alkyl refers to a linear or branched, cyclic or acyclic hydrocarbon chain consisting of unsaturated carbon and hydrogen atoms from 1 to 12, preferably two to four carbon atoms, and which binds to the rest of the molecule by a single bond, which may optionally be isotopically labeled so that one or more hydrogens are replaced by deuterium (2 H) or tritium (3 H) and / or one or more carbons are replaced by carbon-11 (U C), carbon-13 ( 13 C) or carbon-14 ( 14 C), optionally substituted by one or more substituents selected from the group consisting of a halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a cyano group, a nitro group, a thioalkoxy group, a heteroalkyl group, a heterocyclic group or CF3, for example, methyl, ethyl, "-propyl, / -propyl,” -butyl,
  • Alkenyl refers to a linear or branched, cyclic or acyclic hydrocarbon chain consisting of carbon and hydrogen atoms, containing at least one unsaturation, conjugated or otherwise, from 2 to 12, preferably from two to eight, more preferably from two to four carbon atoms, and which is attached to the rest of the molecule by a single bond and may optionally be isotopically labeled so that one or more hydrogens are replaced by 2 H or 3 H and / or one or more carbons substituted by U C, 13 C or 14 C.
  • the alkenyl radicals can be optionally substituted by one or more substituents such as a halogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a group cyano, a nitro group, a thioalkoxy group, a heteroalkyl group, a heterocyclic group, or CF 3 , for example, vinyl, allyl, butenyl (for example, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl), or pentenyl (for example, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl).
  • substituents such as a halogen atom, a halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a group cyano, a nitro group, a thioalkoxy group, a heteroalkyl group, a heterocyclic group, or CF 3 , for
  • Alkynyl refers to a linear or branched, cyclic or acyclic hydrocarbon chain consisting of carbon and hydrogen atoms, containing at least one carbon-carbon triple bond, conjugated or otherwise, from two to twelve, preferably from two to eight , more preferably two to four carbon atoms, and which is attached to the rest of the molecule by a single bond, such as -CCH, -CH 2 CCH, -CCCFfi, -CH 2 CCCH 3 , and which may optionally be labeled isotopically so that one or more hydrogens are replaced by H or 3 H 2 and / or one or more carbons are replaced by n C, 13 C or 14 C.
  • the alkynyl radicals may be optionally substituted by one or more substituents such as halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a cyano group, a nitro group, a thioalkoxy group, a heterocyclic group or CF 3 .
  • substituents such as halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a cyano group, a nitro group, a thioalkoxy group, a heterocyclic group or CF 3 .
  • I sharpen refers to an aromatic hydrocarbon of 6 to 10 carbon atoms, such as phenyl or naphthyl, and which may optionally be isotopically labeled so that one or more hydrogens are replaced by 2 H or 3 H and / or one or more carbons are replaced by U C, 13 C or 14 C.
  • the afil radicals may optionally be substituted by one or more substituents selected from the group consisting of a halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, a cyano group, a nitro group, a thioalkoxy group, an alkyl group or CF 3 .
  • Arylalkyl refers to one or more aryl groups attached to the rest of the molecule by an alkyl radical, for example, benzyl, 3- (phenyl) -propyl, etc.
  • Heterocycle refers to a stable 3- to 15-membered ring consisting of carbon atoms and between 1 to 5 heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen, and sulfur, preferably a 4-8 membered ring consisting of one or more heteroatoms, and more preferably a 5-6 membered ring with one or more heteroatoms.
  • heterocyclic groups can be monocyclic, bicyclic, or tricyclic systems, which can include fused rings; and the nitrogen or sulfur atom in the heterocyclic ring can be optionally oxidized; the nitrogen atom can optionally be quartearized; and the heterocyclic radical can be partially or totally saturated.
  • Heterocyclic radicals may be aromatic (eg, they may have one or more aromatic rings) in which case they are considered “heteroaryls" for the purposes of the present invention.
  • the heterocyclic ring may be substituted by one or more substituents selected from the group consisting of a halogen atom, a hydroxy group, a carboxy group, an alkoxy group, an alkyl group, a thioalkoxy group, a cyano group, a nitro group or CF 3 .
  • heterocycles include, for example, furan, thiophene, pyrrole, imidazole, triazole, isothiazole, benzothiophene, benzofuran, indole, benzoimidazole, tetrahydrofuran.
  • Alkoxy refers to a radical of the formula -O-alkyl, for example methoxy, ethoxy, propoxy, etc.
  • Aryloxy refers to a radical of the formula -O-aryl, for example phenoxy, benzyloxy, etc.
  • Alkylcarboxy refers to an alkyl group that is attached to the rest of the molecule by a carboxy (-CO2-) group, such as EtOC (O).
  • Arylcarboxy refers to an aryl group that is attached to the rest of the molecule by a carboxy group (-CO2-).
  • Alkylacyl refers to an alkyl group that is attached to the rest of the molecule by a carbonyl group (-CO-).
  • Arylacyl refers to an aryl group that is attached to the rest of the molecule by a carbonyl group (-CO-).
  • Carboxyalkyl refers to a carboxy (-CO2-) group that is attached to the rest of the molecule by an alkyl group.
  • the carboxy group can be for example a carboxylic acid group or a chyl ester such as for example ethylcarboxyalkyl.
  • Heteroalkyl refers to an alkyl group in which one or more carbons are substituted by heteroatoms, preferably from 1 to 5, where the heteroatom can be selected from oxygen, sulfur, selenium, tellurium, nitrogen, phosphorous, arsenic.
  • Heteroalkenyl refers to an alkenyl group in which one or more carbons are substituted by heteroatoms, preferably from 1 to 5, where the heteroatom can be selected from oxygen, sulfur, selenium, tellurium, nitrogen, phosphorous, arsenic.
  • Heteroalkynyl refers to an alkynyl group in which one or more carbons are substituted by heteroatoms, preferably from 1 to 5, where the heteroatom can be selected from oxygen, sulfur, selenium, tellurium, nitrogen, phosphorous, arsenic.
  • Hydroalkyl refers to a hydroxyl group (-OH) that is attached to the rest of the molecule by an alkyl chain, the alkyl chain can be branched or unbranched.
  • Hydroalkenyl refers to a hydroxyl group (-OH) that is attached to the rest of the molecule by an alkenyl chain, the alkenyl chain may be branched or unbranched.
  • the compounds of the present invention can include diastereoisomers and / or enantiomers and their racemic mixtures, in terms of the presence of chiral centers, and isomers depending on the presence of multiple bonds (for example Z, E). Such isomers, diastereomers, enantiomers, and mixtures thereof are within the scope of the present invention.
  • the compounds of the present invention can be defined as derivatives of lithocolic acid and its metabolites. For this reason the compounds of the invention are named using the steroid numbering system.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which Rl, R2 and R3 are selected from hydrogen, hydroxyalkyl, hydroxyalkenyl, Carboxyalkyl and carboxyalkenyl, or R1 and R2 can together form a methylene group substituted by a group selected from hydroxyalkyl, hydroxyalkenyl, and alkylcarboxy.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R2 is hydrogen and R1 is selected from hydroxyalkyl, heteroalkyl, arylalkyl, alkylalkyl, carboxyalkyl, carboxyalkenyl, heteroalkenyl and hydroxyalkenyl.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R2 is hydrogen and R1 is selected from hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxybutyl, hydroxy (tert-butyl), carboxymethyl, carboxyethyl and carboxypropyl.
  • R2 is hydrogen and R1 is hydroxy (tert-butyl).
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R1 is hydrogen and R2 is selected from hydroxyalkyl, heteroalkyl, arylalkyl, alkylalkyl, carboxyalkyl, carboxyalkenyl, heteroalkenyl and hydroxyalkenyl.
  • R1 is hydrogen and R2 is selected from hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxybutyl, hydroxy (tert-butyl), carboxymethyl, carboxyethyl and carboxypropyl.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R1 is hydrogen and R2 is hydroxy (tert-butyl).
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R1 and R2 together form a methylene group substituted by a group selected from hydroxyalkyl, hydroxyalkenyl and alkylcarboxy.
  • the invention is directed to compounds of formula (I) in which R1 and R2 together form a methylene group substituted by an alkylcarboxy group.
  • the invention is also directed to any of the compounds described above in which R3 is selected from alkyl, alkenyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, arylalkyl, hydroxyalkyl, and carboxyalkyl.
  • the invention is directed to any of the following compounds: (R) -4 - ⁇ (5R, SR, 9S, 100) 13?, 14 ⁇ , 17A, Z) -3- (2-Ethoxy-2-oxoethylidene) -10, 13-dimethylhexa decahydro- 1 H- cyclopenta [a] phenanthren-17-yl ⁇ -pentanoic,
  • Example 1 Preparation of 3 » n, 5 / ?, 8 / ?, 9 / ?, 10 ⁇ 13 / ?, 14 » , 17 /?) - 17 - [(/?) - 5-H ⁇ Gqc ⁇ r 6h ⁇ 3h -2- yl] -10,13-dimethylhexadecahydro-lH-cyclopenta [a] fenantren-3-ol (1)
  • Triethylphosphonoacetate (3.2 mL) was dripped onto a suspension of NaH (0.640 g, 60% w / w) in THF
  • Esters 4 were subjected to preparative HPLC (Phenomenex Luna Silica 5 D, 250x210 mm, 100 A; 0.5% EtOAc / Hexanes) obtaining 4a (0.746 g, 43%, colorless oil) and 4b (0.802 g, 47%, colorless oil ).
