WO2020035267A1 - Verfahren zum bestimmen einer spezifität einer echtzeit-polymerase-kettenreaktion mit einer schmelzkurvenanalyse - Google Patents

Verfahren zum bestimmen einer spezifität einer echtzeit-polymerase-kettenreaktion mit einer schmelzkurvenanalyse Download PDF

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WO2020035267A1
WO2020035267A1 PCT/EP2019/069746 EP2019069746W WO2020035267A1 WO 2020035267 A1 WO2020035267 A1 WO 2020035267A1 EP 2019069746 W EP2019069746 W EP 2019069746W WO 2020035267 A1 WO2020035267 A1 WO 2020035267A1
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real
dyes
polymerase chain
chain reaction
curve analysis
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PCT/EP2019/069746
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Tino Frank
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Robert Bosch Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • Microfluidic systems also known as lab-on-a-chip systems, allow the analysis of small amounts of biological samples with high sensitivity. Automation, miniaturization and parallelization of laboratory processes allow a reduction in manual steps and lead to a reduction in process errors.
  • Microfluidic systems which draw fluidic processes and analytical conclusions via an optical system, are assigned to optofluidics.
  • One such optofluidic application is the real-time polymerase chain reaction (qPCR).
  • pathogens can be detected in biological samples, for example in the blood of patients, which is also referred to as a test.
  • the specificity i.e. the reliable duplication of the desired DNA sections
  • the specificity must generally be checked using a qualitative method such as gel electrophoresis or a melting curve, as described, for example, in US Pat. No. 6,664,064 B1, in particular if several DNA sections are used simultaneously can be reproduced via qPCR (so-called multiplex reaction).
  • Melting curve analysis can thus be used to obtain information about the specificity of the q PCR reaction.
  • the invention relates to a method for determining the specificity of a real-time polymerase chain reaction with a
  • a real-time polymerase chain reaction can be understood in particular as a quantitative real-time PCR (short qPCR).
  • the dyes are to be understood in particular as fluorophores, preferably fluorophores typically used in a qPCR.
  • Dyes are to be understood in particular to mean several particles or molecules of one type or one type of dye. Deactivating the dyes means in particular a change in the dyes such that the dyes are no longer capable of fluorescence. Deactivating the dyes can thus be understood to mean optically deactivating the dyes.
  • the method according to the invention has the advantage that a disruptive influence of dyes of the qPCR in the melting curve analysis is reduced and preferably completely eliminated. This advantageously reduces the risk that a fluorescence signal from a dye of the qPCR is confused with a fluorescence signal from a dye of the melting curve analysis and in particular leads to false-positive results. It is therefore advantageously a trouble-free melting curve analysis
  • the method can also be used in the field of predictive maintenance. This means that the melting curve does not have to be carried out for every test or analysis, but can be used at certain intervals to characterize the test performance in the field and to collect data.
  • the dyes are deactivated by photobleaching, also referred to as light bleaching or photobleaching. Irradiation with sufficiently intense light changes the structure of the dyes in such a way that the dyes are no longer capable of fluorescence.
  • photobleaching also referred to as light bleaching or photobleaching.
  • Irradiation with sufficiently intense light changes the structure of the dyes in such a way that the dyes are no longer capable of fluorescence.
  • the disadvantage of qPCR described above is advantageously used to deactivate the dyes in a simple and reliable manner. It is preferred to use light in the same wavelength range for photobleaching as for performing the qPCR. This further facilitates the use of the method according to the invention already described above in known qPCR systems. Alternatively, white light or light with sufficient intensity and / or sufficiently short wavelengths can also be used to deactivate the dyes.
  • the deactivation step can advantageously be carried out with the fluorescent light source already present in the qPCR system, as a rule, without structural changes.
  • the fluorescence intensity is below 10% of the original Fluorescence intensity or below 10% above the detection limit.
  • the photo bleaching is carried out until one
  • second dyes are added for the melting curve analysis after the dyes have been deactivated. This has the advantage that the second dyes are not affected by the deactivation. It is also of particular advantage that the second
  • Second dyes are to be understood in particular to mean several particles or molecules of one type or one type of dye.
  • products of the real-time polymerase chain reaction are heated for denaturing DNA sections of the products.
  • the entire sample or the reaction mixture comprising the qPCR products can also be heated.
  • the denaturation advantageously enables the incorporation of second dyes into the DNA products for the subsequent melting curve analysis.
