WO2019225920A1 - 톨-유사 수용체 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물 tac5 시리즈 - Google Patents

톨-유사 수용체 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물 tac5 시리즈 Download PDF

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tlr7
compound
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최상돈
김은하
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms

Definitions

  • the present invention relates to an antagonistic small molecule compound having a Toll-like receptor (TLR) 3/7/8/9 inhibitory function, and more particularly, a toll-like receptor 3/7/8/9 signal.
  • TLR Toll-like receptor
  • Novel small molecule compounds, derivatives thereof, and compositions for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases comprising the same, and methods for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases using the same.
  • Intrinsic (or innate) immunity is the first defense against bacterial infection in the mammalian immune system.
  • Pattern recognition receptors such as Toll-like receptors
  • TLR1 / 2 eg Pam3CSK4
  • DAMP damage-associated molecular pattern
  • TLR1 / 2 eg Pam3CSK4
  • TLR2 / 6 eg Pam2CSK4
  • TLR2 / 6 eg Pam2CSK4
  • LPS lipopolysaccharide
  • TLR4 Polytorak, A., et al., Science 282: 2085-2088
  • bacterial flagellin by TLR5
  • dsRNA viral double stranded RNA
  • TLR3 Polytorak, A., et. al., Science 282: 2085-2088
  • ssRNA viral single stranded RNA
  • TLRs play an important role in endogenous immune responses (Akira, S. & Takeda, K. Nat Rev Immunol 4, 499-511) and act on plasma membranes including TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 and TLR11
  • TLRs can be divided into TLRs and intracellular TLRs that function in cells such as endosomes, including TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9.
  • the TLR has a leucine-rich repeat (LRR) site that is recognized by a ligand or an accessory molecule at the N-terminus of the extracellular domain and signals at the C-terminus of the intracellular portion. It has a Toll / interleukin 1 receptor (TIR) domain to deliver.
  • LRR leucine-rich repeat
  • TIR Toll / interleukin 1 receptor
  • TLR7, TLR8, TLR9 and TLR3 can detect exogenous ssRNA (single stranded RNA), dsRNA (double stranded RNA), CpG DNA, etc., which are exposed to endosomes from chip particles outside the cell, or cells in tissues caused by abnormal reactions. Endogenous ssRNA or DNA fragments exposed from tissues damaged by necrosis or apoptosis are recognized as ligands and amplified inflammatory cytokines through signaling.
  • TLR7 and TLR8 recognize ssRNA from influenza or damaged cells
  • TLR9 detects fragments of CpG DNA generated from genomes or damaged tissue of bacteria and viruses
  • TLR3 recognizes dsRNA, an intermediate of viral growth. Activate the innate immune response. Due to the role of TLRs, researches for using TLRs as targets for treating immune-related diseases have been actively conducted worldwide.
  • MyD88 myeloid differentiation primary response 88 dependent signaling of TLR7 / 8/9 forms a dimer by the corresponding ligand and forms a complex by combining the TIR domain of TLR and the TIR domain of MyD88 to form a signaling pathway.
  • the activated TLR signal induces NF- ⁇ B activation and migration to the nucleus, MAPK activation and interferon ⁇ (interferon ⁇ ; IFN ⁇ ) and IFN-inducible genes are expressed.
  • TLR3 TIR domain-containing adapter-inducing interferon- ⁇
  • type 1 interferon IRF
  • IRF interferon-regulatory factor
  • TLRs in the endosome membranes are important for protecting the host from various viral and bacterial infections.
  • expression of TLRs 7, 8 and 9 is essential for the ongoing defense against pathogenic components or self antigens released from damaged or stressed tissues / cells (Demaria, O., et al., J Clin Invest 120: 3651). -3662 (2010)).
  • These malfunctions of nucleic acid-sensing TLRs are associated with several autoimmune pathologies, such as psoriasis and systemic lupus erythematosus (SLE) (Vincent, FB et al., Nat Rev Rheumatol 10: 365-373 (2014)). have.
  • TLR may be a target for treating various diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases and cancer
  • diseases related to TLRs are being actively conducted.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a substance targeting TLR and a medical composition for treating a disease related to TLR.
  • the present inventors have described a novel method including TAC5 (TLR antagonistic compound 5), a derivative thereof TAC5-a or TAC5-c
  • TAC5 TLR antagonistic compound 5
  • the compounds inhibit TLR signaling pathways induced by TLR7, TLR8, TLR9, or TLR3 activation to inhibit the secretion of cytokines (IL6, TNF ⁇ , IFN ⁇ ), NO and ROS, and overactivation of NF- ⁇ B and MAPK, as well as
  • the lupus mouse model [MRL / Fas lpr / lpr ] has been shown to treat skin erythema and lupus nephritis and to reduce inflammatory cytokines to mitigate the inflammatory response, thus completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide an antagonistic small molecule compound having a toll-like receptor 3/7/8/9 inhibitory function and a TLR7, TLR8, TLR9 and TLR3 inhibitor comprising the same.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising the compound as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the compound as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to administer to a subject in need thereof a composition for preventing or treating an autoimmune disease or inflammatory disease comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient. It provides a method for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt.
  • L is a single bond, substituted or unsubstituted linear or branched alkylene, cycloalkylene, haloalkylene, arylene, heteroalkylene, heteroarylene, arylenealkylene, alkylene arylene, Alkyleneheteroarylene, heteroarylenealkylene, alkylene ester or alkylene amide, wherein alkylene is C 2-30 , cycloalkylene is C 3-30 , arylene is C 6-30 , hetero Alkylene, heteroarylene or heteroarylene contains heteroatoms selected from fluorine, oxygen, sulfur and nitrogen,
  • R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently a hydrogen atom, a straight or branched chain alkyl of C 1 to C 6, amino, -NR 3 R 4 , wherein R 3 and R 4 are the same as or different from each other and independently Substituted with a hydrogen atom, alkyl, cycloalkyl or aryl), hydroxy, halogen, nitrile group, nitro group, cycloalkyl, haloalkyl, allyl, alkoxy, alkylcarbonyl, cycloalkylcarbonyl, arylcarbonyl, alkylaryl Carbonyl, alkoxycarbonyl, cycloalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocycloalkyl, aryloxy, alkoxyheteroaryl, heteroaryloxyalkyl, alkylheteroaryl, alkylaryl, arylalkyl, alkylesters, alkyl, cycloalkyl
  • the present invention also provides a method for preparing a compound represented by Formula 1-1, comprising the following steps:
  • the present invention also provides 3- (benzyloxy)-by reacting bromobenzene with a solution in which 2-amino-3-benzyloxypyridine, copper iodide (I), potassium carbonate and N, N'-dimethylethylenediamine are dissolved.
  • a method for preparing a compound represented by Chemical Formula 1-3 including synthesizing N-phenylpyridin-2-amine.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases containing the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • the present invention also provides an autoimmune agent comprising administering a composition for preventing or treating an autoimmune disease or an inflammatory disease comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • a composition for preventing or treating an autoimmune disease or an inflammatory disease comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient to an individual in need thereof.
  • the present invention also provides a use of the composition for the prevention or treatment of an autoimmune disease or an inflammatory disease comprising the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient in the prevention or treatment of an autoimmune disease or an inflammatory disease. .
  • 1 is a flow chart of the screening of a QSAR model according to the present invention.
  • TAC5 tumor necrosis factor ⁇
  • FIG. 3 is a view confirming the effect of TAC5 on NF- ⁇ B and MAPK activity according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the inhibitory effect of TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d and TAC5-e on the TLR signal transduction pathway according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram confirming the protective effect of TAC5-a in the psoriasis mouse model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram confirming the protective effect of TAC5-a in a systemic lupus erythematosus mouse model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 illustrates a structural model of TAC5-a coupled to TLR7 and TLR8 according to an embodiment of the present invention.
  • a novel compound comprising TAC5, its derivative TAC5-a or TAC5-c inhibits the TLR signaling pathway induced by TLR7, TLR8, TLR9 or TLR3 activation, thereby inhibiting cytokines (IL6, TNF ⁇ , IFN ⁇ ), NO And inhibition of ROS secretion and overactivation of NF- ⁇ B and MAPK, as well as the treatment of cutaneous erythema and lupus nephritis in the lupus mouse model [MRL / Fas lpr / lpr ] and the effects of inflammatory cytokine reduction (mitigation of inflammation) The effect of the treatment was confirmed in the mouse model of psoriasis.
  • the present invention relates to a compound represented by the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt in one aspect.
  • L is a single bond, substituted or unsubstituted linear or branched alkylene, cycloalkylene, haloalkylene, arylene, heteroalkylene, heteroarylene, arylenealkylene, alkylene arylene, Alkyleneheteroarylene, heteroarylenealkylene, alkylene ester or alkylene amide, wherein alkylene is C 2-30 , cycloalkylene is C 3-30 , arylene is C 6-30 , hetero Alkylene or heteroarylene contains heteroatoms selected from fluorine, oxygen, sulfur and nitrogen,
  • substituent is C 1-30 alkyl, C 3-30 cycloalkyl, C 1-30 alkylester, C 1-30 alkylamide, —CH 2 OCH 2 CH 3 and —CH 2 OCH 2 CH 2 NR 5 R 6 (where R 5 and R 6 are the same as or different from each other and independently may be selected from a hydrogen atom, C 1-30 alkyl, C 3-30 cycloalkyl or C 6-30 aryl), but is not limited thereto.
  • R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently a hydrogen atom, a straight or branched chain alkyl, amino, —NR 3 R 4 , wherein R 3 and R 4 are the same as or different from each other, and independently a hydrogen atom, alkyl , Substituted with cycloalkyl or aryl), hydroxy, halogen, nitrile group, nitro group, cycloalkyl, haloalkyl, allyl, alkoxy, alkylcarbonyl, cycloalkylcarbonyl, arylcarbonyl, alkylarylcarbonyl, alkoxy Carbonyl, cycloalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocycloalkyl, aryloxy, alkoxyheteroaryl, heteroaryloxyalkyl, alkylheteroaryl, alkylaryl, arylalkyl, alkylheteroaryl, alkylaryl, arylal
  • the present invention provides 3- (benzyloxy) by reacting bromobenzene with a solution in which 2-amino-3-benzyloxypyridine, copper iodide (I), potassium carbonate, and N, N'-dimethylethylenediamine are dissolved.
  • the present invention relates to a method for preparing a compound represented by Chemical Formula 1-3 including synthesizing) -N-phenylpyridin-2-amine.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases, containing the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • the present invention provides a small molecule compound TAC5 (TLR antagonistic compound 5) that inhibits TLR7, TLR8, TLR9 and TLR3 signaling pathways and novel derivatives thereof, TAC5-a and TAC5-c, and a method for preparing the compound and the compound It provides a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases or inflammatory diseases including systemic lupus erythematosus, psoriasis, skin rash, photosensitive, arthritis, oral ulcer, nephritis, thrombocytopenia, vasculitis, meningitis.
  • autoimmune diseases or inflammatory diseases including systemic lupus erythematosus, psoriasis, skin rash, photosensitive, arthritis, oral ulcer, nephritis, thrombocytopenia, vasculitis, meningitis.
  • TLR7 agonist Ie IMQ (TLR7 agonist), CL075 (TLR7 / 8 agonist), R848 (TLR7 / 8 agonist), TL8 (TLR8 agonist), CpG ODN (TLR9 agonist), or poly (I: C) (TLR3 agonist) Induced TNF ⁇ (tumor necrosis factor ⁇ ) secretion, NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell) activity, MAPKs (mitogen-activated protein kinases: p38, c-Jun N-terminal kinase and small molecule compounds that block the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase, as well as inhibit the production of inflammatory cytokines, including IL-6 (interleukin 6), systemic lupus erythematosus containing the compound, psoriasis, skin rash, photosensitivity, arthritis,
  • the present invention
  • the present invention provides a compound represented by the formula (TAC5) or a pharmaceutically acceptable salt.
  • L is a single bond, substituted or unsubstituted linear or branched alkylene, cycloalkylene, haloalkylene, arylene, heteroalkylene, heteroarylene, arylenealkylene, alkylene arylene, Alkyleneheteroarylene, heteroarylenealkylene, alkylene ester or alkylene amide, wherein alkylene is C 2-30 , cycloalkylene is C 3-30 , arylene is C 6-30 , hetero Alkylene or heteroarylene is a divalent radical containing a heteroatom selected from fluorine, oxygen, sulfur and nitrogen,
  • R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently a hydrogen atom, a straight or branched chain alkyl, amino, —NR 3 R 4 , wherein R 3 and R 4 are the same as or different from each other, and independently a hydrogen atom, alkyl , Substituted with cycloalkyl or aryl), hydroxy, halogen, nitrile group, nitro group, cycloalkyl, haloalkyl, allyl, alkoxy, alkylcarbonyl, cycloalkylcarbonyl, arylcarbonyl, alkylarylcarbonyl, alkoxy Carbonyl, cycloalkoxy, aryl, heteroaryl, heterocycloalkyl, aryloxy, alkoxyheteroaryl, heteroaryloxyalkyl, alkylheteroaryl, alkylaryl, arylalkyl, alkylheteroaryl, alkylaryl, arylal
  • L, R 1 and R 2 are a combination of substituents as shown in Table 1 below.
  • the present invention is formula 1-1 (TAC5-a), formula 1-2 (TAC5-b), formula 1-3 (TAC5-c), formula 1-4 (TAC5-d), formula 1-5 ( TAC5-e), Formula 1-6 (TAC5-f), Formula 1-7 (TAC5-g), Formula 1-8 (TAC5-h) and Formula 1-9 (TAC5-e-1)
  • Particularly preferred are Formula 1-1 (TAC5-a) and Formula 1-3 (TAC5-c), but are not limited thereto.
  • TAC5 its derivatives TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d or TAC5-e may be prepared according to chemical synthesis methods known in the art and may be synthesized in detail as described above.