  • Example 5 Preparation of
  • Example 7 Preparation of (£ 2 - ⁇ (5 / ?, 8 / ?, 9A, 10A, 13 / ?, 14A, 17 ⁇ ) - 1H ( ⁇ ) - 5-hydroxypentan-2-yl] -10.13 -dimethylhexadeca hydro-3H-cyclopenta [a] phenanthrene-3-yliden ⁇ -ethyl acetate (15).
  • Pyridinium dichromate (0.525 g) was added to a solution of the alcohol 15 (0.20 g) in CH2CI2 (15 mL). The mixture was stirred protected from light and at room temperature for 12 h. The mixture was diluted with MTBE (10 mL), filtered under vacuum over a celite pad, and the solids were washed with MTBE (3x20 mL). The filtrates were concentrated in vacuo and the resulting residue (16, 0.180 g) was dissolved in DMF. Oxone® (0.085 g) was added to the previous solution. The mixture was stirred at room temperature for 3 h.
  • Example 9 Preparation of 2 - ⁇ (3R, 5R, SR, 9S, l S, l3R, l4S, ⁇ 7R) -l7 - [(R) -5- (tert-Butyldimethylsilyloxy) pentan-2-yl] -10, Ethyl 13-dimethylhexadecahydro-lH-cyclopenta [a] phenanthrene-3-yl ⁇ acetate (5a).
  • reaction mixture was removed from the bath and allowed to come to room temperature.
  • the reaction was stopped by the addition of an aqueous HC1 solution (15 mL, 10%).
  • the mixture was extracted with AcOEt (3x20 mL).
  • the combined organic phase was dried, filtered, and concentrated. The residue
  • 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25D) was purchased from Cayman Europe (Tallinn, Estonia) and was dissolved in absolute ethanol to a concentration of 1 mM.
  • Compounds of the invention to be tested Compound A.9, prepared in Example 11, was dissolved in absolute ethanol at a concentration of 20 mM, and the remaining compounds tested (A.5 prepared in Example 14; A.6 prepared in Example 18; A.10 prepared in Example 16; A. l- (Z) prepared in Example 6; A.11 - (E) prepared in Example 8) were dissolved in absolute ethanol at a concentration of 50mM. 19.1.2. Cells
  • HL60 and HT-29 cells were obtained from a local cell bank at the Institute of Immunology and Experimental Therapy in Wroclaw, Tru. Cells were grown in RPMI 1640 medium and HT-29 adherent cultures in DMEM, both supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), penicillin 100 units / mL, and sterptomycin 100 pg / mL (Sigma, St. Louis , MO). Cells were grown in an atmosphere moistened with 95% air and 5% C02 at 37 ° C. Cell number and viability were determined by counts on a hematocytometer and by trypan blue exclusion. The cells were seeded with a density of 2.5 x 10 5 cells / mL in a culture medium containing 1.25D, a compound of the present invention mentioned in section 19.1.1. or the equivalent volume of ethanol as a control vehicle.
  • FCS fetal calf serum
  • penicillin 100 units / mL penicillin 100 units / mL
  • VDR affinity was determined using a competitive PolarScreen TM vitamin D receptor assay kit following manufacturer's conditions (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1,25D and the tested compounds were evaluated in the concentration range of 10 12 -10 5 M. The components of the test were incubated for 4h at room temperature to allow equilibrium to be reached. The polarized fluorescence of each tray was determined in triplicate using the Envision multiwell reader (PerkinElmer, Waltham, MA) and the average fluorescence polarization was calculated from these measurements. The complete test was repeated three times. IC50 values were calculated with the GraphPad Prism 7 program (GraphPad Software, San Diego CA) using the average of the values obtained.
  • cytosolic and nuclear extracts 6x10 6 cells / sample were washed and disaggregated using NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo Fisher Scientific Inc., Worcester, MA) following the manufacturer's conditions. Cellular uses were denatured by adding the sample buffer five times (with a maximum volume corresponding to 1/4 of the volume of the Used) and boiled for 5 min. 20 pL of each Usado was separated by SDS-PAGE and electrodeposited on a PVDF membrane. The membranes dried up and went sequentially incubated with primary and secondary horseshoe fish conjugated peroroxidase antibodies. Protein bands were visualized by chemiluminescence. The membranes were then trimmed, dried again, and assayed for subsequent antibodies.
  • NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents Thermo Fisher Scientific Inc., Worcester, MA
  • Cellular uses were denatured by adding the sample buffer five times (with a maximum volume corresponding to 1/4 of the volume of the Used) and
  • Cells were seeded at a density of 15 x 10 4 cells / mL in a culture medium containing 1.25D, a compound of the invention to be tested as indicated in 19.1.1. or the equivalent volume of ethanol as a control vehicle. After 96 h incubation, the cells were washed with PBS / 0.1% BSA, and then incubated for 1 h, in an ice bath, with 1 pL CD14-PE and 2 pL CDl lb-APC (ImmunoTools, Friesoythe, Germany ). Cells were washed and suspended in 350 pL PBS / 0.1% BSA prior to analysis on a Becton Dickinson Accuri C6 flow cytometer (San Jose, CA). Data analysis was performed using Becton Dickinson Accuri C6 programs. The test was repeated 3 to 5 times. The percentages of positive cells were printed on the charts and the EC50 values were calculated using the GraphPad Prism software.
  • the affinity of the compounds of the invention to be tested as indicated in 19.1.1. by the VDR receptor was determined by a competitive assay using fluorescence polarization. In this assay recombinant human VDR is added to a fluorescent VDR ligand to form a complex, resulting in a high value for fluorescence polarization. The compounds to be tested were then added to the complex in a 386-well tray. The tested compounds displace the fluorescent ligand from the complex, resulting in a lower polarization value.
  • the affinity of the compounds for VDR was tested with a wide range of concentrations and was compared with 1.25D. It should be mentioned that the affinity for VDR could not be determined for those compounds of the invention applied at concentrations higher than 10 5 M.
  • concentration-response curve is U-shaped instead of be sigmoidal.
  • the probable cause is due to the formation of colloidal association of the tested compounds.
  • concentration-response curve was plotted (presented in Figure 1), and IC50 values were calculated using GraphPad Prism 7.
  • the affinity for VDR is compared to 1.25D, for which the relative binding affinity (RBA) is normalized to 100, and has been presented in Table 1.
  • RBA relative binding affinity
  • VDR affinity is expressed as IC50 and percentage activity. a The potency of 1,25D is normalized to 100. RBA: relative binding affinity. ND: not detected.
  • VDR Since the nuclear accumulation of VDR and the pro-differentiating activity were correlated for previously tested analogs, it was studied as the compounds of the invention to be tested as indicated in 19.1.1. They influence the levels of VDR protein in HL60 cells exposed for 24h to 100 nM concentrations of analogs. VDR levels in nuclear fractions of cells were analyzed. The HDAC2 nuclear protein was used as a control, as a protein that does not change during cell differentiation from HL60. The amount of VDR in the cell nucleus had increased for 1,25D and for compounds A.5, A.6 and A.11- (Z) (Fig. 2).
  • HL60 cells were used to determine the pro-differentiating activity of the compounds of the invention to be tested as indicated in 19.1.1 .. After the initial scan, the concentration ranges were established for each compound. 1,25D was tested in concentrations between 0.032 nM - 100 nM, A.5, A.6 and Al l- (Z) were tested in concentrations 0.032 nM - 500 nM, while A.9, A.10 and Al l- (E) were applied in concentrations 4 mM - 50 pM. The cells were exposed to the compounds for 96 h and then the expression of the monocyte / macrophage differentiation marker CD14 and the monocyte / granulocyte differentiation marker CDl lb were studied by flow cytometry.
  • CD14- and CD1 Ib positive cells were recorded using the Becton Dickinson Accuri C6 software. The results are presented in the Figures 3A and 3B. EC50 values were estimated from dose-response curves using GraphPad Prism 7 software. The effective molar ratios (EMR) for each analog compared to 1.25D for the CD14 antigen are depicted in Table 2 and for the antigen. for CD1 Ib in Table 3. Table 2. Induction of CD14 expression by 1,25D and compounds of the invention.
  • EMR effective molar ratios
  • EMR effective molar ratio
  • EMR effective molar ratio
  • HL60 cells were exposed to 1,25D or the compounds of the invention to be tested as indicated in 19.1.1. at 1 nM, 10 nM and 100 nM concentrations for 96h. Control cells were treated with an equivalent volume of ethanol (solvent for all compounds). Then the mRNA was isolated from the cells, transcribed into cDNA and the Expression of CYP24A1, the most heavily regulated VDR target gene, was determined in real-time PCR relative to the GAPDH gene. The effects of exposure to 1 nM of the compounds is depicted in Figure 4A, to 10 nM in Figure 4B, and to 100 nM in Figure 4C. The expressions, which were significantly higher than those of the control cells, are marked with asterisks. The expressions, which were significantly higher than those of the cells exposed to 1.25D, are marked with a pad.
  • HL60 cells were exposed to 1,25D or the compounds of the invention as indicated in 19.1.1. at 1 nM, 10 nM and 100 nM concentrations for 96h. Control cells were treated with an equivalent volume of ethanol (solvent for all compounds). The mRNA was then isolated from the cells, transcribed into cDNA and the expression of CD14 was determined in a real-time PCR in relation to the GAPDH gene.
  • the CD14 gene encodes a cell surface protein present in macrophages, which is a co-receptor for bacterial LPS.
