WO2019229288A1 - Método para la obtención de un extracto con propiedades anti-hipertensivas, anti-hiperlipidémicas y antioxidantes - Google Patents

Método para la obtención de un extracto con propiedades anti-hipertensivas, anti-hiperlipidémicas y antioxidantes Download PDF

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Carlos VERDASCO MARTÍN
Azahara DÍAZ LOZANO
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention falls within the scope of biotechnology and refers to an extract of Artrospira sp. with a peptide base, as well as its procedure of obtaining.
  • the extract is useful for making compositions with antihypertensive, antioxidant, and / or anti-hyperlipidemic activity applicable in the food, cosmetic or pharmaceutical industry.
  • Microalgae are eukaryotic living organisms that have a considerable source of biocomponents of high value for various industrial fields.
  • Cyanobacteria are prokaryotic organisms and, although they do not have the same cellular structure, they share certain functional characteristics and are therefore also known as blue-green algae.
  • Spirulina as an ingredient or dietary supplement is made from cyanobacteria of the genus Arthrospira, especially the species Arthrospira platensis and Arthrospira maxim (formerly known as Spirulina platensis and Spirulina maxim). These filamentous cyanobacteria are considered the major components of phytoplankton present in oceans and marine waters (Setchell & NLGardner.
  • Spirulina is a high protein organism, around 60%, which grown under stress conditions can reach up to 77% of its dry weight (Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 2017, 20 (3): 1- 9; J. of Aquatic Research, 2012, 40 (3): 763-771), and which also presents components of diverse interest such as essential amino acids, minerals, antioxidants, vitamins (in greater proportion vitamin B), essential fatty acids, carbohydrates and sterols, among others. It has also been shown to contain blue pigments in its structure, such as phycocyanin, which contribute to the increase in protein and ferric content in its composition. The consumption of spirulina has beneficial properties for health (antiviral, anti-inflammatory, antimicrobial), in addition to the positive effect on both the animal and human immune system.
  • the structure of the envelope of the Gram (-) bacteria is formed by two complex polymers: peptidoglycans and lipopolysaccharides.
  • Peptidoglycans are formed by disaccharides and tetrapeptides. The latter join together and give rise to a rigid and covalent structure that surrounds the entire cell.
  • lipopolysaccharides are composed of lipid A and a complex polysaccharide chain.
  • the cellular envelope makes it difficult to extract intracellular lipids, stored in the form of subcellular compartments called lipid bodies, lipid drops or oleosomes (Appl. Biochem. Biotechnol. 2011, 164 (7): 1215-1224).
  • peptide extracts with antitumor activity are obtained by treating a two-stage spirulina biomass.
  • spirulina biomass proteins are extracted by means of freeze / thaw cycles and ultrasound application, and in a second stage they are enzymatically hydrolyzed by a multiple enzymatic treatment with the enzymes trypsin, alkaline, papain, and pepsin.
  • the lle-GIn-Pro peptide with antihypertensive activity is described (J. Agrie. Food Chem. 2010; 58: 7166-7171), obtained by a method comprising a first stage in which spirulina is subjected to Freeze / thaw cycles along with ultrasound to break down the cells, and a subsequent stage of enzymatic hydrolysis carried out with the enzyme alcalase.
  • the present invention provides a method for extracting biocomponents from a plant biomass, where said biomass is spirulina, by a step of enzymatic treatment of the biomass with the Alcalase® enzyme to selectively degrade specific components of its cell membrane. Subsequently, it can be completed with a second stage of extraction and recovery of its biocomponents and, optionally, a stage of concentration / purification and drying of the extract. Said method results in obtaining an extract with particular properties, among which an antihypertensive activity is much higher than that obtained in other spirulina enzymatic treatments.
  • the extract of the invention also has a wide range of activities: antioxidant, anti-hyperlipidemic (anti-hypertriglycerolimic and hypocholesterolemic).
  • the extract is very heterogeneous, containing high amounts of amino acids and peptides of low molecular weight together with phenolic compounds, polyphenols and carbohydrates, and it differs from other extracts by its greater antihypertensive activity, in addition to greater antioxidant and anti- activity / property hyperlipidemic (anti-hypertriglyceridemic and anti-hypercholesterolemic).
  • Obtaining an extract with greater effectiveness provides several advantages such as the need for a lower dose to obtain the same effect and the consequent reduction of possible side effects. Therefore, the extract is useful for making compositions with antihypertensive, antioxidant, and / or anti-hyperlipidemic activity applicable in the food, cosmetic or pharmaceutical industry.
  • the present invention describes a method for obtaining an extract of Arthrospira sp., Hereinafter referred to as "method of the invention", characterized in that it comprises the following steps: a) incubating the biomass of Arthrospira sp. in an aqueous solution at a pH between 3 and 14 in the presence of the enzyme Alcalase ® and b) separate the biomass from the solution obtained in step (a) to obtain the extract.
  • Alcalase ® refers to a serine endopeptidase enzyme, in particular, said serine endopeptidase enzyme is the subtilisin enzyme (EC 3.4.21.62.)
  • extract refers to the highly concentrated substance that is obtained from a bacterial biomass, algae, plant, seed or other object by various procedures, of which it retains its properties.
  • Said extract is constituted by components of different nature, characteristic that allows its separation in different phases, for example: oily or organic, aqueous and residual biomass.
  • the genus Arthrospira comprises several species, among which are, without limitation, A. platensis and A. maxima, formerly known as Spirulina platensis and Spirulina maxima.
  • spirulina biomass is composed of the species A. platensis and A. maxim; more preferably of the species A. platensis.
  • A. platensis is a multicellular filamentous cyanobacterium coiled in a levógira helix, which grows naturally in tropical and subtropical lakes in Africa, Asia and South America with high pH and high concentrations of carbonate and bicarbonate; It is cultivated in the US, Asia, Europe and South America.
  • a linear (non-helical) variety of A. platensis has been used. Both dry biomass and a wet biomass concentrate (for example, as obtained by decantation, centrifugation or flocculation of culture tanks) can be used to obtain the aqueous extract.
  • a wet biomass concentrate for example, as obtained by decantation, centrifugation or flocculation of culture tanks
  • the origin of the biomass of Arthrospira sp It can be both the cultivation of cyanobacteria and their extraction or collection of the natural environment.
  • the cultivation of the cioanobacteria Arthrospira sp can be carried out under conditions of gentle agitation of the culture medium, favoring contact with sunlight and photosynthesis reactions. Lighting is an important factor for the growth of spirulina, but it should not be maintained continuously 24 hours a day; An individual spirulina filament cannot withstand prolonged exposure to the sun as it is destroyed by photolysis and hence the need to agitate the crop.
  • the water used to make the culture medium must be clean, or filtered, to remove contaminants.
  • the water used can be fresh water or sea water. Drinking water can also be used but without containing too much chlorine. In case of using seawater, very rich in magnesium, many precautions must be taken and analyzed previously.
  • the culture medium can be obtained by dissolving chemicals in water; Chemicals that include, but are not limited to, sodium bicarbonate, salt, potassium nitrate, dipotassium sulfate, monoammonium phosphate, iron solution and lime.
  • the culture medium also has to contain nutrients for the cyanobacterium, the greatest nutritive element is carbon, which the culture medium spontaneously absorbs from the air in the form of carbon dioxide (C0 2 ) when its pH is greater than 10. As the air contains very little C0 2 absorption it corresponds to maximum productivity (when the pH reaches 11) 4 g of spirulina per day per m 3 of pond. However, it is possible to inject supplemental C0 2 to increase productivity.
  • the preparation of the culture medium for the cultivation of spirulina is widely known in the state of the art and routine practice for the person skilled in the art.
  • the biomass used in this invention is a linear variety of the A. platensis cyanobacterium, cultivated by ASN Leader S.L. with mountain water in the Spanish southeast (Murcia), where daily analytical controls are carried out.
  • This biomass is essentially pure and free of other microalgae or contaminating cyanobacteria.
  • Arthrospira's biomass is A. maxima.
  • the term "enzyme” refers to a protein responsible for catalyzing the biochemical reactions of metabolism, which depending on their catalytic action are classified as: oxidoreductases, transferases, hydrolases, Nasas, isomerases and ligases .
  • the enzyme used is a protease, which is a type of hydrolase, more specifically an alklase (Serine endo-peptidase (mostly subtilisin A), EC 3.4.21.62).
  • the term "enzymatic loading" refers to the percentage of the enzyme in the solution.
  • the enzymatic load in the solution of step (a) can be 0.3-10% v / p (volume of commercial Alcalase ® solution referred to the total weight of spirulina biomass suspension in the enzymatic solution), preferably 0.5-2%, and more preferably 1% v / p.
  • Alcalase ® 2.4 L FG is a commercial preparation of Novozymes, based on a serine endoprotease that hydrolyzes internal peptide bonds. Being a protease (Subtilisin A) the enzyme declared with an activity of 2.4 AU-A / g, this product not being GMO.
  • the method comprises an additional step comprising the addition of an organic solvent. extraction between stages (a) and (b).
  • organic solvent it is hexane, isopropanol or a mixture of both.
  • any of the methods used in the state of the art can be used (separation of the aqueous, organic and residual biomass phases by a first stage of centrifugation or decantation or flocculation, and / or a filtering stage that can be in vacuum or other known methods to separate / remove the fraction of residual biomass that is suspended from the liquid phases, and followed by another stage of separation of the phases in different containers (Maniglia et al. Food Sci & Technol. 2014, 56: 269-277)).
  • each of the extracts can optionally be concentrated or purified by conventional techniques (chromatographic, etc.), and taken to dryness by any of the available and known techniques (lyophilization, rotary evaporator, under air flow or nitrogen, etc.)
  • the extracts can be obtained using the Shóxlet method or by accelerated solvent extraction (Food Chemistry, 2005, 93: 417-423).
  • an additional stage of biomass treatment could also be applied by mechanical disruption techniques, ultrasound, microwave, negative pressure cavitation, electrical pulses, etc., whose effect is the disintegration / separation of cellular components more than its breakdown at the molecular level.
  • organic solvent is understood the chemical agent outside the formulation, that is, the chemical compound that is not necessary in the final formulation but which is introduced during the process of obtaining in order to favor the extraction.
  • organic solvents are the aliens such as hexane or toluene, ketones such as acetone, alcohols such as isopropanol, methanol, or ethanol, esters such as ethyl acetate, and other linear, cyclic or branched hydrocarbons substituted or not , such as chloroform, and xylene, ethers such as dimethyl ether or petroleum ether, ionic liquids, organic acids and bases and amides such as N, N-dimethyl formamide.
  • step (b) of the method after step (b) of the method, successive processes of centrifugation, filtration, and / or decantation are carried out.
  • a step c) may be added for drying the extract by any known method, such as those based on evaporation or lyophilization.
  • the present invention relates to an extract of Arthrospira sp., Hereinafter referred to as "extract of the invention”, obtained by the method described above, that is, the method of the invention.
  • extract of the invention obtained by the method described above, that is, the method of the invention.
  • the term extract has been defined and explained in previous paragraphs of this description.
  • said extract comprises at least one, two, three, four, five, six, seven or eight peptides selected from the list consisting of MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2) , ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) and / or CHLLLSM ( +15.99) (SEQ ID 8).
  • MKKIEAIIRPF SEQ ID NO: 1
  • LPPL SEQ ID NO: 2
  • ALAVGIGSIGPGLGQGQ SEQ ID NO: 3
  • TTAASVIAAAL SEQ ID NO: 4
  • DFPGDDIPIVS SEQ ID NO: 5
  • LELL SEQ ID NO: 6
  • WKLLP SEQ ID NO: 7
  • CHLLLSM +15.99
  • the extract of the invention comprises the peptides SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • composition of the invention comprising the peptides MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) and / or CHLLLSM (+15.99) (SEQ ID 8).
  • composition comprises an excipient and / or a vehicle.
  • excipient and vehicle are defined in the following paragraphs.
  • peptide-based extract from spirulina which has antihypertensive, antioxidant and anti-hyperlipidemic (anti-hypertriglyceridemic and anti-hypercholesterolemic) capacity / activity, which, in a particular embodiment, in addition to the peptides described above, comprises:
  • composition is understood as the substance consisting of a combination of molecules among which the bioactive peptides of interest are found.
  • peptides refers to natural molecules formed by linear chains of amino acids linked by peptide bonds. Amino acids are represented throughout the description and claims through the code of a letter known in the state of the art.
  • antioxidant refers to compounds that mitigate oxidation and which, when ingested, can be beneficial to human health. The most abundant antioxidants in the diet are ascorbic acid or vitamin C, polyphenols, vitamin E, and carotenoids, the first two being water soluble and the last two fat soluble.
  • polyphenol (s) refers to natural molecules that are phenolic compounds with an aromatic ring and one or more hydroxyl groups, and are classified into “flavonoids” and “non-flavonoids.” Flavonoids are polyphenols with 15 carbon atoms and two aromatic rings connected by a three carbon bridge; they can have numerous substituents in their structure, and in nature they are mostly in the form of glycosides and to a lesser extent in the form of aglycones. The most common structures of non-flavonoids are C6-C1 phenolic acids, which naturally occur in the form of complex sugar esters.
  • Polyphenols are secondary metabolites, which both in the form of phenolic (poly) aglycones and their conjugated sugars, exist in plants in concentrations of mM to mM. Both of them they have protective functions, and they are attributed important positive effects in chronic diseases. They modulate the activity of digestive enzymes, or act as antioxidants directly on ROS (reactive oxygen species) present in the lumen, or systemically (in organs, tissues or cells through their previous gastrointestinal absorption and distribution from the blood to such tissues). After their intake, they are transformed into the corresponding metabolites (phase II), and pass into the circulatory system, where their concentration in plasma is of the order nM.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present invention relates to a pharmaceutical, food or cosmetic composition
  • a pharmaceutical, food or cosmetic composition comprising the extract of the invention or the composition of the invention, and optionally, further comprising at least one pharmaceutical, food or cosmetically acceptable excipient or vehicle, respectively.
  • composition refers to a composition, as previously described, administered in solid or liquid form in any pharmaceutical format, such as, without limitation, tablets, capsules, sachets, syrups, sprays, injectables, ointments , creams, lotions, suppositories, vials and ointments.
  • food composition refers to a composition, as previously described, administered as food or formulated food supplement such as, for example, capsules, pills, syrups or beverages, etc. which provides nutrients to the subject who takes it, and can beneficially affect one or more functions of the body. It can be administered in the form of a drink or food, with or without prior elaboration, and can be destined for human or animal feed. Animals include, but are not limited to, pets, farm animals (cattle, sheep, pigs, goats) and farm animals, etc.
  • cosmetic composition refers to a composition, as previously described, administered as creams, ointments, lotions, emulsions, microemulsions, liposomes, sprays, liquids, compact or loose powders, anhydrous bars, gels and oils, masks, soaps, shampoos, or other personal hygiene products and solar cosmetics.
  • excipient refers to a substance that aids in the absorption of the pharmaceutical, food or cosmetic composition of the invention, stabilizes said compositions or aids in their preparation, in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function, for example to isolate it from air and / or moisture.
  • filling function of a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • an essence can be added, such as cinnamon, lemon, orange, tangerine or vanilla essence.
  • the "pharmaceutical, food or cosmetically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical and / or cosmetic sector, used in the preparation of pharmaceutical and / or cosmetic administration forms and includes, but is not limited to , solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle can be an inert substance.
  • the vehicle is preferably at a concentration of 2.5 to 7% v / p with respect to the final composition.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the product of the invention, as well as other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • These vehicles may be known to the person skilled in the art, for example, but not limited to, lysosomes, microcapsules, microcapsules, nanocapsules, sponges, microspheres, microspheres, nanospheres, miliparticles, microparticles and nanoparticles.
  • pharmaceutical, food or cosmetically acceptable refers to the compound to which it makes reference is allowed and evaluated so as not to cause harm to the organisms to which it is administered.
  • the present invention relates to the extract of the invention or the composition of the invention for use as a medicament.
  • medication refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals.
  • Administration should be adjusted to a desirable dose of the composition of the invention and varies depending on the condition and weight of the subject, the severity of the disease, the form of the drug, the route and the period of administration, and may be chosen by the specialist in the art.
  • the present invention relates to the extract of the invention or the composition of the invention for use in the treatment and / or prevention of any of the diseases selected from the list consisting of hypertension, anemia, malnutrition, hyperlipidemia (such as hypertriglycerol, hypercholesterolemia, and mixed hyperlipidemia), obesity and diabetes.
  • diseases selected from the list consisting of hypertension, anemia, malnutrition, hyperlipidemia (such as hypertriglycerol, hypercholesterolemia, and mixed hyperlipidemia), obesity and diabetes.
  • treatment refers to combating the effects caused as a result of the disease or pathological condition of interest in a subject that includes inhibiting the disease or pathological condition, that is, stopping its development; relieving the disease or pathological condition, is that is to say, cause the regression of the disease or the pathological condition or its symptomatology and stabilize the disease or the pathological condition.
  • prevention refers to preventing the onset of the disease, that is, preventing the disease or pathological condition from occurring in a subject, in particular, when said subject is predisposed to the pathological condition, but has not yet diagnosed to have it.
  • the disease that is treated and / or prevents with greater efficacy with respect to other extracts or compositions derived from spirulina is hypertension.
  • hypertension also known as high blood pressure, is a disorder in which blood vessels have persistently high blood pressure, which can damage them.
  • Normal blood pressure in adults is 120 mm Hg (systolic blood pressure) and 80 m Hg (diastolic blood pressure).
  • systolic tension is equal to or greater than 140 mm Hg and / or the diastolic tension is equal to or greater than 90 mm Hg, the blood pressure is considered high.
  • Hyperlipidemia which includes different metabolic disorders that lead to elevated levels of triglycerides and / or cholesterol in the bloodstream. They are classified into hypertriglyceridemias, hypercholesterolemias, and mixed hyperlipemias.
  • Type I hyperlipidemia developed by lipoprotein lipase deficiency, causes an accumulation of chylomicrons (QM) resulting in the increase in plasma triglycerides.
  • QM chylomicrons
  • Hypercholesterolemia which consists in the presence of high levels of cholesterol in the blood or, more specifically, a high concentration of low density cholesterol (LDL), which is a factor that increases the risk of developing heart disease.
  • LDL low density cholesterol
  • the disease is hypercholesterolemia.
  • Anemia is a disease that is characterized by the abnormal decrease in the number or size of the red blood cells that the blood contains or its hemoglobin level.
  • Malnutrition which is that pathological state of varying degrees of seriousness and different clinical manifestations caused by poor assimilation of food by the body.
  • Other parameters used to determine if an individual suffers from central obesity are the absolute waist circumference (the subject suffers from obesity when it is> 102 cm in men [central obesity] and> 88 cm in women) or the waist-hip index (the subject suffers obesity when it is> 0.9 for men and> 0.85 for women).
  • An alternative way to determine obesity is to measure the percentage of body fat (the subject is obese when he has approximately> 25% body fat in a man and approximately> 30% body fat in women).
  • Diabetes preferably gestational diabetes or diabetes Mellitus type 2.
  • Diabetes Mellitus type 2 is characterized by the relative deficit of insulin production and sensitivity in tissues and, therefore, a deficient peripheral glucose utilization.
