WO2020054922A1 - 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법 - Google Patents

고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2020054922A1
WO2020054922A1 PCT/KR2019/000712 KR2019000712W WO2020054922A1 WO 2020054922 A1 WO2020054922 A1 WO 2020054922A1 KR 2019000712 W KR2019000712 W KR 2019000712W WO 2020054922 A1 WO2020054922 A1 WO 2020054922A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
organic solvent
water
polymer beads
superabsorbent polymer
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2019/000712
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김영환
방글
김정아
최정훈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Basic Science Institute KBSI
Original Assignee
Korea Basic Science Institute KBSI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Basic Science Institute KBSI filed Critical Korea Basic Science Institute KBSI
Publication of WO2020054922A1 publication Critical patent/WO2020054922A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G01N2001/385—Diluting, dispersing or mixing samples diluting by adsorbing a fraction of the sample

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting lipids using a spin column filled with super absorbent polymer beads (SAPB) and a lipid extraction kit using the super absorbent polymer beads.
  • SAPB super absorbent polymer beads
  • Lipids are major components of biological cell membranes and are involved in a number of biochemical functions and metabolic processes such as intracellular cellular signaling, secretion and energy storage.
  • lipids are known to play an important role in biological mechanisms and are closely related to diseases such as diabetes, Alzheimer's disease, atherosclerosis, and cancer, which has led to extensive and quantitative studies of lipids in bioanalytical chemistry. Is being made.
  • the most important issue in the analysis of a sample is the loss of the sample due to the sample processing process. To overcome this, methods have been developed to reduce sample delivery and loss volume during sample preparation.
  • lipids vary depending on the polarity of the lipids and the molecular skeleton structure, which complicates simultaneous analysis of all types of lipids with a high recovery rate.
  • successful analysis is determined by efficient extraction and separation methods of complex lipid mixtures from biological samples such as cells, tissues, and body fluids.
  • LLE liquid-liquid extraction
  • 10-1816288 relates to a method for pre-treatment of a sample using a super absorbent polymer and a device therefor (hereinafter also referred to as a “SAP” method), using a super absorbent polymer powder and lipid without requiring a centrifugation step.
  • SAP super absorbent polymer and a device therefor
  • the present inventors are using a spin column filled with super absorbent polymer beads (SAPB) while researching to improve the procedure of existing Folch and SAP methods used to extract lipids and increase separation efficiency.
  • SAPB super absorbent polymer beads
  • An object of the present invention is to provide a method for extracting lipids using a spin column filled with super absorbent polymer beads (SAPB).
  • SAPB super absorbent polymer beads
  • Another object of the present invention is to provide a lipid extract kit using super absorbent polymer beads (SAPB).
  • SAPB super absorbent polymer beads
  • Super Absorbent Polymer refers to a synthetic polymer material having the ability to absorb moisture up to 500 to 1,000 times its own weight.
  • sample refers to a compound or composition to be analyzed containing an analyte
  • a sample that can be used in the present invention is an aqueous phase or a similar flowable material including an aqueous solution.
  • the sample is a biological sample, and includes a body-derived body component such as whole blood, plasma, serum, urine, saliva, manure, lymph fluid, and amniotic fluid, and refers to a fluid material including liquid extracted from tissues, cells, and microorganisms. do.
  • the principle of extracting lipids using the superabsorbent polymer beads according to the present invention is shown in FIG. 1.
  • the present invention is a conventional modified by using a spin column filled with super absorbent polymer beads (SAPB) to separate the lipids dissolved in the organic solvent added to the added organic solvent through the interaction with SAPB through centrifugation. Samples in a small amount (for example, 10 ⁇ L or less in the case of plasma) compared to the Folch method and the SAP method can be extracted with high sensitivity and reproducibility.
  • SAPB super absorbent polymer beads
  • the method for extracting lipids using the superabsorbent polymer beads of the present invention it is possible to extract lipids from a small amount of samples for a short time compared to the conventional Folch method using the superabsorbent polymer beads, and also compared with the conventional SAP method. It has the advantage of excellent reproducibility, sensitivity and quantification. Therefore, the present invention is expected to have a very high industrial applicability in the biomedical and chemical fields, such as the development of a sample pretreatment diagnostic kit capable of extracting and concentrating disease-related biomarkers in biological fluids necessary for disease diagnosis.
