WO2020080884A1 - 락토코커스 중앙젠시스를 함유하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

락토코커스 중앙젠시스를 함유하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020080884A1
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cau
lactococcus
strain
group
metabolic syndrome
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PCT/KR2019/013754
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김원용
장기
김종화
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중앙대학교 산학협력단
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) It relates to a composition for preventing or treating fatty liver or metabolic syndrome. Specifically, a composition for the prevention or treatment of fatty liver or metabolic syndrome comprising at least one selected from the group consisting of Lactococcus chungangensis strain, culture of the strain and fermentation product of the strain will be.
  • Metabolic syndrome refers to cases that simultaneously have cardiovascular risk factors such as hyperlipidemia, hypertension, metabolic abnormalities, blood coagulation abnormalities, and obesity. Many of these risk factors are diabetes and arteriosclerosis. Promotes the onset and increases the risk of developing cardiovascular disease.
  • cardiovascular risk factors such as hyperlipidemia, hypertension, metabolic abnormalities, blood coagulation abnormalities, and obesity. Many of these risk factors are diabetes and arteriosclerosis. Promotes the onset and increases the risk of developing cardiovascular disease.
  • the mechanism underlying metabolic syndrome is not fully understood, but insulin resistance associated with obesity is known to be the main cause. Insulin resistance is known to cause hyperglycemia, hypertension, and dyslipidemia, which causes metabolic syndrome to develop. That is, metabolic syndrome is characterized by an increase in blood pressure, an increase in glucose and triglycerides in plasma, an increase in low-density lipoprotein cholesterol (LDL) and a decrease in high-density lipoprotein cholesterol (HDL).
  • LDL low-density lipoprotein cholesterol
  • HDL
  • Obesity is a metabolic disease caused by an imbalance in consumption and consumption of calories, and refers to an abnormal increase in fat tissue due to excess calories.
  • Fatty acids made from fat tissue accumulated due to obesity increase the concentration of fatty acids in the blood and lower insulin utilization in the liver and muscles.
  • the fatty acid in the blood increases, the cells receive fatty acid instead of glucose, and accordingly, the glucose inflow becomes difficult, causing hyperglycemia, and the high blood glucose concentration stimulates the beta cells of the pancreas to secrete insulin, thereby secreting insulin to increase insulin resistance. do.
  • abdominal obesity increases the risk of pancreatic cancer.
  • Abdominal obesity is caused by storing excess energy in the abdominal viscera and subcutaneously by converting the remaining energy into fat as the underlying metabolism decreases due to an incorrect diet, uncontrolled lifestyle, excessive stress, and lack of exercise.
  • abdominal obesity is associated with drinking, smoking, and high-fat food intake, so it appears easily in middle-aged working men.
  • Simvastatin is a cholesterol-lowering agent commonly used to treat hypercholesterolemia, and is known to exhibit anti-inflammatory effects in metabolic syndrome by reducing the release of anti-inflammatory cytokines into the plasma (Devaraj et al., 2006).
  • non-alcoholic fatty liver lesions are also associated with metabolic syndrome such as obesity, adult-type diabetes, and hyperlipidemia.
  • Fat cells and liver fat accumulate in the body when excessive calories are continuously consumed.
  • fats are diagnosed as fatty liver when excess fat (mainly triglycerides) in the liver accumulates, and more than 5% of the weight of the liver is accumulated.
  • the increased fat releases harmful cytokines from the liver, leading to fatty hepatitis and cirrhosis.
  • Adult-type diabetes which occurs due to resistance to insulin secreted by the body, is also known as a cause of fatty liver. Increased insulin due to insulin resistance not only lowers blood sugar, but also stores fat in the liver, causing fatty liver.
  • hyperlipidemia in which the amount of total cholesterol or triglycerides in the blood vessels is increased above normal levels, is known to cause fatty liver by lowering the liver's detoxification and lipolysis functions.
  • Enzymes present in hepatocytes are mainly released into the blood when the hepatocytes are damaged, thereby increasing the blood level.
  • concentrations of AST (aspartate aminotransferase) and ALT (alanine aminotransferase) change.
  • Lactococcus Lactococcus chungangensis Lactococcus Lactococcus chungangensis
  • the culture of the strain, and the fermentation product of the strain were found to have various effects such as obesity suppression, insulin resistance improvement, and liver protection efficacy, and thus the present invention was completed.
  • the object of the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver or metabolic syndrome comprising at least one selected from the group consisting of a strain, a culture of the strain, and a fermentation product of the strain.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver or metabolic syndrome consisting essentially of one or more selected from the group consisting of a Lactococcus central gensis strain, a culture of the strain, and a fermentation product of the strain. Is to do.
  • Another object of the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) is to provide a food composition having the prevention and improvement effect of fatty liver or metabolic syndrome comprising at least one selected from the group consisting of a strain, a culture of the strain, and a fermentation product of the strain.
  • another object of the present invention is to provide a food composition having the prevention and improvement effect of fatty liver or metabolic syndrome consisting of at least one selected from the group consisting of a Lactococcus central gensis strain, a culture of the strain and a fermentation product of the strain. Is to do.
  • another object of the present invention is a food composition having a prevention effect and improvement of fatty liver or metabolic syndrome consisting essentially of one or more selected from the group consisting of a Lactococcus central gensis strain, a culture of the strain and a fermentation product of the strain.
  • Another object of the present invention is to produce a preparation for the prevention or treatment of fatty liver or metabolic syndrome Lactococcus junggensis ( Lactococcus chungangensis ) strain, to provide the use of a composition comprising at least one selected from the group consisting of the culture of the strain and the fermentation product of the strain as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) treatment of fatty liver or metabolic syndrome, comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising at least one selected from the group consisting of strains, cultures of said strains and fermented products of said strains as active ingredients Is to provide a way.
  • the present invention is Lactococcus chungangensis ( Lactococcus chungangensis ) strain, fatty liver comprising at least one selected from the group consisting of the culture of the strain and the fermentation product of the strain as an active ingredient or It provides a pharmaceutical composition effective for the prevention and treatment of metabolic syndrome.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition effective in preventing and treating fatty liver or metabolic syndrome composed of at least one member selected from the group consisting of the Lactococcus junggensis strain, the culture of the strain, and the fermentation product of the strain.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition effective in preventing and treating fatty liver or metabolic syndrome consisting essentially of one or more selected from the group consisting of the Lactococcus junggensis strain, the culture of the strain and the fermentation product of the strain. .
  • the present invention is a fatty liver comprising at least one selected from the group consisting of Lactococcus chungangensis strain, culture of the strain and fermentation product of the strain, or Provides a food composition for preventing and improving metabolic syndrome.
  • the present invention provides a food composition for preventing and improving fatty liver or metabolic syndrome consisting of at least one member selected from the group consisting of Lactococcus central gensis strain, culture of the strain and fermentation product of the strain.
  • the present invention provides a food composition for preventing and improving fatty liver or metabolic syndrome consisting essentially of one or more selected from the group consisting of the Lactococcus junggensis strain, the culture of the strain and the fermentation product of the strain.
  • the present invention provides Lactococcus ( Lactococcus) for preparing a preparation for the prevention or treatment of fatty liver or metabolic syndrome chungangensis ) strain, a culture of the strain and a composition comprising at least one selected from the group consisting of fermentation products of the strain as an active ingredient.
  • the present invention is a composition comprising at least one selected from the group consisting of Lactococcus chungangensis strain, culture of the strain and fermentation product of the strain as an active ingredient It provides a method for treating fatty liver or metabolic syndrome, comprising administering an effective amount of to an individual in need thereof.
  • the Lactococcus Lactococcus chungangensis may be characterized in that the deposit number is KCTC 12684BP, but is not limited thereto.
  • Lactococcus the strain of the present invention, Lactococcus chungangensis
  • Lactococcus chungangensis is a strain isolated from wastewater in a wastewater treatment plant, and is a strain corresponding to Gram-positive cocci. This strain was identified as a strain belonging to the genus Lactococcus as a result of cell morphological and biochemical tests as a new strain newly discovered by the inventors of the present invention, and was deposited with the Korea Microbial Resource Center in 2008 (Accession No .: KCTC 12684BP).
  • Lactococcus Lactococcus chungangensis is a Gram-positive cocci that does not form spores and mycelium, and has a characteristic that occurs singly or in pairs in the form of short chains or irregular clusters.
  • this strain refers to "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2008), 58, 18441849 ".
  • the composition of the present invention is the Lactococcus Lactococcus chungangensis ) Since the microorganism enzyme is present in the culture medium or the culture supernatant of the strain, as well as the strain, the composition comprising the strain, its culture medium or the culture supernatant is included in the scope of rights. Lactococcus chungangensis can be removed from the culture medium, and the preferred culture medium is a supernatant after centrifugation.
  • the culture medium may include both a concentrate of the culture medium and a dried product of the culture medium.
  • the composition of the present invention may include the Lactococcus central zensis live bacteria, crushed cell wall fraction, dead or dry bacteria as an active ingredient, and may further include an excipient or a carrier.
  • the fermentation product is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) strain, a product obtained by fermenting natural products, dairy products, and the like by using at least one selected from the group consisting of cultures of the strains, concentrates of the cultures, and dried products of the cultures as a starter.
  • the method for culturing Lactococcus central zensis of the present invention is not particularly limited, and can be performed by a regular method.
  • the microorganisms can be cultured in a medium capable of propagation, and the cells can be recovered using a means such as centrifugation.
  • the composition comprising Lactococcus central genesis of the present invention as an active ingredient has an activity of improving various diseases of fatty liver or metabolic syndrome, for example, obesity, dyslipidemia, hyperlipidemia, diabetes or insulin resistance syndrome.
  • the composition of the present invention can prevent or treat metabolic syndrome by various activities.
  • the term 'insulin resistance syndrome' is a concept that collectively refers to diseases caused by insulin resistance, cell resistance to insulin action, hyperinsulinemia, very low density lipoprotein (VLDL) and neutrality. It refers to diseases characterized by increased fat, decreased high density lipoprotein (HDL) and high blood pressure, and is a concept recognized as a risk factor for cardiovascular disease and type 2 diabetes (Reaven GM., Role of insulin resistance in human disease, Diabetes, 37: 1595-607 (1988).
  • insulin resistance is known to increase oxidative stress in cells and change the signal transduction system along with risk factors such as hypertension, diabetes, and smoking to induce an inflammatory reaction and promote atherosclerosis (Freeman BA et al., Biology of disease: free radicals and tissue injury, Lab.Invest. 47: 412-26 (1982), Kawamura M et al., Pathophysiological concentrations of glucose promote oxidative modification of low density lipoprotein by a superoxidedependent pathway, J. Clin.Invest. 94 : 771-8 (1994)).
