WO2019224324A1 - Promoteurs meiotiques et leurs utilisations - Google Patents

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WO2019224324A1
WO2019224324A1 PCT/EP2019/063377 EP2019063377W WO2019224324A1 WO 2019224324 A1 WO2019224324 A1 WO 2019224324A1 EP 2019063377 W EP2019063377 W EP 2019063377W WO 2019224324 A1 WO2019224324 A1 WO 2019224324A1
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WO
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nucleic acid
sequence
expression cassette
coding sequence
acid according
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PCT/EP2019/063377
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English (en)
Inventor
Giacomo BASTIANELLI
Alain Nicolas
Peter Rogowsky
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Normale Superieure de Lyon
Meiogenix SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Ecole Normale Superieure de Lyon
Meiogenix SAS
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation

Definitions

  • the present invention relates to tools, methods and compositions for expression of proteins during meiosis in a eukaryotic cell, and more particularly in a plant cell.
  • a plant having particular properties can be obtained by sexual reproduction by crossing two parental strains having interesting characteristics and by selecting a hybrid strain providing the desired improvement.
  • This method is however random and the selection step can lead to significant delays.
  • a third alternative is to cause reassortment of paternal and maternal alleles in the genome during meiotic recombination.
  • Meiotic recombination is a DNA exchange between homologous chromosomes during meiosis. It is initiated by the formation of double-strand breaks in one or the other chromatid of the homologous chromosomes, followed by the repair of these breaks, using as a matrix a chromatid of the homologous chromosome. Meiotic recombinations, however, have the disadvantage of being non-uniformly distributed in terms of frequency and location along the chromosomes.
  • promoters having transcriptional activity during this phase Some of these promoters have been described such as the promoter of the Arabidopsis thaliana DMC1 gene (Klimyuk and Jones, Plant J. 1997 Jan. 1 (1): 1-14) or the promoter of the Saccharomyces cerevisiae SP013 gene (Buckingham et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1990 Dec; 87 (23): 9406-10).
  • the available choice remains largely insufficient to cover all the applications envisaged. There remains a real need for new transcriptional promoters for the expression of proteins of interest during meiosis.
  • the present invention provides a novel functional transcriptional promoter during meiosis.
  • it relates to an isolated nucleic acid having a functional transcriptional promoter activity during meiosis and comprising or consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and variants functional variants thereof, said functional variants comprising, or consisting of,
  • sequence SEQ ID NO: 1 a sequence capable of hybridizing under low, medium or high stringency conditions with the sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and functional variants thereof having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • it may comprise, or consist of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4.
  • the present invention relates to an expression cassette comprising a coding sequence operably linked to a nucleic acid according to the invention. It also relates to an expression vector comprising a nucleic acid or an expression cassette according to the invention.
  • the coding sequence may in particular encode a polypeptide of interest, preferably a reporter protein or a protein capable of modulating, preferably increasing, the frequency of meiotic recombination, a protein which modifies the structure of chromatin such as, for example, histone (de) acetylases or histone (de) methylases or a protein that modifies the methylation of DNA.
  • the coding sequence encodes a nucleic acid of interest, preferably a siRNA, a shRNA, an RNAi, a miRNA, an antisense RNA, a ribozyme, a DNAzyme or a guide RNA capable of targeting the action of an endonuclease of CRISPR type, preferably Cas9 or dCas9, at a specific sequence.
  • a nucleic acid of interest preferably a siRNA, a shRNA, an RNAi, a miRNA, an antisense RNA, a ribozyme, a DNAzyme or a guide RNA capable of targeting the action of an endonuclease of CRISPR type, preferably Cas9 or dCas9, at a specific sequence.
  • the present invention also relates to a non-human host cell transfected or transformed with a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention.
  • the invention relates to a method, preferably an in vitro method, for expressing a coding sequence of interest in a non-human host cell during meiosis, comprising introducing into said cell an acid nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention, preferably an expression cassette or an expression vector according to the invention, said coding sequence being operably linked to a nucleic acid according to the invention.
  • It also relates to a method, preferably an in vitro method, for producing a plant multicellular organism expressing a coding sequence of interest during meiosis, comprising introducing into a plant cell a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention, preferably an expression cassette or an expression vector according to the invention, said coding sequence being operably linked to a nucleic acid according to the invention; invention, and the reconstitution of said organism from said cell.
  • the host cell is a plant cell.
  • the present invention also relates to a multicellular plant organism comprising an expression cassette or an expression vector according to the invention, as well as the use of a nucleic acid, an expression cassette or a vector of expression according to the invention for expressing a coding sequence of interest, preferably heterologous, in a non-human host cell, preferably a plant cell, during meiosis.
  • Figure 1 Nucleotide sequence of the genomic region comprising the last intron, the last exon and the 3'UTR of the ZmPHYC2 gene and the intergenic region upstream of ZmSpol l-1.
  • the framed sequences are motifs preserved in different species.
  • Figure 2 Panicles. The panicles of homozygous mutant Zmspol l-1 plants carry significantly fewer anther.
  • Figure 3 Anthers. The anthers of homozygous mutant Zmspol l-1 plants are atrophied.
  • FIG. 4 Pollen.
  • the anthers of the homozygous mutant Zmspol 1-1 plants contain many aborted pollen grains and almost no turgid pollen grains.
  • FIG. 5 Panicles. Panicles of mutant homozygous Zmspol 1-1 (WT / Homo) plants complemented by the L1605 transgene (TR Spol l / Homo) or by the L1604 transgene (TR Ubi / Homo).
  • FIG. 6 Anthers. Anthers of mutant homozygous Zmspol l-1 (WT / Homo) plants complemented by the L1605 transgene (TR Spol l / Homo) or by the L1604 transgene (TR Ubi / Homo).
  • FIG. 7 Pollen. Anther pollen of homozygous mutant Zmspol l-1 (WT / Homo) plants complemented by the L1605 transgene (TR Spol l / Homo) or the L1604 transgene (TR Ubi / Homo).
  • the present application describes the identification and characterization of regulatory nucleic acid sequences of plant origin, which make it possible to control the expression of a gene of interest in a eukaryotic cell, preferably a plant cell, during the meiosis.
  • the inventors have in fact identified a nucleotide sequence upstream of the ZmSpol 1-1 gene (GenelD NCBI: 100279325) of maize (Zea mays) having a transcriptional promoter activity during meiosis. They also demonstrated that this promoter was more efficient during meiosis than a strong constitutive promoter such as the ubiquitin promoter (ZmUBI). Definitions
  • nucleic acid refers to a deoxyribonucleotide and / or ribonucleotide polymer.
  • these terms may include, in particular, synthetic or semi-synthetic, recombinant molecules comprising non-natural bases or modified nucleotides comprising, for example, a modified binding, a modified purine or pyrimidine base, or a modified sugar.
  • the nucleic acid according to the invention can be obtained by any method known to those skilled in the art, for example by chemical synthesis and / or by recombination and / or mutagenesis techniques.
  • the nucleic acid according to the invention is a DNA molecule, preferably a double-stranded DNA molecule. This molecule can be obtained by recombinant techniques well known to those skilled in the art.
  • isolated refers to biological material that has been removed from its natural environment. More particularly, the term “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid molecule that is separated from nucleic acids that are adjacent to it when in its natural environment, i.e., in the genome from from which he was isolated. The isolated nucleic acid can be included in a vector, genome, composition or any other element while remaining isolated insofar as this element does not constitute its natural environment.
  • transcriptional promoter refers to a regulatory element that has the ability to initiate transcription of a nucleic acid to which it is operably linked.
  • the activity of such a promoter can be evaluated by any method known to those skilled in the art, and in particular by any method making it possible to quantify the mRNA or the protein obtained from the gene controlled by the promoter.
  • the activity can be measured by evaluating the amount of mRNA, for example by Northern-blot or RT-PCR, or by evaluating the amount of translated protein, for example by Westem-blot, ELISA, tests. colorimetric, enzymatic activity tests or using a reporter gene system.
  • operably linked refers to nucleotide sequences that are combined / arranged so that the function of one acts on the other.
  • a transcriptional promoter and a nucleotide sequence are operably linked when the expression of the nucleotide sequence is controlled by said promoter.
  • % sequence identity refers to the percentage of identical nucleotides in an alignment of two polynucleotides. This percentage can be easily calculated by those skilled in the art using a computer program for sequence comparison. Sequence identity is determined by comparing sequences after aligning them by maximizing overlaps and identities while minimizing gaps. In particular, the sequence identity can be determined using one of the available global or local mathematical alignment algorithms. Sequences of similar sizes are preferably aligned by means of a global alignment algorithm (e.g. Needleman and Wunsch, 1970) which optimally aligns the sequences along their entire length.
  • a global alignment algorithm e.g. Needleman and Wunsch, 1970
  • Sequences of substantially different lengths are preferably aligned using a local alignment algorithm (e.g., Smith and Waterman, 1981, Altschul et al., 1997, Altschul et al., 2005).
  • the alignments for determining the percentage of identity can be made by any method known to those skilled in the art, in particular by using computer programs available on the internet (for example, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ or http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/).
  • the present application relates to a nucleic acid, preferably isolated, having a functional transcriptional promoter activity during meiosis and comprising, or consisting of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and functional variants thereof.
  • the nucleic acid according to the invention has functional transcriptional promoter activity during meiosis. This means that it is able to initiate, during meiosis, the transcription of a nucleic acid to which it is operably linked.