  • the present invention relates to the extract of the invention or the composition of the invention for use as an antioxidant agent.
  • the present invention relates to the extract of the invention or to the composition of the invention for use as an anti-hypertensive or anti-hyperlipidemic agent.
  • the present invention relates to the extract of the invention or to the composition of the invention for preparing an easily assimilated protein concentrate.
  • FIG. 5 Chromatogram of the HPLC-ELSD gradient analysis of the aqueous biomass extract of A. platensis, obtained with the assistance of the Alcalase ® biocatalyst. Extraction conditions: 1% v / p of Alcalase ® enzyme at pH 6.5 and 30 ° C for 24 hours. The peak identification limit was 7500 ua area. The eluted peaks from 2.39 min were computed, at lower times the solvent is eluted.
  • FIG. 6 Chromatogram of the HPLC-ELSD gradient analysis of the aqueous biomass extract of A. platensis, obtained with the assistance of the Control biocatalyst (without enzyme). Extraction conditions: mili-Q water instead of enzymatic solution buffered, 30 ° C and 24h. The peak identification limit was 7500 ua area. Eluted peaks were counted from 2.39 min. , at lower times the solvent is eluted.
  • FIG. 7 Influence of the pH of the biomass degradation process with Alcalase ® on the recovery of polar spirulina components (variation of the total peak area in the HPLC-ELSD chromatogram of the aqueous extract).
  • FIG. 13 Micrographs taken at 15,000 magnifications.
  • FIG. 14 Micrographs performed at 200,000 magnifications.
  • Figure 15 Total concentration of amino acids extracted in different extractive methods in their respective optimal conditions.
  • the optimal conditions were: pH 6.5, 1% v / p and 30 ° C for Alcalase ® ; pH 6.0, 1% v / p and 30 ° C for Flavourzyme ® ; pH 7.0, 1% v / p and 30 ° C for Ultraflo ® ; pH 6.5, 2% v / p and 40 ° C for Vinoflow ® , pH 6.5, 1% v / p and 30 ° C for Lipozyme ® ; pH 6.5, 1% v / p and 30 ° C for Celluclast ® .
  • the optimal conditions were: pH 6.5, 1% v / p and 30 ° C for Alcalase ® ; pH 6.0, 1% v / p and 30 ° C for Flavourzyme ® ; pH 7.0, 1% v / p and 30 ° C for Ultraflo ® ; pH 6.5, 2% v / p and 40 ° C for Vinoflow ® .
  • milli-Q water was added instead of buffered enzymatic solution, 30 ° C and 24h.
  • the specific biocomposites obtained as products of the enzymatic degradation are specific to the type of enzyme used, and their operating conditions during the treatment of the biomass with the biocatalyst, since they are the result of a specific and selective enzymatic action on cellular components of the biomass, and of the extension of said action according to the operating conditions of the degrading enzymatic process.
  • Example 1
  • Duplicate or triplicate cell disruption of the biomass (4 g) was carried out in a 25 ml reactor where the spirulina was in a concentration of 0.2 g / ml in a 0.1 M buffer. pH value studied was used sodium acetate buffer or sodium phosphate.
  • the biomass concentration value used corresponds to the concentration range in order to have the greatest possible amount of biomass per ml of aqueous solution, which allows a completely dispersed suspension to be formed and in such a way that there are minimal material transfer limitations and to enable contact among those involved in the enzymatic and extractive degradation process.
  • the enzymatic degradation process of the biomass was carried out in an incubator (Stuart SI50) at controlled temperature and magnetic stirring (500 rpm). During the reaction, 0.5 ml aliquots were collected in duplicate to monitor the enzymatic reaction up to 24-48 h.
  • the analyzes of the oily extracts were performed by high pressure liquid chromatography (HPLC), in a Merck-Hitachi Ltd. (Germany and Japan) brand equipment coupled to a Kromasil silica column 5pm, 250x4. 6 mm and with an evaporative light scattering detector (ELSD, Evaporative Light Scattering Detector) from SEDERE model SEDEX 55.
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • ELSD evaporative light scattering detector
  • SEDERE model SEDEX 55 SEDERE model SEDEX 55.
  • the samples were filtered through a nylon filter (15mm x 0.45pm, from V ⁇ nicos SA Analysis, Spain). pl of sample dissolved in chloroform (99% pure HPLC quality), analyzed at a flow of 1.5 ml / min. for 30min.
  • a mobile gradient phase was used where mobile phase A was n-Hexane (HPLC grade 96%) and mobile phase B contained Hexane / lsopropanol / Ethyl acetate (80:10:10). From a ratio of A: B phases of 1: 99, the phase ratio was increased linearly to 98: 2 for 20 minutes. These conditions were maintained for 3 minutes, after which the initial conditions (1: 99) were returned in 1 min, which were maintained socratic for 9 minutes.
  • the analyzes of the aqueous extracts were performed in the same HPLC equipment, coupled to a Kromasil C18 5u column, 250x4.6 mm. 10 pl of a solution of the extract in water (50 mg / ml) was injected and analyzed at a flow of 1.5 ml / min for 83 minutes in gradient using 100% MiliQ Water as phase A and as a phase B a mixture of Acetonitrile: MiliQ Water at 80:20. Socratic conditions of 96% A and 4% B were maintained for five minutes, followed by a linear increase up to 40% of B in 60 min and a linear increase to 95% of B in one minute. The proportions were maintained for seven minutes and the initial conditions were returned in 10 minutes. All analyzes were replicated 2-3 times.
  • aqueous extracts obtained after 24 hours of enzymatic treatment of biomass were studied from lyophilized extracts obtained on a larger scale.
  • the large-scale extractive process was prepared by performing cell disruption of biomass (10 g) in a 250 ml reactor where spirulina was in a concentration of 0.2 g / ml in a 0.1 M buffer.
  • the pH value studied was used sodium acetate buffer or sodium phosphate.
  • the enzymatic degradation process of the biomass was carried out for 24 hours. in an incubator (Stuart SI50) at controlled temperature and magnetic stirring (500 rpm). These samples were extracted by a hexane / isopropanol 3: 2 mixture (v / v).
  • the resulting mixture was kept under magnetic stirring at 500 rpm at room temperature for 10 min, after which it was centrifuged in a refrigerated centrifuge at 10 ° C at 14,000 rpm for 30 min. After the phase separation occurred in this process, the upper phase (oil) was carefully separated. Then, this extractive step was repeated by adding 90 mL of the hexane / isopropanol 3/2 solvent mixture (v / v) to the remaining material in the centrifuge tube (aqueous phase + residual biomass), then repeating the stirring steps, centrifugation and removal of the oil phase.
  • the liquid aqueous phase remaining in the centrifuge tube was filtered on filter paper and transferred to a separatory funnel, leaving the residual biomass at the bottom of the centrifuge tube.
  • the aqueous phase was lyophilized for 4 days.
  • the two volumes obtained from the oil phase were combined and filtered, leading to dryness in a rotary evaporator and finally under a stream of nitrogen.
  • the two dried extracts (aqueous and oily) were stored until use at -70 ° C.
  • the control extract was obtained with the same protocol except that mili-Q water was used instead of the enzyme solution in buffer.
  • the yield by weight of the aqueous extracts was determined from the values of lyophilized dry weight of each aqueous extract in a 4-digit precision balance. For this, the aqueous phases were lyophilized for 4 days and the phases Oils were rotavaporated at 30 ° C to remove the solvent, and subsequently treated for 4 hours under a stream of nitrogen until complete removal of traces of solvent. The weight values of the aqueous extracts obtained were subtracted from the weight value corresponding to their salt content of the buffer and that of the enzyme added in the Alcalase ® solution, the total amount subtracted being less than 1% w / p. The residual biomass was also dried under a stream of nitrogen.
  • LC ESI-MS MS analyzes were performed on an Ultimate 3000 nanoHPLC (Dionex, Sunnyvale, California) coupled to an AmaZon Speed ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
  • the analytical column used was C18 PepMap reverse phase silica base 75 pm c 15 cm, 3 pm particle size and 100 ⁇ pore size (Dionex, Sunnyvale, California).
  • the trap column was a C18 PepMap (Dionex, Sunnyvale, California), 5 pm particle diameter, 100 Pore size, connected in line with the analytical column.
  • the automatic data acquisition allowed to obtain sequentially, the son full of MS spectra (m / z 350-1500), and MS CID spectra of the eight most abundant ions.
  • the complete spectra of MS spectra was 100-1000 m / z.
  • the exclusion dynamics was applied to prevent the same m / z from its isolation for 1 minute after its fragmentation.
  • MS and MS / MS data obtained for individual HPLC fractions were processed with DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
  • MS / MS spectra in the form of generic Mascot files
  • NCBInr National Center for Biotechnology Information, as a protein database for searches. It contains non-identical sequences from GenBank CDS translations, PDB, Swiss-Prot, PIR, and PRF) and containing 68623 protein entries from both, Spirulina and Arthrospira.
  • the total carbohydrate content of lyophilized aqueous extracts was determined by the phenol-sulfuric method (Analytical Chemistry, 1956, 28 (3): 350-356). The extracts were resuspended in milliQ water at a concentration of 0.2 g / l and analyzed in duplicate, the results being expressed as the average value calculated with their standard deviation.
  • ACE inhibitory activity angiotensin I converting enzyme
  • Sentandreu and Toldrá the protocol described by Sentandreu and Toldrá (Nat. Protoc. 2006, 1: 2423-2427).
  • the renin-angiotensin system is the largest system regulator of blood pressure in the human body.
  • ACE transforms the angiotensin I decapeptide into the angiotensin II vasoconstrictor peptide and, in turn, deactivates the bradykinin vasodilator.
  • this enzyme plays an important role in the control of blood pressure.
  • the value of IC 50 concentration of spirulina extract necessary to inhibit 50% of ACE activity
  • IC 50 concentration of spirulina extract necessary to inhibit 50% of ACE activity
  • ACE activity was determined following the generation of fluorescence due to the release of the fluorescent product o-aminobenzoylglycine (Abz-Gly) from the non-fluorescent substrate Abz-Gly-Phe (N02) -Pro.
  • the ACE inhibitory activity of the samples was measured in triplicate. The emitted fluorescence was determined every minute for 30 minutes at emission and excitation wavelengths of 355 and 405 nm, respectively, in a Synergy HT fluorimetric microplate (Biotek, Winooski, VT, USA).
  • the IC50 value is determined by dose-response curves in which the protein concentration range (0-0.8 mg / ml) was distributed along a logarithmic scale and using the adjustment function to a curve of non-linear sigmoidal regression in GraphPad Prism 4.00 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).
  • the activity of the extracts in the inhibition of the activity of the pig pancreatic lipase was carried out based on the method described above by Lee et al., Slightly modified (Biochim Biophys Acta. 1993; 1169: 156-164). Briefly, p-nitrophenyl butyrate (PNPB, from Sigma) was dissolved in acetonitrile giving a stock solution of 13.33 mM concentration, which was stored at -20 ° C. Pork pancreatic lipase was dissolved in Mili-Q water at a final concentration of 15 mg / ml.
  • PNPB p-nitrophenyl butyrate
  • the capacity of the extracts for the inhibition of pancreatic esterase cholesterol was determined using the method described by Pietsch and Gütschow (J. Med. Chem. 2005; 48: 8270-8288)
  • the enzyme plays an essential role in hydrolyzing cholesterol asters of the diet Generally, the hydrolysis of the cholesterol esters takes place in the lumen of the small intestine mediated by the pancreatic cholesterol esterase (CEase), producing cholesterol.
  • the inhibitory capacity of some compounds makes it possible to control the bioavailability of cholesterol from cholesterol esters, and thus limit the absorption of free cholesterol in the bloodstream.
  • the buffer solution contained 100 mM sodium phosphate and 100 mM NaCI, pH 7.0.
  • a fresh stock solution of CEase (0.075 mg / ml) was prepared in the buffer and kept at 0 ° C until use.
  • a stock solution of taurocolic acid (TC, 8.6 mM) was prepared in the buffer solution and kept at 4 ° C until use.
  • the stock solution of PNPB (13.33 mM) was prepared in acetonitrile.
  • the enzyme extracts (75 pg / ml) were incubated at 25 ° C with a mixture containing 5.16 mM taurocholic acid, 0.2 mM PNPB in a 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 mM NaCI a pH 7.0.
  • the reaction was initiated by the addition of porcine pancreatic cholesterol esterase (2.5 pg / ml).
  • the absorbance variation of the mixtures was measured in a UV-vis spectrophotometer at 405 nm.
  • Antioxidant analysis methods are classified into two types: i) those based on a hydrogen atom transfer (HAT) reaction and ii) those based on an electron transfer (ET) reaction.
  • HAT hydrogen atom transfer
  • ET electron transfer
  • the antioxidant and the substrate compete for thermally generated peroxide radicals in the decomposition of azo compounds (eg, ORAC method).
  • ET methods measure the ability of the antioxidant to reduce an oxidant, which changes color when reduced. The color change correlates with the antioxidant concentration of the sample.
  • ET trials are those for the determination of total phenols by Folin-Ciocalteu reagent (FCR) and some for the determination of Trolox equivalence antioxidant capacity (TEAC).
  • FCR is used to quantify the antioxidant reducing capacity and the ORAC method to quantify the ability to sequester peroxide radicals. It is common to find different values for different antioxidant capacity techniques. This is one of the reasons why it is recommended to measure the antioxidant capacity by more than one method and that is why they are expressed in TEAC. For a comprehensive study of antioxidants in a sample, in addition to these commonly accepted tests (ABTS, ORAC and FCR), it is recommended to perform specifically validated tests for it (J Agrie Food Chem. 2005, 53 (6): 1841-56) .
  • TEAC value trolox equivalent t antioxidant capacity
  • concentration mM
  • Trolox concentration of the solution a standard reference (Trolox) with antioxidant capacity equivalent to that of a 1 mM solution of investigated analyte.
  • the results are expressed as TEAC values (mmol trolox / g extract).
  • the anti-radical activity with ABTS was determined in quadruplicate, with the reproducibility of the ABTS method being 5%.
  • hydroxyl radical (OH * ) is a radical generated in the human body, which plays an important role in tissue damage with inflammatory processes of diseases caused by oxidative stress.
  • Biotek Gen5TM was the software used for data analysis. Each 96-well plate was analyzed four times, with four levels of calibration standards and eight repetitions per target or control. The reaction was initiated by the automatic addition of 60 ml of the ABTS radical in the solution or of the AAPH for the ABTS and ORAC tests, respectively. The anti-radical activity with ABTS was determined in a standard way after 10 minutes of reaction. For the ORAC method the values were taken after 180 minutes of reaction.
  • the anti-radical activity with ABTS was determined in quadruplicate and the ORAC assay in triplicate.
  • the reproducibility of some of the samples in ORAC, specifically the control sample, is higher than normal (approx. 10%).
  • the reproducibility of the ABTS method is usually 5%.
  • the Folin-Ciocalteu method (Nature Protocols, 2007; 2 (4): 875-877) was used, which determines the content of polyphenols and other antioxidants. Although aromatic amines, phenols, high levels of sugars and ascorbic acid interfere with the determination, this method reduces the interference of ascorbic acid by 15%.
  • the lyophilized aqueous extracts were resuspended (1 Og / I) in 95% (v / v) methanol / water, and subjected to an ultrasonic bath (20 kHz) for 10 minutes for better dilution in the solution. The results are expressed as the average value of values obtained in two replicas with their standard deviation.
  • the optimization of the spirulina biomass enzyme treatment was carried out by studying the effect of different reaction parameters on the recovery of oily spirulina biocomponents.
  • the study allowed to determine the optimal values of the pH of the medium, temperature and biocatalyst load in the enzymatic reaction for the recovery of hydrophobic biocomponents of spirulina.
  • the spirulina biomass used in the study was a commercial freeze-dried powder preparation for food use supplied by the company ASN Espirulina Leader SL. All solvents used in both extraction and analysis were HPLC quality supplied by Scharlau. Both hexadecane and salts for Preparation of the solutions with purity of more than 99% were supplied by Sigma-Aldrich (Madrid, Spain).
  • Alcalase commercially known as Alcalase ® 2.4 L FG (EC 3.4.21.62)
  • Flavourzyme ® protease endoglycosidase Ultraflo ® Max, and Max exoglucanase Vinoflow ®
  • ® 100L Lipozyme lipase and cellulase Celluclast ® All of them were supplied by Novozymes.
  • the optimal pH values were 6.5 and 6.0, respectively ( Figure 2). These pH values allowed to obtain the maximum values of total peak area with 4 h enzyme treatments. In the case of Ultraflo ® , an optimal pH value of 7.0 was found. In the case of Vinoflow ® , only the optimum pH 6.5 yields the maximum amount of biocomponents extracted with 4h of enzymatic treatment, suggesting that at this pH value the degradation of the biomass is faster. For the Lipozyme ® and Celluclast ® enzymes, the optimal extraction is obtained at pH 6.5.
  • the optimal pH values determined were pH 6 to obtain the oily extract with Flavouzyme ® , pH 6.5 for extraction with Alcalase ® , Vinoflow ® , Lipozyme ® and Celluclast ® , and pH 7.0 for Ultraflo ® . These values are within the range of operating conditions declared by the manufacturer Novozymes Ltd (Denmark) for these enzymatic preparations.
  • values at 4h and 24h indicated that the optimum temperature could be 30-40 ° C for some enzymes.
  • the temperature of 30 ° C was selected as optimal for enzymatic processes with Alcalase ® , Ultraflo ® , Flavourzyme ® , Lipozyme ® and Celluclast ® , and 40 ° C for Vinoflow ® .
  • the biocatalyst load used in the degrading stage is an important parameter of the extractive process, since it affects the biodegradation rate of the biomass prior to the extraction of biocomponents with solvents, and this determines the value of the extractive yield.
  • the optimal value of the enzyme load should be carefully determined. Although the use of a high enzymatic load reduces the time required to achieve the desired degradation of the biomass, this also means increasing the cost of the biocatalyst leaving, and in the case of proteases it can favor self-destruction via autolysis of the biocatalyst.
  • the total area of peaks increases when the duration of the enzymatic treatment is prolonged in the interval 0-24h with all the enzymatic loads studied ( Figure 4). Only in the case of Vinoflow ® with 1% (v / p) of enzyme the reaction slows down after 4h, so that the amount of biocomponents recovered is virtually unchanged. Also, the total product area extracted does not increase with increasing treatment time with Vinoflow ® from 4h to 24h using the highest enzyme load studied (4% v / p Ultraflow ® ). This suggests that excessive enzymatic concentration may favor the subsequent degradation of the extracted products.
  • the optimal values of enzymatic load determined are 1% v / p for all the biocatalysts studied, except for Vinoflow ® (2% v / p).
  • aqueous extracts obtained with both proteases both (endo- and exo-) glucanases, the cellulase and lipases used in this study must contain different biocomponents, as a result of the different types of reactions catalyzed by the different biocatalysts. In all cases, the total sums of area values of the significant peaks were also comparatively analyzed.
  • the following shows the determination of the optimal conditions of the extractive process with Alcalase ® based on pH, temperature, enzymatic load and exposure time to the enzyme on the aqueous extract after solvent extraction.
  • Figure 7 shows the variation of the total area of chromatographic peaks with the pH for extraction with Alcalase ® .