  • 3- (benzyl) by reacting bromobenzene with a solution in which 2-amino-3-benzyloxypyridine, copper iodide (I), potassium carbonate, N, N'-dimethylethylenediamine is dissolved
  • a method for preparing a compound represented by Chemical Formula 1-3 including synthesizing oxy) -N-phenylpyridin-2-amine.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases containing the compound or a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • the autoimmune disease or inflammatory disease is psoriasis, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, skin rash, photosensitivity, arthritis, oral ulcer, nephritis, cytopenia, vasculitis, meningitis, inflammatory bowel disease (IBD) , Diabetes, multiple sclerosis, sclerosis and pemphigus, atopic dermatitis, arthritis, urethritis, cystitis, arteriosclerosis, allergic diseases, rhinitis, asthma, acute pain, chronic pain, periodontitis, gingivitis, gout, myocardial infarction, congestive Heart disease, hypertension, angina pectoris, stomach ulcer, cerebral infarction, Down syndrome, multiple sclerosis, obesity, diabetes, dementia, depression, schizophrenia, tuberculosis, sleep disorders, sepsis, burns, pancreatitis, Parkinson's disease and stroke have.
  • SLE systemic lupus ery
  • composition for preventing or treating autoimmune diseases or inflammatory diseases may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • C 1-30 alkyl means a monovalent linear or branched saturated hydrocarbon moiety consisting only of carbon and hydrogen atoms, having 1 to 30 carbon atoms.
  • alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, secondary-butyl, tert-butyl and the like.
  • branched alkyl include isopropyl, isobutyl, tert-butyl and the like.
  • C 1-30 alkoxy refers to the formula -OC 1-30 alkyl, including but not limited to, for example, methoxy, ethoxy, isopropoxy, tert-butoxy and the like.
  • halo include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br) and iodine (I).
  • C 6-30 aryl includes at least one ring having a shared pi electron system, for example monocyclic or fused polycyclic (ie rings that divide adjacent pairs of carbon atoms). Include a group. That is, aryl in the present specification may include aryl, phenyl, naphthyl and the like unless otherwise defined. In one embodiment of the present invention aryl refers to an aromatic ring having 6 to 30 carbon atoms.
  • C 3-30 cyclic alkyl means a cyclic saturated hydrocarbon moiety consisting of only carbon and hydrogen atoms, having from 5 to 6 carbon atoms.
  • Examples of such cyclic alkyl groups include, but are not limited to, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like.
  • heteroaryl is an aromatic ring of 5 or 6 ring atoms containing 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S, unless otherwise defined, or the heteroaryl ring is a benzene ring or It refers to a bicyclic ring fused to another heteroaryl ring.
  • Examples of monocyclic heteroaryls include thiazolyl, oxazolyl, thiophenyl, furanyl, pyrrolyl, imidazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, pyrazolyl, triazolyl, triazinyl, thiazolyl, tetrazolyl , But not limited to, oxadiazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, and the like.
  • bicyclic heteroaryls examples include indolyl, azaindoleyl, indolinyl, benzothiophenyl, benzofuranyl, benzimidazolyl, benzooxazolyl, benzisoxazolyl, benzthiazolyl, benzthiadiazolyl, benztria Jolyl, quinolinyl, isoquinolinyl, purinyl, furypyridinyl, and the like, but are not limited to these.
  • heterocycloalkyl denotes a saturated or partially unsaturated carbocyclic ring having 5 to 9 ring atoms containing from 1 to 3 heteroatoms selected from N, O and S in addition to carbon atoms.
  • heterocyclyl may be azetidinyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydro-thienyl, pyrazolidinyl, imidazolidinyl, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, thiazolidinyl, pipepe Ridinyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, 1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl, azepanyl, diazepanyl, arc Morpherazinyl, oxazpanyl, dihydro
  • TLR7 refers to a protein belonging to Toll-like receptors (TLRs; toll-like receptors), a family of transmembrane proteins that function as a monitor for pathogen infection. It is also called UNQ248 / PRO285.
  • TLR7 recognizes ssRNA (single stranded RNA) of RNA virus, or synthetic small molecules imidazoquinoline, loxoribine, bropirimine and activates the innate immune system.
  • TLR8 refers to a protein belonging to TLR, a transmembrane protein family that functions as a monitor for pathogen infection, and refers to a protein encoded by the TLR8 gene, which is CD288 (cluster of differentiation 288) or UNQ249. Also called / PRO286.
  • the TLR8 is activated by single-stranded viral RNA, phagocytized bacterial RNA introduced into the cell by phagocytosis, or synthetic small molecule TL8.
  • TLR9 refers to a protein that belongs to TLR, a transmembrane protein family that functions as a monitor for pathogen infection, and refers to a protein encoded by the TLR9 gene, also referred to as CD289 or UNQ5798 / PRO19605. .
  • the TLR9 recognizes unmethylated CpG oligodeoxynucleotide DNA of bacteria or DNA viruses to activate the innate immune system.
  • TLR3 refers to a protein belonging to the TLR, a transmembrane protein family that functions as a monitor for pathogen infection, and refers to a protein encoded by the TLR3 gene, also referred to as CD283 or IIAE2.
  • the TLR3 recognizes the double-stranded RNA (dsRNA) and poly I: C of the virus, which is very important for activation of the endogenous immune system.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • poly I C of the virus
  • TLR signaling pathway refers to a signaling pathway through TLR, and is a complex formed by TLR and adapter protein MyD88 (for TLR7 / 8/9) or TLR and adapter protein TRIF (for TTL3). It can be a response that depends on which signal is transmitted. Activated TLR7 / 8/9 activates NF- ⁇ B to the nucleus through Myd88-dependent signaling, leading to the activation of MAPK.
  • TNF ⁇ inflammatory cytokines
  • IL1 ⁇ IL6
  • ROS free radicals
  • TLR3 also induces MyD88-independent signaling by the activation of TRIF, interferon-regulator (IRF), and NF- ⁇ B to secrete type 1 interferon.
  • TIR domain refers to a domain for intracellular signaling, which has three highly conserved regions and mediates the interaction between TLRs and other signaling molecules. In the activated response, the TIR domain induces binding to MyD88 or TRIF and activates the TLR signaling pathway.
  • the term “inhibition” refers to a phenomenon in which biological activity or signaling activity is deteriorated due to deficiency, incompatibility, and many other causes, and partially, completely blocks, reduces, prevents, or activates TLR activity. May be delayed, inactivated or down regulated.
  • the present invention relates to the TLR7, TLR8, TLR9 or TLR3 signaling pathways of small molecule compounds represented by TAC5, TAC5-a or TAC5-c and their downstream signal molecules, such as BAFF (B cell-activating factor of the TNF family).
  • BAFF B cell-activating factor of the TNF family.
  • the compound represented by TAC5, its derivative TAC5-a or TAC5-c inhibits the TLR signaling pathway induced by TLR7, TLR8, TLR9 or TLR3 activation to inhibit cytokines (IL6, TNF ⁇ ).
  • IFN ⁇ IFN ⁇
  • NF- ⁇ B and MAPK NF- ⁇ B and MAPK
  • it can be usefully used as a composition for preventing or treating autoimmune diseases and inflammatory diseases caused by TLR7, TLR8, TLR9 or TLR3 activation.
  • the present invention also provides TLR7, TLR8, TLR9 and / or TLR3 inhibitors comprising the compounds.
  • inhibitor refers to a molecule that, by any mechanism, partially or completely inhibits the effects of other molecules, such as receptors or intracellular mediators.
  • TLR7, TLR8, TLR9 and / or TLR3 inhibitor refers to a substance that can directly, indirectly, or substantially interfere with, reduce or inhibit the biological activity of TLR7, TLR8, TLR9 and / or TLR3.
  • the TLR7, TLR8, TLR9 and / or TLR3 signaling pathways are blocked by binding to TLR7, TLR8, TLR9 and / or TLR3 receptors and neutralizing their activity, thereby blocking NF- ⁇ B and MAPK and inflammatory cytokines, NO And it refers to a substance that can reduce the secretion of ROS.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising the compound as an active ingredient.
  • autoimmune disease is caused by a process in which a problem occurs in inducing or maintaining self-tolerance to cause an immune response to an autoantigen, thereby attacking its own tissue.
  • self-tolerance refers to immunologic unresponsiveness, which does not deleteriously react with antigens that make up self. Diseases caused by breakdown of self-resistance that allow them to respond and mediate cellular and tissue damage.
  • autoimmune diseases are characterized at least in part as a result of a humoral immune response.
  • Autoimmune diseases of the present invention include systemic lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, autoimmune arthritis, myasthenia gravis, thyroiditis, experimental form of uveitis, Hashimoto thyroiditis, primary myxedema, thyroid poisoning, Pernicious anemia, autoimmune atrophy, gastritis, Addison's disease, early menopause, male infertility, childhood diabetes, Goodpasture syndrome, common swelling, ileal swelling, sympathetic ophthalmitis, lens uveitis, autoimmune hemolytic anemia, idiopathic leukocyte reduction, primary bile duct Sclerosis, chronic active hepatitis Hbs-ve, latent cirrhosis, ulcerative colitis, Sjogren's syndrome, scleroderma, Wegener's granulomatosis, polymyositis / skin myos
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, acute disseminated encephalomyelitis (ADEM), acute necrotic hemorrhagic leukoencephalitis, Addison's disease, agammaglobulinemia, allergic asthma, allergic rhinitis, alopecia areata, amyloidosis, ankylosing spondylitis , Antibody mediated graft rejection, anti-GBM / anti-TBM nephritis, antiphospholipid antibody syndrome (APS), autoimmune angioedema, autoimmune aplastic anemia, autoimmune autonomic dysplasia, autoimmune hepatitis, autoimmune hyperlipidemia, autoimmune Immune immunodeficiency syndrome, autoimmune internal disease (AIED), autoimmune myocarditis, autoimmune pancreatitis, autoimmune diabetic retinopathy, autoimmune thrombocytopenic purpura (ATP), autoimmune thyroid disease, autoimmune urticaria, axon and neuronal
  • composition for preventing or treating autoimmune diseases of the present invention may include a pharmaceutically effective amount of the compound alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of the autoimmune disease.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and, when administered to a human, typically does not cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • composition of the present invention may include one or more known active ingredients having an autoimmune disease treatment effect with the compound.
  • compositions of the present invention can be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to mammals other than humans.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • compositions of the present invention can be administered via a variety of routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the active ingredient depends on a number of factors including the route of administration, the age, sex, weight and severity of the patient.
  • the composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases can be administered in parallel with known compounds having the effect of preventing, ameliorating or treating the symptoms of autoimmune diseases.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the compound as an active ingredient.
  • the term "inflammatory disease” refers to TNF ⁇ , IL1, IL6, prostaglandin (prostaglandin), rucot, which are secreted from immune cells such as macrophages by excessively promoting the immune system due to harmful stimuli such as inflammation-inducing factors or irradiation. It refers to a disease caused by inflammatory agents (inflammatory cytokines) such as leukotriene or NO.
  • An "inflammatory disease” can be an acute or chronic inflammatory condition and can arise from an infectious or non-infectious cause.
  • Inflammatory diseases of the present invention include psoriasis, asthma, eczema, allergy, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, contact dermatitis, atopic dermatitis, acne, atopic rhinitis, allergic dermatitis, chronic sinusitis, seborrheic Dermatitis (seborrheic dermatitis), gastritis, gout, gout arthritis, ulcers, chronic bronchitis, pulmonary inflammation, Crohn's disease, ulcerative colitis, ankylosing spondylitis, sepsis, vasculitis, bursitis, lupus, rheumatoid polymyalgia, temporal arthritis , Multiple sclerosis, solid cancer, Alzheimer's disease, arteriosclerosis, obesity, and viral infections.
  • inflammatory diseases include, but are not limited to, atherosclerosis, arteriosclerosis, autoimmune disorders, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, multiple muscle pain rheumatoid (PMR), gouty arthritis, degenerative arthritis, tendinitis, bursitis, psoriasis, Cystic fibrosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, inflammatory arthritis, Sjogren's syndrome, giant cell arteritis, progressive systemic sclerosis (scalposis), ankylosing spondylitis, polymyositis, dermal myositis, swelling, stool, diabetes mellitus (e.g.
  • Type I Myasthenia gravis, Hashimoto's thyroiditis, Graves' disease, Goodpasture disease, mixed connective tissue disease, sclerotic cholangitis, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, pernicious anemia, inflammatory skin disease, common interstitial pneumonia (UIP), asbestos disease , Silicosis, bronchiectasis, beryllium poisoning, talc, pneumoconiosis, sarcoidosis, exfoliative interstitial pneumonia, lymphocytic interstitial pneumonia, giant cell interstitial pneumonia, cell interstitial Pneumonia, exogenous allergic alveolitis, Wegener's granulomatosis and vasculitis-associated forms (temporal arthritis and nodular polyarteritis), inflammatory skin disease, hepatitis, delayed hypersensitivity reactions (eg lacquer poisoning), pneumonia, airway inflammation, adult respiratory distress syndrome (ARDS), encephalitis, immediate hypersensitivity reactions,
  • the inflammatory disease is selected from the group consisting of atherosclerosis, arteriosclerosis, autoimmune disorders, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, inflammatory arthritis, and myocarditis.
  • treatment means stopping or delaying the progression of the disease when used in a subject with symptoms of onset.
  • composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, or combination thereof as needed with the compound of the present invention.
  • pharmaceutically acceptable means a property that does not impair the biological activity and physical properties of the compound.
  • carrier refers to a substance that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue.
  • liquid is defined as a substance that not only stabilizes the biologically active form of a compound of interest, but also is diluted in water to dissolve the compound.
  • composition for preventing or treating the inflammatory disease includes a pharmaceutical agent comprising the above-described compound as an active ingredient
  • the contents overlapped with the above-described composition of the present invention are excessive in this specification due to the description of the overlapping contents. The description is omitted in order to avoid complexity.
  • the present invention provides a method for preventing or treating autoimmune diseases, including the step of administering to a subject a compound represented by TAC5, TAC5-a or TAC5-c.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering a compound represented by TAC5, TAC5-a or TAC5-c to a subject.