  • Fluorescence signals from the melting curve are thus used to measure the fluorescence signals from a cooling curve.
  • the melting curve analysis here corresponds to an inverse sequence, which is also called inverse
  • Melting curve analysis can be called. This has the advantage that there is no need for renewed heating to carry out the melting curve analysis, which advantageously saves time and other resources and thus simplifies the method according to the invention
  • the invention also relates to a microfluidic device for
  • a known microfluidic device can also be set up, in particular programmed, in a simple manner for the use of the method according to the invention.
  • Figure 1 is a flow diagram of an embodiment of the
  • Figure 2 shows an embodiment of the device set up to carry out the method.
  • FIG. 1 shows a flowchart for an embodiment of the
  • Method 500 according to the invention.
  • a real-time polymerase chain reaction qPCR
  • qPCR real-time polymerase chain reaction
  • this serves to replicate characteristic DNA sequences of pathogens in a sample of a body fluid, for example blood or saliva, for subsequent detection of the pathogens.
  • a body fluid for example blood or saliva
  • the number of duplicated DNA sections is monitored in real time using fluoroscence spectroscopy.
  • the PCR approach contains in dyes suitable for fluoroscence spectroscopy in the reaction chamber, for example fluorophores typically used in qPCR.
  • the reaction chamber thus comprises a reaction mixture with the sample and the PCR mixture for the qPCR.
  • the dyes are deactivated in a subsequent second step 502. Since the fluorophores have no chemical influence on the further process, it is sufficient to use the fluorophores
  • photobleaching also referred to as photobleaching, for example using the fluorescent light source of the qPCR with a sufficiently high intensity for a sufficiently long time.
  • the sufficiently high intensity and the sufficiently long time are determined by the type of fluorophores and the desired degree of reduction in fluorescence.
  • the sufficiently high intensity and the sufficiently long time are determined by the type of fluorophores and the desired degree of reduction in fluorescence.
  • Photobleaching Light in the same wavelength range as used for carrying out the qPCR.
  • the photobleaching can then be carried out, for example, until the measured fluorescence drops below a predetermined threshold value.
  • a second dye is used in the third step 503 for the subsequent one
  • the dye is an asymmetrical cyanine dye typical of a melting curve analysis, such as SYBR TM Green I or PicoGreen®.
  • the reaction mixture is heated to a temperature between 90 and 98 ° C. in order to denature the double strands of the DNA sections. This causes not only the melting of the double strands, but also a faster distribution of the second dye in the reaction mixture.
  • the second dyes can also only be added when the elevated temperature has been reached. If necessary or desired, this third step 503 can also be used
  • the melting curve analysis is then carried out in a fourth step 504. This can be done in the usual way. Alternatively, a change in the fluorescence of the second dyes can already be measured during the cooling after the heating described above, in order to thereby convey a cooling curve, which corresponds to an inverse melting curve analysis.
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment of a microfluidic device 100 for carrying out a real-time polymerase chain reaction, the device 100 being set up, for example, for carrying out the method 500 described above according to FIG. 1.
  • FIG. 2a shows the device 100 four times in the states described below, while FIG. 2b qualitatively represents the intensities 10 of the measured fluorescence corresponding to these states after the time 20 in a graph 600.
  • the device 100 can be, for example, a microfluidic system, with a cartridge 200 of the system 100 being one
  • Reaction chamber 210 for performing the qPCR includes. After qPCR has been carried out in the first step of method 501, reaction chamber 210 contains reaction mixture 220 with dyes 221, which are capable of an overall intensive fluorescence. As indicated in FIG. 2b, this fluorescence capability is significantly reduced by the photobleaching 502. As stated above, the duration and the intensity of the photobleaching 502 can be individually adjusted to the reaction mixture or during the photobleaching up to a predetermined reduction in the
  • Fluorescence intensity can be performed dynamically. With the latter
  • the photobleaching curve has a double asymptotic behavior.
  • the graph 600 comprises a first plateau 601 in time before photo bleaching 502 and a second plateau 602 in time after bleaching, which over two pseudoasymptotes covers the linearly decreasing region of the
  • the photo bleaching 502 can thus be ended, for example, when the measured fluorescence intensity of the bleached fluorophores reaches a predetermined minimum value.
  • the minimum value can be, for example, 10% of the original fluorescence intensity or 10% above the detection limit.
