WO2019216248A1 - ペプチド類の大環状化酵素 - Google Patents

ペプチド類の大環状化酵素 Download PDF

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WO2019216248A1
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amino acid
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acid sequence
base sequence
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敏幸 脇本
健史 倉永
研一 松田
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国立大学法人北海道大学
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    • C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to a peptide cyclase capable of producing a macrocyclic peptide, a method for producing the enzyme, and a method for producing a cyclic peptide using the enzyme.
  • Macrocyclic compounds are structural features that are often found especially in physiologically active substances and pharmaceuticals derived from natural products because they can confer the conformation of the compounds and impart resistance to biodegrading enzymes.
  • conventional organic synthetic methods there are very limited methods for cyclizing peptides by efficiently connecting functional groups that exist at a 1: 1 ratio in the molecule and are located at distant positions ( Finding an efficient cyclization technique is one of the problems that have not been solved yet in organic synthetic chemistry.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems, found that a peptide cyclase derived from actinomycetes can efficiently produce the desired macrocyclic peptide, and have completed the present invention. .
  • the present invention provides the following (1) to (7): (1) (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) an amino acid sequence having 35% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or (c) a deletion of 1 to several tens of amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a peptide cyclase comprising a substituted, inserted or added amino acid sequence (2) (a) a DNA comprising a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (b) a base sequence which hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A peptide cyclase comprising the amino acid sequence encoded by; (3) (a) a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) a base sequence encoding an amino acid sequence having 35% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (C) a base sequence encoding an amino acid sequence in which 1 to several tens of amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or (d) shown in SEQ ID NO: 1.
  • DNA containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence (4) A DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in (a) SEQ ID NO: 2 or (b) SEQ ID NO: 2 ; (5) A vector comprising the DNA according to (3) or (4); (6) Peptide cyclase comprising culturing a cell introduced with the DNA according to (3) or (4) or the vector according to (5), and then obtaining the peptide cyclase from the culture Production method; (7) A method for producing a cyclic peptide, comprising causing the peptide cyclase according to (1) or (2) to act on a substrate peptide.
  • an enzyme capable of efficiently producing a cyclic peptide, particularly a macrocyclic peptide a method for producing the enzyme, and a method for producing a cyclic peptide using the enzyme. Since the peptide cyclization enzyme of the present invention has a wide substrate specificity, cyclized peptides having various compositions and lengths, which have been difficult by conventional organic synthetic techniques, can be obtained. According to the present invention, various physiologically active substances and pharmaceuticals can be produced.
  • FIG. 1 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • Lane M shows a molecular weight marker
  • Lane 1 shows a peptide cyclase of the present invention.
  • FIG. 2a is a reaction formula showing the conversion from the substrate peptide (3) to the cyclized peptide (1) by the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • FIG. 2b shows an HPLC chromatogram of the reaction solution when the peptide cyclase of the present invention is allowed to act on the substrate peptide of FIG. 2a.
  • FIG. 3 is a reaction formula showing a non-enzymatic cyclization reaction of a substrate peptide.
  • FIG. 4 shows the results of HPLC analysis of the reaction by the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854) when another substrate peptide is used.
  • + indicates a chromatogram of a reaction solution to which the peptide cyclase of the present invention is added
  • ⁇ indicates a chromatogram of a reaction solution to which the peptide cyclase of the present invention is not added.
  • x10 indicates that the portion surrounded by the square of the chromatogram has been magnified 10 times.
  • FIG. 5 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of the peptide cyclase of the present invention (derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988).
  • Lane M shows a molecular weight marker
  • lane E2 shows a peptide cyclase of the present invention.
  • FIG. 6 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces noursei NBRC15452).
  • Lane M shows a molecular weight marker
  • lane E2 shows a peptide cyclase of the present invention.
  • SB-SNAC substrate peptide 3
  • FIG. 8 shows a peptide cyclizing enzyme derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988 when a substrate (SB (L8A) -SNAC) in which D-Leu at the C-terminal of substrate peptide 3 shown in FIG.
  • SB (L8A) -SNAC substrate
  • the result of having analyzed the cyclization product by the peptide cyclase derived from Streptomyces noursei NBRC15452 by HPLC is shown.
  • SB (L8A) -SNAC only indicates no enzyme addition system
  • +14988 indicates a peptide cyclase addition system derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988
  • +15452 indicates a peptide cyclase addition system derived from Streptomyces noursei NBRC15452.
  • FIG. 9 shows a peptide cyclase derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988 when the substrate (SB (L8F) -SNAC) obtained by substituting D-Phe for C-terminal D-Leu of the substrate peptide 3 shown in FIG.
