WO2020099571A1 - Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique - Google Patents

Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique Download PDF

Info

Publication number
WO2020099571A1
WO2020099571A1 PCT/EP2019/081339 EP2019081339W WO2020099571A1 WO 2020099571 A1 WO2020099571 A1 WO 2020099571A1 EP 2019081339 W EP2019081339 W EP 2019081339W WO 2020099571 A1 WO2020099571 A1 WO 2020099571A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
composition according
composition
vitamin
lymphocytes
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/081339
Other languages
English (en)
Inventor
Joffrey DE LARICHAUDY
Sandy CAZALON NEMORIN
Original Assignee
Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies filed Critical Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Priority to EP19801368.2A priority Critical patent/EP3880167A1/fr
Priority to US17/293,867 priority patent/US20220226383A1/en
Publication of WO2020099571A1 publication Critical patent/WO2020099571A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions

Definitions

  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising, in a physiologically acceptable medium:
  • composition having a pH between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the present invention also relates to a method for preserving a sample of cells for therapeutic purposes, comprising at least one step of mixing the sample of cells for therapeutic purposes with:
  • composition thus obtained having a pH between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the present invention also relates to the use of a composition comprising, in a physiologically acceptable medium:
  • the biological material is preserved by the freezing of said material, in an appropriate support, such as a tube or an ampoule of glass or plastic material (generally called “straw” or freezing tube in the field of cryopreservation), said support being suitable for long-term storage and at low temperature; it's cryopreservation.
  • an appropriate support such as a tube or an ampoule of glass or plastic material (generally called “straw” or freezing tube in the field of cryopreservation)
  • straw or freezing tube in the field of cryopreservation
  • cryopreservation poses a number of problems and technical constraints.
  • cell damage can occur during thawing, resulting in apoptosis or bursting of the cells.
  • survival of cryopreserved cells may depend on the conditions and techniques used during freezing.
  • cryoprotectants it is also essential to use cryoprotectants to preserve cellular integrity and functionality.
  • the finished product is packaged:
  • the composition according to the invention makes it possible to meet this need.
  • the composition according to the invention makes it possible to obtain cell therapy products comprising cells for therapeutic purposes, ready for use (ie ready to be injected without washing, which avoids all additional manipulations causing a drop in viability and loss of cells), easy to use and non-toxic.
  • the composition according to the invention makes it possible to preserve the viability of cells for therapeutic purposes, and their functionality is maintained (ie for one, two, three days up to a week).
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising, in a physiologically acceptable medium:
  • composition having a pH between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the present invention also relates to a method for preserving a sample of cells for therapeutic purposes, comprising at least one step of mixing the sample of cells for therapeutic purposes with:
  • composition thus obtained having a pH between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the present invention also relates to the use of a composition comprising, in a physiologically acceptable medium:
  • composition according to the invention therefore comprises, in a physiologically acceptable medium: a) at least one saccharide,
  • the composition has a pH of between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the composition according to the invention is directly injectable into the patient.
  • physiologically acceptable medium an aqueous medium comprising electrolytes.
  • the electrolytes are, for example, sodium, potassium, magnesium and / or calcium salts with anions of the chloride, acetate, carbonate, hydrogen carbonate, hydroxide or citrate type.
  • the physiologically acceptable medium is an aqueous medium comprising at least sodium chloride, potassium chloride and calcium chloride.
  • the physiologically acceptable medium also comprises sodium acetate and trisodium citrate.
  • Sodium is preferably present in the composition according to the invention in a concentration between 130 and 200 mmol / L, preferably between 135 and 190 mmol / L, preferably between 138 and 188 mmol / L.
  • Potassium is preferably present in the composition according to the invention in a concentration between 0.5 and 5.0 mmol / L, preferably between 1.0 and 4.5 mmol / L, preferably between 1.5 and 4.0 mmol / L.
  • Calcium is preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 0.01 and 10 mmol / L, preferably between 0.01 and 1 mmol / L, preferably between 0.01 and 0.05 mmol / L.
  • the chloride is preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 40 and 110 mmol / L, preferably between 70 and 105 mmol / L, preferably between 65 and 100 mmol / L.
  • Magnesium is preferably present in the composition according to the invention in a concentration between 0 and 5 mmol / L, preferably between 0.5 and 4.5 mmol / L, preferably between 1 and 3.5 mmol / L.
  • the physiologically acceptable medium preferably comprises at least one hydrogencarbonate salt (HC0 3 ) (also called bicarbonate).
  • HC0 3 hydrogencarbonate salt
  • the physiologically acceptable medium comprises sodium hydrogencarbonate.
  • the physiologically acceptable medium is such that the composition which contains it has a pH of between 7.0 and 8.5, preferably between 7.0 and 8.3.
  • the HC0 3 ions are present to adjust the pH within this range of values.
  • the bicarbonate is present in the composition according to the invention at a concentration of between 20 and 100 mmol / L, preferably between 20 and 80 mmol / L, preferably between 20 and 60 mmol / L, preferably between 20 and 55 mmol / L.
  • the composition according to the invention has an osmolarity of between 250 and 400 mOsm / L, preferably between 260 and 390 mOsm / L, preferably between 280 and 320 mOsm / L.
  • the composition according to the invention comprises at least one saccharide (compound a)).
  • the saccharide improves cell survival and function by preserving the osmotic balance. A fraction penetrates the cells and makes it possible to stabilize the membrane structures.
  • the saccharide is preferably chosen from monosaccharides, disaccharides and trisaccharides.
  • the monosaccharides are preferably chosen from glucose, galactose, fructose and mannose.
  • the saccharide is glucose.
  • the disaccharide preferably has the formula A-B, in which A and B are each independently chosen from glucose, fructose and mannose.
  • the saccharide is preferably a disaccharide.
  • the disaccharide is preferably a glucose dimer. More preferably, the disaccharide is chosen from trehalose and sucrose.
  • the trisaccharides are preferably chosen from raffinose (galactose trimer, glucose and fructose), maltotriose and isomaltotriose (glucose trimer).
  • the saccharide is preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 10 and 20 mmol / L, preferably between 10 and 15 mmol / L, preferably between 12.5 and 15 mmol / L.
  • the composition according to the invention comprises at least one vitamin (compound b)).