  • the minimum value can be, for example, 10% of the original fluorescence intensity or 10% above the detection limit.
  • Photo bleaching 502 can be ended, for example, when the slope of the graph 600, that is to say the change in the fluorescence intensity, no longer changes, for example in the region of the second plateau 602.
  • the second dye 222 can be introduced into the reaction chamber 210 by pumping in the third step 503, for example via a diaphragm pump 110 or a peristaltic pump 120 of the device 100. If the reaction chamber 210 was previously completely filled with the reaction mixture, one can small part of the
  • Reaction mixture 220 are replaced by the second dye 222.
  • the possible fluorescence intensity increases again, as shown in FIG. 2b.
  • the fourth state of the reaction chamber 210 shown on the far right in FIG. 2a shows complete mixing of the reaction mixture 220 with the second dye 222. As described above, the installation of the second dye is carried out
  • the reaction mixture 220 is heated into the double-stranded DNA sections, for example to a temperature between 90 and 98 ° C., which, in addition to melting the DNA, causes the second dye to mix faster.
  • the cooling curve can be optically recorded directly instead of cooling the mixture and then the
  • Start melting curve which corresponds to a melting curve in reverse order and saves process time.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) und eine Vorrichtung (100) zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion, wobei eine Durchführung einer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (501) gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse (504) zum Bestimmen der Spezifität durchgeführt wird, wobei vor Beginn der Schmelzkurvenanalyse (504) Farbstoffe, insbesondere Fluorophore (221), der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion deaktiviert werden.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit- Polymerase-
Ketenreaktion mit einer Schmelzkurvenanalyse
Stand der Technik
Mikrofluidische Systeme, auch als Lab-on-a-Chip-Systeme bekannt, erlauben das Analysieren von kleinen Mengen biologischer Proben mit einer hohen Sensitivität. Dabei erlauben Automation, Miniaturisierung und Parallelisierung von Laborprozessen eine Reduktion von händischen Schritten und führen zu einer Verminderung von Prozessfehlern.
Mikrofluidische Systeme, welche fluidische Vorgänge und analytische Schlüsse via ein optisches System ziehen, werden der Optofluidik zugeordnet. Eine solche optofluidische Anwendung ist die Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (qPCR).
Bei diesem Verfahren wird die Vervielfältigung von DNA-Abschnitten in-situ über Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Diese Methode ist sehr sensitiv und erlaubt das Quantifizieren von solchen DNA-Abschnitten in Proben.
Insbesondere können damit Krankheitserreger in biologischen Proben, beispielsweise in Blut von Patienten, nachgewiesen werden, was auch als Test bezeichnet wird. Für einen Qualitätsnachweis der Methode muss die Spezifität, also die zuverlässige Vervielfältigung der gewünschten DNA-Abschnitte, in der Regel mit einer qualitativen Methode wie einer Gelelektrophorese oder einer Schmelzkurve überprüft werden, wie beispielsweise in US 6,664,064 Bl beschrieben, insbesondere wenn mehrere DNA-Abschnitte gleichzeitig über qPCR vervielfältigt werden (sogenannte Multiplexreaktion). Bei einer
Schmelzkurvenanalyse wird dabei die DNA aufgeschmolzen, indem die
Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C— > 95 °C). Bei einer für den DNA-Abschnitt spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der DNA- Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein im DNA- Abschnitt eingefügter Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR™ Green I) freigesetzt und eine Änderung der Fluoreszenz registriert. Die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur eines DNA-Abschnitts sind im Wesentlichen abhängig von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Abschnitts. Die
Schmelzkurvenanalyse kann somit eingesetzt werden, um Auskunft über die Spezifität der q PCR- Reaktion zu erhalten.
Ein unerwünschtes Phänomen bei Durchführung einer qPCR ist die sogenannte Photobleichung, auch als Lichtbleichung oder Photobleaching bezeichnet, und beispielsweise in WO 2015/189297 Al angesprochen. Dabei ist die Abnahme und der Verfall der strukturellen Stabilität der Farbstoffe durch den andauernden Einfall der Strahlung zur Anregung der Fluoreszenz der Farbstoffe zu verstehen, wodurch die Qualität der Fluoreszenzauslese und somit die Qualität der qPCR insgesamt abnimmt.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion mit einer
Schmelzkurvenanalyse. Das Verfahren umfasst die Durchführung der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion gefolgt von der Schmelzkurvenanalyse zum
Bestimmen der Spezifität, wobei vor Beginn der Schmelzkurvenanalyse
Farbstoffe der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion deaktiviert werden.