  • Meiosis comprises two successive cell divisions. The first meiotic division is called reductional and includes the stages of prophase I, metaphase I, anaphase I and telophase I. The second meiotic division is The so-called equation consists of the metaphase II, anaphase II and telophase II stages.
  • the nucleic acid according to the invention has functional transcriptional promoter activity at least during prophase I of meiosis.
  • the nucleic acid according to the invention has a transcriptional promoter activity during meiosis, and more particularly during prophase I of meiosis, which is greater than that of a strong constitutive promoter.
  • the nucleic acid according to the invention has a transcriptional promoter activity during meiosis which is greater than that of the promoter of the ubiquitin gene, and in particular the ubiquitin gene of corn (GenBank accession number : S94464, position 4-1997).
  • the nucleic acid according to the invention is therefore preferably capable of inducing, during meiosis, and more particularly during prophase I of meiosis, the expression of a coding sequence of interest more efficiently than a strong constitutive promoter, in particular the promoter of the ubiquitin gene, and in particular the ubiquitin gene of corn.
  • a strong constitutive promoter in particular the promoter of the ubiquitin gene, and in particular the ubiquitin gene of corn.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a functional variant of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • variant refers to a nucleotide sequence that differs from the parent sequence (e.g., SEQ ID NO: 1) but retains the essential properties thereof.
  • the sequence of the variant may differ from the parent sequence by one or more substitutions, deletions and / or insertions.
  • the variant may have the same or different length (shorter or longer) of the parent sequence.
  • functional variant refers to a variant as defined above which retains the activity of the parent application, in this case a functional transcriptional promoter activity during meiosis.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a functional variant of the sequence SEQ ID NO: 1 selected from the group consisting of
  • sequence SEQ ID NO: 1 a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 of at least 50 consecutive nucleotides, and a sequence capable of hybridizing under conditions of low, medium or high stringency with the sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a functional variant having a sequence having at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%. %, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least
  • the nucleic acid according to The invention may differ from SEQ ID NO: 1 by up to 15, i.e. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15, substitutions, insertions and / or deletions.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a functional variant which is a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 of at least 50, 60, 70, 80, 90 , 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 or 170 consecutive nucleotides.
  • the functional variant is a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 of at least 100 consecutive nucleotides. More preferably, the functional variant is a fragment of the sequence SEQ ID NO: 1 of at least 110 consecutive nucleotides.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a functional variant having a sequence capable of hybridizing under conditions of low, medium or high stringency with the sequence SEQ ID NO: 1 or its complementary strand, preferably under medium or high stringency conditions, and more particularly preferably under conditions of high stringency.
  • low stringency conditions refers to pre-hybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE medium, 0.3% SDS, 200 ⁇ g / mL of denatured salmon sperm DNA and sonicated and 25% formamide, followed by conventional Southern blot procedures for 12 to 24 hours. The support is then washed three times for 15 minutes in 2X SSC buffer, 0.2% SDS at 50 ° C.
  • medium stringency conditions refers to pre-hybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE medium, 0.3% SDS, 200 ⁇ g / mL of denatured salmon sperm DNA.
  • the support is then washed three times for 15 minutes in 2X SSC buffer, 0.2% SDS at 55 ° C.
  • high stringency conditions refers to pre-hybridization and hybridization at 42 ° C in 5X SSPE medium, 0.3% SDS, 200 ⁇ g / mL of denatured salmon sperm DNA. and sonicated and 50% formamide, followed by conventional Southern blot procedures for 12 to 24 hours.
  • the support is then washed three times for 15 minutes in 2X SSC buffer, 0.2% SDS at 65 ° C.
  • the functional variants of the sequence SEQ ID NO: 1 comprise, preferably when they are aligned with SEQ ID NO: 1 by means of a global or local alignment mathematical algorithm, at least 1, 2 or 3 conserved motifs selected from the following grounds:
  • - CGANCGA preferably CGATCGA, at positions 115 to 121 of SEQ ID NO: 1,
  • AAGCCNA preferably AAGCCTA, at positions 94 to 100 of SEQ ID NO: 1, and
  • AAAANNAAAA (SEQ ID NO: 7), preferably AAAATCAAAA (SEQ ID NO: 8), at positions 152 to 161 of SEQ ID NO: 1.
  • N can be A, T, C or G
  • the functional variants comprise these 4 conserved motifs. These patterns are framed in Figure 1.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2, 3 or 4 and functional variants thereof, under provided that these functional variants comprise (i) at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, at least 90, at least 100, at least 100, minus 150, at least 160 or at least 170 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, and / or (ii) comprise a sequence having at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least
  • the variants comprise at least 1, 2 or 3 of the above-mentioned conserved units, preferably the 4 units.
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2, 3 or 4 and functional variants thereof, provided that these functional variants comprise (i) at least 110 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 1, and / or (ii) comprise a sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, preferably at least 70% sequence identity throughout the length of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the functional variants comprise at least 1, 2 or 3 of the above-mentioned conserved motifs, preferably the 4 motifs. .
  • the nucleic acid according to the invention comprises, or consists of, a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and functional variants thereof having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, preferably at least 80% sequence identity over the entire length of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also relates to an expression cassette comprising a coding sequence of interest operably linked to a nucleic acid according to the invention.
  • the term "expression cassette” refers to a nucleic acid construct comprising a coding sequence and one or more control sequences required for the expression of said coding sequence.
  • one of these control sequences is a nucleic acid according to the invention having a promoter activity.
  • the expression cassette comprises a coding sequence and regulatory sequences preceding (5 'non-coding sequences) and following (3' non-coding sequences) the coding sequence which is required for the expression of the gene product of interest .
  • an expression cassette typically comprises a promoter sequence, a 5 'untranslated region, a coding sequence and a 3' untranslated region which usually contains a polyadenylation site and / or a transcription terminator.
  • the expression cassette may also comprise additional regulatory elements such as, for example, enhancer sequences ("enhancers”), a "polylinker” sequence facilitating the insertion of a DNA fragment into a vector and / or splicing signals.
  • the expression cassette is usually included in a vector, to facilitate cloning and transformation.
  • the expression cassette is a recombinant expression cassette, i.e. the nucleic acid according to the invention is operably linked to a heterologous coding sequence.
  • heterologous refers to a coding sequence that is different from that to which the promoter is operably linked in a natural genome.
  • the coding sequence of interest is not the ZmSpoll-1 gene (GenelD: 100279325) of corn (Zea mays).
  • the coding sequence of interest operably linked to a nucleic acid according to the invention can encode a polypeptide of interest or a nucleic acid of interest.
  • the coding sequence of interest operably linked to a nucleic acid according to the invention encodes a polypeptide of interest.
  • the polypeptide of interest may be any polypeptide whose expression is desired during meiosis.
  • the polypeptide of interest may be a reporter protein, a protein capable of modulating, preferably increasing, the frequency of meiotic recombination, a protein that modifies the structure of chromatin such as, for example, histone (de) acetylases or histone (de) methylases, and / or a protein that modifies the methylation of DNA.
  • the reporter protein may be readily selected by those skilled in the art depending on the nature of the host cell and the detection technique.
  • the reporter protein may be selected, for example, from fluorescent proteins, alkaline phosphatases, beta-glucuronidases, beta-galactosidases, beta-lactamases or horseradish peroxidase.
  • the protein capable of modulating the frequency of meiotic recombinations can also be easily chosen by those skilled in the art.
  • the modulation may be a general increase in the frequency of recombinations or a targeted increase, i.e., an increase in a given genomic region.
  • this protein may be a protein obtained by fusing a Spol I protein with a DNA binding domain such as the Gal4 transcription activator (Pecina et al, 2002 Cell, 111, 173-184).
  • the ZF domain Zinc Finger
  • TALE domain Transcription Activator-Like Effector
  • a protein obtained by fusing a Spol 1 protein with a Cas9 domain preferably a "dead Cas9” or dCas9 domain devoid of activity. nuclease, and used in combination with a guide RNA capable of targeting a specific sequence (WO 2016/120480).
  • the coding sequence of interest operably linked to a nucleic acid according to the invention encodes a nucleic acid of interest.
  • the nucleic acid of interest may be any nucleic acid whose expression is desired during meiosis.
  • the nucleic acid of interest may be a siRNA, a shRNA, an RNAi, a miRNA, an antisense RNA, a ribozyme, a DNAzyme or a guide RNA capable of targeting the action of a CRISPR type endonuclease , preferably Cas9 or dCas9, at a specific sequence.
  • the coding sequence of interest operably linked to a nucleic acid according to the invention may encode one or more molecules of interest, i.e. for one or more polypeptides of interest and / or one or more nucleic acids of interest.
  • the expression cassette according to the invention may comprise one or more coding sequences of interest operably linked to the nucleic acid according to the invention.
  • the present invention also relates to a vector comprising a nucleic acid according to the invention or an expression cassette according to the invention.
  • vector refers to a nucleic acid molecule used as a vehicle for transferring genetic material, and in particular for delivering a nucleic acid into a host cell, either in vitro or in vivo.
  • the vector may be a DNA or an RNA, circular or not, single- or double-stranded.
  • Vectors include, but are not limited to, plasmids, phasmids, cosmids, transposable elements, viruses and artificial chromosomes (eg YACs). Vectors can be constructed by standard molecular biology techniques well known to those skilled in the art.
  • the vector according to the invention is a plant vector, that is to say a vector capable of transforming a plant cell.
