WO2020116331A1 - 改変型菊酸エステラーゼ - Google Patents

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WO2020116331A1
WO2020116331A1 PCT/JP2019/046690 JP2019046690W WO2020116331A1 WO 2020116331 A1 WO2020116331 A1 WO 2020116331A1 JP 2019046690 W JP2019046690 W JP 2019046690W WO 2020116331 A1 WO2020116331 A1 WO 2020116331A1
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amino acid
substitution
mutation point
mutation
sequence
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PCT/JP2019/046690
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English (en)
French (fr)
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篤 大野
和典 吉田
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to modification of an enzyme (chrysanthemic acid esterase) that exhibits a hydrolytic activity on ethyl chrysanthemate. More specifically, it relates to a modified chrysanthemate esterase with altered stereoselectivity and its use.
  • Chrysanthemic acid is widely used as a synthetic raw material for synthetic pyrethroid insecticides. Chrysanthemic acid has four isomers ((1R,3R)-chrysanthemic acid, (1R,3S)-chrysanthemic acid, (1S,3S)-chrysanthemic acid and (1S,3R)-chrysanthemic acid). , (1R,3R)-Chrysanthemic acid has the highest insecticidal activity. Industrially, chrysanthemic acid is produced using a chemical synthesis method. On the other hand, chrysanthemic acid is also produced by enzymatic reaction by utilizing chrysanthemic acid esterase.
  • Patent Document 1 describes that Arthrobacter globiformis-derived esterase specifically decomposes chrysanthemic acid ethyl ester by 1R,3R ((+)-trans) (Table 1).
  • Non-Patent Document 2 describes that, as the insecticidal effect of each isomer of chrysanthemic acid, 1R,3R ((+)-trans) and 1R,3S ((+)-cis) show different insecticidal effects.
  • Non-Patent Document 3 is a research report on the degradation of chrysanthemic acid ethyl ester by esterase derived from Arthrobacter globiformis, and the stereoselectivity is changed by a specific mutation (K62R mutation) (reaction to (1S,3R)-ethyl chrysanthemate). Shows the sex).
  • (1R,3S)-chrysanthemic acid also has insecticidal activity and is useful as such.
  • the enzyme that efficiently produces (1R,3S)-chrysanthemic acid that is, the esterase with high selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate
  • (1R,3S)-Chrysanthemic acid was obtained by selective hydrolysis and subsequent optical resolution (purification by chiral column).
  • an object of the present invention is to provide an esterase useful for producing (1R,3S)-chrysanthemic acid.
  • the present inventors tried to modify the stereoselectivity of the esterase derived from Arthrobacter globiformis by a protein engineering method.
  • the esterase is specific to (1R,3R)-ethyl chrysanthemate and practically cannot be used for the production of (1R,3S)-chrysanthemic acid.
  • the mutant (A328G/A221F) in which two amino acids have been substituted is an enzyme that acts specifically on (1R,3S)-ethyl chrysanthemate, and its utility and utility value are extremely high.
  • the mutation A328G also included in the mutant is an important mutation that can be said to define the stereoselectivity of the substrate.
  • Modified esterase with improved (1) the mutation point is F58, the amino acid after substitution is E, I, C, A, M or Y; (2) the mutation point is D227, the amino acid after substitution is I, S, A, W, H, G, F or V; (3) The mutation point is I228, the amino acid after substitution is Y, S, T or W; (4) The mutation point is L229, the amino acid after substitution is Y, F or V; (5) The mutation point is L231, the amino acid after substitution is M, A or G; (6) The mutation point is S244, the amino acid after substitution is F; (7) The mutation point is A245, the amino acid after substitution is N or G; (8) the mutation point is V297, the amino acid after substitution is R, W, Q, A or I; (9) The mutation point is F298, the amino acid after substitution is S; (10) The mutation point is A328, the amino acid after substitution is N; (11) The mutation point is A328, the amino acid after substitution is G; (12) The mutation points are A328 and F
  • the amino acid after substitution of (1) is E, I, C, A or M
  • the amino acid after substitution in (2) is I, S, A, W, H or G
  • the amino acid after substitution of (3) is Y or S
  • the amino acid after substitution in (4) is Y or F
  • the amino acid after substitution of (5) is M or A
  • the amino acid after substitution of (8) is R, W or Q
  • the amino acid after substitution of the mutation point F58 in (12) is L
  • the amino acid after substitution of the mutation point L151 of (13) is Q or R
  • (14) the amino acid after substitution of the mutation point F217 is W, G, A, D, T, R or E
  • the amino acid after substitution of the mutation point S220 of (15) is Q or L
  • (16) the amino acid after substitution of the mutation point A221 is F, M, L, V, E, R or G
  • the modified esterase according to [1], wherein the amino acid after substitution of the mutation point L229 in (19) is R, V or I.
  • the amino acid after substitution of (4) is Y
  • the amino acid after substitution in (5) is M
  • the amino acid after substitution of (8) is R or W
  • the amino acid after substitution of the mutation point L151 in (13) is Q
  • Amino acid after substitution of the mutation point F217 of (14) is W, G, A, D or T
  • the modified esterase according to [1] wherein the amino acid after substitution of the mutation point A221 in (16) is F, M, L, V, E or R.
  • the modified esterase according to [1] wherein the amino acid substitution is any one of (11) to (23) and the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate is improved. ..
  • [15] A microorganism having the recombinant DNA according to [14].
  • [17] A method for preparing a modified esterase, which includes the following steps (I) to (III): (I) a step of preparing a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the modified esterase according to any one of [1] to [11]; (II) expressing the nucleic acid, and (III) recovering the expression product.
  • modified esterase is an enzyme obtained by modifying or mutating a reference esterase (hereinafter referred to as "reference esterase”).
  • reference esterase is typically an esterase from Arthrobacter globiformis having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • amino acid substitution is performed as modification or mutation. Therefore, when comparing the modified esterase with the reference esterase, some amino acid residues differ.
  • the modified esterase is also referred to as modified enzyme or mutant.
  • each amino acid is represented by a single letter as follows, according to the convention.
  • F glutamic acid: E, tryptophan: W, lysine: K, cysteine: C, arginine: R, glycine: G, histidine: H
  • the position of the mutation point is specified by the number assigned from the N-terminal to the C-terminal, with the N-terminal amino acid residue as the first position.
  • the mutation due to amino acid substitution is one character representing the amino acid residue before the substitution, the number representing the mutation point (the position of the amino acid residue where the amino acid substitution occurs), and the one character representing the amino acid residue after the substitution.
  • a mutation in which alanine at position 328 is replaced with glycine is expressed as "A328G”.
  • the symbol "/" is used to represent a combination (combination) of two mutations.
  • a combination of a mutation in which alanine at position 328 is replaced with glycine and a mutation in which alanine at position 221 is replaced with phenylalanine are expressed as “A328G/A221F”.
  • the first aspect of the present invention relates to a modified esterase (modified enzyme).
  • the modified enzyme of the present invention typically has an amino acid sequence containing one or more specific amino acid substitutions (mutations) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Due to this feature, the reactivity or selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanate or both of them are improved as compared with the esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the sequence of Arthrobacter globiformis-derived esterase).
  • Reactivity to (1R,3S)-ethyl chrysanthemate means an optical isomer of (1R,3S)-ethyl chrysanthemate ((1R,3R)-ethyl chrysanate, (1S,3S)-ethyl chrysanate, The expression also includes the reactivity (relative reactivity) when compared with the reactivity for (1S,3R)-ethyl chrysanthemate.
  • improved of reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanthemate means improvement of selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate, increase of activity against (1R,3S)-ethyl chrysanthemate, ( 1R,3S)-Ethyl chrysanate caused by decreased activity towards optical isomers ((1R,3R)-ethyl chrysanate, (1S,3S)-ethyl chrysanate, (1S,3R)-ethyl chrysanthe) Be done.
  • Arthrobacter globiformis-derived esterase has a high selectivity for (1R,3R)-ethyl chrysanthemate, and four optical isomers ((1R,3R)-ethyl chrysanthemate, When (1R,3S)-ethyl chrysanthe, (1S,3S)-ethyl chrysanthe, (1S,3R)-ethyl chrysanthe) coexist, (1R,3R)-ethyl chrysanthe is preferentially hydrolyzed. To do. Therefore, usually, only (1R,3R)-chrysanthemic acid is detected as the product.
  • the wild-type enzyme also has a hydrolytic activity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate, but its reaction rate is overwhelmingly higher than that for (1R,3R)-chrysanthemic acid. Since it is extremely slow, it does not apparently react with (1R,3S)-ethyl chrysanate in the presence of (1R,3R)-ethyl chrysanthemate. On the other hand, when (1R,3S)-ethyl chrysanthemate is reacted alone as a substrate, the product (1R,3S)-chrysanthemic acid is detected.
  • the "ratio (%) of the amount of (1R,3S)-chrysanthemic acid produced to the wild-type enzyme in the reaction using (1R,3S)-ethyl chrysanthemate (single substrate)” is defined as “mixed substrate”.
  • “(1R,3S)-reactivity to ethyl chrysanthemate” is evaluated by a value divided by the ratio (% of the amount of (1R,3R)-chrysanthemic acid to the wild-type enzyme in the reaction using), When the value exceeds 1, it is judged that the “reactivity to (1R,3S)-ethyl chrysanthemate” is improved.
  • the value is 2.0 or more, and the degree of reactivity improvement is high. In a more preferable modified enzyme, the value is 3.0 or more, and the reactivity is further improved.
  • the wild-type enzyme is an enzyme before modification, that is, a reference esterase.
  • the wild-type enzyme has high selectivity for (1R,3R)-ethyl chrysanthemate, and when reacted with a mixed substrate, (1R,3S)-chrysanthemic acid is not detected (substantially Not generated).
  • a mutant (A328G mutant) in which the 328th amino acid alanine of the wild-type enzyme was replaced with glycine had improved selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate, Even when it was reacted with a mixed substrate, it showed hydrolytic activity to (1R,3S)-ethyl chrysanthemate and production of (1R,3S)-chrysanthemic acid was observed. Therefore, in the present application, the A328G mutant is used for evaluation of “selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate”.
  • the “ratio (%) of the amount of (1R,3S)-chrysanthemic acid produced in the reaction using the mixed substrate to the A328G mutant” was calculated as “(1R,3R) in the reaction using the mixed substrate”.
  • “Selectivity for ((1R,3S)-ethyl chrysanthemate”” is evaluated by the value obtained by dividing by “ratio (%) of production amount of chrysanthemic acid to A328G mutant”. When the value is 1 or more, the selectivity is equal to or higher than that of the A328G mutant, and it is determined that the “selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanate” is improved.
  • the value is 1.5 or more, and the degree of selectivity improvement is high. In a more preferable modified enzyme, the value is 2.0 or more, and the selectivity is further improved.