Unter einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (kurz Echtzeit-PCR) kann insbesondere eine quantitative Echtzeit-PCR (kurz qPCR) verstanden werden. Unter den Farbstoffen sind insbesondere Fluorophore zu verstehen, bevorzugt typischerweise in einer qPCR verwendete Fluorophore.
Unter Farbstoffe sind insbesondere mehrere Partikel oder Moleküle eines Typs oder einer Art Farbstoff zu verstehen. Unter einer Deaktivierung der Farbstoffe ist insbesondere eine Veränderung der Farbstoffe dahingehend zu verstehen, dass die Farbstoffe nicht länger zur Fluoreszenz fähig sind. Somit kann unter einer Deaktivierung der Farbstoffe eine optische Deaktivierung der Farbstoffe verstanden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass ein störender Einfluss von Farbstoffen der qPCR in der Schmelzkurvenanalyse verringert und vorzugsweise vollständig eliminiert wird. Dies verringert somit vorteilhafterweise das Risiko, dass ein Fluoreszenzsignal von einem Farbstoff der qPCR mit einem Fluoreszenzsignal von einem Farbstoff der Schmelzkurvenanalyse verwechselt wird und insbesondere zu Falsch- Positiv- Resultaten führt. Es wird daher vorteilhafterweise eine störungsfreiere Schmelzkurvenanalyse zur
Oualitätsüberprüfung der qPCR ermöglicht. Vorteilhafterweise kann auf zusätzliche Schritte zur Eliminierung oder Deaktivierung der qPCR- Farbstoffe wie beispielsweise Filtrierung, Spülung oder Aufreinigung verzichtet werden. Dies erleichtert oder gar ermöglicht vorteilhafterweise die automatisierte Durchführung dieses Verfahrens in einem mikrofluidischen System in automatisierter Weise. Das Verfahren kann vollständig in-situ durchgeführt werden. Ferner ist von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren in bereits bekannten qPCR- Systemen ohne Hardwareänderungen angewendet werden kann, es muss vorteilhafterweise lediglich der Prozessablauf um den Schritt der Deaktivierung der q PCR- Farbstoffe ergänzt werden. Darüber hinaus kann das Verfahren vorteilhafterweise auch benutzt werden, um die Invalidität einer Analyse oder eines Tests zu evaluieren. Ist während der qPCR keine Vervielfältigung gemessen worden, aber in der Schmelzkurve ein Fluoreszenzsignal zu sehen, dann kann durch die Lage des Signals festgestellt werden, ob unspezifische Produkte entstanden sind oder ein Fehler in der Fluoreszenzsonde vorlag.
Außerdem kann das Verfahren im Bereich der Predictive Maintenance eingesetzt werden. So muss die Schmelzkurve nicht bei jedem Test oder bei jeder Analyse durchgeführt werden, sondern kann in gewissen Intervallen eingesetzt werden, um die Testperformance auf dem Feld zu charakterisieren und Daten zu sammeln.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erfolgt die Deaktivierung der Farbstoffe durch eine Photobleichung, auch als Lichtbleichung oder Photobleaching bezeichnet. Durch eine Bestrahlung mit ausreichend intensivem Licht wird dabei die Struktur der Farbstoffe derart geändert, dass die Farbstoffe nicht länger zur Fluoreszenz fähig sind. Hierdurch wird der oben beschriebene Nachteil der qPCR vorteilhafterweise ausgenutzt, um auf einfache und zuverlässige Weise die Farbstoffe zu deaktivieren. Vorzugsweise wird für die Photobleichung Licht im selben Wellenlängenbereich wie für die Durchführung der qPCR verwendet. Dies erleichtert weiters die bereits oben ausgeführte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in bekannten qPCR-Systemen. Alternativ kann auch weißes Licht oder Licht mit ausreichender Intensität und/oder ausreichend kurzen Wellenlängen zur Deaktivierung der Farbstoffe verwendet. Der Schritt zur Deaktivierung kann vorteilhafterweise in der Regel ohne bauliche Veränderungen mit der bereits in dem qPCR-System vorhandenen Fluoreszenzlichtquelle durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Photobleichung so lange durchgeführt, bis die gemessene
Fluoreszenzintensität unter einen vorgegebenen Schwellwert sinkt,
beispielsweise bis die Fluoreszenzintensität auf unter 10% der ursprünglichen Fluoreszenzintensität oder auf unter 10% über der Nachweisgrenze sinkt.