  • plant vectors are described in the literature, among which mention may in particular be made of A. tumefaciens T-DNA plasmids rBIN19 (Bevan et al., 1984, Nucleic Acids Research, Vol.12: 8711-8721), pPZ100 (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Mol Biol 25: 989-994), the vectors of pCAMBIA series (Jefferson, R., 1987, Plant Mol Biol.Rep., 5: 387-405) or the vectors described in the articles by Kairmi et al. (Plant Physiology, 2007, 145 (4): 1183-91, and Plant Physiology, 2007, 145 (4): 1144-54) which are more specific to monocots.
  • the vectors according to the invention may furthermore comprise one or more bacterial and / or eukaryotic origins of replication. It may in particular comprise an origin of bacterial replication permitting its selection during the cloning steps, for example an origin of functional replication in E. coli, and another origin of replication used during transfer into the plant cell, for example an origin of functional replication in Agrobacterium tumefaciens.
  • the vector may further comprise elements allowing its selection in a bacterial or eukaryotic host cell such as, for example, an antibiotic resistance gene, a gene for complementing an auxotrophy or a gene conferring tolerance to a herbicide. Such elements are well known to those skilled in the art and widely described in the literature.
  • the expression vector may also comprise one or more sequences allowing the targeted insertion of the vector, the expression cassette or the nucleic acid according to the invention into the genome of a host cell.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention for transforming or transfecting a host cell. It also relates to a host cell transformed or transfected with at least one nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention. Preferably, the transformed or transfected host cell contains said nucleic acid, said cassette or said vector according to the invention in non-integrated form or integrated into the genome.
  • the term "host cell” refers to a prokaryotic cell or a non-human eukaryotic cell.
  • the host cell is a non-human eukaryotic cell selected from a yeast, plant, fungus or animal cell. More preferably, the host cell is a plant cell. In some embodiments, this term also includes plant protoplasts. In a preferred embodiment, the host cell is a plant cell.
  • the host cell may be a plant cell selected from the group consisting of cereals such as maize, rice, wheat, barley, sorghum, millet, oats and rye, sunflower, rapeseed, model plants such as Arabidopsis thaliana or Brachypodium dystachion, vegetables such as tomato, pepper, pepper, cabbage, cauliflower or lettuce, legumes such as beans, beans, lentils, split peas, chickpeas, soybeans, faba beans or alfalfa, cotton, sugar plants such as sugar cane or beetroot, and fruit plants such as citrus plants (eg lemons, oranges or grapefruit), berries (eg strawberries, currants, raspberries or grapes), pome fruits (eg apples or pears), stone fruits (eg example, apricots, cherries or peaches) or f shelled (for example, hazelnuts or walnuts). More preferably, the host cell is a corn cell.
  • cereals such as maize, rice, wheat,
  • the host cell can be transformed / transfected transiently or stably.
  • the nucleic acid, the cassette or the vector according to the invention may be contained in the cell in non-integrated form or integrated into the genome.
  • Transfection or transformation techniques of the host cells are well known to those skilled in the art.
  • plant transgenesis techniques are well known and include, for example, the use of the bacterium Agrobacterium tumefaciens, electroporation, direct transfer, biolistic techniques, etc.
  • a commonly used technique is based on the use of the bacterium Agrobacterium tumefaciens, which consists essentially in introducing the construction of interest (nucleic acid, cassette, vector, etc.) into the bacterium A. tumefaciens, and then bringing this bacterium into contact transformed with appropriate explants of the chosen plant.
  • the introduction of the expression cassette into the bacterium is typically carried out using as a vector a plasmid with a disarmed T-DNA, which can be transferred into the bacterium, for example, by thermal shock. Incubation of the transformed bacterium with the appropriate explants makes it possible to obtain the transfer of the T-DNA containing the expression cassette into the genome of the cells of the disks.
  • transgenic plants may optionally be grown under conditions suitable for reconstituting a transgenic plant whose cells comprise the construction of the invention.
  • A. tumefaciens transformation technique reference may be made, for example, to Horsch et al. (1985). Science 227: 1229-1231, Hooykaas and Schilperoort (1992) Plant Mol. Biol. 19: 15-38 or Ishida et al. (2007) Nat Protoc, 2 (7): 1614-21.
  • microparticles typically microbeads
  • the particles used are typically gold particles, which are typically projected by means of a particle gun (see, for example, Russell et al., In Vitro Cell, Dev Biol., 1992, 28P, pp. 97-105). Klein et al Plant Physiol, 1989 Sep, 91 (1): 440-4).
  • the microinjection technique consists essentially of injecting genetic constructs into plant embryos or protoplasts and then cultivating these tissues in order to regenerate complete plants.
  • Other plant transgenesis techniques are well known, or other protocols employing the above techniques are described in the prior art (Siemens, J and Schieder, 1996, Plant Tissue Culture, Biotechnol 2:66). -75) and can be applied to the present invention.
  • the present invention relates to a method for expressing a coding sequence of interest in a host cell during meiosis, comprising introducing into said cell a nucleic acid, an expression cassette or a an expression vector according to the invention, said coding sequence being operably linked to a nucleic acid according to the invention. It also relates to the use of a nucleic acid, an expression cassette or an expression vector according to the invention for expressing a coding sequence of interest, preferably a heterologous one, in a host cell during the meiosis.
  • the coding sequence of interest may be heterologous with respect to the promoter, that is to say different from that to which the promoter is functionally linked in a natural genome, and / or heterologous with respect to the promoter.
  • the host cell that is to say a sequence that is not naturally present in the host cell.
  • the coding sequence of interest is heterologous with respect to the promoter, and optionally heterologous vis-à-vis the host cell.
  • the coding sequence of interest is either included in the expression cassette or the expression vector according to the invention and is operably linked to a nucleic acid according to the invention, or already present in the genome of the cell. host. In the latter case, the nucleic acid according to the invention is inserted into the genome of the cell so as to be operably linked to said sequence and thus allow its expression during meiosis.
  • the present invention relates to a multicellular plant organism, comprising an expression cassette or a vector according to the invention. It also relates to a method for producing a multicellular plant organism expressing a coding sequence of interest during meiosis, comprising introducing into a plant cell a nucleic acid, an expression cassette or a a vector according to the invention, preferably an expression cassette or a vector according to the invention, said coding sequence being operably linked to a nucleic acid according to the invention, and the reconstitution of said organism from of said cell.
  • the coding sequence of interest is heterologous vis-à-vis the promoter, and optionally heterologous vis-à-vis the plant cell.
  • the method may also comprise a step of selecting the organisms containing the nucleic acid, the cassette or the vector according to the invention.
  • This selection can be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by DNA amplification methods using primers targeting a specific sequence of the nucleic acid, the cassette or the vector.
  • the method may also further comprise a step of crossing the organisms obtained between themselves or with other plants of the same species or of different species. At the end of this cross, it is possible to select organisms containing the nucleic acid, the cassette or the vector according to the invention.
  • the introduction of the nucleic acid, the cassette or the vector according to the invention into the cell can be carried out by any means known to those skilled in the art, for example by one of the methods described above.
  • the term "multicellular plant organism” refers to an entire plant, plant parts such as flowers, seeds, leaves, stems, fruits, pollen, tubers, wood, or multicellular structures such as calli, plant organs, particularly meiotic and meiotic epicles, or immature embryos (eg explants used for transgenesis).
  • the multicellular plant organism is a whole plant or a seed.
  • the methods according to the invention can be processes in vitro, in vivo or ex vivo.
  • the methods according to the invention are in vitro processes.
  • the inventors have identified a transcriptional promoter functional during meiosis and demonstrated that the use of this promoter made it possible to express a fusion protein comprising a ZmSpol 1-1 domain and a DNA binding domain during meiosis.
  • the ZmSpol 1-1 gene carries the identifier GRMZM2Gl29913T04 (gene model T04 of the gene GRMZM2G129913) in version 3 of the genotype B73 reference sequence of maize.
  • the ZmPHYC2 gene (GRMZM2Gl29889_T0l) is unusually close to ZmSpol 1-1, with only 162bp between the end of the predicted 3'UTR of ZmPHYC2 and the beginning of the predicted 5'UTR of ZmSpol 1-1.
  • an internal NcoI restriction site was removed by point mutation, thus maintaining a unique NcoI site at the 3 'end of the fragment, which overlaps the ZmSpol 1-1 START codon.
  • an I-SceI restriction site was added. The sequence used in the clonings described below and comprising the ZmSpol 1-1 promoter is shown in FIG.
  • a phylogenetic analysis involving several species of cereals namely Zea mays, Sorghum bicolor, Setaria italica, Oryza sativa japonica, Brachypodium distachyon, Triticum aestivum, Saccharum officinarum, and Hordeum vulgare, demonstrated a strong sequence divergence in the intergenic region and the presence in this region of four conserved motifs, namely TTGX [A / T] GG, CGAXCGA, AAGCCXA, and AAAAXXAAAA (SEQ ID NO: 7). These patterns are framed in Figure 1.
  • a cassette comprising the TAL-ZmSpol II-1 chimeric gene placed under the control of the ZmSpo 11-1 promoter contained in SEQ ID NO: 5 (FIG. 1) was inserted into a plasmid to obtain the L1605 plasmid.
  • the TAL domain is a DNA binding domain that has been designed to recognize the 5'-TGGTTCTGTGACTACAAGTACAATG-3 'sequence (SEQ ID NO: 6). Its coding sequence was placed in phase upstream of the ZmSpol 1-1 cDNA, a 36 bp spacer with no STOP codon joining. An 18-bp sequence encoding a 6-His tag was added in-phase at the end of the ZmSpo 11-1 gene just before the STOP codon.