  • the effects of exposure to 1 nM of the compounds is depicted in Figure 5A, at 10 nM in Figure 5B, and at 100 nM in Figure 5C. The expressions, which were significantly higher than those of the control cells, are marked with asterisks.
  • compound A.5 is the most active of the group of lithocolic acid derivatives studied. This compound is especially effective in inducing cell differentiation and expression of the VDR target gene at a concentration of 10 nM.
  • HT-29 cells originated in the intestines.
  • the intestine is an important tissue for the absorption of calcium and phosphate.
  • TRPV6 Located at the brush border of intestinal cell membranes, TRPV6 is a potential mediator of dietary calcium absorption.
  • the gene encoding this calcium channel is directly regulated by 1,25D by activating multiple vitamin D receptor binding sites.
  • HT-29 cells were treated with 1,25D compounds or compounds of the invention at concentrations of lOnM and lOOnM for 96 hours.
  • Control cells were treated with an equivalent volume of ethanol (solvent for the above compounds).
  • the mRNA was then isolated from the cells, transcribed into cDNA, and the expression of TRPV6 was analyzed in real-time PCR for the GAPDH gene. The effects of the treatment are found in Figure 6.
  • the expressions that were significantly higher than in the control cells are marked with an asterisk. Expressions that were significantly higher than 1.25D-treated cells are padded.

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Abstract

Compuestos de interés farmacéutico. Los compuestos de la presente invención pueden definirse como derivados de ácido litocólicoy de sus metabolitos. Por este motivo los compuestos de la invención se nombran empleando el sistema de numeración de esteroides. Más en particular, se dirige a compuestos derivados del ácido litocólico, a los procedimientos de obtención de los mismos, a compuestos intermedios de su síntesis, y a sus aplicaciones.

Description

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Compuestos de interés farmacéutico
Sector de la técnica
La presente invención se dirige a compuestos de interés farmacéutico. Más en particular, se dirige a compuestos derivados del ácido litocólico, a los procedimientos de obtención de los mismos, a compuestos intermedios de su síntesis, y a sus aplicaciones.
Antecedentes
La l,25a-dihidroxivitamina D3 (1,25D) es el metabolito más activo de la vitamina D. Ejerce sus acciones biológicas uniéndose de forma específica a su receptor nuclear, el receptor de la vitamina D (VDR). El sistema endocrino de la vitamina D juega un papel fundamental en la regulación del metabolismo fosforo-cálcico, estimulando la absorción intestinal de estos minerales esenciales y su movilización en el tejido óseo. Aunque las acciones sobre el metabolismo del fosfato y del calcio son las más conocidas, estudios epidemiológicos, bioquímicos, celulares, o de genética molecular han demostrado su implicación en otros procesos fisiológicos, al inhibir la proliferación e inducir la diferenciación celular, y patológicos, como psoriasis, diabetes, osteoporosis, enfermedades autoinmunes, degenerativas, endocrinológicas, cardiovasculares, infecciosas, o tumorales.
El VDR también funciona como un receptor para el ácido litocólico (LCA), un acido biliar secundario hepatotóxico y potencialmente carcinógeno (Masuno, et al., Journal of Lipid Research, 2013, volumen 54, 2206-2213; Deluca, et al., PNAS, 2007, volumen 104, 10006- 10009; Belorusova, et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 57, 4710-4719). El VDR es un orden de magnitud más sensible al LCA y sus metabolitos, que otros receptores nucleares. La activación de VDR por el LCA o la 1,25D induce la expresión in vivo de la enzima citocromo P450 CYP3 A, que desintoxica el LCA en el hígado y en el intestino. Estos estudios ofrecen un mecanismo que pueden explicar los efectos protectores de la vitamina D y su receptor contra el cáncer de colon {Science, 2002, 296 , 1313-1316).
Un factor que contribuye a los efectos dañinos de una dieta rica en grasas es un incremento asociado a la excreción de ácidos biliares fecales, el más tóxico de los cuales es el LCA, un ácido biliar secundario. A diferencia de los ácidos biliares primarios, el ácido quenodesoxicólico (CDCA) y el ácido cólico (CA), el LCA se reabsorbe mal en la circulación enterohepática y pasa al colon. A altas concentraciones, el LCA produce roturas en las cadenas de ADN, formando aductos con el ADN e inhibiendo a las enzimas encargadas de la reparación del ADN. El LCA puede también promover cáncer de colon en animales, y su concentración es mayor que otros ácidos biliares secundarios en pacientes con cáncer colorectal.
En contraste con la correlación directa entre las dietas ricas en grasas, el LCA y el cáncer de colon, la ingesta de vitamina D y calcio reduce la incidencia del cáncer colorrectal. Además, la administración de vitamina D inhibe la carcinogénesis del colon inducida por dietas ricas en grasas o por acción de la acumulación del LCA intrarrectal. Una vía para la eliminación del LCA es a través de su catabolismo por acción del citocromo enterohepático P450, CYP3 A, un gen diana de la vitamina D.
Así, el desarrollo de nuevos análogos de vitamina D con las mismas propiedades de la hormona natural, pero además efectivo en la inducción de la diferenciación celular y en la expresión del gen diana del VDR, es un objetivo a alcanzar para su utilización en la práctica clínica.
Descripción breve de la invención
Los autores de la presente invención han diseñado y obtenido compuestos derivados del ácido litocólico que presentan afinidad por el receptor de la vitamina D y además presentan actividad en la diferenciación celular. Esto permitiría su empleo para el tratamiento de ciertas enfermedades en particular el cáncer y más específicamente el cáncer de mama, colon y próstata.
Una ventaja adicional de la invención es que, aunque los compuestos de la invención están altamente funcionalizados, el procedimiento para su preparación consta de pocas etapas de síntesis.
Otra ventaja adicional es que los intermedios obtenidos en esa ruta sintética presentan una elevada versatilidad en cuanto a la naturaleza de los sustituyentes. Más en concreto, la funcionalidad en C-3 y C-20 permite preparar fácilmente derivados del ácido litocólico con una amplia variedad de sustituyentes. En particular, los compuestos de la invención presentan sustituyentes en la posición C-3 y C-20, tan versátiles que pueden ser diseñados a medida de las necesidades de su aplicación y así pueden además presentar configuración R o en dichas posiciones según se requiera. La funcionalidad en C-3 y C-20 permite además preparar derivados marcados isotópicamente de un modo sencillo y rápido.
Así, en un aspecto la invención se dirige a un compuesto de fórmula (I), sus diastereoi someros o sus enantiómeros
Figure imgf000004_0001
donde cada uno de R1, R2 y R3, se seleccionan independientemente de entre hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, ardo, heteroarilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, alcoxilo, ariloxi, alquilcarboxi, arilcarboxi, heterociclo, -OSiRaRbRc, donde cada uno de Ra, Rb y Rc se seleccionan de entre alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclo, y R1 y R2 pueden formar conjuntamente un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I).
Otro aspecto de la invención se refiere al compuesto de fórmula (I) para su uso en medicina.
En una realización particular, la invención se dirige a los compuestos de fórmula (I) para su uso en el tratamiento de trastornos del metabolismo del calcio y del fósforo, osteoporosis, osteodistrofia renal, osteomalacia, enfermedades cutáneas hiperproliferativas, eczema, dermatitis, miopatía, leucemia, osteosarcomas, carcinomas escamososos, melanomas, desórdenes inmmunológicos y en el rechazo a transplantes. En otra realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) para su uso para el tratamiento del cáncer. Más particularmente, cáncer de mama, colon y próstata. En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) para su uso para el tratamiento de enfermedades del sistema inmune. En un aspecto más particular, para su uso para el tratamiento de psoriasis.
Descripción de las figuras
Figura 1. Muestra las curvas dosis-respuesta de la afinidad de los análogos al VDR. Diluciones seriadas de los compuestos fueron preparadas en placas de 384 pocilios. El complejo VDR/Fluormone™ VDR Red fue entonces añadido a cada pocilio de muestra y los componentes a ensayar fueron incubados durante 4 horas a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio. La polarización de fluorescencia de cada pocilio fue determinada. Las curvas de concentración-respuesta fueron representados usando GraphPad Prism 7.
Figura 2. Muestra la localización nuclear de la proteína VDR en HL60 expuestos a 1,25D o a los compuestos de la invención testados. Las células HL60 fueron expuestas durante 24 horas a lOOnM 1,25D o los compuestos de la invención testados. Extractos nucleares fueron separados por SDS-PAGE y electrodepositados en una membrana de PVDF. La membrana fue ensayada contra VDR y HDAC2.
Figura 3. Muestra las curvas dosis-respuesta de la expresión de CD14 (Figura 3A) y de CD1 Ib (Figura 3B) inducida por 1,25D o por los compuestos de la invención testados. Las células HL60 fueron expuestas a 1,25D o a los compuestos de la invención testados en un amplio rango de concentraciones durante 96h. Entonces la expresión de los marcadores de superficie celular CD14 (A) y CDl lb (B) fueron determinados por citometría de flujo. Se ha representado los valores promedio (±SEM) de los porcentajes de células positivas al antígenos.