  • the amount of (1R,3R)-chrysanthemic acid produced is below the detection limit, that is, when (1R,3R)-chrysanthemic acid is not substantially produced, ⁇ in the reaction using the mixed substrate ( The ratio of the amount of (1R,3R)-chrysanthemic acid produced to the mutant of A328G mutant was zero, and the above value cannot be calculated. It can be said that the modified enzyme (which corresponds to the A328G/A221F mutant) that produces such a result is specific to (1R,3S)-ethyl chrysanate.
  • “including amino acid substitution” means that the mutation point (that is, the position of an amino acid residue at which a specific amino acid substitution occurs) is the amino acid after substitution. Therefore, when the amino acid sequence containing an amino acid substitution (mutant amino acid sequence) is compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 containing no amino acid substitution (reference amino acid sequence), a difference in amino acid residue is recognized at the position of the amino acid substitution. It will be.
  • amino acid substitutions (mutation points and post-substitution amino acids) that are included in the modified enzyme of the present invention and bring about improved reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanate are listed below.
  • (11) to (23) are more preferable because they improve not only reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanate but also selectivity with respect to (1R,3S)-ethyl chrysanate.
  • the mutation point is F58 and the amino acid after substitution is E, I, C, A, M or Y.
  • the amino acid after substitution is E, I, C, A or M.
  • the mutation point is D227 and the amino acid after substitution is I, S, A, W, H, G, F or V.
  • the amino acid after substitution is I, S, A, W, H or G. More preferably, the amino acid after substitution is I, S, A, W or H.
  • the mutation point is I228 and the amino acid after substitution is Y, S, T or W.
  • the amino acid after substitution is Y or S.
  • the mutation point is L229, and the substituted amino acid is Y, F, or V.
  • the amino acid after substitution is Y or F. More preferably, the amino acid after substitution is Y.
  • the mutation point is L231 and the amino acid after substitution is M, A or G. Preferably, the amino acid after substitution is M or A. More preferably, the amino acid after substitution is M.
  • the mutation point is S244 and the amino acid after substitution is F.
  • the mutation point is A245, the amino acid after substitution is N or G (8)
  • the mutation point is V297 and the amino acid after substitution is R, W, Q, A or I.
  • the amino acid after substitution is R, W or Q. More preferably, the amino acid after substitution is R or W.
  • the mutation point is F298 and the amino acid after substitution is S.
  • the mutation point is A328 and the amino acid after substitution is N.
  • the mutation point is A328 and the amino acid after substitution is G.
  • the mutation points are A328 and F58, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after substitution of the mutation point F58 is L or E.
  • the amino acid after substitution at the mutation point F58 is L.
  • the mutation point is A328 and L151, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, the amino acid after substitution of the mutation point L151 is Q, R, H, W, A, V, M, N, C, T or I.
  • the amino acid after substitution at the mutation point L151 is Q or R.
  • the amino acid after substitution at the mutation point L151 is Q.
  • the mutation points are A328 and F217, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acids after substitution of the mutation point F217 are W, G, A, D, T, R, E, V or Y.
  • the amino acid after substitution of the mutation point F217 is W, G, A, D, T, R or E. More preferably, the amino acid after substitution at mutation point F217 is W, G, A, D or T.
  • the mutation points are A328 and S220, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after substitution of the mutation point S220 is Q, L, N or G.
  • the amino acid after substitution at the mutation point S220 is Q or L.
  • the mutation points are A328 and A221, the amino acid after the substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acids after the substitution of the mutation point A221 are F, M, L, V, E, R, G or S.
  • the amino acid after substitution of the mutation point A221 is F, M, L, V, E, R or G. More preferably, the amino acid after substitution of the mutation point A221 is F, M, L, V, E or R.
  • the mutation points are A328 and D227, the amino acid after the substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after the substitution of the mutation point D227 is E or C.
  • the mutation points are A328 and I228, the amino acid after the substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after the substitution of the mutation point I228 is L or G.
  • the mutation points are A328 and L229, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after substitution of the mutation point L229 is R, V, I or H.
  • the amino acid after substitution of the mutation point L229 is R, V or I.
  • the mutation points are A328 and V297, the amino acid after the substitution of the mutation point A328 is G, and the amino acid after the substitution of the mutation point V297 is C or L.
  • the mutation points are A328, A221, and D326, the amino acid after substitution of the mutation point A328 is G, the amino acid after substitution of the mutation point A221 is F, and the amino acid after substitution of the mutation point D326 is V.
  • the mutation point is A328, A221, D326, F298 and N222
  • the amino acid after the substitution of the mutation point A328 is G
  • the amino acid after the substitution of the mutation point A221 is F
  • the amino acid after the substitution of the mutation point D326 is V
  • the mutation The amino acid after substitution at the point F298 is L
  • the amino acid after substitution at the mutation point N222 is D.
  • an esterase consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2 to 11 (in order, a mutant containing the amino acid substitution A328G of (11), and one of the amino acid substitutions of (14) A mutant containing A328G/F217W, (16) a mutant containing A328G/A221F which is one of the amino acid substitutions, (16) a mutant containing A328G/A221M which is one of the amino acid substitutions of (16), (16) A mutant containing A328G/A221L which is one of the amino acid substitutions, a mutant containing A328G/A221V which is one of the amino acid substitutions of (16), and A328G/I228L which is one of the amino acid substitutions of (18) Mutant containing, (21) A328G / A221F / D326V is a variant containing one of the amino acid substitutions, (22) One of the amino acid substitutions A328G / A22121F / D326V is a variant
  • these mutants have particularly improved selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate.
  • the A328G/A221F mutant acts specifically on (1R,3S)-ethyl chrysanate and is particularly useful.
  • A328G/A221F/D326V mutant, A328G/A221F/D326V/F298L mutant, and A328G/A221F/D326V/F298L/N222D mutant is (1R,3S)-reactive in addition to selectivity for ethyl chrysanate. Very expensive and extremely useful.
  • the mutated protein may have the same function as the pre-mutation protein. That is, the amino acid sequence mutation does not substantially affect the protein function, and the protein function may be maintained before and after the mutation.
  • the amino acid sequences of the two proteins have a high degree of identity, it is highly probable that they will exhibit the same characteristics.
  • the amino acid sequence of the modified enzyme that is, "in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence containing any of the amino acid substitutions (1) to (23) (the amino acid sequence) Is not completely identical (that is, 100% identity) with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 11), but has an amino acid sequence showing a high degree of identity and has a desired property change.
  • the enzyme is substantially the same as the modified enzyme (substantially the same esterase).
  • the identity here is 60% or more, 70% or more, 80% or more, 82% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, 98%, or 99% or more. The higher the identity, the better. Therefore, in the most preferred embodiment, the identity is 99% or more.
  • the amino acid sequence difference occurs at a position other than the position where the above amino acid substitution is made. Therefore, for example, if the identity criterion is the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, a position other than position 328 G, and if the identity criterion is the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, a position other than positions 328 G and 217 W, If the identity criterion is the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, a position other than 328th position G and 221nd position F, and if the identity criterion is the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, a position other than 328th position G and 221st position M, If the identity criterion is the amino acid sequence of SEQ ID NO:6, a position other than 328th position G and 221st position L, and if the identity criterion is the amino acid sequence difference.
  • the amino acid at position 328 is G.
  • the amino acid at position 328 is G and the amino acid at the 217-position is W
  • the amino acid sequence showing the above-mentioned identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is 328.
  • the amino acid at position G is 221 and the amino acid at position 221 is F.
  • amino acid at position 328 is G and the amino acid at position 221 is M.
  • amino acid at position 328 is G and the amino acid at position 221 is L.
  • amino acid at position 328 is G and amino acid at position 221 is V.
  • the amino acid at position 328 is G, the amino acid at the 228th position is L, and the amino acid sequence showing the above-mentioned identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is 328.
  • the amino acid at position G is G
  • the amino acid at position 221 is F
  • the amino acid at position 326 is V.
  • amino acid at position 328 is G
  • amino acid at position 221 is F
  • amino acid at position 326 is V.
  • Is V and the amino acid at position 298 is L.
  • amino acid at position 328 is G
  • amino acid at position 221 is F
  • amino acid at position 326 is V
  • amino acid at position 298 is L.
  • the amino acid at position 222 is D.
  • the slight difference in the amino acid sequence here occurs due to deletion, substitution, addition, insertion of amino acids, or a combination thereof.
  • a deletion or substitution of 1 to several amino acids (upper limit is, for example, 3, 5, 7, 10) constituting the amino acid sequence, or 1 to several amino acids (upper limit is for example 3, It means that the amino acid sequence is mutated (changed) by the addition, insertion, or combination of these (5, 7, 10) amino acids.
  • “Slight differences in amino acid sequence” preferably result from conservative amino acid substitutions.
  • conservative amino acid substitution refers to substituting an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain with similar properties.
  • An amino acid residue has a basic side chain (for example, lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (for example, aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine) depending on its side chain.
  • a basic side chain for example, lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain for example, aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine
  • Cysteine non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, Tryptophan, histidine) and are classified into several families.
  • Conservative amino acid substitutions are preferably those between amino acid residues within the same family.
  • the active residues of Arthrobacter globiformis-derived esterase (SEQ ID NO: 1) are known to be the 59th amino acid serine, the 325th amino acid histidine, and the 326th amino acid aspartic acid. It is advisable not to affect the acid residues.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two base sequences can be determined by the following procedure, for example.
  • the two sequences are aligned for optimal comparison (eg, a gap may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence).
  • a gap may be introduced in the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • Gapped BLAST described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402 can be used.
  • the default parameters of the corresponding program for example, XBLAST and NBLAST
  • the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that is, the esterase derived from Arthrobacter globiformis is mutated (amino acid substitution of any one of (1) to (23) above) to give the modified enzyme of the present invention.
  • the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated (amino acid substitution of any one of (1) to (23) above), and further mutated.
  • the term “equivalent mutation” used herein refers to a mutation point (mutation point in amino acid substitution of any of (1) to (23) above) of the present invention in an amino acid sequence having high identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid residue corresponding to the amino acid residue will be replaced.
  • an esterase having an amino acid sequence having a high identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 an esterase derived from Arthrobacter sp. Rue61a and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 (81% identity in amino acid sequence) is given. be able to.
  • the term “corresponding” when used for amino acid residues means that proteins (enzymes) to be compared make an equivalent contribution to the exertion of their functions.
  • the amino acid sequence to be compared with the amino acid sequence of the reference esterase (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) is arranged so that optimal comparison can be performed while considering partial homology of the primary structure (amino acid sequence).
  • the amino acid at the position corresponding to the specific amino acid in the reference amino acid sequence should be identified as the “corresponding amino acid”.
  • You can The “corresponding amino acid” can be specified by comparison of the three-dimensional structures (three-dimensional structures) instead of or in addition to the comparison of the primary structures.
  • the three-dimensional structure information of the mutation target enzyme can be obtained from, for example, Protein Data Bank (http://www.pdbj.org/index_j.html).
  • Crystallize protein Crystallization is indispensable for determining the three-dimensional structure, but it is also industrially useful as a method for purifying proteins with high purity and a method for preserving high-density and stable proteins. In this case, it is advisable to crystallize a protein bound with a substrate or its analog compound as a ligand.