  • the composition containing a compound represented by TAC5, TAC5-a or TAC5-c may further include a suitable carrier, excipient or diluent according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition containing the compound represented by TAC5, TAC5-a or TAC5-c of the present invention may be prepared according to a conventional method for powders, pills, granules, capsules, suspensions, solvents, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, and non-aqueous solutions. , Suspensions, lyophilizers and suppositories.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose ( It is prepared by mixing sucrose or lactose and gelatin.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose ( It is prepared by mixing sucrose or lactose and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 60, cacao butter, laurin butter, glycero gelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the patient's state of health, weight, age, sex, The range varies depending on the diet, the rate of excretion, the extent of the disease, the type of drug, the time of administration, the route of administration and the duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the compound of the present invention is preferably administered at 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.01 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • Multiplicity is expressed as follows: s (singlet); d (doublet); t (triplet); q (quartet); m (multiplet); dd (doublet of doublet); ddd (doublet of doublet of doublet); doublet of triplet (dt); td (triplet of doublet); brs (broad singlet).
  • 2-amino-3-hydroxy pyridine, cesium carbonate, 3-nitrobenzyl bromide, 2-amino-3-benzyloxypyridine, bromobenzene, 2-amino-3-benzyloxypyridine were purchased from TCI (Japan).
  • Anhydrous tin (II) chloride anhydride was purchased from alfa aesar (US).
  • Copper iodide (I), N, N'-dimethylenediamine was purchased from sigma Aldrich (US).
  • the progress of the reaction was monitored using TLC (silica gel 60 F254 0.25 mm) and the constituents were observed under UV light (254 nm, 365 nm) or the TLC plate with anisealdehyde, KMNO 4, and phosphomolybdic acid. Visualized by heating after treatment. Unless otherwise noted, all reactions were performed in oven-dried glassware under a dry argon atmosphere.
  • Step 1 Preparation of 3-((3-nitrobenzyl) oxy) -pyridin-2-amine (TAC5-a intermediate)
  • Step 2 Preparation of 3-((3-aminobenzyl) oxy) pyridin-2-amine (TAC5-a).
  • Step 2 Synthesis of (1-chloro-2-ethoxyethyl) benzene ((1-chloro-2-ethoxyethyl) benzene, TAC5-d intermediate 2)
  • Step 3 Synthesis of 3- (2-ethoxy-1-phenylethoxy) pyridin-2-amine (3- (2-ethoxy-1-phenylethoxy) pyridine-2-amine, TAC5-d)
  • Step 2 tert-butyl (2- (2-chloro-2-phenylethoxy) ethyl) carbamate (tert-butyl (2- (2-chloro-2-phenylethoxy) ethyl) carbamate, TAC5-e intermediate 2) Synthesis of
  • Step 3 3- (2- (2-aminoethoxy) -1-phenylepoxy) pyridin-2-amine (3- (2- (2-aminoethoxy) -1-phenylethoxy) pyridin-2-amine, TAC5- e) synthesis
  • FIG. 1 The overall workflow of QSAR model development and screening implemented in the present invention is shown in FIG. 1.
  • the QSAR model was constructed using three algorithms: k-Nearest Neighbor (k-NN), Random Forest (RF), and Support Vector Machine (SVM).
  • k-NN k-Nearest Neighbor
  • RF Random Forest
  • SVM Support Vector Machine
  • the chemical properties of each molecule are represented by DragonX-H or MOE technicians.
  • Three QSAR methods k-NN, RF and SVM) identified predictive models that met statistical threshold Q 2 or correct classification rate (CCR) (Table 2). It is a standard.
  • Virtual screening was performed on a library of 2,000 molecules of chemical compounds filtered using a fingerprint-based method on a multivariate library of ⁇ 8,000,000 molecules. Top 13 compounds were selected for experimental validation of activity, and RAW 264.7 cells were incubated with 1, 10, 50 or 100 ⁇ M of compounds to identify the most potent candidates.
  • TAC2, TAC5 and TAC10 were further analyzed by MTT assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
  • the three compounds were noncytotoxic at concentrations of 1, 10 and 50 ⁇ M and TAC2 and TAC5 inhibited CL075 (TLR7 / 8 antagonist) -induced TNF- ⁇ secretion (FIGS. 2C and 2D).
  • CL075 TLR7 / 8 antagonist
  • TNF- ⁇ secretion FIGS. 2C and 2D
  • TAC5 showed an increased inhibitory effect compared to the inhibitory effect of TAC2 in a dose dependent manner.
  • Example 2 Effect of TAC5, TAC5-a or TAC5-c on the Activity of NF- ⁇ B and MAPK (Effect of TAC5 on CL075-Induced TLR7 and TLR8 Signaling)
  • Rat macrophage RAW264.7 cells (ATCC, Manassas, VA, USA) were a low-glucose DMEM (Thermo) supplemented with 10% FBS, 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. Fisher Scientific Inc.) and incubated in the culture system. THP1 cells, human monocytes, were cultured in RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) with 10% FBS, 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin, followed by 10 nM of phorbol 12-myristate 13.
  • pre-protein extraction solutions M-PER, Thermo Fisher Scientific Inc.
  • protease and phosphatase inhibitory mixtures in RAW 264.7 cell pellets. Added. The pellet was cooled for 10 minutes and the lysate was centrifuged at 16000 X g for 10 minutes. Then, the proteins of the cytoplasm and the nucleus were extracted using NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo Fisher Scientific Inc.), and the concentration of the protein was measured using a BCA kit (Sigma-Aldrich Co. LLC) It was.
  • the same amount of protein was then developed on an SDS-polyacrylamide gel and transferred to a Hybond-ECL nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA).
  • the membrane was blocked with 0.05% skim milk powder in deionized water for 1 hour and then immunoblotted by shaking gently with a primary antibody at a temperature of 4 ° C. overnight (the primary antibody was iNOS (BD Biosciences, San Jose, CA). , USA) and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA).
  • the membrane was incubated with anti-rat / rabbit HRP-conjugated secondary antibody (Thermo Fisher Scientific Inc.) for 2 hours and the SuperSignal West Pico ECL solution (Thermo Fisher Scientific Inc.) Protein detection with Fuji LAS-3000 system (Fujifilm, Tokyo, Japan) and HDAC1 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA), p-NF- ⁇ B (p-p65), I ⁇ B ⁇ , p-ERK, ERK , p-JNK, JNK, p-p38, p38 and ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) proteins were visualized and the results are shown in FIG. 3.
  • TAC5 inhibits MyD88-dependent signaling pathway induced by CL075 bound to TLR7 / 8.
  • TAC5 showed an excellent antagonistic effect on CL075-induced activation of TLR7 and TLR8 in mouse macrophages (RAW264.7 cells), among other TACs.
  • Western blot analysis showed that TAC5 inhibited CL075-induced NF- ⁇ B activation and I ⁇ B ⁇ degradation in RAW264.7 cells (FIG. 3A).
  • TLRs are c-Jun N-terminal kinase (JNK), mitogen-activated protein kinases (MAPK), extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38 mitogen- It is known to induce the activation of active protein kinases (p38), which regulate various cellular functions, including proliferation and apoptosis.
  • the present invention confirmed that TAC5 inhibits CL075-induced activation of MAPKs, ie, phosphorylation of JNK, ERK and p38 (FIG. 3B).
  • RAW264.7 cells were cultured in CL075 or a combination of CL075 and poly (dT) and raised TLR8 mediated signals (Gorden, KK, et al. J Immunol 177: 8164-8170 (2006); Jurk, M., et al. Eur J Immunol 36: 1815-1826 (2006)).
  • Measurement of TNF- ⁇ secretion levels showed a slightly improved inhibitory effect compared to cells treated with TAC5 only with CL075 compared to poly (dT) treated cells (FIG. 3C).
  • TAC5 significantly reduced the expression level of phosphorylated p65 (p-p65), indicating inactivation of NF- ⁇ B (FIG. 3D).
  • p-p65 phosphorylated p65
  • FIG. 3E TNF- ⁇ production did not affect cells treated with Pam3CSK4 (TLR1 / 2 antagonist) or LPS (TLR4 antagonist).
  • TAC5 has a simple structure with a 2-aminopyridine functional group linked to a methoxy group on the benzyl ring (FIG. 2B).
  • Three modifications have been made to the structure to enhance the activity of TAC5, such as TAC5-a (3-((4-aminobenzyl) oxy) pyridin-2-amine), TAC5-b (3- (3-benzyloxy) Oxy) pyridin-2-amine), TAC5-c (3- (benzyloxy) -N-phenyl pyridin-2-amine), TAC5-d (3- (2-ethoxy-1-phenylethoxy) pyridine- 2-amine) and TAC5-e (3- (2- (2-aminoethoxy) -1-phenylethoxy) pyridin-2-amine) derivatives were generated (FIG.
  • TAC5-a, TAC5-d and TAC5-e all dependently inhibited TLR7 / 8 mediated IL-6 expression in THP-1 cells (human monocyte cell line) (FIG. 4C); Further experiments were performed using one of the compounds, TAC5-a, at a concentration of 1-50 ⁇ M.
  • TAC5-a did not block TLR4 (LPS)-, TLR1 / 2 (Pam3CSK4) and TLR2 / 6 (FSL-1) mediated TNF- ⁇ secretion (FIG. 4D).
  • TAC5-a was a potential blocker of endosomal TLR activation.
  • TAC5-a The efficacy of TAC5-a in psoriasis and SLE mouse models was evaluated. Psoriasis was induced by topical application of 42 mg IMQ cream (5%) to the dorsal skin after 6 days of continuous shaving in 6-7 week old C57BL / 6 mice (FIG. 5A). TAC5-a was injected daily at doses of 50, 100 and 200 nmol / g and the effect on severity was analyzed. Inflammation reversal was evident in the dorsal skin of TAC5-a-treated mice (FIG. 5B), but was relatively weaker than that of the chemotherapy drug methotrexate (MTX).
  • MTX methotrexate
  • mTLR7 5′-ATG TGG ACA CGG AAG AGA CAA-3 ′ and 5′-GGT AAG GGT AAG ATT GGT G-3 ′
  • mTLR9 5′- ATG GTT CTC CGT CGA AGG ACT-3 ′ and 5′-GAG GCT TCA GCT CAC AGG G-3 ′
  • mIL-6 5′-GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC-3 ′ and 5′-AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA-3 ′
  • mMyd88 5′-CAC CTG TGT CTG GTC CAT TG-3 ′ and 5′-CTG TTG GAC ACC TGG AGA CA-3 ′
  • mIL-17 5′-GCT CCA GAA GGC CCT CAG A-3 ′ and 5′-AGC TTT CCC TCC GCA TTG A-3 ′
  • mGAPDH 5′-GCT CCA GAA GGC C
  • TAC5-a Therapeutic potential of TAC5-a for systemic autoimmunity was injected intraperitoneally with a daily dose of 10 nmol / g TAC5-a (dissolved in 1% dimethylsulfoxide [DMSO]) for 11 days using MARC / lpr mice. It was further confirmed. This inhibitor clearly affected mouse lymphoid proliferation. Lymphocyte expansion in TAC5-a-treated mice was significantly prevented in vehicle-treated mice (FIG. 6A). Production of anti-dsDNA autoantibodies remained low (FIG. 6B) and serum antinuclear antibodies (ANAs) were reduced by treatment with inhibitors (FIG. 6C).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • GN glomerulonephritis
  • TAC5-a significantly reduced TLR7, IL-17 and IL-6 mRNA levels in lymph nodes (Fig. 6E-G).
  • TLR7, TLR9 and MyD88 mRNA expression in the spleen In the kidneys, expression of TLR7 and IL-17 was observed (Fig. 6k-1). This means that enlargement of lymph nodes may be due to the down regulation of proinflammatory cytokines, as shown in FIG. 6A.
  • TAC5-a After confirming the in vitro and in vivo efficacy of TAC5-a, the binding mode and interaction pattern with TLR7 and TLR8 were predicted. The agonist / antagonist binding sites on these receptors are well defined by X-ray crystallographic studies. The chemical structure of TAC5-a was docked with representative low energy forms of TLR7 and TLR8. Analysis of the top docked poses confirmed that the inhibitor reliably occupies the cavities present in the lateral junction between the two subunits (FIGS. 7A-D) and primarily forms hydrophobic contacts with adjacent amino acids.
  • the 2-amino pyridine ring interacts with F408 via ⁇ -interaction and the phenylamine group is deposited in the hydrophobic region defined by F466, F351 and F449 of TLR7 (FIG. 7E).
  • the 2-aminopyridine ring interacts with [pi] -stacking with Y348 and its amino group forms a hydrogen bond of 2-A with N262 of TLR8.
  • Hydrophobic interaction was also observed between the phenylamine group of TAC5-a and the TLR8 residues, F320 and F346 (FIG. 7F). This indicates that the antagonistic activity of TAC5-a can be attributed mainly to hydrophobic rings that stabilize the overall structure inside the polar-aromatic small molecule binding cavity of TLR7 / 8.
  • novel compounds represented by TAC5 and its derivatives TAC5-a or TAC5-c according to the invention are poly (I: C) (TLR3 agonist), IMQ (TLR7 agonist), CL075 (TLR7 / 8 agonist), R848 (TLR7 / 8 agonist), TL8 (TLR8 agonist) or CpG ODN (TLR9 agonist) secretion of TNF ⁇ , NFkB activation, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell (IkB) degradation, MAPKs (p38, It not only blocks the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal-regulated kinase, but also inhibits the production of inflammatory cytokines, in particular TLR3 / 7/8 / 9-related autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus and psoriasis, and inflammatory It has an excellent effect as a composition for the prevention or

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Abstract

본 발명은 톨-유사 수용체 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물 및 이를 포함하는 TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR3 억제제에 관한 것으로, TAC5 및 그 유도체인 TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d 또는 TAC5-e로 표시되는 신규 화합물은 poly(I:C) (TLR3 작용제), IMQ (TLR7 작용제), CL075 (TLR7/8 작용제), R848 (TLR7/8 작용제), TL8 (TLR8 작용제) 또는 CpG ODN (TLR9 작용제)에 의해 유도된 TNFα의 분비, NFkB 활성화, IkB 분해, MAPKs의 인산화를 차단할 뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 생성을 억제함으로써 전신홍반루푸스 및 건선 등을 비롯한 TLR3/7/8/9 관련 자가면역 질환과 염증성 질환의 예방 또는 치료용도로 탁월한 효과가 있다.