  • Figure 2 shows the results of the recovery test (recovery test) according to the extraction method of Examples 1 and 3
  • Figure 3 shows the results of the sensitivity and quantitative comparison in the cation mode according to the extraction method of Examples 1 to 3.
  • Figure 4 shows the results of comparing the sensitivity and quantification in the anion mode according to the extraction method of Examples 1 to 3.
  • Figure 5 shows the results of the reproducibility comparison in the cation mode according to the extraction method of Examples 1 to 3.
  • the present invention is to provide a method for extracting lipids using a spin-colum filled with super absorbent polymer beads (SAPB), the method comprising:
  • (C) characterized in that it comprises a step of separating the organic solvent layer containing a lipid by centrifugation from the aqueous solution layer containing the superabsorbent polymer beads.
  • the average diameter of the beads is 1.5 mm or less.
  • the sample is characterized in that it is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, saliva, manure, lymph fluid, amniotic fluid, tissue, cells and microorganisms.
  • the organic solvent is an alkyl ether (for example, diisopropyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), ethyl t-butyl ether, methyl t-pentyl ether (TAME) ), Ethyl t-pentyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, ethylene glycol dimethyl ether or diethyl ether, diethylene glycol dimethyl ether or diethyl ether); Dialkyl ketones (e.g., diisopropyl ether, methyl t-butyl ether (MTBE), ethyl t-butyl ether, methyl t-pentyl ether (TAME) ), Ethyl t-pentyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, ethylene glycol dimethyl ether or diethyl ether,
  • nitriles e.g. acetonitrile, propionitrile, butylonitrile or benzonitrile
  • amides e.g. , N, N-dimethyl-formamide (DMF), N, N-dimethyl-acetamide, N-methyl-formanilide, N-methyl-pyrrolidone or hexamethyl-phosphoramide
  • esters e.g. , Methyl, ethyl, n- or i-propyl, n-, i- or s-butyl acetate
  • alcohols e.g. ethanol, n- or i-propanol, n-, i-, s- or t- Butanol
  • sulfoxide e.g. ethanol, n- or i-propanol, n-, i-, s- or t- Butanol
  • the method includes: (A) adding a water-soluble sample to a spin-colum filled with a superabsorbent polymer bead to absorb the mixture; (B) By adding MeOH and MTBE (methyl tert-butyl ether) to the superabsorbent polymer beads, the aqueous solution layer and the hydrophobic material absorbed in the superabsorbent polymer beads are separated and dissolved into organic solvent layers, respectively, and organic Separating the solvent liquid layer from the solidified aqueous solution layer; And (C) separating the organic solvent layer containing the lipid by centrifuging for 1 minute at 6,000 rpm from the aqueous solution layer containing the superabsorbent polymer beads.
  • MeOH and MTBE methyl tert-butyl ether
  • the present invention is to provide a lipid extraction kit using super absorbent polymer beads (Super Absorbent Polymer Bead, SAPB), the kit
  • the aqueous layer and the hydrophobic material in which the water-soluble material in the water-soluble sample is absorbed into the superabsorbent resin are separately dissolved into an organic solvent layer, and the organic solvent liquid layer is separately dissolved. It is characterized by being separated from the solidified aqueous solution layer.
  • the kit is characterized in that it further comprises a filter unit that is provided between the receiving portion and the discharge portion to filter the lipid to be centrifuged.
  • the filter unit may be formed of a membrane or a media filter.
  • the average diameter of the beads is characterized in that less than 1.5 mm.
  • the sample is selected from the group consisting of whole blood, plasma, serum, urine, saliva, manure, lymph fluid, amniotic fluid, tissue, cells and microorganisms do.
  • the organic solvent is characterized in that it is selected from one or more of the group consisting of alkyl ether, dialkyl ketone, amide, ester, alcohol and sulfoxide.
  • Plasma was placed in an Eppendorf tube and 200 ⁇ L of MeOH and 600 ⁇ L of MTBE were continuously added. After vortexing for 30 minutes, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was collected and transferred to a new Eppendorf tube, then 200 ⁇ L of DW was added. Then, after vortexing for 30 minutes, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was collected and transferred to a new Eppendorf tube and dried using nitrogen gas.