  • the vitamin (s) is (are) chosen in particular from the vitamins B1 (thiamine), B2 (riboflavin), B4 (choline), B5 (panthotenic acid), B6 (pyridoxal), B7 (inositol) , B9 (folic acid), PP (nicotinamide) and their mixtures.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of vitamins B1, B2, B4, B5, B6, B7, B9 and PP.
  • a mixture of vitamins is in particular marketed by Thermo Fisher under the reference Gibco® MEM Vitamin Solution (100X).
  • the vitamin (s) is (are) preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 0.1 and 100 mg / L, preferably between 0.5 and 90 mg / L , preferably between 1 and 80 mg / L, preferably between 1, 5 and 70 mg / L, preferably between 2 and 60 mg / L, preferably between 2.5 and 50 mg / L, preferably between 3 and 40 mg / L, preferably between 3.5 and 30 mg / L, preferably between 4 and 20 mg / L, preferably between 4.5 and 20 mg / L, preferably between 5 and 10 mg / L.
  • composition according to the invention comprises at least one amino acid (compound c)).
  • the amino acid (s) is (are) chosen from glutamine, alanyl-glutamine, tryptophan, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine , leucine and isoleucine, arginine, histidine, tyrosine, cysteine and their mixtures.
  • the composition according to the invention comprises at least one mixture of glutamine and alanyl-glutamine, in particular a mixture of L-glutamine and L-alanyl-L-glutamine.
  • the composition according to the invention comprises essential amino acids.
  • An essential amino acid is an amino acid which cannot be synthesized de novo by the body (generally human) or which is synthesized at an insufficient speed, and must therefore be provided by food, a condition necessary for the proper functioning of the organization.
  • tryptophan In humans, there are eight essential amino acids: tryptophan, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine, leucine and isoleucine.
  • composition according to the invention preferably comprises the eight essential amino acids mentioned above, as well as arginine, histidine, tyrosine and cysteine.
  • arginine a mixture of amino acids is notably marketed by Thermo Fisher under the reference Gibco® MEM Amino Acids 50X.
  • the amino acids are preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 10 and 700 mg / L, preferably between 50 and 700 mg / l, of preferably between 100 and 700 mg / L, preferably between 150 and 700 mg / L, preferably between 200 and 700 mg / L, preferably between 250 and 700 mg / L, preferably between 300 and 700 mg / L, preferably between 300 and 600 mg / L.
  • composition according to the invention preferably comprises a mixture of the eight essential amino acids mentioned above, arginine, histidine, tyrosine, cysteine, glutamine and alanyl-glutamine.
  • composition according to the invention comprises cysteine.
  • composition according to the invention comprises at least one antioxidant (compound d)).
  • antioxidant is meant any compound which makes it possible to slow down or prevent the oxidation caused by an oxidizing agent which can lead to the production of free radicals.
  • the antioxidant makes it possible to protect cells from oxidative stress and therefore to maintain or improve their viability.
  • the composition according to the invention comprises at least one antioxidant chosen from glutathione, vitamin C, vitamin E, vitamin A, L-cysteine or coenzyme Q10.
  • the composition according to the invention comprises glutathione.
  • the antioxidant (s) is (are) present in the composition according to the invention in a concentration of between 0.5 and 2 g / L, preferably between 0.5 and 1.5 g / L, preferably between 0.8 and 1 g / L.
  • composition according to the invention further comprises a platelet lysate.
  • the platelet lysate is preferably present in the composition according to the invention in a concentration of between 5% and 30% by volume, preferably between 15% and 25% by volume relative to the total volume of composition.
  • the platelet lysate comprises at least one growth factor chosen from TGF-beta1, EGF, PDGF-AB, IGF-1, VEGF, bFGF and their mixtures.
  • the composition according to the invention is substantially free of dextran.
  • substantially free composition is meant that this composition contains less than 10% by weight, preferably less than 5% by weight, preferably less than 3% by weight, preferably less than 1% by weight of dextran.
  • the composition according to the invention does not contain dextran.
  • composition according to the invention comprises, in an aqueous medium comprising electrolytes:
  • composition according to the invention is particularly advantageous, and aims to preserve at least one sample of cells for therapeutic purposes.
  • the compounds a) to d) used in the composition make it possible to conserve the cells for therapeutic purposes, in a lasting and effective manner.
  • the cell viability after 24 hours of incubation in the composition of the invention at a temperature between +1 ° C and + 5 ° C inclusive, preferably at a temperature of + 4 ° C, is between 85% and 100%
  • the cell viability after 48 hours of incubation in the composition of the invention at a temperature between +1 ° C and + 5 ° C inclusive, preferably at a temperature of + 4 ° C, is between 80% and 100%
  • cell viability is measured directly on the cells in the composition of the invention by flow cytometry after labeling the cells with propidium lodide (PI) which is a marker for cell viability.
  • PI propidium lodide
  • cell viability is measured directly on the cells in the composition of the invention by counting on Malassez cells after labeling the cells with trypan blue.
  • cell viability is measured directly on the cells in the composition of the invention by counting with a counting machine such as Nucleocounter after labeling with Acridine Orange (cell marker) and DAPI (marker cell mortality).
  • therapeutic cells is meant cells which constitute in themselves the therapeutic product, and which are administered to the patient. These cells are distinct from cells which are cultured for the production of biological drugs, such as for example CHO, HEK or YB2 / 0 cells, and which are not intended to be administered to the patient.
  • the cells for therapeutic purposes are preferably chosen from:
  • - immune cells such as NK cells, monocytes, B lymphocytes, T lymphocytes, natural or genetically modified, such as regulatory T lymphocytes, T lymphocytes infiltrating tumors, cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes (or helper) and T lymphocytes having a chimeric antigen receptor (CAR);
  • NK cells such as NK cells, monocytes, B lymphocytes, T lymphocytes, natural or genetically modified, such as regulatory T lymphocytes, T lymphocytes infiltrating tumors, cytotoxic T lymphocytes, helper T lymphocytes (or helper) and T lymphocytes having a chimeric antigen receptor (CAR);
  • CAR chimeric antigen receptor
  • NK cells are cells of innate immunity. These are non-T (CD3-), non-B (CD19-) lymphocytes, characterized in humans by the markers CD56, CD16 and NK.
  • Monocytes are leukocytes which evolve into macrophages, dendritic cells or osteoclasts.
  • B lymphocytes are the immune cells responsible for the production of antibodies.
  • Regulatory T cells are a subpopulation of CD4 + T cells, which inhibit the proliferation of other effector T cells.
  • Cytotoxic T cells are a subpopulation of CD8 + T cells, which destroy infected cells.
  • Helper T cells are a subpopulation of CD4 + T cells, which are intermediaries of the immune response.
  • T lymphocytes with a chimeric antigen receptor also called CAR-T cells
  • CAR chimeric antigen receptor