  • SB (L8F) -SNAC only indicates an enzyme-free system
  • +14988 indicates a Goodfellowiella ⁇ coeruleoviolacea NBRC14988-derived peptide cyclase addition system
  • +15452 indicates a Streptomyces noursei NBRC15452-derived peptide cyclase addition system.
  • the present invention provides: (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) an amino acid sequence having 35% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or (c) a deletion of 1 to several tens of amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a peptide cyclase comprising a substituted, inserted or added amino acid sequence is provided.
  • a peptide cyclase comprises an amino group present in one part (for example, one amino acid residue) constituting a peptide and a carboxyl group present in another part (for example, another amino acid residue). It is an enzyme having an action of cyclizing the peptide by binding to form a peptide bond.
  • the peptide cyclase of the present invention can cyclize a peptide in a head-to-tail manner, and can produce a large cyclic peptide.
  • an amino acid is usually a natural amino acid and is an L-form, but is modified by a non-natural amino acid such as ⁇ -alanine, a D-form amino acid, and a technique such as alkylation, esterification, or halogenation. Modified amino acids may be included.
  • the peptide cyclase of the present invention may contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the peptide cyclase of the present invention may contain a mutated sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the peptide cyclase of the present invention is 35% or more, such as 40% or more, preferably 50% or more, such as 60% or more, more preferably 70% or more, with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An amino acid sequence having 80% or more or 85% or more, more preferably 90% or more, for example, 92% or more, 94% or more, 96% or more, or 98% or more may be included.
  • the identity of amino acid sequences can be examined by known means such as FASTA search or BLAST search.
  • the amino acid sequence of the portion corresponding to the 63rd to 66th amino acid residues of SEQ ID NO: 1 is included in the mutant sequence -X 1 -X 2 -Lys and / or the amino acid sequence of the portion corresponding to amino acid residues 153 to 158 of SEQ ID NO: 1 is Ser-Tyr-Ser-Asn-X 3 -Gly, And / or the amino acid sequence corresponding to the amino acid residues 304 to 307 in SEQ ID NO: 1 is Gly-His-X 4 -Gly, and / or the amino acid residues from 374 to 379 in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence corresponding to the group is preferably Gly-X 5 -X 6 -X 7 -Asn-Gly.
  • the amino acid sequence of the portion corresponding to the 374th to 379th amino acid residues of SEQ ID NO: 1 is Gly-X 5 -X 6 -X 7 -Asn-Gly.
  • the corresponding portion does not need to be a portion where the amino acid residue number coincides with SEQ ID NO: 1, and may be a portion in the vicinity thereof.
  • the corresponding part can be found by comparing the amino acid sequence with SEQ ID NO: 1.
  • the portion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 corresponding to the 63rd to 66th amino acid residues of SEQ ID NO: 1 is the 59th to 62nd Ser-Leu-Thr-Lys.
  • X 1 to X 7 each independently represent an amino acid residue.
  • the peptide cyclase of the present invention may include an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not limited to 1 to several, and is 1 to several tens, preferably 1. It may be from 40 to 40, more preferably from 1 to 20, and even more preferably from 1 to several.
  • the tens of pieces may be 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, for example.
  • the number may be, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9.
  • amino acid residues in the amino acid sequence of a protein is known to those skilled in the art.
  • deletion, substitution, insertion or addition of an amino acid residue in the amino acid sequence of the peptide cyclase of the present invention may be caused by using site-directed mutagenesis or a known chemical technique.
  • substitution between homologous amino acids is preferred.
  • homologous amino acids are known to those skilled in the art.
  • the peptide cyclization enzyme of the present invention containing a mutant sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably 50% or more of the peptide cyclization enzyme of the present invention containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably It has a cyclization activity of 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more.
  • Cyclization activity can be measured by a known method.
  • the amount of the unit enzyme and the amount of cyclic peptide produced per unit time may be used as an index of cyclization activity.
  • the present invention provides: (A) encoded by DNA comprising a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (b) a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a peptide cyclase comprising the amino acid sequence is provided.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence includes a degenerate sequence encoding the target amino acid sequence.
  • the peptide cyclase of the present invention may contain an amino acid sequence encoded by DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the peptide cyclase of the present invention may contain an amino acid sequence encoded by DNA containing a mutant sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the peptide cyclization enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence encoded by a DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. You may go out.
  • Stringent conditions include, for example, the following conditions: In a buffer solution containing 0.25M Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA, 1 ⁇ Denhardt solution at a temperature of 60-68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C. Hybridization for 16 to 24 hours, and further in a buffer solution containing 20 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA at a temperature of 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C.