Description

톨-유사 수용체 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물 TAC5 시리즈
본 발명은 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR) 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 톨-유사 수용체 3/7/8/9 신호전달 경로를 억제하는 신규 소분자 화합물, 이의 유도체 및 이를 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
내재(또는 선천)면역은 포유류의 면역 시스템에서 세균 감염에 대항하는 첫 번째 방어 작용으로 톨-유사 수용체와 같은 패턴 인식 수용체가 병원균-연관 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern; PAMP)이나 손상-연관 분자 패턴(damage-associated molecular pattern; DAMP)을 인식함으로써 활성화된다. 예를 들면, TLR1/2에 의해 인식되는 트리아실 지방단백질(e.g. Pam3CSK4)(Takeuchi, O., et al. J Immunol 169: 10-14 (2002)), TLR2/6에 의한 디아실 지방단백질(e.g. Pam2CSK4)(Takeuchi, O., et al. Int Immunol 13: 933-940 (2001)), TLR4에 의한 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)(Poltorak, A., et al., Science 282: 2085-2088 (1998)), TLR5에 의한 세균성 플라겔린(flagellin)(Poltorak, A., et al. Science 282: 2085-2088 (1998), TLR3에 의한 바이러스 이중가닥 RNA (dsRNA)(Poltorak, A., et al., Science 282: 2085-2088 (1998)), TLR7 및 TLR8에 의한 바이러스 단일가닥 RNA (ssRNA)(Diebold, S. S. et al., Science 303: 1529-1531 (2004); Heil, F., et al., Science 303: 1526-1529 (2004)) 및 TLR9에 의한 비메틸화 CpG-함유 올리고데옥시 뉴클레오티드 (ODN)(Hemmi, H., et al. Nature 408: 740-745 (2000)). 등이 있다.
TLR은 내재면역 반응에서 중요한 역할을 하며(Akira, S. & Takeda, K. Nat Rev Immunol 4, 499-511), TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 및 TLR11을 포함하는 원형질막에서 작용을 하는 세포외 TLR와 TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9를 포함하는, 엔도솜과 같은 세포 내에서 작용을 하는 세포내 TLR로 나눌 수 있다. 구조적으로, TLR는 세포외 도메인의 N-말단에 리간드 또는 부속분자(accessory molecule)에 의해 인식되는 루신고반복(leucine-rich repeat; LRR) 부위를 가지고 있으며, 세포내 부분의 C-말단에 신호를 전달하는 톨/인터루킨 1 수용체(Toll/interleukin 1 receptor; TIR) 도메인을 가지고 있다.
특히, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR3은 세포 외부의 칩입자로부터 엔도솜에 노출되는 외인성 ssRNA (single stranded RNA), dsRNA (double stranded RNA), CpG DNA 등을 알아 보거나 비정상적 반응에 의한 조직내부의 세포괴사 또는 세포자멸사에 의해 손상된 조직으로부터 노출되는 내인성 ssRNA나 DNA 조각을 리간드로 인식하여 신호전달 과정을 통해 염증성 사이토카인을 증폭시키게 된다. 일반적으로 TLR7 및 TLR8은 influenza나 손상된 세포로부터의 ssRNA를 인식하는 한편, TLR9은 박테리아와 바이러스의 제놈 또는 손상된 조직으로부터 생성되는 CpG DNA 조각을 감지하고, TLR3은 바이러스 증식의 중간산물인 dsRNA를 인식하여 내재면역 반응을 활성화시킨다. 이러한 TLR의 역할로 인해 면역 관련 질병을 치료하기 위한 타겟으로 TLR를 활용하기 위한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다.
TLR7/8/9의 MyD88 (myeloid differentiation primary response 88) 의존적 신호전달은 해당 리간드에 의해 이량체(dimer)를 형성하고 TLR의 TIR 도메인과 MyD88의 TIR 도메인끼리 결합하여 복합체를 형성함으로써 신호전달 경로를 활성화시킨다(Hemmi, H. et al. Nat Immunol 3, 196-200, (2002)) 활성화된 TLR 신호는 NF-κB의 활성화 및 핵으로의 이동, MAPK의 활성화를 유도하고 인터페론 α (interferon α; IFNα) 및 IFN-inducible 유전자들을 발현시킨다. 상기 NF-κB와 MAPK의 활성화는 TNFα, IL1β (interleukin 1β) 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 분비시킨다. TLR3의 MyD88 비의존 신호전달 과정은 TLR3의 TIR 도메인과 TRIF (TIR domain-containing adapter-inducing interferon-β)의 TIR 도메인 간의 결합으로 개시되며, IRF (interferon-regulatory factor)의 활성화에 의해 타입 1 인터페론을 분비시킨다. 또한, TLR 활성은 대식세포에서 NO와 ROS와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다.
엔도솜막(TLR3, 7, 8 및 9)에 있는 TLR은 다양한 바이러스 및 세균 감염으로부터 호스트를 보호하는 데 중요하다. 특히, TLRs 7, 8 및 9의 발현은 손상된 또는 스트레스가 가해진 조직/세포로부터 방출된 병원성 성분 또는 자체 항원에 대한 지속적인 방어에 필수적이다(Demaria, O., et al., J Clin Invest 120: 3651-3662 (2010)). 이러한 핵산 감지 TLR의 오작동은 건선 및 전신홍반루푸스 (루푸스; systemic lupus erythematosus; SLE) (Vincent, F. B. et al., Nat Rev Rheumatol 10: 365-373 (2014))와 같은 몇 가지 자가면역 병리학과 관련되어 있다. 그러나 이러한 질병의 병인학은 여전히 불분명하다(Krieg, A. M. & Vollmer, J., Immunol Rev 220: 251-269 (2007); Terhorst, D., et al. J Immunol 195: 4953-4961 (2015)). 그러므로, 엔도솜 TLR-매개 질병 진행을 감소시키는 신규한 길항제의 개발에 대한 필요성이 증대되고 있다.
이와 같이 TLR는 자가면역 질환, 염증성 질환 및 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위한 타겟이 될 수 있으므로 TLR를 타겟으로 하는 물질과 TLR와 관련된 질병을 치료하기 위한 의학적 조성물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자들은 TLR를 타겟으로 하는 물질과 TLR와 관련된 질병을 치료하기 위한 의학적 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, TAC5 (TLR antagonistic compound 5), 그의 유도체 TAC5-a 또는 TAC5-c를 포함하는 신규 화합물이 TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR3 활성화에 의해 유도된 TLR 신호전달 경로를 억제하여 사이토카인 (IL6, TNFα, IFNβ), NO 및 ROS의 분비와 NF-κB와 MAPK의 과활성화를 억제함은 물론 루푸스 마우스 모델 [MRL/Faslpr/lpr]에서 피부홍반 및 루푸스신염을 치료하고 염증성 사이토카인을 감소시켜 염증반응을 완화시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 톨-유사 수용체 3/7/8/9 억제 기능이 있는 길항성 소분자 화합물 및 이를 포함하는 TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR3 억제제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000001
화학식 1에서 L은 단일결합, 치환 또는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬렌, 사이클로알킬렌, 할로알킬렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로아릴렌, 아릴렌알킬렌, 알킬렌아릴렌, 알킬렌헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌알킬렌, 알킬렌 에스테르 또는 알킬렌 아마이드이고, 여기서, 알킬렌은 C2-30, 사이클로알킬렌은 C3-30, 아릴렌은 C6-30이고, 헤테로알킬렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로아릴렌은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유하며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소원자, C1~C6의 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 아미노, -NR3R4(여기서 R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴로 치환됨), 히드록시, 할로겐, 니트릴기, 니트로기, 시클로알킬, 할로알킬, 알릴, 알콕시, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 알콕시카보닐, 시클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 아릴옥시, 알콕시헤테로아릴, 헤테로아릴옥시알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬에스테르, 알킬아미드 또는 아크릴이고, 여기서, 알킬 또는 알콕시는 C1-30, 사이클로알킬은 C3-30, 알릴은 C2-30, 아릴은 C6-30이고, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유한다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 화학식 1-1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
(a) 2-아미노-3-하이드록시피리딘과 세슘 카보네이트가 용해된 용액을 3-니트로벤질브로마이드를 반응시켜 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민과 SnCl2와 반응시켜 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민을 생성하는 단계.
[화학식 1-1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000002
본 발명은 또한, 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 요오드화 구리(Ⅰ), 탄산칼륨, N,N’-디메틸에틸렌디아민이 용해된 용액과 브로모벤젠을 반응시켜 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민을 합성하는 단계를 포함하는 화학식 1-3으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1-3]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000003
본 발명은 또한, 상기 화합물 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또한, 상기 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
도 1은 본 발명에 의한 QSAR 모델의 스크리닝에 관한 플로우 차트이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 TAC5의 세포 생존율 측정 결과 및 종양괴사인자 α(TNF-α) 억제제 프로파일을 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 NF-κB 및 MAPK 활성에 미치는 TAC5 의 영향을 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 TLR 신호 전달 경로에 대한 TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d 및 TAC5-e의 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 건선 마우스 모델에서의 TAC5-a의 보호 효과를 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 전신홍반루푸스 마우스 모델에서의 TAC5-a의 방어 효과를 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 TLR7 및 TLR8에 결합된 TAC5-a의 구조 모델을 도시한 도면이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 TAC5, 그 유도체 TAC5-a 또는 TAC5-c를 포함하는 신규 화합물이 TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR3 활성화에 의해 유도된 TLR 신호전달 경로를 억제하여 사이토카인(IL6, TNFα, IFNβ), NO 및 ROS의 분비와 NF-κB와 MAPK의 과활성화를 억제함은 물론 루푸스 마우스 모델 [MRL/Faslpr/lpr]에서 피부 홍반 및 루푸스신염을 치료하고 염증성 사이토카인 감소(염증반응 완화)에 영향을 미치는 것을 규명하였고 건선 마우스 모델에서 치료효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000004
화학식 1에서 L은 단일결합, 치환 또는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬렌, 사이클로알킬렌, 할로알킬렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로아릴렌, 아릴렌알킬렌, 알킬렌아릴렌, 알킬렌헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌알킬렌, 알킬렌 에스테르 또는 알킬렌 아마이드이고, 여기서, 알킬렌은 C2-30, 사이클로알킬렌은 C3-30, 아릴렌은 C6-30이고, 헤테로알킬렌 또는 헤테로아릴렌은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유하며,
여기서, 상기 치환기는 C1-30 알킬, C3-30 사이클로알킬, C1-30 알킬에스테르, C1-30 알킬아미드, -CH2OCH2CH3 및 -CH2OCH2CH2NR5R6(여기서 R5 및 R6는 서로 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소원자, C1-30 알킬, C3-30 사이클로알킬 또는 C6-30 아릴임) 중에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소원자, 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 아미노, -NR3R4(여기서 R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴로 치환됨), 히드록시, 할로겐, 니트릴기, 니트로기, 시클로알킬, 할로알킬, 알릴, 알콕시, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 알콕시카보닐, 시클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 아릴옥시, 알콕시헤테로아릴, 헤테로아릴옥시알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬에스테르, 알킬아미드 또는 아크릴이고, 여기서, 알킬 또는 알콕시는 C1-30, 사이클로알킬은 C3-30, 알릴은 C2-30, 아릴은 C6-30이고, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유한다.
본 발명은 다른 관점에서 (a) 2-아미노-3-하이드록시피리딘과 세슘 카보네이트가 용해된 용액을 3-니트로벤질브로마이드를 반응시켜 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민과 SnCl2와 반응시켜 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민을 생성하는 단계를 포함하는 화학식 1-1로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1-1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000005
본 발명은 또 다른 관점에서 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 요오드화 구리(Ⅰ), 탄산칼륨, N,N’-디메틸에틸렌디아민이 용해된 용액과 브로모벤젠을 반응시켜 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민을 합성하는 단계를 포함하는 화학식 1-3으로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 1-3]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000006
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 화합물 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR3 신호전달 경로를 억제하는 소분자 화합물 TAC5 (TLR antagonistic compound 5) 및 이의 신규 유도체인 TAC5-a와 TAC5-c, 및 상기 화합물의 제조방법 그리고 상기 화합물을 포함하는 전신홍반루푸스, 건선, 피부발진, 광과민성, 관절염, 구강궤양, 신장염, 혈구감소증, 혈관염, 장막염을 비롯한 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 즉, IMQ (TLR7 작용제), CL075 (TLR7/8 작용제), R848 (TLR7/8 작용제), TL8 (TLR8 작용제), CpG ODN (TLR9 작용제), 또는 poly(I:C) (TLR3 작용제)에 의해 유도된 TNFα (tumor necrosis factor α)의 분비, NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell) 활성, MAPKs (mitogen-activated protein kinases: p38, c-Jun N-terminal kinase 및 extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 차단할 뿐만 아니라 IL-6 (interleukin 6)를 비롯한 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 소분자 화합물, 상기 화합물을 포함하는 전신홍반루푸스, 건선, 피부발진, 광과민성, 관절염, 구강궤양, 신장염, 혈구감소증, 혈관염, 장막염 등을 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물(TAC5) 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000007
화학식 1에서 L은 단일결합, 치환 또는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬렌, 사이클로알킬렌, 할로알킬렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로아릴렌, 아릴렌알킬렌, 알킬렌아릴렌, 알킬렌헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌알킬렌, 알킬렌 에스테르 또는 알킬렌 아마이드이고, 여기서, 알킬렌은 C2-30, 사이클로알킬렌은 C3-30, 아릴렌은 C6-30이고, 헤테로알킬렌 또는 헤테로아릴렌은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유하는 2가 라디칼이며,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소원자, 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 아미노, -NR3R4(여기서 R3 및 R4는 서로 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴로 치환됨), 히드록시, 할로겐, 니트릴기, 니트로기, 시클로알킬, 할로알킬, 알릴, 알콕시, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 알콕시카보닐, 시클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 아릴옥시, 알콕시헤테로아릴, 헤테로아릴옥시알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬에스테르, 알킬아미드 또는 아크릴이고, 여기서, 알킬 또는 알콕시는 C1-30, 사이클로알킬은 C3-30, 알릴은 C2-30, 아릴은 C6-30이고, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유한다.