Figura 4. Muestra la expresión de CYP24A1 en células HL60 inducidas por 1,25D o por los compuestos de la invención testados. Las células HL60 fueron expuestas a 1,25D o los compuestos de la invención testados a concentraciones de InM (figura 4 A), lOnM (figura 4B) or lOOnM (C) y después de 96 h la expresión del mARN de CYP24A1 fue determinada por PCR en tiempo real. Las barras en las representaciones muestran los valores promedio (±SEM) de los órdenes de magnitud en los niveles de mARN relativos a los niveles del mARN de GAPDH. Los valores que son significativamente más altos para aquellos obtenidos por las respectivas células control están marcados con asteriscos (*p < 0.05;
**p<0.01). Figura 5. Muestra la expresión de CD14 en células HL60 inducidas por 1,25D o por compuestos testados de la invención. Las células HL60 fueron expuestas a 1,25D o a compuestos de la invención a concentraciones de InM (figura 5 A), lOnM (figura 5B) or lOOnM (figura 5C) y después de 96 h la expresión del mARN de CD14 fue determinada por PCR en tiempo real. Las barras en las representaciones muestran los valores promedio (±SEM) de los órdenes de magnitud en los niveles de mARN relativos a los niveles del mARN de GAPDH. Los valores que son significativamente más altos para aquellos obtenidos por las respectivas células control están marcados con asteriscos (*p < 0.05; **p<0.01). Las expresiones que fueron significativamente mayores en células expuestas a 1,25D están marcadas con una almohadilla (##p<0.01).
Figura 6. Muestra la expresión de TRPV6 en células HT-29 inducidas por lOnM 1,25D o los compuestos de la invención. Las células HT-29 se expusieron a 1,25D o a los compuestos de la invención a concentraciones de lOnM (figura 6 A) o lOOnM (figura 6B) y después de 96 h se midió la expresión de ARNm de TRPV6 por PCR en tiempo real. Los gráficos de barras muestran los valores medios (± SEM) de los niveles de ARNm en relación con los niveles de ARNm de GAPDH. Los valores que son significativamente más altos que los obtenidos para las celdas de control respectivas están marcados con asteriscos (** p <0.01). La expresión que fue significativamente mayor que en las células expuestas a 1,25D está marcada con almohadilla (## p <0.01).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
“Alquilo” se refiere a una cadena hidrocarb onada lineal o ramificada, cíclica o acíclica formada por átomos de carbono e hidrógeno, sin insaturaciones, de 1 a 12, preferiblemente dos a cuatro átomos de carbono, y que se une al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, que opcionalmente puede estar marcado isotópicamente de modo que uno o más hidrógenos se sustituyen por deuterio (2H) o tritio (3H) y/o uno o más carbonos se sustituyen por carbono-11 (UC), carbono-13 (13C) o carbono-14 (14C), opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo heteroalquilo, un grupo heterocíclico o CF3, por ejemplo, metilo, etilo, «-propilo, /-propilo, «-butilo, /-butilo, «-pentilo, ciclopropilo, etc.
"Alquenilo" se refiere a una cadena hidrocarb onada lineal o ramificada, cíclica o acíclica formada por átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos una insaturación, conjugada o no, de 2 a 12, preferiblemente de dos a ocho, más preferiblemente de dos a cuatro átomos de carbono, y que se une al resto de la molécula mediante un enlace sencillo y que opcionalmente puede estar marcado isotópicamente de modo que uno o más hidrógenos se sustituyen por 2H o 3H y/o uno o más carbonos se sustituyen por UC, 13C o 14C. Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un átomo de halógeno, en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo heteroalquilo, un grupo heterocíclico o CF3, por ejemplo, vinil, alil, butenil (por ejemplo, 1-butenil, 2-butenil, 3-butenil), o pentenil (por ejemplo, 1-pentenil, 2-pentenil, 3- pentenil, 4-pentenil).
"Alquinilo" se refiere a una cadena hidrocarb onada lineal o ramificada, cíclica o acíclica formada por átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace carbono- carbono, conjugado o no, de dos a doce, preferiblemente de dos a ocho, más preferiblemente de dos a cuatro átomos de carbono, y que se une al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, tal como -CCH, -CH2CCH, -CCCFfi, -CH2CCCH3, y que opcionalmente puede estar marcado isotópicamente de modo que uno o más hidrógenos se sustituyen por 2H o 3H y/o uno o más carbonos se sustituyen por nC, 13C o 14C. Los radicales alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo heterocíciclo o CF3.
"Afilo" se refiere a un hidrocarburo aromático de 6 a 10 átomos de carbono, tal como fenilo o naftilo, y que opcionalmente puede estar marcado isotópicamente de modo que uno o más hidrógenos se sustituyen por 2H o 3H y/o uno o más carbonos se sustituyen por UC, 13C o 14C. Los radicales afilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo tioalcoxi, un grupo alquilo o CF3. "Arilalquilo" se refiere a uno o varios grupos arilo unidos al resto de la molécula mediante un radical alquilo, por ejemplo, bencil, 3-(fenil)-propil, etc.
"Heterociclo" se refiere a un anillo estable de 3 a 15 miembros formado por átomos de carbono y entre 1 a 5 heteroátomos escogidos entre nitrógeno, oxígeno y azufre, preferiblemente un anillo de 4 a 8 miembros formado por uno o más heteroátomos, y más preferiblemente un anillo de 5 a 6 miembros con uno o más heteroátomos. Para los propósitos de esta invención, los grupos heterocíclico pueden ser sistemas monocíclicos, bicíclicos o triciclicos, que pueden incluir anillos fusionados; y el átomo de nitrógeno o de azufre en el anillo heterocíclico puede estar opcionalmente oxidado; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuartenarizado; y el radical heterocíciclo puede estar parcial o totalmente saturado. Los radicales heterocí ciclos pueden ser aromáticos (por ejemplo, pueden tener uno o más anillos aromáticos) en cuyo caso se consideran como "heteroarilos" para los propósitos de la presente invención. El anillo heterocíclico puede estar sustituido por uno o más sustituy entes seleccionados entre el grupo consistente en un átomo de halógeno, un grupo hidroxi, un grupo carboxi, un grupo alcoxi, un grupo alquilo, un grupo tioalcoxi, un grupo ciano, un grupo nitro o CF3. Ejemplos de tales heterociclos incluyen, por ejemplo, furano, tiofeno, pirrol, imidazol, triazol, isotiazol, benzotiofeno, benzofurano, indol, benzoimidazol, tetrahidrofurano.
"Alcoxi" se refiere a un radical de fórmula -O-alquilo, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, etc.
“Ariloxi” se refiere a un radical de fórmula -O-arilo, por ejemplo fenoxi, benciloxi, etc.
“Alquilcarboxi” se refiere a un grupo alquilo que se une al resto de la molécula mediante un grupo carboxi (-CO2-), como por ejemplo EtOC(O).
“Arilcarboxi se refiere a un grupo arilo que se une al resto de la molécula mediante un grupo carboxi (-CO2-).
“Alquilacilo” se refiere a un grupo alquilo que se une al resto de la molécula mediante un grupo carbonilo (-CO-).
“Arilacilo” se refiere a un grupo arilo que se une al resto de la molécula mediante un grupo carbonilo (-CO-). “Carboxialquilo” se refiere a un grupo carboxi (-CO2-) que se une al resto de la molécula mediante un grupo alquilo. El grupo carboxi puede ser por ejemplo un grupo ácido carboxílico o un éster al quilico como por ejemplo etilcarboxial quilo.
“Heteroalquilo” se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más carbonos están sustituidos por heteroátomos, preferentemente de 1 a 5, donde el heteroátomo se puede seleccionar de entre oxígeno, azufre, selenio, teluro, nitrógeno, fósforo, arsénico.
“Heteroalquenilo” se refiere a un grupo alquenilo en el que uno o más carbonos están sustituidos por heteroátomos, preferentemente de 1 a 5, donde el heteroátomo se puede seleccionar de entre oxígeno, azufre, selenio, teluro, nitrógeno, fósforo, arsénico.
“Heteroalquinilo” se refiere a un grupo alquinilo en el que uno o más carbonos están sustituidos por heteroátomos, preferentemente de 1 a 5, donde el heteroátomo se puede seleccionar de entre oxígeno, azufre, selenio, teluro, nitrógeno, fósforo, arsénico.
“Hidroxialquilo” se refiere a un grupo hidroxilo (-OH) que se une al resto de la molécula mediante una cadena alquílica, la cadena alquílica puede estar ramificada o no ramificada.
“Hidroxialquenilo” se refiere a un grupo hidroxilo (-OH) que se une al resto de la molécula mediante una cadena alquenílica, la cadena alquenílica puede estar ramificada o no ramificada.
“Metileno” se refiere a un grupo ((¾=).
Los compuestos de la presente invención pueden incluir diastereoisómeros y/o enantiómeros y sus mezclas racémicas, en cuanto a la presencia de centros quirales, e isómeros dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo Z, E). Dichos isómeros, diastereómeros, enantiómeros y sus mezclas están dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención pueden definirse como derivados de ácido litocólico y de sus metabolitos. Por este motivo los compuestos de la invención se nombran empleando el sistema de numeración de esteroides.
En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que Rl, R2 y R3 se seleccionan de entre hidrógeno, hidroxialquilo, hidroxialquenilo, carboxialquilo y carboxialquenilo, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi.
En una realización preferida, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R2 es hidrógeno y R1 se selecciona de entre hidroxialquilo, heteroalquilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, carboxialquilo, carboxialquenilo, heteroalquenilo y hidroxialquenilo.
En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R2 es hidrógeno y R1 se selecciona de entre hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, hidroxi(terc-butilo), carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo. En una realización preferida la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R2 es hidrógeno y R1 es hidroxi(terc-butilo).