  • Example 3 According to the present invention (modified SAP) Lipid extraction
  • Lipid standard materials (LPC 17: 0, Cer d17: 0, SM d17: 0, TG 15: 0/15: 0/15: 0, PC to compare the extraction recovery rate of lipids according to Examples 1 to 3) 19: 0/19: 0, PG 17: 0/17: 0, PE 17: 0 /! 7: 0, PS 17: 0/17: 0) in the positive and negative modes, respectively, recovery test Proceeded. It was confirmed that the method according to the present invention (Example 3) had a higher recovery rate than Example 1 for all lipid standard substances except TG in the cation mode and all lipid substances in the anion mode.
  • the LODs of Examples 1, 2 and 3 were 0.2431, 0.3096 and 0.0351 pmole, respectively, 7 times compared to mFolch and 9 compared to SAP when extracting lipids by the method according to the present invention. It was confirmed that the extraction efficiency more than doubled was increased (FIG. 3).
  • the LODs of Examples 1, 2, and 3 were 0.2340, 0.2359, and 0.1280 pmole, respectively, and when extracting lipids by the method according to the present invention, extraction was more than twice that of mFolch and SAP It was confirmed that the efficiency increased (Fig. 4).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법 및 상기 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지질체의 추출 방법은 종래 Folch 방법 및 SAP 방법에 비해 민감도. 재현성 그리고 정량성이 우수한 장점이 있다.

Description

고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법
본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법 및 상기 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 관한 것이다.
지질은 생물 세포막의 주요 성분으로서 다수의 생화학적 기능 및 세포 내 세포 신호, 분비, 에너지 저장과 같은 대사 과정에 관여한다. 또한, 지질은 생물학적 메커니즘에서 중요한 역할을 하고 당뇨병, 알츠하이머병, 동맥경화, 및 암과 같은 질병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 이로 인해 생분석 화학 분야에서 지질에 대한 광범위하고 정량적인 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 시료의 분석에서 가장 중요한 이슈는 시료 처리 공정에 따른 시료의 손실에 있다. 이를 극복하기 위하여, 시료 준비 과정에서 시료 전달 및 손실 부피를 감소시키기 위한 방법이 개발되고 있다. 또한, 지질의 극성과 분자 골격 구조에 따라 지질의 종류가 다양하기 때문에 높은 회수율로 모든 종류의 지질에 대한 동시 분석을 복잡하게 만든다. 고도로 정교한 지질 분석 방법에도 불구하고, 성공적인 분석은 세포, 조직, 및 체액과 같은 생체 시료로부터의 복잡한 지질 혼합물의 효율적인 추출 및 분리 방법에 의해 결정된다.
전통적인 지질 추출 방법으로는 액체-액체 추출 (liquid-liquid extraction, LLE) 방법을 기반으로 하는 Folch(혹은 modified Folch) method 또는 Bligh/Dyer method 방법이 존재한다. 일반적으로, 상기 LLE 방법은 적은 양의 시료 분석에는 적합하지 않으며 지질 추출에 오랜 시간이 걸리며 또한 낮은 회수율을 보인다. 특히, 혈장, 소변 또는 체액과 같은 생체액 시료로부터 지질을 추출하여 분석할 경우에는 수분의 제거가 전제조건이다. 한편, 특허 제10-1816288호는 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스 (이하 “SAP” 방법이라고도 함)에 관한 것으로, 고흡수성 수지 파우더를 이용하고 원심분리 단계를 요구함이 없이 지질추출의 간소화된 방법을 개시하고 있으나, 일반적인 에펜도르프 튜브에서 원심분리 없이 분리하여 정량적으로 유기층을 분리하는데 한계가 있으며, 편리성, 재현성 그리고 정량성이 떨어지는 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 지질체를 추출하기 위해 사용된 기존 Folch 및 SAP 방법의 절차를 개선하고 분리 효율을 증대시키기 위하여 연구하던 중, 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀 컬럼을 이용하여 시료 내 수용액을 SAPB와의 교화를 거친 후 유기용매를 첨가하여 녹여진 지질체를 원심분리하는 경우 높은 민감도, 재현성 그리고 정량성으로 지질체를 분리할 수 있음을 확인하고 본 발명(Modified SAP method)을 완성하였다.