  • composition of the present invention may be applied to the prevention or treatment of insulin resistance syndrome, more preferably, insulin resistance, obesity, hypertension, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hyperinsulinemia, non-alcoholic fatty liver or type 2 diabetes.
  • lactococcus lyophilis lyophilisate as a result of orally administering to the animal model of high-fat diet C57BL / 6J mouse, lactococcus lyophilis lyophilisate (same as freeze-dried cells) or cream cheese containing the same, the blood glucose level is reduced and obese. It was found to have a preservative effect on the glucose tolerance function induced by. By confirming the preservative effect on the glucose-resistant function resulting from obesity of Lactococcus neutrophils, it was found that Lactococcus neutrophils can be usefully used for the prevention or treatment of metabolic syndrome including insulin resistance risk factors.
  • the present invention has an effect of preventing or treating obesity or obesity-related metabolic syndrome.
  • the C57BL / 6J mouse animal model ingesting the normal diet had higher cholesterol levels in the blood due to obesity in the positive control group ingesting the high-fat diet than in the negative control group, but the lactococcus central gene along with the high-fat diet.
  • the cholesterol level was significantly low.
  • Lactococcus central genesis has an effect of reducing fat and cholesterol levels in a hyperlipidemia BALB / c mouse animal model induced by a high-fat diet, preventing or treating obesity or hyperlipidemia. It was confirmed that the effect.
  • Lactococcus central zensis is preferably obese, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain excipients or diluents.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further contain excipients or diluents.
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a non-toxic composition that does not cause allergic reactions or similar reactions, such as gastrointestinal disorders, dizziness, etc., when physiologically acceptable and administered to humans.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like.
  • the carrier for parenteral administration may include water, a suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-parabens and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, etc. in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, etc.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers and formulations can be referenced to those known in the art.
  • composition of the present invention can be administered in any way to mammals, including humans.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • the parenteral administration method is not limited to this, but intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated as a formulation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art as powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. You can.
  • oral preparations can obtain tablets or dragees by blending the active ingredient with a solid excipient and then grinding it and adding a suitable adjuvant to the granule mixture.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, and starches including cellulose starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, etc. Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included, including methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose. In addition, if necessary, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a preservative.
  • injection, cream, lotion, external ointment, oil, moisturizer, gel, aerosol and nasal inhaler may be formulated by methods known in the art. These formulations are described in the formulas generally known in all pharmaceutical chemistry.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to a patient in a single dose, and can be administered by a fractionated treatment protocol that is administered for a long time in multiple doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can vary the content of the active ingredient according to the degree of disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg per kg of patient body weight per day, and most preferably 0.1 ⁇ g to 1000 mg per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, the route of administration and the number of treatments, as well as the patient's age, weight, health status, gender, disease severity, diet and excretion rate, etc.
  • compositions of the present invention are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the present invention also provides Lactococcus chungangensis ) strain, a culture composition of the strain and a food composition for improving obesity comprising at least one selected from the group consisting of fermentation products of the strain as an active ingredient.
  • the food may be a fermented food or cheese containing Lactococcus central genesis, but is not limited thereto.
  • the fermented food is Lactococcus Lactococcus chungangensis
  • starter is a preparation containing microorganisms involved in the fermentation of food, refers to microorganisms that grow predominantly in mature foods by adding them during fermentation food production, and constantly regulate the taste of fermented foods It means not only to make it, but also to provide a microorganism having excellent sensory properties, that is, a preparation essentially comprising Lactococcus central genesis.
  • the fermented food is beer, fruit wine, medicinal wine, vinegar, soy sauce, miso, cheonggukjang, red pepper paste, kimchi, pickles, miso, natto, salted fish, edible seafood, fermented dairy products, ham or sausage, etc. It includes, preferably may be fermented dairy products such as cheese or yogurt, but is not limited thereto.
  • Such a food composition is Lactococcus Lactococcus , an active ingredient chungangensis ) strains, cultures of the strains, concentrates of the cultures or dried products of the cultures, as well as various food additives, natural carbohydrates, etc., may be included as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include monosaccharides, for example, glucose, fructose, etc .; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc .; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • flavoring agents can advantageously use natural flavoring agents (taumatine), stevia extracts (eg rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • natural flavoring agents taumatine
  • stevia extracts eg rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention may be formulated in the same manner as the pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, and health supplement foods. There is this.
  • the food composition is Lactococcus Lactococcus as an active ingredient chungangensis ) various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors, natural flavors and other flavors, colorants and neutralizers (cheese) in addition to strains, cultures of the strains, concentrates of the cultures or dried products of the cultures , Chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice beverages and vegetable beverages.
  • the food composition of the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) strain, a culture of the strain, a concentrate of the culture, and a health functional food for obesity improvement comprising at least one selected from the group consisting of the dried matter of the culture as an active ingredient.
  • the term 'health functional food' refers to food manufactured and processed using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body according to Act 6727 on the Health Functional Food, and it is a nutrient for the structure and function of the human body. It means to ingest for the purpose of obtaining a useful effect for health purposes such as controlling or physiological action.
  • the health functional food of the present invention may include a normal food additive, and whether or not it is suitable as a food additive is applied to the relevant item according to the general rules and general test methods of food additives approved by the Ministry of Food and Drug Safety unless otherwise specified. It is judged according to related standards and standards.
  • Examples of items listed in the 'food additive revolution' include chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamonic acid; Natural additives such as decolorant, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, and guar gum; And mixed preparations such as L-sodium glutamate, noodle-added alkalis, preservatives, and tar colorants.
  • the health functional food is granulated by mixing the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants and other additives in a conventional manner, and then compression molding with a lubricant or the like. The mixture can be compression molded directly.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent or the like as necessary.
  • Hard capsules in the form of capsules health supplements can be prepared by filling a mixture of the active ingredient of the present invention with additives such as excipients in a conventional hard capsule, and soft capsules gelatin mixture of additives such as excipients It can be prepared by filling the same capsule base.
  • the soft capsule agent may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
  • the health functional food in the form of a ring can be prepared by molding a mixture of the active ingredient of the present invention with an excipient, a binder, a disintegrant, etc. by a conventionally known method, and can be removed with a white sugar or other skin repellent if necessary.
  • the surface may be coated with a material such as starch or talc.
  • the health functional food in the form of granules can be prepared in a granular form by mixing the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants, etc., and may contain flavoring agents, mating agents, etc., if necessary. have.
  • the health functional food may be beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, and health supplements.
  • the present invention is a Lactococcus ( Lactococcus) for preparing a preparation for the prevention or treatment of fatty liver or metabolic syndrome chungangensis ) strain, a culture of the strain and a composition comprising at least one selected from the group consisting of fermentation products of the strain as an active ingredient.
  • Lactococcus Lactococcus
  • the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) treatment of fatty liver or metabolic syndrome, comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising at least one selected from the group consisting of strains, cultures of said strains and fermented products of said strains as active ingredients Provides a method.
  • the 'effective amount' of the present invention when administered to an individual, refers to the amount of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing or suppressing or reducing the effect of fatty liver or metabolic syndrome when administered to an individual, and the 'individual' animal , Preferably it may be an animal including a mammal, particularly a human, and may be cells, tissues, organs, etc. derived from an animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention broadly refers to improving the symptoms of the fatty liver or metabolic syndrome or the disease, which may include healing, substantially preventing, or improving the condition of the fatty liver or metabolic syndrome, , Alleviating, curing or preventing one symptom or most symptoms resulting from the disease, but is not limited thereto.
  • the term 'comprising' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'as a feature', and does not exclude additional component elements or method steps not mentioned in the composition or method. .
  • the term 'consisting of' means excluding additional elements, steps or ingredients, which are not described separately.
  • the term 'essentially consisting of' means that in the scope of a composition or method, it includes the described component elements or steps, as well as component elements or steps that do not materially affect its basic properties.
  • the present invention is Lactococcus Lactococcus chungangensis ) provides a composition for preventing or treating fatty liver or metabolic syndrome, comprising at least one selected from the group consisting of a strain, a culture of the strain, and a fermentation product of the strain as an active ingredient.
  • the composition comprising Lactococcus central genesis of the present invention as an active ingredient is excellent in preventing or treating fatty liver or metabolic syndrome, reducing blood glucose levels, resolving insulin resistance, preserving glucose tolerance, and increasing weight Since it has excellent inhibitory effect and inhibitory effect on liver damage, it can be usefully used to prevent and treat fatty liver or metabolic syndrome disease.
  • FIG. 2A to 2e show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on organ and adipose tissue weights, liver / weight ratio (FIG. 2A), lung / weight ratio (FIG. 2B), kidney / weight Ratio (FIG. 2C), white fat / weight ratio (FIG. 2D) and brown fat / weight ratio (FIG. 2E) are indicated (%).
  • FIG. 3A to 3D show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on liver and adipose tissue, and histological analysis results of liver and adipose tissue (FIG. 3A); The size of brown adipose tissue (Figure 3b), abdominal adipose tissue ( Figure 3c) and subcutaneous adipose tissue (Figure 3d) is shown. Red arrows and squares indicate areas of interest. The difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. * P ⁇ 0.05, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • Figures 4a and 4b shows the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on OGTT
  • Figure 4a shows the blood glucose concentration measured by OGTT at each time point after glucose intake
  • Figure 4b shows the AUC calculated from OGTT data for 0-120 minutes after glucose intake. The difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • 5a and 5b show the effect of oral administration of L. chungangensis CAU 28 and CAU 28 cream cheese on ITT
  • FIG. 5A shows the blood glucose concentration measured by ITT at each time point after insulin injection
  • FIG. 5B shows the AUC calculated from ITT data for 0-120 minutes after insulin injection.
  • the difference between the means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.0005.
  • FIG. 6a to 6f show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on adipocaine and serum cytokine levels, and the results of measuring each protein level using ELISA:
  • FIG. 6a is leptin
  • Figure 6b is adiponectin
  • Figure 6c is TNF- ⁇
  • Figure 6d is IL-1 ⁇
  • Figure 6e is IL-6
  • Figure 6f is the serum level of IFN- ⁇ .
  • the difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. *** P ⁇ 0.0005; **** P ⁇ 0.0001.
  • FIGS. 7A and 7B show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on T cell activation, and T cell activation was evaluated using flow cytometry.
  • the percentages of helper T cells (CD3 + CD4 + CD8-) ( Figure 7A) and cytotoxic T cells (CD3 + CD4-CD8 +) ( Figure 7B) are shown.