  • the peptide cyclizing enzyme of the present invention comprising an amino acid sequence encoded by a DNA containing a mutant sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferably an amino acid encoded by a DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the peptide cyclizing enzyme of the present invention containing a sequence has a cyclization activity of 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, further preferably 80% or more, and most preferably 90% or more.
  • the present invention provides: (A) a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (B) a base sequence encoding an amino acid sequence having 35% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (C) a base sequence encoding an amino acid sequence in which 1 to several tens of amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or (d) shown in SEQ ID NO: 1.
  • a DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to a base sequence encoding an amino acid sequence.
  • amino acid sequences are as described above.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted, inserted or added is also as described above.
  • Stringent conditions are also as described above.
  • the present invention provides: (A) A DNA comprising a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (b) a DNA comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 .
  • the above DNA can be obtained by methods known to those skilled in the art.
  • the DNA may be obtained by cloning the surE gene or a homolog or ortholog thereof.
  • the organism that is the source of the DNA is not particularly limited, but is preferably a microorganism, more preferably an actinomycete.
  • the DNA of the present invention may be obtained by the method described in the examples of the present specification.
  • Examples of actinomycetes include actinomycetes such as Streptomyces genus, Actinomyces genus, Mycobacterium genus, Corynebacterium genus, and Goodfellowiella genus However, it is not limited to these.
  • the above DNA encodes the peptide cyclization enzyme of the present invention described above.
  • the peptide cyclization enzyme of the present invention can be produced by genetic engineering techniques.
  • the peptide cyclase of the present invention may be obtained from a culture obtained by incorporating the DNA of the present invention into an expression vector and introducing it into a cell, and culturing the cell.
  • the peptide cyclase of the present invention can be obtained from a culture obtained by introducing the DNA into cells using a known method such as PEG method, electroporation or particle gun method and culturing the cells. Good.
  • the present invention provides a vector containing the DNA of the above aspect.
  • the vector is preferably an expression vector.
  • Various expression vectors are known and can be appropriately selected and used. Methods for incorporating the DNA of the present invention into vectors are also known.
  • the present invention provides a method for producing a peptide cyclase comprising culturing cells into which the DNA of the present invention or the above vector has been introduced, and then obtaining the peptide cyclase from the culture.
  • the cells used in the method of this embodiment are not particularly limited, and may be microbial cells such as bacteria, yeast, filamentous fungi, and actinomycetes, plant cells, and animal cells.
  • Preferred cells for use in this method include, but are not limited to, microbial cells such as E. coli and Bacillus subtilis.
  • the microbial cells are crushed by known means such as ultrasonic waves, mills, homogenizers to obtain an extract, and known methods such as ammonium sulfate precipitation and chromatography.
  • the peptide cyclase of the present invention can be obtained from the extract by the means described above.
  • the peptide cyclizing enzyme of the present invention can be obtained by subjecting the culture solution to known means such as ammonium sulfate precipitation or chromatography.
  • the present invention provides a method for producing a cyclic peptide, which comprises allowing the peptide cyclase of the present invention to act on a substrate peptide.
  • the peptide cyclase of the present invention has a wide substrate specificity, and even a large peptide can be cyclized. Therefore, the composition and length of the substrate peptide used in the method of the present invention are not particularly limited.
  • the substrate peptide may be a peptide obtained by cleaving any peptide bond in the target cyclic peptide.
  • the length of the substrate peptide may be several amino acids or more, for example, 7 amino acids or more, 9 amino acids or more, or 11 amino acids or more.
  • the cyclization reaction is accelerated when the C-terminal and / or N-terminal of the substrate peptide is a bulky amino acid residue and / or a hydrophobic amino acid residue. Is done. Therefore, the use of the peptide cyclase of the present invention enables condensation between bulky amino acid residues that are difficult to perform by chemical synthesis.
  • the C-terminal carboxyl group of the substrate peptide used in the method of the present invention is activated as a derivative.
  • derivatization include, but are not limited to, esterification.
  • esterification include, but are not limited to, thioesterification, alkyl esterification (eg, methyl esterification, ethyl esterification, etc.) and the like.
  • the peptide cyclase of the present invention can act on the substrate peptide by incubating a solution containing the substrate peptide and the peptide cyclase of the present invention under appropriate conditions.
  • Appropriate conditions can be determined by those skilled in the art depending on factors such as the type and concentration of the substrate peptide and the amount of enzyme used. Suitable conditions include, for example, conditions for reacting for several hours at room temperature to 37 ° C. and pH 6 to 9, but are not limited to these conditions.