  • the prepared crystal is irradiated with X-ray to collect diffraction data. In many cases, protein crystals are damaged by X-ray irradiation and their diffractive ability deteriorates.
  • phase information is required in addition to the diffraction data.
  • the heavy atom isomorphous substitution method is a method in which a metal atom having a large atomic number such as mercury or platinum is introduced into a crystal, and phase information is obtained by utilizing the contribution of the large X-ray scattering ability of the metal atom to X-ray diffraction data. ..
  • the determined phase can be improved by smoothing the electron density in the solvent region in the crystal. Since the water molecules in the solvent region have large fluctuations, the electron density is hardly observed. Therefore, by approximating the electron density in this region to 0, the true electron density can be approximated and the phase can be improved. ..
  • the phase is further significantly improved by averaging the electron densities of these molecules.
  • the model of the protein is fitted to the electron density map calculated using the phase thus improved.
  • This process is performed on computer graphics using a program such as QUANTA of MSI (USA).
  • the structure is refined using a program such as X-PLOR manufactured by MSI, and the structural analysis is completed.
  • Molecular replacement and structure refinement can be performed using programs such as CNS_SOLVE ver.11.
  • the second aspect of the present invention provides a nucleic acid related to the modified enzyme of the present invention. That is, a gene encoding a modified enzyme, a nucleic acid that can be used as a probe for identifying a nucleic acid that encodes a modified enzyme, and a primer that is used to amplify or mutate a nucleic acid that encodes a modified enzyme.
  • the gene encoding the modified enzyme is typically used for preparing the modified enzyme. According to the genetic engineering preparation method using the gene encoding the modified enzyme, it is possible to obtain the modified enzyme in a more homogeneous state. Further, the method can be said to be a suitable method even when a large amount of modified enzyme is prepared.
  • the use of the gene encoding the modified enzyme is not limited to the preparation of the modified enzyme.
  • the nucleic acid can be used as an experimental tool for elucidating the action mechanism of a modified enzyme, or as a tool for designing or producing a further modified form of the enzyme.
  • the term "gene encoding a modified enzyme” refers to a nucleic acid that yields the modified enzyme when expressed, and has a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the modified enzyme. It includes not only nucleic acid but also nucleic acid in which a sequence that does not encode an amino acid sequence is added to such nucleic acid. Also, degeneracy of codons is considered.
  • sequences (base sequences) of genes encoding modified enzymes are shown in SEQ ID NOs: 13 to 22. These sequences encode the variants shown in the Examples below, as described below.
  • a sequence (signal sequence) encoding a signal peptide may be added to the 5'end of the above sequence (any of SEQ ID NOs: 13 to 22).
  • the signal sequence may be selected depending on the host. Any signal sequence capable of expressing the desired mutant can be used in the present invention.
  • a sequence encoding the ⁇ -factor signal peptide (Protein Engineering, 1996, vol9, p.1055-1061), a sequence encoding the ⁇ -factor receptor signal peptide, the SUC2 protein signal peptide Coding sequence, PHO5 protein signal peptide coding sequence, BGL2 protein signal peptide coding sequence, AGA2 protein signal peptide coding sequence, TorA (trimethylamine N-oxidoreductase) signal peptide coding sequence , A sequence encoding a signal peptide of PhoD (phosphoesterase) derived from Bacillus subtilis, a sequence encoding a signal peptide of LipA (lipase) derived from Bacillus subtilis, a sequence encoding a signal peptide of Takaamylase derived from Aspergillus oryzae ( JP-A-2009-60804), a sequence encoding a signal peptide of ⁇ -amylase derived from Bacill
  • nucleic acid of the present invention by referring to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing, by using standard genetic engineering techniques, molecular biology techniques, biochemical techniques, chemical synthesis, etc., It can be prepared in an isolated state.
  • nucleic acids when compared with the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention, the functions of the protein encoded by it are equivalent, but some of the nucleic acids have different base sequences (hereinafter, Also referred to as “homologous nucleic acid.”
  • a base sequence defining a homologous nucleic acid is also referred to as “homologous base sequence”.
  • the modified enzyme DNA encoding a protein having an enzyme activity characteristic of (i.e., esterase activity) can be mentioned.
  • Substitutions or deletions of bases may occur at multiple sites.
  • the term "plurality" as used herein depends on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid, but is, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases. Is.
  • the homologous nucleic acid is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, still more preferably about 90% or more, still more preferably, with respect to the reference nucleotide sequence.
  • the homologous nucleic acid as described above is, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease or DNA ligase, position-directed mutagenesis method (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) or random sudden Mutation introduction method (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter13,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) can be used to obtain mutations.
  • the homologous nucleic acid can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • Another aspect of the present invention relates to a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention. Still another aspect of the present invention is at least about 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the nucleotide sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention, or the nucleotide sequence complementary thereto, Provided is a nucleic acid having a nucleotide sequence which is 99% and 99.9% identical.
  • Yet another aspect of the present invention is a nucleic acid having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention or a homologous base sequence thereof.
  • stringent conditions here are conditions under which so-called specific hybrid is formed and non-specific hybrid is not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art, and for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory,Press New York) and Current protocol b in (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987). Can be set by referring to.
  • hybridization solution 50% formamide, 10 x SSC (0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0), 5 x Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, denaturation of 10 ⁇ g/ml
  • 5 x Denhardt solution 1% SDS
  • 10% dextran sulfate denaturation of 10 ⁇ g/ml
  • salmon sperm DNA 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)
  • washed at about 65°C to about 70°C using 0.1 x SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • More preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide as a hybridization solution, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g/ml.
  • the conditions using the denatured salmon sperm DNA of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) can be mentioned.
  • nucleic acid having a part of a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a base sequence complementary thereto.
  • a nucleic acid fragment can be used for detecting, identifying, and/or amplifying a nucleic acid having a nucleotide sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • a nucleic acid fragment is, for example, a nucleotide portion (for example, about 10 to about 100 bases in length, preferably about 20 to about 100 bases in length, more preferably about 30 to about 10 in the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid fragment can be labeled.
  • labeling for example, a fluorescent substance, an enzyme, or a radioisotope can be used.
  • Yet another aspect of the present invention relates to a recombinant DNA containing the gene of the present invention (a gene encoding a modified enzyme).
  • the recombinant DNA of the present invention is provided in the form of a vector, for example.
  • the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and the type of host cell.
  • a vector using E. coli as a host pET21 or its modified form, M13 phage or its modified form, ⁇ phage or its modified form, pBR322 or its modified form (pB325, pAT153, pUC8, etc.), etc.
  • Examples thereof include pYepSec1, pMFa, pYES2, pPIC3.5K and the like, vectors such as pAc and pVL for insect cell hosts, and pCDM8 and pMT2PC for mammalian cell hosts.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • the “expression vector” refers to a vector that can introduce the nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and can be expressed in the cell.
  • the expression vector usually contains a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence for promoting the expression, and the like.
  • Expression vectors containing selectable markers can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence (and the degree thereof) of the introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. can be carried out by standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold). Spring Harbor Laboratory Press, New York can be referred to, and known methods using restriction enzymes and DNA ligases) can be used.
  • microorganisms such as Aspergillus oryzae (for example, Aspergillus oryzae), Bacillus bacterium (for example, Bacillus subtilis), Escherichia coli (Escherichia coli), budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) and the like are used as the host cells.
  • Bacillus bacterium for example, Bacillus subtilis
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • budding yeast Sacharomyces cerevisiae
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli BL21(DE3) when a T7 promoter is used, and Escherichia coli JM109 otherwise.
  • the budding yeast examples include budding yeast SHY2, budding yeast AH22 and budding yeast INVSc1 (Invitrogen).
  • microorganism that is, a transformant
  • the microorganism of the present invention can be obtained by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • calcium chloride method Frnal of Molecular Biology (J. Mol.Biol.), 53, p. 159 (1970)
  • Hanahan method Journal of Molecular Biology, 166, 557. Page (1983)
  • SEM method Gene, Volume 96, Page 23 (1990)
  • Chung's method Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86th
  • microorganism of the present invention can be used for producing the modified enzyme of the present invention.
  • the modified enzyme of the present invention is provided in the form of an enzyme preparation, for example.
  • the enzyme preparation may contain, in addition to the active ingredient (modified enzyme of the present invention), an excipient, a buffer, a suspension, a stabilizer, a preservative, a preservative, physiological saline and the like.
  • an excipient starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used.
  • As the buffer phosphate, citrate, acetate or the like can be used.
  • propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like can be used.
  • ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for preparing a modified enzyme.
  • the modified enzyme successfully obtained by the present inventors is prepared by a genetic engineering technique.
  • a nucleic acid encoding any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 11 is prepared (step (I)).
  • the "nucleic acid encoding a specific amino acid sequence” is a nucleic acid which, when expressed, yields a polypeptide having the amino acid sequence, not to mention a nucleic acid having a base sequence corresponding to the amino acid sequence.
  • nucleic acid encoding the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 11 refers to the sequence information disclosed in the present specification or the attached sequence listing, and refers to standard genetic engineering techniques, molecular biology techniques, It can be prepared in an isolated state by using a biochemical technique or the like.
  • all of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 11 are obtained by mutating the amino acid sequences of Arthrobacter globiformis-derived esterases.
  • nucleic acid encoding any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 11 can be obtained by adding necessary mutations to the gene encoding Arthrobacter globiformis-derived esterase.
  • Many methods for position-specific nucleotide sequence substitution are known in the art (see, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), and an appropriate method is selected from them. Can be used.
  • a position-specific mutation introduction method a position-specific amino acid saturation mutation method can be adopted.
  • the position-specific amino acid saturation mutation method is a "Semi-rational, semi-random" method that estimates the position involved in the desired function based on the three-dimensional structure of the protein and introduces an amino acid saturation mutation (J. Mol. Biol.331,585-592 (2003)).
  • a position-specific amino acid saturation mutation using a kit such as Quick change (Stratagene) or Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16,7351-7367 (1988)).
  • a kit such as Quick change (Stratagene) or Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16,7351-7367 (1988)).
  • As the DNA polymerase used for PCR Taq polymerase or the like can be used.
  • a highly accurate DNA polymerase such as KOD-PLUS- (Toyobo Co., Ltd.) or Pfu turbo (Stratagene Co.).
  • step (I) express the prepared nucleic acid (step (II)).
  • an expression vector into which the above-mentioned nucleic acid is inserted is prepared, and this is used to transform a host cell.
  • the carbon source used in the medium may be any assimilable carbon compound, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid.
  • Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkali extract, etc. are used.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese and zinc, specific amino acids, specific vitamins and the like are used as necessary.
  • the culture temperature can be set within the range of 30 to 40°C (preferably around 37°C).
  • the culture time can be set in consideration of the growth characteristics of the transformant to be cultured and the production characteristics of the modified enzyme.
  • the pH of the medium is adjusted so that the transformant grows and the enzyme is produced.