  • the results obtained from the effect of pH in the total area of the significant chromatographic peaks obtained after 4h of enzymatic action are shown in Figure 7A.
  • the highest initial speed (4h) of biocomponent extraction with Alcalase ® is obtained at pH 6.5 ( Figure 7A).
  • pH 6.5 the enzymatic degradation process is the fastest, and consequently the maximum total area value of chromatographic peaks is obtained at this pH for extractions with short enzymatic treatment (4h, Figure 7A).
  • stage a The effect of the temperature of stage a) on the extraction of polar components was studied for 24 h of enzymatic treatment of biomass. The study was carried out at the corresponding optimum pH value of the Alcalase ® enzyme, and an enzymatic load of 1% (v / p) in the range 30-50 ° C.
  • Figure 8 shows the total area values of chromatographic peaks of the corresponding aqueous extracts obtained with Alcalase ® .
  • Figure 8 shows the total area value referred to the total amount of aqueous extract obtained from 1 g of spirulina, calculated considering the total area obtained with the injected amount of extract (see below the determination of extractive yields).
  • the enzyme load value used must be carefully selected. Among other reasons, an optimal biocatalyst load should be identified, so as to reduce the time to complete the desired degradation of the biomass to extract its biocomponents, without excessively increasing the expense in the biocatalyst (J Am Oil Chem Soc, 2009, 86 (12): 1235-1240).
  • the catalyst load used affects the biodegradation rate of the biomass, prior to the solvent extraction stage, and determines the extractive yield at a given time.
  • the aqueous phases of the Alcalase ® and Flavouzyme ® extractions recovered without using these solvents have less weight than their respective control extraction without enzyme. This is due to the extraordinary increase in the weight recovered from the aqueous phase of the control extraction without solvents with respect to the same control extraction using solvents for the recovery of biocomponents. These extractions without the addition of organic solvents also have losses in weight performance due to the same reasons as the other extracts (filtration operations, etc.).
  • Figure 15 shows the total moles of amino acids extracted per g of biomass with each extractive system.
  • the aqueous extract obtained with Alcalase ® has a higher total amino acid content (45% w / w lyophilized extract) than the control extract without enzyme (34% w / w) and those of the other enzymes (13-17%).
  • the extract obtained with the Alcalase® method is particularly rich in Glu, Asp and Leu; highlights the increase in the recovery of moles of Tyr (3.7-10.8 times greater amount than with the other methods).
  • the Alcalase ® method allows to recover up to 7.2 and 10.8 times more moles of Arg and Tyr, respectively, and for the other elements that of Alcalase® is 2, 6-3, 3 times higher than the method of the protease (Flavourzyme ® ).
  • the biocomponents of the different aqueous extracts separated with solvents were analyzed and identified by LC ESI-MS MS in positive ionization mode, by the methodology described in example 1.
  • the conditions for obtaining the extracts were determined as optimal: pH 6.5, 1% v / p and 30 ° C for Alcalase ® , Lipozyme ® and Celluclast ® ; pH 6.0, 1% v / p and 30 ° C for Flavourzyme ® ; pH 7.0, 1% v / p and 30 ° C for Ultraflo ® ; pH 6.5, 2% v / p and 40 ° C for Vinoflow ® ;
  • the enzyme-free control extract was obtained by adding mili-Q water at 30 ° C instead of the 24h buffered enzyme solution.
  • the chromatographic column used resolves by hydrophobic interaction with the products, eluting at higher times those of lower polarity.
  • the control extract there are three peaks that do not appear in the rest of the extracts: two narrow bands at 46 and 63 min. of medium intensity, and a broad and high band at high retention times (66-94 min .; Figure 16).
  • Alcalase ® extract 8 different peptides have been detected from those detected in the rest of the extracts (enzymatic or control). Specifically it has at least 11 families of exclusive peptides, corresponding to different proteins of Arthrospira sp.
  • MKKIEAIIRPF SEQ ID NO: 1
  • LPPL SEQ ID NO: 2
  • ALAVGIGSIGPGLGQGQ SEQ ID NO: 3
  • TTAASVIAAAL SEQ ID NO: 4
  • DFPGDDIPIVS SEQ ID NO: 5
  • Full Elongation factor Tu
  • Short EF-Tu
  • LELL SEQ ID NO: 6
  • WKLLP SEQ ID NO: 7
  • CHLLLSM (+15.99) SEQ ID NO : 8
  • the extract of the invention comprises the peptides SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 Table 2.
  • Alcalase ® (protease) 0.050 ⁇ 0.006 7.3 ⁇ 0.9 7.3
  • Vinoflow ® (exoglucanase) 0.404 ⁇ 0.029 0.7 ⁇ 0.0 0.6
  • Celluclast ® (cellulase) 0.216 ⁇ 0.019 1, 2 ⁇ 0, 1 1, 2
  • Lipozyme ® (lipase) 0.255 ⁇ 0.054 1, 1 ⁇ 0.2 1.0
  • Hyperlipidemia includes different metabolic disorders that lead to hypertriglyceridemia and / or hypercholesterolemia in the bloodstream. In the long term, all this leads to vascular complications (microangiopathy, cardiovascular diseases, cerebrovascular diseases and / or metabolic syndrome).
  • Enzyme yT (AAbs x L / s. G (AAbs x L / s. G A / Acontrol
  • the antioxidant activity of lyophilized extracts was determined by three different methods: by means of the ABTS test, which measures the ability of the antioxidant compounds to sequester a stable radical cation (ABTS ' + ), by means of the ORAC test, in which the hydroxyl radical sequestration (ORAC-Fluorescein) Assay), by analysis of total polyphenols by FCR.
  • the results of the ABTS and ORAC methods are expressed by the TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) value, which is the concentration of the solution the standard reference (Trolox, mM) with antioxidant capacity equivalent to that of a 1 mM solution of investigated analyte .
  • the results are expressed as mmol Trolox per g extract.
  • Table 6 shows that all extracts have antioxidant activity. It is usual to find different values for different antioxidant capacity techniques and that is why they are expressed in TEAC, as in this case. It is one of the reasons why it is recommended to measure the antioxidant capacity by more than one method.
  • the extracts have antioxidant activity
  • the Alcalase ® process allows to extract more antioxidant activity than the control.
  • the ORAC method the extracts of Alcalase ® and Ultraflo ® have higher values of antioxidant activity than the rest.
  • a higher antioxidant activity value is extracted than with the other processes by the ORAC method, this being 4.4 times greater than the amount obtained with the control process, and 1, 6 times greater than with the other protease.
  • the antioxidant capacity extracted with Alcalase ® determined by the ABTS method, proved to be 1.5 times greater than that obtained with the control extraction, and 1.4 times greater than that of Flavourzyme ® .
  • FCT Folin-Ciocalteu
  • the total carbohydrate content of the lyophilized aqueous extracts was determined by the phenol-sulfuric method described in Example 1.
  • the results shown in Table 8 indicate that Flavourzyme ® is the enzyme that allows the greatest amount of carbohydrates to be extracted. From each gram of biomass with this enzyme, 2.1 and 1, 6 times more carbohydrates are extracted than with the control process and with Alcalase ® , respectively. The Alcalase ® extracts 1, 3 times more carbohydrates than the control.
  • Carbohydrates Carbohydrates

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para la obtención de un extracto de Arthrospira platensis caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) incubar la biomasa de Arthrospira platensis en agua o en una solución acuosa tamponada a un pH de 6.5 y a una temperatura de 30°C en presencia de la enzima alcalasa; y b) separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa a) para obtener el extracto. El extracto acuoso así obtenido es un concentrado de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular y polifenoles, entre otros antioxidantes. El extracto tiene múltiples aplicaciones terapéuticas, pudiendo usarse en la prevención y tratamiento de la hipertensión o la hiperlipidemia.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE UN EXTRACTO CON PROPIEDADES ANTI- HIPERTENSIVAS. ANTI-HIPERLIPIDÉMICAS Y ANTIOXIDANTES.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra dentro del ámbito de la biotecnología y se refiere a un extracto de Artrospira sp. con una base peptídica, así como a su procedimiento de obtención. El extracto es útil para elaborar composiciones con actividad antihipertensiva, antioxidante, y/o anti-hiperlipidémica de aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las microalgas son organismos vivos eucariotas que presentan una considerable fuente de biocomponentes de alto valor para diversos campos industriales. Las cianobacterias, por otro lado, son organismos procariotas y, aunque no presentan la misma estructura celular, comparten ciertas características funcionales y por ello también son conocidas como algas verdeazuladas. La espirulina como ingrediente o suplemento dietético es elaborado a base de cianobacterias del género Arthrospira, sobre todo las especies Arthrospira platensis y Arthrospira máxima (antes conocidas como Spirulina platensis y Spirulina máxima). Estas cianobacterias filamentosas se consideran los mayores componentes del fitoplancton presente en océanos y aguas marinas (Setchell & N.L.Gardner. Spirulina máxima, pp 923, Published in: Geitler, L, Cyanophyceae. In: Kryptogamen-Flora von Deutschland, Osterreich und der Schweiz. Ed. 2. Rabenhorst, L. Eds. 1932, 14:673-1196, i-[vi] Leipzig: Akademische Verlagsgesellschaft).
La espirulina es un organismo de alto contenido proteico, en torno al 60%, que cultivada en condiciones de stress puede alcanzar hasta el 77% de su peso seco (Biotechnology, Agronomy, Society and Environment, 2017, 20(3): 1-9; J. of Aquatic Research, 2012, 40(3): 763-771), y que además presenta componentes de interés diverso como aminoácidos esenciales, minerales, antioxidantes, vitaminas (en mayor proporción vitamina B), ácidos grasos esenciales, carbohidratos y esteróles, entre otros. También se ha demostrado que contiene pigmentos azules en su estructura, como la ficocianina, que contribuyen al aumento del contenido proteico y férrico en su composición. El consumo de espirulina tiene propiedades beneficiosas para la salud (antiviral, antiinflamatoria, antimicrobiana), además del efecto positivo en el sistema inmune tanto animal como humano. Diversos estudios han demostrado su inocuidad y seguridad en el consumo y su mínima citotoxicidad, además de no producir toxinas como microcistinas. Por ello, y debido a su seguridad, este microorganismo se clasifica como ingrediente de complementos dietéticos de Clase A por la Farmacopea norteamericana ( United States Pharmacopeia and National Formulary (USP-NF)). No obstante, cada productor debe determinar la posible contaminación de espirulina con ciertas cantidades de otras algas productoras de microcistinas. Por ello, se ha visto la necesidad de establecer estándares que identifiquen las cantidades máximas permisibles de microcistinas en los productos comerciales a base de espirulina. (Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2011 , 51 :593-604).
La estructura de la envoltura de las bacterias Gram (-), como el caso de espirulina, está formada por dos polímeros complejos: peptidoglicanos y lipopolisacáridos. Los peptidoglicanos están formados por disacáridos y tetrapéptidos. Estos últimos se unen entre ellos y da lugar a una estructura rígida y covalente que rodea toda la célula. Por su parte, los lipopolisacáridos se componen de lípido A y de una cadena de polisacárido compleja. La envoltura celular dificulta la extracción de los lípidos intracelulares, almacenados en forma de compartimentos subcelulares denominados cuerpos lipidíeos, gotas lipídicas u oleosomas (Appl. Biochem. Biotechnol. 2011 , 164 (7): 1215-1224). Estos están formados por un núcleo de lípidos neutros rodeado de una monocapa lípidica o membrana envuelta por proteínas (Proteomics 2011 , 11(21): 4266-4273). Una efectiva extracción de lípidos requiere la destrucción de las estructuras celular y subcelular (J. Agrie. Food Chem. 2012, 60(47):11771-11776).
Existen diferentes métodos de extraer los biocomponentes de biomasas vegetales. Los más eficaces incluyen una etapa de disgregación de la biomasa previa a la etapa de recuperación de los biocomponentes. La disgregación de la biomasa aumenta notablemente los rendimientos extractivos, y cuando esta produce la ruptura de la membrana celular permite la recuperación de biocompuestos intracelulares. El tratamiento de la biomasa previo a la extracción de los péptidos de interés tiene gran influencia en el producto obtenido, distintos tratamientos generan distintos extractos con propiedades diferentes. Diferentes extracciones con asistencia enzimática rinden distintos extractos con diferente composición, que es función del tipo de biocatalizador y condiciones del bioproceso. Así, en un estudio realizado por Zhang y Zhang (Biotechnol Prog., 2013, 29(5): 1230-8) se obtienen extractos de péptidos con actividad antitumoral mediante el tratamiento de una biomasa de espirulina en dos etapas. En una primera etapa se extraen proteínas de la biomasa de espirulina mediante ciclos de congelación/descongelación y aplicación de ultrasonidos, y en una segunda etapa estas se hidrolizan enzimáticamente mediante un tratamiento enzimático múltiple con las enzimas tripsina, alcalasa, papaína, y pepsina.
Por otro lado, se describe el péptido lle-GIn-Pro con actividad antihipertensiva (J. Agrie. Food Chem. 2010; 58: 7166-7171), obtenido por un método que comprende una primera etapa en la que la espirulina se somete a ciclos de congelación/descongelación junto con ultrasonidos para romper las células, y una posterior etapa de hidrólisis enzimática llevada a cabo con la enzima alcalasa.
También se encuentra descrita la obtención de péptidos con actividad antioxidante a partir de espirulina (J. Microbiol Biotechnol. 2016; 26(7): 1216-23). En este estudio se lleva a cabo la hidrólisis de la cianobacteria con la enzima proteasa K y la posterior extracción de los péptidos mediante ultracentrifugación y cromatografía en gel.
Además, es conocido el efecto anticolesterolémico de la espirulina (J. Nutr. Sci. Vitaminol 2010; 56(1): 34-40) y más concretamente de la molécula entera de C- ficocianina obtenida a partir de dicha cianobacteria (J. Nutr. 2005 Oct;135(10): 2425- 30).
Si bien la espirulina es muy rica en proteínas, su asimilación no es siempre buena. La asimilación de algunos péptidos y biocomponentes de la espirulina, se ve afectada por su mayor o menor capacidad de degradación en el organismo. Así, la obtención de extractos a base de péptidos y aminoácidos resultantes de la degradación de la biomasa, particularmente mediante un tratamiento enzimático previo a su recuperación por extracción con disolventes, ha de suponer un gran avance en el diseño de procesos de obtención de extractos ricos en metabolitos altamente asimilables y de alta funcionalidad biológica.
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de seguir desarrollando extractos con nuevos componentes bioactivos generados a partir de degradaciones específicas y selectivas de la biomasa de espirulina, así como métodos de extracción de estos, analizando la posibilidad de obtención de rendimientos extractivos mayores que los métodos actualmente disponibles.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para extraer biocomponentes de una biomasa vegetal, donde dicha biomasa es de espirulina, mediante una etapa de tratamiento enzimático de la biomasa con la enzima Alcalase® para degradar selectivamente componentes específicos de su membrana celular. Posteriormente, puede completarse con una segunda etapa de extracción y recuperación de sus biocomponentes y, opcionalmente, una etapa de concentración/purificación y secado del extracto. Dicho método da lugar a la obtención de un extracto con unas propiedades particulares, entre las que destaca una actividad antihipertensiva mucho más elevada que la obtenida en otros tratamientos enzimáticos de espirulina. Además, el extracto de la invención presenta también un amplio abanico de actividades: antioxidante, anti-hiperlipidémica (anti-hipertriglicerolémica e hipocolesterolémica).
El extracto es muy heterogéneo, conteniendo elevadas cantidades de aminoácidos y péptidos de bajo peso molecular junto con compuestos fenólicos, polifenoles e hidratos de carbono, y se diferencia de otros extractos por su mayor actividad antihipertensiva, además de mayor actividad/propiedad antioxidante y anti-hiperlipidémica (anti- hipertrigliceridémica y anti-hipercolesterolémica). La obtención de un extracto con una mayor efectividad proporciona diversas ventajas como la necesidad de una dosis menor para la obtención del mismo efecto y la consecuente disminución de posibles efectos secundarios. Por tanto, el extracto es útil para elaborar composiciones con actividad antihipertensiva, antioxidante, y/o anti-hiperlipidémica de aplicación en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica.
En un primer aspecto, la presente invención describe un método para la obtención de un extracto de Arthrospira sp., de aquí en adelante denominado “método de la invención”, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) incubar la biomasa de Arthrospira sp. en una disolución acuosa a un pH de entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase® y b) separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa (a) para obtener el extracto.
En en la presente invención el término Alcalase® se refiere a una enzima serina endopeptidase, en particular, dicha enzima serina endopeptidasa es la enzima subtilisina (EC 3.4.21.62.)
El término“extracto” hace referencia a la sustancia muy concentrada que se obtiene de una biomasa bacteriana, alga, planta, semilla u otro objeto por diversos procedimientos, del cual conserva sus propiedades. Dicho extracto está constituido por componentes de distinta naturaleza, característica que permite su separación en distintas fases, por ejemplo: oleosa u orgánica, acuosa y biomasa residual.
El género Arthrospira comprende varias especies, entre las que se encuentran, sin limitar a, A. platensis y A. maxima, antes conocidas como Spirulina platensis y Spirulina maxima. En una realización particular, la biomasa de espirulina está compuesta de la especie A. platensis y A. máxima ; más preferentemente de la especie A. platensis. A. platensis es una cianobacteria filamentosa pluricelular enrollada en hélice levógira, que crece de forma natural en lagos tropicales y subtropicales de África, Asia y Sudamérica con pH elevado y altas concentraciones de carbonato y bicarbonato; es cultivada en EEUU, Asia, Europa y Sudamérica. En el contexto de la presente invención, se ha utilizado una variedad lineal (no helicoidal) de A. platensis. Se puede partir tanto de biomasa seca como de un concentrado de biomasa húmeda (por ejemplo, según se obtiene por decantación, centrifugación o floculación de los tanques de cultivo) para la obtención del extracto acuoso. Además, el origen de la biomasa de Arthrospira sp. puede ser tanto el cultivo de las cianobacterias como su extracción o recolección del medio natural.
El cultivo de la cioanobacteria Arthrospira sp. puede llevarse a cabo en condiciones de agitación suave del medio del cultivo, favoreciendo el contacto con la luz solar y las reacciones de fotosíntesis. La iluminación es un factor importante para el crecimiento de la espirulina, pero no debe ser mantenida de forma continua durante las 24 horas del día; un filamento individual de espirulina no puede soportar una exposición prolongada al sol ya que es destruido por fotolisis y de ahí la necesidad de agitar el cultivo. El agua utilizada para hacer el medio de cultivo debe estar limpia, o filtrada, para eliminar los contaminantes. El agua empleada puede ser agua dulce o agua de mar. También puede emplearse agua potable pero sin que contenga demasiada cantidad de cloro. En caso de emplearse agua de mar, muy rica en magnesio, deben tomarse muchas precauciones y ser analizada previamente. El medio de cultivo puede obtenerse disolviendo productos químicos en agua; productos químicos que incluyen, sin limitarse a, bicarbonato de sodio, sal, nitrato potásico, sulfato dipotásico, fosfato monoamónico, solución de hierro y cal. El medio de cultivo también tiene que contender nutrientes para la cianobacteria, el mayor elemento nutritivo es el carbono, que el medio de cultivo absorbe espontáneamente del aire bajo la forma de anhídrido carbónico (C02) cuando su pH es mayor de 10. Como el aire contiene muy poco C02, la absorción de éste corresponde a una productividad máxima (cuando el pH llega a 11) de 4 g de espirulina por día y por m3 de estanque. No obstante, es posible inyectar C02 suplementario para aumentar la productividad. En caso necesario, el azúcar puede reemplazar al C02 como fuente de carbono (0.5 kg de azúcar = 1 kg de C02). La preparación del medio de cultivo para el cultivo de espirulina es ampliamente conocido en el estado de la técnica y práctica de rutina para el experto en la materia.