  • the peptide cyclase of the present invention may be used by immobilizing it on a carrier.
  • Cyclic peptide production can be confirmed by known means. For example, you may confirm by analyzing a reaction liquid using a high performance liquid chromatography (HPLC). A product having a molecular weight when the substrate peptide is cyclized may be confirmed using mass spectrometry.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the preparation of the cyclic peptide may be a commercially available product or may be obtained by chemical synthesis.
  • SurE the peptide cyclization enzyme of the present invention is referred to as “SurE” or “SurE protein”.
  • SurE protein Expression Plasmid A gene fragment encoding SurE was amplified by PCR reaction using Streptomyces albidoflavus NBRC12854 genome as a template and using the primers SurE_Fw / SurE_Rv shown below. This was treated with restriction enzymes EcoRI / HindIII and inserted into the multicloning site (MCS) of pUC19. After confirming the inserted sequence, the inserted fragment was reinserted into the EcoRI / HindIII site of MCS of pET28 to prepare pET28-surE.
  • SurE_Fw CCGGAATTCCATATGGGTGCCGAGGGGGCG (SEQ ID NO: 3)
  • SurE_Rv CCCAAGCTTTCAGAGCCGGTGCATGGC (SEQ ID NO: 4)
  • the disrupted solution was subjected to centrifugation at 15,000 ⁇ g, and the resulting supernatant was subjected to Ni affinity column chromatography that was pre-equilibrated with buffer B (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8.0). Provided. After the resin was further washed with buffer B, the recombinant SurE protein bound to the resin was eluted with buffer C (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole pH 8.0). The eluted protein was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. As shown in FIG. 1, a single band having a molecular weight of 47 kDa was confirmed.
  • the amino acid sequence of the obtained SurE protein is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a reaction solution having the following composition was prepared using the recombinant SurE protein and the substrate peptide (SNAC body, 3 in FIG. 2a) prepared by the above procedure: 20 mM TrisHCl pH 8.0, 1 mM substrate peptide, 9 ⁇ g recombinant SurE.
  • the substrate peptide was prepared by condensing a peptide synthesized by solid phase synthesis with N-acetylcysteamine. The reaction solution was incubated at 30 ° C. for 2 hours and subjected to HPLC analysis.
  • the column was a COSMOSIL 5C18-MS-II 4.6 ⁇ 250 mm column (nacalai tesque), and the mobile phase was 41% MeCN + 0.05% TFA with a flow rate of 0.8 ml / min.
  • the product was monitored by UV absorption at a wavelength of 200 nm.
  • the result of HPLC analysis is shown in FIG.
  • the reaction solution of recombinant SurE protein and substrate peptide (ReactionRemix. In Fig. 2b) produced a single product peak at a retention time of about 18.4 minutes.
  • the retention time of this peak was the same as the retention time of the peak (Surugamide B 1 (Std.) In FIG. 2b) of the Sulgamide B preparation (1 in FIG. 2a).
  • the sample obtained by mixing the reaction solution and the Sulgamide B sample gave a single peak at the same retention time as the peak of the Sulgamide B sample (Reaction mix. + 1 (std.) Dco-injection in Fig. 2b). From these results, it was confirmed that the substrate peptide was cyclized by the peptide cyclization enzyme (SurE) of the present invention, and cyclized peptide 1 (Surugamide B) was obtained as a single product.
  • the substrate peptide was cyclized by the peptide cyclization
  • the substrate peptide was incubated for 2 days in the presence of Et3N (pH 12) and subjected to HPLC analysis. A peak was observed at a retention time of about 16.2 minutes, and the retention time coincided with that of the compound 4 of FIG. 3 (data not shown).
  • the peptide cyclase of the present invention is a useful enzyme that can cyclize substrate peptides having different compositions and lengths.
  • the primers used for cloning were: In the case of Goodfelloiella couleuleoviolacea NBRC14988, forward primer: ccggaattcgtgcccaacgagcaggatctcggg (SEQ ID NO: 7) Reverse primer: cccaagctttcatccggtcacctgccgccgc (SEQ ID NO: 8), For Streptomyces noursei NBRC15452 Forward primer: ccggaattcgtgcacggactcagcggatcc (SEQ ID NO: 11) Reverse primer: cccaagcttttagtgcggccgtgcgccgtgg (SEQ ID NO: 12).
  • FIG. 5 and FIG. 6 show the results of polyacrylamide gel electrophoresis of the peptide cyclase obtained from the above two strains of microorganisms.