Ergänzend oder alternativ wird die Photobleichung durchgeführt, bis eine
Änderung der gemessenen Fluoreszenzintensität einen vorgegebenen
Schwellwert erreicht, beispielsweise bis sich die gemessene
Fluoreszenzintensität nicht mehr ändert. So wird die Photobleichung
vorteilhafterweise so lange durchgeführt, so lange sie einen direkten Effekt erzielt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Zugabe von zweiten Farbstoffen für die Schmelzkurvenanalyse nach der Deaktivierung der Farbstoffe. Dies hat den Vorteil, dass die zweiten Farbstoffe nicht durch die Deaktivierung beeinflusst werden. Ferner ist von besonderem Vorteil, dass die zweiten
Farbstoffe nicht durch den PCR-Prozess mitgeführt werden müssen und dabei eventuell eine Wirksamkeit der PCR durch Interaktionen mit den PCR- Komponenten beeinträchtigt. Unter zweiten Farbstoffen sind insbesondere mehrere Partikel oder Moleküle eines Typs oder einer Art Farbstoff zu verstehen.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung werden Produkte der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion für eine Denaturierung von DNA-Abschnitten der Produkte erhitzt. Dabei kann auch die gesamte Probe oder das Reaktionsgemisch, welche die qPCR-Produkte umfassen, erhitzt werden.
Die Denaturierung ermöglicht vorteilhafterweise die Aufnahme von zweiten Farbstoffen in die DNA-Produkte für die nachfolgende Schmelzkurvenanalyse.
Vorzugweise wird während der nachfolgenden Abkühlung der Produkte eine Messung einer Änderung einer Fluoreszenz von zweiten Farbstoffen der
Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Statt einer üblichen Messung der
Fluoreszenzsignale der Schmelzkurve werden somit die Fluoreszenzsignale einer Abkühlkurve gemessen. Die Schmelzkurvenanalyse entspricht hier somit einer Durchführung in inverser Reihenfolge, was auch als inverse
Schmelzkurvenanalyse bezeichnet werden kann. Dies hat den Vorteil, dass auf eine erneute Erhitzung für die Durchführung der Schmelzkurvenanalyse verzichtet werden kann, was vorteilhafterweise Zeit und andere Ressourcen einspart und somit das erfindungsgemäße Verfahren vereinfacht und
beschleunigt. Gegenstand der Erfindung ist auch eine mikrofluidische Vorrichtung zur
Durchführung einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion, wobei die Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche eingerichtet ist. Wie oben ausgeführt, kann auch eine bekannte mikrofluidische Vorrichtung in einfacher Weise für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet, insbesondere programmiert, werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figur 1 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des
erfindungsgemäßen Verfahrens und
Figur 2 ein Ausführungsbeispiel der zur Ausführung des Verfahrens eingerichteten erfindungsgemäßen Einrichtung.
Ausführungsformen der Erfindung
Figur 1 zeigt ein Ablaufdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des
erfindungsgemäßen Verfahrens 500. In einem ersten Schritt 501 des Verfahrens 500 wird eine Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (qPCR) zur Vervielfältigung eines oder mehrerer DNA-Abschnitte aus einer biologischen Probe durchgeführt. Beispielsweise dient dies zur Vervielfältigung charakteristischer DNA-Sequenzen von Krankheitserregern in einer Probe einer Körperflüssigkeit, beispielsweise Blut oder Speichel, für einen anschließenden Nachweis der Krankheitserreger. Wie bei qPCR üblich, wird die Anzahl der vervielfältigten DNA-Abschnitte mittels Fluoroszenzspektroskopie in Echtzeit verfolgt. Dazu enthält der PCR-Ansatz in der Reaktionskammer für die Fluoroszenzspektroskopie geeignete Farbstoffe, beispielsweise in der qPCR typischerweise eingesetzte Fluorophore. Die
Reaktionskammer umfasst somit ein Reaktionsgemisch mit der Probe und dem PCR-Ansatz für die qPCR.