  • T lymphocytes which express a chimeric antigen receptor are capable of killing cancer cells, by recognition and binding to the tumor antigen present on said cancer cells.
  • the therapeutic cell sample can come from the patient to be treated (in this case the patient and the donor are the same person), by biopsy or blood sample.
  • the composition obtained and stored will be administered to the same patient: it is an autologous product.
  • the cell sample for therapeutic purposes may come from another source (i.e. another individual, cell engineering), in particular by biopsy or blood sample.
  • the composition obtained and stored will be administered to a patient to be treated other than the donor: it is an allogenic product.
  • the composition according to the invention comprises a concentration of cells of between 2 and 300 M cells / mL, preferably between 10 and 200 M cells / mL, preferably between 20 and 100 M cells / mL.
  • the present invention also relates to a method for preserving a sample of cells for therapeutic purposes, comprising at least one step of mixing the sample of cells for therapeutic purposes with:
  • composition thus obtained having a pH between 7.0 and 8.5., preferably between 7.0 and 8.3.
  • the step of mixing the sample of cells for therapeutic purposes with the various compounds described above is typically done by dilution.
  • the mixing can be done at a temperature between +1 ° C and + 20 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 20 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 15 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 10 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 6 ° C inclusive, preferably at 4 ° C.
  • the cell sample for therapeutic purposes is, for its part, previously cultured in vitro, in an appropriate culture medium.
  • the sample can then be stored at a temperature between +1 ° C and + 20 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 20 ° C inclusive, preferably between + 2 ° C and + 15 ° C inclusive , preferably between + 2 ° C and + 10 ° C inclusive, preferably between +2 and + 6 ° C inclusive, preferably at + 4 ° C.
  • the myoblasts can be prepared as described in application FR2810045.
  • Mesenchymal stem cells can be prepared as described in Sensebé L, Bourin P, Tarte K. Good manufacturing practices production of mesenchymal stem / stromal cells. Hum Gene Ther. 201 Jan 1; 22 (1): 19-26.
  • composition in platelet lysate The ingredient “5X ion solution” corresponds to:
  • Glutathione 5X ion solution corresponds to:
  • the ingredient “5X ion solution 50% water” corresponds to:
  • the ingredient “5X ion solution 50% water + glutathione” corresponds to:
  • the ingredient "Ringer Solution” corresponds to:
  • the viability of the myoblasts was measured according to the protocol below:
  • the viability measurement by flow cytometry is carried out after labeling the cells with propidium lodide (PI) which is a marker of cell viability. It makes it possible to determine the viability of the cells.
  • PI propidium lodide
  • the percentage of myoblasts is measured by flow cytometry. It corresponds to the percentage of living cells IP-, CD56 +, CD15- after labeling the cells with specific antibodies CD56, CD15 and IP. Indeed, the product tested also contains impurities which are CD56- and CD15 + or - cells and which can take precedence over myoblasts because they are less demanding in terms of culture. The goal is to maintain the percentage of myoblasts in the product after freezing and therefore to get closer to the value before freezing. Cell viability and the measurement of the percentage of myoblasts were analyzed directly before formulation (TOh) then 24, 48, 72 or 144 hours after formulation and incubation at +3 ⁇ 2 ° C.
  • the viabilities of the cells obtained after storage for 72 hours in the formulations comprising glutathione are greater than 70% (cf. formulations 3 and 7);
  • the most effective formulation seems to be formulation 3 or 7 (Plasmalyte or Ringer solution formulation, without dextran and with glutathione). They allow the conservation of more than 85% of the cells after 24 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C, more than 80% of the cells after 48 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C and more than 70% of the cells after 72 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C.
  • the cells were first concentrated to 2000 cells / pL and then diluted to 1 ⁇ 2 with trypan blue (marker of cell mortality). A volume of 1 mm 3 of cells diluted in the Trypan blue solution is deposited on a Malassez cell and the cells are counted under the microscope (objective 40). Dead cells are marked with trypan blue while living cells are able to release it and are therefore not stained.
  • the "DP AH4%" corresponds to the reference solution in which the cells are formulated only in 4% human albumin and stored for 24 hours at +3 ⁇ 2 ° C.
  • the Drug Substance "DS" corresponds to cells from the harvest at the end of the process before formulation.
  • An analysis of the cell phenotype is carried out in order to determine the stability of the MSCs in formulation in solutions A, Abis, B and C.
  • the phenotype is analyzed by flow cytometry and corresponds to the percentage of CD90 + / CD73 + / CD45- / CD34 cells - using specific antibodies CD90, CD73, CD45 and CD34 labeled with Phycoerythrin (PE).
  • PE Phycoerythrin
  • the cells When the cells are formulated in solutions A, Abis, B and C, they are stored for 72 h at +3 ⁇ 2 ° C. At 72 hours, the phenotype of the cells is observed.
  • the Drug Substance "DS" corresponds to cells from the harvest at the end of the process before formulation.
  • the phenotype of MSCs formulated in solutions A, Abis, B and C is well preserved after 72 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C (more than 95% of markers CD90 and CD73, less than 2% of markers CD45 and CD34 ).
  • the apoptosis test helps determine early cell death from apoptosis.
  • the principle of the apoptosis test is based on a double SYTOX green marking (membrane integrity marker - dead cell marker), Annexin V (early apoptosis marker) analyzed by flow cytometry. This labeling makes it possible to distinguish cells in early apoptosis (SYTOX- / AnnexinV +), dead cells (SYTOX + / AnnexinV +) and living cells (SYTOX- / AnnexinV-).
  • the cells When the cells are formulated in solutions A, Abis, B and C, they are stored for 72 h at +3 ⁇ 2 ° C. At 72 hours, the apoptosis test is then carried out.
  • the "DP AH4%" corresponds to the reference solution in which the cells are formulated only in 4% human albumin and stored for 24 hours at +3 ⁇ 2 ° C.
  • the Drug Substance "DS" corresponds to cells from the harvest at the end of the process before formulation.
  • the percentage of non-apoptotic cells after 72 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C for the formulations prepared with solutions A, Abis, B and C is greater than the percentage of non-apoptotic cells of the cells formulated in the reference solution (DP AH4 %) after 24 hours at +3 ⁇ 2 ° C.
  • the formulations prepared A, Abis, B and C allow good cell conservation (more than 70% of viable cells after 72 hours of storage at +3 ⁇ 2 ° C).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) au moins un saccharide, b) au moins une vitamine, c) au moins un acide aminé, d) au moins un antioxydant, et e) des cellules à visée thérapeutique, ladite composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence entre 7.0 et 8.3. Elle se rapporte également à un procédé de conservation d'un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec les ingrédients a) à d) ci-dessus et un milieu physiologiquement acceptable, la composition ainsi obtenue ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3.