En una realización particular, la biomasa utilizada en esta invención es una variedad lineal de la cianobacteria A. platensis, cultivada por ASN Leader S.L. con agua de la montaña en el sureste español (Murcia), donde se realizan controles diarios analíticos. Esta biomasa es esencialmente pura y libre de otras microalgas o cianobacterias contaminantes. En otra realización particular, la biomasa de Arthrospira es A. maxima.
Una vez que se tiene la cantidad deseada de biomasa de Arthrospira sp., se procede a añadir la enzima Alcalase®. Así, en una primera etapa [etapa (a)], el método de la invención comprende incubar la biomasa de Arthrospira sp. en una disolución acuosa a un pH entre 3 y 14 en presencia de la enzima Alcalase®, preferiblemente a un pH de entre 4,5 y 8,5. En otra realización más preferida tanto para la extracción óptima de biocomponentes hidrofílicos como para la de los hidrofóbicos, la suspensión enzima- biomasa se encuentra a un pH de 6,5.
La incubación de la biomasa junto con la enzima puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. No obstante, en una realización preferida del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 5-80°C, preferiblemente de entre 25-50°C. En una realización más preferida la temperatura es de 30°C.
En el contexto de la presente invención, el término“enzima” se refiere a una proteína encargada de catalizar las reacciones bioquímicas del metabolismo, las cuales en función de su acción catalítica se clasifican en: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, Nasas, isomerasas y ligasas. En la presente invención la enzima utilizada es una proteasa, que es un tipo de hidrolasa, más concretamente una alcalasa (Serina endo-peptidasa (mayormente subtilisina A), EC 3.4.21.62).
Para expresar la cantidad de enzima que se puede usar en el método de la invención, se emplea el término “carga enzimática” que hace referencia al porcentaje de la enzima en la solución. Así, la carga enzimática en la disolución de la etapa (a) puede ser 0,3-10% v/p (volumen de solución de Alcalase® comercial referido al peso total de suspensión de biomasa de espirulina en la solución enzimática), preferentemente de 0,5-2%, y más preferentemente de 1 % v/p. Alcalase® 2.4 L FG es una preparación comercial de la empresa Novozymes, a base de una serina endoproteasa que hidroliza enlaces peptídicos internos. Siendo una proteasa (Subtilisina A) la enzima declarada con una actividad de 2,4 AU-A/g, no siendo este producto OMG.
Una vez que ha pasado el tiempo suficiente de incubación de la biomasa junto con la enzima (para extraer el mayor número y cantidad de biocomponentes hidrofílicos e hidrofóbicos a sus respectivas fases, tal y como se identifica por ejemplo mediante análisis de cromatografía de líquidos (HPLC)), se procede a separar la biomasa residual de la solución obtenida en la etapa (a) obteniendo el extracto de Arthrospira sp. [etapa b) del método de la invención]. En una realización particular, el extracto obtenido comprende la fase acuosa o la fase oleosa de la solución obtenida en la etapa (a). Para retirar los compuestos menos polares presentes en las partes de la biomasa, principalmente lípidos, fosfolípidos, esteroides, vitaminas y pigmentos liposolubles o productos de degradación de éstos, y otros biocomponentes liposolubles, se procede a separarlos mediante adición de diferentes disolventes orgánicos, realizándose el correspondiente reparto de los biocomponentes hidrosolubles de los liposolubles en las diferentes fases formadas en el procedimiento de extracción. Así, en una realización particular del método de la invención, el método comprende una etapa adicional que comprende la adición de un disolvente orgánico de extracción entre las etapas (a) y (b). En otra realización más particular, en disolvente orgánico es hexano, isopropanol o una mezcla de ambos.
En el caso de no interesar el extracto oleoso correspondiente, es posible obviar la adición de los disolventes orgánicos tras el tratamiento enzimático, en cuyo caso únicamente se utiliza una solución acuosa para extraer biocomponentes polares a la fase acuosa, separándolos de una pequeña fase oleosa y de la biomasa residual. Para ello, puede usarse cualquiera de los métodos empleados en el estado de la técnica (separación de las fases acuosa, orgánica y biomasa residual por una primera etapa de centrifugación o decantación o floculación, y/o una etapa de filtrado que puede ser a vacío u otros métodos conocidos para separar/retirar la fracción de biomasa residual que quede en suspensión de las fases líquidas, y seguida de otra etapa de separación propia de las fases en distintos recipientes (Maniglia et al. Food Sci & Technol. 2014, 56:269-277)).
A continuación, cada uno de los extractos (acuoso y oleoso) pueden opcionalmente concentrarse o purificarse mediante técnicas convencionales (cromatográficas, etc), y llevarse a sequedad por cualquiera de las técnicas disponibles y conocidas (liofilización, en rotavapor, bajo corriente de aire o nitrógeno, etc). Tras el tratamiento enzimático de la biomasa, los extractos pueden obtenerse usando el método Shóxlet o mediante una extracción acelerada de disolventes (Food Chemistry, 2005, 93: 417- 423). Anterior o posteriormente a la etapa enzimática, podría aplicarse también una etapa adicional de tratamiento de la biomasa por técnicas disrupción mecánica, ultrasonidos, microondas, cavitación por presión negativa, pulsos eléctricos, etc., cuyo efecto es de disgregración/separación de los componentes celulares más que de su ruptura a nivel molecular. Esta última disgregación, por tanto, facilita la recuperación/extracción de biocomponentes intracelulares, pero no su transformación en productos de degradación molecular (ej., péptidos de bajo peso molecular). Una vez degradada la biomasa, para la recuperación de biocomponentes puede usarse destilación Soxhlet, autoclavado, shock osmótico, etc, y pueden usarse solventes tradicionales o solventes“verdes” como fuídos supercríticos, agua subcrítica, líquidos iónicos, etc). (Food Sci. and Technol. 2014, 56: 269-277). En una realización particular, el método comprende añadir a la disolución obtenida en la etapa (a) al menos un disolvente orgánico. Se entiende por "disolvente orgánico" al agente químico ajeno a formulación, es decir, al compuesto químico que no es necesario en la formulación final pero que se introduce durante el proceso de obtención con el fin de favorecer la extracción. Entre los disolventes orgánicos se encuentran los aléanos como el hexano o el tolueno, cetonas como la acetona, alcoholes como el isopropanol, el metanol, o el etanol, esteres como el acetato de etilo, y otros hidrocarburos lineales, cíclicos o ramificados sustituidos o no, como el cloroformo, y el xileno, éteres como el dimetil éter o el éter de petróleo, líquidos iónicos, ácidos y bases orgánicas y amidas como la N,N-dimetil formamida. En otra realización preferida el disolvente orgánico es hexano, isopropanol o cualquiera de sus combinaciones. En particular, una mezcla 3:2 (v/v) de n- hexano/iso-propanol. Otros métodos pueden diferir en el tipo, número y proporciones relativas de disolventes utilizados, sean o no miscibles entre sí, y pudiendo ser solo agua pura o con diversos solutos: sales, buffer, etc, si solo interesa extraer componentes hidrofílicos.
En otra realización particular del método de la invención, tras la etapa (b) del método se lleva a cabo procesos sucesivos de centrifugación, filtrado, y/o decantación. Opcionalmente puede añadirse una etapa c) para el secado del extracto por cualquier método conocido, como los basados en evaporación o liofilización.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un extracto de Arthrospira sp., de aquí en adelante denominado“extracto de la invención”, obtenido mediante el método descrito anteriormente, es decir, el método de la invención. El término extracto ha sido definido y explicado en párrafos anteriores de la presente descripción.
En otra realización preferida, dicho extracto comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho péptidos seleccionados de la lista que consiste en MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y/o CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID 8). En una realización todavía más particular, el extracto de la invención comprende los péptidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
Por otro lado, la presente invención también se refiere a una composición, de aquí en adelante“composición de la invención”, que comprende los péptidos MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y/o CHLLLSM (+15.99) (SEQ ID 8). En una realización particular, dicha composición comprende un excipiente y/o un vehículo. Los términos excipiente y vehículo están definidos en los párrafos siguientes.
Se trata de un extracto de base peptídica procedente de espirulina, que presenta capacidad/actividad antihipertensiva, antioxidante y anti-hiperlipidémica (anti- hipertrigliceridémica y anti-hipercolesterolémica) que, en una realización particular, además de los péptidos descritos anteriormente, comprende:
a) un contenido mínimo en polifenoles totales de 12 mg/g de extracto,
b) un contenido mínimo de carbohidratos totales de 226 mg /g de extracto, y/o c) cantidades significativas de todos los aminoácidos incluidos los esenciales, con un contenido mínimo del 45% p/p de aminoácidos totales
En la presente invención se entiende por“composición” a la sustancia constituida por una combinación de moléculas entre las que se encuentran los péptidos bioactivos de interés. El término“péptidos” hace referencia a moléculas naturales formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Los aminoácidos se representan a lo largo de la descripción y las reivindicaciones a través del código de una letra conocido en el estado del arte. El término“antioxidante” hace referencia a compuestos que mitigan la oxidación y que, al ser ingeridos, pueden ser beneficiosos para la salud humana. Los antioxidantes que más abundan en la dieta son el ácido ascórbico o vitamina C, los polifenoles, la vitamina E, y los carotenoides, siendo los dos primeros hidrosolubles y los dos últimos liposolubles. El término “polifenol(es)” hace referencia a moléculas naturales que son compuestos fenólicos con un anillo aromático y uno o varios grupos hidroxilo, y se clasifican en“flavonoides” y“no flavonoides”. Los flavonoides son polifenoles con 15 átomos de carbono y dos anillos aromáticos conectados por un puente de tres carbonos; pueden tener numerosos sustituyentes en su estructura, y en la naturaleza están mayormente en forma de glicósidos y en menor proporción en forma de agliconas. Las estructuras más comunes de no flavonoides son C6-C1 ácidos fenólicos, que en la naturaleza se presentan en forma de complejos esteres de azúcares. Los polifenoles son metabolitos secundarios, que tanto en forma de agliconas (poly)fenólicas como sus azúcares conjugados, existen en las plantas en concentraciones de mM hasta mM. Ambos tienen funciones protectoras, y se les atribuyen importantes efectos positivos en enfermedades crónicas. Modulan la actividad de enzimas digestivas, o actúan como antioxidantes en forma directa sobre ROS (reactive oxigen species) presentes en el lumen, o bien en forma sistémica (en órganos, tejidos o células a través de su previa absorción gastrointestinal y distribución desde la sangre a tales tejidos). Tras su ingesta, se transforman en los correspondientes metabolitos (fase II), y pasan al sistema circulatorio, donde su concentración en plasma es del orden nM. En el colon son degradados por la microbiota local, dando pequeños ácidos fenólicos y catabolitos aromáticos que se absorben en el sistema circulatorio. La forma conjugada de los polifenoles es más polar (hidrosoluble) y menos absorbible (y biodisponible). En el intestino grueso, las bacterias del colon metabolizan los flavonoides, hidrolizando sus enlaces glucosídicos y favoreciendo así su absorción. Dietas ricas en polifenoles favorecen la proliferación de microbios beneficiosos e inhiben la de organismos patógenos.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, alimentaria o cosmética que comprende el extracto de la invención o la composición de la invención, y opcionalmente, comprende además al menos un excipiente o vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable, respectivamente.
El término “composición farmacéutica” se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada en forma de sólida o líquida en cualquier formato farmacéutico, tales como, sin limitar a, comprimidos, cápsulas, bolsitas, jarabes, sprays, inyectables, pomadas, cremas, lociones, supositorios, viales y ungüentos.
Por otro lado "composición alimentaria" se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada como alimento o suplemento alimentario formulado como, por ejemplo, cápsulas, pastillas, jarabes o bebidas, etc. que aporta nutrientes al sujeto que lo toma, y puede afectar beneficiosamente a una o varias funciones del organismo. Puede ser administrada en forma de bebida o comida, con o sin elaboración previa, y puede ser destinada para alimentación humana o animal. Entre los animales se incluyen, sin limitar a, mascotas, animales de granja (ganado bobino, ovino, porcino, caprino) y animales de cultivos piscícolas, etc. El término "composición cosmética” se refiere a una composición, como se ha descrito previamente, administrada como cremas, pomadas, lociones, emulsiones, microemulsiones, liposomas, sprays, líquidos, polvos compactos o sueltos, barras anhidras, geles y aceites, mascarillas, jabones, champús, u otros productos de higiene personal y cosméticos solares.
El término "excipiente" se refiere a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica, alimentaria o cosmética de la invención, estabiliza dichas composiciones o ayuda a su preparación, en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento, como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Para que la composición de la invención tenga un sabor agradable se puede añadir una esencia, como por ejemplo esencia de canela, limón, naranja, mandarina o vainilla.
El “vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable” se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico y/o cosmético, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas y/o cosméticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte. El vehículo se encuentra, preferiblemente, a una concentración del 2,5 al 7% v/p con respecto a la composición final. La función del vehículo es facilitar la incorporación del producto de la invención, así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. Estos vehículos pueden ser conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, pero sin limitar a, lisosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, miliesferas, microesferas, nanoesferas, milipartículas, micropartículas y nanopartículas. El término "farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o de la composición de la invención para su uso como medicamento. El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. La administración debe ajustarse a una dosis deseable de la composición de la invención y varía dependiendo de la condición y del peso del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la forma del fármaco, de la ruta y del periodo de administración, y puede ser elegida por el especialista en la técnica.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o la composición de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de cualquiera de las enfermedades seleccionadas de la lista que consiste en hipertensión, anemia, desnutrición, hiperlipidemia (tales como hipertriglicerolemia, hipercolesterolemia, e hiperlipidemia mixta), obesidad y diabetes.
El término "tratamiento” se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto que incluye inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología y estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
El término "prevención" se refiere a evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto, en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.
En la presente invención, la enfermedad que se trata y/o previene con una mayor eficacia respecto a otros extractos o composiciones derivados de espirulina es la hipertensión. El término“hipertensión” también conocida como tensión arterial alta, es un trastorno en el que los vasos sanguíneos tienen una tensión persistentemente alta, lo que puede dañarlos. La tensión arterial normal en adultos es de 120 mm Hg (tensión sistólica) y de 80 m Hg (tensión diastólica). Cuando la tensión sistólica es igual o superior a 140 mm Hg y/o la tensión diastólica es igual o superior a 90 mm Hg, la tensión arterial se considera alta.
Además de la hipertensión, otras enfermedades que pueden ser prevenidas y/o tratadas por el extracto acuoso o la composición de la invención:
La hiperlipidemia, que incluye diferentes desórdenes metabólicos que conducen a niveles elevados de triglicéridos y/o colesterol en el torrente sanguíneo. Se clasifican en hipertrigliceridemias, hipercolesterolemias, e hiperlipemias mixtas.
• la hiperlipidemia tipo I, desarrollada por la deficiencia de lipoproteína lipasa, provoca una acumulación de quilomicrones (QM) el consiguiente aumento de los triglicéridos plasmáticos.
• La hipercolesterolemia, que consiste en la presencia de niveles elevados de colesterol en la sangre o, más concretamente, una elevada concentración de colesterol de baja densidad (LDL), que es un factor que aumenta el riesgo de desarrollo de enfermedades cardiacas. En una realización preferida, la enfermedad es hipercolesterolemia.
• Las hiperlipemias mixtas en las que aumentan tanto el colesterol como los triglicéridos.
La anemia es una enfermedad que se caracteriza por la disminución anormal del número o tamaño de los glóbulos rojos que contiene la sangre o de su nivel de hemoglobina.
La desnutrición, que es ese estado patológico de distintos grados de seriedad y de distintas manifestaciones clínicas causado por la asimilación deficiente de alimentos por el organismo.
El sobrepeso, que se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) igual o superior a 25. El IMC es una medida de asociación entre el peso y la talla de un individuo. El IMC tiene la siguiente fórmula para su cálculo: Masa (Kg) / estatura2 (m). El sobrepeso se caracteriza por un IMC de entre ³ 25 a < 30. La obesidad, que se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un IMC es igual o mayor de 30. La obesidad se clasifica en diferentes niveles, considerando que sujetos con IMC > 40 padecen de obesidad mórbida. Otros parámetros utilizados para determinar si un individuo padece obesidad central son la circunferencia de cintura absoluta (el sujeto padece obesidad cuando es >102 cm en hombres [obesidad central] y >88 cm en mujeres) o el índice cintura-cadera (el sujeto padece obesidad cuando es >0,9 para hombres y >0,85 para mujeres). Una vía alternativa para determinar la obesidad es medir el porcentaje de grasa corporal (el sujeto padece obesidad cuando tiene aproximadamente >25% de grasa corporal en un hombre y aproximadamente >30% de grasa corporal en la mujer).
Diabetes, preferentemente diabetes gestacional o diabetes Mellitus tipo 2. La diabetes Mellitus tipo 2 se caracteriza por el déficit relativo de la producción y sensibilidad a la insulina en los tejidos y, por tanto, una deficiente utilización periférica de glucosa.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o la composición de la invención para su uso como un agente antioxidante.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o a la composición de la invención para su uso como un agente anti-hipertensivo o anti- hiperlipidemico.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere al extracto de la invención o a la composición de la invención para preparar un concentrado proteico de fácil asimilación.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto oleoso de biomasa de A. platensis obtenido con asistencia del biocatalizador Alcalase®. Condiciones de extracción: 1 % v/p de enzima Alcalase® a pH 6,5 y 30°C durante 24h. Se computaron los picos eluídos a partir de 3 min., a tiempos inferiores se eluye el disolvente. El estándar interno (hexadecano) eluye a 9 min.
Figura 2. Influencia del pH de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido utilizando 1 % v/p de enzima, a 40°C durante 4h. U. A., unidades arbitrarias: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC- ELSD.
Figura 3. Influencia de la temperatura de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: pH 6,5 y 1 % (v/p) de carga enzimática durante el tratamiento enzimático de 4 ó 24h.
Figura 4. Influencia de la carga enzimática (v/p) de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto oleoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD, a pH 6,5 y 30°C, y a diferentes tiempos de tratamiento enzimático (0-24h). El ensayo control (0% carga enzimática) se realizó con idéntico protocolo, pero usando agua milli-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.
Figura 5. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto acuoso de biomasa de A. platensis, obtenido con asistencia del biocatalizador Alcalase®. Condiciones de extracción: 1% v/p de enzima Alcalase® a pH 6,5 y 30°C durante 24h. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. Se computaron los picos eluídos a partir de 2,39 min, a tiempos inferiores se eluye el disolvente.
Figura 6. Cromatograma del análisis en gradiente por HPLC-ELSD del extracto acuoso de biomasa de A. platensis, obtenido con asistencia del biocatalizador Control (sin enzima). Condiciones de extracción: agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. Se computaron los picos eluídos a partir de 2,39 min. , a tiempos inferiores se eluye el disolvente.