  • the difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005.
  • FIG. 8A to 8D show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on blood lipids, serum TC (FIG. 8A), HDL / TC (FIG. 8B), LDL / TC (FIG. 8C) and TG. (Fig. 8D) The value is displayed. The difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • FIG. 9A and 9B show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on liver disease biomarkers, and serum AST (FIG. 9A) and ALT (FIG. 9B) levels are shown.
  • the difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • FIG. 10A and 10B show the effect of oral administration of CAU 28 dry matter and CAU 28 cream cheese on excretion SCFA, and the excretion levels of acetic acid (FIG. 10A) and propionic acid (FIG. 10B) were measured.
  • the difference between means compared to the positive control was evaluated using ANOVA. * P ⁇ 0.05, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • FIG. 11A and 11B are results of observing the degree of accumulation of fat (FIG. 11A) and adipocytes stained under a microscope when treating lysate of CAU 28 while inducing differentiation of 3T3-L1 adipocytes (FIG. 11B). * P ⁇ 0.05, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • FIG. 13A and 13B show the degree of accumulation of triglyceride in adipocytes (Fig. 13A) and the amount of IL-6 secreted from adipocytes (Fig. 13B) when inducing differentiation of 3T3-L1 adipocytes and simultaneously treating CAU 28 lysate. ). * P ⁇ 0.05, *** P ⁇ 0.0005, **** P ⁇ 0.0001.
  • Lactococcus chungangensis CAU 28 T Lactococcus chungangensis CAU 28 T
  • KCTC Korean Collection for Type Cultures
  • KCTC 12684BP Korean Collection for Type Cultures
  • TSB Bacto soytone 3g, Glucose 2.5, Sodium chloride 5g, Dipotassium hydrogen phosphate 2.5g, DW 1000ml
  • incubated at 30 °C lyophilized to make powder, and dissolved in distilled water before use in the experiment.
  • Pasteurized milk (Pasteur Milk Co., Ltd., Seoul, Korea) was cooled after being heated at 68 ° C for 30 minutes. After adding 5% (v / v) of Lactococcus junggensis CAU 28 T starter, it was incubated at 30 ° C. During this process, the milk became acidified and curds formed. After stirring at a temperature of 70 ° C. for 5 minutes, whey was separated through a filter paper. 0.5% salt was added to the separated curd. The finally produced cream cheese samples were lyophilized and stored in a dark room at 4 ° C until the next experiment.
  • mice During the experimental period, the experimental group had free access to diet and drinking water. Lyophilized L. chungangensis CAU 28 [1 ⁇ 10 8 CFU / mouse] and cream cheese made from L. chungangensis CAU 28 (1.4g / kg / mouse) were suspended in 200 ⁇ l of sterile water for oral gavage. Was administered. The same volume of PBS was administered to the negative and positive controls. Simvastatin (10 mg / kg) was dissolved in 200 ⁇ l of sterile water and administered orally. All mice were gavaged once a week for 12 weeks.
  • mice were sacrificed by administration of isoflurane. For further analysis, blood samples and visceral and adipose tissue were immediately harvested. All procedures and procedures have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) guidelines. The animals used in this study were managed in accordance with the principles and guidelines of the Animal Animal Care and Use Committee (IACUC) of Chung-Ang University of the Institute for Laboratory Animals (IACUC no. 2017-00044).
  • IACUC Animal Animal Care and Use Committee
  • the weight and body length of each mouse were measured once a week.
  • BMI weight (kg) / height 2 (m 2 )] was measured at week 12, and Lee obesity index (weight ⁇ 0.33 / naso-anal length) was calculated at week 1 and week 12 (Novelli et al., 2007).
  • Liver, lung, kidney, spleen and adipose tissue were dissected; Liver, lung, kidney and adipose tissues were weighed. Organs and tissues were rinsed with saline for further analysis.
  • a glucose tolerance test was performed after 12 weeks of rearing. After 16 hours of fasting, glucose (2.5 mg / g body weight, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was administered by oral gavage. Blood samples were taken from the tail vein 0, 10, 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after glucose administration. Blood glucose levels were measured using an Accu-Check Advantage blood glucose monitor (LifeScan, Johnson & Johnson, Chesterbrook, Pa.) And the area under the curve (AUC) was calculated according to the manufacturer's instructions.
  • Blood glucose changes after insulin injection were assessed by ITT. Mice were fasted for 4 hours prior to intraperitoneal injection of insulin solution (0.75 UI / kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Blood samples were collected from the tail vein 0, 10, 20, 30, 60, 90 and 120 minutes after insulin injection. Blood glucose levels were determined by the Accu-Check Advantage Blood Sugar Monitor and AUC was calculated according to the manufacturer's instructions.
  • AST Serum aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • TC high density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • TG TG were analyzed in serum supernatants using appropriate assay kits (Green Cross Biopharmaceutical, Yongin, Korea). The same sample was also used for hormone measurements
  • Adiponectin concentration in serum was measured according to the method described in the kit instructions by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using the ADP ELISA kit (CUSABIO, Houston, TX, USA). Serum leptin concentration was measured using a Linco Human Leptin ELISA kit (Linco Research, St. Charles, MO, USA) according to the manufacturer's instructions. Sample absorbance at 450 nm was measured using an Infinite M200 NanoQuant plate reader (Tecan, Switzerland).
  • cytokine analysis [tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), interferon (IFN- ⁇ ), interleukin (IL) 1 ⁇ and IL-6]. Blood samples were coagulated at 4 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 5000 ⁇ for 1 hour. The supernatant (serum) was stored at -80 ° C until analysis. Cytokine concentrations were measured using an appropriate ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) according to the manufacturer's instructions. Sample absorbance at 450 nm was measured using an Infinite M200 NanoQuant plate reader (Tecan).
  • Spleens were harvested from the sacrificed mice and ground on a cell strainer (SPL Life Sciences, Pocheon, Korea). Cells were counted after staining with trypan blue using a TC10 automatic cell counter (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). It was then diluted with 2.0 x 10 6 cells / tube and stained for 20 min on ice with picoerythrin (PE) labeled anti-mouse antibody: CD4 or CD8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Cells were analyzed by collecting at least 10,000 events from FACSCalibur TM flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and BD CellQuest Pro Software (version 6.0).
  • PE picoerythrin
  • SCFAs acetic acid and propionic acid
  • Aminex 87H column 300 x 10 mm, Bio-Rad.
  • isocratic elution with 0.01 N sulfuric acid was used, and the flow rate was 0.5 ml / min.
  • SCFAs were identified at a wavelength of 210 nm using a RefractoMax521 Refractive Index Detector (ERC, RefractoMAX520, Kawaguchi, Japan).
  • 3T3-L1 cells used in the experiment were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 by adding FCS (Fetal Calf Serum) and Streptomycin & Penicillin antibiotic to DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium.
  • FCS Fetal Calf Serum
  • Streptomycin & Penicillin antibiotic to DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Each group was treated with medium containing only 3T3-L1 cells, and the negative control group cultured with medium containing differentiation components (Insulin, 3-Isobutyl-1-methylxanthine, Dexamethasone) was treated with the positive control group, CAU 28 in differentiation medium.
  • the conditions treated with lysate were set as the experimental group.
  • Four days after induction of differentiation the positive control group was treated with a medium containing only Insulin.
  • lactic acid bacteria were continuously treated under the same medium conditions to induce differentiation for 9 days, and from the 7th day of induction of differentiation, the medium containing no differentiation component was treated for 2 days.
  • the concentration of Lysate is 1x10 10 CFU / ml, and when treated with cells, 1% was treated. After a total of 9 days of differentiation, the degree of fat differentiation was confirmed from cells and supernatant.
  • the cells were fixed with formalin solution. After staining the adipocytes with Oil red O solution, observed with a microscope, destaining with Isopropanol, and the degree of fat accumulation was confirmed by absorbance measurement.
  • RNA extraction was performed using Trizol. After RNA extraction, cDNA synthesis was performed. Expression levels were confirmed using Real-Time PCR using primers of fat accumulation-related factors.
  • the pellets obtained through centrifugation were mixed well with a solution used for triglyceride measurement, and then cells were destroyed using sterilized beads. After centrifugation once again, the supernatant was separately obtained and triglyceride was measured.
  • the cytokine was measured by obtaining supernatant after treatment with LPS (100 ng / ml) for 4 hours after treatment with the positive control group and lactic acid bacteria in the differentiated 3T3-L1 cells.
  • Results are expressed as mean ⁇ standard error (SEM). Biochemical parameter data were normally distributed and significant differences between groups were determined by one-way ANOVA using post-hoc analysis (Duncan's test). P ⁇ 0.05 was considered to represent a statistically significant difference. All analyzes were performed using GraphPad Prism statistical package (version 7.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
  • Example One CAU 28 dry cells and CAU 28 Cream cheese intake With BMI Lee's Impact on Obesity Index
  • the Lee Obesity Index of all animals at week 1 and week 12 were compared to accurately evaluate the changes in obesity of the experimental animals during the entire experimental period.
  • P 0.1042
  • the positive obesity index of the positive control group was significantly higher than that of the other groups (P ⁇ 0.01).
  • the negative obesity index of the negative control group, CAU 28 and CAU 28 cream cheese group was significantly lower at week 12 than at week 1.
  • the simastatin group's Lee obesity index was slightly higher at week 12 than at week 1 ( FIG. 1B ).
  • Organ tissue-to-weight ratio of liver, lung, kidney and adipose tissue (abdominal, subcutaneous and scapular adipose tissue) to determine the effects of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese on organs and adipose tissue -body weight ratio) was determined.
  • the liver / weight of the positive control group was significantly higher than that of the CAU 28, CAU 28 cream cheese and simvastatin groups (P ⁇ 0.01) ( FIG. 2A ). This means that oral administration of CAU 28 freeze-dried and CAU 28 cream cheese groups prevented liver hypertrophy. In addition, the effect of the CAU 28 cream cheese intake group was more pronounced than that of the CAU 28 lyophilized cell intake.
  • Body fat ratio is the ratio of fat to body weight and can be used to determine the degree of obesity in animals.
  • Abdominal and subcutaneous fat tissue shows white fat.
  • the scapular adipose tissue represents brown fat.
  • the white fat / weight ratio of the positive control group was significantly higher than that of the negative control group (P ⁇ 0.0001). This showed that HFD increased the white fat / weight ratio in obese mice.
  • the white fat / weight ratio was clearly decreased compared to the positive control group (P ⁇ 0.0001) ( FIG. 2D ).
  • oral administration of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese was found to increase the brown fat / weight ratio of HFD-induced obese mice while decreasing the white fat / weight ratio.