본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)를 이용한 지질체 추출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “고흡수성 수지(Super Absorbent Polymer, SAP)는 자체 무게의 최대 5백 내지 1천 배 정도의 수분을 흡수할 수 있는 기능을 가진 합성 고분자 물질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “시료(sample)”는 분석물을 포함하는 분석대상 화합물 또는 조성물을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 수용액상 또는 수용액을 포함한 유사한 유동성 있는 물질이다. 상기 시료는 생물학적 시료로, 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수 등의 생체 유래 체성분을 포함하며, 그 밖에 조직, 세포 및 미생물로부터 추출된 액체를 포함하는 유동성 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용하여 지질을 추출하는 원리를 도 1에 나타내었다. 본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀 컬럼을 이용하여 시료 내 수용액을 SAPB와의 교화를 거쳐 첨가된 유기용매에 녹여진 지질체를 원심분리를 통해 분리함으로써, 종래 modified Folch 방법 및 SAP 방법에 비해 적은 양(예를 들면, 혈장의 경우 10 μL 이하)의 시료도 신속하고 높은 민감도 및 재현성으로 추출할 수 있다.
본 발명의 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체의 추출 방법에 따르면 고흡수성 수지 비드를 이용하여 종래 Folch 방법에 비해 빠른 시간 동안 적은 양의 시료로부터 지질체의 추출이 가능하고, 또한 종래 SAP 방법에 비해 재현성, 민감도 그리고 정량성이 우수한 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 질환 진단에 필요한 생체액내 질환 관련 바이오마커들을 추출 및 농축할 수 있는 시료전처리 진단 키트 개발 등의 의생물 및 화학분야의 산업적 이용 가능성이 매우 높은 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용하여 지질을 추출하는 원리를 나타낸다.
도 2는 실시예 1과 3의 추출 방법에 따른 회수시험(recovery test) 결과를 나타낸다
도 3은 실시예 1 내지 3의 추출 방법에 따른 양이온 모드에서 민감도 및 정량성 비교 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1 내지 3의 추출 방법에 따른 음이온 모드에서 민감도 및 정량성을 비교 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 1 내지 3의 추출 방법에 따른 양이온 모드에서 재현성 비교 결과를 나타낸다.
도 6는 실시예 1 내지 3의 추출 방법에 따른 음이온 모드에서 재현성 비교 결과를 나타낸다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀-컬럼을 이용한 지질체의 추출방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은:
(A) 수용성 시료를 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀-컬럼에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계;
(B) 상기 고흡수성 수지 비드에 유기용매를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지 비드에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 단계; 및
(C) 상기 고흡수성 수지 비드를 포함하는 수용액층으로부터 원심분리하여 지질체를 포함한 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 지질체의 추출 방법에 있어서, 상기 비드의 평균 직경은 1.5 mm 이하 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 지질체의 추출 방법에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수, 조직, 세포 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 지질체의 추출 방법에 있어서, 상기 유기용매는 알킬 에테르(예를 들면, 디이소프로필 에테르, 메틸 t-부틸에테르(MTBE), 에틸 t-부틸 에테르, 메틸 t-펜틸 에테르(TAME), 에틸 t-펜틸 에테르, 테트라히드로푸란(THF), 1,4-디옥산, 에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 또는 디에틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 디메틸 에테르 또는 디에틸 에테르); 디알킬 케톤(예를 들면, 메틸 에틸 케톤, 메틸 i-프로필 케톤 또는 메틸 i-부틸 케톤, 니트릴(예를 들면, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 부틸로니트릴 또는 벤조니트릴); 아미드(예를 들면, N,N-디메틸-포름아미드(DMF), N,N-디메틸-아세트아미드, N-메틸-포름아닐리드, N-메틸-피롤리돈 또는 헥사메틸-포스포르아미드); 에스테르(예를 들면, 메틸, 에틸, n- 또는 i-프로필, n-, i- 또는 