  • the pH of the medium is preferably about 6.0 to 9.0 (preferably around pH 7.0).
  • the expression product (modified enzyme) is collected (step (III)).
  • the culture solution containing the microbial cells after culturing can be used as it is or as an enzyme solution after concentration, removal of impurities, etc., but generally, the expression product is once recovered from the culture solution or the microbial cells. If the expression product is a secretory protein, it can be recovered from the culture solution, and if it is other than that, it can be recovered from the inside of the cell.
  • the culture supernatant is filtered, centrifuged to remove insoluble matter, and then concentrated under reduced pressure, membrane concentration, salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, methanol, ethanol, or acetone.
  • Fractional precipitation method dialysis, heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. (eg Sephadex gel (GE Healthcare Bioscience)) Separation by combining gel filtration with DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), Octyl Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), CM Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), etc.
  • DEAE Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • Octyl Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • CM Sepharose CL-6B GE Healthcare Bioscience
  • the bacterial cells are collected by filtering the culture solution, centrifuging, etc., and then the bacterial cells are subjected to a pressure treatment, an ultrasonic treatment, a physical disruption treatment or a mechanical method such as lysozyme.
  • a purified product of the modified enzyme can be obtained by disrupting by an enzymatic method such as the above, and then separating and purifying in the same manner as above.
  • the purified enzyme obtained as described above in the form of powder by freeze drying, vacuum drying, spray drying, or the like.
  • the purified enzyme may be previously dissolved in a phosphate buffer solution, a triethanolamine buffer solution, a tris-hydrochloric acid buffer solution, or a GOOD buffer solution.
  • a phosphate buffer solution or a triethanolamine buffer solution can be used.
  • the GOOD buffer may be PIPES, MES or MOPS.
  • cell-free synthetic system cell-free transcription system, cell-free transcription/translation system
  • ribosomes derived from live cells or obtained by genetic engineering techniques
  • DNA or mRNA nucleic acid
  • a cell extract obtained by purifying a cell lysate as needed is used.
  • the cell extract generally contains ribosomes required for protein synthesis, various factors such as initiation factors, and various enzymes such as tRNA.
  • various substances necessary for protein synthesis such as various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and creatine phosphate are added to this cell extract.
  • energy sources such as ATP and GTP
  • creatine phosphate are added to this cell extract.
  • separately prepared ribosome, various factors, and/or various enzymes may be supplemented as necessary.
  • cell-free transcription/translation system is used interchangeably with cell-free protein synthesis system, in vitro translation system, or in vitro transcription/translation system.
  • RNA is used as a template to synthesize proteins.
  • total RNA, mRNA, in vitro transcription products, etc. are used.
  • the other in vitro transcription/translation system uses DNA as a template.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably also contains suitable terminator sequences.
  • conditions in which factors necessary for each reaction are added are set so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • a further aspect of the present invention relates to use of the modified enzyme, which provides a method for producing (1R,3S)-chrysanthemic acid using the modified enzyme of the present invention.
  • the modified enzyme of the present invention is allowed to act on (1R,3S)-ethyl chrysanthemate and hydrolyze to produce (1R,3S)-chrysanthemic acid.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the desired hydrolysis reaction is achieved. For example, using a buffer such as glycine-NaOH or PIPES, the reaction can be carried out under the conditions of pH 6-11 and temperature 40°C-60°C.
  • the wild-type esterase derived from Arthrobacter globiformis (the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1 and the gene sequence is shown in SEQ ID NO: 12) has high selectivity for (1R,3R)-ethyl chrysanthemate. An attempt was made to modify the stereoselectivity of the esterase by a protein engineering method.
  • mutant library (CASTing Library and two-point combination mutant) was prepared by the following method. (1) Introduction of mutation/transformation A PCR primer for introduction of mutation was designed, and PCR was performed under the following conditions to introduce the mutation. ⁇ Template plasmid> pET21b (introducing wild-type enzyme gene) Approx.
  • ⁇ PCR conditions Reaction at 98°C for 1 minute Reaction at 98°C for 10 seconds, 60°C for 15 seconds and 68°C for 2 minutes 20 cycles 68°C for 5 minutes Reaction left at 4°C
  • DpnI (1.5 ⁇ L) was added to the PCR reaction solution (15 ⁇ L) for treatment (37°C, 3 hours or more).
  • ligation treatment (16° C., O/N) was performed with the following ligation reaction composition.
  • E. coli BL21(DE3) was transformed (45° C. treatment at 42° C., followed by rapid cooling on ice). About 30 ⁇ L of the transformation solution was applied to an LB agar medium plate to which ampicillin (final concentration 0.1 mg/mL) was added, and cultured at 37° C. at O/N (preculture).
  • Substrate 2 single substrate: (1R,3S)-Ethyl chrysantherate 1 ⁇ L of substrate (substrate 1 or substrate 2) was dispensed into the reaction vessel, and measurement sample (enzyme extract prepared in 1.
  • the following mutations show a value of 2.0 or more, which is preferable because the reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanthemate is improved.
  • F58E, F58I, F58C, F58A, F58M D227I, D227S, D227A, D227W, D227H, D227G I228Y, I228S L229Y, L229F L231M, L231A V297R, V297W, V297Q A328G
  • A328G is a particularly effective mutation because the formation of (1R,3S)-chrysanthemic acid was observed even in the reaction using substrate 1 (mixed substrate).
  • A328G
  • mutant enzyme A328G mutant having the mutation (A328G) that caused the change in the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate to the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate
  • selectivity was evaluated as a standard.
  • the evaluation results are shown in FIGS.
  • the following combinations of mutations were identified as effective in improving the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate.
  • A328G/F217E, A328G/F217V, A328G/F217Y, A328G/S220Q, A328G/S220L, A328G/S220N and A328G/S220G the mutation point F217 and the mutation point S220 alone improve the reactivity.
  • the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanate was improved.
  • mutant A328G/A221F which shows specific reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanthemate.
  • mutant enzyme A328G mutant having the mutation (A328G) that caused the change in the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate to the selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate
  • selectivity was evaluated as a standard.
  • the A328G/A221F mutant shows specific reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanate and is extremely characteristic.
  • the A328G/A221F/D326V/F298L/N222D mutant is extremely useful because it has significantly improved reactivity as well as selectivity for (1R,3S)-ethyl chrysanthemate.
  • the amino acid sequences of mutants including particularly effective mutations, including these mutants, and the gene (example) encoding the same are shown below.
  • A328G mutant SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 13 (gene sequence) A328G/F217W mutant: SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 14 (gene sequence) A328G/A221F mutant: SEQ ID NO: 4 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 15 (gene sequence) A328G/A221M mutant: SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 16 (gene sequence) A328G/A221L mutant: SEQ ID NO: 6 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 17 (gene sequence) A328G/A221V mutant: SEQ ID NO: 7 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 18 (gene sequence) A328G/I228L mutant: SEQ ID NO: 8 (amino acid sequence), SEQ ID NO: 19 (gene sequence) A328G/A221F/D326V mutant: SEQ ID NO: 9 (
  • the modified esterase of the present invention has high reactivity with (1R,3S)-ethyl chrysanthemate and is useful for the production of (1R,3S)-chrysanthemic acid.
  • the modified esterase of the present invention it is possible to efficiently produce (1R,3S)-chrysanthemic acid by an enzymatic method, and it is possible to solve the problem of the conventional production method (chemical hydrolysis).
  • SEQ ID NO: 2 Description of artificial sequence: A328G mutant SEQ ID NO: 3: Description of artificial sequence: A328G/F217W mutant SEQ ID NO: 4: Description of artificial sequence: A328G/A221F mutant SEQ ID NO: 5: Description of artificial sequence: A328G /A221M mutant SEQ ID NO: 6: Description of artificial sequence: A328G/A221L mutant SEQ ID NO: 7: Description of artificial sequence: A328G/A221V mutant SEQ ID NO: 8: Description of artificial sequence: A328G/I228L mutant SEQ ID NO: 9: Description of artificial sequence: A328G/A221F/D326V mutant SEQ ID NO: 10: Description of artificial sequence: A328G/A221F/D326V/F298L mutant SEQ ID NO: 11: Description of artificial sequence: A328G/A221F/D326V/F298L mutant SEQ ID NO: 11: Description of artificial sequence: A328G/A221F/D326

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Abstract

(1R,3S)-菊酸の製造に有用なエステラーゼを提供することを課題とする。アルスロバクター属微生物由来のエステラーゼにおいて、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性向上に有効な複数のアミノ酸置換が開示される。

Description

改変型菊酸エステラーゼ