본 발명은 상기 L, R1 및 R2이 하기 표 1과 같은 치환기의 조합인 것이 바람직하다.
Figure PCTKR2019005978-appb-T000001
또한, 본 발명은 화학식 1-1(TAC5-a), 화학식 1-2(TAC5-b), 화학식 1-3(TAC5-c), 화학식 1-4(TAC5-d), 화학식 1-5(TAC5-e), 화학식 1-6(TAC5-f), 화학식 1-7(TAC5-g), 화학식 1-8(TAC5-h) 및 화학식 1-9(TAC5-e-1) 중에서 선택된 하나인 것이 바람직하며, 화학식 1-1(TAC5-a) 및 화학식 1-3(TAC5-c)이 특히 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1-1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000008
[화학식 1-2]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000009
[화학식 1-3]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000010
[화학식 1-4]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000011
[화학식 1-5]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000012
[화학식 1-6]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000013
[화학식 1-7]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000014
[화학식 1-8]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000015
[화학식 1-9]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000016
본 발명에서 TAC5, 그 유도체 TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d 또는 TAC5-e는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며 상세하게는 상기와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 (a) 2-아미노-3-하이드록시피리딘과 세슘 카보네이트가 용해된 용액을 3-니트로벤질브로마이드를 반응시켜 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민과 SnCl2와 반응시켜 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민을 생성하는 단계를 포함하는 화학식 1-1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1-1]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000017
본 발명의 다른 실시예에 따라 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 요오드화 구리(Ⅰ), 탄산칼륨, N,N’-디메틸에틸렌디아민이 용해된 용액과 브로모벤젠을 반응시켜 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민을 합성하는 단계를 포함하는 화학식 1-3으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1-3]
Figure PCTKR2019005978-appb-I000018
본 발명은 상기 화합물 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 건선, 전신홍반루푸스(SLE), 건선, 피부발진, 광과민성, 관절염, 구강궤양, 신장염, 혈구감소증, 혈관염, 장막염, 염증성 장질환(IBD), 당뇨, 다발성 경화증, 피부 경화증 및 천포창(pemphigus), 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병 및 뇌졸중으로 구성된 군에서 선택된 질환일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 자가면역질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 정의하는데 사용된 용어들은 하기와 같은 의미를 갖는다.
용어 “C1-30 알킬”은 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 1가 선형 또는 분지형 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 이러한 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "분지형 알킬"의 예는 아이소프로필, 아이소부틸, 3급-부틸 등이 있다.
용어 "C1-30 알콕시"는 화학식 -O-C1-30 알킬을 의미하며, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 3급-부톡시 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 “할로(halo)”의 구체적인 예로는 플루오르(F), 클로린(Cl), 브롬(Br) 및 요오드(I)를 들 수 있다.
용어 “C6-30 아릴(aryl)”은 공유 파이 전자계를 가지는 적어도 하나의 환을 포함하며, 예를 들어 모노사이클릭 또는 융합환 폴리사이클릭(즉, 탄소 원자들의 인접한 쌍들을 나눠가지는 링들)그룹을 포함한다. 즉, 본 명세서에서 아릴은 달리 정의하지 않는 한 페닐, 나프틸 등과 바이아릴을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 아릴은 탄소수 6 내지 30의 방향족 고리를 지칭한다.
용어 " C3-30 사이클릭알킬(Cyclic alkyl)"은 5 내지 6개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 고리형의 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 이러한 사이클릭 알킬 기의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 “헤테로아릴”은 달리 정의하지 않는 한 N, O 및 S로 이루어진 그룹에서 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 포함하는 고리원자수 5 또는 6의 방향족 고리이거나, 또는 상기 헤테로아릴 고리가 벤젠 고리 또는 다른 헤테로아릴 고리에 융합된 2환식 고리를 지칭한다. 모노사이클릭 헤테로아릴의 예로는 티아졸릴, 옥사졸릴, 티오페닐, 퓨라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 이소옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 트리아지닐, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사디아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비사이클릭 헤테로아릴의 예로는 인돌릴, 아자인돌릴, 인돌리닐, 벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈티아디아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 퓨로피리디닐 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 “헤테로사이클로알킬”은 탄소 원자 이외에 N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 고리원자수 5 내지 9의 포화되거나 부분적으로 불포화된 카보사이클릭 고리를 나타낸다. 예를 들어, 헤테로사이클릴은 아제티디닐, 피롤리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로-티에닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 아이소옥사졸리디닐, 티아졸리디닐, 피페리디닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 1,1-다이옥소-티오모르폴린-4-일, 아제파닐, 다이아제파닐, 호모피페라지닐, 옥사제파닐, 디하이드로인돌릴, 디하이드로푸릴, 디하이드로이미다졸리닐, 디하이드로옥사졸릴, 테트라하이드로피리디닐, 디하이드로피라닐, 디하이드로벤조퓨라닐, 벤조디옥솔릴, 또는 벤조디옥사닐이다.
본 발명에서 용어, “TLR7”은 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 Toll-like receptors (TLRs; 톨-유사 수용체)에 속하는 단백질로서, TLR7 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, UNQ248/PRO285로 명명되기도 한다. 상기 TLR7은 RNA 바이러스의 ssRNA (단일가닥 RNA), 또는 합성 소분자인 imidazoquinoline, loxoribine, bropirimine을 인지하여 내재면역 시스템을 활성화시킨다.
본 발명에서 용어, “TLR8”은 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLR에 속하는 단백질로서, TLR8 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD288 (cluster of differentiation 288) 또는 UNQ249/PRO286로 명명되기도 한다. 상기 TLR8은 단일가닥 바이러스 RNA, 식균작용에 의해 세포내부로 들어온 세균 RNA(phagocytized bacterial RNA), 또는 합성 소분자인 TL8에 의해 활성화된다.
본 발명에서 용어, “TLR9”는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLR에 속하는 단백질로서, TLR9 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD289 또는 UNQ5798/PRO19605로 명명되기도 한다. 상기 TLR9는 세균이나 DNA 바이러스의 메틸화되지 않은 CpG DNA 조각(unmethylated CpG oligodeoxynucleotide DNA)을 인지하여 내재면역 시스템을 활성화시킨다.
본 발명에서 용어, “TLR3”은 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통(tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLR에 속하는 단백질로서, TLR3 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며, CD283 또는 IIAE2로 명명되기도 한다. 상기 TLR3은 바이러스의 이중가닥 RNA(dsRNA) 및 poly I:C를 인지하기 때문에 내재면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.
본 발명에서 용어, “TLR 신호전달 경로”는 TLR를 통한 신호전달 경로를 말하며, TLR 및 어댑터 단백질 MyD88 (TLR7/8/9의 경우) 또는 TLR 및 어댑터 단백질 TRIF (TLR3의 경우)에 의해 형성된 복합체에 의존하는 반응일 수 있으며, 이를 통해 신호가 전달된다. 활성화된 TLR7/8/9는 Myd88-의존 신호전달 과정을 통해 NF-κB를 활성화시켜 핵으로 이동시키며, MAPK의 활성화를 유도한다. 상기 NF-κB와 MAPK의 활성화로 인해 TNFα, IL1β 및 IL6와 같은 염증성 사이토카인이 분비되고, 대식세포에서 일산화질소(이하, NO라 한다)와 활성산소(이하, ROS라 한다)와 같은 산화 스트레스성 물질을 생성한다. 또한, TLR3은 TRIF, 인터페론-조절자(IRF) 및 NF-κB의 활성화에 의해 MyD88-비의존 신호전달 과정이 유도되어 타입 1 인터페론이 분비된다.
본 발명에서 용어, “TIR 도메인”은 세포내 신호전달을 위한 도메인으로, 3개의 고도로 보존된 영역(highly conserved region)을 가지고 있으며 TLR과 다른 신호전달 분자 사이의 상호작용을 매개한다. 활성화된 반응에서 TIR 도메인은 MyD88 또는 TRIF와의 결합을 유도하고 TLR 신호전달 경로를 활성화 시킨다.
본 발명에서 용어, “억제”는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 신호활성이 저하되는 현상을 말하며, TLR의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나, 감소시키거나, 방지하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화 시키거나 또는 하향 조절하는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 소분자 화합물의 TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR3 신호전달 경로와 그 하위 신호분자, 예를 들면 BAFF (B cell-activating factor of the TNF family; B-lymphocyte stimulator; BLyS) 억제용도를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, TAC5, 그의 유도체 TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 화합물은 TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR3 활성화에 의해 유도된 TLR 신호전달 경로를 억제하여 사이토카인 (IL6, TNFα, IFNβ), NO 및 ROS의 분비와 NF-κB와 MAPK의 과활성화를 억제함은 물론 루푸스 마우스 모델 [MRL/Faslpr/lpr]에서 피부 홍반 및 루푸스신염을 치료하고 염증성 사이토카인 감소(염증반응 완화)에 미치는 효과가 우수한바, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR3 활성화에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 TLR7, TLR8, TLR9 및/또는 TLR3 억제제를 제공한다.
본 발명에서 용어, “억제제”는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다.
본 발명에서 용어, “TLR7, TLR8, TLR9 및/또는 TLR3 억제제”는 TLR7, TLR8, TLR9 및/또는 TLR3의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 방해, 감소 또는 저해할 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 TLR7, TLR8, TLR9 및/또는 TLR3 수용체에 결합하고, 이들의 활성을 중화시킴으로써 TLR7, TLR8, TLR9 및/또는 TLR3 신호전달 경로를 차단하여, NF-κB 및 MAPK 그리고 염증성 사이토카인, NO 및 ROS의 분비를 감소시킬 수 있는 물질을 말한다.
이에, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "자가면역 질환”은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 상기 자기관용이란 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness)을 말한다. 자가면역 질환은 획득(adaptive) 면역계가 자기 항원에 대해 반응하고 세포 및 조직 손상을 매개하도록 하는 자체 내성의 고장(breakdown)에서 기인된 질환을 포함한다. 특정 구체예에서, 자가면역 질환은 적어도 부분적으로는 체액성 면역 반응의 결과로서 특징지어진다.
본 발명의 자가면역 질환은 전신홍반루푸스, 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 및 원판상 LE를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 자가면역 질환의 예는, 비제한적 예로서, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 알레르기 천식, 알레르기 비염, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항체 매개 이식 거부반응, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질항체 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율신경이상증, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍증, 자가면역 내이질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 당뇨망막병증, 자가면역 혈소판감소성자반병(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 액손 및 뉴런 신경장애, 발로병(Balo disease), 베체트병, 유천포창, 심근증, 캐슬맨병, 소아 지방변증, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창, 크론병, 코간 증후군, 한랭응집소병, 선천성 심장 차단, 콕사키(coxsackie) 심근염, 크레스트(CREST) 질환, 본태성 혼합 한냉글로불린혈증(essential mixed cryoglobulinemia), 탈수초성 신경장애(demyelinating neuropathies), 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시속신경수염), 원판상 루프스, 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 자궁내막증, 호산성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두동맥염), 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 다발성맥관염 육아종증(GPA: granulomatosis with polyangiitis), 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모노 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병, 임신포진, 저감마글로부민혈증, 고감마글로불린혈증, 특발성 혈소판감소성자반병(ITP), IgA 신장병, IgG4 관련 경화성 질환, 면역조절 지질단백질, 포함체 근육염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존형 당뇨병(제1형), 간질성 방광염, 소아 관절염, 소아 당뇨병, 가와사키 증후군, 이튼 람베르트 증후군, 백혈구파쇄성맥관염, 편평태선, 경화성태선, 목질결막염, 선상 IgA 질환(LAD), 루프스(SLE), 라임병, 메니에르병, 현미경 다발성맥관염, 혼합 결합 조직병(MCTD), 의미불명 단클론성 감마병증(MGUS), 잠식성각막궤양, 뮈샤 하버만 병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시속신경수염(데빅병), 호중구감소증, 안구반흔성 유천포창, 시신경염, 재발성 류마티즘, PANDAS(연쇄구균 감염 관련 소아기 자가면역성 신경정신과적 질환), 방종양성 소뇌 변성, 발작성 야간혈색소 요증(PNH), 안면편측 위축증, 파소네지(Parsonnage)-터너 증후군, 중간부 포도막염(pars planitis)(주변부 포도막염), 천포창, 말초신경병증, 정맥주위 뇌척수염(perivenous encephalomyelitis), 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성다발성동맥염, 제I형, 제II형, 및 제III형 자가면역 다산성(polyglandular) 증후군, 다발성근육통 류마티즘, 다발성근염, 심근경색후증후군, 심막절개술후증후군, 프로게스테론 피부염, 원발담즙성간경변, 일차성 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐섬유증, 괴저성 농피증, 순수적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사성교감신경성이영양증, 라이터 증후군, 재발성 다발 연골염, 하지불안증후군, 후복막섬유증, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 유육종증, 시미트 증후군, 공막염, 강피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 전신근강직 증후군(stiff person syndrome), 아급성세균성심내막염(SBE), 수작 증후군(Susac's syndrome), 교감성 안염, 타까야수동맥염, 측두동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성자반병(TTP), 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직질환(UCTD), 포도막염, 맥관염, 수포성 피부염(vesiculobullous dermatosis), 백반, 발덴슈트롬 마크로글로불린혈증(WM), 및 베게너 육아종증(다발성맥관염 육아종증(GPA))을 포함한다.
본 발명의 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
상기 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 화합물과 함께 자가면역 질환 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, “염증성 질환”은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNFα, IL1, IL6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene) 또는 NO와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다. "염증성 질환"은 급성 또는 만성 염증성 병태일 수 있고 감염 또는 비감염성 원인에서 발생할 수 있다.