  • Example 3 CAU 28 dry cells and CAU 28 Effect of Cream Cheese Intake on Liver Fatosis and Fat Cell Size
  • FIG. 3A Histological analysis confirmed that lipid accumulation in the liver of the positive control group was abnormal ( FIG. 3A ).
  • the positive control group vesicular damage was observed in the liver tissue, the fat content in the liver was high, and a large amount of fat accumulated in the blood vessels, causing the cell contents to leak, swelling the cells, and destroying the cell membrane.
  • hepatic steatosis was less than that of the positive control group, and hepatocytes had less fat fear and morphology was similar to the negative control.
  • the liver fat drop in the simvastatin group was smaller than the positive control group, but the number did not decrease significantly in the simvastatin group.
  • Example 4 Effect of CAU 28 dry cell and CAU 28 cream cheese intake on OGTT
  • OGTT was used to determine blood glucose response to glucose administered surgically in all groups of animals after 12 weeks. Blood glucose levels in all groups increased immediately after glucose administration and reached the highest concentration 20-30 minutes after glucose administration. ( FIG. 4A ). The peak blood glucose levels of the CAU 28 and CAU 28 cream cheese groups were lower than those of the positive control group and simvastatin group.
  • Example 6 Effect of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese intake on inflammatory markers of blood
  • Serum leptin levels in the positive control group were significantly higher than those in the negative control group (P ⁇ 0.0001), indicating that HFD induces leptin resistance ( FIG. 6A ).
  • the serum leptin concentrations in the CAU 28 and CAU 28 cream cheese groups were significantly lower than those in the positive control group (P ⁇ 0.0001).
  • There was no statistically significant difference in serum leptin concentration in the simvastatin group and the positive control group (P 0.9971).
  • Serum adiponectin levels were clearly higher in the negative control group than in the positive control group ( FIG. 6B ). It is known that increased oxidative stress reduces adiponectin secretion, and adiponectin is mainly secreted from fat cells to increase insulin sensitivity and decrease sugar production in the liver, thereby improving hyperlipidemia.
  • the high fat diet showed a decrease in adiponectin levels in obese mice induced by HFD, but serum adiponectin levels in the CAU 28 and CAU 28 cream cheese groups (P ⁇ 0.0001) and simvastatin group (P ⁇ 0.001). It was significantly higher than the positive control.
  • these results indicate that oral administration of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese elevated serum adiponectin levels in obese mice induced by HFD.
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • oxidative stress is known to increase the inflammatory cytokines TNF- ⁇ (tumor necrosis factor-alpha), MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1), IL-6 (interleukin-6), and the like.
  • Serum concentrations of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , and IL-6 were significantly higher in the positive control group than in the negative control, CAU 28, and CAU 28 cream cheese groups (P ⁇ 0.0001) ( FIG. 6c-f ).
  • TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , and IL-6 are inflammatory cytokines.
  • Example 7 Effect of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese intake on lymphocytes
  • the number of T lymphocytes in the spleen was measured to investigate the effect of HFD on the immune system of obese mice induced by HFD ( FIGS. 7A and 7B ).
  • the number of CD4 + T cells was significantly lower in the positive control group than the negative control group (P ⁇ 0.05) ( FIG. 7A ). This indicates that HFD reduced CD4 + T cell levels in obese mice. As a result of the measurement, the number of CD4 + T cells in the CAU 28 and CAU 28 cream cheese group was higher than that of the positive control group.
  • the number of CD8 + T cells in the negative control and CAU 28 cream cheese group was higher than that of the positive control, but the number of CD8 + T cells in the CAU 28 group was lower than that of the positive control. ( FIG. 7B ).
  • Example 8 Effect of CAU 28 dry cell and CAU 28 cream cheese intake on blood components
  • ALT Alanine aminotransferase
  • ALT levels in the blood are frequently used as indicators of liver damage.
  • Example 9 Effect of CAU 28 dry cells and CAU 28 cream cheese intake on fecal SCFA
  • SCFA predominantly propionic acid
  • PPAR PPAR
  • SCFAs short chain fatty acids
  • Example 10 Anti-obesity effect of CAU28 strain on 3T3-L1 and ability to inhibit fat differentiation
  • Lactococcus chungangensis as a therapeutic composition having a prophylactic and therapeutic effect on fatty liver or metabolic syndrome comprising at least one selected from the group consisting of a strain, a culture of the strain, and a fermentation product of the strain, reducing blood glucose levels, It has the effect of suppressing the weight gain caused by the high-fat diet, and has the effect of reducing the fat in tissues produced by obesity and the effect of inhibiting liver damage. Since it can be usefully used, it has excellent industrial applicability.

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Abstract

지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선효과를 가지는 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게 상기 균주 및 상기 균주를 함유하는 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 25.11.2019]　락토코커스 중앙젠시스를 함유하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2018년 10월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0124768호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)를 함유하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대사증후군(metabolic syndrome)은 고지혈증, 고혈압, 당대사 이상, 혈액응고 이상 및 비만과 같은 심뇌혈관 위험인자를 동시 다발적으로 갖고 있는 경우를 지칭하는 것으로, 이러한 위험 인자들 중 다수는 당뇨병, 동맥경화증의 발병을 촉진시키고 심뇌혈관 질환 발병의 위험성을 증가시킨다. 대사 증후군의 기본을 이루는 기작은 완전히 밝혀지지는 않았으나, 비만과 연관된 인슐린 저항성이 주요 원인으로 알려져 있다. 인슐린 저항성은 고혈당과 고혈압 및 이상지질혈증 등을 유발하여 대사증후군이 발병하도록 한다고 알려져 있다. 즉, 대사증후군은 혈압 상승, 혈장내 글루코스의 증가 및 트리글리세리드의 증가, 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDL)의 증가 및 고밀도 지단백질 콜레스테롤 (HDL)의 감소를 특징으로 한다.
비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생하는 대사성 질환으로, 과잉 열량으로 지방 조직이 비정상적으로 증가한 상태를 말한다. 비만으로 축적된 지방조직에서 만들어진 지방산은 혈중 지방산의 농도를 증가시키고 간, 근육에서의 인슐린 이용률을 저하시킨다. 혈중 지방산이 증가하면 세포에서 포도당 대신 지방산을 받아들이고 이에 따라 포도당 유입이 어려워져 고혈당이 유발되고, 높은 혈중 포도당 농도는 췌장의 베타세포가 인슐린을 분비하도록 자극함으로써 인슐린을 더욱 분비하여 인슐린 저항성이 증가하도록 한다.
한편, 비만이 있는 사람은 정상 체중인 사람에 비해 콜레스테롤이나 중성지방의 수치가 상승되어 고지혈증에 걸릴 확률이 높다. 특별히 복부비만은 췌장암 위험을 증가시킨다는 연구결과가 나왔다. 복부비만은 잘못된 식생활과 무절제한 생활, 과도한 스트레스, 운동결핍 등으로 인해 기초대사량이 저하되면서 남는 에너지를 지방으로 바꾸어 복부 내장과 피하에 저장하기 때문에 생기게 된다. 특히 복부비만은 음주와 흡연, 고지방 음식섭취와 밀접한 관계가 있어 중년의 직장 남성에게 쉽게 나타난다.
현재 비만에 대한 치료법으로는 운동요법, 약물요법, 지방 흡입술 또는 위절제술 등이 사용되고 있다. 하지만 바쁜 현대인들은 규칙적인 운동을 하기가 어려운 문제가 있고, 약물요법은 복통, 지방변, 구토증, 다리의 통증 등과 같은 여러 부작용을 수반하는 문제가 있으며, 지방 흡입술과 위절제술은 안전성이 떨어진다는 문제가 있다. 심바스타틴은 일반적으로 고콜레스테롤 혈증 치료에 사용되는 콜레스테롤 저하제로, 항 염증성 사이토카인의 혈장 내 방출을 감소시킴으로써 대사 증후군에서 항염증 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Devaraj et al., 2006).
비만, 성인형 당뇨병, 고지혈증 등의 대사증후군과 연관되어 비알코올성 지방간 병변이 나타나기도 한다고 알려져 있다. 과도한 열량을 계속 섭취하게 되면 체내 지방세포 및 간에 지방이 축적되는데, 간 내 과도한 지방 (주로 중성지방)이 쌓여서 일반적으로 간 무게의 5% 이상의 지방이 쌓이게 되면 지방간으로 진단한다. 증가된 지방에서 간에 유해한 사이토카인이 분비되어 지방간염과 간경변증으로 진행한다고 알려져 있다. 체내에서 분비되는 인슐린에 대한 저항성 때문에 발생하는 성인형 당뇨병도 지방간의 원인으로 알려져 있다. 인슐린 저항성으로 인한 증가된 인슐린이 혈당을 떨어뜨릴 뿐 아니라 지방을 간에 저장시키는 작용하여 지방간을 유발한다. 또한 혈관 내 총 콜레스테롤이나 중성지방의 양이 정상치 이상으로 증가된 고지혈증이 간의 해독기능과 지방분해 기능을 저하시켜 지방간을 일으키는 원인으로도 알려져 있다.
간세포 내에 존재하는 효소들은 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 간세포가 손상되면 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 의 농도가 변하므로 주로 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), ALP (Alkaline phosphatase), GGT (Gamma-Glutamyl Transferase) 효소들의 혈중 농도를 검사하여 간 기능의 이상 유무를 확인한다.
현대인의 경우, 식생활에 있어서 지방 성분의 과잉 섭취로 인하여 비만 또는 대사증후군 환자가 급증하고 있다. 비만 또는 대사증후군은 그 자체의 문제점뿐만 아니라, 그 상태가 지속되면서 고혈압, 고인슐린혈증, 고지혈증, 지방간, 동맥경화증, 당뇨병, 심장 혈관 질환 등과 같은 다양한 질병과 합병증이 발생하여 종국적으로 생명을 단축시키기 때문에 더욱 위험하다. 이에 따른 사회경제적 비용도 막대하기 때문에 전 세계적으로 비만 또는 대사증후군 치료에 많은 관심이 있지만, 아직까지 효과적인 대사증후군의 치료제는 미비한 상황이다. 이에 이를 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 소재의 개발이 매우 필요한 실정이다.