 本発明は、菊酸エチルに対する加水分解活性を示す酵素(菊酸エステラーゼ)の改変に関する。詳しくは、立体選択性が変化した改変型菊酸エステラーゼ及びその用途に関する。本出願は、2018年12月6日に出願された日本国特許出願第2018-229479号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
 菊酸は合成ピレスロイド系殺虫剤の合成原料として広く利用されている。菊酸には4種類の異性体((1R,3R)-菊酸、(1R,3S)-菊酸、(1S,3S)-菊酸及び(1S,3R)-菊酸)が存在するが、(1R,3R)-菊酸の殺虫活性が最も高い。工業的には化学合成法を利用して菊酸が製造されている。一方、菊酸エステラーゼを利用することにより、酵素反応によって菊酸を製造することも行われている。菊酸エステラーゼに関する過去の報告を以下に示す(特許文献1、非特許文献1~3)。特許文献1には、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来エステラーゼが1R,3R((+)-trans)特異的に菊酸エチルエステルを分解することが記載されている(表1)。また、非特許文献1には、Arthrobacter globiformis由来エステラーゼやその他の由来のエステラーゼにて1R,3R((+)-trans)特異的又は1S,3R((-)-trans)特異的に菊酸エチルエステルを分解することが記載されている。非特許文献2には、菊酸の各異性体の殺虫効果として、1R,3R((+)-trans)と1R,3S((+)-cis)で異なる殺虫効果を示すことが記載されている。非特許文献3は、Arthrobacter globiformis由来エステラーゼによる菊酸エチルエステルの分解に関する研究報告であり、特定の変異(K62R変異)によって立体選択性が変化すること((1S,3R)-菊酸エチルに対する反応性を示す)を示す。
特開平5-56787号公報
Agric.Biol.Chem.,55(11),2865-2870,1991 最近の合成ピレスロイドとその立体異性体の化学と作用、吉岡 宏輔、有機合成化学 第38巻第12号(1980)、1151-1162 微生物酵素を用いた光学活性ピレスロイド中間体の製造に関する研究、奈良先端科学技術大学院大学 物質創成科学研究科、西澤 雅子、2011年3月
 菊酸の異性体の一つである(1R,3S)-菊酸も殺虫活性を有し、それ自体が有用である。(1R,3S)-菊酸を効率よく生成する酵素(即ち、(1R,3S)-菊酸エチルに選択性の高いエステラーゼ)は知られておらず、現在は菊酸エチル異性体混合物の化学的加水分解及びその後の光学分割(キラルカラムによる精製)によって(1R,3S)-菊酸が得られている。収率やコストの面、或いは排水規制の観点から、酵素を利用して(1R,3S)-菊酸を製造することが望まれるが、(1R,3S)-菊酸エチルに選択的ないし特異的に作用する酵素は報告されていない。そこで本発明は、(1R,3S)-菊酸の製造に有用なエステラーゼを提供することを課題とする。
 上記課題を解決すべく本発明者らは、アルスロバクター属微生物(Arthrobacter globiformis)由来のエステラーゼの蛋白質工学的手法による立体選択性の改変を試みた。当該エステラーゼは(1R,3R)-菊酸エチルに特異的であり、(1R,3S)-菊酸の製造には事実上、利用できない。試行錯誤の末、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性又は選択性の向上に有効な複数の変異点(アミノ酸残基)を特定することに成功し、有用性の高い変異体(改変型エステラーゼ)が得られた。特に、2箇所のアミノ酸が置換された変異体(A328G/A221F)は(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する酵素であり、その有用性及び利用価値は極めて高い。尚、当該変異体にも含まれる変異A328Gは、基質の立体選択性を規定するともいえる重要な変異である。
 以下の発明は以上の成果及び考察に基づく。
 [1]配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)~(23)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が向上している改変型エステラーゼ:
 (1)変異点がF58、置換後のアミノ酸がE、I、C、A、M又はY;
 (2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV;
 (3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、T又はW;
 (4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV;
 (5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG;
 (6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF;
 (7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN又はG;
 (8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI;
 (9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS;
 (10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN;
 (11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG;
 (12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE;
 (13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI;
 (14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY;
 (15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG;
 (16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS;
 (17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC;
 (18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG;
 (19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH;
 (20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL;
 (21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV;
 (22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL;
 (23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。
 [2](1)の置換後のアミノ酸がE、I、C、A又はMであり、
 (2)の置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はGであり、
 (3)の置換後のアミノ酸がY又はSであり、
 (4)の置換後のアミノ酸がY又はFであり、
 (5)の置換後のアミノ酸がM又はAであり、
 (8)の置換後のアミノ酸がR、W又はQであり、
 (12)の変異点F58の置換後のアミノ酸がLであり、
 (13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はRであり、
 (14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はEであり、
 (15)の変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はLであり、
 (16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はGであり、
 (19)の変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はIである、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
 [3](4)の置換後のアミノ酸がYであり、
 (5)の置換後のアミノ酸がMであり、
 (8)の置換後のアミノ酸がR又はWであり、
 (13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQであり、
 (14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はTであり、
 (16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はRである、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
 [4]アミノ酸置換が(11)~(23)の中のいずれか一つであり、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上している、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
 [5]アミノ酸置換が、A328G、A328G/F217W、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、又はA328G/I228Lである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
 [6]アミノ酸置換がA328G/A221Fであり、(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
 [7]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326Vである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
 [8]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298Lである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
 [9]アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298L/N222Dである、[4]に記載の改変型エステラーゼ。
 [10]前記同一性が95%以上である、[1]~[9]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼ。
 [11]配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列からなる、[1]に記載の改変型エステラーゼ。
 [12][1]~[11]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
 [13]配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、[12]に記載の遺伝子。
 [14][12]又は[13]に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
 [15][14]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
 [16][1]~[11]のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
 [17]以下のステップ(I)~(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法:
 (I)[1]~[11]のいずれか一項の改変型エステラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
 (II)前記核酸を発現させるステップ、及び
 (III)発現産物を回収するステップ。
 [18]前記アミノ酸配列が配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列である、[17]に記載の調製法。
 [19]前記核酸が、配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、[17]に記載の調製法。
 [20][1]~[11]のいずれか一項の改変型エステラーゼを(1R,3S)-菊酸エチルに作用させることを特徴とする、(1R,3S)-菊酸の製造方法。
 [21](1R,3S)-菊酸エチルが、(1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルと共存した状態である、[20]に記載の製造方法。
変異F58Xの評価結果。「(1R,3S)-菊酸エチル(単独基質)を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」(B)を「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」(A)で除した値(B/A)で「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性」を評価した(以下の変異についても同様)。 変異F217X、S220X、D227Xの評価結果。 変異I228X、L229X、L231Xの評価結果。 変異S244X、A245X、V297Xの評価結果。 変異F298X、A328Xの評価結果。 組み合わせ変異A328G/F58X、A328G/L151X、A328G/F217Xの評価結果。「混合基質を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」(C)を「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」(D)で除した値(C/D)で「(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性」を評価した(以下の組み合わせ変異についても同様)。(1R,3S)-菊酸の生成量/(1R,3R)-菊酸の生成量の値も示した。 組み合わせ変異A328G/S220X、A328G/A221X、A328G/D227Xの評価結果。 組み合わせ変異A328G/I228X、A328G/L229X、A328G/V297Xの評価結果。 組み合わせ変異A328G/A221F、A328G/A221F/D326V、A328G/A221F/D326V/F298L、A328G/A221F/D326V/F298L/N222Dの評価結果。
 説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
(用語)
 用語「改変型エステラーゼ」とは、基準となるエステラーゼ(以下、「基準エステラーゼ」と呼ぶ)を改変ないし変異して得られる酵素である。基準エステラーゼは、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列を有する、アルスロバクター属微生物(Arthrobacter globiformis)由来のエステラーゼである。
 本発明では、改変ないし変異として「アミノ酸の置換」が行われる。従って、改変型エステラーゼと基準エステラーゼを比較すると、一部のアミノ酸残基に相違が認められる。尚、本明細書では、改変型エステラーゼのことを改変型酵素又は変異体とも呼ぶ。
 本明細書では慣例に従い、以下の通り、各アミノ酸を1文字で表記する。
 メチオニン:M、セリン:S、アラニン:A、トレオニン:T、バリン:V、チロシン:Y、ロイシン:L、アスパラギン:N、イソロイシン:I、グルタミン:Q、プロリン:P、アスパラギン酸:D、フェニルアラニン:F、グルタミン酸:E、トリプトファン:W、リジン:K、システイン:C、アルギニン:R、グリシン:G、ヒスチジン:H
 本明細書では、N末端のアミノ酸残基を1番目としてN末端からC末端に向かって付けた番号によって変異点の位置を特定する。
 本明細書では、アミノ酸置換による変異を、置換前のアミノ酸残基を表す1文字、変異点(アミノ酸置換が生じるアミノ酸残基の位置)を表す数字、及び置換後のアミノ酸残基を表す1文字の組合せで表現する。例えば、328位のアラニンがグリシンに置換される変異であれば「A328G」と表現される。また、二つの変異の組合せ(併用)を表す場合、記号「/」を用いる。例えば、328位のアラニンがグリシンに置換される変異と、221位のアラニンがフェニルアラニンに置換される変異の組合せであれば、「A328G/A221F」と表現される。
1.改変型エステラーゼ
 本発明の第1の局面は改変型エステラーゼ(改変型酵素)に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号1のアミノ酸配列において、一又は二以上の特定のアミノ酸置換(変異)を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼと比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性又は選択性或いはこれらの両者が向上している。尚、配列番号1のアミノ酸配列は、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼ)の配列である。
 「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性」は、(1R,3S)-菊酸エチルの光学異性体((1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル、(1S,3R)-菊酸エチル)に対する反応性と比較した場合の反応性(相対的反応性)も含む表現である。従って、「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の向上」は、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上、(1R,3S)-菊酸エチルに対する活性の上昇、(1R,3S)-菊酸エチルの光学異性体((1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル、(1S,3R)-菊酸エチル)に対する活性の低下等によってもたらされる。
 ここで、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼ(野生型酵素)は(1R,3R)-菊酸エチルに対して高い選択性を有し、4種の光学異性体((1R,3R)-菊酸エチル、(1R,3S)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル、(1S,3R)-菊酸エチル)が共存する場合、(1R,3R)-菊酸エチルを優先的に加水分解する。そのため、通常、生成物として(1R,3R)-菊酸のみが検出される。また、野生型酵素は(1R,3S)-菊酸エチルに対する加水分解活性も有しているが、その反応速度が(1R,3R)-菊酸に対する加水分解活性の反応速度に比べて圧倒的に遅いため、(1R,3R)-菊酸エチル共存下では見かけ上(1R,3S)-菊酸エチルに反応しない。一方で、(1R,3S)-菊酸エチルを単独で基質として反応させると、その生成物(1R,3S)-菊酸が検出される。
 本願では野生型酵素の上記特性を考慮し、「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性」が、基質として(1R,3S)-菊酸エチルのみ(単独基質)を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量と、(1R,3R)-菊酸エチル、(1R,3S)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルの混合物である混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸エチルの生成量に基づき評価される。具体的には、「(1R,3S)-菊酸エチル(単独基質)を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」を「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」で除した値で「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性」が評価され、当該値が1を超える場合に「(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性」が向上していると判定される。好ましい改変型酵素では当該値が2.0以上となり、反応性向上の程度が高い。更に好ましい改変型酵素では当該値が3.0以上となり、反応性が一層向上している。尚、野生型酵素は改変前の酵素、即ち基準エステラーゼである。
 上記の通り、野生型酵素は(1R,3R)-菊酸エチルに対して高い選択性を有し、混合基質に反応させた場合、(1R,3S)-菊酸は検出されない(実質的に生成しない)。一方、後述の実施例に示すように、野生型酵素の328位アミノ酸アラニンをグリシンに置換した変異体(A328G変異体)は(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上しており、混合基質に反応させた場合においても(1R,3S)-菊酸エチルに対する加水分解活性を示し、(1R,3S)-菊酸の生成が認められた。そこで本願では、「(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性」の評価にA328G変異体を利用する。具体的には、「混合基質を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」を「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」で除した値で「(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性」が評価される。当該値が1以上の場合、A328G変異体と同等又はそれ以上の選択性であり、「(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性」が向上していると判定される。好ましい改変型酵素では当該値が1.5以上となり、選択性向上の程度が高い。更に好ましい改変型酵素では当該値が2.0以上となり、選択性が一層向上している。尚、(1R,3R)-菊酸の生成量が検出限界以下の場合、即ち、(1R,3R)-菊酸が実質的に生成していない場合は「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量のA328G変異体変異体に対する比率」がゼロであり、上記値は計算不能となる。このような結果をもたらす改変型酵素(A328G/A221F変異体が該当する)は(1R,3S)-菊酸エチル特異的といえる。