Figura 7. Influencia del pH del proceso de degradación de la biomasa con Alcalase® en la recuperación de componentes polares de espirulina (variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD del extracto acuoso). A) Efecto del pH a las 4 h del tratamiento enzimático. B) Cinética de la extracción al valor óptimo de pH 6,5. Otras condiciones: 1 % (v/p) carga enzimática y 40°C. u. a. Unidades arbitrarias de área.
Figura 8. Influencia de la temperatura de la etapa de degradación enzimática de la biomasa con Alcalase® en el extracto acuoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: 1% v/p de Alcalase® a pH 6,5 durante 24h (variación del área total de picos).
Figura 9. Influencia de la carga enzimática de la etapa de degradación de la biomasa con Alcalase® en el extracto acuoso obtenido: variación del área total de picos en el cromatograma de HPLC-ELSD. Condiciones: pH 6,5 y 30°C durante 24h. La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo extractivo, pero usando agua milli-Q en lugar de la disolución enzimática tamponada a 30°C.
Figura 10. Evolución del área de los diferentes picos cromatográficos del extracto acuoso obtenido con Alcalase® en condiciones óptimas de extracción. Condiciones: pH= 6.5, 30°C y 1 % (v/p) biocatalizador. A) tiempo de retención (Tr) = 3-5min.; B) Tr = 5,5min.; C) Tr = 11-14min.; D) Tr = 20-22min.; E) Tr = 28min.: F) Tr = 68min. El límite de identificación de picos fue de 7500 u.a. de área. La identificación y seguimiento en el tiempo de los dos primeros picos (Tr= 3-5,5 min) se realizó con un volumen de inyección de 5 pl de muestra, mientras que el resto de picos se identificaron con inyecciones de 20 pl de muestra.
Figura 11. Estudio comparativo de los extractos oleosos (enzimáticos y control) obtenidos en sus respectivas condiciones óptimas. Variación del área total de picos en los análisis de HPLC-ELSD ponderado por su correspondiente rendimiento, es decir área equivalente extraída por cada gramo de biomasa inicial de espirulina. Condiciones: 24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas (pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®). La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo, pero usando agua milli-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.
Figura 12. Estudio comparativo de los extractos acuosos (enzimáticos y control) obtenidos en sus respectivas condiciones óptimas. Variación del área total de picos en los análisis de HPLC-ELSD ponderado por su correspondiente rendimiento, es decir área equivalente extraída por cada por gramo de biomasa inicial de espirulina. Condiciones: 24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas (pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Lipozyme®; pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Celluclast®). La extracción control (0% carga enzimática) se realizó con el mismo protocolo, pero usando agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada a 30°C.
Figura 13. Micrografías realizadas a 15.000 aumentos. A) Biomasa de A. platensis comercial seca no tratada con enzima ni extraída; B) biomasa extraída con Alcalase® en las condiciones óptimas determinadas para este proceso extractivo (pH 6,5, 1 % v/p Alcalase® y 30°C durante 24h).
Figura 14. Micrografías realizadas a 200.000 aumentos. A) Biomasa comercial seca no tratada con enzima ni extraída; B) extraída con Alcalase® en las condiciones óptimas determinadas para este proceso extractivo (pH 6,5, 1 % v/p Alcalase® y 30°C durante 24h).
Figura 15. Concentración total de aminoácidos extraídos en diferentes métodos extractivos en sus respectivas condiciones óptimas. Las condiciones óptimas fueron: pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®, pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Lipozyme®; pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Celluclast®. Al extracto control se le añadió agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h. El método control es igual que los enzimáticos, pero usando agua milli-Q en vez de solución enzimática tamponada. Figura 16. Cromatogramas de los extractos acuosos de biomasa de A. platensis obtenidos con diferentes procesos enzimáticos en sus respectivas condiciones óptimas y sin enzima (control), analizados por LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva. Las condiciones óptimas fueron: pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®. Al extracto control se le añadió agua mili-Q en lugar de solución enzimática tamponada, 30°C y 24h.
EJEMPLOS
La invención se basa en una etapa enzimática específica, en la que el biocatalizador actúa para degradar específica- y selectivamente la biomasa. La degradación enzimática de la biomasa permite recuperar y extraer mayor cantidad de biocomponentes intracelulares y diferentes productos de degradación según el biocatalizador/bioproceso empleado. Los componentes extraídos son tanto acuosos como oleosos (o hidrofílicos e hidrofóbicos). La cantidad y composición de ambos extractos son consecuencia tanto de la elección del biocatalizador como del efecto de las variaciones de los valores de los parámetros que influyen en la etapa de degradación de la biomasa. Esta etapa enzimática previa a la recuperación de biocomponentes acuosos y oleosos de espirulina, facilita su extracción maximizándose los rendimientos extractivos para valores óptimos de dichos parámetros. Por otra parte, independientemente de los rendimientos de material extraído, los biocompuestos específicos obtenidos como productos de la degradación enzimática son específicos del tipo de enzima utilizado, y de sus condiciones de operación durante el tratamiento de la biomasa con el biocatalizador, dado que son el resultado de una acción enzimática específica y selectiva sobre componentes celulares de la biomasa, y de la extensión de dicha acción según sean las condiciones de operación del proceso enzimático degradador. Ejemplo 1
Descripción metodológica
Tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina
Se llevó a cabo por duplicado o triplicado la disrupción celular de la biomasa (4 g) en un reactor de 25 ml_ donde la espirulina se encontraba en una concentración de 0,2 g/ml en un tampón 0,1 M. Según fue el valor de pH estudiado se utilizó tampón acetato sódico o fosfato sódico. Si bien la degradación enzimática de la biomasa puede realizarse utilizando diferentes concentraciones de biomasa en el reactor, la usada corresponde a la concentración de compromiso para tener la mayor productividad volumétrica. El valor de concentración de biomasa utilizada corresponde al rango de concentración para tener la mayor cantidad posible de biomasa por mi de solución acuosa, que permite formar una suspensión completamente dispersa y de forma que se tengan mínimas limitaciones de transferencia de materia y para posibilitar el contacto entre los intervinientes en el proceso degradador enzimático y extractivo. El proceso degradador enzimático de la biomasa se llevó a cabo en un incubador (Stuart SI50) a temperatura y agitación magnética (500 rpm) controladas. Durante la reacción se recogieron por duplicado alícuotas de 0,5 ml_ para hacer el seguimiento de la reacción enzimática hasta 24-48 h.
Extracción de los Biocomponentes mediante Disolventes
A cada alícuota (0,5 mi) recogida del medio de reacción enzimático se le adicionó 1 mi de una mezcla de disolventes compuesta por hexano e isopropanol en una proporción 3:2 (v/v). Se agitó la mezcla en un vértex durante 1 minuto y a continuación se centrifugó durante 15 minutos a 10.000 rpm. La fase orgánica o fase superior se extrajo cuidadosamente a un eppendorf. Las operaciones de adición de la mezcla de hexano e isopropanol, y posterior extracción de la fase oleosa, se llevaron a cabo dos veces más utilizando 0,25 mi de la mezcla de disolventes. Los tres volúmenes de las fases orgánicas recuperadas tras cada una de las tres adiciones de disolventes se juntaron y homogeneizaron en el vértex. La fase acuosa recuperada tras las tres extracciones de disolventes fue filtrada. Ambos extractos (acuoso y oleoso) se guardaron a 4°C hasta su análisis por HPLC-ELSD. Análisis de los extractos
El estudio de la influencia de los parámetros de pH, temperatura, tiempo y carga enzimática en los extractos oleosos, se realizó mediante análisis de las soluciones en cloroformo de alícuotas de las diferentes fases oleosas por HPLC-ELSD ( High pressure liquid chromatography with an evaporative light scattering detector), siguiendo la variación del área total de los picos cromatográficos significativos. Un ejemplo de cromatograma se muestra en la Figura 1. El pico eluído a 9 min. corresponde al hexadecano usado como estándar interno. El detector utilizado de ELSD es universal, si bien no visualiza compuestos de alta volatilidad como el isopropanol o difíciles de nebulizar (alto peso molecular, etc).
Los análisis de los extractos oleosos se realizaron por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, High-Performance Liquid Chromatography), en un equipo marca Merck-Hitachi Ltd. (Germany and Japan) acoplado a una columna Kromasil de sílice 5pm, 250x4.6 mm. y con un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, Evaporative Light Scattering Detector) de SEDERE modelo SEDEX 55. Las muestras, fueron filtradas a través filtro de nylon (15mm x 0,45pm, de Análisis Vínicos S.A., España) Se inyectaron 10 pl de muestra disuelta en cloroformo (calidad HPLC 99% puro), analizándose a un flujo de 1 ,5 ml/min. durante 30min. Se usó una fase móvil en gradiente donde la fase móvil A era n-Hexano (calidad HPLC 96%) y la fase móvil B contenía Hexano/lsopropanol/Acetato de etilo (80:10:10). Desde una proporción de fases A:B de 1 :99, se aumentó de manera lineal la relación de fases hasta 98:2 durante 20 minutos. Estas condiciones se mantuvieron durante 3 minutos, a partir de los cuales se volvió a las condiciones iniciales (1 :99) en 1 min, que se mantuvieron ¡socráticamente durante 9 minutos.
El estudio de la influencia de los mismos parámetros de la etapa enzimática en los extractos acuosos, se realizó mediante análisis por HPLC-ELSD, evaluando variaciones en el área total de todos los picos significativos. Ejemplos de cromatogramas se muestran en las Figuras 5-6.
Los análisis de los extractos acuosos se realizaron en el mismo equipo de HPLC, acoplado a una columna Kromasil C18 5u, 250x4.6 mm. Se inyectaron 10 pl de una disolución del extracto en agua (50 mg/ml) y se analizó a un flujo de 1 ,5 ml/min durante 83 minutos en gradiente utilizando como fase A 100% Agua MiliQ y como fase B una mezcla de Acetonitrilo:Agua MiliQ a 80:20. Se mantuvieron condiciones ¡socráticas del 96% A y 4% de B durante cinco minutos, seguido de un aumento lineal hasta el 40% de B en 60 min y un aumento lineal hasta 95% de B en un minuto. Se mantuvieron las proporciones durante siete minutos y se volvió a las condiciones iniciales en 10 minutos. Todos los análisis se replicaron 2-3 veces.
Los extractos acuosos obtenidos tras 24h de tratamiento enzimático de la biomasa se estudiaron a partir de extractos liofilizados obtenidos a mayor escala.
Proceso extractivo a mayor escala
El proceso extractivo a mayor escala se preparó realizando la disrupción celular de la biomasa (10 g) en un reactor de 250 mi donde la espirulina se encontraba en una concentración de 0,2 g/ml en un tampón 0,1 M. Según fue el valor de pH estudiado se utilizó tampón acetato sódico o fosfato sódico. El proceso degradador enzimático de la biomasa se llevó a cabo durante 24h. en un incubador (Stuart SI50) a temperatura y agitación magnética (500 rpm) controlada. Estas muestras se extrajeron mediante una mezcla hexano/isopropanol 3:2 (v/v). Para ello, tras añadir la mezcla de disolventes en igual proporción biomasa/disolvente que para el proceso a pequeña escala, la mezcla resultante se mantuvo bajo agitación magnética a 500 rpm a temperatura ambiente durante 10 min, tras los cuales se centrifugó en una centrifuga refrigerada a 10°C a 14.000 rpm durante 30 min. Tras la separación de fases ocurrida en este proceso, se separó cuidadosamente la fase superior (oleosa). Seguidamente, se repitió esta etapa extractiva añadiendo al material remanente en el tubo de centrífuga (fase acuosa + biomasa residual) 90 mL de la mezcla de disolventes hexano/isopropanol 3/2 (v/v), repitiéndose a continuación las etapas de agitación, centrifugación y retirada de la fase oleosa. Tras las sucesivas etapas de extracción con disolventes, la fase acuosa líquida remanente en el tubo de centrífuga se filtró en papel de filtro y se trasvasó a un embudo de decantación, quedando la biomasa residual en el fondo del tubo de centrífuga. La fase acuosa fue liofilizada durante 4 días. Los dos volúmenes obtenidos de fase oleosa se juntaron y filtraron, llevándose a sequedad en rotavapor y finalmente bajo corriente de nitrógeno. Los dos extractos (acuoso y oleoso) secos se almacenaron hasta su uso a -70°C. El extracto control se obtuvo con idéntico protocolo salvo que se usó agua mili-Q en lugar de la solución del enzima en buffer.
Determinación del rendimiento extractivo
El rendimiento en peso de los extractos acuosos fue determinado a partir de los valores de peso seco liofilizado de cada extracto acuoso en balanza de precisión de 4 dígitos. Para ello, las fases acuosas fueron liofilizadas durante 4 días y las fases oleosas fueron rotavaporeadas a 30°C para eliminar el disolvente, y posteriormente tratadas durante 4h bajo corriente de nitrógeno hasta la completa eliminación de las trazas de disolvente. A los valores de peso seco de los extractos acuosos obtenidos se les sustrajo el valor del peso correspondiente a su contenido en sales del tampón y al de la enzima añadida en la solución de Alcalase®, siendo la cantidad total sustraída inferior al 1 % p/p. La biomasa residual fue igualmente secada bajo corriente de nitrógeno.
Análisis de la biomasa residual
Los cambios morfológicos producidos en la biomasa por los diferentes métodos extractivos, se estudiaron con un microscopio electrónico de transmisión Jeol Jem 1010 (100Kv) Yokyo Japan. Cámara digital acoplada al equipo modelo Orius SC200 de Gatan Inc. Pleasanton, California. Software para adquisición de imágenes Digital Micrograph v 3.4. Todas las muestras fueron previamente tratadas para su fijación con aldehidos, lavado, osmificación, deshidratación, inclusión en resina durcupan con una polimerización final en estufa a 60°C durante 48h.
Análisis de composición en aminoácidos de los extractos acuosos
El análisis cuantitativo de las mezclas de aminoácidos se realizó conforme al procedimiento cromatográfico desarrollado. por Spackman, Moore y Stein en 1958 (Fed Proc. 1958, 17 (4) : 1107- 1115) y basado en el principio básico de operación en modo flujo continuo, en un aparato Biochrom 30 Series amino Acid Analyser, con una reproducibilidad > 0,5 CV a 10 nmoles. Biochrom 30 usó la metodología clásica de análisis de aminoácidos basada en cromatografía líquida de intercambio iónico y una reacción post-columna en continuo con ninhidrina para obtener una análisis cualitativo y cuantitativo, con una sensitividad de ~10 pmol,
Se prepararon por triplicado las correspondientes soluciones de los diferentes extractos acuosos secos (1-2,6 mg/mL) en tubos de hidrólisis, y se les añadió un volumen determinado de una solución de concentración conocida de norleucina (utilizada como estándar interno). Se analizaron cantidades conocidas de estándar y estándar interno para calibrar el analizador.
Identificación de biocomponentes de los extractos acuosos por LC ESI-MS MS Los diferentes extractos acuosos (enzimáticos y control) fueron analizados mediante LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva, a fin de identificar sus respectivos biocomponentes.
Previo a su análisis, todas las muestras se limpiaron utilizando las puntas con fase estacionaria C18 de Millipore. Los análisis LC ESI-MS MS se realizaron en un Ultímate 3000 nanoHPLC (Dionex, Sunnyvale, California) acoplado a un espectrómetro de masas trampa de iones AmaZon Speed (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La columna analítica usada de era de base sílice de fase reversa C18 PepMap 75 pm c 15 cm, 3 pm de tamaño de partícula y 100 Á tamaño de poro (Dionex, Sunnyvale, California). La columna de la trampa era una C18 PepMap (Dionex, Sunnyvale, California), 5 pm diámetro de partícula, 100 Á tamaño de poro, conectada en línea con la columna analítica. La carga de la bomba eluía una solución de 0,1 % ácido trifluoroacetico en 98% agua/2% acetonitrilo (ScharLab, Barcelona, Spain) a 30 pl/minutos. La nanobomba proporcionaba una velocidad de flujo de 300 nl/minutos y operó en condiciones de elución con gradiente, usando 0,1 % ácido fórmico (Fluka, Buchs, Suiza) en agua como fase móvil A, y 0,1 % ácido fórmico en 80% acetonitrilo / 20% agua como fase móvil B. El gradiente de elución se realizó conforme al siguiente esquema: en modo ¡socrático con 96% A: 4% B durante cinco minutos, un incremento lineal a 40% B en 60 minutos, un incremento lineal hasta 95% B en un minuto, condiciones ¡socráticas de 95% B durante siete minutos y retorno a las condiciones iniciales en 10 minutos. Se inyectaron 5 pl de las disoluciones de extractos (4 pg/pl), siendo las longitudes de onda registradas 214 y 280 nm. En un segundo análisis se inyectaron 5 pl de disoluciones de extractos de 10 pg/pl. El sistema LC estaba conectado mediante una fuente CaptiveSpray (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) al espectrómetro de masas con trampa de iones operando en modo positivo con un set de voltaje capilar a 1400 V. La adquisición automática de datos permitió obtener secuencialmente, el sean completo de espectros de MS (m/z 350-1500), y los espectros MS CID de los ocho iones más abundantes. En el análisis de las muestras de 10 pg/pl, el sean completo de espectros de MS fue 100-1000 m/z. La dinámica de exclusión fue aplicada para prevenir la misma m/z desde su aislamiento durante 1 minuto después de su fragmentación.
Para la identificación de péptidos, los datos de MS y MS/MS obtenidos para fracciones individuales de HPLC fueron procesados con DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Para la identificación de péptidos, los espectros MS/MS (en forma de ficheros genéricos Mascot) fueron analizados frente a una base de datos compuesta obtenida del NCBInr (National Center for Biotechnology Information, as a protein database for searches. It contains non-identical sequences from GenBank CDS translations, PDB, Swiss-Prot, PIR, and PRF) y que contenía 68623 entradas de proteínas de ambas, Spirulina y Arthrospira. Las búsquedas en la base de datos se hicieron usando una versión licenciada de Mascot v.2.6.0 (Matrix Science, London, UK) (Electrophoresis, 1999, 20(18): 3551-67). Los parámetros de búsqueda fueron fijados como sigue: metionina oxidada como modificación de variable, sin restricción de enzima. La tolerancia de masa peptídica se fijó a 0,3 Da en modo MS y 0,4 Da en modo MS/MS, no se permitieron pérdidas por rupturas. En la mayor parte de los casos, se obtuvo una precisión de ± 0,1 -0,2 Da tanto en espectros de MS como de MS/MS.
Además, en el caso de la muestra de Alcalase® se tomaron todos los espectros MS y MS/MS obtenidos en el análisis de la muestra y se analizaron utilizando la herramienta "de novo" del programa Peaks (Bioinformatics Solutions, Inc). Este programa permite, al igual que Mascot, enfrentar los espectros MS/MS obtenidos en el análisis de las muestras frente a una base de datos de entradas de secuencias, en este caso de Artrhospira-Spirulina. Este análisis “de novo” analiza matemáticamente los datos espectrales buscando la mejor solución de secuencia que explique el espectro. Se trata de un análisis no condicionado. La tabla incluye sólo aquellos espectros MS y MS/MS y sus correspondientes interpretaciones de novo. La columna confianza tiene los valores solo iguales o superiores a 80 para evitar que entren secuencias muy dudosas. La interpretación tiene una serie de condicionantes que hacen indistinguibles las identidades: I y L; K y Q; F y M(ox).