Wenn beispielsweise eine vorgegebene Mindestmenge an vervielfältigten DNA- Abschnitten vorliegt, werden in einem darauffolgenden zweiten Schritt 502 die Farbstoffe deaktiviert. Da die Fluorophore chemisch keinen Einfluss auf das weitere Verfahren haben, genügt es, die Fähigkeit der Fluorophore zur
Fluoreszenz abzustellen. Dies erfolgt vorzugsweise durch Photobleichung, auch als Photobleaching bezeichnet, wobei beispielsweise die Fluoreszenzlichtquelle der qPCR mit einer ausreichend hohen Intensität für eine ausreichend lange Zeit eingesetzt wird. Die ausreichend hohe Intensität und die ausreichend lange Zeit bestimmen sich dabei durch die Art der Fluorophore und das gewünschte Ausmaß an Reduktion der Fluoreszenz. Vorzugsweise wird für die
Photobleichung Licht im selben Wellenlängenbereich wie für die Durchführung der qPCR verwendet Dann kann die Photobleichung beispielsweise so lange durchgeführt werden, bis die gemessene Fluoreszenz unter einen vorgegebenen Schwellwert sinkt.
Nach dem Entfernen oder der Verringerung des Fluoreszenzsignals wird im dritten Schritt 503 ein zweiter Farbstoff für die nachfolgende
Schmelzkurvenanalyse beigegeben, welcher sich in die doppelsträngige DNA der vervielfältigten DNA-Abschnitte einbaut und dadurch bei Anregung ein stärkeres Signal emittiert. Beispielsweise handelt es sich bei dem Farbstoff um einen für eine Schmelzkurvenanalyse typischen asymmetrischen Cyanin- Farbstoff wie SYBR™ Green I oder PicoGreen®. Dazu wird das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur zwischen 90 und 98 °C erwärmt, um die Doppelstränge der DNA- Abschnitte zu denaturieren. Dies bewirkt nicht nur das Aufschmelzen der Doppelstränge, sondern auch ein schnelleres Verteilen des zweiten Farbstoffs im Reaktionsgemisch. Die Zugabe der zweiten Farbstoffe kann dabei auch erst dann erfolgen, wenn die erhöhte Temperatur erreicht ist. Wenn nötig oder gewünscht, kann dieser dritte Schritt 503 auch benutzt werden, das
Reaktionsgemisch zu verdünnen. In einem vierten Schritt 504 erfolgt dann die Schmelzkurvenanalyse. Diese kann in der üblichen Weise durchgeführt werden. Alternativ kann während der Abkühlung nach der oben beschriebenen Erwärmung bereits eine Messung einer Änderung der Fluoreszenz der zweiten Farbstoffe erfolgen, um damit eine Abkühlkurve zu vermitteln, was einer inversen Schmelzkurvenanalyse entspricht.
Figur 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zur Durchführung einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion, wobei die Vorrichtung 100 beispielsweise zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens 500 gemäß Figur 1 eingerichtet ist. Figur 2a zeigt dabei die Vorrichtung 100 viermal in nachfolgend beschriebenen Zuständen, während Figur 2b die zu diesen Zuständen korrespondierenden Intensitäten 10 der gemessenen Fluoreszenz nach der Zeit 20 in einem Graphen 600 qualitativ darstellt.
Bei der Vorrichtung 100 kann es sich beispielsweise um ein mikrofluidisches System handeln, wobei eine Kartusche 200 des Systems 100 eine
Reaktionskammer 210 für die Durchführung der qPCR umfasst. Nach erfolgter qPCR im ersten Schritt des Verfahrens 501 enthält die Reaktionskammer 210 das Reaktionsgemisch 220 mit den Farbstoffen 221, welche zu einer insgesamt intensiven Fluoreszenz fähig sind. Wie in Figur 2b angedeutet, wird diese Fluoreszenzfähigkeit durch das Photobleaching 502 deutlich reduziert. Wie oben ausgeführt, kann die Dauer und die Intensität der Photobleichung 502 individuell abgestimmt auf die Reaktionsmischung festgelegt werden oder auch während der Photobleichung bis zu einer vorgegebenen Reduktion der
Fluoreszenzintensität dynamisch durchgeführt werden. Bei letzterem
dynamischen Ansatz wird ausgenutzt, dass die Photobleachingkurve ein doppeltes asymptotisches Verhalten aufweist. Wie nämlich in Figur 2b qualitativ dargestellt, umfasst der Graph 600 ein erstes Plateau 601 zeitlich vor der Photobleichung 502 und ein zweiten Plateau 602 zeitlich nach der Bleichung, welche über zwei Pseudoasymptoten den linear sinkenden Bereich der
Photobleichung 502 600 begrenzen. Die Photobleichung 502 kann also beispielsweise beendet werden, wenn die gemessene Fluoreszenzintensität der gebleichten Fluorophores einen vorgegebenen Mindestwert erreicht,
beispielsweise den Wert des zweiten Plateaus 602. Wie oben beschrieben kann der Mindestwert beispielsweise 10% der ursprünglichen Fluoreszenzintensität oder 10% über der Nachweisgrenze betragen. Alternativ kann die
Photobleichung 502 beispielsweise beendet werden, wenn sich die Steigung des Graphen 600, also die Änderung der Fluoreszenzintensität nicht mehr ändert, wie beispielsweise im Bereich des zweiten Plateaus 602.