En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R1 es hidrógeno y R2 se selecciona de entre hidroxialquilo, heteroalquilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, carboxialquilo, carboxialquenilo, heteroalquenilo y hidroxialquenilo. En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R1 es hidrógeno y R2 se selecciona de entre hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, hidroxi(terc-butilo), carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo. En una realización particular la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R1 es hidrógeno y R2 es hidroxi(terc-butilo). En una realización particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R1 y R2 conjuntamente forman un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi. En una realización más particular, la invención se dirige a compuestos de fórmula (I) en los que R1 y R2 conjuntamente forman un grupo metileno sustituido por un grupo alquilcarboxi. En una realización particular, la invención también se dirige a cualquiera de los compuestos descritos anteriormente en los que R3 se selecciona de entre alquilo, alquenilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, hidroxialquilo y carboxialquilo.
En una realización particular la invención se dirige a cualquiera de los compuestos siguientes: Ácido (R)-4-{(5R,SR,9S, 100) 13 ?, 14^, 17A,Z)-3-(2-Etoxi-2-oxoetiliden)-10, 13-dimetilhexa decahidro- 1 H-ciclopenta[a]fenantren- 17-il } -pentanoico,
Ácido (i?)-4-
Figure imgf000011_0001
90*, 100*, 13i?, 140*, 17i?,£)-3-(2 -Etoxi-2-oxoetiliden)- 10, 13-dimetilhexa decahidro- 1 H-ciclopenta[a]fenantren- 17-il } -pentanoico,
Ácido (i?)-4-[(3i?, 57?, 87?, 95”, 1 OS, 137?, 145”, 17i?)-3 -(2-Etoxi-2-oxoetil)- 10, 13- dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]-pentanoico,
Ácido (i?)-4-[(3i?,5i?,8i?,9ó,, 10ó', 13i?, 14ó', 17i?)-3-(2-hidroxi-2-metilpropil)-10, 13- dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il)pentanoico,
Ácido (A)-4- { (3S, 5R, 87?, 9S, 1 OS, 137?, 14S, 17R)-3 -(2-etoxi-2-oxoetil)- 10, 13 -dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il}-pentanoico, y
Ácido (R)-4-[(3S,5R,8R,9S, IOS, 137?, 140*, 17i?)-3-(2-Hidroxi-2-metilpropil)-10, 13- dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]-pentanoico.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben de ser interpretados como limitativos de la misma:
Ejemplo 1. Preparación de 3»n,5/?,8/?,9/?,10^13/?,14» ,17/?)-17-[(/?)-5-HίάGqcίr6hΐ3h-2- il]-10,13-dimetilhexadecahidro-lH-ciclopenta[a] fenantren-3-ol (1)
Figure imgf000011_0002
L1AIH4 (2.02 g) se añadió en porciones sobre una disolución de ácido Litocólico (4 g) en THF (100 mL) enfriada a 0 °C. Después 15 min, la mezcla de reacción se retiró del baño y se agito a temperatura ambiente durante 12 h. Sobre la mezcla enfriada a 0 °C se añadió lentamente ácido clorhídrico (30 mL, 10%) y se agitó durante 30 min hasta que la disolución se vuelve transparente. La mezcla se extrajo con AcOEt (3x25 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cristalización. Al residuo se añadieron 20 mL de una mezcla 1 : 1 de EtOAc/Hexanes. La suspensión resultante se calentó a 50 °C hasta que se vuelve transparente. La mezcla se dejo venir a temperatura ambiente y luego se enfrió a 0 °C, observándose la formación de un sólido blanco. El sólido se filtro a vacio para dar el alcohol 1 (3.79 g, 98%).
Refi: Arto Valkonen, Elina Siev nen, Satu Ikonen, Nikolai V. Lukashev, Pavel A. Donez, Alexej D. Averin, Manu Lahtinen, Erkki Kolehmainen. Novel lithocholaphanes: syntheses, NMR, MS and molecular modeling studies. J. Mol. Struc. 2007, 846, 65-73.
Ejemplo 2. Preparación de ( 3S,5R,SR,9R,1 S,13R,14S,17R)-17-[(R)-5-(íerc -
Butildimetilsililoxi)pentan-2-il]-10,13-dimetilhexadecahidro-lH- ciclopenta[a]fenantren-3-ol (2a)
Figure imgf000012_0001
Lina suspensión del diol 1 (2 g) en DMF (50 mL) se calentó hasta su disolución. Después de 5 min, la disolución se dejo venir a temperatura ambiente. Sobre la disolución anterior se añadió sucesivamente imidazol (0.375 g) y cloruro de /erc-butildimetilsilil éter (0.83 g). Tras agitar 15 min, la reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl (30 mL). La mezcla se extrajo con hexanos (3x20 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (10% EtOAc/hexanes) para dar el alcohol monoprotegido 2a (1.51 g, 57%, espuma blanca) y el diol dioprotegido 2b (0.287 g, 9% (16% BSMR), aceite incoloro), recuperándose sustancia de partida 1 (0.61 g, 1.68 mmol, 30%).
Ejemplo 3. Preparación de ( 5R,SR,9R,1 S,13R,14S,17R)-17-{(R)-5-(íerc -
Butildimetilsililoxi)-pentan-2-il)-10,13-dimetilhexadecahidro-3H- ciclopenta[a]fenantren-3-ona (3)
Figure imgf000012_0002
Dicromato de piridinio (PDC, 2.60 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 2a (1.10 g) en CH2CI2 (45 mL). La mezcla se agitó protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 7 h. La mezcla se diluyo con MTBE (50 mL), se agitó 15 min y se filtró a vacio sobre un lecho de celita, lavando los solidos con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio y el residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (2% EtOAc/Hexanos) para dar la cetona 3 (1.02 g 93%, sólido blanco).
Ejemplo 4. Preparación de (Z)-2-{(5R,SR,9S,l S,l3R,l4S,l7R)-l7-[(R)-5-(terc- Butildimetilsililoxi)pentan-2-il]-10,13-dimetilhexa decahidro-3H- ciclopenta[a]fenantren-3-iliden}-acetato de etilo (4a) y (E)-2-
{(5 ?,8 ?,9»V,10»V,13 ?,14»V,17 ?)-17-[( ?)-5-(terc-Butildimetilsililoxi)pentan-2-il]-10,13 - dimetilhexa decahidro-3H-ciclopenta[a]fenenatren-3-iliden}acetato de etilo (4b)
Figure imgf000013_0001
Trietilfosfonoacetato (3.2 mL) se goteó sobre una suspensión de NaH (0.640 g, 60% p/p) en THF
(15 mL) enfriada a 0 °C. Después de 30 min, se añadió vía cánula una disolución de la cetona 3 (1.5 g) en THF (15 mL). Tras 5 min, la mezcla de reacción se retiró del baño y se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se detuvo por adición lenta de H2O (20 mL). La mezcla resultante se extrajo con EtOAc (3x25 mL). La fase orgánica combinada se seco, filtro y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (5% EtOAc/Hexanes) para dar la mezcla de alquenos 4 (1.68 g, 98%). Los esteres 4 se sometieron a HPLC preparativo (Phenomenex Luna Silica 5 D, 250x210 mm, 100 A; 0.5% EtOAc/Hexanes) obteniéndose 4a (0.746 g, 43%, aceite incoloro) y 4b (0.802 g, 47%, aceite incoloro). Ejemplo 5. Preparación de
hidroxipentan-2-il]-10,13-dimetil hexadecahidro-3H-ciclopenta[a]fenantren-3-iliden}- acetato de etilo (13).
Figure imgf000014_0001
Una disolución de TBAF en THF (1.1 mL, 1M) se añadió a una disolución del éster 4a (0.40 g) in THF (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl (15 mL). La mezcla resultante se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se seco, filtro y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (10% AcOEt/hexanos) para dar el alcohol 13 (0.301 g, 95%, sólido blanco).
Ejemplo 6. Preparación de Ácido (/?)-4-{(5/?,8/?,9A,10A,13/?,1 V,17/?,Z)-3-(2-Etoxi-2- oxoetiliden)-10,13-dimetilhexa decahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il}- pentanoico (A.11-(Z))
Figure imgf000014_0002
Dicromato de piridinio (0.525 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 13 (0.200 g) en CH2CI2 (15 mL). La mezcla se agitó protegido de la luz y a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se diluyo con MTBE (10 mL), se filtró a vacio sobre una capa de celita y los sólidos se lavaron con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio. El resido (14) se disolvió en DMF (5 mL) y sobre esta disolución se añadió Oxone® (0.106 g). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (10 mL, 10%). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (15% AcOEt/hexanos) para dar A.ll (158 mg, 77%, aceite incoloro).
Ejemplo 7. Preparación de (£ 2-{(5/?,8/?,9A,10A,13/?,14A,17^)-1H(^)-5- hidroxipentan-2-il]-10,13-dimetilhexadeca hidro-3H-ciclopenta[a]fenantren-3-iliden}- acetato de etilo (15).
Figure imgf000015_0001
Una disolución de TBAF en THF (0.55 mL, 1M) se añadió sobre una disolución del ester 4b (0.200 g) en THF (10 mL). Después de 12 h, la reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa de NaCl (15 mL). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna (10% AcOEt/hexanos) para dar el alcohol 15 (0.147 g, 93%, sólido blanco).