 本明細書において「アミノ酸置換を含む」とは、変異点(即ち、特定のアミノ酸置換が生ずるアミノ酸残基の位置)が置換後のアミノ酸になっていることを意味する。従って、アミノ酸置換を含むアミノ酸配列(変異アミノ酸配列)を、アミノ酸置換を含まない配列番号1のアミノ酸配列(基準アミノ酸配列)と比較すれば、当該アミノ酸置換の位置においてアミノ酸残基の相違が認められることになる。
 以下、本発明の改変型酵素が含み、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の向上をもたらすアミノ酸置換(変異点及び置換後のアミノ酸)を列挙する。尚、(11)~(23)は、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性に加え、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性についても向上させるものであり、より好ましい。
 (1)変異点がF58、置換後のアミノ酸がE、I、C、A、M又はY。好ましくは、置換後のアミノ酸がE、I、C、A又はM。
 (2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV。好ましくは、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はG。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がI、S、A、W又はH。
 (3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、T又はW。好ましくは、置換後のアミノ酸がY又はS。
 (4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV。好ましくは、置換後のアミノ酸がY又はF。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がY。
 (5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG。好ましくは、置換後のアミノ酸がM又はA。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がM。
 (6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF。
 (7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN又はG
 (8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI。好ましくは、置換後のアミノ酸がR、W又はQ。更に好ましくは、置換後のアミノ酸がR又はW。
 (9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS。
 (10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN。
 (11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG。
 (12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE。好ましくは、変異点F58の置換後のアミノ酸がL。
 (13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI。好ましくは、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はR。更に好ましくは、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ。
 (14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY。好ましくは、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はE。更に好ましくは、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はT。
 (15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG。好ましくは、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はL。
 (16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS。好ましくは、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はG。更に好ましくは、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はR。
 (17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC。
 (18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG。
 (19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH。好ましくは、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はI。
 (20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL。
 (21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV。
 (22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL。
 (23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。
 以上のアミノ酸置換の中で(14)と(15)については、変異点F217と変異点S220が単独では反応性の向上をもたらさなかったにもかかわらず、A328G変異との組み合わせになると(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上しており、注目に値する。また、変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がFについては、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の飛躍的な向上をもたらし、(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する改変型酵素の調製を可能にするものであり、極めて好ましいアミノ酸置換である。
 本発明の改変型酵素の具体例として、配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列からなるエステラーゼ(順に、(11)のアミノ酸置換A328Gを含む変異体、(14)のアミノ酸置換の一つであるA328G/F217Wを含む変異体、(16)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221Fを含む変異体、(16)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221Mを含む変異体、(16)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221Lを含む変異体、(16)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221Vを含む変異体、(18)のアミノ酸置換の一つであるA328G/I228Lを含む変異体、(21)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221F/D326Vを含む変異体、(22)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221F/D326V/F298Lを含む変異体、(23)のアミノ酸置換の一つであるA328G/A221F/D326V/F298L/N222Dを含む変異体が対応する)を挙げることができる。後述の実施例に示す通り、これらの変異体は(1R,3S)-菊酸エチル選択性が特に向上している。この中でA328G/A221F変異体は(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用するものであり、特に有用性が高い。また、A328G/A221F/D326V変異体、A328G/A221F/D326V/F298L変異体、及びA328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体は(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性に加え反応性も非常に高く、極めて有用である。
 一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部を変異させた場合において変異後のタンパク質が変異前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の変異がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されることがある。一方、二つのタンパク質のアミノ酸配列の同一性が高い場合、両者が同等の特性を示す蓋然性が高い。これらの技術常識を考慮すれば、上記改変型酵素のアミノ酸配列、即ち、「配列番号1のアミノ酸配列において、上記(1)~(23)のいずれかのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列(当該アミノ酸配列の具体例は配列番号2~11のアミノ酸配列)」と完全に同一(即ち100%の同一性)でないものの、高い同一性を示すアミノ酸配列を有し、且つ所望の特性変化を認めるものであれば、上記改変型酵素と実質的に同一の酵素(実質同一エステラーゼ)であると見なすことができる。ここでの同一性は、60%以上、70%以上、80%以上、82%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、98%、又は99%以上である。同一性は高いほど好ましい。従って、最も好ましい態様では、同一性が99%以上となる。
 上記改変型酵素と実質同一エステラーゼを比較すれば、アミノ酸配列の僅かな相違が認められることになる。但し、アミノ酸配列の相違は上記アミノ酸置換が施された位置以外の位置で生ずることとする。従って、例えば、同一性の基準が配列番号2のアミノ酸配列の場合は328位G以外の位置、同一性の基準が配列番号3のアミノ酸配列の場合は328位Gと217位W以外の位置、同一性の基準が配列番号4のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位F以外の位置、同一性の基準が配列番号5のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位M以外の位置、同一性の基準が配列番号6のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位L以外の位置、同一性の基準が配列番号7のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位V以外の位置、同一性の基準が配列番号8のアミノ酸配列の場合は328位Gと228位L以外の位置、同一性の基準が配列番号9のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位Fと326位V以外の位置、同一性の基準が配列番号10のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位Fと326位Vと298位L以外の位置、同一性の基準が配列番号11のアミノ酸配列の場合は328位Gと221位Fと326位Vと298位Lと222位D以外の位置においてアミノ酸配列の相違が生じることになる。換言すれば、配列番号2のアミノ酸配列と上記の同一性(60%以上、70%以上、80%以上、82%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、98%、又は99%以上)を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はGである。同様に、配列番号3のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、217位アミノ酸はWであり、配列番号4のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はFであり、配列番号5のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はMであり、配列番号6のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はLであり、配列番号7のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はVであり、配列番号8のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、228位アミノ酸はLであり、配列番号9のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はF、326位アミノ酸はVであり、配列番号10のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はF、326位アミノ酸はV、298位アミノ酸はLであり、配列番号11のアミノ酸配列と上記の同一性を示すアミノ酸配列では328位アミノ酸はG、221位アミノ酸はF、326位アミノ酸はV、298位アミノ酸はL、222位アミノ酸はDである。
 ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」は、アミノ酸の欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組合せにより生じる。典型的には、アミノ酸配列を構成する1~数個(上限は例えば3個、5個、7個、10個)のアミノ酸の欠失、置換、若しくは1~数個(上限は例えば3個、5個、7個、10個)のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異(変化)が生じていることをいう。「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。尚、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼ(配列番号1)の活性残基は59位アミノ酸セリン、325位アミノ酸ヒスチジン、326位アミノ酸アスパラギン酸であることが知られていることから、変異を施す際には当該酸残基に影響がないようにするとよい。
 ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの塩基配列(以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する)の同一性(%)は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる(例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい)。第一の配列の特定位置の分子(アミノ酸残基又はヌクレオチド)が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり(すなわち、同一性(%)=同一位置の数/位置の総数 × 100)、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
 二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー(IGH Montpellier、フランス)またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ=12、ギャップペナルティ=4とすることができる。
 二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重=12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重=2、3、又は4として決定することができる。また、二つの塩基配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重=50、ギャップ長加重=3として決定することができる。
 典型的には、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼ、即ち、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼが変異(上記(1)~(23)のいずれかのアミノ酸置換)することによって、本発明の改変型酵素となる。上記の実質同一エステラーゼについては、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼが変異(上記(1)~(23)のいずれかのアミノ酸置換)したものに更に変異を加えること、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼを産生するアルスロバクター・グロビフォルミス株と同種同属由来のエステラーゼ等、配列番号1のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるエステラーゼに対して同等の変異を加えること、又は当該変異によって得られるものに更に変異を加えること、によって得ることができる。ここでの「同等の変異」では、配列番号1のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列において、本発明における変異点(上記(1)~(23)のいずれかのアミノ酸置換における変異点)のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が置換されることになる。尚、配列番号1のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるエステラーゼの例として、Arthrobacter sp. Rue61aに由来し、配列番号23のアミノ酸配列を有するエステラーゼ(アミノ酸列の同一性81%)を挙げることができる。
 本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質(酵素)間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味する。例えば、基準エステラーゼのアミノ酸配列(配列番号1のアミノ酸配列)に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造(アミノ酸配列)の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに(このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい)、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて立体構造(三次元構造)同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。変異対象酵素の立体構造情報は例えばProtein Data Bank(http://www.pdbj.org/index_j.html)より取得することができる。
 X線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定方法の一例を以下に示す。
(1)タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
(2)作製した結晶にX線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はX線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に-173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
(3)結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなX線散乱能のX線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を0に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社(アメリカ)のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
2.改変型エステラーゼをコードする核酸等
 本発明の第2の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