  • Plasmid L1604 was similarly obtained and contained a cassette comprising the TAL-ZmSpol 1-1 chimeric gene placed under the control of the strong constitutive promoter of the corn Pubiquitin gene, ZmUBI (GenBank accession number: S94464). Plasmid L1604 is identical to plasmid L1605 with the exception of the ZmUBI promoter which replaces the ZmSpol l-1 promoter.
  • the inventors used a maize plant comprising a mutation consisting of a deletion of part of the ZmSpo 11-1 gene (supplied by Arnaud Ronceret). This mutant has many defects in recombination, chromosome pairing and synapses during meiosis and shows complete male and nearly complete female sterility.
  • Maize A188 genotype was transformed with plasmids L1604 and L1605 according to the standard Ishida et al protocol (Nat. Protoc 2007; 2 (7): 1614-21).
  • T1 seedlings from these crosses were genotyped to identify seedlings carrying both the transgene and the mutation. Plants hemizygous for the transgene and hemizygous for the Zmspol 1-1 mutation were self-fertilized.
  • T2 seedlings resulting from selfing were genotyped. Plantlets homozygous for the Zmspol 1-1 mutation and (i) carrying the L1604 transgene (ZmUBI promoter
  • the panicles of mutant homozygous plants complemented by the L1605 transgene carry a normal number of anthers, while the complementation by the L1604 transgene (ZmUBI promoter - protein melting point TAL-ZmSpol 1-1) only slightly increases the number of anthers of the mutant (WT / Homo),
  • the anthers of homozygous mutant plants without complementation (WT / Homo) or complemented by L1604 (ZmUBI promoter - TAL-ZmSpol 1-1 fusion protein) contain many aborted pollen grains and almost no turgid pollen grains, whereas anthers supplemented with L1605 (ZmSpol 1-1 promoter - TAL-ZmSpol 1-1 fusion protein) contain normal amounts of turgid pollen.
  • the Spol II gene is recognized in many eukaryotic species as indispensable for meiotic recombination (Grêlon et al., EMBO J. 2001 Feb. 1, 20 (3): 589-600, Stacey et al., Plant J. 2006 Oct; 48 (2): 206-16) and SPO11 protein as necessary to initiate recombination by double-stranded DNA cleavage (Shingu et al., FEBS J. 2010 May; 277 (10): 2360-74; Hartung et al.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux promoteurs transcriptionnels fonctionnels durant la méiose. Elle fournit ainsi de nouveaux outils, méthodes et compositions pour l'expression de protéines lors de la méiose dans une cellule eucaryote, et plus particulièrement dans une cellule de plante.

Description

PROMOTEURS MÉIOTIQUES ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne des outils, méthodes et compositions pour l’expression de protéines lors de la méiose dans une cellule eucaryote, et plus particulièrement dans une cellule de plante.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION
Afin d’optimiser les productions végétales, l’industrie de l’agriculture est en perpétuelle recherche de plantes présentant des caractéristiques améliorées notamment au niveau de la croissance, du rendement, des propriétés organoleptiques, de la résistance aux maladies ou aux aléas climatiques, ou encore au niveau de caractéristiques d’importance en chimie verte ou pour la production de biocarburant.
De manière classique, une plante présentant des propriétés particulières peut être obtenue par reproduction sexuée en croisant deux souches parentales présentant des caractéristiques intéressantes et en sélectionnant une souche hybride apportant l’amélioration recherchée. Cette méthode est cependant aléatoire et l’étape de sélection peut engendrer des délais conséquents.
De manière alternative, il peut également être envisagé de modifier génétiquement la plante par une technique d’ADN recombinant. Cette modification peut néanmoins constituer un frein à son exploitation, que ce soit pour des raisons réglementaires, sanitaires ou environnementales.
Une troisième alternative consiste à provoquer un réassortiment des allèles d’origine paternelle et maternelle dans le génome, au cours de la recombinaison méiotique. La recombinaison méiotique est un échange d’ADN entre chromosomes homologues au cours de la méiose. Elle est initiée par la formation de cassures double -brin dans l’une ou l’autre des chromatides des chromosomes homologues, suivie de la réparation de ces cassures, utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue. Les recombinaisons méiotiques ont cependant l’inconvénient d’être distribuées de manière non-uniformes en terme de fréquence et de localisation le long des chromosomes.
Ces dernières années ont vu émerger de nouvelles technologies permettant d’influer sur la fréquence ou le positionnement des recombinaisons méiotiques. Il a ainsi été démontré qu’il était possible de modifier les sites de formation de cassures double-brin en exprimant des protéines recombinantes durant la prophase de la première division méiotique (Pecina et al, 2002 Cell, 111, 173-184 ; WO 2016/120480). Ces nouveaux outils ouvrent des perspectives extrêmement intéressantes pour l’optimisation dirigée des végétaux via un réassortissement des gènes naturellement présents chez la plante.
La modulation des événements méiotiques via l’expression de protéines recombinantes nécessite cependant l’utilisation de promoteurs présentant une activité transcriptionnelle durant cette phase. Certains de ces promoteurs ont été décrits tels que le promoteur du gène DMC1 d’Arabidopsis thaliana (Klimyuk and Jones. Plant J. 1997 Jan;l 1(1): 1-14) ou le promoteur du gène SP013 de Saccharomyces cerevisiae (Buckingham et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Dec;87(23):9406-l0.) Le choix disponible reste cependant largement insuffisant pour couvrir toutes les applications envisagées. Il subsiste donc un réel besoin pour de nouveaux promoteurs transcriptionnels permettant l’expression de protéines d’intérêt lors de la méiose.
RÉSUMÉ DE L’INVENTION
La présente invention propose un nouveau promoteur transcriptionnel fonctionnel durant la méiose. Ainsi, selon un premier aspect, elle concerne un acide nucléique isolé ayant une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel lors de la méiose et comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci, lesdits variants fonctionnels comprenant, ou consistant en,
- une séquence présentant au moins 70 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ;
- un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 50 nucléotides consécutifs, ou
- une séquence capable de s’hybrider en conditions de faible, moyenne ou forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou son brin complémentaire.
De préférence, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci présentant au moins 80 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. En particulier, il peut comprendre, ou consister en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une cassette d'expression comprenant une séquence codante liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention. Elle concerne également un vecteur d'expression comprenant un acide nucléique ou une cassette d’expression selon l’invention. La séquence codante peut notamment coder un polypeptide d'intérêt, de préférence une protéine rapportrice ou une protéine susceptible de moduler, de préférence d’augmenter, la fréquence des recombinaisons méiotiques, une protéine qui modifie la structure de la chromatine telle que par exemple des histone (dé)acétylases ou histone (dé)méthylases ou une protéine qui modifie la méthylation de l'ADN. Alternativement, la séquence codante code un acide nucléique d'intérêt, de préférence un siRNA, un shRNA, un ARNi, un miARN, un ARN antisens, un ribozyme, un DNAzyme ou un ARN guide capable de cibler l’action d’une endonucléase de type CRISPR, de préférence Cas9 ou dCas9, au niveau d’une séquence spécifique.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une cellule hôte non humaine transfectée ou transformée avec un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention.
Selon encore un autre aspect, l’invention concerne un procédé, de préférence un procédé in vitro, pour exprimer une séquence codante d’intérêt dans une cellule hôte non humaine lors de la méiose, comprenant l'introduction dans ladite cellule d’un acide nucléique, d'une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention, de préférence une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention. Elle concerne également un procédé, de préférence un procédé in vitro, de production d’un organisme multicellulaire végétal exprimant une séquence codante d’intérêt lors de la méiose, comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique, d'une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention, de préférence une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule. De préférence la cellule hôte est une cellule de plante.
La présente invention concerne également un organisme multicellulaire végétal comprenant une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention, ainsi que l’utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour exprimer une séquence codante d’intérêt, de préférence hétérologue, dans une cellule hôte non humaine, de préférence une cellule de plante, lors de la méiose. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1 : Séquence nucléotidique de la région génomique comprenant le dernier intron, le dernier exon et le 3’UTR du gène ZmPHYC2 et la région intergénique en amont de ZmSpol l-l. Les séquences encadrées constituent des motifs conservés chez différentes espèces.
Figure 2 : Panicules. Les panicules des plantes homozygotes mutantes Zmspol l-l portent beaucoup moins d'anthères.
Figure 3 : Anthères. Les anthères des plantes homozygotes mutantes Zmspol l-l sont atrophiées.
Figure 4 : Pollen. Les anthères des plantes homozygotes mutantes Zmspol 1-1 contiennent beaucoup de grains de pollen avortés et quasiment pas de grains de pollen turgescents.
Figure 5 : Panicules. Panicules des plantes homozygotes mutantes Zmspol 1-1 (WT/Homo) complémentées par le transgène L1605 (TR Spol l/Homo) ou par le transgène L1604 (TR Ubi/Homo).
Figure 6 : Anthères. Anthères des plantes homozygotes mutantes Zmspol l-l (WT/Homo) complémentées par le transgène L1605 (TR Spol l/Homo) ou par le transgène L1604 (TR Ubi/Homo).