이에 따라, 대사증후군을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 소재를 개발하기 위해 예의 노력을 기울인 결과, 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물이 비만 억제, 인슐린 저항성 개선, 간보호 효능 등 다양한 효과를 가진다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 필수적으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선 효능을 갖는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선 효능을 갖는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 필수적으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선 효능을 갖는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 필수적으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 필수적으로 구성되는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 치료 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 기탁번호가 KCTC 12684BP 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 균주인 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 폐수처리장의 폐수에서 분리된 균주로서, 분류학적으로 그람-양성 구균에 해당하는 균주이다. 본 균주는 본 발명의 발명자가 새로이 발견한 신균주로서 세포 형태학적 및 생화학적 시험 결과 락토코커스 ( Lactococcus)속에 속하는 균주로 동정이 되었으며, 2008년에 한국 미생물자원센터에 기탁되었다(기탁번호: KCTC 12684BP). 또한, 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 그람-양성구균으로 포자와 균사체를 형성하지 않으며, 짧은 체인 형태 또는 불규칙한 클러스터의 형태로 단독 또는 쌍으로 발생하는 특징이 있으며, 본 균주에 대한 보다 구체적인 설명은 "International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2008), 58, 18441849"를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주를 비롯하여, 균주의 배양액 또는 배양 상등액에도 미생물 효소가 존재하므로, 상기 균주, 이의 배양액 또는 배양 상등액을 포함하는 조성물을 권리범위로 포함한다. 상기 배양액에서 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)를 제거할 수 있고, 바람직한 배양액은 원심분리 후 상층액이다. 배양액은 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 락토코커스 중앙젠시스 생균, 파쇄된 세포벽 분획, 사균 또는 건조균을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 발효물은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 스타터(starter)로 이용하여 천연물, 유제품 등을 발효시킨 산물을 의미한다.
본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 배양하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 정규적인 방법으로 할 수 있다. 예컨대, 미생물이 증식가능한 배지에서 배양하고, 원심 분리 등의 수단을 이용하여 균체를 회수할 수 있다.
본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 지방간 또는 대사증후군의 다양한 질환, 예를 들어, 비만, 이상지방혈증, 고지혈증, 당뇨 또는 인슐린 저항성 증후군을 개선하는 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 다양한 활성에 의해 대사증후군을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '인슐린 저항성 증후군'은 상기 인슐린 저항성에 의하여 유발된 질환을 총칭하는 개념으로 인슐린 작용에 대한 세포의 저항성, 고인슐린혈증, 초저밀도지단백(very low density lipoprotein, VLDL)과 중성지방의 증가, 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL)의 감소 및 고혈압 등을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 심혈관질환과 제2형 당뇨병의 위험인자로 인식되고 있는 개념이다(Reaven GM., Role of insulin resistance in human disease, Diabetes, 37:1595-607(1988)). 또한 인슐린저항성은 고혈압, 당뇨, 흡연 등의 위험인자들과 함께 세포 내 산화스트레스를 증가시키고 신호전달체계를 변화시켜 염증반응을 유발하여 죽상경화증을 진행시킨다고 알려져있다(Freeman BA et al., Biology of disease: free radicals and tissue injury, Lab. Invest. 47:412-26(1982), Kawamura M et al., Pathophysiological concentrations of glucose promote oxidative modification of low density lipoprotein by a superoxidedependent pathway, J. Clin. Invest. 94:771-8(1994)).
본 발명의 조성물은 인슐린 저항성 증후군, 보다 바람직하게는 인슐린 저항성에 의한 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 고인슐린혈증, 비알코올성 지방간 또는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 락토코커스 중앙젠시스 동결건조물(동결건조세포와 같음) 또는 그를 함유하는 크림치즈를 고지방식이 C57BL/6J 마우스 동물 모델에 경구 투여한 결과 혈중 글루코오스 수치를 감소시켜 비만에서 유발된 당내성 기능에 대하여 보존 효과가 있는 것으로 나타났다. 락토코커스 중앙젠시스의 비만에서 비롯된 당내성 기능에 대하여 보존 효과를 확인함으로써 락토코커스 중앙젠시스가 인슐린 저항성 위험인자를 포함하는 대사증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 다른 실시예에서는 C57BL/6J 마우스 동물 모델에서 고지방식이에 의해 유발되는 체중 증가를 억제하는 효과가 상기 락토코커스 중앙젠시스를 경구 투여한 실험군에서 현저하게 나타나는 것을 확인하였으며, 비만에 의해 생성돤 조직의 지방을 감소시키는 효능이 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에서 비만 또는 비만 관련 대사증후군 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 일반 식이를 섭취한 C57BL/6J 마우스 동물모델 음성대조군보다 고지방식이를 섭취한 양성대조군에서 비만에 의한 혈중 콜레스테롤 수치가 높았으나 고지방식이와 함께 락토코커스 중앙젠시스 또는 그를 함유한 크림치즈를 경구투여한 실험군에서는 콜레스테롤 수치가 상당히 낮은 수준인 것을 확인하였다.
고지방식이 섭취에 의한 과도한 지방은 지방간을 유발하며, 비알코올성 지방간은 간기능의 이상 및 손상을 야기한다. 락토코커스 중앙젠시스를 경구 투여한 실험군은 AST 및 ALT 수치가 양성대조군과 비교하여 상당히 낮은 수치를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스는 간기능 손상을 저해하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 락토코커스 중앙젠시스가 고지방식이에 의해 유도된 고지혈증 BALB/c 마우스 동물모델의 지방 및 콜레스테롤 수치를 감소시키는 효과가 있는 것으로 나타나 비만 또는 고지혈증 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다. 락토코커스 중앙젠시스가 본 발명에서 상기 비만은 바람직하게는 복부비만일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 1000mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법은 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 식품은 락토코커스 중앙젠시스를 포함하는 발효식품 또는 치즈일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 발효식품은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 스타터 (starter)로 이용하여 제조된 발효식품일 수 있다.
본 발명에서 용어 '스타터 (starter)'란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말하며, 발효식품의 맛을 일정하게 조절하게 할 뿐만 아니라 우수한 관능미를 가질 수 있도록 제공하는 미생물, 즉, 락토코커스 중앙젠시스를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.
본 발명에서 상기 발효식품은 맥주, 과실주, 약주, 식초, 간장, 된장, 청국장, 고추장, 김치, 피클, 미소 (miso), 나토 (natto), 젓갈류, 식해류, 발효유제품, 햄 또는 소시지 등을 포함하며, 바람직하게는 치즈 또는 요거트와 같은 발효 유제품일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 식품 조성물은 유효성분인 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 건강기능식품일 수 있다.
본 발명에서 '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 지방간 또는 대사증후군의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 지방간 또는 대사증후군의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 지방간 또는 대사증후군 또는 상기 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 지방간 또는 대사증후군을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료 효과가 우수하며, 혈중 글루코스 수치를 감소시켜 인슐린 저항성을 해소하고 당내성 기능 보존 효과가 있으며, 체중 증가 억제 효과 및 간손상 저해능이 우수하여 지방간 또는 대사증후군 질환 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 BMI와 Lee 비만 지수에 미치는 영향을 나타낸 것으로, BMI (도 1a)와 Lee 비만 지수 (도 1b)로부터 계산된 AUC가 표시된다. 데이터는 평균 ± SEM (n = xx)으로 나타내었다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05, ** P <0.005, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 2a 내지 2e는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 기관 및 지방 조직 무게에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 간/체중 비 (도 2a), 폐/체중 비 (도 2b), 신장/체중 비 (도 2c), 백색 지방/체중 비 (도 2d) 및 갈색 지방/체중 비 (도 2e)가 표시된다 (%). 데이터는 xx (n = xx)로 표시된다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05, ** P <0.005, *** P <0.001, **** P <0.0001.
도 3a 내지 3d는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 간과 지방 조직에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 간 및 지방 조직의 조직학적 분석결과(도 3a); 갈색 지방 조직(도 3b), 복부 지방 조직(도 3c) 및 피하 지방 조직 (도 3d)의 크기가 표시된다. 빨간색 화살표와 사각형은 관심 영역을 나타낸다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 4a 및 4b는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 OGTT에 미치는 영향을 나타낸 것으로,
도 4a는 포도당 섭취 후 각 시점에서 OGTT에 의해 측정된 혈당 농도를, 도 4b는 포도당 섭취 후 0-120 분 동안 OGTT 데이터로부터 계산된 AUC를 나타낸다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05, ** P <0.005, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 5a 및 5b는 L. chungangensis CAU 28과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 ITT에 미치는 영향을 나타낸 것으로,
도 5a는 인슐린 주사 후 각 시점에서 ITT에 의해 측정된 혈당 농도를, 도 5b는 인슐린 주사 후 0-120 분 동안 ITT 데이터로부터 계산된 AUC를 나타낸다. 양성 대조군과 비교 한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05 , ** P <0.005, *** P <0.0005.
도 6a 내지 6f는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 아디포카인 및 혈청 내 사이토카인 수치에 미치는 영향을 나타낸 것으로, ELISA를 사용하여 각 단백질 수준을 측정한 결과이다: 도 6a는 렙틴, 도 6b는 아디포넥틴, 도 6c는 TNF-α, 도 6d는 IL-1β, 도 6e는 IL-6, 도 6f는 IFN-γ의 혈청 수준. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. *** P <0.0005; **** P <0.0001.
도 7a 및 7b은 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 T 세포 활성화에 미치는 영향을 나타낸 것으로, T 세포 활성화는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가한 것이다. helper T 세포(CD3 + CD4 + CD8-)(도 7a) 및 세포 독성 T 세포 (CD3 + CD4-CD8 +) (도 7b)의 백분율이 표시되었다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. * P <0.05, ** P <0.005.
도 8a 내지 8d는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 혈중 지질에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 혈청 TC (도 8a), HDL/TC (도 8b), LDL/TC (도 8c) 및 TG (도 8d) 값이 표시된다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. ** P <0.005, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 9a 및 9b는 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 간 질환 바이오 마커에 미치는 영향을 나타낸 것으로, 혈청 AST (도 9a) 및 ALT (도 9b) 수준이 표시된다. 양성 대조군과 비교한 평균 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가하였다. ** P <0.005, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 10a 및 10b은 CAU 28 건조물과 CAU 28 크림치즈의 배설 SCFA에 대한 경구 투여 효과를 나타낸 것으로, 아세트산 (도 10a)과 프로피온산 (도 10b)의 배설 수준을 측정하였다. 양성 대조군과 비교한 평균간의 차이는 ANOVA를 사용하여 평가 하였다. * P <0.05, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 11a 및 11b는 3T3-L1 지방세포의 분화를 유도하면서 동시에 CAU 28의 lysate를 처리하였을 때, 지방의 축적 정도(도 11a)와 현미경으로 염색된 지방세포를 관찰한 결과이다(도 11b). * P <0.05, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 12는 3T3-L1 지방세포의 분화를 유도하면서 동시에 CAU 28의 lysate를 처리하고, 지방세포의 분화가 끝났을 때 지방 축적 관련 인자의 mRNA 발현량을 real-time PCR로 평가한 결과이다. * P <0.05, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
도 13a 및 13b는 3T3-L1 지방세포의 분화를 유도하면서 동시에 CAU 28의 lysate를 처리하였을 때, 지방 세포 내 triglyceride의 축적 정도(도 13a) 및 지방세포로부터 분비된 IL-6의 양(도 13b)을 측정한 결과이다. * P <0.05, *** P <0.0005, **** P <0.0001.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 락토코커스 중앙젠시스 CAU 28 T 의 배양 및 동결건조
유산균의 일종인 락토코커스 중앙젠시스 CAU 28 T ( Lactococcus chungangensis CAU 28 T)는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC;Taejon, Korea, 기탁번호 KCTC 12684BP)에 기탁 후 분양받아 사용하였고, TSB (Bacto Tryptone 17g, Bacto soytone 3g, Glucose 2.5, Sodium chloride 5g, Dipotassium hydrogen phosphate 2.5g, D.W. 1000ml)에 접종하여 30℃에서 배양한 후, 동결건조하여 분말로 만들었으며 실험에 사용하기 전 증류수에 녹여 사용하였다.