 改変型酵素をコードする遺伝子は典型的には改変型酵素の調製に利用される。改変型酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の改変型酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の改変型酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型酵素をコードする遺伝子の用途は改変型酵素の調製に限られない。例えば、改変型酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは酵素の更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
 本明細書において「改変型酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に当該改変型酵素が得られる核酸のことをいい、当該改変型酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
 改変型酵素をコードする遺伝子の配列(塩基配列)の例を配列番号13~22に示す。これらの配列は、下記の通り、後述の実施例に示した変異体をコードする。
 配列番号13:A328G変異体
 配列番号14:A328G/A217W変異体
 配列番号15:A328G/A221F変異体
 配列番号16:A328G/A221M変異体
 配列番号17:A328G/A221L変異体
 配列番号18:A328G/A221V変異体
 配列番号19:A328G/I228L変異体
 配列番号20:A328G/A221F/D326V変異体
 配列番号21:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
 配列番号22:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体
 本発明の遺伝子を宿主内で発現させる場合に、上記の配列(配列番号13~22のいずれか)の5'末端側にシグナルペプチドをコードする配列(シグナル配列)を付加しても良い。シグナル配列は宿主に応じて選択すればよい。目的とする変異体を発現可能なシグナル配列である限り、本発明に使用できる。利用可能なシグナル配列として、α-因子のシグナルペプチドをコードする配列(Protein Engineering, 1996, vol9, p.1055-1061)、α-因子受容体のシグナルペプチドをコードする配列、SUC2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、PHO5タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、BGL2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、AGA2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、TorA(トリメチルアミンN-オキシドレダクターゼ)のシグナルペプチドをコードする配列、バチルス・サチルス由来のPhoD(ホスホエステラーゼ)のシグナルペプチドをコードする配列、バチルス・サチルス由来のLipA(リパーゼ)のシグナルペプチドをコードする配列、アスペルギルス・オリゼ由来タカアミラーゼのシグナルペプチドをコードする配列(特開2009-60804号公報)、バチルス・アミロリケファシエンス由来のα-アミラーゼのシグナルペプチドをコードする配列(Eur. J. Biochem. 155, 577-581 (1986))、バチルス・サチルス由来の中性プロテアーゼのシグナルペプチドをコードする配列(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Apr. 1995, p. 1610-1613 Vol. 61, No. 4)、Bacillus属細菌由来セルラーゼのシグナルペプチドをコードする配列(特開2007-130012号公報)、pET系に使われているpelBをコードする配列を例示することができる。
 本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
 本発明の他の態様では、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸(以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう)が提供される。相同核酸の例として、本発明の改変型酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、改変型酵素に特徴的な酵素活性(即ちエステラーゼ活性)を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2~40塩基、好ましくは2~20塩基、より好ましくは2~10塩基である。
 相同核酸は、基準となる塩基配列に対して、例えば60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、より一層好ましくは85%以上、さらに好ましくは約90%以上、更に一層好ましくは95%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する。
 以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やランダム突然変異導入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
 本発明の他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
 本発明の更に別の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning(Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液(50%ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1% SDS、10% デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いて約42℃~約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1% SDSを用いて約65℃~約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50%ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1%SDS、10%デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5))を用いる条件を挙げることができる。
 本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸(核酸断片)を提供する。このような核酸断片は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び/又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分(例えば約10~約100塩基長、好ましくは約20~約100塩基長、更に好ましくは約30~約100塩基長)にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
 本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子(改変型酵素をコードする遺伝子)を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
 使用目的(クローニング、タンパク質の発現)に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはpET21又はその改変体、M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体(pB325、pAT153、pUC8など)等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
 本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞(宿主細胞)内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無(及びその程度)を確認することができる。
 本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入(必要な場合)、プロモーターの挿入(必要な場合)等は標準的な組換えDNA技術(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法)を用いて行うことができる。
 宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、麹菌(例えばアスペルギルス・オリゼ)、バチルス属細菌(例えばバチルス・サチルス)、大腸菌(エシェリヒア・コリ)、出芽酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)などの微生物を用いることができるが、組換えDNAが複製可能で且つ改変型酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。好ましくは大腸菌(エシェリヒア・コリ)、出芽酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)を用いることができる。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1(インビトロジェン社)を挙げることができる。
 本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物(即ち形質転換体)に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法(ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970))、ハナハン(Hanahan)法(ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983))、SEM法(ジーン(Gene)、第96巻、第23頁(1990))、チャング(Chung)らの方法(プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989))、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の改変型酵素を生産することに利用することができる。
3.改変型エステラーゼを含む酵素剤
 本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本発明の改変型酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
4.改変型エステラーゼの調製法
 本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する(ステップ(I))。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列(アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい)が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号2~11のアミノ酸配列はいずれも、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、Arthrobacter globiformis由来のエステラーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸(遺伝子)を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例えば、Quick change(ストラタジーン社)等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-(東洋紡社)、Pfu turbo(ストラタジーン社)などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
 ステップ(I)に続いて、用意した核酸を発現させる(ステップ(II))。例えば、まず上記核酸を挿入した発現ベクターを用意し、これを用いて宿主細胞を形質転換する。
 次に、発現産物である改変型酵素が産生される条件下で形質転換体を培養する。形質転換体の培養は常法に従えばよい。培地に使用する炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
 一方、培養温度は30℃~40℃の範囲内(好ましくは37℃付近)で設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型酵素の産生特性などを考慮して設定することができる。培地のpHは、形質転換体が生育し且つ酵素が産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のpHを6.0~9.0程度(好ましくはpH7.0付近)とする。
 続いて、発現産物(改変型酵素)を回収する(ステップ(III))。培養後の菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より発現産物を一旦回収する。発現産物が分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー(例えば、セファデックス(Sephadex)ゲル(GEヘルスケアバイオサイエンス)などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B (GEヘルスケアバイオサイエンス)、オクチルセファロースCL-6B (GEヘルスケアバイオサイエンス)、CMセファロースCL-6B(GEヘルスケアバイオサイエンス))などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理、物理破砕処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。
 上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
 通常は、以上のように適当な宿主-ベクター系を利用して遺伝子の発現~発現産物(改変型酵素)の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系(無細胞転写系、無細胞転写/翻訳系)」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の(或いは遺伝子工学的手法で得られた)リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸(DNAやmRNA)からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び/又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
 タンパク質合成に必要な各分子(因子)を再構成した転写/翻訳系の開発も報告されている(Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001)。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する3種類の開始因子、3種類の伸長因子、終結に関与する4種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる20種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる31種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
 用語「無細胞転写/翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写/翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写/翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写/翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
5.改変型エステラーゼの用途
 本発明の更なる局面は改変型酵素の用途に関し、本発明の改変型酵素を用いた、(1R,3S)-菊酸の製造方法が提供される。本発明の製造方法では、本発明の改変型酵素を(1R,3S)-菊酸エチルに作用させて加水分解し、(1R,3S)-菊酸を生成させる。所望の加水分解反応が達成させる限りにおいて反応条件は特に限定されない。例えば、グリシン-NaOHやPIPES等の緩衝液を利用し、pH6~11、温度40℃~60℃の条件下で反応させることができる。基質として、純度の高い(1R,3S)-菊酸エチル(例えば純度が98%以上)を使用しても、或いは(1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルが共存した状態の基質(例えば、(1R,3R):(1S,3S):(1R,3S):(1S,3R)=3:3:2:2の混合菊酸エチル等)を使用することにしてもよい。反応産物は必要に応じて光学分割した後、各種用途に利用される。光学分割にはカラムクロマトグラフィーを用いることができる。改変型酵素は固定化したものを用いても良い。
 Arthrobacter globiformis)由来の野生型エステラーゼ(アミノ酸配列を配列番号1に遺伝子配列を配列番号12に示す)は(1R,3R)-菊酸エチルに対して高い選択性を有する。当該エステラーゼの蛋白質工学的手法による立体選択性の改変を試みた。
1.変異体ライブラリーの作製
 以下の方法で変異体ライブラリー(CASTing Library及び2点組み合わせ変異体)を作製した。
(1)変異の導入・形質転換
 変異導入用PCRプライマーを設計し、以下の条件でPCRを行い、変異を導入した。
<鋳型プラスミド>
 pET21b (野性型酵素遺伝子を導入)約30 ng/μL
<PCR反応組成>(総量20μL)
 5× Prime STAR GXL Buffer(タカラバイオ): 4μL
 dNTP Mixture (2.5mM each): 1.6μL
 鋳型(約30 ng/μL): 0.25μL
 F-プライマー: 0.2μL
 R-プライマー: 0.2μL
 Prime STAR GXL DNA Polymerase (タカラバイオ): 0.8μL
 以上を混合し、超純水(Milli Q水)で20μLに調整
<PCR条件>
 98℃で1分の反応
 98℃で10秒、60℃で15秒及び68℃で2分の反応を20サイクル
 68℃で5分の反応
 4℃で放置
 PCR反応液 15μLにDpnI 1.5μLを添加して処理(37℃、3時間以上)した。次に、DpnI 処理液 2μLを用いて、以下のライゲーション反応組成にてライゲーション処理(16℃、O/N)した。
<ライゲーション反応組成>(総量5.5μL)
 DpnI 処理 PCR産物: 2μL
 T4 Polynucleotide Kinase: 1μL
 Ligation High(東洋紡): 2.5μL
 ライゲーション反応液5.5μLを用いて、E.coli BL21(DE3) 25μLに形質転換(42℃で45秒処理後、氷上で急冷)した。形質転換溶液約30μLを、アンピシリン(最終濃度0.1mg/mL)を添加したLB寒天培地プレートに塗布して、37℃、O/Nで培養した(前培養)。
(2)酵素抽出液の取得
 前培養後の各変異株を、アンピシリン(最終濃度0.1mg/mL)を添加したTB培地(invitrogen) 1 mLに植菌した。33℃で48時間培養し(培養開始24時間の時点でIPTG (最終濃度 0.1mM)を添加)、遠心分離(3,000 g × 10分)した。上澄みを除去して菌体を回収した後、溶菌剤にて菌体を溶菌(25℃、2時間以上)させて酵素を抽出した。溶菌液を遠心分離(3,000 g × 10分)後、上澄みを回収して酵素抽出液とした。
(3)組み合わせ変異体の作製
 A328G変異体を鋳型として、上記(1)と同様の操作でPCRを行った。PCR産物を回収し、上記(2)と同様の操作で酵素抽出液を得た。尚、CASTing Libraryの評価結果とMOE(MOLSIS社)によるドッキングシミュレーションの結果を踏まえてA328Gに組み合わせる変異点の候補を選定した。
(4)多重変異体の作製
 A328G/A221F変異体を鋳型として、Error-prone PCRによりランダム変異導入を行った。trans-pNP菊酸を用い、遊離するpNP量を指標にスクリーニングを行った。得られた変異体を鋳型として同様の変異導入及びスクリーニングを繰り返し複数回実施することで、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が増加した多重変異体を作製した。
2.変異体の評価
2-1.CASTing Libraryの評価
 以下の方法でCASTing Libraryを評価した。(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の変化を評価するため、以下の2種類の基質を用いた。
 基質1(混合基質):菊酸エチル(純度95%以上、(1R,3R)体、(1R,3S)体、(1S,3R)体、(1S,3S)体の混合物((1R,3R):(1S,3S):(1R,3S):(1S,3R)=3:3:2:2)、東京化学工業)
 基質2(単独基質):(1R,3S)-菊酸エチル
 1μLの基質(基質1又は基質2)を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(2)で調製した酵素抽出液)99μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件を以下に示す。
<超臨界流体クロマトグラフ(SFC)の分析条件>
 装置:ACQUITY UPC2 PDA システム(Waters社)
 カラム:ACQUITY UPC2 Trefoil AMY1(Waters社) 2.5μm, 3.0×150mm
 移動相:CO2/10mM 酢酸アンモニウム含有2-プロパノール (0.5% 酢酸) = 92/8
 流量:2.0 mL/分
 注入量:1μL
 分析時間:1.5分
 PDA検出機:205-400 nm
 解像度:1.2 nm