Figure 7 : Pollen. Pollen des anthères des plantes homozygotes mutantes Zmspol l-l (WT/Homo) complémentées par le transgène L1605 (TR Spol l/Homo) ou par le transgène L1604 (TR Ubi/Homo).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
La présente demande décrit l'identification et la caractérisation de séquences d’acide nucléique régulatrices d'origine végétale, qui permettent de contrôler l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule eucaryote, de préférence une cellule de plante, durant la méiose. Les inventeurs ont en effet identifié une séquence nucléotidique en amont du gène ZmSpol 1-1 (GenelD NCBI : 100279325) du maïs ( Zea mays) présentant une activité de promoteur transcriptionnel durant la méiose. Ils ont également démontré que ce promoteur était plus performant durant la méiose qu’un promoteur constitutif fort tel que le promoteur de l’ubiquitine (ZmUBI). Définitions
Dans la présente description, les termes «acide nucléique», «séquence nucléique», «polynucléotide», «oligonucléotide», «séquence nucléotidique», sont employés indifféremment et se réfèrent à un polymère de désoxyribonucléotides et/ou de ribonucléotides. Ces termes peuvent notamment inclure des molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, comprenant des bases non-naturelles ou des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. L’acide nucléique selon l’invention peut être obtenu par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple par synthèse chimique et/ou par des techniques de recombinaison et/ou de mutagenèse. Selon certains modes de réalisation préférés, l’acide nucléique selon l’invention est une molécule d’ADN, de préférence une molécule d’ADN double brin. Cette molécule peut être obtenue par des techniques recombinantes bien connues de l'homme du métier.
Tel qu’utilisé ici, le terme « isolé » se réfère à un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement naturel. Plus particulièrement, le terme « acide nucléique isolé » se réfère à une molécule d’acide nucléique qui est séparée des acides nucléiques qui lui sont adjacents lorsqu’il est dans son environnement naturel, c’est-à-dire dans le génome à partir duquel il a été isolé. L’ acide nucléique isolé peut être inclus dans un vecteur, un génome, une composition ou tout autre élément, tout en demeurant isolé, dans la mesure où cet élément ne constitue pas son environnement naturel.
Tel qu’utilisé ici, le terme « promoteur transcriptionnel » se réfère à un élément de régulation qui a la capacité d’initier la transcription d’un acide nucléique auquel il est lié de manière opérationnelle. L’activité d’un tel promoteur peut être évaluée par toute méthode connue de l’homme du métier, et notamment par toute méthode permettant de quantifier l’ARNm ou la protéine obtenu à partir du gène contrôlé par le promoteur. A titre d’illustration, l’activité peut être mesurée en évaluant la quantité d’ ARNm, par exemple par Northern-blot ou RT-PCR, ou en évaluant la quantité de protéine traduite, par exemple par Westem-blot, ELISA, tests colorimétriques, tests d’activité enzymatique ou en utilisant un système de gène rapporteur.
Tel qu’utilisé ici, l’expression « lié de manière opérationnelle » se réfère à des séquences nucléotidiques qui sont combinées/agencées de manière à ce que la fonction de l’une agisse sur l’autre. Ainsi, un promoteur transcriptionnel et une séquence nucléotidique, par exemple une séquence codante, sont liés de manière opérationnelle lorsque l’expression de la séquence nucléotidique est contrôlée par ledit promoteur.
Le terme « % d’identité de séquence » ou « % d’identité », tel qu’utilisé ici, se réfère au pourcentage de nucléotides identiques dans un alignement de deux polynucléotides. Ce pourcentage peut être aisément calculé par l'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquence. L’identité de séquence est déterminée en comparant les séquences après les avoir alignées en maximisant les recouvrements et les identités tout en minimisant les espaces. En particulier, l’identité de séquence peut être déterminée en utilisant l’un des algorithmes mathématiques d’alignement global ou local disponibles. Les séquences de tailles similaires sont de préférence alignées au moyen d’un algorithme d’alignement global (e.g. Needleman and Wunsch, 1970) qui aligne les séquences de façon optimisée sur toute leur longueur. Les séquence de longueurs substantiellement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d’alignement local (e.g. Smith and Waterman, 1981 ; Altschul et al., 1997 ; Altschul et al., 2005). Les alignements pour déterminer le pourcentage d’identité peuvent être réalisés par toute méthode connue de l’homme du métier, notamment en utilisant des programmes informatiques disponibles sur internet (par exemple, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). De préférence, la valeur du pourcentage d’identité se réfère ici à une valeur obtenue avec le programme EMBOSS Needle qui utilise l’algorithme d’alignement global Needleman-Wunsch avec les paramètres par défaut, à savoir : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.
Selon un premier aspect, la présente demande concerne un acide nucléique, de préférence isolé, ayant une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel lors de la méiose et comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci.
L’acide nucléique selon l’invention a une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel lors de la méiose. Cela signifie qu’il est capable d’initier, durant la méiose, la transcription d’un acide nucléique auquel il est lié de manière opérationnelle. La méiose comprend deux divisions cellulaires successives. La première division méiotique est dite réductionnelle et comprend les étapes de prophase I, métaphase I, anaphase I et télophase I. La seconde division méiotique est dite équationnelle comprend les étapes de métaphase II, anaphase II et télophase II. De préférence, l’acide nucléique selon l’invention a une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel au moins durant la prophase I de la méiose.
Selon un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique selon l’invention a une activité de promoteur transcriptionnel durant la méiose, et plus particulièrement durant la prophase I de méiose, qui est supérieure à celle d’un promoteur constitutif fort. De préférence, l’acide nucléique selon l’invention a une activité de promoteur transcriptionnel durant la méiose qui est supérieure à celle du promoteur du gène de l’ubiquitine, et notamment du gène de l’ubiquitine du maïs (numéro d’entrée GenBank : S94464, position 4-1997). L’acide nucléique selon l’invention est donc, de préférence, capable d’induire, durant la méiose, et plus particulièrement durant la prophase I de méiose, l’expression d’une séquence codante d’intérêt de manière plus efficace qu’un promoteur constitutif fort, en particulier que le promoteur du gène de l’ubiquitine, et notamment du gène de l’ubiquitine du maïs. Cette caractéristique peut être évaluée par toute méthode connue de l’homme du métier, et en particulier selon la méthode décrite dans la partie expérimentale ci-dessous. Selon un mode de réalisation, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, la séquence SEQ ID NO : 1.
Selon un autre mode de réalisation, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, un variant fonctionnel de la séquence SEQ ID NO : 1.
Tel qu’utilisé ici, le terme « variant » se réfère à une séquence nucléotidique qui diffère de la séquence parente (e.g. SEQ ID NO : 1), mais qui en conserve les propriétés essentielles. La séquence du variant peut différer de la séquence parente par une ou plusieurs substitutions, délétions et/ou insertions. Le variant peut avoir une longueur identique ou différente (plus courte ou plus longue) de la séquence parente. Le terme « variant fonctionnel » se réfère à un variant tel que défini ci-dessus qui conserve l’activité de la demande parente, en l’occurrence une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel lors de la méiose.
Selon un mode de réalisation, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, un variant fonctionnel de la séquence SEQ ID NO : 1 sélectionné dans le groupe constitué de
- d’une séquence présentant au moins 70 %, de préférence au moins 80%, d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ;
- un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 50 nucléotides consécutifs, et - d’une séquence capable de s’hybrider en conditions de faible, moyenne ou forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou son brin complémentaire.
Selon un mode de réalisation, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, un variant fonctionnel présentant une séquence ayant au moins 70%, au moins 71%, au moins 72%, au moins 73%, au moins 74%, au moins 75%, au moins 76%, au moins 77%, au moins
78%, au moins 79%, au moins 80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins
84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins
90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins
96%, au moins 97%, au moins 98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence sur toute la longueur de la séquence SEQ ID NO : 1. L’acide nucléique selon l’invention peut différer de la séquence SEQ ID NO : 1 par au maximum 15, c’est-à-dire 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, substitutions, insertions et/ou délétions.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, un variant fonctionnel qui est un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 ou 170 nucléotides consécutifs. De préférence, le variant fonctionnel est un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 100 nucléotides consécutifs. De manière plus particulièrement préférée, le variant fonctionnel est un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 110 nucléotides consécutifs.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, un variant fonctionnel présentant une séquence capable de s’hybrider en conditions de faible, moyenne ou forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou son brin complémentaire, de préférence en conditions de moyenne ou forte stringence, et de manière plus particulièrement préférée en conditions de forte stringence.
Tel qu’utilisé ici, le terme « conditions de faible stringence » se réfère à une pré hybridation et une hybridation à 42°C dans un milieu 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 pg/mL d’ADN de sperme de saumon dénaturé et soniqué et 25% formamide, suivies des procédures classiques de Southern blot durant 12 à 24 heures. Le support est ensuite lavé trois fois durant 15 minutes dans un tampon 2X SSC, 0.2% SDS à 50°C. Tel qu’utilisé ici, le terme « conditions de moyenne stringence » se réfère à une pré-hybridation et une hybridation à 42°C dans un milieu 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 pg/mL d’ADN de sperme de saumon dénaturé et soniqué et 35% formamide, suivies des procédures classiques de Southern blot durant 12 à 24 heures. Le support est ensuite lavé trois fois durant 15 minutes dans un tampon 2X SSC, 0.2% SDS à 55°C. Tel qu’utilisé ici, le terme « conditions de forte stringence » se réfère à une pré-hybridation et une hybridation à 42°C dans un milieu 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 pg/mL d’ADN de sperme de saumon dénaturé et soniqué et 50% formamide, suivies des procédures classiques de Southern blot durant 12 à 24 heures. Le support est ensuite lavé trois fois durant 15 minutes dans un tampon 2X SSC, 0.2% SDS à 65°C.