Description

Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique
La présente invention concerne une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
e) des cellules à visée thérapeutique,
ladite composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence entre 7.0 et 8.3.
La présente invention se rapporte également à un procédé de conservation d’un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
un milieu physiologiquement acceptable,
la composition ainsi obtenue ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3.
La présente invention se rapporte également à l’utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant,
et ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3, pour la conservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique.
La conservation d’échantillons biologiques, notamment dans un but thérapeutique, est un enjeu crucial pour l’industrie pharmaceutique.
En général, le matériel biologique est conservé par la congélation dudit matériel, dans un support approprié, tel qu'un tube ou une ampoule en verre ou en matière plastique (généralement appelé "paillette" ou tube de congélation dans le domaine de la cryoconservation), ledit support étant adapté pour le stockage à long terme et à basse température ; c’est la cryoconservation.
La cryoconservation pose cependant un certain nombre de problèmes et de contraintes techniques. Notamment, des lésions cellulaires peuvent se produire lors de la décongélation, entraînant l'apoptose ou l'éclatement des cellules. En outre, la survie des cellules cryoconservées peut dépendre des conditions et des techniques employées lors de la congélation. Pour la plupart des cellules de mammifères, comme cela est le cas pour les produits et médicaments de thérapie cellulaire, il est en outre indispensable d'utiliser des cryoprotectants pour préserver l'intégrité et la fonctionnalité cellulaires.
Actuellement, la fabrication à une échelle industrielle (européenne ou mondiale notamment) de produits de thérapie cellulaire pose de nouvelles problématiques, telles que la stabilité du produit fini administré et la variabilité liée à la matière biologique de départ.
Dans la plupart des cas, le produit fini est conditionné :
- frais dans un milieu liquide (type albumine ou solution saline) avec une conservation limitée à quelques heures, ou bien
- congelé dans une formulation simple à base de DMSO, peu stable et peu efficace à long terme. La quantité non négligeable de cellules mortes, de débris aux effets potentiellement immunogènes et la toxicité pour le patient des excipients couramment utilisés sont autant de limites. La plupart du temps, un lavage des cellules avant administration pour retirer ces éléments toxiques (biologiques ou non) est indiqué. Ces solutions ne sont donc pas compatibles avec une distribution industrielle, et offrent peu de flexibilité d'administration et de stockage.
Il existe donc un besoin pour le développement d'un produit et/ou médicament de thérapie cellulaire qui soit stable à long terme (i.e. pendant un, deux, trois jours jusqu’à une semaine), qui soit facile à utiliser, directement injectable et non toxique.
En outre, un tel produit et/ou médicament de thérapie cellulaire doit présenter une viabilité et une fonctionnalité cellulaires préservées.
La présente invention permet de répondre à ce besoin. En effet, la composition selon l'invention permet d'obtenir des produits de thérapie cellulaire comprenant des cellules à visée thérapeutique, prêts à l'emploi (i.e. prêts à être injectés sans lavage, ce qui évite toutes manipulations supplémentaires provoquant une baisse de viabilité et une perte de cellules), faciles à utiliser et non toxiques. En outre, la composition selon l’invention permet de préserver la viabilité des cellules à visée thérapeutique, et leur fonctionnalité est maintenue (i.e. pendant un, deux, trois jours jusqu’à une semaine).
La présente invention concerne une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
e) des cellules à visée thérapeutique,
ladite composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence entre 7.0 et 8.3.
La présente invention se rapporte également à un procédé de conservation d’un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
un milieu physiologiquement acceptable,
la composition ainsi obtenue ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3.
La présente invention se rapporte également à l’utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant,
et ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3, pour la conservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique.
La composition selon l'invention comprend donc, dans un milieu physiologiquement acceptable : a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
e) des cellules à visée thérapeutique,
En outre, la composition a un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence entre 7.0 et 8.3.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention est directement injectable au patient.
Par « milieu physiologiquement acceptable », on entend un milieu aqueux comprenant des électrolytes. Les électrolytes sont par exemple des sels de sodium, de potassium, de magnésium et/ou de calcium avec des anions de type chlorure, acétate, carbonate, hydrogénocarbonate, hydroxyde ou citrate. De préférence, le milieu physiologiquement acceptable est un milieu aqueux comprenant au moins du chlorure de sodium, du chlorure de potassium et du chlorure de calcium. Selon cette dernière phrase, de préférence, le milieu physiologiquement acceptable comprend en outre de l’acétate de sodium et du citrate trisodique.
Le sodium est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 130 et 200 mmol/L, de préférence entre 135 et 190 mmol/L, de préférence entre 138 et 188 mmol/L.
Le potassium est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0.5 et 5.0 mmol/L, de préférence entre 1 .0 et 4.5 mmol/L, de préférence entre 1.5 et 4.0 mmol/L.
Le calcium est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0.01 et 10 mmol/L, de préférence entre 0.01 et 1 mmol/L, de préférence entre 0.01 et 0.05 mmol/L.
Le chlorure est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 40 et 1 10 mmol/L, de préférence entre 70 et 105 mmol/L, de préférence entre 65 et 100 mmol/L.
Le magnésium est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0 et 5 mmol/L, de préférence entre 0.5 et 4.5 mmol/L, de préférence entre 1 et 3.5 mmol/L. Le milieu physiologiquement acceptable comprend de préférence au moins un sel d’hydrogénocarbonate (HC03 ) (appelé aussi bicarbonate). De préférence le milieu physiologiquement acceptable comprend de l’hydrogénocarbonate de sodium.
De préférence, le milieu physiologiquement acceptable est tel que la composition qui le contient a un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence entre 7.0 et 8.3. En particulier, les ions HC03 sont présents pour ajuster le pH dans cette gamme de valeurs.
De préférence, le bicarbonate est présent dans la composition selon l’invention à une concentration comprise entre 20 et 100 mmol/L, de préférence entre 20 et 80 mmol/L, de préférence entre 20 et 60 mmol/L, de préférence entre 20 et 55 mmol/L.
De préférence, la composition selon l'invention présente une osmolarité comprise entre 250 et 400 mOsm/L, de préférence entre 260 et 390 mOsm/L, de préférence entre 280 et 320 mOsm/L.
La composition selon l’invention comprend au moins un saccharide (composé a)). Le saccharide améliore la survie et la fonction des cellules en préservant l'équilibre osmotique. Une fraction pénètre les cellules et permet de stabiliser les structures membranaires. Le saccharide est de préférence choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides.
Les monosaccharides sont de préférence choisis parmi le glucose, le galactose, le fructose et le mannose. De préférence, le saccharide est le glucose.
Le disaccharide a de préférence pour formule A-B, dans laquelle A et B sont chacun indépendamment choisis parmi le glucose, le fructose et le mannose. Le saccharide est de préférence un disaccharide. Le disaccharide est de préférence un dimère de glucose. Plus préférentiellement, le disaccharide est choisi parmi le tréhalose et le saccharose.