Ejemplo 8. Preparación de Ácido (/?)-4-{(5/?,8/?,9A,10A,13/?,1 V,17/?,E)-3-(2-Etoxi-2- oxoetiliden)-10,13-dimetilhexa decahidro-lH-ciclopenta[a]fenentran-17-il}- pentanoico (A.ll-(E))
Figure imgf000015_0002
Dicromato de piridinio (0.525 g) se añadió a una disolución del alcohol 15 (0.20 g) en CH2CI2 (15 mL). La mezcla se agito protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se diluyo con MTBE (10 mL), se filtró a vacio sobre un lecho de celita y los sólidos se lavaron con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio y el residuo (16, 0.180 g) resultante se disolvió DMF. Sobre la disolución anterior se añadió Oxone® (0.085 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (10 mL, 10%) y la mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (20% AcOEt/hexanos) para dar A.ll (137 mg, 66%, sólido espumoso).
Ejemplo 9. Preparación de 2-{(3R,5R,SR,9S,l S,l3R,l4S,í7R)-l7-[(R)-5-(terc- Butildimetilsililoxi)pentan-2-il]-10,13-dimetilhexadecahidro-lH- ciclopenta[a]fenantren-3-il} acetato de Etilo (5a).
Figure imgf000016_0001
Pd/C (135 mg, 10% p/p) se añadió sobre una disolución de 4a (0.690 g) en AcOEt (20 mL). El sistema se purgo 3 veces vacio/hidrogeno. La mezcla se agitó bajo atmosfera de hidrógeno (globo de EL) durante 12 h. La mezcla se filtró a vacio sobre una capa de celita lavando AcOEt (20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio y el residuo resultante se purificó por cromatografía rápida en columna (10% AcOEt/hexanos) para dar el éster 5a (570 mg, 82%, aceite incoloro).
Ejemplo 10. Preparación de 2- {(3R,5R,8R^S, 1 OL', 13R, 1 V, 17R)- 17- | (fi)-5- hidroxipentan-2-il]-10,13-dimetilhexa decahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3- il} acetato de etilo (9)
Figure imgf000016_0002
Una disolución de TBAF en THF (1.1 mL, 1M) se añadió sobre una disolución de 5a (0.390 g) en TITF (10 mL). Después de 12 h, la reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl. La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (10% AcOEt/Hexanos) para dar el alcohol 9 (0.300 g, 0.699 mmol, 97%, solido blanco). Ejemplo 11. Preparación de Ácido (Y?)-4-[(3/?,5/?,8/?,9»S,10»y,13/?,1 V,17/?)-3-(2-Etoxi-
2-oxoetil)-10,13-dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]-pentanoico
(A.9)
Figure imgf000017_0001
Dicromato de piridinio (0.430 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 9 (0.165 g) en CH2CI2 (25 mL). La mezcla se agitó protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se diluyo en MTBE (10 mL) y se agito durante 15 min. La mezcla se filtró a vacio sobre un lecho de celita, lavando los sólidos con MTBE (3x20 mL) y los filtrados se concentraron. El residuo (10, 0.160 g) se disolvió en DMF (10 mi) y sobre esta disolución se añadió Oxone® (60 mg). Después de 3 h, la reacción se detuvo por adición de una disolución de HC1 (10 mL, 10%). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgáncia combianda se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (20% AcOEt/hexanos) para dar el ácido A.9 (120 mg, 70%, sólido blanco). Ejemplo 12. Preparación de l-{(3R,5R,SR,9S,1 S,13R,14S,17R)-17-[(R)-5-(íerc- Butildimetilsililoxi)pentan-2-il]-10,13-dimetilhexadecahidro-lH- ciclopenta[a]fenantren-3-il}-2-metilpropan-2-ol (6)
Figure imgf000017_0002
Una disolución de bromuro de metilmagnesio en THF (MeMgBr, 1.5 mL, 3 M) se añadió sobre una disolución del éster 5a (0.50 g) en THF (10 mL), enfriada a 0 °C. Después de 5 min, la mezcla se retiró del baño y se calentó a reflujo (65 °C) durante 3 h. La reacción se dejó venir a temperatura ambiente y se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (15 mL, 10%). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x15 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (5% AcOEt/hexanos) para dar el alcohol 6 (0.479 g, 98%, aceite incoloro).
Ejemplo 13. Preparación de (R)-4- 1 (3/?,5/?,8/?,9L', 1 OL', 13R, 14S, 17R)-3-(2- H id rox i-2- metilpropil)-10,13-dimetilhexa decahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentan-l-ol (7)
Figure imgf000018_0001
Una disolución de TBAF en THF (0.6 mL, 1M) se añadió sobre una disolución del éter de silicio 6 (0.226 g) en THF (1 mL). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 12 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl (5 mL). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida (15% AcOEt/hexanos) para dar el alcohol 7 (0.167 g, 94%, solido blanco).
Ejemplo 14. Preparación de Ácido (R)-4- [ (3R,5R,8R,9S, 1 OL', 13R, 14L', 17 R)-3-(2- hidroxi-2-metilpropil)-10,13-dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17- iljpentanoico (A.5)
Figure imgf000018_0002
Dicromato de piridinio (0.620 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 7 (0.230 g) en CH2CI2
(15 mL). La mezcla se agito protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 7 h. La mezcla resultante se diluyo con MTBE (20 mL) y se agitó 15 min. A continución, la mezcla se filtró a vacio sobre una lecho de celita, lavando los sólidos con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio y el residuo (8, 0.229 g) se disolvió en DMF (10 mi). Sobre la disolución anterior se añadió oxone® (0.125 g) y la mezcla se agito a temperatura ambiente 3 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl (10 mL) y la mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (15% AcOEt/hexanos) para dar el ácido 6 (0.180 g, 0.416 mmol, 76%, sólido blanco).
Ejemplo 15. Preparación de 2-{(3A,5 ?,8 ?,9A,10A,13 ?,14A,17 ?)-17-[( ?)-5- hidroxipentan-2-il]-10,13-dimetilhexadecahidro-lH-ciclopenta[a]fenentren-3-yl}- acetato de etilo (11)
Figure imgf000019_0001
Poli(metilhidroxisiloxano) (PMHS, 0.53 mL) y una disolución de /erc-butóxido de potasio en THF (KO/Bu, 0.41 mi) se añadieron sucesivamente sobre una suspensión de CuCl (38 mg) y (ó')-tol-BINAP (45 mg) en hexanos (8 mL). La mezcla se sónico durante 2h y luego se enfrió a -20 °C. A continuación, sobre la suspensión anterior se añadió vía canula una disolución del éster 4a (0.300 g) en /PrOH (0.170 mL) y hexanos (2 mL). Después de 3.5 h, la mezcla de reacción se retiro del baño y se dejo venir a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (15 mL, 10 %). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x20 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo
(5b y restos de PMHS) se disolvió en THF (10 mL) y sobre esta disolución se añadió HF
(0.5 mL, 48%). Transcurridas 12 h, la mezcla se vertió sobre una disolución acuosa saturada de NaHC03 (50 mL). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x25 mL). La fase orgánica combinada, se lavó con una disolución acuosa saturada de NaCl (20 mL), se secó, filtró y concentro. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (10%
AcOEt/Hexanos) para dar el alcohol 11 (0.220 g, 0.508 mmol, 92%, sólido blanco).
Ejemplo 16. Preparación de Ácido ( ?)-4-{(3A,5 ?,8 ?,9A,10A,13 ?,14A,17 ?)-3-(2-etoxi-2- oxoetil)-10,13-dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il}-pentanoico (A.10) Dicromato de piridinio (0.430 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 11 (0.165 g) en CH2CI2
(10 mL). La mezcla se agito protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 5 h. La mezcla de reacción se diluyo con MTBE (10 mL), se agitó durante 15 min y se filtró a través de un lecho de celita, lavando los sólidos con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron y el residuo resultante (12, 0.160 g) se disolvió en DMF (5 mL). A continuación, se añadió Oxone® (0.060 g) y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (10 mL, 10%). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentro. El residuo se purifico por cromatografía rápida en columna (15% AcOEt/hexanos) para dar A.10 (120 mg, 70%, sólido blanco).
Ejemplo 17. Preparación de (R)-4- [ (3.V,5fl,8fl,9.V, 1 OL', 13R, 14L', 17R)-3-(2- H id rox i-2- metilpropil)-10,13-dimetilhexa decahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentan-l-ol
Figure imgf000020_0001
Una disolución de bromuro de metilmagnesio en THF (1 mL) se añadió sobre una disolución, enfriada a 0 °C, del éster 11 (0.300 g) en THF (10 mL). Al cabo de 5 min, la mezcla de reacción se retiró del baño y se calentó a reflujo durante 3 h. Entonces, la reacción se dejó venir a temperatura ambiente y se detuvo por adición de una disolución acuosa de HC1 (15 mL, 5%). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x15 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purifico por cromatografía rápida en columna (15% AcOEt/hexanos) para dar el alcohol 17 (0.276 g, 0.659 mmol, 95%, sólido blanco). Ejemplo 18. Preparación de Ácido (/?)-4-[(3A,5/?,8/?,9A,10A,13/?,14A,17/?)-3-(2- Hidroxi-2-metilpropil)-10,13-dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]- pentanoico (A.6)
Figure imgf000021_0001
Dicromato de piridinio (PDC, 0.270 g) se añadió sobre una disolución del alcohol 17 (0.150 g) en CH2CI2 (15 mL). La mezcla de reacción se agitó protegida de la luz y a temperatura ambiente durante 7 h. A continuación, la mezcla se diluyó con MTBE (50 mL), se agitó 15 min y se filtró a vacio sobre un lecho de celita, lavando los sólidos con MTBE (3x20 mL). Los filtrados se concentraron a vacio y el residuo resultante (18, 0.149 g) se disolvió en DMF (10 mL). Sobre la disolución anterior se añadió Oxone (0.054 g) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La reacción se detuvo por adición de una disolución acuosa saturada de NaCl (10 mL). La mezcla se extrajo con AcOEt (3x10 mL). La fase orgánica combinada se secó, filtró y concentró. El residuo se purificó por cromatografía rápida en columna (15% AcOEt/hexanos) para dar el ácido 6 (120 mg, 0.277 mmol, 77%, sólido blanco).