  • the peptide cyclization enzyme of Goodfelloiella ceruleoviolacea NBRC14988 produced a single band of 49.2 kDa
  • the cyclase of Streptomyces noursei NBRC15452 produced a single band of 49.0 kDa.
  • amino acid sequence of the peptide cyclase of Goodfelloiella coeruleoviolacea NBRC14988 is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 6.
  • amino acid sequence of the cyclase of Streptomyces noursei NBRC15452 is shown in SEQ ID NO: 9, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the identity of the amino acid sequence of the peptide cyclization enzyme of Goodfelloiella ceruleoviolacea NBRC14988 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 38%, and the identity of the amino acid sequence of the peptide cyclase of Streptomyces NBRC15452 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 37. %Met.
  • the above two enzymes produced cyclized peptides from three substrates.
  • the peak with a retention time of about 11.7 minutes in FIG. 7 is a head-to-tail cyclized peptide.
  • the peak of retention time of about 10.3 minutes in FIG. 8 is a head-to-tail cyclized peptide.
  • the peak of retention time of about 11.8 minutes in FIG. 9 is a head-to-tail cyclized peptide.
  • peaks of two kinds of cyclized peptides were observed, and the slower retention time was cyclized non-enzymatically between the lysine residue and the C-terminal amino acid residue in the substrate peptide. Isopeptide.
  • peptide cyclization enzymes can be obtained from microorganisms other than Streptomyces albidoflavus.
  • the present invention can be used for manufacturing pharmaceuticals and research reagents.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the peptide cyclizing enzyme of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • SEQ ID NO: 2 shows the base sequence encoding the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the forward primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of the reverse primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces albidoflavus NBRC12854).
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of the peptide cyclase of the present invention (derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988).
  • SEQ ID NO: 6 shows the base sequence encoding the peptide cyclase of the present invention (derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988).
  • SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of the forward primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988).
  • SEQ ID NO: 8 shows the base sequence of the reverse primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988).
  • SEQ ID NO: 9 shows the amino acid sequence of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces noursei NBRC15452).
  • SEQ ID NO: 10 shows the base sequence encoding the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces noursei NBRC15452).
  • SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of the forward primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces noursei NBRC15452).
  • SEQ ID NO: 12 shows the base sequence of the reverse primer used for the cloning of the peptide cyclase of the present invention (derived from Streptomyces noursei NBRC15452).

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Abstract

配列番号：１に示すアミノ酸配列またはその変異配列を有するペプチド環化酵素、あるいは配列番号：１に示すアミノ酸配列またはその変異配列をコードする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチド環化酵素、該ペプチド環化酵素をコードするＤＮＡ、該ペプチド環化酵素の製造方法、ならびに該ペプチド環化酵素を用いる環状ペプチドの製造方法。

Description

ペプチド類の大環状化酵素
　本発明は、大環状ペプチドを生成しうるペプチド環化酵素、該酵素の製造方法、および該酵素を用いる環状ペプチドの製造方法に関する。
　大環状化合物は、化合物の立体配座の固定化や生体内分解酵素への抵抗性などを付与できるため、特に天然物由来の生理活性物質や医薬品に多く見出される構造的特徴である。しかしながら、従来の有機合成的手法では、分子内で１：１の比率で存在し、かつ離れた位置にある官能基同士を効率的に繋げてペプチドを環化させる手法は極めて限られており（非特許文献１参照）、効率的な環化手法を見出すことは、有機合成化学において未だ解決できていない課題の一つである。