Determinación del contenido total de carbohidratos
El contenido en carbohidratos totales de los extractos acuosos liofilizados se determinó el método fenol-sulfúrico (Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356). Los extractos se resuspendieron en agua miliQ a una concentración de 0,2 g/l y analizaron por duplicado, expresándose los resultados como el valor medio calculado con su desviación estándar.
Análisis de la actividad antihipertensiva
Evaluación in vitro de la actividad inhibidora de ACE (enzima convertidora de angiotensina I), según el protocolo descrito por Sentandreu y Toldrá (Nat. Protoc. 2006, 1 : 2423-2427). El sistema renina-angiotensina constituye el mayor sistema regulador de la presión sanguínea en el cuerpo humano. En dicho sistema, ACE transforma el decapéptido angiotensina I en el péptido vasoconstrictor angiotensina II y, a su vez, desactiva el vasodilatador bradiquinina. Además, esta enzima juega un importante papel en el control de la presión sanguínea. El valor de IC50 (concentración de extracto de espirulina necesario para inhibir el 50 % de la actividad de ACE) se utiliza para expresar la capacidad inhibidora de ACE in vitro del extracto.
La actividad ACE se determinó siguiendo la generación de fluorescencia debido a la liberación del producto fluorescente o-aminobenzoylglicina (Abz-Gly) del sustrato no fluorescente Abz-Gly-Phe(N02)-Pro. La actividad inhibidora de ACE de las muestras se midió por triplicado. La fluorescencia emitida se determinó a cada minuto durante 30 minutos a longitudes de onda de emisión y excitación de 355 y 405 nm, respectivamente, en un microplato de fluorimétrico Synergy HT (Biotek, Winooski, VT, USA). El valor de IC50 se determina mediante curvas de dosis-respuesta en las que el rango de concentración de proteína (0-0,8 mg/ml) se distribuyó a lo largo de una escala logarítmica y usando la función de ajuste a una curva de regresión no-lineal sigmoidal en GraphPad Prism 4.00 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Análisis de la actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la lipasa pancreática
La actividad de los extractos en la inhibición de la actividad de la lipasa pancreática de cerdo se realizó en base al método descrito anteriormente por Lee et al., ligeramente modificado (Biochim Biophys Acta. 1993; 1169: 156-164). Brevemente, p- nitrofenil butirato (PNPB, de Sigma) fue disuelto en acetonitrilo dando una disolución stock de concentración 13,33 mM, que se almacenó a -20 °C. La lipasa pancreática de cerdo se disolvió en agua Mili-Q a una concentración final de 15 mg/ml.
Todas las reacciones se llevaron a cabo con una concentración de sustrato 0,4 mM de PNPB en tampón 0,061 M Tris-HCI, pH 8,5 a 37 °C durante 5 minutos. El incremento de absorbancia del p-nitrofenol liberado en presencia de 1 ,5 mg/ml de lipasa pancreática porcina se midió a 400 nm en un espectrofotómetro UV-vis (Jasco V-630 Spectrophotometer) durante 3 minutos. Seguidamente, se determinó la velocidad de reacción en idénticas condiciones en presencia de una concentración de 0,75 mg/ml del extracto de espirulina correspondiente La diferencia entre la actividad enzimática del ensayo sin extracto y con extracto se definió como la actividad inhibidora del extracto. El ensayo de actividad se realizó por triplicado para cada extracto, los resultados fueron promediados y expresados con sus deviaciones estándar. Análisis de actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la enzima colesterol esterasa pancreática
Se determinó la capacidad de los extractos para la inhibición de la colesterol esterasa pancreática, utilizando el método descrito por Pietsch y Gütschow (J. Med. Chem. 2005; 48: 8270-8288) La enzima desempeña un papel esencial hidrolizando los ásteres de colesterol de la dieta. Generalmente, la hidrólisis de los colesterol ásteres tiene lugar en el lumen del intestino delgado mediada por la colesterol esterasa pancreática (CEase), produciéndose colesterol. La capacidad inhibidora de algunos compuestos permite controlar la biodisponibilidad del colesterol procedente de los ásteres de colesterol, y así limitar la absorción de colesterol libre en el torrente sanguíneo.
La disolución buffer contenía 100 mM fosfato sódico y 100 mM NaCI, pH 7.0. Se preparó una disolución stock fresca de CEase (0,075 mg/ml) en el buffer y conservó a 0 °C hasta su uso. Una disolución stock de ácido taurocólico (TC, 8,6 mM) fue preparada en la disolución buffer y mantuvo a 4°C hasta su empleo. La disolución stock de PNPB (13,33 mM) se preparó en acetonitrilo. En la cubeta, los extractos enzimáticos (75 pg/ml) se incubaron a 25°C con una mezcla que contenía ácido taurocólico 5,16 mM, PNPB 0,2 mM en un tampón fosfato sódico 0,1 M, 100 mM NaCI a pH 7,0. La reacción se inició mediante la adición de colesterol esterasa pancreática porcina (2,5 pg/ml). La variación de absorbancia de las mezclas se midió en un espectrofotómetro UV-vis a 405 nm.
Análisis de actividad antioxidante
Los métodos de análisis de antioxidantes se clasifican en dos tipos: i) los basados en una reacción de transferencia de un átomo de hidrógeno (HAT) y ii) los basados en una reacción con transferencia electrónica (ET). Generalmente, en los HAT el antioxidante y el sustrato compiten por radicales peróxido generados térmicamente en la descomposición de azocompuestos (ej. , método ORAC). Los métodos ET miden la capacidad del antioxidante para reducir a un oxidante, que cambia de color al reducirse. El cambio de color se correlaciona con la concentración de antioxidante de la muestra. Entre los ensayos ET están los de determinación de fenoles totales por Folin-Ciocalteu reagent (FCR) y algunos de determinación de Trolox equivalence antioxidant capacity (TEAC). FCR se usa para cuantificar la capacidad reductora de antioxidantes y el método ORAC para cuantificar la capacidad de secuestrar radicales peróxido. Es habitual encontrar valores diferentes para diferentes técnicas de capacidad antioxidante. Este es uno de los motivos por lo que se recomienda realizar la medición de la capacidad antioxidante por más de un método y por eso se expresan en TEAC. Para un estudio integral de antioxidantes en una muestra, además de estos ensayos comúnmente aceptados (ABTS, ORAC y FCR), se recomienda realizar ensayos específicamente validados para la misma (J Agrie Food Chem. 2005, 53(6):1841-56).
Todos los extractos acuosos se analizaron por ABTS, ORAC y FCT.
• Ensayo ABTS.
Se utilizó el método descrito por Re et al. (Biol. Med. 1999; 26, 1231-1237), que mide la capacidad de los compuestos antioxidantes para secuestrar un catión radical estable (ABTS'+). El radical monocatión preformado de 2,29-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS*1) se genera por oxidación de ABTS con persulfato potásico y es reducido en presencia de antioxidantes donadores de hidrógeno. Las influencias tanto de la concentración de antioxidante y de la duración de la reacción de inhibición de la absorción del radical catiónico son consideradas para determinar la actividad antioxidante. Los resultados se expresan mediante el valor TEAC (trolox equivalen t antioxidant capacity), que es la concentración (mM) de la solución una referencia estándar (Trolox) con capacidad antioxidante equivalente a la de una disolución 1 mM de analito investigado. Los resultados se expresan como los valores TEAC (mmol trolox/ g extracto). La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinado por cuadruplicado, siendo la reproducibilidad del método ABTS del 5%.
• Análisis de actividad antioxidante mediante determinación del secuestro de radicales hidroxilo (Hydroxyl radical scavenging assay, (ORAC-Fluorescein) Assay).
Se utilizó el método descrito por Dávalos et al. (J. Agrie. Food Chem. 2004; 52, 48-54). El radical hidroxilo (OH*) es un radical generado en el cuerpo humano, que desempeña un importante papel en el daño de los tejidos con procesos inflamatorios de enfermedades causadas por stress oxidativo.
En ambos análisis (ABTS y ORAC) se utilizó un lector multimodal de microplacas SynergyTM HT con dispensador automático de muestra, y control de temperatura de Biotek Instruments (VT, USA).
Biotek Gen5TM fue el software usado para el análisis de datos. Cada placa de 96 pocilios fue analizada cuatro veces, con cuatro niveles de estándares para calibración y ocho repeticiones por blanco o control. La reacción fue iniciada mediante la adición automática de 60 mI del radical ABTS en la disolución o del AAPH para los ensayos ABTS y ORAC, respectivamente. La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinada de manera estándar tras 10 minutos de reacción. Para el método ORAC los valores se tomaron tras 180 minutos de reacción.
La actividad antiradicalaria con el ABTS fue determinado por cuadruplicado y el ensayo de ORAC por triplicado. La reproducibilidad de algunas de las muestras en ORAC, en concreto la muestra control, es superior a lo normal (aprox. 10%). La reproducibilidad del método ABTS suele ser del 5%.
· Determinación del contenido total de polifenoles por FCT
Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (Nature Protocols, 2007; 2(4): 875-877), que determina contenido en polifenoles y otros antioxidantes. Aunque aminas aromáticas, fenoles, altos niveles de azúcares y ácido ascórbico interfieren en la determinación, este método reduce en un 15% la interferencia del ácido ascórbico. Los extractos acuosos liofilizados se resuspendieron (1 Og/I) en 95% (v/v) metanol/agua, y se sometieron a un baño de ultrasonidos (20 kHz) durante 10 minutos para su mejor dilución en la solución. Los resultados se expresan como el valor medio de valores obtenidos en dos réplicas con su desviación estándar.
Ejemplo 2.
Optimización de los parámetros del tratamiento enzimático para el extracto oleoso
Se llevó a cabo la optimización del tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina estudiando el efecto de diferentes parámetros de la reacción en la recuperación de biocomponentes oleosos de espirulina. El estudio permitió determinar los valores óptimos del pH del medio, temperatura y carga de biocatalizador en la reacción enzimática para la recuperación de biocomponentes hidrofóbicos de espirulina.
La biomasa de espirulina utilizada en el estudio fue un preparado comercial liofilizado en polvo de uso alimentario suministrado por la empresa ASN Espirulina Leader SL. Todos los disolventes utilizados tanto en la extracción y en los análisis fueron de calidad HPLC suministrados por Scharlau. Tanto el hexadecano como las sales para la preparación de las disoluciones con pureza de más del 99% fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Madrid, Spain).
Las enzimas utilizadas en el estudio fueron: Alcalasa, denominada comercialmente Alcalase® 2.4 L FG (EC 3.4.21.62), la proteasa Flavourzyme®; la endoglucosidasa Ultraflo® Max, y la exoglucanasa Vinoflow® Max, la lipasa Lipozyme® 100L y la Celulasa Celluclast®. Todas ellas fueron suministradas por Novozymes.
El estudio de todos los parámetros se realizó mediante análisis de las diferentes fases oleosas por HPLC-ELSD, siguiendo las variaciones en el área total de los picos mayoritarios. Un ejemplo de cromatograma se muestra en la Figura 1. El pico eluído a 9 min. corresponde a hexadecano usado como estándar interno. Todos los experimentos se realizaron por duplicado o triplicado, dándose el valor medio de los valores obtenidos y su error calculado como la desviación estándar.
Efecto del pH en la extracción asistida por enzimas
El efecto del pH del tratamiento enzimático en la recuperación de biocomponentes oleosos con seis diferentes enzimas comerciales se realizó con una carga enzimática de 1% (v/p) (volumen de solución enzimática por peso total de mezcla de reacción: biomasa y buffer) a 40°C. El estudio se realizó por duplicado, tomando alícuotas de cada mezcla biomasa-enzima tras 4 h. Los valores óptimos de pH se determinaron considerando los valores de área total de picos cromatográficos obtenidos en el análisis del extracto oleoso (Figura 2).
Para la obtención óptima del extracto oleoso con las dos proteasas estudiadas (Alcalase® y Flavourzyme®), los valores óptimos de pH fueron 6,5 y 6,0, respectivamente (Figura 2). Estos valores de pH permitieron obtener los valores máximos de área total de picos con tratamientos enzimáticos de 4 h. En el caso de Ultraflo®, se encontró un valor óptimo de pH de 7,0. En el caso de Vinoflow®, solo el valor óptimo de pH 6,5 rinde la máxima cantidad de biocomponentes extraídos con 4h de tratamiento enzimático, sugiriendo que a este valor de pH la degradación de la biomasa es más rápida. Para las enzimas Lipozyme® y Celluclast®, la extracción óptima se obtiene a pH 6,5.
En resumen, los valores óptimos de pH determinados fueron pH 6 para obtener el extracto oleoso con Flavouzyme®, pH 6,5 para la extracción con Alcalase®, Vinoflow®, Lipozyme® y Celluclast®, y pH 7,0 para la de Ultraflo®. Estos valores están dentro del rango de condiciones de operación declaradas por el fabricante Novozymes Ltd (Denmark) para estas preparaciones enzimáticas.
Los valores óptimos de temperatura y carga de biocatalizador fueron determinados seguidamente a los respectivos valores óptimos de pH de los diferentes procesos enzimáticos extractivos.
Estudio de la temperatura
Este estudio se realizó a los respectivos valores óptimos de pH de cada enzima en el intervalo 25-50°C (Figura 3).
El efecto de la temperatura de la etapa degradadora de la biomasa (etapa a) en el proceso extractivo se estudió tomando alícuotas de la mezcla biomasa-enzima tras 4 h y 24 h de tratamiento. En la Figura 3 se muestran los valores de área total de picos de los cromatogramas de HPLC-ELSD de la fase oleosa obtenida con Alcalase®.
Considerando el error experimental del conjunto de valores tomados a 4h y a 24h, se determinó un valor óptimo de temperatura de 30°C para las extracciones con las dos proteasas (Alcalase® and Flavourzyme®), para Ultraflo® (con actividades b-glucanasa y xylanasa, junto a otras secundarias como celulasa, hemicelulasa, y pentosanasa), para la celulasa Celluclast® y la lipasa Lipozyme®. Este valor corresponde a la menor temperatura a la cual puede obtenerse el máximo valor de área total de picos de biocomponentes oleosos extraídos con estos cinco distintos tratamientos enzimáticos de 24 h. Aunque para algunas enzimas los valores a tiempos cortos (4h) son mayores a otra temperatura, a tiempos largos los valores a esas temperaturas resultan inferiores a los de 30°C, indicando una degradación de los productos a dichas temperaturas a tiempos largos. Sin embargo, a una temperatura suave de 30°C los productos susceptibles de oxidación (ácidos grasos poliinsaturados, vitaminas, antioxidantes, etc) se preservan mejor. En el caso de Vinoflow®, la máxima concentración de biocomponentes extraídos en la fase oleosa puede alcanzarse a 40°C o mayor temperatura (considerando el error experimental). El empleo de mayor temperatura favorece la cinética del proceso enzimático degradador de la biomasa, reduciendo el tiempo necesario para obtener la extracción máxima de biocomponentes, pero ello conlleva el aumento del gasto energético y reduce tanto la estabilidad de productos lábiles, como la estabilidad operacional del biocatalizador. Por tal razón, se observa un descenso en el área total observada cuando el tratamiento enzimático de la biomasa se prolonga de 4h a 24h al aumentar la temperatura del proceso con algunas de estas enzimas (Alcalase® a 50°C, Flavourzyme® a 40-50°C, Ultraflo® y Vinoflow® a 50°C). Teniendo en cuenta la disminución de la estabilidad enzimática al aumentar la temperatura, y la termolabilidad de los compuestos a extraer, resulta más favorable la temperatura de 40°C respecto a otras superiores para Vinoflow®.
Por tanto, los valores a 4h y 24h indicaron que la temperatura óptima podría ser 30- 40°C para algunos enzimas. En base a la termolabilidad de los biocomponentes (antioxidantes, etc) y a consideraciones para minimizar el consumo energético del proceso, se seleccionó la temperatura de 30°C como óptima para los procesos enzimático con Alcalase®, Ultraflo®, Flavourzyme®, Lipozyme® y Celluclast®, y de 40°C para el de Vinoflow®.
Estudio de la carga enzimática
La carga de biocatalizador empleada en la etapa degradadora es un importante parámetro del proceso extractivo, ya que afecta a la velocidad de biodegradación de la biomasa previa a la extracción de biocomponentes con disolventes, y ésta determina el valor del rendimiento extractivo. El valor óptimo de la carga enzimática debe determinarse cuidadosamente. Aunque el empleo de una alta carga enzimática reduce el tiempo necesario para lograr la deseada degradación de la biomasa, ello también supone incrementar el coste de la partida del biocatalizador, y en el caso de proteasas puede favorecer la autodestrucción vía autolisis del biocatalizador.
Los resultados obtenidos para la extracción con Alcalase® a diferentes cargas del biocatalizador se muestran en la Figura 4. Este estudio se realizó en el intervalo 0-2% v/p de carga para todas las enzimas estudiadas, excepto para Vinoflow® (0-4% v/p). Los resultados obtenidos en las diferentes extracciones enzimáticas se compararon con los obtenidos en el experimento control sin enzima, donde en lugar de la solución enzimática se empleó una cantidad equivalente de solución acuosa (Figura 4).
Se determinó un valor óptimo de carga enzimática de 1 % v/p para todos los casos, excepto para Vinoflow®, que fue 2% v/p, habida cuenta que o bien el empleo de cargas enzimáticas superiores rendían inferiores valores de área o el aumento de ésta no justificaba el empleo de mayor cantidad de biocatalizador.
En general, el área total de picos incrementa cuando la duración del tratamiento enzimático se prolonga en el intervalo 0-24h con todas las cargas enzimáticas estudiadas (Figura 4). Solo en el caso de Vinoflow® con 1 % (v/p) de enzima la reacción se ralentiza después de 4h, de forma que la cantidad de biocomponentes recuperada resulta prácticamente invariable. También, el área total de productos extraídos no aumenta al aumentar el tiempo de tratamiento con Vinoflow® de 4h a 24h usando la mayor carga enzimática estudiada (4% v/p Ultraflow®). Ello sugiere que una excesiva concentración enzimática puede favorecer la posterior degradación de los productos extraídos. Además, la recuperación de los productos oleosos incrementa al aumentarse la carga enzimática de 0,5% a 1 % (v/p) cuando se usan las dos proteasas y Ultraflo®, pero disminuye dramáticamente cuando se usan mayores cargas de ellas (ej. , 2% v/p). Este efecto puede deberse a una excesiva biodegradación de la biomasa en presencia de una excesiva concentración de enzima. Como resultado de ello, puede tenerse una ulterior biodegradación de los productos extraídos, disminuyéndose su concentración en el extracto oleoso. En el caso de proteasas, los menores rendimientos extractivos de biocomponentes oleosos pueden ser debidos a una rápida inactivación enzimática vía autolisis favorecida a altas concentraciones de enzima. Cabe notar que las extracciones con una etapa degradadora previa por Alcalase®, Flavourzyme®, Ultraflo® y Vinoflow® (24h de tratamiento enzimático en sus respectivas condiciones óptimas de operación) proporcionan significativos aumentos en las cantidades recuperadas de biocomponentes oleosos, comparado con las del proceso extractivo sin tratamiento enzimático de la biomasa (Figura 4). Este resultado prueba la favorable contribución de la etapa de degradación de la biomasa de espirulina por las enzimas estudiadas, para la extracción de los componentes oleosos.