Ejemplo 19. Pruebas in vitro
19.1. Métodos
19.1.1. Compuestos
1,25-Dihidroxivitamina D3 (1,25D) se adquirió en Cayman Europe (Tallinn, Estonia) y fue disuelta en etanol absoluto hasta una concentración de 1 mM.
Compuestos de la invención a testar: El compuesto A.9, preparado en el ejemplo 11, fue disuelto en etanol absoluto a una concentración de 20 mM, y los restantes compuestos testados (A.5 preparado en el ejemplo 14; A.6 preparado en el ejemplo 18; A.10 preparado en el ejemplo 16; A. l l-(Z) preparado en el ejemplo 6; A.11 -(E) preparado en el ejemplo 8) fueron disueltos en etanol absoluto a una concentración de 50 mM. 19.1.2. Células
Las células HL60 y HT-29 se obtuvieron de un banco de células local en el Instituto de Inmunología y Terapia Experimental en Wroclaw, Polonia. Las células fueron cultivadas en un medio RPMI 1640 y HT-29 cultivos adherentes en DMEM, ambos complementados con un 10% de suero fetal de ternera (FCS), penicilina 100 unidades/mL y sterptomicina 100 pg/mL (Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron cultivadas en atmósfera humedecida con un 95% de aire y un 5% de C02 a 37°C. El número y la viabilidad celular fueron determinados mediante conteos en un hematocitómetro y por exclusión de azul tripano. Las células fueron sembradas con una densidad de 2,5 x 105 células/mL en un medio de cultivo conteniendo 1,25D, un compuesto de la presente invención citado en el apartado 19.1.1. o el volumen equivalente de etanol como vehículo control.
19.1.3. Ensayo de afinidad por el VDR
La afinidad por el VDR fue determinada mediante un kit de ensayo competitivo del receptor de la vitamina D PolarScreen™ siguiendo las condiciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). La 1,25D y los compuestos ensayados fueron evaluados en el rango de concentraciones de 10 12-10 5 M. Los componentes del ensayo fueron incubados durante 4h a temperatura ambiente para permitir alcanzar el equilibrio. La fluorescencia polarizada de cada bandeja fue determinada por triplicado usando el lector multipocillo Envision (PerkinElmer, Waltham, MA) y el promedio de la polarización de fluorescencia fue calculada a partir de estas medidas. El ensayo completo se repitió tres veces. Los valores IC50 fueron calculados con el programa GraphPad Prism 7(GraphPad Software, San Diego CA) utilizando el promedio de los valores obtenidos.
19.1.4. Western blotting
Para obtener los extractos citosólicos y nucleares, 6x106 células/muestra fueron lavadas y disgregadas usando los reactivos de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER (Thermo Fisher Scientific Inc., Worcester, MA) siguiendo las condiciones del fabricante. Los Usados celulares fueron desnaturalizados mediante la adición del tampón de muestra cinco veces (con un volumen máximo correspondiente a 1/4 del volumen del Usado) y se llevó a ebullición durante 5 min. 20 pL de cada Usado fue separado mediante SDS-PAGE y electrodepositado sobre una membrana de PVDF. Las membranas se secaron y fueron incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios de peroroxidasa conjugada pez de herradura. Las bandas de proteína fueron visualizadas mediante quimioluminiscencia. Entonces las membranas fueron recortadas, secadas otra vez y ensayadas con anticuerpos subsecuentes.
19.1.5. Diferenciación celular y citometría de flujo
Las células fueron sembradas con una densidad de 15 x 104 células/mL en un medio de cultivo conteniendo 1 ,25D, un compuesto de la invención a testar según se indican en 19.1.1. o el volumen equivalente de etanol como vehículo control. Después de 96 h de incubación, las células fueron lavadas con PBS/0.1%BSA, y entonces incubadas durante 1 h, en baño de hielo, con 1 pL de CD14-PE y 2 pL CDl lb-APC (ImmunoTools, Friesoythe, Germany). Las células fueron lavadas y suspendidas en 350 pL de PBS/0.1%BSA antes de su análisis en un citómetro de flujo Becton Dickinson Accuri C6 (San José, CA). El análisis de datos fue realizado utilizando programas del Becton Dickinson Accuri C6. El ensayo se repitió de 3 a 5 veces. Los porcentajes de células positivas fueron impresos en los gráficos y los valores EC50 fueron calculados usando el software GraphPad Prism.
19.1.6. Síntesis de cDNA y PCR en tiempo real
ARN total fue aislado utilizando el reactivo EXTRAzol (BLIRT S.A., Gdahsk, Polonia) siguiendo las condiciones del fabricante. La cantidad de ARN fue determinada usando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc. Worcester, MA) y la calidad del ARN fue verificada por electroforesis de gel. EL ARN fue transcrito en ADN utilizando un kit "High Capacity cDNA Reverse Transcription" (Applied Biosystems, Foster City, CA).
PCR en tiempo real fue realizada utilizando el kit SensiFAST™ SYBR Hi-ROX (Bioline) en un sistema de detección "CFX Connect Real-Time PCR" (Bio-Rad Laboratories, Inc.). La secuencia de los primers de CYP24A1 fueron (fp): 5’-
CTC AT GCT AAAT ACCC AGGT G-3’ , (rp): 5’ -TCGCTGGC AAAACGCGAT GGG-3’ [1], los primers de CD14 fueron (fp): 5’- GTTCGGAAGACTTATCGACCATGGAGC-3’,
(rp): 5’-CAGACGCAGCGGAAATCTTCATC-3’ [2], TRPV6 (fp): 5’- TGT ACT TCG CCC GAG GAT TC-3’, (rp): 5’- ATA GAA GGC TGA AGC AAA GCC-3’, mientras que las secuencias de GAPDH fueron las siguientes: (fp): 5’-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3’, (rp): 5’-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3’ [3] Los cambios de magnitud en los niveles de mARN en los genes de CYP24A1 , CD14 o TRPV6 relacionados con el gen de GAPDH fueron calculados por análisis cuantitativo relativo.
19.1.7. Análisis de resultados
Los programas Microsoft Excel and Graphpad Prism 7 (San Diego, CA, USA) fueron usados para analizar los resultados. El análisis estadístico de t de Student de las diferencias entre muestras tratadas y no tratadas fue utilizado para determinar muestras independientes. Para verificar si las muestras tratadas con los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1., eran significativamente diferentes de las muestras tratadas con 1,25D, fueron empleados un análisis ANOVA unidireccional seguido de un análisis Dunnett adapatado.
19.2. Resultados
19.2.1. Afinidad de los compuestos por el VDR
La afinidad de los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1. por el receptor VDR fue determinada mediante un ensayo competitivo que utiliza polarización de fluorescencia. En este ensayo VDR humano recombinante se añade a un ligando fluorescente del VDR para formar un complejo, dando lugar a un gran valor de la polarización de fluorescencia. Entonces los compuestos a ensayar fueron añadidos al complejo en una bandeja de 386 pocilios. Los compuestos ensayados desplazan al ligando fluorescente del complejo, resultando un valor menor de polarización. La afinidad de los compuestos por el VDR fue ensayada con amplio rango de concentraciones y fue comparada con la 1,25D. Se debe mencionar que la afinidad por el VDR no pudo ser determinada para aquellos compuestos de la invención aplicados a concentraciones superiores a 10 5 M. Cuando los compuestos fueron ensayados en elevadas concentraciones, la curva concentración- respuesta es de forma de U en vez de ser sigmoidal. La causa probable se debe a la formación de asociación coloidal de los compuestos ensayados. La curva concentración-respuesta fue representada (presentada en la Figura 1), y los valores IC50 fueron calculados usando GraphPad Prism 7.
La afinidad por el VDR se compara con la 1,25D, para la cual la afinidad relativa de enlace (RBA) está normalizada a 100, y ha sido presentada en la Tabla 1. Tabla 1. Afinidades de los compuetos al VDR recombinante.
Figure imgf000025_0001
La afinidad por el VDR se expresa como IC50 y actividad porcentual. a La potencia de la 1,25D está normalizada a 100. RBA: afinidad relativa de enlace. ND: no detectada.
19.2.2. Translocación nuclear y acumulación de VDR en respuesta a los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1.
Dado que la acumulación nuclear del VDR y la actividad pro-diferenciadora estaban correlacionadas para análogos anteriormente ensayados, se estudió como los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1. influyen en los niveles de proteína VDR en células HL60 expuestas durante 24h a concentraciones 100 nM de análogos. Se analizaron los niveles de VDR en fracciones nucleares de las células. La proteína nuclear HDAC2 fue usada como control, como proteína que no cambia durante la diferenciación celular de HL60. La cantidad de VDR en el núcleo celular se había incrementado para 1,25D y para los compuestos A.5, A.6 y A.11-(Z) (Fig. 2).