C. J. White, A. K. Yudin, Nature Chem. 2011, 3, 509-524.
　分子内で１：１の比率で存在し、かつ離れた位置にある官能基同士を効率的に繋げてペプチドを環化させる手法を見出すことが本発明の解決すべき課題であった。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、放線菌由来のペプチド環化酵素が効率良く目的の大環状ペプチドを生成しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は下記（１）～（７）を提供する：
　（１）（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列、
　　　　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
　　　　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列
を含むペプチド環化酵素；
　（２）（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
　　　　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むペプチド環化酵素；
　（３）（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
　　　　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
　　　　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、または
　　　　（ｄ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡ；
　（４）（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
　　　　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡ；
　（５）（３）または（４）に記載のＤＮＡを含むベクター；
　（６）（３）または（４）に記載のＤＮＡあるいは（５）に記載のベクターを導入した細胞を培養し、次いで、培養物からペプチド環化酵素を得ることを含む、ペプチド環化酵素の製造方法；
　（７）（１）または（２）に記載のペプチド環化酵素を基質ペプチドに作用させることを含む、環状ペプチドの製造方法。
　本発明によれば、環状ペプチド、特に大環状ペプチドを効率良く製造することができる酵素、該酵素の製造方法、ならびに該酵素を用いる環状ペプチドの製造方法が提供される。本発明のペプチド環化酵素の基質特異性は広いので、従来の有機合成的手法では困難であった様々な組成および長さの環化ペプチドを得ることができる。本発明によれば、様々な生理活性物質や医薬品の製造を行うことができる。
図１は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レーンＭは分子量マーカー、レーン１は本発明のペプチド環化酵素を示す。 図２ａは、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）による基質ペプチド（３）から環化ペプチド（１）への変換を示す反応式である。図２ｂは、図２ａの基質ペプチドに本発明のペプチド環化酵素を作用させた場合の反応液のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。Reaction mix. + 1 (std.) co-injectionは、反応液に図２ａの１（surugamide B 標品）を混合したサンプルのクロマトグラムを示す。Surugamide B 1 (std.)は、surugamide B 標品のクロマトグラムを示す。Reaction mix.は、反応液のクロマトグラムを示す。Reaction mix. without enzymeは、本発明のペプチド環化酵素を添加しなかった反応液のクロマトグラムを示す。Reaction mix. without substrateは、基質ペプチドを添加しなかった反応液のクロマトグラムを示す。 図３は、基質ペプチドの非酵素的環化反応を示す反応式である。 図４は、別の基質ペプチドを用いた場合の本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）による反応をＨＰＬＣにて分析した結果を示す。ＨＰＬＣクロマトグラム中、＋は本発明のペプチド環化酵素を添加した反応液のクロマトグラムを、－は本発明のペプチド環化酵素を添加しなかった反応液のクロマトグラムを示す。ｘ１０は、クロマトグラムの四角で囲った部分を１０倍に拡大したことを示す。 図５は、本発明のペプチド環化酵素（Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レーンＭは分子量マーカー、レーンＥ２は本発明のペプチド環化酵素を示す。 図６は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces noursei NBRC15452由来）のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レーンＭは分子量マーカー、レーンＥ２は本発明のペプチド環化酵素を示す。 図７は、図２に示す基質ペプチド３（ＳＢ－ＳＮＡＣ）を基質とした場合の、Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素およびStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素による環化生成物をＨＰＬＣにて分析した結果を示す。ＳＢ－ＳＮＡＣ　ｏｎｌｙは酵素無添加系、＋１４９８８はGoodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素添加系、＋１５４５２はStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素添加系であることを示す。 図８は、図２に示す基質ペプチド３のＣ末端のＤ－ＬｅｕをＤ－Ａｌａに置換したペプチド（ＳＢ（Ｌ８Ａ）－ＳＮＡＣ）を基質とした場合の、Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素およびStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素による環化生成物をＨＰＬＣにて分析した結果を示す。ＳＢ（Ｌ８Ａ）－ＳＮＡＣ　ｏｎｌｙは酵素無添加系、＋１４９８８はGoodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素添加系、＋１５４５２はStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素添加系であることを示す。 図９は、図２に示す基質ペプチド３のＣ末端のＤ－ＬｅｕをＤ－Ｐｈｅに置換したペプチド（ＳＢ（Ｌ８Ｆ）－ＳＮＡＣ）を基質とした場合の、Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素およびStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素による環化生成物をＨＰＬＣにて分析した結果を示す。ＳＢ（Ｌ８Ｆ）－ＳＮＡＣ　ｏｎｌｙは酵素無添加系、＋１４９８８はGoodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来のペプチド環化酵素添加系、＋１５４５２はStreptomyces noursei NBRC15452由来のペプチド環化酵素添加系であることを示す。