Los valores óptimos de carga enzimática determinados son 1 % v/p para todos los biocatalizadores estudiados, excepto para Vinoflow® (2% v/p).
En conclusión, para cada extracción enzimática, se determinaron sus condiciones óptimas de proceso, en función del pH, temperatura y tiempo de exposición a la enzima (pH 6,5, 1% v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1% v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; la duración en todos los casos es de 24h). Los extractos del experimento control sin enzima se obtuvieron añadiendo agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada, a 30°C y 24h. Ejemplo 3
Optimización del tratamiento enzimático para el extracto acuoso de Alcalase®. Su comparación con otras extracciones enzimáticas y control sin enzima.
Se llevó a cabo la optimización del tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina, previo a la extracción por la mezcla de disolventes hexano/isopropanol 3:2 (v/v) para la recuperación de biocomponentes hidrofílicos de espirulina, estudiando el efecto de diferentes parámetros de la reacción enzimática en el extracto acuoso. Este estudio permitió determinar los valores óptimos del pH del medio, temperatura, carga de biocatalizador y duración de la reacción enzimática para la obtención del extracto acuoso de espirulina.
El estudio de todos los parámetros se realizó tomando alícuotas de la mezcla enzima- biomasa al tiempo indicado, y analizando las diferentes fases acuosas extraídas por HPLC-ELSD, y mediante comparación del área total de los picos significativos de cada cromatograma. Un ejemplo de cromatograma obtenido con Alcalase® se muestra en la Figura 5 (en la Figura 6, control sin enzima). El primer pico eluído hasta 2,39 min. corresponde al disolvente y no fue computado. En el estudio inicial de optimización de las variables de los procesos enzimáticos, los valores de área total de picos en sus respectivos cromatogramas de análisis por HPLC-ELSD fueron comparados, para determinar las condiciones de operación óptimas que permiten obtener la mayor tasa de recuperación de biocomponentes hidrofílicos.
Los extractos acuosos obtenidos con las dos proteasas las dos (endo- y exo-) glucanasas, la celulasa y las lipasas usadas en este estudio, deben contener diferentes biocomponentes, como resultado de los diferentes tipos de reacciones catalizadas por los diferentes biocatalizadores. En todos los casos, las sumas totales de valores de área de los picos significativos fueron también comparativamente analizados.
Seguidamente se muestra la determinación de las condiciones óptimas del proceso extractivo con Alcalase® en función del pH, temperatura, carga enzimática y tiempo de exposición a la enzima sobre el extracto acuoso tras la extracción con disolventes.
Efecto del pH en la extracción asistida por Alcalase®
El efecto del pH del tratamiento enzimático de la biomasa en la recuperación de biocomponentes acuosos se realizó a 40°C con una carga enzimática de 1% (v/p) (unidades en volumen de solución enzimática por peso total de mezcla de reacción: biomasa y buffer). Los extractos acuosos post-extracción con disolventes obtenidos a diferentes valores de pH de la etapa enzimática (etapa (a)) se estudiaron para diferentes tiempos de tratamiento enzimático.
En la Figura 7 se representa la variación del área total de picos cromatográficos con el pH para la extracción con Alcalase®. Los resultados obtenidos de efecto del pH en el área total de los picos cromatográficos significativos obtenidos tras 4h de acción enzimática, se representan en las Figura 7A. La mayor velocidad inicial (4h) de extracción de biocomponentes con Alcalase® se obtiene a pH 6,5 (Figura 7A). A pH 6,5 el proceso de degradación enzimática resulta el más rápido, y en consecuencia se obtiene el máximo valor de área total de picos cromatográficos a este pH para extracciones con tratamiento enzimático corto (4h, Figure 7A).
También, la evolución de la extracción enzimática con la duración de la etapa a) (disgregación enzimática de la biomasa) para el valor óptimo de pH fue determinada durante las primeras 48h. Los resultados obtenidos con Alcalase® se representan en la Figura 7B. Similarmente al caso de Alcalase®, el resto de extracciones enzimáticas estudiadas requieren 24h de tratamiento enzimático de la biomasa de espirulina para obtenerse la máxima cantidad de biocomponentes en el extracto acuoso extraído con disolventes. Un mayor duración de la etapa a) (enzimática), por ej de 48h rinde menor cantidad de biocomponentes posiblemente debido a una degradación enzimática de parte de éstos (péptidos por la proteasa Alcalase®),
Estudio de la temperatura
El efecto de la temperatura de la etapa a) en la extracción de componentes polares se estudió para 24 h de tratamiento enzimático de la biomasa. El estudio se realizó al correspondiente valor óptimo de pH de la enzima Alcalase®, y una carga enzimática de 1 % (v/p) en el intervalo 30-50°C.
La Figura 8 muestra los valores de área total de picos cromatográficos de los correspondientes extractos acuosos obtenidos con Alcalase®. A fin de identificar la temperatura que permite extraer mayor cantidad de componentes hidrofílicos a partir de cada gramo de espirulina, en la Figura 8 se representa el valor de área total referida a la cantidad total de extracto acuoso obtenido a partir de 1 g de espirulina, calculada considerando el área total obtenida con la cantidad inyectada de extracto (ver adelante la determinación de rendimientos extractivos).
Considerando el error experimental, 30°C o una temperatura inferior resulta ser la temperatura óptima para la extracción con Alcalase®. La temperatura para obtener la máxima recuperación de biocomponentes en el extracto acuoso es relativamente baja. Vitaminas, antioxidantes y otros componentes termolábiles de los extractos pueden preservarse relativamente bien a estas temperaturas (30-40°C). Comparado con temperaturas mayores, a estas suaves temperaturas el coste energético y la desnaturalización de los extractos es reducida, mientras que la estabilidad operacional de los biocatalizadores empleados aumenta. De hecho, la disminución observada en la extracción de biocomponentes a mayores temperaturas (Figura 8) puede ser debida a una indeseable degradación enzimática de los biocomponentes al acelerarse térmicamente el proceso y/o a la disminución de la estabilidad operacional del enzima.
Estudio de la carga enzimática
El valor de carga enzimática utilizado debe ser cuidadosamente seleccionado. Entre otras razones, una carga óptima de biocatalizador debe ser identificada, de forma que permita reducir el tiempo para completar la degradación deseada de la biomasa para extraer sus biocomponentes, sin aumentar excesivamente el gasto en el biocatalizador (J Am Oil Chem Soc, 2009, 86(12): 1235-1240). La carga de catalizador empleada afecta a la velocidad de biodegradación de la biomasa, previa a la etapa de extracción por disolventes, y determina el rendimiento extractivo a un tiempo dado.
Los resultados obtenidos con diferentes cargas de Alcalase® (0-2% v/p enzima) están representados en la Figura 9. Los resultados fueron comparados con los obtenidos en la extracción control, en la que se utilizó un volumen equivalente de agua milli-Q en lugar de la solución enzimática (0% carga de enzima en la Figura 9).
La extracción de biocomponentes polares aumenta al aumentar la carga enzimática empleada de 0,0% a 1 % (v/p) de Alcalase®, pero disminuye dramáticamente al utilizar cargas superiores (por ej. , 2% v/p; Figura 9).
La disminución de la recuperación de productos al emplear cargas superiores a cierto valor, sugiere que con elevadas concentraciones de enzima se favorece una excesiva biodegradación de la biomasa. Como resultado de ello, los componentes extraídos son el resultado de un mayor grado de biodegradación de los productos extraídos a cargas menores. En el caso de proteasas, el descenso de los rendimientos extractivos de biocomponentes puede también deberse a cierto grado de autolisis enzimática, favorecida a altas concentraciones de enzimas proteolíticas.
Un análisis individual de la evolución del área de los diferentes picos cromatográficos (Figura 10), indica que algún(os) producto(s) es(son) extraído(s) casi completamente con solo 4h de tratamiento enzimático (tiempo de retención (Tr) = 68min, Figura 10E), mientras que otros productos requieren tiempos mayores (24h) para la etapa a) (los eluídos a Tr = 3-5min.; 5,5 min; 11-14min.; 20-22min.; 28min., Figuras 10 A-E). Estos resultados sugieren que algunos de los biocomponentes extraídos son, bien intracelulares o pueden formarse por la acción degradadora enzimática sobre los componentes celulares (ej., péptidos y/o azúcares, etc).
La inspección individual de la evolución temporal del área de los diferentes picos de productos extraídos en el extracto acuoso, revela la existencia de dos tipos de cinéticas extractivas para los diferentes productos. Estos resultados sugieren que los productos localizados en lugar más accesible de la célula (ej, región extracelular) necesitan un tiempo corto para la etapa a) de degradación enzimática de la biomasa. Pero, la extracción completa de los dos tipos de biocomponentes requiere una duración de la etapa enzimática de 24h. La duración de la etapa de tratamiento enzimático es un importante parámetro. En este proceso, 24h son necesarias para obtener la máxima extracción de componentes intra- y extracelulares de la biomasa de espirulina.
Finalmente, se determinó que las condiciones óptimas del tratamiento enzimático para Alcalase® son: temperatura de 30°C, pH 6,5, 24h y carga enzimática 1 % v/p.
Los estudios de los ejemplos 2 y 3 revelaron que tanto las cantidades de biocomponentes recuperados en la fase acuosa (determinados en base a áreas cromatográficas), como la composición de los diferentes extractos, varían según estos parámetros (tipo y carga de enzima, extensión temporal de su acción, temperatura y pH de trabajo). También, se determinó que las condiciones de operación óptimas para la etapa de degradación enzimática de la biomasa, son idénticas para la recuperación tanto de los biocomponentes hidrofílicos como hidrofóbicos (extractos acuosos y oleosos, respectivamente).
Ejemplo 4
Rendimientos en peso de los extractos en condiciones óptimas
Los procesos extractivos fueron realizados a mayor escala (10 g de biomasa de A. platensis) y los correspondientes extractos oleosos y acuosos obtenidos en sus respectivas condiciones llevados a sequedad para determinar su peso. Los diferentes extractos enzimáticos y el control (sin enzima) fueron preparados (por duplicado) en sus respectivas condiciones óptimas: pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®. Los extractos del control sin enzima se obtuvieron añadiendo agua mili-Q en lugar de la solución enzimática tamponada, a 30°C y 24h.
Todos los extractos fueron secados (en rotavapor+corriente de nitrógeno) o liofilizados, determinando su peso seco en una balanza de precisión (4 dígitos). En la Tabla 1 se recoge los valores de rendimiento en peso seco de las diferentes fases (oleosa, acuosa y residual) Los rendimientos se calcularon como el porcentaje de peso del extracto seco (o biomasa residual seca) respecto al peso utilizado de la biomasa seca de espirulina.
Todos los sistemas de recuperación de biocomponentes con asistencia enzimática proporcionaron mayores rendimientos extractivos de las fases acuosas y oleosas que el sistema control sin enzima. El mayor rendimiento en peso de extracto oleoso se obtuvo con Vinoflow®, mientras que, para el extracto acuoso los sistemas extractivos que utilizan biocatalizadores proteolíticos (Alcalase® y Flavourzyme®) dieron el mayor rendimiento en peso seco; si bien, el mayor rendimiento en el extracto acuoso fue el de Alcalase® El proceso de extracción enzimática con Alcalase® permitió aumentar 1 ,5 y 1 ,9 veces el peso de los extractos oleoso y acuoso, respectivamente, con respecto a los obtenidos en el control sin enzima (Tabla 1).
Tabla 1. - Rendimientos en peso de la Extracción en condiciones óptimas
RENDIMIENTOS DE EXTRACCIÓN (%)
Enzima FASE
Orgánica Acuosa Biomasa Residual
Alcalase® 6,7±0,1 36,5±0,1 47,7±0,4
Flavourzyme® 6,4±0,1 31 ,8±0, 1 47,8±1 ,0
Ultraflo® 5,9±0,1 19,7±0,1 61 ,4±1 ,2
Vinoflow® 8,1±0,2 26,3±0,1 57,1±0,3
Lipozyme® 5,0 27,0 66,6
Celluclast® 4,9 26,1 69,3
Control 4,7±0,2 19,2±0,2 70,1±0,4
Alcalase®* n.d. 42,9 56.1
Flavourzyme®* n.d. 41,8 56,8
Control* n.d. 49,0 50.2 * Rendimientos de la extracción de biocomponentes de la etapa a), sin emplear disolventes post-tratamiento enzimático. n.d.: no determinado.
Cuando la recuperación del extracto acuoso se realiza sin adición de la mezcla de disolventes hexano/isopropanol, los rendimientos en peso de las fases acuosas y biomasa residual varían respecto a la extracción usando estos disolventes (Tabla 1 , indicado como *), de forma que se obtiene mayor peso de fase acuosa sin el uso de estos disolventes. Hecho que es particularmente notable en el caso de la extracción control sin enzima. Ello es probablemente debido a la dificultad de separar bien el material oleoso, que, al no retirarse a la fase de hexano, queda firmemente adherido a la biomasa residual y parcialmente emulsionado en la fase acuosa. A diferencia de lo que ocurre usando la mezcla de hexano/isopropanol para extraer los biocomponentes, las fases acuosas de las extracciones con Alcalase® y Flavouzyme® recuperadas sin empleo de estos disolventes tienen menor peso que su respectiva extracción control sin enzima. Esto es debido al extraordinario aumento del peso recuperado de la fase acuosa de la extracción control sin disolventes con respecto a la misma extracción control usando disolventes para la recuperación de biocomponentes. Estas extracciones sin adición de disolventes orgánicos tienen igualmente pérdidas de rendimiento en peso debido a las mismas razones que los otros extractos (operaciones de filtración, etc).
Para los extractos recuperados con la mezcla de disolventes a partir de los rendimientos en peso de los extractos oleoso y acuoso (Tabla 1) se calcularon las unidades de área total de picos de los análisis de HPLC-ELSD de los diferentes extractos óptimos (enzimáticos y control sin enzima) referidas a 1 gramo de biomasa de A. platensis inicial. El valor calculado es indicativo de la cantidad total de biocomponentes extraídos a partir de 1 g de biomasa seca de espirulina en los diferentes procesos extractivos. El estudio comparativo de los valores obtenidos para los diferentes procesos extractivos se representa en las Figuras 11 y 12 para los extractos acuoso y oleoso, respectivamente. En la Figura 11 se representan los diferentes valores de área total de picos de biocomponentes oleosos correspondientes a un gramo de biomasa extraída con los diferentes tratamientos enzimáticos en sus respectivas condiciones óptimas de operación. Todos los procesos extractivos tras una etapa a) de digestión enzimática de la biomasa permiten obtener la mayor cantidad de biocomponentes oleosos detectados por HPLC-ELSD, indicando que la acción de todas las enzimas facilita la recuperación de los biocomponentes oleosos intracelulares. Vinoflow® proporciona la mayor recuperación de biocomponentes detectados por HPLC-ELSD.
La comparación de los valores obtenidos para los diferentes extractos acuosos (Figura 12) indica, que el mejor método enzimático (1% v/p Alcalase®, pH=6,5, 30°C y 24h) permite aumentar la recuperación de biocomponentes polares por gramo de espirulina 2,5 veces con respecto al obtenido con la simple extracción por disolventes (control), lo cual es consecuencia de que el método de Alcalase® aumenta el peso del extracto acuoso un 90% (1 ,90 veces mayor % p/p) y de la diferente composición de los extractos obtenidos con las distintas enzimas (ver Ejemplos 6 y 7). La cantidad de biocomponentes hidrofílicos detectados por HPLC-ELSD, extraída de cada gramo de espirulina con Alcalase® resulta 3 veces mayor que el obtenido con la otra proteasa (Flavourzyme®). Para el extracto acuoso, no todos los sistemas enzimáticos aumentan la cantidad de biocomponentes extraídos, siendo las cantidades obtenidas con Vinoflow®, Lipozyme® y Celluclast® similares a la obtenida en el control sin enzima.
Estos resultados demuestran la superioridad del proceso extractivo de Alcalase® para la recuperación de biocomponentes hidrofílicos de espirulina.
Ejemplo 5
Análisis morfológico de la biomasa.
La mayor extracción neta de biocomponentes y menor cantidad de biomasa residual) obtenida mediante tratamiento con Alcalase®, se visualizó también mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la biomasa residual, siendo la de Alcalase® la que se visualizó más desintegrada y traslúcida, indicando mayor desaparición de sus biocomponentes, con respecto a los otros casos (Figuras 13-14). La visualización de las biomasas residuales al microscopio electrónico corrobora la superioridad extractiva de componentes del proceso con Alcalase® con respecto a otros procesos enzimáticos estudiados y al control sin enzima. Ejemplo 6
Análisis de composición en aminoácidos de los extractos acuosos obtenidos en condiciones óptimas de los procesos extractivos
El análisis cuantitativo de las mezclas de aminoácidos se realizó conforme al procedimiento descrito en el ejemplo 1. En la Figura 15 se representa el contenido total de moles de aminoácidos extraídos por g de biomasa con cada sistema extractivo.
El extracto acuoso obtenido con Alcalase® tiene mayor contenido en amino ácidos totales (45% p/p extracto liofilizado) que el extracto control sin enzima (34% p/p) y que los de las otras enzimas (13-17%).
El extracto obtenido con el método de Alcalase® es particularmente rico en Glu, Asp y Leu; destaca el aumento en la recuperación de moles de Tyr (3,7-10,8 veces mayor cantidad que con los demás métodos). El método de Alcalase® permite recuperar hasta 7,2 y 10,8 veces mayor cantidad de moles de Arg y Tyr, respectivamente, y para los demás elementos el de Alcalase® es 2, 6-3, 3 veces superior que el método de la proteasa (Flavourzyme®).
Ejemplo 7
Identificación de biocomponentes de los extractos acuosos por LC ESI-MS MS
Los biocomponentes de los diferentes extractos acuosos separados con disolventes (enzimáticos y control) fueron analizados e identificados mediante LC ESI-MS MS en modo de ionización positiva, mediante la metodología descrita en el ejemplo 1. Las condiciones de obtención de los extractos fueron las determinadas como óptimas: pH 6,5, 1 % v/p y 30°C para Alcalase®, Lipozyme® y Celluclast®; pH 6,0, 1 % v/p y 30°C para Flavourzyme®; pH 7,0, 1 % v/p y 30°C para Ultraflo®; pH 6,5, 2% v/p y 40°C para Vinoflow®; el extracto del control sin enzima se obtuvo añadiendo agua mili-Q a 30°C en lugar de la solución enzimática tamponada y 24h.
Los perfiles cromatográficos obtenidos con trampa Bruker AmaZon del equipo empleado, están representados en la Figura 16, donde se representa la variación de intensidad de señal recibida por el detector (un sistema basado en conversión dinodal (Daly detector)).
Los diferentes cromatogramas indicaron que todos los extractos estaban integrados por un importante número de biocomponentes. También se observó que, todos los sistemas enzimáticos extractivos dieron mayor número y cantidad de biocomponentes en el extracto acuoso que el control no enzimático (Figura 16).