s-부틸 아세테이트); 알콜(예를 들면, 에탄올, n- 또는 i-프로판올, n-, i-, s- 또는 t-부탄올) 및 술폭사이드로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 지질체의 추출 방법에 있어서, 상기 방법은: (A) 수용성 시료를 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀-컬럼에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계; (B) 상기 고흡수성 수지 비드에 MeOH 및 MTBE(methyl tert-butyl ether)를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지 비드에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 단계; 및 (C) 상기 고흡수성 수지 비드를 포함하는 수용액층으로부터 6,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 지질체를 포함하는 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)를 이용한 지질체 추출 키트를 제공하고자 하는 것으로, 상기 키트는
(a) 수용성 시료와 유기용매가 유입되는 유입부;
(b) 수용성 시료를 혼합 흡수하기 위한 고흡수성 수지 비드를 포함하는 수용부; 및
(c) 상기 수용부 내의 수용성 시료, 유기용매 및 고흡수성 수지 비드 혼합물로부터 원심분리된 지질체가 배출되는 배출부를 포함하고,
상기 수용부 내의 수용성 시료가 혼합 흡수된 고흡수성 수지 비드에 유기용매가 첨가되면 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 수용부와 상기 배출부 사이에 마련되어 원심분리되는 상기 지질체를 여과하는 필터부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 필터부는 분리막(membrane) 또는 여과제(media filter)로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 있어서, 상기 비드의 평균 직경은 1.5 mm 이하 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 있어서, 상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수, 조직, 세포 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트에 있어서, 상기 유기용매는 알킬 에테르, 디알킬 케톤, 아미드, 에스테르, 알콜 및 술폭사이드로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1. Folch 방법에 따른 지질체 추출
혈장을 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣고 200 μL의 MeOH 및 600 μL의 MTBE를 연속적으로 첨가하였다. 30분 동안 볼텍싱 이후에, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 수거하여 새로운 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 200 μL의 DW를 첨가하였다. 그 다음, 30분 동안 볼텍싱 이후에, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 수거하여 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 질소 가스를 이용하여 건조시켰다.
실시예 2. SAP 방법에 따른 지질체 추출
LG Chemicals, lnc으로부터 구입한 고흡수성 수지 분말 2-15mg을 에펜도르프 튜브에 넣고, 혈장 시료를 첨가하였다. 상기 고흡수성 수지 분말이 충분히 swelling된 후, 100 μL의 MeOH 및 200 μL의 MTBE를 연속적으로 첨가하였다. 5분 동안 볼텍싱 이후에, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 수행하였다. 상층액을 수거하여 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 질소 가스를 이용하여 건조시켰다.
실시예 3. 본 발명 (modified SAP)에 따른 지질체 추출
15개의 고흡수성 수지 비드를 spin column의 reservoir에 넣고, 혈장 시료를 첨가하였다. 상기 고흡수성 수지 비드가 충분히 swelling된 후, 100 μL의 MeOH 및 200 μL의 MTBE를 연속적으로 첨가하였다. 그 다음, 6,000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 수행하였다. spin down된 용매(유기층)을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮기고 질소 가스를 이용하여 건조시켰다.
< 실험예 >
실험예 1. 추출 방법에 따른 회수시험 결과 비교
상기 실시예 1 내지 3에 따른 지질의 추출 회수율을 비교하기 위하여 지질 표준 물질들(LPC 17:0, Cer d17:0, SM d17:0, TG 15:0/15:0/15:0, PC 19:0/19:0, PG 17:0/17:0, PE 17:0/!7:0, PS 17:0/17:0)에 대해 양이온과 음이온 모드에서 각각 회수시험(recovery test)을 진행하였다. 양이온 모드에서 TG를 제외한 모든 지질표준 물질 그리고 음이온 모드에선 모든 지질 물질에 대해 실시예 1에 비해 본 발명에 따른 방법(실시예 3)이 회수율이 높은 것으로 확인되었다.