Selon des modes de réalisation préférés, les variants fonctionnels de la séquence SEQ ID NO : 1 comprennent, de préférence lorsqu’ils sont alignés avec la SEQ ID NO : 1 au moyen d’un algorithme mathématique d’alignement global ou local, au moins 1, 2 ou 3 motifs conservés choisis parmi les motifs suivants :
- TTGN[A/T]GG, de préférence TTGNAGG, et de manière particulièrement préférée, TTGAAGG, aux positions 62 à 68 de la SEQ ID NO : 1,
- CGANCGA, de préférence CGATCGA, aux positions 115 à 121 de la SEQ ID NO : 1,
- AAGCCNA, de préférence AAGCCTA, aux positions 94 à 100 de la SEQ ID NO : 1, et
- AAAANNAAAA (SEQ ID NO : 7), de préférence AAAATCAAAA (SEQ ID NO : 8), aux positions 152 à 161 de la SEQ ID NO : 1.
N peut être A, T, C ou G
De préférence, les variants fonctionnels comprennent ces 4 motifs conservés. Ces motifs sont encadrés dans la figure 1.
Selon un mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 2, 3 ou 4 et des variants fonctionnels de celles-ci, sous réserve que ces variants fonctionnels comprennent (i) au moins 50, au moins 60, au moins 70, au moins 80, au moins 90, au moins 100, au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 150, au moins 160 ou au moins 170 nucléotides consécutifs de la SEQ ID NO : 1, et/ou (ii) comprennent une séquence présentant au moins 70%, au moins 71%, au moins 72%, au moins 73%, au moins 74%, au moins 75%, au moins 76%, au moins 77%, au moins 78%, au moins 79%, au moins
80%, au moins 81%, au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins
86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins
92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins
98% ou au moins 99% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, les variants fonctionnels comprennent au moins 1, 2 ou 3 des motifs conservés mentionnés ci-dessus, de préférence les 4 motifs.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 2, 3 ou 4 et des variants fonctionnels de celles-ci, sous réserve que ces variants fonctionnels comprennent (i) au moins 110 nucléotides consécutifs de la SEQ ID NO : 1, et/ou (ii) comprennent une séquence présentant au moins 70% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence au moins 70% d’identité de séquence sur toute la longueur de la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, les variants fonctionnels comprennent au moins 1, 2 ou 3 des motifs conservés mentionnés ci-dessus, de préférence les 4 motifs.
Selon un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique selon l’invention comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence au moins 80% d’identité de séquence sur toute la longueur de la séquence SEQ ID NO : 1.
Dans un second aspect, la présente invention concerne également une cassette d’expression comprenant une séquence codante d’intérêt liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention.
Tel qu'utilisé ici, le terme "cassette d'expression" se réfère à une construction d'acide nucléique comprenant une séquence codante et une ou plusieurs séquences de contrôle requises pour l'expression de ladite séquence codante. En particulier, l'une de ces séquences de contrôle est un acide nucléique selon l'invention ayant une activité de promoteur. Généralement, la cassette d'expression comprend une séquence codante et des séquences régulatrices précédant (séquences non codantes en 5 ') et suivant (séquences non codantes en 3') la séquence codante qui est requise pour l'expression du produit génique d’intérêt. Ainsi, une cassette d'expression comprend typiquement une séquence promotrice, une région 5' non traduite, une séquence codante et une région 3' non traduite qui contient habituellement un site de polyadénylation et / ou un terminateur de transcription. La cassette d'expression peut également comprendre des éléments régulateurs supplémentaires tels que, par exemple, des séquences amplificatrices (« enhancers »), une séquence « polylinker » facilitant l'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur et / ou des signaux d'épissage. La cassette d'expression est habituellement incluse dans un vecteur, pour faciliter le clonage et la transformation.
De préférence, la cassette d’expression est une cassette d’expression recombinante, c’est- à-dire que l’acide nucléique selon l'invention est lié de manière fonctionnelle à une séquence codante hétérologue. Tel qu'utilisé ici, le terme "hétérologue" se réfère à une séquence codante qui est différente de celle auquel le promoteur est lié de manière fonctionnelle dans un génome naturel. En particulier, dans certains modes préférés de réalisation, la séquence codante d’intérêt n’est pas le gène ZmSpoll-1 (GenelD : 100279325) du maïs (Zea mays).
La séquence codante d’intérêt liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention peut coder pour un polypeptide d'intérêt ou un acide nucléique d’intérêt.
Selon un mode de réalisation, la séquence codante d’intérêt liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention code pour un polypeptide d'intérêt. Le polypeptide d'intérêt peut être n'importe quel polypeptide dont l'expression est souhaitée durant la méiose. En particulier, le polypeptide d'intérêt peut être une protéine rapportrice, une protéine susceptible de moduler, de préférence d’augmenter, la fréquence des recombinaisons méiotiques, une protéine qui modifie la structure de la chromatine telle que par exemple des histone (dé)acétylases ou histone (dé)méthylases, et/ou une protéine qui modifie la méthylation de l'ADN.
La protéine rapportrice peut être aisément choisie par l’homme du métier selon la nature de la cellule hôte et la technique de détection. La protéine rapportrice peut être choisie, par exemple, parmi les protéines fluorescentes, les phosphatases alcalines, les bêta-glucuronidases les bêta-galactosidases, les bêta-lactamases ou la peroxydase de raifort.
La protéine susceptible de moduler la fréquence des recombinaisons méiotiques peut également être aisément choisie par l’homme du métier. La modulation peut être une augmentation générale de la fréquence des recombinaisons ou une augmentation ciblée, c’est- à-dire une augmentation concernant une région génomique donnée. A titre d’exemple, cette protéine peut être une protéine obtenue en fusionnant une protéine Spol l avec un domaine de liaison à l’ADN tel que l’activateur de transcription Gal4 (Pecina et al, 2002 Cell, 111, 173- 184), le domaine ZF (Zinc Finger) ou le domaine TALE (Transcription Activator-Like Effector), ou encore une protéine obtenue en fusionnant une protéine Spol 1 avec un domaine Cas9, de préférence un domaine « dead Cas9 » ou dCas9 dépourvu d’activité nucléase, et utilisée en combinaison avec un ARN guide capable de cibler une séquence spécifique (WO 2016/120480).
Selon un autre mode de réalisation, la séquence codante d’intérêt liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention code pour un acide nucléique d'intérêt. L’acide nucléique d'intérêt peut être n'importe quel acide nucléique dont l'expression est souhaitée durant la méiose. En particulier, l'acide nucléique d'intérêt peut être un siRNA, un shRNA, un ARNi, un miARN, un ARN antisens, un ribozyme, un DNAzyme ou un ARN guide capable de cibler l’action d’une endonucléase de type CRISPR, de préférence Cas9 ou dCas9, au niveau d’une séquence spécifique.
La séquence codante d’intérêt liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention peut coder pour une ou plusieurs molécules d’intérêt, i.e. pour un ou plusieurs polypeptides d'intérêt et/ou un ou plusieurs acides nucléiques d’intérêt.
La cassette d’expression selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs séquences codantes d’intérêt liées de manière opérationnelle à l’acide nucléique selon l’invention.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
Dans un troisième aspect, la présente invention concerne également un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention ou une cassette d'expression selon l'invention.
Tel qu'utilisé ici, le terme "vecteur" se réfère à une molécule d'acide nucléique utilisée comme véhicule pour transférer un matériel génétique, et en particulier pour délivrer un acide nucléique dans une cellule hôte, soit in vitro, soit in vivo. Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double-brin. Les vecteurs comprennent, mais sans y être limités, les plasmides, les phasmides, les cosmides, les éléments transposables, les virus et les chromosomes artificiels (par exemple les YAC). Les vecteurs peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier.
Avantageusement, le vecteur selon l’invention est un vecteur de plante, c'est-à-dire un vecteur capable de transformer une cellule végétale. Des exemples de vecteurs de plantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on peut citer notamment les plasmides T-DNA de A. tumefaciens rBIN19 (Bevan et al., 1984, Nucleic Acids Research, vol. 12 : 8711-8721), le vecteur pPZPlOO (Hajdukiewicz et al. 1994, Plant Mol. Biol. 25: 989-994), les vecteurs de la série pCAMBIA (R. Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405) ou encore les vecteurs décrits dans les articles de K a ri mi et al. (Plant Physiology; 2007, 145(4): 1183-91, et Plant Physiology; 2007, 145(4): 1144-54) qui sont plus spécifiques des monocots.
Les vecteurs selon l'invention peuvent comprendre, en outre, une ou plusieurs origines de réplication bactériennes et/ou eucaryotes. Il peut notamment comprendre une origine de réplication bactérienne permettant sa sélection lors des étapes de clonage, par exemple une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli, et une autre origine de réplication utilisée lors du transfert dans la cellule végétale, par exemple une origine de réplication fonctionnelle chez Agrobacterium tumefaciens. Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans une cellule hôte bactérienne ou eucaryote comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique, un gène permettant de complémenter une auxotrophie ou un gène conférant une tolérance à un herbicide. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
Le vecteur d’expression peut également comprendre une ou plusieurs séquences permettant l’insertion ciblée du vecteur, de la cassette d’expression ou de l’acide nucléique selon l’invention dans le génome d’une cellule hôte.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne G utilisation d’un acide nucléique, d’une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour transformer ou transfecter une cellule hôte. Elle concerne également une cellule hôte transformée ou transfectée par au moins un acide nucléique, une cassette d’expression ou un vecteur d’expression selon l’invention. De préférence, la cellule hôte transformée ou transfectée contient ledit acide nucléique, ladite cassette ou ledit vecteur selon l’invention sous forme non intégrée ou intégrée dans le génome.