　本発明は、１の態様において、
　（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列、
　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列
を含むペプチド環化酵素を提供する。
　本明細書において、ペプチド環化酵素は、ペプチドを構成する１の部分（例えば１のアミノ酸残基）に存在するアミノ基と、別の部分（例えば別のアミノ酸残基）に存在するカルボキシル基を結合させてペプチド結合を生じさせることにより、該ペプチドを環化させる作用を有する酵素である。本発明のペプチド環化酵素は、ペプチドをhead-to-tail様式で環化させることができ、大型の環状ペプチドを生成することができる。
　本明細書において、アミノ酸は、通常は天然アミノ酸であり、Ｌ－体であるが、β－アラニンなどの非天然アミノ酸、Ｄ－体アミノ酸、およびアルキル化、エステル化、ハロゲン化などの手法によって修飾された修飾アミノ酸を包含しうる。
　本明細書にて使用される用語は、特に断らない限り、生物学、生化学、化学、薬学、医学等の分野において通常に理解されている意味を有する。
　本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列の変異配列を含んでいてもよい。例えば、本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上、例えば４０％以上、好ましくは５０％以上、例えば６０％以上、より好ましくは７０％以上、例えば８０％以上または８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、例えば９２％以上、９４％以上、９６％以上または９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。アミノ酸配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索等の公知の手段によって調べることができる。
　本発明のペプチド環化酵素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の変異配列を含む場合、当該変異配列中、配列番号：１の６３～６６番目のアミノ酸残基に相当する部分のアミノ酸配列がＳｅｒ－Ｘ１－Ｘ２－Ｌｙｓであり、および／または配列番号：１の１５３～１５８番目のアミノ酸残基に相当する部分のアミノ酸配列がＳｅｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｘ３－Ｇｌｙであり、および／または配列番号：１の３０４～３０７番目のアミノ酸残基に相当する部分のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｈｉｓ－Ｘ４－Ｇｌｙであり、および／または配列番号：１の３７４～３７９番目のアミノ酸残基に相当する部分のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａｓｎ－Ｇｌｙであることが好ましい。配列番号：１の３７４～３７９番目のアミノ酸残基に相当する部分のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ａｓｎ－Ｇｌｙであることがより好ましい。相当する部分は、配列番号：１とアミノ酸残基番号が一致する部分である必要はなく、その近傍の部分であってもよい。相当する部分は、アミノ酸配列を配列番号：１と比較することによって見出すことができる。例えば、配列番号：１の６３～６６番目のアミノ酸残基に相当する配列番号：５のアミノ酸配列中の部分は、５９～６２番目のＳｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓである。なお、Ｘ１～Ｘ７は各々独立してアミノ酸残基を表す。
　また例えば、本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。しかし、配列番号：１に示すアミノ酸配列において欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基の数は１ないし数個に限定されることはなく、１個ないし数十個、好ましくは１個ないし４０個、より好ましくは１個ないし２０個、さらに好ましくは１個ないし数個であってもよい。数十個とは、例えば２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個であってもよい。数個とは、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個であってもよい。タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加は当業者に公知である。例えば部位特異的突然変異法や公知の化学的手法を用いて、本発明のペプチド環化酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加を生じさせてもよい。アミノ酸残基の置換の場合、同族アミノ酸同士の置換が好ましい。同族アミノ酸は当業者に公知である。
　配列番号：１に示すアミノ酸配列の変異配列を含む本発明のペプチド環化酵素は、好ましくは、配列番号：１に示すアミノ酸配列を含む本発明のペプチド環化酵素の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の環化活性を有する。
　環化活性は公知の方法にて測定することができる。例えば、単位酵素量および単位時間あたりの環状ペプチドの生成量を環化活性の指標としてもよい。
　本発明はもう１つの態様において、
　（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むペプチド環化酵素を提供する。
　配列番号：２に示す塩基配列は配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするものである。
　本明細書において、塩基配列は、目的のアミノ酸配列をコードする縮重配列を包含する。
　本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：２に示す塩基配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：２に示す塩基配列の変異配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、本発明のペプチド環化酵素は、配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
　ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、例えば下記条件が挙げられる：
　０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液を含む緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％　ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件；あるいは
　２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む緩衝液中で３７℃において、より厳しい条件としては０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む緩衝液中で４２℃において、さらに厳しい条件としては０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含む緩衝液中で６５℃において洗浄を行う条件。