Les trisaccharides sont de préférence choisis parmi le raffinose (trimère de galactose, glucose et fructose), le maltotriose et l'isomaltotriose (trimères de glucose).
Le saccharide est de préférence présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 10 et 20 mmol/L, de préférence entre 10 et 15 mmol/L, de préférence entre 12,5 et 15 mmol/L.
La composition selon l’invention comprend au moins une vitamine (composé b)). Le(s) vitamine(s) est (sont) notamment choisie(s) parmi les vitamines B1 (thiamine), B2 (riboflavine), B4 (choline), B5 (acide panthoténique), B6 (pyridoxal), B7 (inositol), B9 (acide folique), PP (nicotinamide) et leurs mélanges.
De préférence, la composition selon l'invention comprend un mélange de vitamines B1 , B2, B4, B5, B6, B7, B9 et PP. Un tel mélange de vitamines est notamment commercialisé par Thermo Fisher sous la référence Gibco® MEM Vitamin Solution (100X).
La (ou les) vitamine(s) est(sont) de préférence présente(s) dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0,1 et 100 mg/L, de préférence entre 0,5 et 90 mg/L, de préférence entre 1 et 80 mg/L, de préférence entre 1 ,5 et 70 mg/L, de préférence entre 2 et 60 mg/L, de préférence entre 2,5 et 50 mg/L, de préférence entre 3 et 40 mg/L, de préférence entre 3,5 et 30 mg/L, de préférence entre 4 et 20 mg/L, de préférence entre 4,5 et 20 mg/L, de préférence entre 5 et 10 mg/L.
La composition selon l’invention comprend au moins un acide aminé (composé c)). De préférence, le (les) acide(s) aminé(s) est (sont) choisi(s) parmi la glutamine, l’alanyl- glutamine, le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine, l’arginine, l’histidine, la tyrosine, la cystéine et leurs mélanges.
De préférence, la composition selon l'invention comprend au moins un mélange de glutamine et d’alanyl-glutamine, en particulier un mélange de L-glutamine et de L-alanyl- L-glutamine.
De préférence, la composition selon l'invention comprend des acides aminés essentiels. Un acide aminé essentiel est un acide aminé qui ne peut être synthétisé de novo par l'organisme (généralement humain) ou qui est synthétisé à une vitesse insuffisante, et doit donc être apporté par l'alimentation, condition nécessaire au bon fonctionnement de l'organisme.
Chez l'homme, on compte huit acides aminés essentiels : le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine.
La composition selon l’invention comprend de préférence les huit acides aminés essentiels précités, ainsi que de l’arginine, de l’histidine, de la tyrosine et de la cystéine. Un tel mélange d’acides aminés est notamment commercialisé par Thermo Fisher sous la référence Gibco® MEM Amino Acids 50X.
Les acides aminés sont de préférence présents dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 10 et 700 mg/L, de préférence entre 50 et 700 mg/l, de préférence entre 100 et 700 mg/L, de préférence entre 150 et 700 mg/L, de préférence entre 200 et 700 mg/L, de préférence entre 250 et 700 mg/L, de préférence entre 300 et 700 mg/L, de préférence entre 300 et 600 mg/L.
La composition selon l'invention comprend de préférence un mélange des huit acides aminés essentiels précités, de l’arginine, de l’histidine, de la tyrosine, de la cystéine, de la glutamine et de l’alanyl-glutamine.
De préférence la composition selon l’invention comporte de la cystéine.
La composition selon l’invention comprend au moins un antioxydant (composé d)). Par « antioxydant », il est entendu tout composé permettant de ralentir ou empêcher l’oxydation provoquée par un agent oxydant pouvant entraîner la production de radicaux libres. Dans la composition de la présente invention, l’antioxydant permet de protéger les cellules du stress oxydatif et donc de maintenir ou améliorer leur viabilité.
De préférence, la composition selon l’invention comprend au moins un antioxydant choisi parmi le glutathion, la vitamine C, la vitamine E, la vitamine A, la L-cystéine ou le coenzyme Q10.
De préférence, la composition selon l’invention comprend du glutathion.
De préférence, le(s) antioxydant(s) est (sont) présent dans la composition selon l'invention en concentration comprise entre 0,5 et 2 g/L, de préférence entre 0,5 et 1 ,5 g/L, de préférence entre 0,8 et 1 g/L.
De préférence, la composition selon l’invention comprend en outre un lysat plaquettaire.
Le lysat plaquettaire est de préférence présent dans la composition selon l’invention en concentration comprise entre 5% et 30% en volume, de préférence entre 15% et 25% en volume par rapport au volume total de composition.
De préférence, le lysat plaquettaire comprend au moins un facteur de croissance choisi parmi TGF-beta1 , EGF, PDGF-AB, IGF-1 , VEGF, bFGF et leurs mélanges.
De préférence, la composition selon l’invention est substantiellement exempte de dextran. Par composition « substantiellement exempte », on entend que cette composition contient moins de 10% en poids, de préférence moins de 5% en poids, de préférence moins de 3% en poids, de préférence moins de 1% en poids de dextran. De préférence, la composition selon l'invention ne contient pas de dextran.
De préférence, la composition selon l'invention comprend, dans un milieu aqueux comprenant des électrolytes:
a) du glucose,
b) un mélange de vitamines B1 , B2, B4, B5, B6, B7, B9 et PP,
c) un mélange de glutamine, alanyl-glutamine, tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine, isoleucine, arginine, histidine, tyrosine et de cystéine, et
d) du glutathion.
La composition selon l'invention est particulièrement intéressante, et vise à conserver au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique. En effet, les composés a) à d) utilisés dans la composition permettent de conserver les cellules à visée thérapeutique, de façon durable et efficace.
Par « conservation » ou « préservation », il est entendu que la viabilité cellulaire après 24 heures d’incubation dans la composition de l’invention à une température comprise entre +1 °C et +5°C inclus, de préférence à une température de +4°C, est comprise entre 85% et 100%, la viabilité cellulaire après 48 heures d’incubation dans la composition de l’invention à une température comprise entre +1 °C et +5°C inclus, de préférence à une température de +4°C, est comprise entre 80% et 100%, la viabilité cellulaire après 72 heures d’incubation dans la composition de l’invention à une température comprise entre +1 °C et +5°C inclus, de préférence à une température de +4°C, est comprise entre 70% et 100%.
Dans un mode de réalisation de l’invention, la viabilité cellulaire est mesurée directement sur les cellules dans la composition de l’invention par cytométrie en flux après marquage des cellules au lodure de Propidium (IP) qui est un marqueur de viabilité cellulaire. Dans un second mode de réalisation, la viabilité cellulaire est mesurée directement sur les cellules dans la composition de l’invention par comptage sur cellules de Malassez après marquage des cellules au bleu de trypan. Dans un troisième mode de réalisation, la viabilité cellulaire est mesurée directement sur les cellules dans la composition de l’invention par comptage avec un automate de comptage tel que Nucleocounter après marquage avec de l’Acridine Orange (marqueur cellulaire) et du DAPI (marqueur de mortalité cellulaire). Par « cellules à visée thérapeutique », on entend des cellules qui constituent en elles- mêmes le produit thérapeutique, et qui sont administrées au patient. Ces cellules sont distinctes des cellules qui sont cultivées pour la production de médicaments biologiques, comme par exemple les cellules CHO, HEK ou encore YB2/0, et qui ne sont pas destinées à être administrées au patient.
Parmi les cellules à visée thérapeutique, on peut citer notamment les médicaments de thérapie innovante ou les produits de thérapie cellulaire.
Les cellules à visée thérapeutique (composés d)) sont de préférence choisies parmi :
- les cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes B, les lymphocytes T, naturels ou génétiquement modifiés, tels que les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T infiltrant les tumeurs, les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires (ou helper) et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR) ;