또한, 멸균된 beads를 이용하여 CAU28 T의 lysate를 만든 후, 실험에 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였으며 실험에는 녹인 후 사용하였다.
2. 크림치즈의 제조
Pasteurized milk (Pasteur Milk Co., Ltd., Seoul, Korea)는 68℃에서 30분 간 열처리를 진행한 후 식혀주었다. 5%(v/v)의 락토코커스 중앙젠시스 CAU 28 T 스타터를 첨가한 후 30℃에서 배양하였다. 이 과정에서 우유는 산성화가 되었으며 커드가 형성되었다. 70℃의 열을 가하며 5분 동안 저어준 후, 유청 (whey)은 여과지를 통해 분리하였다. 분리된 커드에는 0.5%의 salt를 첨가하였다. 최종적으로 생산된 크림치즈 샘플은 동결건조하여 다음 실험 진행 전까지 4℃의 암실에서 보관하였다.
3. 실험동물 및 사육 조건
사용한 쥐 모델은 생후 6주된 C57BL/6J 마우스(n=50) 모델이며 (Samtako, Osan, Korea), 실험을 하기에 앞서 C57BL/6J 마우스는 1주간 순화과정을 거쳤으며, 10마리씩 5군으로 나누어 사육하였다. 동물 사육실의 온도는 22℃, 채광은 12시간 명암을 조절하였으며 이 조건은 실험기간동안 유지되었다.
4. 투여 및 실험군
실험군은 크게 5개 그룹 (각 그룹당 n = 10)으로 나누었다 : (1) 음성 대조군, 정상식이(NFD) 및 PBS 경구투여; (2) 양성 대조군, 고지방 식이(HFD) 및 PBS 경구투여; (3) 심바스타틴군, 고지방식이(HFD) 및 심바스타틴 경구투여; (4) L. chungangensis CAU 28(CAU 28)군, 고지방식이(HFD) 및 동결건조된 L. chungangensis CAU 28 경구투여; (5)CAU 28 크림치즈군, 고지방식이(HFD) 및 L. chungangensis CAU 28로 만든 크림치즈 경구투여.
실험기간동안 실험군은 식이요법과 식수에 자유롭게 접근가능하였다. 동결 건조 L. chungangensis CAU 28 [1 ×10 8 CFU/mouse]와 L. chungangensis CAU 28 (1.4g/kg/mouse)로 만든 크림치즈를 200 ㎕의 멸균수에 현탁시켜 경구 위관 영양법(oral gavage)으로 투여하였다. 음성 대조군 및 양성 대조군에는 동일한 부피의 PBS를 투여하였다. 심바스타틴 (10 mg/kg)을 200 ㎕의 멸균 수에 용해시키고 경구 투여 하였다. 모든 마우스는 12 주동안 주 1회 위관영양(gavaged)되었다.
동물의 몸무게와 길이는 일주일에 한 번 측정되었다. 분변 샘플을 채취하여 연구 기간이 끝나기 며칠 전에 경구 포도당 내성 검사 (OGTT)와 인슐린 내성 검사 (ITT)를 실시했다. 12 주간의 치료 기간이 끝날 때, 마우스는 isoflurane의 투여에 의해 희생되었다. 추가분석을 위하여, 혈액 시료와 내장 및 지방 조직을 즉시 수확하였다. 모든 과정 및 절차는 식품 의약청(FDA) 지침에 의해 승인되었다. 본 연구에서 사용된 동물은 실험동물 연구소(IACUC no. 2017-00044)의 중앙 대학교 동물 동물 보호 및 사용위원회 (IACUC)의 원칙과 지침에 따라 관리되었다.
5. 체중, BMI, 체지방 및 장기 무게 측정
각 마우스의 체중과 몸 길이는 일주일에 한 번 측정되었다. BMI [weight (kg)/height 2 (m 2)]는 12 주째에 측정되었고, Lee 비만 지수(Lee obesity index)(weight×0.33/ naso-anal length)는 1 주와 12 주에 계산되었다 (Novelli et al., 2007).
간, 폐, 신장, 비장 및 지방 조직 (복부, 피하 및 견갑골 지방)을 해부 하였다; 간, 폐, 신장 및 지방 조직을 칭량하였다. 장기 및 조직은 추가 분석을 위해 식염수로 헹구었다.
6. 포도당 내성 검사(OGTT)
12 주간의 사육 후에 포도당 내성 검사를 시행하였다. 16 시간의 금식 후 경구 위관 영양법으로 포도당(2.5 mg/g 체중, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 투여하였다. 글루코스 투여 후 0, 10, 20, 30, 60, 90 및 120 분 후에 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. Accu-Check Advantage blood glucose monitor(LifeScan, Johnson & Johnson, 미국 펜실베니아 주 Chesterbrook 소재)를 사용하여 혈당 수준을 측정하였고 곡선 아래의 면적 (AUC)은 제조업체의 지침에 따라 계산되었다.
7. 인슐린 내성 검사(ITT)
인슐린 주입 후 혈당 변화는 ITT에 의해 평가되었다. 생쥐를 인슐린 용액 (0.75UI/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 복강 내 주사 전에 4 시간 동안 금식시켰다. 인슐린 주사 후 0, 10, 20, 30, 60, 90 및 120 분 후에 꼬리 정맥에서 혈액샘플을 채취하였다. 혈당 수준은 Accu-Check Advantage 혈당 모니터에 의해 결정되었고 AUC는 제조업체의 지침에 따라 계산되었다.
8. 생화학 및 조직학 분석
8-1. 대사 매개 변수
EDTA를 함유하는 원심 분리 튜브 내에서 각각의 실험군으로부터 2마리의 마우스로부터 12 주간의 처리 후에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액은 안와 내 안와를 통해 안와 구멍을 뚫고 뽑았다. 샘플을 1200×에서 15분간 원심 분리하고 4℃에서 10분간 배양하였다. 혈청 aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), TC, 고밀도 지단백질(HDL), 저밀도 지단백질(LDL) 및 TG를 혈청 상등액에서 적절한 분석 키트 (Green Cross Biopharmaceutical, Yongin, Korea)를 사용하여 분석하였다. 동일한 샘플을 호르몬 측정에도 사용하였다.
8-2. 호르몬 분석
혈청 중의 아디포넥틴(adiponectin) 농도는 ADP ELISA 키트 (CUSABIO, Houston, TX, USA)를 사용하여 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)에 의해 키트 설명서에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 제조사의 지시에 따라 Linco Human Leptin ELISA 키트(Linco Research, St. Charles, MO, USA)를 사용하여 혈청 leptin 농도를 측정 하였다. Infinite M200 NanoQuant 플레이트 판독기 (Tecan, Switzerland)를 사용하여 450 nm에서 샘플 흡광도를 측정 하였다.
8-3. 사이토카인 분석
12 주간의 처리 후에 수집된 혈액 샘플은 cytokine 분석 [종양 괴사 인자 (TNF-α), 인터페론 (IFN-γ), 인터루킨 (IL) 1β 및 IL-6]에 사용되었다. 혈액 샘플을 4 ℃에서 1 시간 동안 응고시킨 다음 5000×에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 분석할 때까지 상등액 (serum)을 -80℃에서 보관하였다. Cytokine 농도는 제조자의 지침에 따라 적절한 ELISA 키트 (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. Infinite M200 NanoQuant 플레이트 판독기 (Tecan)를 사용하여 450 nm에서 샘플 흡광도를 측정하였다.
8-4. 유세포 분석
희생된 마우스로부터 비장을 수확하고 셀 스트레이너(SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)상에서 분쇄하였다. TC10 자동 세포 계수기 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 trypan blue로 염색한 후 세포를 계수하였다. 이어서 2.0 ×10 6 cells/tube로 희석하고 피코에리트린(PE)표지 항-마우스 항체:CD4 또는 CD8(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 얼음상에서 20분 동안 염색하였다. 세포는 FACSCalibur ™ 유동 세포 계측기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)와 BD CellQuest Pro Software (버전 6.0)에서 적어도 10,000 개의 이벤트를 수집하여 분석되었다.
8-5. 조직학적 분석
조직 검사를 위해 희생된 마우스의 간, 복부, 피하 및 견갑부 지방을 수득하였다. 내장 및 지방 조직을 식염수로 완전히 씻어내었다. 샘플을 분주하고 10 % (v/v) 중성 완충 포르말린(neutral-buffered formalin)에서 24 시간 동안 0 ℃에서 고정시켰다. 그런 다음 파라핀에 끼워 넣고 헤마톡실린&에오신 염색을 수행하기 위해 4-5 μm로 절개하였다. 지방 조직에서 지방 세포의 크기는 광학 현미경 (Leica, Wetzlar, Germany)을 사용하여 측정하였다.
8-6. SCFA 분석
마우스 대변 샘플은 희생하기 며칠 전에 수집되었다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) (Dionex Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 SCFA(장 대사물)의 함량을 측정 하였다.
시료는 4 ℃에서 12,000 x g으로 20 분간 균질화 및 원심분리하여 준비하였다. SCFAs (아세트산과 프로피온산)는 Aminex 87H 컬럼 (300 x 10 mm, Bio-Rad)에서 분리되었다. 이동상(Fluka; Sigma-Aldrich)으로서 0.01 N 황산과 함께 등용매(isocratic) 용출을 사용하였으며, 유속은 0.5 ml/분이었다. SCFAs는 RefractoMax521 Refractive Index Detector (ERC, RefractoMAX520, Kawaguchi, Japan)를 사용하여 210 nm의 파장에서 확인되었다.