Tel qu’utilisé ici, le terme « cellule hôte » se réfère à une cellule procaryote ou une cellule eucaryote non humaine. De préférence, la cellule hôte est une cellule eucaryote non humaine choisie parmi une cellule de levure, de plante, de champignon ou une cellule animale. De manière plus particulièrement préférée, la cellule hôte est une cellule de plante. Selon certains modes de réalisation, ce terme englobe également les protoplastes végétaux. Dans un mode de réalisation préféré, la cellule hôte est une cellule de plante. En particulier, la cellule hôte peut être une cellule de plante sélectionnée dans le groupe constitué des céréales telles que le maïs, le riz, le blé, l’orge, le sorgho, le millet, l’avoine et le seigle, du tournesol, du colza, de plantes modèles telles qu ' Arabidopsis thaliana ou Brachypodium dystachion, des légumes tels que la tomate, le poivron, le piment, le chou, le chou-fleur ou la laitue, des légumineuses telles que les fèves, les haricots, les lentilles, les pois cassés, les pois chiches, le soja, la féverole ou la luzerne, du coton, des plantes sucrières telles que la canne à sucre ou la betterave, et les plantes fruitières telles que les plantes produisant les agrumes (par exemple, les citrons, les oranges ou les pamplemousses), les baies (par exemple, les fraises, les groseilles, les framboises ou les raisins), les fruits à pépins (par exemple, les pommes ou les poires), les fruits à noyau (par exemple, les abricots, les cerises ou les pêches) ou les fruits à coque (par exemple, les noisettes ou les noix). De manière plus particulièrement préférée, la cellule hôte est une cellule de maïs.
La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable. L’acide nucléique, la cassette ou le vecteur selon l’invention peut être contenu dans la cellule sous forme non intégrée ou intégrée dans le génome.
Les techniques de transfection ou de transformation des cellules hôtes sont bien connues de l’homme du métier. En particulier, les techniques de transgénèse végétale sont bien connues et comprennent par exemple G utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, l’électroporation, le transfert direct, des techniques biolistiques, etc.
Une technique communément utilisée repose sur l’utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, qui consiste essentiellement à introduire la construction d’intérêt (acide nucléique, cassette, vecteur, etc.) dans la bactérie A. tumefaciens, puis à mettre en contact cette bactérie transformée avec des explants appropriés de la plante choisie. L’introduction de la cassette d’expression dans la bactérie est typiquement réalisée en utilisant comme vecteur un plasmide avec un T-DNA désarmé, qui peut être transféré dans la bactérie, par exemple, par choc thermique. L’incubation de la bactérie transformée avec les explants appropriés permet d’obtenir le transfert du T-DNA contenant la cassette d’expression dans le génome des cellules des disques. Ceux-ci peuvent éventuellement être cultivés dans des conditions appropriées pour reconstituer une plante transgénique dont les cellules comprennent la construction de l’invention. Pour plus de détails ou des variantes de mise en œuvre de la technique de transformation par A. tumefaciens, on peut se référer par exemple à Horsch et al., (1985) Science 227:1229-1231, Hooykaas and Schilperoort (1992) Plant Mol. Biol. 19: 15-38 ou encore Ishida et al. (2007) Nat Protoc, 2(7):1614-21.
Une autre technique de transformation végétale est basée sur la projection de microparticules (typiquement des microbilles) auxquelles sont attachées les constructions génétiques, directement sur des cellules végétales, suivie de la culture de ces cellules pour reconstituer une plante transgénique. Les particules utilisées sont typiquement des particules d’or, qui sont projetées typiquement au moyen d’un canon à particules (voir notamment Russell et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 1992, 28P, p. 97-105 et Klein et al. Plant Physiol. 1989 Sep;9l(l):440-4).
La technique de microinjection consiste essentiellement à injecter des constructions génétiques dans des embryons ou protoplastes végétaux, puis à cultiver ces tissus de manière à régénérer des plantes complètes. D’autres techniques de transgénèse végétale sont bien connues, ou d’autres protocoles mettant en œuvre les techniques ci-dessus sont décrits dans l’art antérieur (Siemens, J and Schieder, 1996, Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 2:66-75) et peuvent être appliqués à la présente invention.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé pour exprimer une séquence codante d’intérêt dans une cellule hôte lors de la méiose, comprenant l'introduction dans ladite cellule d’un acide nucléique, d'une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention. Elle concerne également G utilisation d'un acide nucléique, d'une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour exprimer une séquence codante d’intérêt, de préférence hétérologue, dans une cellule hôte lors de la méiose.
La séquence codante d’intérêt peut être hétérologue vis-à-vis du promoteur, c’est-à-dire différente de celle auquel le promoteur est lié de manière fonctionnelle dans un génome naturel, et/ou hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte, c’est-à-dire une séquence qui n’est pas naturellement présente dans la cellule hôte. De préférence, la séquence codante d’intérêt est hétérologue vis-à-vis du promoteur, et optionnellement hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte. La séquence codante d’intérêt est soit comprise dans la cassette d’expression ou le vecteur d’expression selon l’invention et y est liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention, soit déjà présente dans le génome de la cellule hôte. Dans ce dernier cas, l’acide nucléique selon l’invention est inséré dans le génome de la cellule de sorte à être lié de manière opérationnelle à ladite séquence et ainsi permettre son expression lors de la méiose.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un organisme multicellulaire végétal, comprenant une cassette d'expression ou un vecteur selon l’invention. Elle concerne également un procédé de production d’un organisme multicellulaire végétal exprimant une séquence codante d’intérêt lors de la méiose, comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique, d'une cassette d'expression ou d’un vecteur selon l’invention, de préférence d'une cassette d'expression ou d’un vecteur selon l’invention, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l’invention, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule. De préférence, la séquence codante d’intérêt est hétérologue vis-à-vis du promoteur, et optionnellement hétérologue vis-à-vis de la cellule de plante.
Optionnellement, le procédé peut également comprendre une étape de sélection des organismes contenant l’acide nucléique, la cassette ou le vecteur selon l’invention. Cette sélection peut être réalisée par toute méthode connue de l’homme du métier, notamment par des méthodes d’amplification de l’ADN utilisant des amorces ciblant une séquence spécifique de l’acide nucléique, de la cassette ou du vecteur.
Le procédé peut également comprendre en outre une étape de croisement des organismes obtenus entre eux ou avec d’autres plantes de la même espèce ou d’espèces différentes. A l’issue de ce croisement, il est possible de sélectionner des organismes contenant l’acide nucléique, la cassette ou le vecteur selon l’invention.
L’introduction de l’acide nucléique, de la cassette ou du vecteur selon l’invention dans la cellule peut être effectué par tout moyen connu de l’homme du métier, par exemple par l’une des méthodes décrites ci-dessus. Tel qu’utilisé ici, le terme « organisme multicellulaire végétal » se réfère à une plante entière, des parties de plante telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, du bois, ou des structures multicellulaires telles que des cals, des organes de plante, en particulier des panicules méiotiques et épi méiotiques, ou des embryons immatures (e.g. explants utilisés pour la transgenèse). Dans certains modes de réalisation préférés, l’organisme multicellulaire végétal est une plante entière ou une graine.
La reconstitution d’un organisme multicellulaire végétal tel que défini ci-dessus à partir d’une cellule de plante transfectée ou transformée fait appel à des techniques de routine bien connues de l’homme du métier.
Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.
Les procédés selon l’invention peuvent être des procédés in vitro, in vivo ou ex vivo. De préférence, les procédés selon l’invention sont des procédés in vitro.
Les exemples qui suivent sont présentés dans un but illustratif et non limitatif.
EXEMPLES
Les inventeurs ont identifié un promoteur transcriptionnel fonctionnel durant la méiose et démontré que l’utilisation de ce promoteur permettait d’exprimer une protéine de fusion comprenant un domaine ZmSpol 1-1 et un domaine de liaison à l'ADN pendant la méiose.
Le gène ZmSpol 1-1 porte l'identifiant GRMZM2Gl299l3_T04 (gene model T04 du gène GRMZM2G129913) dans la version 3 de la séquence de référence du génotype B73 du maïs. Dans le génome de ce génotype, le gène ZmPHYC2 (GRMZM2Gl29889_T0l) est inhabituellement proche de ZmSpol 1-1, avec seulement 162 pb entre la fin du 3'UTR prédit de ZmPHYC2 et le début du 5'UTR prédit de ZmSpol 1-1. Afin de faciliter le clonage de la région promotrice, un site de restriction Ncol interne a été éliminé par mutation ponctuelle, maintenant ainsi un site unique Ncol à l'extrémité 3' du fragment, qui chevauche le codon START de ZmSpol l-l. A l'extrémité 5' un site de restriction I-Scel a été ajouté. La séquence utilisée dans les clonages décrits ci-après et comprenant le promoteur ZmSpol 1-1 est présentée en Figure 1.