- les myoblastes notamment humains ;
- les cellules souches hématopoïétiques ;
- les cellules souches mésenchymateuses ;
- les cellules cardiaques ;
- les fibroblastes ; et
- toutes autres cellules naturelles ou génétiquement modifiées.
Les cellules NK (ou lymphocytes NK) sont des cellules de l'immunité innée. Ce sont des lymphocytes non T (CD3-), non B (CD19-), caractérisés chez l'homme par les marqueurs CD56, CD16 et NK.
Les monocytes sont des leucocytes qui évoluent en macrophages, cellules dendritiques ou ostéoclastes.
Les lymphocytes B sont les cellules immunitaires responsables de la production d'anticorps.
Les lymphocytes T régulateurs sont une sous-population de lymphocytes T CD4+, qui inhibent la prolifération d'autres lymphocytes T effecteurs.
Les lymphocytes T cytotoxiques sont une sous-population de lymphocytes T CD8+, qui détruisent les cellules infectées.
Les lymphocytes T auxiliaires (helper) sont une sous-population de lymphocytes T CD4+, intermédiaires de la réponse immunitaire.
Enfin, les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), appelés également cellules CAR-T, correspondent à une technologie particulière d'ingénierie cellulaire. Ce sont des lymphocytes T qui expriment un récepteur antigénique chimérique. Les cellules CAR-T sont capables de tuer les cellules cancéreuses, par reconnaissance et liaison à l'antigène tumoral présent sur lesdites cellules cancéreuses.
L'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir du patient à traiter (dans ce cas le patient et le donneur sont la même personne), par biopsie ou prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue et conservée sera administrée à ce même patient : c'est un produit autologue.
Alternativement, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique peut provenir d'une autre source (i.e. autre individu, ingénierie cellulaire), notamment par biopsie ou prélèvement sanguin. Dans ce cas, la composition obtenue et conservée sera administrée à un patient à traiter autre que le donneur : c'est un produit allogénique.
De préférence, la composition selon l'invention comprend une concentration de cellules comprise entre 2 et 300 M cellules / mL, de préférence entre 10 et 200 M cellules / mL, de préférence entre 20 et 100 M cellules / mL.
La présente invention se rapporte également à un procédé de conservation d'un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec:
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant,
un milieu physiologiquement acceptable,
la composition ainsi obtenue ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5., de préférence compris entre 7.0 et 8.3.
Dans ce procédé, l'étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec les différents composés décrits ci-dessus se fait typiquement par dilution. Le mélange peut se faire à une température comprise entre +1 °C et +20°C inclus, de préférence entre +2°C et +20°C inclus, de préférence entre +2°C et +15°C inclus, de préférence entre +2°C et +10°C inclus, de préférence entre +2°C et +6°C inclus, de préférence à 4°C. De préférence, l'échantillon de cellules à visée thérapeutique est, quant à lui, préalablement cultivé in vitro, dans un milieu de culture approprié. Puis il subit une centrifugation, le surnageant est retiré et le culot est suspendu dans un mélange de milieu physiologiquement acceptable et de composés a) à d) décrits ci-dessus, afin d’obtenir une composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, de préférence compris entre 7.0 et 8.3.
L'échantillon peut ensuite être conservé à une température comprise entre +1 °C et +20°C inclus, de préférence entre +2°C et +20°C inclus, de préférence entre +2°C et +15°C inclus, de préférence entre +2°C et +10°C inclus, de préférence entre +2 et +6°C inclus, de préférence à +4°C.
L'invention est illustrée par les exemples suivants, nullement limitatifs.
Exemples :
Exemple 1 : Préparation de formulations selon l'invention
Les formulations suivantes ont été préparées et testées pour leur capacité à préserver les myoblastes (solutions 1 , 3, 4, 6, 7, 8) ou les cellules souches mésenchymateuses (MSC) (A, Abis, B, C).
Les myoblastes peuvent être préparés comme décrit dans la demande FR2810045.
Les cellules souches mésenchymateuses peuvent être préparées comme décrit dans Sensebé L, Bourin P, Tarte K. Good manufacturing practices production of mesenchymal stem/stromal cells. Hum Gene Ther. 201 1 Jan; 22 (1 ): 19-26.
Figure imgf000013_0001
Solutions préparées (volume final de 10 mL) pour la conservation des cellules souches mésenchymateuses (MSC)
Figure imgf000014_0001
* Cf ci-dessous
** Mélange 200mM L-alanyl-L-glutamine
*** Composition en lysat plaquettaire L’ingrédient « Solution d’ions 5X » correspond à :
Figure imgf000015_0001
L’ingrédient « Solution d’ions 5X glutathion » correspond à :
Figure imgf000015_0002
L’ingrédient « Solution d’ions 5X 50% eau » correspond à :
Figure imgf000015_0003
L’ingrédient « Solution d’ions 5X 50% eau + glutathion » correspond à :
Figure imgf000016_0001
L’ingrédient « Solution d’ions 5X Ringer solution + glutathion » correspond à :
Figure imgf000016_0002
L’ingrédient « Plasmalyte » correspond à :
Figure imgf000016_0003
L’ingrédient « Ringer Solution » correspond à :
Figure imgf000017_0001
***Composition en facteurs de croissance du lysat plaquettaire :
Figure imgf000017_0002
Exemple 2 : Préservation des myoblastes dans les formulations de l’invention Protocole expérimental :
La viabilité des myoblastes a été mesurée selon le protocole ci-dessous :
La mesure de la viabilité par cytométrie en flux est effectuée après marquage des cellules au lodure de Propidium (IP) qui est un marqueur de viabilité cellulaire. Il permet de déterminer la viabilité des cellules.
La mesure du pourcentage de myoblastes est réalisée par cytométrie en flux. Elle correspond au pourcentage de cellules vivantes IP-, CD56+, CD15- après marquage des cellules à l’aide d’anticorps spécifiques CD56, CD15 et de IP. En effet, le produit testé contient également des impuretés qui sont des cellules CD56- et CD15+ ou - et qui peuvent prendre le pas sur les myoblastes car moins exigeants en terme de culture. Le but est de maintenir le pourcentage de myoblastes dans le produit après congélation et donc de se rapprocher de la valeur avant congélation. La viabilité cellulaire et la mesure du pourcentage de myoblastes ont été analysées directement avant formulation (TOh) puis 24, 48, 72 ou 144 heures après formulation et incubation à +3 ±2°C.
Résultats :
1ère série d’essais
Figure imgf000018_0001
2ème série d’essais
Figure imgf000018_0002
3ème série d’essais
Figure imgf000018_0003
Il ressort que :
• que les formulations préparées ont un pH physiologique compris entre 7 et 8,5 ;
• que les formulations ont une osmolarité comprise entre 300 et 400 mOsm/L, se rapprochant de l’osmolarité physiologique ;
• les formulations 3 et 7 utilisées pour l’essai 3, préparées 6 jours auparavant et conservées à +3 ±2°C, sont stables et préservent les cellules ;
• l’ajout de dextran 5% provoque un stress pour les cellules et semble impliqué dans une diminution de leur viabilité cellulaire (formulations 4 à 6) ;
• les formulations contenant du glutathion préservent mieux les cellules à +3 ±2°C .
Les viabilités des cellules obtenues après conservation pendant 72h dans les formulations comportant du glutathion sont supérieures à 70% (cf formulations 3 et 7) ;
• l’utilisation du Plasmalyte ou de Ringer solution ne modifie pas la solution (cf formulations 3 et 7) ;
• la formulation la plus efficace semble être la formulation 3 ou 7 (formulation Plasmalyte ou Ringer solution, sans dextran et avec du glutathion). Elles permettent la conservation de plus de 85% des cellules après 24heures de conservation à +3 ±2°C, de plus de 80% des cellules après 48 heures de conservation à +3 ±2°C et de plus de 70% des cellules après 72 heures de conservation à +3 ±2°C.
Exemple 3 : Préservation des cellules souches mésenchymateuses dans les formulations de l’invention