19.2.3. Diferenciación de células HL60
Las células HL60 fúeron utilizadas para determinar la actividad pro-diferenciadora de los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1.. Después del barrido inicial, los rangos de concentración fueron establecidos para cada compuesto. La 1,25D se ensayó en concentraciones entre 0.032 nM - 100 nM, A.5, A.6 y A.l l-(Z) se ensayaron en concentraciones 0.032 nM - 500 nM, mientras que A.9, A.10 y A.l l-(E) fueron aplicados en concentraciones 4 mM - 50 pM. Las células fúeron expuestas a los compuestos durante 96 h y entonces la expresión del marcador de diferenciación monocito/macrófago CD14 y del marcador de diferenciación monocito/granulocito CDl lb fueron estudiados mediante citometría de flujo. Los porcentajes de células positivas a CD14- y CD1 Ib fueron registrados usando el software del Becton Dickinson Accuri C6. Los resultados son presentados en las Figuras 3A y 3B. Los valores EC50 fueron estimados de las curvas dosis-respuesta utilizando el software GraphPad Prism 7. Las relaciones molares efectivas (EMR) para cada análogo en comparación con la 1,25D para el antígeno para CD14 se representan en la Tabla 2 y para el antígeno para CD1 Ib en la Tabla 3. Tabla 2. Inducción de la expresión de CD14 por 1,25D y compuestos de la invención.
Figure imgf000026_0001
aLos valores de EC50 fueron estimados de la curva dosis-respuesta utilizando el programa GraphPad Prism 7. Los valores de EC50 fueron usados para calcular la relación molar efectiva (EMR). EMR=EC5o 1 ,25D/EC o compuesto. ND - no se puedo calcular (actividad no detectada).
Tabla 3. Inducción de la expresión de CD1 Ib por 1,25D y compuestos de la invención.
Figure imgf000026_0002
aLos valores de EC50 fueron estimados de la curva dosis-respuesta utilizando el programa GraphPad Prism 7. Los valores de EC50 fueron usados para calcular la relación molar efectiva (EMR). EMR=EC5o 1 ,25D/EC o compuesto. ND - no se puedo calcular (actividad no detectada).
19.2.4. Expresión de CYP24A1 en células HL60 en respuesta a 1,25D y compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1.
Las células HL60 fueron expuestas a 1,25D o a los compuestos de la invención a testar según se indican en 19.1.1. a concentraciones 1 nM, 10 nM and 100 nM durante 96h. Células control fúeron tratadas con un volumen equivalente de etanol (disolvente para todos los compuestos). Entonces el mARN fue aislado de las células, transcrito en cADN y la expresión de CYP24A1, el gen diana de VDR más fuertemente regulado, fue determinada en una PCR en tiempo real con relación al gen GAPDH. Los efectos de la exposición a 1 nM de los compuestos está representada en la Figura 4A, a 10 nM en la Figura 4B, y a 100 nM en la Figura 4C. Las expresiones, las cuales fueron significativamente superiores a las de las células control, están marcadas con asteriscos. Las expresiones, las cuales fueron significativamente superiores a las de las células expuestas a 1,25D, están marcadas con una almohadilla.
19.2.5. Expresión de CD14 en células HL60 en respuesta a 1,25D y compuestos de la invención.
Las células HL60 fueron expuestas a 1,25D o a los compuestos de la invención según se indica en 19.1.1. a concentraciones 1 nM, 10 nM and 100 nM durante 96h. Células control fueron tratadas con un volumen equivalente de etanol (disolvente para todos los compuestos). Entonces el mARN fue aislado de las células, transcrito en cADN y la expresión de CD14 fue determinada en una PCR en tiempo real con relación al gen GAPDH. El gen CD14 codifica una proteína de superficie celular presente en macrófagos, que es un co-receptor para LPS bacteriano. Los efectos de la exposición a 1 nM de los compuestos está representada en la Figura 5 A, a 10 nM en la Figure 5B, y a 100 nM en la Figura 5C. Las expresiones, las cuales fueron significativamente superiores a las de las células control, están marcadas con asteriscos.
A la vista de los resultados in vitro obtenidos podemos concluir que el compuesto A.5 es el más activo del grupo de derivados del ácido litocólico estudiados. Este compuesto es especialmente efectivo en la inducción de la diferenciación celular y en la expresión del gen diana del VDR a una concentración 10 nM.
19.2.6. Expresión de TRPV6 en células HT-29 en respuesta a 1,25D y compuestos de la invención.
Las células HT-29 se originaron en los intestinos. El intestino es un tejido importante para la absorción de calcio y fosfato. TRPV6, que se localiza en el borde del cepillo de las membranas de las células intestinales, es un mediador potencial de la absorción de calcio de la dieta. El gen que codifica este canal de calcio está directamente regulado por 1,25D mediante la activación de múltiples sitios de unión al receptor de la vitamina D. Así, en estos TI
experimentos, las células HT-29 se trataron con compuestos 1,25D o los compuestos de la invención a concentraciones de lOnM y lOOnM durante 96 horas. Las células control se trataron con un volumen equivalente de etanol (disolvente para los compuestos anteriores). Luego, se aisló el mARN de las células, se transcribió en cADN y se analizó la expresión de TRPV6 en PCR en tiempo real en relación con el gen GAPDH. Los efectos del tratamiento se encuentran en la Figura 6. Las expresiones que fueron significativamente más elevadas que en las celdas de control, están marcadas con asterisco. Las expresiones que fueron significativamente más altas que en las células tratadas con 1,25D están marcadas con almohadilla.

Claims

REIVIN DICACIONES
1.- Compuesto de fórmula (I), sus diastereoisómeros o sus enantiómeros
Figure imgf000029_0001
donde cada uno de R1, R2 y R3, se seleccionan independientemente de entre hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, alcoxilo, ariloxi, alquilcarboxi, arilcarboxi, heterociclo, -OSiRaRbRc, donde cada uno de Ra, Rb y Rc se seleccionan de entre alquilo, arilo, arilalquilo y heterociclo, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi.
2.- Compuestos de fórmula (I), según la reivindicación 1, donde Rl, R2 y R3 se seleccionan de entre hidrógeno, hidroxialquilo, hidroxialquenilo, carboxialquilo y carboxialquenilo, o Rl y R2 pueden formar conjuntamente un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi.
3.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde
R2 es hidrógeno y Rl se selecciona de entre hidroxialquilo, heteroalquilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, carboxialquilo, carboxialquenilo, heteroalquenilo y hidroxialquenilo.
4.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R2 es hidrógeno y Rl se selecciona de entre hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, hidroxi(terc-butilo), carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo.
5.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R2 es hidrógeno y Rl es hidroxi(terc-butilo).
6.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 es hidrógeno y R2 se selecciona de entre hidroxialquilo, heteroalquilo, arilalquilo, alquiladlo, arilacilo, carboxialquilo, carboxialquenilo, heteroalquenilo y hidroxialquenilo.
7.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 es hidrógeno y R2 se selecciona de entre hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, hidroxi(terc-butilo), carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo.
8.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 es hidrógeno y R2 es hidroxi(terc-butilo).
9.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 y R2 conjuntamente forman un grupo metileno sustituido por un grupo seleccionado de entre hidroxialquilo, hidroxialquenilo y alquilcarboxi.
10.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R1 y R2 conjuntamente forman un grupo metileno sustituido por un grupo alquilcarboxi.
11.- Compuestos de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R3 se selecciona de entre alquilo, alquenilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, ardo, heteroarilo, arilalquilo, hidroxialquilo y carboxialquilo.
12.- Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones anteriores seleccionado de entre:
Ácido (R)-4-{(5R,SR,9S, lOÓ*, 137?, 140*, 17f?,Z)-3-(2-Etoxi-2-oxoetiliden)-10, 13-dimetilhexa decahidro- 1 H-ciclopenta[a]fenantren- 17-il } -pentanoico,
Ácido (i?)-4- {(57?, 87?, 95”, 1 OS, 137?, 140*, 177?, £)-3-(2-Etoxi-2-oxoetiliden)- 10, 13-dimetilhexa decahidro- 1 H-ciclopenta[a]fenantren- 17-il } -pentanoico,
Ácido (i?)-4-[(3i?, 57?, 87?, 95”, 105”, 137?, 145”, 17R)-3 -(2-Etoxi-2-oxoetil)- 10,13- dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]-pentanoico,
Ácido (i?)-4-[(3i?,5i?,8i?,9ó,,10ó',13i?,14ó',17i?)-3-(2-hidroxi-2-metilpropil)-10,13- dimetilhexadeca-hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il)pentanoico, Ácido (i?)-4- { (3S, 5R, 87?, 9S, 1 OS, 137?, 14S, 177?)-3 -(2-etoxi-2-oxoetil)- 10,13 -dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il}-pentanoico, y
Ácido (R)-4-[(3S,5R,SR,9S, 105”, 137?, 145”, 177?)-3-(2-Hidroxi-2-metilpropil)-10, 13- dimetilhexadeca hidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-17-il]-pentanoico.
13.- Composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en medicina.
15.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de trastornos del metabolismo del calcio y del fósforo, osteoporosis, osteodistrofia renal, osteomalacia, enfermedades cutáneas hiperproliferativas, eczema, dermatitis, miopatía, leucemia, osteosarcomas, carcinomas escamososos, melanomas, desórdenes inmmunológicos y en el rechazo a transplantes.
16.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento del cáncer.
17.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de cáncer de mama, colon y próstata.
18.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune.
19.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de psoriasis.
20.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune.
21.- Compuesto de fórmula (I), según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en el tratamiento de psoriasis.
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