Une analyse phylogénétique impliquant plusieurs espèces de céréales, à savoir Zea mays, Sorghum bicolor, Setaria italica, Oryza sativa japonica, Brachypodium distachyon, Triticum aestivum, Saccharum officinarum et Hordeum vulgare, a permis de mettre en évidence une forte divergence des séquences au niveau de la région intergénique et la présence dans cette région de quatre motifs conservés, à savoir TTGX[A/T]GG, CGAXCGA, AAGCCXA et AAAAXXAAAA (SEQ ID NO : 7). Ces motifs sont encadrés dans la figure 1.
Constructions ylasmidiaues
Une cassette comprenant le gène chimère TAL-ZmSpol l-l placé sous le contrôle du promoteur ZmSpo 11-1 contenu dans la SEQ ID NO : 5 (Figure 1) a été insérée dans unplasmide afin d’obtenir le plasmide L1605. Le domaine TAL est un domaine de liaison à l'ADN qui a été dessiné pour reconnaître la séquence 5'-TGGTTCTGTGACTACAAGTACAATG-3' (SEQ ID NO : 6). Sa séquence codante a été placée en phase en amont de l'ADNc de ZmSpol l-l, un espaceur de 36 pb sans codon STOP faisant la jonction. Une séquence de 18 pb codant pour un tag 6-His a été ajoutée en phase à la fin du gène ZmSpo 11-1 juste avant le codon STOP.
Un plasmide L1604 a été obtenu de manière similaire et contenait une cassette comprenant le gène chimère TAL-ZmSpol 1-1 placé sous le contrôle du promoteur constitutif fort du gène de Pubiquitine du maïs, ZmUBI (numéro d’entrée GenBank : S94464). Le plasmide L1604 est identique au plasmide L1605 à l'exception du promoteur ZmUBI qui remplace le promoteur ZmSpol l-l.
Mutant Zmspo 11-1
Les inventeurs ont utilisé un plant de maïs comprenant une mutation consistant en une délétion d’une partie du gène ZmSpo 11-1 (fourni par Arnaud Ronceret). Ce mutant présente de nombreux défauts de la recombinaison, de l'appariement des chromosomes et des synapses lors de la méiose et montre une stérilité complète mâle et presque complète femelle.
La floraison mâle et la production de pollen de plantes hétérozygotes et homozygotes pour cette délétion ont été caractérisées au niveau de la panicule, de l'anthère et du pollen.
Il a ainsi été montré que les panicules des plantes mutantes portent beaucoup moins d'anthères, et que les anthères des plantes mutantes sont atrophiées et contiennent beaucoup de grains de pollen avortés et quasiment pas de grains de pollen turgescents (Figures 2 à 4). Plantes transgéniques contenant le promoteur ZmSpol 1-1
Le génotype A188 du maïs a été transformé avec les plasmides L1604 et L1605 selon le protocole standard d'Ishida et al (Nat Protoc. 2007;2(7): 1614-21).
Pour chaque construction, un seul évènement de transformation a été obtenu, chaque fois représenté par deux plantes issues d'un même cal. Les plantes T0 comprenant soit le plasmide L1604 (promoteur ZmUBI), soit le plasmide L1605 (promoteur ZmSpol 1-1) ont été croisées avec le mutant Zmspo 11-1.
Complémentation du mutant Zmspo 11-1
Pour tester la complémentation du mutant Zmspol 1-1 par les transgènes L1604 (promoteur ZmUBI - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) ou L1605 (promoteur ZmSpol 1-1 - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1), les plantes T0 ont été croisées avec des plantes hétérozygotes portant la mutation Zmspo 11-1.
Les plantules Tl issues de ces croisements ont été génotypées pour identifier les plantules portant à la fois le transgène et la mutation. Les plantes hémizygotes pour le transgène et hémizygotes pour la mutation Zmspol 1-1 ont été autofécondées.
Les plantules T2 issues des autofécondations ont été génotypées. Des plantules homozygotes pour la mutation Zmspol 1-1 et (i) portant le transgène L1604 (promoteur ZmUBI
- protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1), (ii) portant le transgène L1605 (promoteur ZmSpol 1-1
- protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1), ou (iii) ne portant pas de transgène, ont été retenues pour analyse phénotypique.
Les résultats de cette analyse sont présentés sur les Figures 5 à 7 et montrent que
- les panicules des plantes homozygotes mutantes complémentées par le transgène L1605 (promoteur ZmSpol 1-1 - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) portent un nombre normal d'anthères, alors que la complémentation par le transgène L1604 (promoteur ZmUBI - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) n'augmente que faiblement le nombre d'anthères du mutant (WT/Homo),
- les anthères des plantes homozygotes mutantes sans complémentation (WT/Homo) ou complémentées par L1604 (promoteur ZmUBI - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) sont atrophiées, alors que les anthères complémentées par L1605 (promoteur ZmSpol 1-1 - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) sont normales (turgescentes),
- les anthères des plantes homozygotes mutantes sans complémentation (WT/Homo) ou complémentées par L1604 (promoteur ZmUBI - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) contiennent beaucoup de grains de pollen avortés et quasiment pas de grains de pollen turgescents, alors que les anthères complémentées par L1605 (promoteur ZmSpol 1-1 - protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1) contiennent des quantités normales de pollen turgescent.
Le gène Spol l-l est reconnu chez de nombreuses espèces d'eucaryotes comme indispensable pour la recombinaison méiotique (Grêlon et al. EMBO J. 2001 Feb l;20(3):589- 600; Stacey et al. Plant J. 2006 Oct;48(2):206-l6) et la protéine SPOl l-l comme nécessaire pour initier la recombinaison par une coupure double brin de l'ADN (Shingu et al. FEBS J. 2010 May;277(l0):2360-74; Hartung et al. Plant Cell. 2007 Oct;l9(l0):3090-9) au sein d'un complexe protéique formé avec SPOl l-2 et TOPOVIB (Vrielynck et al. Science. 2016 Feb 26;35l(6276):939-43). Des mutants spol l-l sont caractérisés par des aberrations de la méiose menant à la stérilité. Le fait qu'une protéine de fusion TAL-ZmSpol 1-1 sous contrôle d’un promoteur selon l’invention présent dans le plasmide L1605 complémente la mutation Zmspol 1-1, démontre que ce promoteur est un promoteur fonctionnel durant la méiose. Par ailleurs, les résultats obtenus montrent également que ce promoteur permet d’obtenir un niveau d’expression durant la méiose supérieur à celui obtenu avec un promoteur constitutif fort tel que le promoteur de l’ubiquitine.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique isolé ayant une activité de promoteur transcriptionnel fonctionnel lors de la méiose et comprenant, ou consistant en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci, lesdits variants fonctionnels comprenant, ou consistant en,
- une séquence présentant au moins 70 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ;
- un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 50 nucléotides consécutifs, ou
- une séquence capable de s’hybrider en conditions de faible, moyenne ou forte stringence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou son brin complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci, lesdits variants fonctionnels comprenant, ou consistant en,
- une séquence présentant au moins 70 % d’identité de séquence sur tout la longueur de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou
- un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 d’au moins 110 nucléotides consécutifs.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 1 et des variants fonctionnels de celle-ci présentant au moins 80 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence au moins 80% d’identité de séquence sur toute la longueur de la séquence SEQ ID NO : 1.
4. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend, ou consiste en, une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3 ou 4.
5. Cassette d'expression recombinante comprenant une séquence codante liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Cassette d'expression recombinante selon la revendication 5, caractérisée en ce que l’acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 est lié de manière fonctionnelle à une séquence codante hétérologue.
7. Cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence codante code un polypeptide d'intérêt, de préférence une protéine rapportrice ou une protéine susceptible de moduler, de préférence d’augmenter, la fréquence des recombinaisons méiotiques, une protéine qui modifie la structure de la chromatine telle que par exemple des histone (dé)acétylases ou histone (dé)méthylases ou une protéine qui modifie la méthylation de l'ADN.
8. Cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que la séquence codante code un acide nucléique d'intérêt, de préférence un siRNA, un shRNA, un ARNi, un miARN, un ARN antisens, un ribozyme, un DNAzyme ou un ARN guide capable de cibler l’action d’une endonucléase de type CRISPR, de préférence Cas9 ou dCas9, au niveau d’une séquence spécifique.
9. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 ou une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8.
10. Cellule hôte non humaine transfectée ou transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, ou un vecteur d’expression selon la revendication 9.
11. Cellule hôte non humaine selon la revendication 10, contenant l’acide nucléique, la cassette d’expression ou le vecteur d’expression sous forme non intégrée ou intégrée dans le génome.
12. Procédé, de préférence in vitro, pour exprimer une séquence codante d’intérêt dans une cellule hôte non humaine lors de la méiose, comprenant l'introduction dans ladite cellule d’un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, d'une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, ou d’un vecteur d’expression selon la revendication 9, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4.
13. Procédé de production d’un organisme multicellulaire végétal exprimant une séquence codante d’intérêt lors de la méiose, comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, d'une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, ou d’un vecteur d’expression selon la revendication 9, ladite séquence codante étant liée de manière opérationnelle à un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule.
14. Cellule selon la revendication 10 ou 11 ou procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la cellule hôte est une cellule de plante.
15. Organisme multicellulaire végétal comprenant une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, ou un vecteur d’expression selon la revendication 9.
16. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, d'une cassette d’expression selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, ou d’un vecteur d’expression selon la revendication 9, pour exprimer une séquence codante d’intérêt dans une cellule hôte non humaine, de préférence une cellule de plante, lors de la méiose.
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