9. 3T3-L1에 대한 CAU28 균주의 항비만 효과 평가
9-1. 3T3-L1 세포주의 배양
실험에 사용한 3T3-L1 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지에 FCS(Fetal Calf Serum)과 Streptomycin&Penicillin 항생제를 첨가하여 37℃, 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 본 실험에서는 3T3-L1 세포주를 12-well plate에 FCS 대신 FBS로 교체하여 seeding한 후, 각각의 모든 well에 세포가 꽉 찰 때까지 배양하였다.
9-2. 분화 유도 및 실험군
각 그룹은 3T3-L1 세포에 배지만 처리하여 배양시킨 음성대조군그룹, 분화성분(Insulin, 3-Isobutyl-1-methylxanthine, Dexamethasone)이 포함된 배지를 처리한 조건을 양성대조군그룹, 분화배지에 CAU 28의 lysate를 처리한 조건을 실험군으로 설정하였다. 분화 유도 4일 후, 양성대조군그룹에는 Insulin만 포함된 배지를 처리함. 실험군에는 같은 배지 조건에 유산균을 계속 처리하여 9일간의 분화를 유도하였으며, 이 때 분화 유도 7일째부터, 분화성분이 포함되지 않은 배지를 이틀 동안 처리하였다. Lysate의 농도는 1x10 10 CFU/ml이며 세포에 처리할 때는 1%를 처리하였다. 총 9일간의 분화가 끝난 후 세포와 상층액으로부터 지방분화 정도를 확인하였다.
9-3. 3T3-L1으로부터 Oil Red O staining
분화가 끝난 3T3-L1 세포를 washing 한 뒤 포르말린용액으로 세포를 고정하였다. Oil red O 용액을 이용하여 지방세포를 염색을 진행한 뒤 현미경으로 관찰 후, Isopropanol로 Destaining을 한 후 흡광도 측정을 통해 지방 축적 정도를 확인하였다.
9-4. 3T3-L1으로부터 Real-Time PCR
분화가 끝난 3T3-L1 세포를 washing 한 뒤 Trizol을 이용하여 RNA extraction을 진행하였다. RNA extraction 후 cDNA 합성을 하였다. 지방 축적 관련 인자들의 primer를 이용하여 Real-Time PCR을 이용하여 발현량을 확인하였다.
9-5. 3T3-L1으로부터 Triglyceride 측정
분화가 완료 된 3T3-L1 세포를 scraper를 이용하여 떼어 낸 뒤, 원심분리를 통해 얻은 pellet을 Triglyceride 측정에 이용하는 용액에 잘 섞은 후 멸균이 된 Beads를 이용하여 세포를 파괴하였다. 다시 한 번 원심분리 후, 상층액을 따로 수득한 후 Triglyceride를 측정하였다.
9-6. 3T3-L1으로부터 cytokine 측정
분화 종료 된 3T3-L1 세포에 양성대조군그룹과 유산균을 처리한 실험군에 LPS(100ng/ml)를 4시간 처리 후 상층액 수득하여 cytokine을 측정하였다.
10. 통계분석
결과는 평균 ±표준 오차 (SEM)로 나타내었다. 생화학적 매개 변수 데이터는 정상적으로 분포되었고 그룹 간의 유의한 차이는 post-hoc analysis(Duncan 's test)을 이용하여 one-way ANOVA 로 결정되었다. P <0.05 가 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 간주되었다. 모든 분석은 GraphPad Prism 통계 패키지(버전 7.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하여 수행되었다.
실시예 1 : CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 BMI와 Lee 비만 지수에 미치는 영향
모든 그룹에서 동물의 초기 체중은 유의한 차이가 없었으나(P = 0.6456; 표 1), BMI의 AUC는 양성 대조군에 비해 CAU 28, CAU 28 크림치즈, 음성 대조군 및 심바스타틴 군에서 명백히 낮았다(P <0.0001)( 도 1a).
표 1에 나타나듯이, 전체 실험 기간 동안 실험 동물의 비만 변화를 정확하게 평가하기 위해 1 주와 12 주에 모든 동물의 Lee 비만 지수를 비교하였다. 1 주째, 그룹 간의 Lee 비만 지수에는 차이가 없었다 (P = 0.1042). 그러나, 12 주째 양성 대조군의 Lee 비만 지수는 다른 군의 비만도보다 유의하게 높았다 (P <0.01).
음성 대조군, CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 Lee 비만 지수는 12 주째가 1주째보다 유의하게 낮았다. 심바스타틴 그룹의 Lee 비만 지수는 12주째가 1주째보다 약간 높았다 ( 도 1b).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 HFD로 인한 비만을 억제하여, BMI와 Lee 비만 지수를 감소시켰음을 나타낸다.
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실시예 2: CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 장기 및 지방 비율에 미치는 영향
CAU 28 건성 세포와 CAU 28 크림치즈가 장기와 지방 조직에 미치는 영향을 알아보기 위해 간, 폐, 신장 및 지방 조직 (복부, 피하 및 견갑골 지방 조직)에 대한 기관-체중의 비(adipose tissue-to-body weight ratio)가 결정되었다.
양성 대조군의 간/체중은 CAU 28, CAU 28 크림치즈 및 심바스타틴군보다 유의하게 높았다 (P <0.01) ( 도 2a). 이는 CAU 28 동결 건조군과 CAU 28 크림치즈군의 경구 투여가 간 비대를 예방함을 의미한다. 이에 더하여, CAU 28 크림치즈 섭취군의 효과는 CAU 28 동결건조 cell 섭취의 효과보다 더 두드러졌다.
양성 대조군, CAU 28, CAU 28 크림치즈 및 심바스타틴군 (P = 0.3841) ( 도 2b 및 2c)에서 폐와 신장/체중의 비에는 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 HFD 유발 비만 마우스에서 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 투여로 폐와 신장이 손상되지 않았음을 시사한다.
체지방 비율은 체중에 대한 지방의 무게의 비율로, 동물의 비만 정도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 복부 및 피하 지방 조직은 백색 지방을 나타낸다. 견갑골 지방 조직은 갈색 지방을 나타냅니다. 양성 대조군의 백색 지방/체중비는 음성 대조군보다 유의하게 높았다 (P <0.0001). 이는 HFD가 비만 마우스에서 백색 지방/체중 비를 증가시키는 결과를 나타내었다. 반면, CAU 28, CAU 28 크림치즈 및 심바스타틴 그룹에서 양성 대조군에 비해 백색 지방/체중비가 분명히 감소하였다 (P <0.0001) ( 도 2d).
또한 양성 대조군의 갈색 지방/체중비는 CAU 28, CAU 28 크림치즈 및 심바스타틴 군 (P = 0.4594)과 유의한 차이가 없었다 ( 도 2e). 따라서, CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여는 HFD 유발 비만 마우스의 갈색 지방/체중 비율은 증가시키면서 백색 지방/체중비는 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 3: CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 간 지방증 및 지방 세포 크기에 미치는 영향
조직학적 분석 결과 양성대조군의 간에서 지질 축적이 비정상임을 확인하였다 ( 도 3a). 양성 대조군에서는 간 조직에 소포 손상이 관찰되었고 간장의 지방 함량은 높았으며 혈관에 많은 양의 지방이 축적되어 세포 내용물이 새고 세포가 부풀어 오르고 세포막이 파괴되었다. 반면, HFD로 유도된 비만 마우스에게 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈를 경구 투여한 결과, 간 지방증은 양성 대조군에 비해 덜 나타났고 간세포에는 지방 공포가 적었으며 형태적으로 음성대조군과 유사했다. 심바스타틴군의 간 지방 방울은 양성 대조군보다 작았지만, 심바스타틴군에서는 그 수가 유의하게 감소하지 않았다.
복부 및 피하 지방 내 지방 세포의 비대는 양성 대조군 및 심바스타틴군에서 CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군보다 더 두드러졌으나, 갈색 지방 세포는 그 반대였다. 이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 섭취가 간세포와 지방 세포에서 지질의 축적을 억제함을 나타낸다. 즉, CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 효과가 심바스타틴의 영향보다 더 두드러졌으며 HFD 유발 비만군의 간 손상 정도를 감소시켰다.
도 3b에 나타나듯이, 마우스의 갈색 및 백색 지방 조직(복부 및 피하)의 크기를 측정하였다. 양성 대조군의 갈색 지방 조직은 CAU 28 크림치즈군 (P <0.001) 및 음성 대조군 (P <0.05)보다 작았다. 그러나, CAU 28 건조 세포와 양성 대조군 (P = 0.9167) 사이에는 크기에 차이가 없었다 ( 도 3b). 복부 및 피하 지방 조직은 양성 대조군보다 다른 모든 군에서 유의하게 더 작은 것을 확인하였다(P <0.001) ( 도 3c 및 3d).
실시예 4: CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 OGTT에 미치는 영향
OGTT는 12주 후 모든 그룹의 동물에서 외과적으로 투여된 포도당에 대한 혈당 반응을 결정하는데 사용되었다. 모든 군에서 혈당 농도는 포도당 투여 직후 증가하였고 포도당 투여 후 20-30 분에 최고 농도에 도달하였다. ( 도 4a). CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 피크 혈당 농도는 양성 대조군 및 심바스타틴군보다 낮았다.
모든 그룹의 혈당 농도는 피크 수준에 도달한 직후 감소하였으나, CAU 28 크림치즈와 음성 대조군에서의 혈당 농도 AUC는 양성 대조군과 비교하여 유의하게 낮았으며 (P <0.01), CAU 28, 심바스타틴 및 양성 대조군의 혈당 농도간 유의한 차이가 없었다(P = 0.2082) ( 도 4b).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈 섭취가 HFD로 유발된 비만 마우스의 혈당 농도를 감소시킨다는 것을 의미한다.
실시예 5: CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 ITT에 미치는 영향
각 그룹에서의 마우스의 인슐린 저항성을 평가하기 위해 인슐린 주사 후 단기 ITT에 의하여 혈당 변화를 측정하였다. 모든 그룹에서 인슐린 주사 직후 혈당 농도가 증가하고 인슐린 주사 후 피크가 20분만에 도달하였다 ( 도 5a). 그 후, 혈당 농도는 즉시 감소하여 인슐린 주사 30분 후에 새로운 낮은 수준에 도달하였다가, 그러한 낮은 수준은 측정이 끝날 때까지 유지되었다 (120 분). 심바스타틴군의 혈당 농도는 양성 대조군보다 유의하게 높았다 (P <0.01. 그러나 CAU 28, CAU 28 크림치즈 및 음성 대조군의 혈당 농도는 양성 대조군보다 낮았다( 도 5b).