Nach der Photobleichung 502 kann im dritten Schritt 503 der zweite Farbstoff 222 durch Pumpen in die Reaktionskammer 210 eingebracht werden, beispielsweise über eine Membranpumpe 110 oder eine peristaltische Pumpe 120 der Vorrichtung 100. Wenn die Reaktionskammer 210 zuvor vollständig mit dem Reaktionsgemisch gefüllt war, kann ein kleines Teilvolumen des
Reaktionsgemisches 220 durch den zweiten Farbstoff 222 ersetzt werden. Dabei steigt die mögliche Fluoreszenzintensität wieder an, wie in Figur 2b gezeigt. Der in Figur 2a ganz rechts gezeigte vierte Zustand der Reaktionskammer 210 zeigt eine vollständige Durchmischung des Reaktionsgemischs 220 mit dem zweiten Farbstoff 222. Wie oben beschrieben wird für den Einbau des zweiten Farbstoffs
222 in die doppelsträngige DNA-Abschnitte das Reaktionsgemisch 220 erhitzt, beispielsweise auf eine Temperatur zwischen 90 und 98 °C, was neben dem Aufschmelzen der DNA ein schnelleres Durchmischen des zweiten Farbstoffs bewirkt.
Wie oben beschrieben, kann im vierten Schritt 504 direkt die Abkühlkurve optisch aufgezeichnet werden, anstatt das Gemisch abzukühlen und dann die
Schmelzkurve zu starten, was einer Schmelzkurve in inverser Reihenfolge entspricht und Prozesszeit einspart.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren (500) zum Bestimmen einer Spezifität einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion, wobei das Verfahren (500) eine Durchführung einer Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (501) gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse (504) zum Bestimmen der Spezifität umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass vor Beginn der Schmelzkurvenanalyse (504) Farbstoffe, insbesondere Fluorophore (221), der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion deaktiviert werden.
2. Verfahren (500) nach Anspruch 1, wobei die Deaktivierung (502) der Farbstoffe (221) durch eine Photobleichung (503) erfolgt.
3. Verfahren (500) nach Anspruch 2, wobei die Photobleichung (503) durchgeführt wird, bis eine gemessene Fluoreszenzintensität (10) einen vorgegebenen Schwellwert erreicht.
4. Verfahren (500) nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Photobleichung durchgeführt wird, bis eine Änderung der gemessenen Fluoreszenzintensität (10) einen
vorgegebenen Schwellwert erreicht.
5. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zugabe (503) von zweiten Farbstoffen (222) für die Schmelzkurvenanalyse (504) nach der
Deaktivierung (502) der Farbstoffe (221) erfolgt
6. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vervielfältigte DNA-Abschnitte der Echtzeit- Polymerase- Kettenreaktion (501) für eine Denaturierung der DNA-Abschnitte erhitzt werden und wobei während einer nachfolgenden
Abkühlung der DNA-Abschnitte eine Messung einer Änderung einer
Fluoreszenzintensität (10) von zweiten Farbstoffen (222) der Schmelzkurvenanalyse (504) erfolgt.
7. Mikrofluidische Vorrichtung (100) zur Durchführung einer Echtzeit- Polymerase-
Kettenreaktion (501), wobei die Vorrichtung (100) zur Durchführung eines Verfahrens (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche eingerichtet ist.
PCT/EP2019/069746 2018-08-13 2019-07-23 Verfahren zum bestimmen einer spezifität einer echtzeit-polymerase-kettenreaktion mit einer schmelzkurvenanalyse WO2020035267A1 (de)

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