실험예 2. 추출 방법에 따른 민감도 및 정량성 비교
상기 실시예 1 내지 3에 따른 지질의 추출 효율을 비교하기 위하여 양이온 모드에서 PC(17:0/17:0), 그리고 음이온 모드에서 PG(17:0/17:0)를 각각 이용하여 LOD test를 진행하였다. 이때 LOD는 3.3 X standard deviation/slope를 이용하여 산출하고, 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
양이온 모드의 경우, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 LOD는 각각 0.2431, 0.3096 및 0.0351 pmole으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우 mFolch에 비해 7배 및 SAP에 비해 9배 이상 추출 효율이 증가한 것으로 확인되었다 (도 3). 음이온 모드의 경우도, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 LOD는 각각 0.2340, 0.2359 및 0.1280 pmole으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우 mFolch 및 SAP에 비해 2배 이상 추출 효율이 증가한 것으로 확인되었다 (도 4). 한편, 조사된 표준 지질 물질의 농도 영역내(0.5 ~ 40 pmol)에서 보여주는 직선성에 대한 상관계수(r 2)를 비교하면 양이온 모드의 경우, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 r 2 값은 각각 0.9955, 0.9955 그리고 0.9997 으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우가 정량성이 우수한 것으로 확인되었다 (도 3). 음이온 모드의 경우도, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 r 2 값은 각각 0.996, 0.999 그리고 0.9999 으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우가 정량성이 우수한 것으로 확인되었다 (도 4).
실험예 3. 추출 방법에 따른 재현성 비교
상기 실시예 1 내지 3에 따른 지질 추출시 안정성 및 재현성을 비교하기 위하여 양이온 모드 및 음이온 모드에 대해 Inter-day 그리고 Intra-day RSD test를 진행하였다. 이때 각 실험은 하루 당 5번씩 5일간 진행하였다, 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
양이온 모드의 경우, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 Inter-day RSD는 각각 11.06, 16.35 및 4.96 %으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우 재현성이 가장 우수한 것으로 확인되었다 (도 5). 음이온 모드의 경우도, 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 Inter-day RSD는 각각 5.60, 11.00 및 4.73 %으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 지질체를 추출하는 경우 재현성이 가장 우수한 것으로 확인되었다 (도 6).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)로 채워진 스핀-컬럼을 이용한 지질체의 추출방법으로, 상기 방법은:
    (A) 수용성 시료를 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀-컬럼에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계;
    (B) 상기 고흡수성 수지 비드에 유기용매를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 단계; 및
    (C) 상기 고흡수성 수지 비드를 포함하는 수용액층으로부터 원심분리하여 지질체를 포함한 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비드의 평균 직경은 1.5 mm 이하 인 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수, 조직, 세포 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유기용매는 알킬 에테르, 디알킬 케톤, 아미드, 에스테르, 알콜 및 술폭사이드로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은: (A) 수용성 시료를 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀-컬럼에 첨가하여 혼합 흡수 시키는 단계; (B) 상기 고흡수성 수지 비드에 MeOH 및 MTBE(methyl tert-butyl ether)를 첨가하여 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지 비드에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기 용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 단계; 및 (C) 상기 고흡수성 수지 비드를 포함하는 수용액층으로부터 6,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 지질체를 포함하는 유기용매층을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  6. (a) 수용성 시료와 유기용매가 유입되는 유입부;
    (b) 수용성 시료를 혼합 흡수하기 위한 고흡수성 수지 비드(Super Absorbent Polymer Bead, SAPB)를 포함하는 수용부; 및
    (c) 상기 수용부 내의 수용성 시료, 유기용매 및 고흡수성 수지 비드 혼합물로부터 원심분리된 지질체가 배출되는 배출부를 포함하는 고흡수성 수지 비드를 이용한 지질체 추출 키트로서,
    상기 수용부 내의 수용성 시료가 혼합 흡수된 고흡수성 수지 비드에 유기용매가 첨가되면 수용성 시료 내 수용성 물질이 고흡수성 수지에 흡수되는 수용액 층과 소수성 물질이 유기용매 층으로 각각 분리 용해되어 유기용매 액체층이 고체화된 수용액 층과 분리되는 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 상기 수용부와 상기 배출부 사이에 마련되어 원심분리되는 상기 지질체를 여과하는 필터부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 비드의 평균 직경은 1.5 mm 이하 인 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 분뇨, 림프액, 양수, 조직, 세포 및 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 유기용매는 알킬 에테르, 디알킬 케톤, 아미드, 에스테르, 알콜 및 술폭사이드로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
PCT/KR2019/000712 2018-09-13 2019-01-17 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법 Ceased WO2020054922A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180109563A KR102118067B1 (ko) 2018-09-13 2018-09-13 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법