a) Test de viabilité cellulaire
Protocole expérimental
Pour déterminer la viabilité des MSC dans les solutions testées, les cellules ont été d’abord concentrées à 2000 cellules/pL puis diluées au ½ avec du bleu trypan (marqueur de mortalité cellulaire). Un volume de 1 mm3 de cellules diluées dans la solution de bleu Trypan est déposé sur une cellule de Malassez et les cellules sont comptées au microscope (objectif 40). Les cellules mortes sont marquées au bleu trypan alors que les cellules vivantes sont capables de le relarguer et ne sont donc pas colorées.
Le calcul de concentration cellulaire et de viabilité cellulaire se fait selon le calcul suivant :
Figure imgf000020_0002
Lorsque les cellules sont formulées dans les solutions A, Abis, B et C, elles sont conservées pendant 72h à +3 ±2°C, puis la viabilité cellulaire est mesurée.
Le « DP AH4% » correspond à la solution de référence dans laquelle les cellules sont formulées uniquement dans de l’albumine humaine 4% et conservées pendant 24 heures à +3 ±2°C.
La Drug Substance « DS » correspond aux cellules issues de la récolte en fin de procédé avant formulation.
Résultats :
Figure imgf000020_0001
Il ressort que les solutions A, Abis, B et C permettent une bonne conservation des cellules formulées dans ces solutions après 72 heures de conservation à +3 ±2°C (plus de 70% de viabilité cellulaire pour chacune de ces solutions). b) Phénotype
Protocole expérimental :
Une analyse du phénotype des cellules est effectuée afin de déterminer la stabilité des MSC en formulation dans les solutions A, Abis, B et C. Le phénotype est analysé par cytométrie en flux et correspond au pourcentage de cellules CD90+/CD73+/CD45- /CD34- à l’aide d’anticorps spécifiques CD90, CD73, CD45 et CD34 marqués au Phycoerythrin (PE).
Lorsque les cellules sont formulées dans les solutions A, Abis, B et C, elles sont conservées pendant 72h à +3 ±2°C. A 72 heures, le phénotype des cellules est observé.
La Drug Substance « DS » correspond aux cellules issues de la récolte en fin de procédé avant formulation.
Résultats :
Figure imgf000021_0001
Le phénotype des MSC formulées dans les solutions A, Abis, B et C est bien conservé après 72 heures de conservation à +3 ±2°C (plus de 95% des marqueurs CD90 et CD73, moins de 2% des marqueurs CD45 et CD34).
c) Test d’apoptose
Protocole expérimental :
Le test d’apoptose permet de déterminer la mortalité précoce des cellules par apoptose.
Le principe du test d’apoptose repose sur un double marquage SYTOX green (marqueur d’intégrité membranaire - marqueur des cellules mortes), Annexine V (marqueur d’apoptose précoce) analysé par cytométrie en flux. Ce marquage permet de distinguer les cellules en apoptose précoce (SYTOX-/AnnexinV+), des cellules mortes (SYTOX+/AnnexinV+) et vivantes (SYTOX-/AnnexinV-).
Lorsque les cellules sont formulées dans les solutions A, Abis, B et C, elles sont conservées pendant 72h à +3 ±2°C. A 72 heures, le test d’apoptose est ensuite réalisé. Le « DP AH4% » correspond à la solution de référence dans laquelle les cellules sont formulées uniquement dans de l’albumine humaine 4% et conservées pendant 24 heures à +3 ±2°C.
La Drug Substance « DS » correspond aux cellules issues de la récolte en fin de procédé avant formulation.
Résultats
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Le pourcentage de cellules non apoptotiques après 72 heures de conservation à +3 ±2°C pour les formulations préparées avec solutions A, Abis, B et C est supérieur au pourcentage de cellules non apoptotiques des cellules formulées dans la solution de référence (DP AH4%) après 24 heures à +3 ±2°C.
Il ressort de ces analyses que :
- les formulations préparées A, Abis, B et C sont stables et préservent bien le phénotype des MSC pendant 72 heures à +3 ±2°C;
- les formulations préparées A, Abis, B et C permettent une bonne conservation des cellules (plus de 70% de cellules viables après 72 heures de conservation à +3 ±2°C).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
e) des cellules à visée thérapeutique,
ladite composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5.
2. Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu’elle présente un pH compris entre 7.0 et 8.3
3. Composition selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu’elle comporte un lysat plaquettaire.
4. Composition selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le saccharide est choisi parmi les monosaccharides, les disaccharides et les trisaccharides.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la vitamine est choisie parmi les vitamines B1 , B2, B4, B5, B6, B7, B9, PP et leurs mélanges.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce l’acide aminé est choisi parmi la glutamine, l’alanyl-glutamine, le tryptophane, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, la valine, la leucine et l'isoleucine, l’arginine, l’histidine, la tyrosine, la cystéine et leurs mélanges.
7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l’acide aminé est la cystéine.
8. Composition selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l’antioxydant est choisi parmi le glutathion, la vitamine C, la vitamine E, la vitamine A, la L-cystéine ou le coenzyme Q10.
9. Composition selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l’antioxydant est le glutathion.
10. Composition selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu’elle comporte au moins un sel de bicarbonate.
1 1. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les cellules à visée thérapeutique sont choisies parmi les cellules NK, les monocytes, les lymphocytes B, les lymphocytes T naturels ou génétiquement modifiés, tels que les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes T infiltrant la tumeur, les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires (ou helper) et les lymphocytes T ayant un récepteur antigénique chimérique (CAR), les myoblastes notamment humains, les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules cardiaques et les fibroblastes.
12. Composition selon l'une des revendications 1 à 1 1 , caractérisée en ce que le milieu physiologiquement acceptable est un milieu aqueux comprenant des électrolytes, et en ce que la composition comprend:
a) du glucose,
b) un mélange de vitamines B1 , B2, B4, B5, B6, B7, B9 et PP,
c) un mélange de glutamine, alanyl-glutamine, tryptophane, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, valine, leucine, isoleucine, arginine, histidine, tyrosine et de cystéine,
d) du glutathion, et
d) des cellules à visée thérapeutique.
13. Procédé de conservation d'un échantillon de cellules à visée thérapeutique, comprenant au moins une étape de mélange de l'échantillon de cellules à visée thérapeutique avec:
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) au moins un antioxydant, et
un milieu physiologiquement acceptable,
la composition ainsi obtenue ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5.
14. Procédé de conservation selon la revendication 13, caractérisé en ce que le pH est compris entre 7.0 et 8.3.
15. Utilisation d'une composition comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable :
a) au moins un saccharide,
b) au moins une vitamine,
c) au moins un acide aminé,
d) du glutathion,
et ayant un pH compris entre 7.0 et 8.5, pour la conservation d'au moins un échantillon de cellules à visée thérapeutique.
16. Utilisation d'une composition selon la revendication 15, ladite composition ayant un pH compris entre 7.0 et 8.3.
PCT/EP2019/081339 2018-11-15 2019-11-14 Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique WO2020099571A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19801368.2A EP3880167A1 (fr) 2018-11-15 2019-11-14 Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique
US17/293,867 US20220226383A1 (en) 2018-11-15 2019-11-14 Method of preserving cells for therapeutic use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1860544 2018-11-15
FR1860544A FR3088541B1 (fr) 2018-11-15 2018-11-15 Procede de conservation de cellules a visee therapeutique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020099571A1 true WO2020099571A1 (fr) 2020-05-22