 (1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の変化を、野生型酵素の反応性を基準として評価した。具体的には、SFCのエリア面積から、「(1R,3S)-菊酸エチル(単独基質)を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」/「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量の野生型酵素に対する比率(%)」の値を算出し、当該値が1を超えれば、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が増加したと判断した。
 評価結果を図1~5に示す。(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が増加したものとして以下の変異が同定された。
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M、F58Y
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H、D227G、D227F、D227V
I228Y、I228S、I228T、I228W
L229Y、L229F、L229V
L231M、L231A、L231G
S244F
A245N、A245G
V297R、V297W、V297Q、V297A、V297I
F298S
A328N、A328G
 以下の変異は2.0以上の値を示し、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性の向上により好ましい。
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H、D227G
I228Y、I228S
L229Y、L229F
L231M、L231A
V297R、V297W、V297Q
A328G
 以下の変異の値は3.0以上であり、より一層好ましいといえる。尚、A328Gは基質1(混合基質)を用いた反応においても(1R,3S)-菊酸の生成が認められ、特に有効な変異である。
F58E、F58I、F58C、F58A、F58M
D227I、D227S、D227A、D227W、D227H
I228Y、I228S
L229Y
L231M
V297R、V297W
A328G
2-2.組み合わせ変異体の評価
 1μLの基質1を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(3)で調製した酵素抽出液)99μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件はCASTing Libraryの評価の場合と同様とした。
 (1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の変化を、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上をもたらした変異(A328G)を有する変異酵素(A328G変異体)の反応性/選択性を基準として評価した。具体的には、SFCのエリア面積から、「混合基質を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」/「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」の値を算出し、当該値が1以上であれば、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上に有効な変異であると判断した。
 評価結果を図6~8に示す。(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上に有効なものとして、以下の変異の組み合わせが同定された。尚、驚くべきことに、A328G/F217E、A328G/F217V、A328G/F217Y、A328G/S220Q、A328G/S220L、A328G/S220N及びA328G/S220Gは、変異点F217及び変異点S220が単独では反応性の向上をもたらさなかったにもかかわらず、A328G変異との組み合わせになると(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上した。
A328G/F58L、A328G/F58E
A328G/L151Q、A328G/L151R、A328G/L151H、A328G/L151W、A328G/L151A、A328G/L151V、A328G/L151M、A328G/L151N、A328G/L151C、A328G/L151T、A328G/L151I
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T、A328G/F217R、A328G/F217E、A328G/F217V、A328G/F217Y
A328G/S220Q、A328G/S220L、A328G/S220N、A328G/S220G
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R、A328G/A221G、A328G/A221S
A328G/D227E、A328G/D227C
A328G/I228L、A328G/I228G
A328G/L229R、A328G/L229V、A328G/L229I、A328G/L229H
A328G/V297C、A328G/V297L
 以下の変異の組み合わせは1.5以上の値を示し、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上により好ましい。
A328G/F58L
A328G/L151Q、A328G/L151R
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T、A328G/F217R、A328G/F217E
A328G/S220Q、A328G/S220L
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R、A328G/A221G
A328G/I228L、A328G/I228G
A328G/L229R、A328G/L229V、A328G/L229I
 以下の変異の組み合わせの値は2.0以上であり、より一層好ましいといえる。尚、特に注目すべきは、変異A328G/A221Fであり、(1R,3S)-菊酸エチルに対して特異的な反応性を示す。
A328G/L151Q
A328G/F217W、A328G/F217G、A328G/F217A、A328G/F217D、A328G/F217T
A328G/A221F、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、A328G/A221E、A328G/A221R
A328G/I228L、A328G/I228G
2-3.多重変異体の評価
 2μLの基質1を反応容器に分注し、測定サンプル(上記1.(3)で調製した酵素抽出液)98μLを加え、反応(40℃、24時間)させた。反応後、6N HCl 10μL及びヘキサン150μLを加えた。よく攪拌した後、遠心分離し、有機層100μLを採取した。抽出物を乾固し、分析用溶媒に再溶解した後、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)で分析した。分析条件はCASTing Libraryの評価の場合と同様とした。
 (1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の変化を、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上をもたらした変異(A328G)を有する変異酵素(A328G変異体)の反応性/選択性を基準として評価した。具体的には、SFCのエリア面積から、「混合基質を用いた反応での(1R,3S)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」/「混合基質を用いた反応での(1R,3R)-菊酸の生成量のA328G変異体に対する比率(%)」の値を算出し、当該値が1以上であれば、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性の向上に有効な変異であり、(1R,3S)-菊酸エチル生成量のA328G変異体に対する比率が高いほど(1R,3S)-菊酸エチルの生産性向上に有用な変異であると判断した。
 評価結果を図9に示す。(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性及び反応性が非常に高いものとして、以下の変異の組み合わせが同定された。
A328G/A221F/D326V
A328G/A221F/D326V/F298L
A328G/A221F/D326V/F298L/N222D
3.まとめ
 (1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性/選択性の向上に有効な複数の変異を同定することに成功した。A328G/A221F変異体は(1R,3S)-菊酸エチル特異的な反応性を示し、極めて特徴的である。A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体は(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性に加え反応性が大きく向上しており、極めて有用である。これらの変異体を含め、特に有効な変異を含む変異体のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子(一例)を以下に示す。
 A328G変異体:配列番号2(アミノ酸配列)、配列番号13(遺伝子配列)
 A328G/F217W変異体:配列番号3(アミノ酸配列)、配列番号14(遺伝子配列)
 A328G/A221F変異体:配列番号4(アミノ酸配列)、配列番号15(遺伝子配列)
 A328G/A221M変異体:配列番号5(アミノ酸配列)、配列番号16(遺伝子配列)
 A328G/A221L変異体:配列番号6(アミノ酸配列)、配列番号17(遺伝子配列)
 A328G/A221V変異体:配列番号7(アミノ酸配列)、配列番号18(遺伝子配列)
 A328G/I228L変異体:配列番号8(アミノ酸配列)、配列番号19(遺伝子配列)
 A328G/A221F/D326V変異体:配列番号9(アミノ酸配列)、配列番号20(遺伝子配列)
 A328G/A221F/D326V/F298L変異体:配列番号10(アミノ酸配列)、配列番号21(遺伝子配列)
 A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体:配列番号11(アミノ酸配列)、配列番号22(遺伝子配列)
 本発明の改変型エステラーゼは(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が高く、(1R,3S)-菊酸の製造に有用である。本発明の改変型エステラーゼを用いることにより、酵素法による効率的な(1R,3S)-菊酸の製造が可能になり、従来の製造法(化学的加水分解)が抱える問題を解決し得る。
 この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
 配列番号2:人工配列の説明:A328G変異体
 配列番号3:人工配列の説明:A328G/F217W変異体
 配列番号4:人工配列の説明:A328G/A221F変異体
 配列番号5:人工配列の説明:A328G/A221M変異体
 配列番号6:人工配列の説明:A328G/A221L変異体
 配列番号7:人工配列の説明:A328G/A221V変異体
 配列番号8:人工配列の説明:A328G/I228L変異体
 配列番号9:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V変異体
 配列番号10:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
 配列番号11:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体
 配列番号13:人工配列の説明:A328G変異体
 配列番号14:人工配列の説明:A328G/F217W変異体
 配列番号15:人工配列の説明:A328G/A221F変異体
 配列番号16:人工配列の説明:A328G/A221M変異体
 配列番号17:人工配列の説明:A328G/A221L変異体
 配列番号18:人工配列の説明:A328G/A221V変異体
 配列番号19:人工配列の説明:A328G/I228L変異体
 配列番号20:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V変異体
 配列番号21:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L変異体
 配列番号22:人工配列の説明:A328G/A221F/D326V/F298L/N222D変異体

Claims (21)

  1.  配列番号1のアミノ酸配列において、以下の(1)~(23)の中のいずれか一つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列(但し、前記アミノ酸置換の位置以外の部分でアミノ酸配列の相違が生じている)を有し、配列番号1のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して、(1R,3S)-菊酸エチルに対する反応性が向上している改変型エステラーゼ:
     (1)変異点がF58、置換後のアミノ酸がE、I、C、A、M又はY;
     (2)変異点がD227、置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H、G、F又はV;
     (3)変異点がI228、置換後のアミノ酸がY、S、T又はW;
     (4)変異点がL229、置換後のアミノ酸がY、F又はV;
     (5)変異点がL231、置換後のアミノ酸がM、A又はG;
     (6)変異点がS244、置換後のアミノ酸がF;
     (7)変異点がA245、置換後のアミノ酸がN又はG;
     (8)変異点がV297、置換後のアミノ酸がR、W、Q、A又はI;
     (9)変異点がF298、置換後のアミノ酸がS;
     (10)変異点がA328、置換後のアミノ酸がN;
     (11)変異点がA328、置換後のアミノ酸がG;
     (12)変異点がA328とF58、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F58の置換後のアミノ酸がL又はE;
     (13)変異点がA328とL151、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L151の置換後のアミノ酸がQ、R、H、W、A、V、M、N、C、T又はI;
     (14)変異点がA328とF217、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R、E、V又はY;
     (15)変異点がA328とS220、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点S220の置換後のアミノ酸がQ、L、N又はG;
     (16)変異点がA328とA221、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R、G又はS;
     (17)変異点がA328とD227、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点D227の置換後のアミノ酸がE又はC;
     (18)変異点がA328とI228、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点I228の置換後のアミノ酸がL又はG;
     (19)変異点がA328とL229、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V、I又はH;
     (20)変異点がA328とV297、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点V297の置換後のアミノ酸がC又はL;
     (21)変異点がA328とA221とD326、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV;
     (22)変異点がA328とA221とD326とF298、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL;
     (23)変異点がA328とA221とD326とF298とN222、変異点A328の置換後のアミノ酸がG、変異点A221の置換後のアミノ酸がF、変異点D326の置換後のアミノ酸がV、変異点F298の置換後のアミノ酸がL、変異点N222の置換後のアミノ酸がD。
  2.  (1)の置換後のアミノ酸がE、I、C、A又はMであり、
     (2)の置換後のアミノ酸がI、S、A、W、H又はGであり、
     (3)の置換後のアミノ酸がY又はSであり、
     (4)の置換後のアミノ酸がY又はFであり、
     (5)の置換後のアミノ酸がM又はAであり、
     (8)の置換後のアミノ酸がR、W又はQであり、
     (12)の変異点F58の置換後のアミノ酸がLであり、
     (13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQ又はRであり、
     (14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D、T、R又はEであり、
     (15)の変異点S220の置換後のアミノ酸がQ又はLであり、
     (16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E、R又はGであり、
     (19)の変異点L229の置換後のアミノ酸がR、V又はIである、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
  3.  (4)の置換後のアミノ酸がYであり、
     (5)の置換後のアミノ酸がMであり、
     (8)の置換後のアミノ酸がR又はWであり、
     (13)の変異点L151の置換後のアミノ酸がQであり、
     (14)の変異点F217の置換後のアミノ酸がW、G、A、D又はTであり、
     (16)の変異点A221の置換後のアミノ酸がF、M、L、V、E又はRである、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
  4.  アミノ酸置換が(11)~(23)の中のいずれか一つであり、(1R,3S)-菊酸エチルに対する選択性が向上している、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
  5.  アミノ酸置換が、A328G、A328G/F217W、A328G/A221M、A328G/A221L、A328G/A221V、又はA328G/I228Lである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
  6.  アミノ酸置換がA328G/A221Fであり、(1R,3S)-菊酸エチル特異的に作用する、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
  7.  アミノ酸置換がA328G/A221F/D326Vである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
  8.  アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298Lである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
  9.  アミノ酸置換がA328G/A221F/D326V/F298L/N222Dである、請求項4に記載の改変型エステラーゼ。
  10.  前記同一性が95%以上である、請求項1~9のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼ。
  11.  配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の改変型エステラーゼ。
  12.  請求項1~11のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
  13.  配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、請求項12に記載の遺伝子。
  14.  請求項12又は13に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
  15.  請求項14に記載の組換えDNAを保有する微生物。
  16.  請求項1~11のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
  17.  以下のステップ(I)~(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法:
     (I)請求項1~11のいずれか一項の改変型エステラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ;
     (II)前記核酸を発現させるステップ、及び
     (III)発現産物を回収するステップ。
  18.  前記アミノ酸配列が配列番号2~11のいずれかのアミノ酸配列である、請求項17に記載の調製法。
  19.  前記核酸が、配列番号13~22のいずれかの塩基配列を含む、請求項17に記載の調製法。
  20.  請求項1~11のいずれか一項の改変型エステラーゼを(1R,3S)-菊酸エチルに作用させることを特徴とする、(1R,3S)-菊酸の製造方法。
  21.  (1R,3S)-菊酸エチルが、(1R,3R)-菊酸エチル、(1S,3S)-菊酸エチル及び(1S,3R)-菊酸エチルと共存した状態である、請求項20に記載の製造方法。
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