KR10-2018-0109563 2018-09-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020054922A1 true WO2020054922A1 (ko) 2020-03-19

Family

ID=69777148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/000712 Ceased WO2020054922A1 (ko) 2018-09-13 2019-01-17 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102118067B1 (ko)
WO (1) WO2020054922A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111624085A (zh) * 2020-07-29 2020-09-04 天津中新科炬生物制药股份有限公司 一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102563A1 (en) * 1998-04-24 2002-08-01 Gjerde Douglas T. Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides
JP2013533978A (ja) * 2010-07-14 2013-08-29 キアゲン ゲーエムベーハー 生体分子の単離および／または精製のためのデバイス
KR20130111153A (ko) * 2012-03-30 2013-10-10 (주)어핀텍 원심분리 키트 및 이를 이용한 원심분리 방법
US20140339160A1 (en) * 2011-09-19 2014-11-20 Certo Labs, Inc. Method, apparatus and kit for the extraction of lipid-soluble compounds
KR101816288B1 (ko) * 2016-08-11 2018-01-09 한국기초과학지원연구원 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102563A1 (en) * 1998-04-24 2002-08-01 Gjerde Douglas T. Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides
JP2013533978A (ja) * 2010-07-14 2013-08-29 キアゲン ゲーエムベーハー 生体分子の単離および／または精製のためのデバイス
US20140339160A1 (en) * 2011-09-19 2014-11-20 Certo Labs, Inc. Method, apparatus and kit for the extraction of lipid-soluble compounds
KR20130111153A (ko) * 2012-03-30 2013-10-10 (주)어핀텍 원심분리 키트 및 이를 이용한 원심분리 방법
KR101816288B1 (ko) * 2016-08-11 2018-01-09 한국기초과학지원연구원 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111624085A (zh) * 2020-07-29 2020-09-04 天津中新科炬生物制药股份有限公司 一种用于新型冠状病毒抗体检测的样本稀释装置及试剂卡

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200030833A (ko) 2020-03-23
KR102118067B1 (ko) 2020-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cochin et al. Rapid identification of analgesic drugs in urine with thin-layer chromatography
JP5449202B2 (ja) サンプル中のビタミンｄ類似体の存在および量の決定のための方法およびキット
CN101680904A (zh) 使用具有两性离子固定相的hilic与质谱对甲基丙二酸和丁二酸的定量检测
CN104897907A (zh) 一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其检测方法
CN109633041B (zh) 衍生化hplc法测定药物中双氢睾酮的方法
CN113391008B (zh) 基于自动化移液工作站的脂溶性维生素样本前处理方法
WO2014152502A1 (en) Method for determining derivatized analytes in a separated biological fluid
CN114669280B (zh) 磺胺类药物残留的净化填料及前处理方法
WO2020054922A1 (ko) 고흡수성 수지 비드로 채워진 스핀 컬럼을 이용한 지질체의 추출방법
WO2018030709A1 (ko) 고흡수성 수지를 이용한 시료의 전처리 방법 및 이를 위한 디바이스
CN116026971B (zh) 一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法
CN110068618B (zh) 一种与肾病相关的肠道菌群代谢物的检测方法
Chen et al. Functionalized nanofibers mat prepared through thiol–ene “click” reaction as solid phase extraction adsorbent for simultaneous detection of florfenicol and paracetamol residues in milk
CN116124905B (zh) 一种小鼠血浆、粪便或组织样本中短链脂肪酸的检测方法
CN104535548B (zh) 一种管内固相微萃取技术用于牛奶中磺胺类抗菌药的快速检测方法
Cheng et al. Supported liquid extraction (SLE) in LC‐MS bioanalysis
CN108459101B (zh) 一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法
US20250144549A1 (en) Filter, adapter, and microvolume ultrafiltration bottle
CN118243826B (zh) 一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的代谢物组合及其应用
CN113624888B (zh) 一种血清和粪便中吲哚乙酸和吲哚丙酸的检测方法
CN108344821A (zh) 生物样品中维生素a的液相串联质谱分析方法
CN110618221B (zh) 一种水产品中脱氢胆酸的检测方法
Kuwayama et al. Preparation of highly concentrated extracts from large volume of urine as the first step in detecting trace amounts of hypnotics in urine collected in drug-facilitated crime cases
CN114073941A (zh) 一种有机-无机杂化材料及其制备方法与应用
CN106166480A (zh) 一种同时具有阳离子交换和反相保留能力的吸附材料及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19859883

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19859883

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1