본 발명의 염증성 질환은 건선, 천식, 습진, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 폐염증, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알쯔하이머병, 동맥경화증, 비만 및 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 염증성 질환의 예는, 비제한적 예로서, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 자가면역 장애, 다발성 경화증, 전신홍반루프스, 다발성근육통 류마티즘(PMR), 통풍 관절염, 퇴행성 관절염, 건염, 활액낭염, 건선, 낭포성 섬유증, 관절골염, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 쇼그렌 증후군, 거대 세포 동맥염, 진행성전신성경화증(강피증), 강직성 척추염, 다발성근염, 피부근염, 천포창, 유천포창, 당뇨병(예, 제I형), 중증 근무력증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 굿패스쳐 질환, 혼합 결합 조직병, 경화성담관염, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 악성 빈혈, 염증성 피부병, 통상성 간질성 폐렴(UIP), 석면병, 규폐증, 기관지 확장증, 베릴륨중독, 활석증, 진폐증, 유육종증, 박리성간질성폐렴, 임파구성 간질성 폐렴, 거대 세포 간질성 폐렴, 세포 간질성 폐렴, 외인성 알레르기성 폐포염, 베게너 육아종증 및 맥관염 관련 형태(측두동맥염 및 결절성다발성동맥염), 염증성 피부병, 간염, 지연형 과민 반응(예, 옻중독), 폐렴, 기도 염증, 성인 호흡 장애 증후군(ARDS), 뇌염, 즉시성 과민 반응, 천식, 건초열, 알레르기, 급성 아나필락시스, 류마티스성 열, 사구체신염, 신우신염, 봉와직염, 방광염, 만성 담낭염, 국소 빈혈(허혈성 손상), 동종이식 거부반응, 숙주대이식편 거부반응, 맹장염, 동맥염, 안검염, 세기관지염, 기관지염, 자궁경관염, 담관염, 융모양막염, 결막염, 누선염, 피부근염, 심장내막염, 자궁내막염, 장염, 전장염, 상과염, 부고환염, 근막염, 결합조직염, 위염, 위장염, 치은염, 회장염, 홍채염, 후두염, 척수염, 심근염, 신염, 제염, 난소염, 고환염, 골염, 이염, 췌장염, 이하선염, 심낭염, 인두염, 능막염, 정맥염, 간질성폐렴, 직장항문염, 전립선염, 비염, 난관염, 부비강염, 구내염, 활액막염, 고환염, 편도염, 요도염, 방광 감염(urocystitis), 포도막염, 질염, 맥관염, 음문염, 및 외음질염, 혈관염, 만성 기관지염, 골수염, 시신경염, 측두동맥염, 횡단척수염, 뇌사성 근막염, 및 뇌사성 전장염을 포함한다. 특정 구체예에서, 염증성 질환은 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 자가면역 장애, 다발성 경화증, 전신홍반루프스, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 및 심근염으로 이루어진 군에서 선택된다.
용어 “치료”라 함은 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
용어 “약학적 조성물”은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
용어 “약학적으로 허용 가능한”이라 함은 화합물의 생물학적 활성과 물성을 손상시키지 않는 성질을 의미한다.
용어 “담체(carrier)”라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다.
용어 “희석제(diluent)”라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.
기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
상기 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상술한 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 화합물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 화합물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.001~1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.01~100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
1H 및 13C NMR 스펙트럼은 JNM-ECZ400S (JEOL, Japan) 을 사용하여 기록되었으며, 화학적 이동(chemical shift)은 내부 테트라메틸실란 표준의 ppm의 낮은 장(downfield) 범위를 측정하였다.
다중도(multiplicity)는 다음과 같이 표시하였다: s(singlet); d(doublet); t(triplet); q(quartet); m(multiplet); dd(doublet of doublet); ddd(doublet of doublet of doublet); dt(doublet of triplet); td(triplet of doublet); brs(broad singlet).
커플링 상수는 H로 기록하였다. 질량 분석(routine mass analyses)은 역상컬럼(C-18, 50×2.1mm, 5㎛)이 구비된 LC/MS 시스템과 전자 분무 이온화(ESI)를 이용하여 수행되었다.
2-아미노-3-하이드록시 피리딘, 세슘 카보네이트, 3-니트로벤질 브로마이드, 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 브로모벤젠, 2-아미노-3-벤질옥시피리딘 는 TCI (Japan)에서 구매하였으며, 무수 틴(Ⅱ) 클로라이드 (Tin (Ⅱ) chloride anhydride)은 alfa aesar (US)에서 구매하였다. 요오드화 구리(Ⅰ), N,N’-디메틸렌디아민은 sigma Aldrich (US)에서 구매하였다.
반응의 진행은 TLC(실리카 겔 60 F254 0.25mm)를 이용하여 모니터하였으며, 구성성분은 UV 광(254nm, 365nm) 하에서 관찰함으로써 또는 TLC 플레이트를 아니스알데히드(anisaldehyde), KMNO4, 및 포스포몰리브딘산으로 처리한 후 가열함으로써 시각화하였다. 특별한 언급이 없으면, 모든 반응은 건조한 아르곤 대기 하 오븐-건조한 글래스웨어(glassware)에서 수행하였다.
제조예 1: 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민(3-((4-aminobenzyl)oxy) pyridin-2-amine, TAC5-a)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000019
시약 및 조건: (i) 3-Nitrobenzylbromide, Cs2CO3, DMF, RT; (ii) SnCl2, EtOH, reflux.
단계 1: 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민(TAC5-a 중간체)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000020
2.04 g의 2-아미노-3-하이드록시피리딘과 6.03 g의 세슘 카보네이트를 80 ml의 디메틸포름알데하이드(DMF)에 용해시켰다. 그 후 용해된 액체에 4.0 g의 3-니트로 벤질 브로마이드가 용해되어있는 20 ml의 디메틸포름알데하이드를 첨가한 후 반응 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반시켰다. TLC에 의해 반응 완료를 확인한 후, 포화된 탄산수소나트륨을 상기 용액에 첨가한 후 디클로로메탄을 넣어 유기물질을 3회 추출하였다. 얻어진 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후 여과하여 용액을 얻었다. 얻어진 용액을 진공상 에서 농축한 뒤 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 컬럼 프로마토그래피로 정제하여 2.20 g의 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 수득하였다(48.4 %).
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.29 (s, 1H), 8.21 (dd, J = 8.1 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.75 (bs, 2H); 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 150.2, 148.5, 141.0, 139.9, 138.5, 133.4, 129.9, 123.4, 122.4, 117.0, 113.7, 69.0.
단계 2: 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민(TAC5-a)의 제조.
Figure PCTKR2019005978-appb-I000021
7.73 g의 무수 틴(Ⅱ) 클로라이드를 1노르말 농도의 염산 0.2 ml과 40 ml 의 에탄올의 용액에 첨가한 후 상온에서 용해하였다. 용해된 액체에 2.0 g의 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 첨가한 후 3시간동안 환류하였다. TLC를 통해 반응의 완결을 확인한 후, 반응 혼합물을 거름종이를 이용하여 여과 후 고체 혼합물을 얻었다. 얻어진 고체 혼합물을 포화된 탄산수소나트륨과 디클로로메탄에 넣어 유기층을 3회 추출하였다. 얻어진 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 여과하여 용액을 얻는다. 얻어진 용액을 진공상 에서 농축하여 945 mg의 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민 (TAC5_a)을 수득하였다(53.9 %).
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.86 (dd, J = 4.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.46-7.39 (m, 5H), 7.23 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.07 (bs, 1H), 7.04 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 7.4 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H); 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 150.3, 146.9, 141.6, 139.1, 137.7, 129.7, 117.6, 116.9, 115.0, 113.9, 113.7, 70.3. LRMS (ESI) m/z calcd. For C18H17N2O [M+H]+ 277.13; found 277.15
제조예 2: 3-(3-벤질벤질)옥시)피리딘-2-아민(3-((3-benzylbenzyl)oxy) pyridin-2-amine, TAC5-b)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000022
시약 및 조건: (i) Benzylbromide, Pd(PPh3)4, Na2CO3, toluene, 80℃; (ii) NaBH4, MeOH, 0℃; (iii) HBr, Water:CH2Cl2 (v:v = 1:1), RT; (iv) 2-amino-3-hydroxylpyridine, Cs2CO3, DMF, RT.
단계 1: 3-벤질 벤즈알데히드(TAC5-b 중간체 1)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000023
3- 포르밀페닐 보론산(450 mg, 3.0 mmol) 및 테트라키스(트리 페닐 포스 핀) 팔라듐(0) (139 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고 아르곤으로 퍼징하였다. 톨루엔(15 ml), 벤질 브로마이드 및 2N Na2CO3(3 ml)를 첨가하고 생성된 반응 혼합물을 80 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3로 희석하고, CH2Cl2로 3 회 추출하였다. 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(EA : Hex = Hex 100 % - EA 15 %)로 정제하여 생성물 (503 mg, 수율=85.3 %)을 맑은 오일로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 9.86 (s, 1H), 7.63 (m, 2H), 7.23 (m, 7H), 3.95 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 191.9, 141.9, 139.8, 136.4, 134.7, 129.5, 128.8, 128.6, 128.4, 127.4, 126.1, 41.2.
단계 2: (3-벤질페닐)메탄올 (TAC5-b 중간체 2)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000024
0 ℃에서 교반된 3- 벤질 벤즈알데히드(196 mg, 1.0 mmol)의 메탄올(10 ml) 용액에 NaBH4(75 mg, 2 mmol)를 적가한 후, 생성 된 반응 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다 h. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 증류수로 세척하고 CH2Cl2로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(EA:Hex = 100 % -EA 50 %)로 정제하여 생성물 (203 mg, 정량적 수율)을 맑은 오일로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.13 (m, 9H), 4.41 (s, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.89 (s, 1H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 141.2, 140.9, 140.9, 128.7, 128.4, 128.3, 127.9, 127.3, 125.9, 124.6, 64.7, 41.7.
단계 3: 1- 벤질-3-(브로모메틸)벤젠(TAC5-b 중간체)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000025
(3-벤질페닐)메탄올 (198 mg, 1.0 mmol)을 DCM 및 HBr 혼합물 (5 ml, v:v = 1:1)로 희석하고, 생성된 반응 혼합물을 실온에서 36 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3로 희석하고, CH2Cl2로 3 회 추출하였다. 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (EA : Hex = Hex 100 % - EA 10 %)로 정제하여 생성물(185 mg, 수율 = 70.8 %)을 맑은 오일로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.17 (m, 9H), 4.36 (s, 2H), 3.92 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 141.6, 140.5, 137.8, 129.4, 129.0, 128.9, 128.8, 128.5, 126.8, 126.1, 41.6, 33.5.
단계 4: 3-(3-벤질벤질)옥시)피리딘-2-아민(TAC5-b)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000026
DMF(3 ml) 중의 2- 아미노-3-하이드록시피리딘(75 mg, 0.68 mmol) 및 Cs2CO3(222 mg, 0.68 mmol)의 용액에 1-벤질-3-(브로모메틸)벤젠 178 mg, 0.68 mmol)의 DMF(3.8 ml) 용액에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3로 희석하고, CH2Cl2로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(EA : Hex = Hex 100 % - EA 100 %)로 정제하여 생성물(110 mg, 수율=55.9 %)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.65 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.21 (s, 9H), 6.88 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 6.53 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 4.94 (s, 2H), 4.79 (bs, 2H), 3.96 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 150.3, 141.5, 141.3, 140.6, 138.9, 136.5, 128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 128.0, 126.1, 125.2, 116.7, 113.3, 70.0, 41.6; LRMS (ESI) m/z calcd. for C19H19N2O [M+H]+ 291.14; found : 291.20.
제조예 3: 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민(TAC5-c)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000027
시약 및 조건: (i) Bromobenzene, CuI, DMEDA, K2CO3, 1,4-dioxane, 90℃.
1.0 g의 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 0.48 g 요오드화 구리(Ⅰ), 1.38 g의 탄산 칼륨, 270 μl의 N,N’-디메틸에틸렌디아민을 25ml의 1,4-디옥산에 용해시켰다. 용해된 액체에 786 μl의 브로모벤젠을 천천히 첨가한 후 90 ℃에서 17시간동안 교반하였다. 17시간뒤, 포화된 탄산수소나트륨와 디클로로메탄을 넣어 유기층을 3회 추출하였다. 추출한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후 여과하여 용액을 얻는다. 얻어진 용액을 진공상에서 농축시킨 후 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 0.11 g의 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민(TAC5_c)을 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.86 (dd, J = 4.8 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.46-7.39 (m, 5H), 7.23 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.07 (bs, 1H), 7.04 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 7.4 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H); 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 147.0, 141.7, 141.0, 138.9, 136.4, 129.2, 129.1, 128.7, 128.0, 121.9, 119.2, 116.6, 114.4, 70.7. LRMS (ESI) m/z calcd. For C18H17N2O [M+H]+ 277.13; found 277.15
제조예 4: 3-(2-에톡시-1-페닐에톡시)피리딘-2-아민(3-(2-ethoxy-1-phenylethoxy)pyridine-2-amine, TAC5-d)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000028
시약 및 조건: (i) EtOH, NaOH, reflux; (ii) Thionyl chloride, DCM, 0℃ to RT; (iii) Cs2CO3, 2-amino-3-hydroxyl pyridine, DMF, RT.
단계 1: 2-에톡시-1-페닐에탄올(2-ethoxy-1-phenylethanol, TAC5-d intermediate 1)의 합성
Ar 분위기 하에 교반된 NaOH(440 mg, 11 mmol)의 EtOH(50 ml) 용액에 스티렌 옥사이드(1.13 ml, 10 mmol)를 첨가하고 생성된 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 포화 NaHCO3 (aq.)으로 희석시키고 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM 층을 Na2SO4(s)에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 목적 생성물(800mg, 48.1 %)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.36 (m, 5H), 4.88 (dd, J = 9.6 Hz, 1H), 3.57 (m, 3H), 3.43 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 3.14 (s, 1H), 1.23 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 140.3, 128.2, 127.7, 126.1, 76.1, 72.7, 66.6, 15.0
단계 2: (1-클로로-2-에톡시에틸)벤젠((1-chloro-2-ethoxyethyl)benzene, TAC5-d intermediate 2)의 합성
0℃에서 교반된 화합물 4-a (1.0 g, 6.02 mmol)의 DCM(15 ml) 용액에 티오닐 클로라이드(thionyl chloride, 524 μl, 7.22 mmol)의 DCM(10 ml) 용액을 첨가하고, 결과 혼합물을 0℃에서 교반하였다. 0℃에서 1시간 더 교반한 후, 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3(aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM층을 Na2SO4(s)상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 목적 생성물(452 mg, 40.7 %)을 맑은 오일로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.36 (m, 5H), 4.99 (dd, J = 7.2 Hz, 1H), 3.81 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 1.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 138.7 128.4 128.3 127.2 75.1 66.5 61.0 14.8.