Family

ID=65763602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/081339 WO2020099571A1 (fr) 2018-11-15 2019-11-14 Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220226383A1 (fr)
EP (1) EP3880167A1 (fr)
FR (1) FR3088541B1 (fr)
WO (1) WO2020099571A1 (fr)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029230A1 (fr) * 1994-04-20 1995-11-02 Diacrin, Inc. Milieu de culture destine a maintenir la viabilite des cellules de mammiferes
WO2000019817A1 (fr) * 1998-10-07 2000-04-13 Cedars-Sinai Medical Center Preconditionnement cellulaire et milieu de cryopreservation
FR2810045A1 (fr) 2000-06-07 2001-12-14 Assist Publ Hopitaux De Paris Procede d'obtention de population cellulaires caracterisees d'origine musculaire et utilisations
WO2017042501A1 (fr) * 2015-09-10 2017-03-16 Etablissement Francais Du Sang Milieu de conservation injectable pour la conservation de cellules du sang placentaire, de la moelle osseuse et du sang périphérique

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2229436B1 (fr) * 2007-12-04 2017-08-30 Proteobioactives Pty Ltd Protection de cellules progénitrices et régulation de leur différenciation
ES2708999T3 (es) * 2013-06-28 2019-04-12 Otsuka Pharma Factory Inc Solución que contiene trehalosa y dextrano para el trasplante celular de mamíferos
FR3040396A1 (fr) * 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995029230A1 (fr) * 1994-04-20 1995-11-02 Diacrin, Inc. Milieu de culture destine a maintenir la viabilite des cellules de mammiferes
WO2000019817A1 (fr) * 1998-10-07 2000-04-13 Cedars-Sinai Medical Center Preconditionnement cellulaire et milieu de cryopreservation
FR2810045A1 (fr) 2000-06-07 2001-12-14 Assist Publ Hopitaux De Paris Procede d'obtention de population cellulaires caracterisees d'origine musculaire et utilisations
WO2017042501A1 (fr) * 2015-09-10 2017-03-16 Etablissement Francais Du Sang Milieu de conservation injectable pour la conservation de cellules du sang placentaire, de la moelle osseuse et du sang périphérique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SENSEBÉ LBOURIN PTARTE K: "Good manufacturing practices production of mesenchymal stemlstromai cells", HUM GENE THER, vol. 22, no. 1, January 2011 (2011-01-01), pages 19 - 26, XP055080830, DOI: 10.1089/hum.2010.197

Also Published As

Publication number Publication date
US20220226383A1 (en) 2022-07-21
EP3880167A1 (fr) 2021-09-22
FR3088541A1 (fr) 2020-05-22
FR3088541B1 (fr) 2021-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2990348C (fr) Procede de cryoconservation de cellules a visee therapeutique
EP3317400B1 (fr) Procédé de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
CN105324480B (zh) 含有海藻糖及葡聚糖的哺乳动物细胞移植用溶液
FR3017299A1 (fr) Composition pharmaceutique comprenant des erythrocytes encapsulant une enzyme a plp et son cofacteur
KR102019277B1 (ko) 미토콘드리아를 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 조성물
FR2928270A1 (fr) Formulation methode pour la prevention ou le traitement des metastases osseuses et autres maladies de l'os
EP3530729A1 (fr) Liquide de conservation de cellules vivantes ou de composition contenant des cellules vivantes
EP3346833B1 (fr) Utilisation de milieu de conservation injectable pour la conservation de cellules du sang placentaire, de la moelle osseuse et du sang périphérique
JP2009219376A (ja) 医療用細胞の保護用液
WO2020099571A1 (fr) Procédé de conservation de cellules à visée thérapeutique
EP3716762A1 (fr) Procédé de cryoconservation de cellules à visée thérapeutique
EP3316895B1 (fr) Procédé de cryoconservation de cellules à visée thérapeutique
US20210368780A1 (en) Compositions for maintaining the viability of living and static biological material, methods of making and the uses thereof
KR20160108280A (ko) 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물
Shatat et al. Liver protection from acetaminophen hepatotoxicity using copper (I)-nicotinic acid complex
JP2017114828A (ja) Ｎｋｔ細胞活性化医薬組成物、その製造方法、及び抗原提示細胞の保存方法
Li et al. Effects of nanographene oxide on adipose-derived stem cell cryopreservation
CH718339A2 (fr) Formulations pour perfusions intraveineuses comprenant un complexe d'inclusion d'un stilbène en synergie avec des microquantités de mélatonine.
WO2017129907A1 (fr) Microcapsule de cellules primaires

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19801368

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019801368

Country of ref document: EP

Effective date: 20210615