뿐만 아니라, CAU 28 크림치즈군, 음성 대조군 및 양성 대조군의 AUC 값에서만 유의미하게 차이가 있었다 (P <0.05) ( 도 5b).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈 섭취가 ITT에서 혈당 농도를 감소시킨다는 것을 나타내었다.
실시예 6: CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈 섭취가 혈액의 염증 표지자에 미치는 영향
사이토카인 및 케모카인 생산에 대한 CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취의 효과를 조사하기 위해, 각 그룹의 동물의 혈청에서 사이토카인 및 케모카인 농도를 조사 하였다.
양성 대조군의 혈청 leptin 수치는 음성 대조군의 수치보다 유의하게 높았으며 (P <0.0001), 이는 HFD가 leptin 내성을 유발한다는 것을 나타낸다 ( 도 6a). CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 혈중 렙틴 농도는 양성 대조군보다 유의하게 낮았다(P <0.0001). 심바스타틴군과 양성 대조군에서 혈청 렙틴 농도는 통계적으로 유의한 차이가 없었다 (P = 0.9971). 이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 HFD로 유발된 비만 마우스에서 혈청 렙틴 수치를 감소 시켰음을 나타낸다.
혈청 adiponectin 수치는 음성 대조군에서 양성 대조군보다 분명히 높았다 ( 도 6b). 증가된 산화스트레스는 아디포넥틴 분비를 감소시킨다고 알려져 있으며, 아디포넥틴은 주로 지방세포에서 분비되어 인슐린감수성을 증가시키고, 간에서의 당 생산을 감소시켜 고지혈증을 개선하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 고지방 식이는 HFD로 유발된 비만 마우스에서 아디포넥틴 수준의 감소를 가져오는 것을 나타냈으나, CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군 (P <0.0001) 및 심바스타틴군 (P <0.001)의 혈청 아디포넥틴 수준은 양성 대조군보다 유의하게 높았다. 따라서, 이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 HFD로 유발된 비만 마우스에서 혈청 아디포넥틴 수치를 상승시킴을 나타낸다.
지방이 체내에 쌓이면 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase가 활성화되어 전신적으로 산화스트레스가 증가된다. 증가된 산화스트레스는 염증성 사이토카인인 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1), IL-6(interleukin-6), 등을 증가시키는 것으로 알려져 있다. TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-6의 혈청 농도는 양성 대조군이 음성대조군, CAU 28, CAU 28 크림치즈군보다 유의하게 높았다(P <0.0001) ( 도 6c-f). TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-6은 염증성 사이토카인이다. 따라서, 이들 데이터는 CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 HFD로 유도된 비만 마우스에서의 전염증성 사이토카인의 수준을 감소시킴으로써, 산화스트레스를 감소 또는 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 7: 림프구에 대한 CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취의 효과
HFD로 유도된 비만 마우스의 면역계에 대한 HFD의 영향을 조사하기 위해 비장에서 T 림프구의 수를 측정하였다 ( 도 7a 및 7b).
CD4 + T 세포의 수는 양성대조군에서 음성 대조군보다 유의하게 낮았다 (P <0.05) ( 도 7a). 이것은 HFD가 비만 마우스의 CD4 + T 세포 수치를 감소시켰음을 나타낸다. 측정 결과, CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 CD4 + T 세포 수가 양성 대조군의 것보다 높았다.
음성 대조군과 CAU 28 크림치즈군의 CD8 + T 세포 수는 양성 대조군보다 높았으나 CAU 28 군의 CD8 + T 세포 수는 양성 대조군보다 낮았다. ( 도 7b).
따라서, CAU 28 건성 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 CD4 + 헬퍼 T 세포의 수를 증가시킴으로써 면역 반응을 향상시키는 것으로 나타났다.
실시예 8: CAU 28 건식 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취가 혈액 성분에 미치는 영향
8-1. TC, HDL/TC, LDL/TC 및 TG 수준 측정
12주 후에, 각 그룹의 혈청 지질 수준을 검사했다 ( 도 8a 내지 8d). 그 결과, 음성 대조군, CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 TC, TG, LDL/TC 값은 양성 대조군보다 유의하게 낮았다(P <0.05) ( 도 8a, 8c 및 8d). 음성 대조군의 HDL/TC 비율은 양성 대조군의 HDL/TC 비율보다 높았다.(P = 0.2721)( 도 8b).
CAU 28 크림치즈의 투여가 TC (P <0.05)를 유의하게 감소시켰으며, 양성대조군과 비교하여 TG 수준 (P = 0.05)을 감소시켰다. 뿐만 아니라, CAU 28 건조 세포 및 심바스타틴의 투여에 의해서도 HFD-유도된 비만 마우스에서 TC 및 TG 수준을 유의하게 감소시켰다(P=0.6401) ( 도 8a 및 도 8d).
심바스타틴, CAU 28 및 CAU 28 크림치즈군의 LDL/TC 비율은 양성 대조군보다 낮았으며(도 8c), 양성 대조군의 HDL/TC ratio는 다른 실험군의 HDL/TC ratio보다 높았지만 통계적 유의성은 없었다 (P = 0.1295, 표 1) ( 도 8b).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈 섭취가 HFD로 유발된 비만 마우스의 TC 및/또는 TG 혈청 수준을 감소시켰음을 나타낸다.
8-2. AST 및 ALT 수준 측정
세포막의 구조와 기능이 파괴되게 되면 간 세포질 내에 널리 존재하는 효소인 ALT(Alanine aminotransferase) 가 혈액으로 유출되므로 혈액 내 ALT 수치는 간 손상의 지표로 빈번히 사용되고 있다. 간 질환의 생체 표지자인 AST와 ALT의 혈청 농도는 양성 대조군이 CAU 28과 CAU 28 크림치즈군보다 유의하게 높았다 (P <0.01)( 도 9a 및 9b).
양성 대조군의 혈청 농도는 심바스타틴군보다도 유의하게 높았으나 (P <0.001), 양성 대조군과 심바스타틴군의 혈청 AST 농도는 통계적으로 차이가 없었다 (P = 0.1849) ( 도 9b).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 섭취가 HFD로 유발 된 비만 마우스의 간 손상을 예방한다는 것을 보여 주었다.
실시예 9: 분변 SCFA에 대한 CAU 28 건조 세포 및 CAU 28 크림치즈 섭취의 효과
아세트산 및 프로피온산은 혈액으로 흡수되어, 간을 통과하여 대사 경로에 도입된다. SCFA, 주로 프로피온산은 글루코즈 저항성을 향상시키고, 간에서의 콜레스테롤 합성을 억제하는 것으로 추측되는데, 이는 아마도 혈청 내 유리 지방산 농도의 증가를 억제하고 인슐린 감수성을 개선시킴으로 인할 것이다. 상기 SCFA는 또한 PPAR의 발현에도 영향을 미친다는 사실을 알게 되었으며, PPAR의 상승 조절 작용은 ApoA1 즉, HDL의 주요 성분의 생성을 증가시키는 것으로 판명되었다.
따라서, SCFAs(short chain fatty acids)인, 아세트산 및 프로피온산의 수준을 12 주 후 마우스 대변을 통하여 측정하였다.
SCFA 수치는 음성 대조군에서 양성 대조군보다 유의하게 높았다(P <0.001) ( 도 10a 및 10b). 이것은 HFD가 HFD로 유발된 비만 마우스의 장내에서 아세트산 및 프로피온산 수준의 감소를 유도한다는 것을 나타냈다.
뿐만 아니라, 대변내 아세트산과 프로피온산 농도는 CAU 28 크림치즈군에서 양성 대조군보다 유의하게 높았다 (P <0.05). 아세트산과 프로피온산 모두 CAU 28군에서 양성 대조군보다 높았다 (P = 0.0749).
이러한 결과는 CAU 28 건조 세포와 CAU 28 크림치즈의 경구 투여가 HFD로 유발된 비만 마우스의 아세트산과 프로피온산의 장내 수준을 증가시켜, 장내균총을 개선하는 효과가 있을 뿐만 아니라 인슐린 저항성 및 글루코즈 저항성을 향상시키고 간에서의 콜레스테롤 합성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 10: 3T3-L1에 대한 CAU28 균주의 항비만 효과 및 지방분화 억제능
3T3-L1에 대한 CAU28 균주를 처리하였을 때, 지방의 축적 정도를 정량화하고, 현미경으로 염색된 지방세포를 확인하였다.
그 결과, 유산균을 처리한 실험군에서 지방 축적 정도가 감소하였다. 분화성분을 처리한 양성대조군과 비교를 했을 때에도 통계적으로 유의적인 차이가 있었다(도 11a). 현미경으로 염색된 지방세포를 확인한 결과에서도 지방세포가 염색된 정도가 양성대조군과 비교해 현저히 감소하였다(도 11b).
그 다음으로, 3T3-L1에 CAU28을 처리하였을 때 지방 축척 관련 인자의 mRNA 발현량, triglyceride 축적량 및 IL-6 분비량을 확인해 보았다.
그 결과, CAU28을 처리한 실험군이 양성대조군에 비해 지방 축적 관련 인자들의 발현 정도가 감소함을 보였고 통계적으로 유의적인 차이가 있었다(도 12). 또한, 지방세포 내 축적된 triglyceride의 양이 감소하였으며(도 13a), IL-6의 분비량 또한 유의하게 감소된 것으로 확인되었다(도 13b).
락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군 예방 및 치료 효과를 갖는 치료용 조성물로서 혈중 글루코오스 수치를 감소시키고, 고지방식이에 의해 유발되는 체중 증가를 억제하는 효과가 있으며, 비만에 의해 생성된 조직의 지방을 감소시키는 효능과 간손상을 저해하는 효과가 있는 것을 특징하여 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료제 개발에도 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12684BP
수탁일자 : 20140926
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Claims (11)

  1. 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 기탁번호가 KCTC 12684BP 인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대사증후군은 비만, 이상지방혈증, 고지혈증, 당뇨 및 인슐린 저항성 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식품은 발효식품 또는 치즈인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  6. 지방간 또는 대사증후군의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 기탁번호가 KCTC 12684BP 인 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제6항에 있어서, 상기 대사증후군은 비만, 이상지방혈증, 고지혈증, 당뇨 및 인슐린 저항성 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis) 균주, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 발효물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 지방간 또는 대사증후군의 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( Lactococcus chungangensis)는 기탁번호가 KCTC 12684BP 인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 대사증후군은 비만, 이상지방혈증, 고지혈증, 당뇨 및 인슐린 저항성 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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