단계 3: 3-(2-에톡시-1-페닐에톡시)피리딘-2-아민(3-(2-ethoxy-1-phenylethoxy)pyridine-2-amine, TAC5-d)의 합성
2-아미노-3-히드록시피리딘(120 mg, 1.08 mmol) 및 KOH(68 mg, 1.08 mmol)의 DMF (5 ml) 용액에 화합물 4-b (200 mg, 1.08 mmol) 및 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 (aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM층을 Na2SO4(s)상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 목적 생성물(137 mg, 49.1 %)을 백색 고체로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.65 (dd, J = 6.0 Hz, 1H), 7.36 (m, 5H), 6.71 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 5.12 (dd, J = 9.0 Hz, 1H), 5.02 (bs, 2H), 3.84 (m, 1H), 3.61 (m, 3H), 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ; 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 151.7, 140.4, 140.3, 137.9, 128.5, 128.1, 126.3, 121.7, 112.9, 81.5, 74.7, 66.7, 14 .9; LRMS (ESI) m/z calcd. for C15H19N2O2 [M+H]+ 258.14; found : 259.05.
제조예 5: 3-(2-(2-아미노에톡시)-1-페닐에톡시)피리딘-2-아민(3-(2-(2-aminoethoxy)-1-phenylethoxy)pyridin-2-amine, TAC5-e)의 제조
Figure PCTKR2019005978-appb-I000029
시약 및 조건: (i) N-Boc-ethanolamine, NaH, THF, 60℃; (ii) Thionyl chloride, DCM, 0℃; (iii) 1. Cs2CO3, 3-hydroxyl-2-aminopyridine, DMF, RT; 2. TFA, DCM (v:v = 1:2), RT, 4 h.
단계 1: tert-부틸(2-(2-하이드록시-2-페닐에톡시)에틸)카바메이트(tert-butyl (2-(2-hydroxy-2-phenylethoxy)ethyl)carbamate, TAC5-e intermediate 1)의 합성
NaH (광유 중 60% 분산액, 40 mg, 1.0 mmol)의 N-Boc-에탄올 아민:THF (1.0 ml, v:v =1:1) 용액을 60℃에서 교반하고, 스티렌 옥사이드(114 ㎕, 1.0 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3 (aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM 층을 Na2SO4(s)상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 (70mg, 24.9 %)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.36 (m, 5H), 5.04 (bs, 1H), 4.87 (dd, J = 8.4 Hz, 1H), 3.58 (m, 4H), 3.32 (bs, 2H), 3.22 (s, 1H), 1.43 (s, 10H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 140.3, 128.3, 127.8, 126.1, 76.5, 72.7, 70.4, 40.3, 28.4.
단계 2: tert-부틸(2-(2-클로로-2-페닐에톡시)에틸)카바네이트(tert-butyl (2-(2-chloro-2-phenylethoxy)ethyl)carbamate, TAC5-e intermediate 2)의 합성
0℃에서 교반된 화합물 5-a (128 mg, 0.46 mmol)의 DCM (4.5 ml) 용액에 티오닐클로라이드(40 μl, 0.55 mmol)를 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3(aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM층을 Na2SO4(s)상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물(69mg, 50.6 %)을 투명한 오일로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.36 (m, 5H), 4.97 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.79 (s, 1H), 3.86 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.27 (s, 2H), 1.44 (s, 10H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 138.5, 128.7, 128.6, 127.4, 75.5, 70.3, 60.8, 40.2, 28.4.
단계 3: 3-(2-(2-아미노에톡시)-1-페닐에폭시)피리딘-2-아민(3-(2-(2-aminoethoxy)-1-phenylethoxy)pyridin-2-amine, TAC5-e)의 합성
화합물 5-b(69 mg, 0.24 mmol), Cs2CO3(79 mg, 0.24 mmol) 및 2-아미노-3-하이드록실피리딘(27 mg, 0.24 mmol)의 DMF(3 ml) 용액을 실온 내지 40℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3(aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM층을 Na2SO4(s)상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 플래쉬 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 목적 생성물을 수득하였다. 정제된 생성물을 추가의 확인 없이 다음 반응에 사용하였다. 정제된 화합물을 DCM:TFA (v:v=2:1) 중에서 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 NaHCO3(aq.)로 희석하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 DCM층을 Na2SO4(s)상에서 건조시켰다. 생성된 여액을 농축시켜 목적 생성물(10mg, 15.2 %)을 황색 고체로 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 7.43 (m, 6H), 8.86 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 7.8 Hz, 1H), 5.39 (dd, J = 7.2 Hz, 1H), 3.93 (dd, J = 10.8 Hz, 1H), 3.75 (dd, J = 6.6 Hz, 1H), 3.61 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.35 (s, 1H), 2.81 (bs, 2H); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 152.9, 142.1, 139.4, 139.2, 129.7, 129.4, 127.7, 121.3, 113.9, 81.5, 76.2, 73,4, 41.9.; LRMS (ESI) m/z calcd. for C15H20N3O2 [M+H]+ 274.15; found : 274.10.
실시예 1: QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) 모델 확인
본 발명에서 구현된 QSAR 모델개발 및 스크리닝(screening)의 전반적인 워크 플로우(workflow)는 도 1에 나타내었다.
이 발명의 초기 주요 화합물은 Tropsha(Tropsha, Mol Inform 29: 476-488 (2010))에 기술된 것처럼 QSAR 모델링 접근법을 사용하여 확인되었다. 초기 목표는 TLR8의 길항성 화합물을 찾는 것이므로, 공지된 몇몇의 TLR8 길항성 화합물을 사용하여 리간드 데이터 세트를 준비하였다. 리간드 데이터 세트는 문헌에 보고된 화합물의 활성 데이터에 기초하여 128개의 활성 및 106개의 비활성 분자로 분류하였다. 필요한 경우 화학 구조를 스케치하고 Molecular Operating Environment (MOE 2016)(Molecular Operating Environment (MOE), 2013.08; Chemical Computing Group ULC, 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2017)를 사용하여 최적화하였다. QSAR 모델은 k-Nearest Neighbor (k-NN), Random Forest (RF) 및 Support Vector Machine (SVM)의 세 가지 알고리즘을 사용하여 구축하였다. 각 분자의 화학적 특성은 DragonX-H 또는 MOE 기술자로 나타냈다. 세 가지 QSAR 방법 (k-NN, RF 및 SVM)은 통계적 임계값 Q2 또는 올바른 분류기준 0.7(correct classification rate, CCR)을 충족시키는 예측모델을 확인하였는데(표 2), 이는 합리적인 예측을 위한 적합한 기준이다. 가상 스크리닝(virtual screening)은 ~8,000,000 분자의 다변수 라이브러리에서 지문 기반 방법(fingerprint-based method)을 사용하여 필터링된 2,000 분자의 화학 화합물 라이브러리에 대해 수행되었다. 활성의 실험적 검증을 위해 상위 13개 화합물을 선택하였으며, 이중에서 가장 효능 있는 후보를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 1, 10, 50 또는 100μM의 화합물과 함께 배양하였다. 24시간 후, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 에세이를 수행하였으며(도 2a), TAC1, TAC3, TAC4, TAC6, TAC7, TAC12 및 TAC13이 세포 독성을 나타내었다. 따라서 TAC2, TAC5 및 TAC10은 추가의 MTT 에세이 및 효소결합면역흡착분석(ELISA)을 수행하였다. 3개의 화합물은 1, 10 및 50μM 농도에서 비세포독성이었고 TAC2 및 TAC5는 CL075 (TLR7/8 길항제)-유도 된 TNF-α 분비를 억제하였다(도 2c 및 도 2d). 또한, TAC5는 용량 의존적으로 TAC2의 억제 효과에 비해 증가된 억제 효과를 나타내었다.
Figure PCTKR2019005978-appb-T000002
실시예 2: TAC5, TAC5-a 또는 TAC5-c가 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 영향(CL075-유도된 TLR7 및 TLR8 신호전달에 대한 TAC5의 효과)
세포 배양 및 준비
쥐 대식세포인 RAW264.7 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10%의 FBS, 100 IU/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 저당 DMEM(Low-Glucose DMEM)(Thermo Fisher Scientific Inc.)에 넣고, 배양 시스템에서 배양하였다. 인간 단핵구 세포인 THP1 세포는 10%의 FBS, 100 IU/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양 후, 10 nM의 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)를 이용하여 24시간 동안 대식세포로 분화 유도하였다. CL075, R848, CpG-ODN 및 Poly(I:C)는 InvivoGen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, LPS는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
TAC5가 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
NF-κB 및 MAPK의 웨스턴 블롯팅
TAC5가 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 전-단백질 추출 용액(M-PER, Thermo Fisher Scientific Inc.)을 프로테아제 및 포스파타아제 억제 혼합물과 섞어 RAW 264.7 세포 펠릿(pellet)에 첨가하였다. 상기 펠릿을 10분간 냉각시킨 후 10분 동안 16000 X g에서 상기 용해물을 원심 분리하였다. 그런 다음, NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 세포질과 핵의 단백질을 각각 추출하고, BCA 키트(Sigma-Aldrich Co. LLC)를 사용하여 상기 단백질의 농도를 측정하였다. 이 후, 동일한 양의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전개하고, Hybond-ECL 니트로셀룰로스 막(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 상기 막을 1시간 동안 탈이온수에서 0.05% 탈지 분유로 블로킹한 후, 1차 항체로 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 가볍게 쉐이킹하여 면역블롯팅하였다(상기 1차 항체는 iNOS(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)에 대한 항체이다). 그런 다음, PBST로 철저히 쉐이킹한 후 상기 막을 항-쥐/-토끼 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(Thermo Fisher Scientific Inc.)와 함께 2시간 동안 배양하고, SuperSignal West Pico ECL 용액(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 단백질을 검출하고 Fuji LAS-3000 시스템(Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 HDAC1(Merck Millipore, Billerica, MA, USA), p-NF-κB (p-p65), IκBα, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) 단백질을 시각화하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 쥐 대식세포인 RAW 264.7 세포에 오직 CL075만을 처리한 경우, NF-κB의 활성이 증가하여 IκBα가 분해된 반면, TAC5를 함께 처리한 경우, NF-κB의 활성이 억제되어 IκBα가 분해되는 정도 및 핵으로 이동하는 NF-κB의 양이 감소하였다. 또한, 오직 CL075만을 처리한 경우, MAPK의 활성이 증가하여 ERK, JNK, p38이 인산화되지만, TAC5를 함께 처리한 경우, MAPK의 활성이 억제되어 상기 효소들의 인산화된 정도가 감소하였다.
이를 통해 본 발명에 따른 TAC5는 TLR7/8에 결합한 CL075에 의해 유도된 MyD88-의존적 신호전달 경로를 억제한다는 것을 알 수 있다.
표준 시험 관내 분석에서 TAC5는 다른 TAC들 중에서도 마우스 대 식세포 (RAW264.7 세포)에서 TLR7 및 TLR8의 CL075-유도된 활성화에 대해 탁월한 길항 효과를 나타냈다. 웨스턴 블롯 분석은 TAC5가 RAW264.7 세포에서 CL075-유도된 NF-κB 활성화 및 IκBα 분해를 억제함을 보여주었다(도 3a). TLRs는 미토젠-활성 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinases, MAPK)인 c-Jun N-말단 키나제(c-Jun N-terminal kinase, JNK), 세포외 신호조절 키나제(ERK), p38 미토젠-활성 단백질 키나제(p38)의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이는 증식과 세포사멸을 포함한 다양한 세포 기능을 조절한다. 본 발명은 TAC5가 MAPKs의 CL075-유도된 활성화, 즉 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 억제함을 확인하였다(도 3b). 다음으로, RAW264.7 세포를 CL075 또는 CL075와 poly(dT)의 조합물에서 배양하였으며, TLR8 매개 신호를 상승시켰다(Gorden, K. K., et al. J Immunol 177: 8164-8170 (2006); Jurk, M., et al. Eur J Immunol 36: 1815-1826 (2006)). TNF-α 분비 수준의 측정은 TAC5가 CL075로만 처리된 세포와 비교하여 poly(dT)처리된 세포에 비하여 약간 향상된 저해 효과를 나타냈다(도 3c). CL075로 유도된 NF-κB 활성화는 RAW264.7 세포에서 공초점 현미경에 의한 면역형광염색법을 사용하여 확인하였다. TAC5는 인산화된 p65(p-p65)의 발현 수준을 유의하게 감소시켜 NF-κB의 불활성화를 나타냈다(도 3d). TAC5 및 다른 TLR 길항제와 함께 처리된 세포는 poly(I:C)-유도된 TLR3 매개 TNF-α 분비에 대해 TAC5가 중간 정도의 저해 효과를 나타내는 반면에 TLR7/8-매개 TNF-α 분비는 용량 의존적으로 감소되었다(도 3e). 한편, TNF-α 생산은 Pam3CSK4 (TLR1/2 길항제) 또는 LPS (TLR4 길항제)로 처리된 세포에는 영향을 미치지 않았다.