La columna cromatográfica utilizada resuelve por interacción hidrofóbica con los productos, eluyendo a tiempos mayores los de menor polaridad. En el extracto control se observan tres picos que no aparecen en el resto de los extractos: dos bandas estrechas a 46 y 63 min. de intensidad media, y una banda ancha y alta a tiempos de retención altos (66-94 min.; Figura 16). La mayor degradación del material celular observada por TEM en el caso de los extractos enzimáticos comparado con el extracto control (no enzimático) se correspondió con el hecho de que los extractos enzimáticos presentaron mayor número de biocomponentes en el análisis por LC ESI-MS MS, existiendo varias zonas del cromatograma con biocomponentes, que no aparecen en los del extracto control (especialmente la zona de tiempo de elución de 50-70 min., Figura 16). Los distintos extractos enzimáticos presentaron diferentes biocomponentes (Figura 16). La mayor desaparición del material celular observada por TEM en el caso del extracto de Alcalase®, se correspondió con el hecho de que este extracto de Alcalase® presentó mayor número de biocomponentes en el análisis por HPLC-MS- MS, existiendo varias zonas del cromatograma con biocomponentes, que no aparecen en los otros extractos (picos mayoritarios a 53 min., 60 min. y 80 min., Figura 16). El cromatograma de Flavourzyme® presenta picos a tiempos de retención entre 35 y 45 min. inexistentes en los comatogramas del resto de extractos (Figura 16).
Según la Tabla 2, en el extracto de Alcalase® se han detectado 8 péptidos diferentes de los detectados en el resto de extractos (enzimáticos o control). Concretamente tiene al menos 11 familias de péptidos exclusivos, correspondientes a diferentes proteínas de Arthrospira sp. con su correspondiente actividad biológica: MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), (nitrogen regulatory protein P-ll [Arthrospira platensis NIES-39]); LPPL (SEQ ID NO: 2), sin asignación; ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3),(AtpH [Arthrospira platensis HN01]); TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), (ATP synthase c Chain [Arthrospira platensis NIES-39]); DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), (Full=Elongation factor Tu; Short=EF-Tu), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID NO: 8); las tres últimas sin asignación. En una realización todavía más particular, el extracto de la invención comprende los péptidos SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 Tabla 2. -Secuencia peptídica, tiempo de retención (Rt, minutos), masa molecular calculada y experimental (Da), y marca o score de los péptidos identificados en los extractos acuosos de A. platensis utilizando LC ESI-MS MS.
RT Secuencia Peptídica Mr. M. Exp
Extracto Marca
(min.) (Seq. ID:) (Da, Cale.) (Da)
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Ejemplo 8
Determinación de las propiedades bioactivas de los extractos acuosos
Se realizó un estudio comparativo de las propiedades antihipertensiva, anti- hiperlipidémica (anti-hipertriglicerolémica y anti-colesterolémica), y antioxidante de los extractos acuosos enzimáticos y control.
Análisis de la actividad anti-hipertensiva
Los valores de actividad anti-hipertensiva de todos los extractos se resumen en la Tabla 3. El tratamiento con Alcalase® presenta la mayor actividad inhibidora de ACE, siendo 3,7 veces superior a la del extracto control. La posterior extracción con disolventes permite incrementar esta actividad frente al control aún más, hasta 7,3 veces. Tabla 3. - Actividad anti-hipertensiva. Evaluación in vitro de la capacidad inhibidora de ACE (enzima convertidora de angiotensina
_ IC50 A extraída* . .. . .**
Enzima . . .. . .. A/Acontrol**
(mg/ml) (mi)
Alcalase®(proteasa) 0,050±0,006 7,3±0,9 7,3
Flavourzyme®(proteasa) 0,236±0,012 1 ,3±0, 1 1 ,3
Ultraflo® (endoglucanasa) 0,178±0,029 1 ,1 ±0,2 1 ,1
Vinoflow®(exoglucanasa) 0,404±0,029 0,7±0,0 0,6
Celluclast® (celulasa) 0,216±0,019 1 ,2±0, 1 1 ,2
Lipozyme®(lipasa) 0,255±0,054 1 ,1 ±0,2 1 ,0
Control (Sin enzima) 0, 189±0,028 1,0±0,2 1,0
Alcalase® (proteasa)*** 0, 105±0,004 4, 1±0,2 3, 7
Flavourzyme® (proteasa)*** 0,397±0,063 1, 1±0,2 1,0
Control (Sin enzima)*** 0,446±0,052 1, 1 ±0, 1 1,0
*La actividad anti-hipertensiva extraída de 1 gr biomasa, calculada como el producto de la inversa del valor de IC50 por el peso obtenido del correspondiente extracto a partir de 1 gr de espirulina (rendimiento (%)/10 g biomasa extraída).
**Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control
*** Valores de la extracción acuosa de la etapa a), sin emplear disolventes post tratamiento enzimático.
Análisis de la actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la lipasa pancreática
La hiperlipidemia incluye diferentes desórdenes metabólicos que conducen a hipertrigliceridemia y/o hipercolesterolemia en el torrente sanguíneo. A largo plazo, todo esto conduce a complicaciones vasculares (microangiopatía, enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y/o síndrome metabólico).
Todos los extractos enzimáticos presentan una mayor capacidad inhibidora que el extracto control, siendo 35-62 veces superior la de aquellos (Tabla 4). Los dos extractos obtenidos con proteasas (Alcalase® y Flavourzyme®) resultaron tener la mayor actividad inhibidora, que fue similar para ambos extractos. Respecto a los procesos extractivos, los dos procesos de proteasas (Alcalase® y Flavourzyme®) resultaron extraer la mayor actividad inhibidora, siendo 106 y 94 veces superior que la obtenida con el extracto control. Tabla 4. - Actividad inhibidora in vitro de la ¡¡pasa pancreática de cerdo.
A Inhibición Aextracto Aextraída
Enzima yT (AAbs x L/s. g (AAbs x L/s. g A/Acontrol
(Aabs/s)*
' °' extracto) biomasa)
Sin Inhibidor 0,368±0,008
Alcalase®
(proteasa) 0,256±0,007 30,3±1 ,9 0,149±0,019 54,5±6,8 106
Flavourzyme®
0,254±0,008 0,152±0,020 48,3±6,4 94
(proteasa) 31 ,1 ±2,1
Ultraflo®
0,282±0,003 20,7±0,7 0,115±0,013 22,6±2,6 44
(endoglucanasa)
Vinoflow®
0,304±0,009 ,5±2,2 0,085±0,021 22,4±5,6 44
(exoglucanasa) 17
Celluclast® 0,366±0,008 0,5±2 0,002±0,020 0,6±5,2 1
(celulasa)
Lypozime® 0,368±0,008 0,0±4,6 0,000±0,020 0,0±5,4 0
(lipasa)
Control
0,366±0,012 0,5±3,0 0,003±0,011 0,5±2,1 1 (Sin enzima)
* unidades de actividad como incremento de absorbancia por segundo, para 750 mg/l extracto en la cubeta
** Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control
Análisis de actividad anti-hiperlipidémica: inhibición de la enzima colesterol esterasa pancreática Los resultados se presentan como inhibición (%) de la colesterol esterasa pancreática (Tabla 5).
Todos los extractos enzimáticos presentaron mayor actividad inhibidora que el control, siendo la del obtenido con Alcalase 16 veces mayor que la del control y 1 ,1 -3, 5 veces superior a la del resto de extractos enzimáticos. Por cada gramo de biomasa, el método de Alcalase® permite extraer 26 veces más productos hipocolesterolémicos que el control sin enzima. Tabla 5. - Actividad hipocolesterolémica determinada por inhibición de la colesterol esterasa pancreática.
Aextracto A extraída
A Inhibición (AAbs x (AAbs x L/seg A/Acontrol
Enzima
(Aabs/seg)* (%) L/seg. g x g biomasa)
extracto)
Sin Inhibidor 0,515±0, 007
Alcalase®
0,432±0,006 16,0±1 ,2 1 ,1 1 ±0,17 0,404±0,063 26
(proteasa)
Flavourzyme®
0,439±0,008 14,7±1 ,6 1 ,01 ±0,20 0,322±0,064 21
(proteasa)
Ultraflo®
0,491 ±0,006 4,5±1 ,2 0,32±0,17 0,063±0,034
Figure imgf000047_0001
(endoglucanasa)
Vinoflow®
0,452±0,011 12,2±2, 1 0,84±0,24 0,221 ±0,063 14 (exoglucanasa)
Control
0,509±0,006 1 ,0±1 ,2 0,08±0,17 0,015±0, 033 1 (Sin enzima)
* Actividad (A) en unidades de actividad como incremento de absorbancia por segundo para 15 mg/l extracto.
** Relación de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control
Análisis de actividad antioxidante
La actividad antioxidante de los extractos liofilizados se determinó mediante tres métodos distintos: mediante el ensayo ABTS, que mide la capacidad de los compuestos antioxidantes para secuestrar un catión radical estable (ABTS'+), mediante el ensayo ORAC, en el que se determina el secuestro de radicales hidroxilo (ORAC-Fluorescein) Assay), mediante análisis de polifenoles totales por FCR.
A) Métodos ABST Y ORAC
Los resultados de los métodos ABTS y ORAC se expresan mediante el valor TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), que es la concentración de la solución la referencia estándar (Trolox, mM) con capacidad antioxidante equivalente a la de una disolución 1 mM de analito investigado. Los resultados se expresan como mmol Trolox por g extracto. Los resultados obtenidos se recogen en la Tabla 6, donde puede observarse que todos los extractos tienen actividad antioxidante. Es habitual encontrar valores diferentes para diferentes técnicas de capacidad antioxidante y por eso se expresan en TEAC, como ocurre en este caso. Es uno de los motivos por lo que se recomienda realizar la medición de la capacidad antioxidante por más de un método. Por los dos métodos utilizados, los extractos tienen actividad antioxidante, y el proceso de Alcalase® permite extraer más actividad antioxidante que el control. Por el método ORAC, los extractos de Alcalase® y Ultraflo® presentan superiores valores de actividad antioxidante que el resto. En el proceso de Alcalase®, por cada gramo de espirulina se extrae superior valor de actividad de antioxidante que con los demás procesos por el método ORAC, siendo éste 4,4 veces mayor que la cantidad obtenida con el proceso control, y 1 ,6 veces mayor que con la otra proteasa. La capacidad antioxidante extraída con Alcalase®, determinada por el método ABTS, resultó ser 1 ,5 veces mayor que la obtenida con la extracción control, y 1 ,4 veces mayor a la de Flavourzyme®. Tabla 6. - Actividad Antioxidante determinada por los métodos ABTS and ORAC.
ABTS ORAC
Figure imgf000048_0001
Enzima
TEAC TEAC TEAC TEAC
(mihoI/g (mihoI/g (mihoI/g (mihoI/g extracto Biomasa) extracto Biomasa) liofilizado) liofilizado)
Figure imgf000048_0002
19,7±0,5 7,19±0, 18 1 ,5 462±19 169±7 4,4
(proteasa)
Flavourzyme
15,5±0,5 4,93±0,16 1 ,0 325±14 107±4 2,8
(proteasa)
Ultraflo®
24, 1 ±0,6 4,75±0,12 1 o 269±12 53±2 1 4
(endoglucanasa)
Vinoflow
16,4±0,6 4,31 ±0,16 0,9 260±5 68±1 1 ,8
(exoglucanasa)
Celluclast 31 ,5±0,8 8,22±0,22 1 ,7 Lipozyme 28,7±0,4 7,75±0, 10 1 Q
Control (Sin
23,4±0,9 4,78±0,12 1 o 199±16 38±3 1 o enzima)
*Valores de la cinética obtenidos a los 180 min.
** Ratio de unidades de actividad extraídas con cada método enzimático y con el control sin enzima
B) Determinación del contenido total de polifenoles.
Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu (FCT) descrito en el ejemplo 1 , que determina contenido en polifenoles y otros antioxidantes. Los resultados mostrados en la Tabla 7 indican que todos los métodos enzimáticos aumentan la capacidad de recuperación de polifenoles. A partir de cada gramo de espirulina, con Alcalase® se obtiene 2,3 veces más peso de polifenoles que el del control y 1 , 4-2,1 veces más que con las demás enzimas (1 ,12 veces más que con Flavourzyme).
Tabla 7. - Polifenoles recuperados en los distintos procesos extractivos
Polifenoles Polifenoles
Figure imgf000049_0001
Enzima
(mg /g extracto) (mg /g biomasa)
Alcalase® (proteasa) 12, 1 ±0, 1 4,16±0,23 2,3 Flavourzyme® (proteasa) 9,3±0,0 2,95±0,01 1 ,6 Celluclast® (celulasa) 8,2±0, 1 2,15±0,02 1 ,2 Ultraflo® (endoglucanasa) 1 1 ,0±0, 1 2,16±0,02 1 ,2 Vinoflow® (exoglucanasa) 8,0±0, 1 2,11±0,04 1 , 1 Lipozyme® (lipasa) 7,3±0,1 1 ,98±0,03 1 , 1 Control 9,6±0,0 1 ,84±0,01 1 ,0
* Ratio del peso de polifenoles extraído por gramo de espirulina con cada método enzimático y con el método control sin enzima Determinación del contenido total de carbohidratos
El contenido en carbohidratos totales de los extractos acuosos liofilizados se determinó el método fenol-sulfúrico descrito en el ejemplo 1. Los resultados mostrados en la Tabla 8 indican que Flavourzyme® es la enzima que permite extraer mayor cantidad de carbohidratos. A partir de cada gramo de biomasa con esta enzima se extraen 2,1 y 1 ,6 veces más carbohidratos que con el proceso control y con Alcalase®, respectivamente. El de Alcalase® extrae 1 ,3 veces más carbohidratos que el control.
Tabla 8. - Carbohidratos recuperados en los distintos procesos extractivos.
Carbohidratos Carbohidratos
Enzima
Figure imgf000050_0001
(mg / g extracto) (mg / g biomasa)
Alcalase® (proteasa) 226,3±13,0 82,6±4,7 1 ,3 Flavourzyme® (proteasa) 425,5±25,7 135,3±8,2 2,1 Celluclast® (celulasa) 308,2±13,9 80,4±3,6 1 ,2 Ultraflo® (endoglucanasa) 122,0±17,7 24,0±3,5 0,4 Vinoflow® (exoglucanasa) 337,0±4,2 88,6±1 ,1 1 ,4 Lipozyme® (lipasa) 327,6±7,8 88,4±2,1 1 ,4 Control 337,0±43,8 64,6±8,4 1 ,0
* Ratio del peso de carbohidratos extraídos por gramo de espirulina con cada método enzimático y con el método control sin enzima

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para la obtención de un extracto de Arthrospira sp. caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) incubar la biomasa de Arthrospira sp. en agua o en una solución acuosa tamponada a un pH de entre 3 y 14 en presencia de la enzima serina endopeptidasa; y
b) separar la biomasa de la solución obtenida en la etapa a) para obtener el extracto.
2. Método según la reivindicación 1 , en donde el método comprende una etapa adicional que comprende la adición de un disolvente orgánico de extracción entre las etapas a) y b).
3. Método según la reivindicación 2, donde el disolvente orgánico es hexano, isopropanol o una mezcla de ambos.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el extracto obtenido en la etapa b) comprende la fase acuosa o la fase oleosa de la solución obtenida en a).
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Arthrospira sp. es A. platensis o A. máxima.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de 30°C.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la solución acuosa de la etapa (a) se encuentra a un pH de 6,5.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la carga enzimática en la disolución de la etapa (a) es 1% v/p.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde tras la etapa (b) se lleva a cabo la separación de las fases acuosa, oleosa y biomasa residual, mediante centrifugación o decantación.
10. Extracto de Arthrospira sp. obtenido mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Extracto según la reivindicación 10, donde dicho extracto comprende al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 péptidos seleccionados de la lista que consiste en MKKIEAIIRPF (SEQ ID NO: 1), LPPL (SEQ ID NO: 2), ALAVGIGSIGPGLGQGQ (SEQ ID NO: 3), TTAASVIAAAL (SEQ ID NO: 4), DFPGDDIPIVS (SEQ ID NO: 5), LELL (SEQ ID NO: 6), WKLLP (SEQ ID NO: 7) y CHLLLSM(+15.99) (SEQ ID NO: 8).
12. Composición farmacéutica, alimentaria o cosmética que comprende un extracto según la reivindicación 10 u 11 y, opcionalmente, comprende además al menos un excipiente o vehículo farmacéutica, alimentaria o cosméticamente aceptable, respectivamente.
13. Un extracto según cualquiera de la reivindicación 10 u 11 para su uso como medicamento.
14. Extracto según la reivindicación 10 u 11 para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en hipertensión, anemia, desnutrición, hiperlipidemia, obesidad y diabetes.
15. Extracto según la reivindicación 10 u 11 , o la composición según la reivindicación 12, para su uso como un agente anti-hipertensivo o anti-hiperlipidemico.
16. Extracto según la reivindicaciónlO u 11 , o la composición según la reivindicación 12, para su uso como un agente antioxidante.
17. Uso del extracto según la reivindicación 10 u 11 , o la composición según la reivindicación 12, para preparar un concentrado proteico de fácil asimilación.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007297327A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Dainippon Ink & Chem Inc アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1187728B (it) * 1985-08-09 1987-12-23 O R A I Italia Spa Procedimento per la produzione di un integratore alimentare proteicolvitaminico da microorganismi autotrofi,in particolare da alga spirulina
FR2857978B1 (fr) * 2003-07-25 2006-10-27 Simer Laboratoires Science Et Extrait peptidique de spiruline et son procede d'obtention, qui permet d'ameliorer les performances biologiques d'un extrait proteique de spiruline
DE102011107307A1 (de) * 2011-07-06 2013-01-10 Ocean Research & Development Gmbh Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutisch wirksamen Extrakts aus Arthrospira spec.
CN107674905A (zh) * 2017-11-02 2018-02-09 林峰 螺旋藻活性肽、组合物及制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007297327A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Dainippon Ink & Chem Inc アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALZAHRANI M. ET AL.: "Production of bioactive proteins and peptides from the diatom Nitzschia laevis and comparison of their in vitro antioxidant activities with those from Spirulina platensis and Chlorella vulgaris", INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 53, 16 October 2017 (2017-10-16), pages 676 - 682 *
HE H-L. ET AL.: "High throughput and rapid screening of marine protein hydrolysates enriched in peptides with angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity by capillary electrophoresis", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 98, 2007, pages 3499 - 3505, XP022226415, DOI: 10.1016/j.biortech.2006.11.036 *
HWANG J. H. ET AL.: "Spirulina prevents memory dysfunction, reduces oxidative stress damage and augments antioxidant activity in senescence-accelerated mice", J NUTR SCI VITAMINOL ( TOKYO, vol. 57, no. 2, 2011, pages 186 - 191, XP055663600 *
LU J. ET AL.: "Isolation of an Antihypertensive Peptide from Alcalase Digest of Spirulina platensis", J. AGRIC. FOOD CHEM, vol. 58, 2010, pages 7166 - 7171, XP055663602 *
VERDASCO-MARTIN C. M. ET AL.: "Advantageous Preparation of Digested Proteic Extracts from Spirulina platensis Biomass", CATALYSTS, vol. 9, no. 2, 2 February 2019 (2019-02-02), pages 145 *

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