실시예 3: TAC5의 3-아미노 유도체(TAC5-a)의 TNF-α 저해 프로파일
TAC5는 벤질 고리에 메톡시기로 연결된 2-아미노피리딘 작용기를 가진 간단한 구조를 가지고 있다(도 2b). TAC5의 활성을 향상시키고자 그 구조에 3개의 변형을 수행하여 TAC5-a (3-((4-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민), TAC5-b (3-(3-벤질옥시)옥시)피리딘-2-아민), TAC5-c (3-(벤질옥시)-N-페닐 피리딘-2- 아민), TAC5-d (3-(2-에톡시-1-페닐에톡시)피리딘-2-아민) 및 TAC5-e (3-(2-(2-아미노에톡시)-1-페닐에톡시)피리딘-2-아민)유도체를 생성하였다(도 4a). 이들 화합물은 12.5 내지 50 μM의 농도로 처리함으로써 RAW 264.7 세포에서의 세포독성을 시험하였다. 이 예비조사에 따르면 TAC5-b는 세포 생존력을 현저히 감소시키는 반면 TAC5-c는 50 μM에서 약간의 세포 독성을 보였다(도 4b). 한편, TAC5-a, TAC5-d 및 TAC5-e는 세포에 세포독성 효과를 나타내지 않았다. TAC5-a, TAC5-c, TAC5-d 및 TAC5-e는 모두 THP-1 세포(사람 단구 세포주)에서 TLR7/8이 매개하는 IL-6 발현을 의존적으로 저해하였다(도 4c); 화합물 중 하나인 TAC5-a를 1 내지 50μM 농도로 사용하여 추가 실험을 수행하였다. TLR- 매개 시그널링에 대한 TAC5-a의 억제효과는 THP1-유래 대식세포에서의 ELISA를 통한 TNF-α 분비를 측정함으로써 확인되었다. 예상대로, TAC5-a는 TLR4 (LPS)-, TLR1/2 (Pam3CSK4) 및 TLR2/6 (FSL-1) 매개 TNF-α 분비를 차단하지 않았다(도 4d). 또한 엔도솜(endosomal) TLR 활성화에 대한 TAC5-a의 길항효과를 평가하기 위해, 세포를 R848 (TLR7/8) 또는 CL075 (TLR7/8), 이미퀴모드(imiquimod, IMQ; TLR7), TL8 (TLR8), poly(I:C) (TLR3) 또는 CpG ODN (TLR9)의 존재하에 이 화합물과 함께 배양하였다(도 4e, f, g). 결과는 TAC5-a가 용량 의존적으로 TLR3-, TLR7-, TLR8- 및 TLR9-매개 TNF-α 또는 IL-6 분비를 유의하게 억제함을 나타내었다. 이것은 TAC5-a가 엔도좀 TLR 활성화의 잠재적 차단제임을 시사한다.
실시예 4: 건선 및 SLE 유사 질병 모델에 대한 TAC5-a의 효과
건선 마우스모델 및 SLE 마우스모델에서 TAC5-a의 치료효능을 평가하였다. 건선은 6-7주된 C57BL/6 마우스에서 6일 연속 면도된 등 피부에 42 mg IMQ 크림 (5 %)을 국소 도포하여 유도하였다(도 5a). TAC5-a를 50, 100 및 200 nmol/g의 용량으로 매일 주사하였고 중증도에 대한 영향을 분석하였다. TAC5-a-처리 마우스의 등 피부에서 염증 정도의 역전이 분명하게 나타났으나(도 5b), 화학 요법 약물인 메토트렉세이트(MTX)의 영향보다 상대적으로 약했다. PASI(Psoriasis Area and Severity Index, 건선 영역 및 중증도 지수)를 사용한 점수는 PASI 점수가 치료 4일째에 8.0 이상에서 치료 5일째에 4.0 미만으로 크게 감소함을 나타낸다(도 5c). 따라서, TAC5-a 처리는 비장 비대를 적당히 예방하였으며(도 5d), 이는 치료군의 체중 동역학과 직접 상관 관계가 있다(도 5e).
마우스 등쪽 병변의 피부 샘플에 대하여 조직학적 분석 및 면역화학 염색을 수행하였다. 샘플을 4% 파라 포름알데히드 용액으로 고정시킨 후에 파라핀에서 포매시키고 유리 슬라이드 상에서 7㎛로 절단하였다. 절편을 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하여 진피와 표피의 두께를 측정하였다. Leica LAS X Hardware Configurator (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)를 사용하여 Leica DMi8 형광 현미경으로 피부의 두께를 측정하였다. IMQ 매개 피부 염증은 CD68 (ab31630, 1:200 희석)을 인식하는 1차 항체를 대 식세포 마커로 사용하여 면역조직화학법(IHC)에 의해 평가하였다. TAC5-a와 MTX (양성 대조군) 그룹의 표피와 진피의 두께를 확인한 결과 처리군에서 유사한 정도의 치료효과를 관찰하였다(도 5f). 각 그룹의 피부 병변의 조직 병리학적 변화를 관찰하기 위해 IMQ로 유도된 건선 마우스에서 표피(노란색 화살표)와 진피(녹색 화살표)의 두께를 평가하기 위해 스킨을 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하였다(도 5g). 각 군의 피부 병변의 면역 조직 화학적 분석은 CD68을 인식하는 1차 항체를 사용하여 수행되었다. TAC5-a는 CD68 (갈색)의 발현을 효과적으로 감소시켰다(도 5h). SLE 질병 모델에 대한 TAC5-a의 치료 효과도 외관상 또는 림프절의 부풀었던 크기가 감소함으로 명확하게 관찰할 수 있었다(도 6a).
정량 실시간 PCR (qRT-PCR)
림프절, 비장 및 신장에서 특정 유전자의 발현 수준을 확인하기 위해 qRT-PCR 분석하였다. TRI 시약(Sigma-Aldrich, Co.)를 사용하여 16주령 생쥐의 림프절, 비장 및 신장에서 총 RNA를 분리하였다. RNA는 SYBR green 기반(Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA)을 사용하여 qRT-PCR에 적용하였다. 마커 유전자에 대한 하기 프라이머를 사용하였다: mTLR7, 5′-ATG TGG ACA CGG AAG AGA CAA-3′및 5′-GGT AAG GGT AAG ATT GGT G-3′; mTLR9, 5′- ATG GTT CTC CGT CGA AGG ACT-3′및 5′-GAG GCT TCA GCT CAC AGG G-3′; mIL-6, 5′-GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC-3′및 5′-AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA-3′; mMyd88, 5′-CAC CTG TGT CTG GTC CAT TG-3′및 5′-CTG TTG GAC ACC TGG AGA CA-3′; mIL-17, 5′-GCT CCA GAA GGC CCT CAG A-3′및 5′-AGC TTT CCC TCC GCA TTG A-3′; mGAPDH, 5′-CTC AAC ACG GGA AAC CTC AC-3′ 및 5′-CGC TCC ACC AAC TAA GAA CG-3′(Bioneer, Daejeon, Korea). 정량된 개별 RNA 발현 수준을 GAPDH에 대해 표준화하고 상응하는 야생형 마우스에 상대적인 RNA 발현 수준으로 나타내었다.
전신 자가면역에 대한 TAC5-a의 치료 잠재력은 MARC/lpr 마우스를 사용하여 10 nmol/g의 TAC5-a(1% 디메틸설폭사이드[DMSO]에 용해)의 일일 투여 량을 11일 동안 복강내 주사하여 추가로 확인하였다. 이 억제제는 명확하게 마우스 림프 증식에 영향을 주었다. TAC5-a-처리 마우스에서 림프구 팽창이 비히클-처리 마우스에서 유의하게 예방되었다(도 6a). 항-dsDNA 자가 항체의 생산은 낮게 유지되었고(도 6b), 혈청 항핵 항체(ANAs)는 억제제로 처리하여 감소하였다(도 6c). 소변에서 알부민(albumin)과 같은 특정 단백질의 검출은 사구체의 염증에 의해 유발되는 사구체 신염(glomerulonephritis, GN)이라 불리는 신장 병리의 표지자 역할을 한다. 도 6d에 나타낸 바와 같이, 소변 알부민의 함량은 TAC5-a 처리에 의해 유의적으로 감소되어 GN 발현에 대한 치료효능을 나타내었다. 다음으로 TAC5-a가 전사 수준에서 림프절, 비장 및 신장에서 특정 유전자의 상대적인 발현 양상에 미치는 영향을 확인하였다. TAC5-a는 림프절에서 TLR7, IL-17 및 IL-6 mRNA 수준이 현저히 감소하였다(도 6e-g). 비장에서의 TLR7, TLR9 및 MyD88 mRNA 발현(도 6h-j); 신장에서는 TLR7과 IL-17의 발현이 관찰되었다(도 6k-l). 이는 도 6a에 나타낸 바와 같이 림프절의 확대방지가 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 하향 조절에 기인할 수 있음을 의미한다.
실시예 5: TLR7/8에서의 TAC5-a 결합 모드의 예측
TAC5-a의 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 효능을 확인한 후, TLR7 및 TLR8과의 결합방식 및 상호작용 패턴을 예측하였다. 이들 수용체상의 작용제/길항제 결합 위치는 X선 결정학 연구에 의해 잘 정의되어 있다. TAC5-a의 화학 구조는 TLR7 및 TLR8의 대표적인 저에너지 형태로 도킹되었다. 최상위 도킹된 포즈의 분석은 억제제가 두 개의 서브 유닛(도 7a-d) 사이의 측 방향 접합부에 존재하는 공동을 안정적으로 차지하고, 주로 인접한 아미노산과의 소수성 접촉을 형성한다는 것을 확인하였다. 2-아미노 피리딘 고리는 π-상호 작용을 통해 F408과 상호 작용하고, 페닐아민기는 TLR7의 F466, F351 및 F449에 의해 정의된 소수성 영역에 적층된다(도 7e). 유사하게, 2-아미노피리딘 고리는 Y348과 π-스태킹 상호작용 하고 그 아미노기는 TLR8의 N262와 2-A의 수소 결합을 형성한다. 소수성 상호 작용은 또한 TAC5-a의 페닐아민기와 TLR8 잔기, F320 및 F346 사이에서도 관찰되었다(도 7f). 이것은 TAC5-a의 길항 활성이 주로 TLR7/8의 극성-방향족 소분자 결합 공동 내부의 전체 구조를 안정화시키는 소수성 고리에 기인할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 따른 TAC5 및 그 유도체인 TAC5-a 또는 TAC5-c로 표시되는 신규 화합물은 poly(I:C) (TLR3 작용제), IMQ (TLR7 작용제), CL075 (TLR7/8 작용제), R848 (TLR7/8 작용제), TL8 (TLR8 작용제) 또는 CpG ODN (TLR9 작용제)에 의해 유도된 TNFα의 분비, NFkB 활성화, IkB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell) 분해, MAPKs (p38, c-Jun N-terminal kinase 및 extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 차단할 뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 생성을 억제함으로써 특히, 전신홍반루푸스 및 건선을 비롯한 TLR3/7/8/9 관련 자가면역 질환과 염증성질환의 예방 또는 치료용 조성물로 탁월한 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000030
    화학식 1에서 L은 단일결합, 치환 또는 비치환된 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬렌, 사이클로알킬렌, 할로알킬렌, 아릴렌, 헤테로알킬렌, 헤테로아릴렌, 아릴렌알킬렌, 알킬렌아릴렌, 알킬렌헤테로아릴렌, 헤테로아릴렌알킬렌, 알킬렌 에스테르 또는 알킬렌 아마이드이고, 여기서, 알킬렌은 C2-30, 사이클로알킬렌은 C3-30, 아릴렌은 C6-30이고, 헤테로알킬렌 또는 헤테로아릴렌은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유하며,
    R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소원자, 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬, 아미노, -NR3R4(여기서 R3 및 R4는 독립적으로 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬 또는 아릴로 치환됨), 히드록시, 할로겐, 니트릴기, 니트로기, 시클로알킬, 할로알킬, 알릴, 알콕시, 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 알킬아릴카보닐, 알콕시카보닐, 시클로알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 아릴옥시, 알콕시헤테로아릴, 헤테로아릴옥시알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬아릴, 아릴알킬, 알킬헤테로아릴, 알킬에스테르, 알킬아미드 또는 아크릴이고, 여기서, 알킬 또는 알콕시는 C1-30, 사이클로알킬은 C3-30, 알릴은 C2-30, 아릴은 C6-30이고, 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L, R1 및 R2이 하기와 같은 치환기인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염.
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000031
  3. 제1항에 있어서, 화학식 1-1 내지 1-9 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 1-1]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000032
    [화학식 1-2]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000033
    [화학식 1-3]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000034
    [화학식 1-4]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000035
    [화학식 1-5]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000036
    [화학식 1-6]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000037
    [화학식 1-7]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000038
    [화학식 1-8]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000039
    [화학식 1-9]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000040
  4. 하기 단계를 포함하는 화학식 1-1로 표시되는 화합물의 제조방법:
    (a) 2-아미노-3-하이드록시피리딘과 세슘 카보네이트가 용해된 용액을 3-니트로벤질브로마이드를 반응시켜 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 3-((3-니트로벤질)옥시)-피리딘-2-아민과 SnCl2와 반응시켜 3-((3-아미노벤질)옥시)피리딘-2-아민을 생성하는 단계.
    [화학식 1-1]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000041
  5. 2-아미노-3-벤질옥시피리딘, 요오드화 구리(Ⅰ), 탄산칼륨, N,N’-디메틸에틸렌디아민이 용해된 용액과 브로모벤젠을 반응시켜 3-(벤질옥시)-N-페닐피리딘-2-아민을 합성하는 단계를 포함하는 화학식 1-3으로 표시되는 화합물의 제조방법.
    [화학식 1-3]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000042
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 화학식 1-1 내지 1-9 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1-1]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000043
    [화학식 1-2]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000044
    [화학식 1-3]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000045
    [화학식 1-4]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000046
    [화학식 1-5]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000047
    [화학식 1-6]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000048
    [화학식 1-7]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000049
    [화학식 1-8]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000050
    [화학식 1-9]
    Figure PCTKR2019005978-appb-I000051
  8. 제6항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 건선, 전신홍반 루푸스(SLE), 건선, 피부발진, 광과민성, 관절염, 구강궤양, 신장염, 혈구감소증, 혈관염, 장막염, 염증성 장질환(IBD), 당뇨, 다발성 경화증, 피부 경화증 및 천포창(pemphigus), 아토피피부염, 관절염, 요도염, 방광염, 동맥경화증, 알러지 질환, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 통풍, 심근경색, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상, 췌장염, 파킨슨병 및 뇌졸중으로 구성된 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
  9. 제6항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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