　ストリンジェントな条件は上例に限定されないことはいうまでもない。
　配列番号：２に示す塩基配列の変異配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む本発明のペプチド環化酵素は、好ましくは、配列番号：２に示す塩基配列を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む本発明のペプチド環化酵素の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の環化活性を有する。
　本発明はもう１つの態様において、
　（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、または
　（ｄ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡを提供する。
　アミノ酸配列の同一性については上で説明したとおりである。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基の数についても上で説明したとおりである。ストリンジェントな条件についても上で説明したとおりである。
　本発明はもう１つの態様において、
　（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含むＤＮＡを提供する。
　ストリンジェントな条件については上で説明したとおりである。
　上記ＤＮＡは当業者に公知の方法によって得ることができる。ｓｕｒＥ遺伝子またはそのホモログもしくはオーソログをクローニングすることによって上記ＤＮＡを得てもよい。上記ＤＮＡの源となる生物は特に限定されないが、好ましくは微生物であり、より好ましくは放線菌である。例えば、本明細書の実施例に記載した方法により、本発明のＤＮＡを得てもよい。放線菌としてはストレプトマイセス（Streptomyces）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、グッドフェロウィエラ（Goodfellowiella）属などの放線菌が例示されるが、これらに限定されない。
　上記ＤＮＡは、上で説明した本発明のペプチド環化酵素をコードするものである。上記ＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法により本発明のペプチド環化酵素を製造することができる。例えば、本発明のＤＮＡを発現ベクターに組み込んで細胞に導入し、細胞を培養して得られる培養物から本発明のペプチド環化酵素を得てもよい。また例えば、ＰＥＧ法、エレクトロポレーションあるいはパーティクルガン法等の公知の方法を用いて上記ＤＮＡを細胞に導入し、細胞を培養して得られる培養物から本発明のペプチド環化酵素を得てもよい。
　本発明は、もう１つの態様において、上記態様のＤＮＡを含むベクターを提供する。ベクターとしては発現ベクターが好ましい。様々な発現ベクターが公知であり、適宜選択して用いることができる。本発明のＤＮＡのベクターへの組み込み方法も公知である。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明のＤＮＡあるいは上記ベクターを導入した細胞を培養し、次いで、培養物からペプチド環化酵素を得ることを含む、ペプチド環化酵素の製造方法を提供する。この態様の方法に使用する細胞は特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物細胞、植物細胞、動物細胞であってよい。この方法に使用する好ましい細胞としては、大腸菌や枯草菌などの微生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明のペプチド環化酵素を菌体内に生産する細胞の場合は、超音波、ミル、ホモジナイザー等の公知の手段によって菌体を破砕して抽出液を得て、硫安沈殿、クロマトグラフィー等の公知の手段によって抽出液から本発明のペプチド環化酵素を得ることができる。本発明のペプチド環化酵素を菌体外に生産する細胞の場合は、培養液を硫安沈殿、クロマトグラフィー等の公知の手段に付すことによって、本発明のペプチド環化酵素を得ることができる。
　本発明は、さらにもう１つの態様において、本発明のペプチド環化酵素を基質ペプチドに作用させることを含む、環状ペプチドの製造方法を提供する。
　本発明のペプチド環化酵素は基質特異性が広く、しかも大型のペプチドであっても環化させることができる。したがって、本発明の方法に使用する基質ペプチドの組成および長さは特に限定されない。基質ペプチドは、目的の環状ペプチド中のいずれのペプチド結合を開裂させたものであってもよい。基質ペプチドの長さは数アミノ酸以上であってもよく、例えば７アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１１アミノ酸以上などであってもよい。
　本発明のペプチド環化酵素を用いて環状ペプチドを得る場合、基質ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端を嵩高いアミノ酸残基および／または疎水性アミノ酸残基とした場合に、環化反応が促進される。したがって、本発明のペプチド環化酵素を用いることにより、化学合成では難しい嵩高いアミノ酸残基間での縮合が可能となる。
　また、本発明の方法に使用する基質ペプチドのＣ末端カルボキシル基を誘導体として活性化することが、環化効率の向上の点から好ましい。誘導体化の例としてエステル化が挙げられるが、これに限定されない。エステル化の例としては、チオエステル化、アルキルエステル化（例えばメチルエステル化、エチルエステル化など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　基質ペプチドおよび本発明のペプチド環化酵素を含む溶液を、適当な条件下でインキュベートすることにより、本発明のペプチド環化酵素を基質ペプチドに作用させることができる。適当な条件は、基質ペプチドの種類や濃度、使用酵素量などの因子に応じて当業者が定めうる。適当な条件としては、例えば室温～３７℃、ｐＨ６～９において、数時間反応させる条件が挙げられるが、これらの条件に限定されない。本発明のペプチド環化酵素を担体に固定化して用いてもよい。
　環状ペプチドの生成は公知の手段にて確認することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液を分析することにより確認を行ってもよい。質量分析を用いて基質ペプチドが環化した場合の分子量を有する生成物を確認してもよい。環状ペプチドの標品は市販品であってもよく、化学合成によって得られたものであってもよい。
　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　以下において、本発明のペプチド環化酵素を「ＳｕｒＥ」または「ＳｕｒＥタンパク質」と称する。
　（１）組換えＳｕｒＥタンパク質発現用プラスミドの作製
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ　ＮＢＲＣ１２８５４のゲノムを鋳型とし、下記に示したプライマーＳｕｒＥ＿Ｆｗ／ＳｕｒＥ＿Ｒｖを用いたＰＣＲ反応により、ＳｕｒＥをコードする遺伝子断片を増幅した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入した。挿入配列の確認後、挿入断片をｐＥＴ２８のＭＣＳのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し直し、ｐＥＴ２８－ｓｕｒＥを作製した。

SurE_Fw: CCGGAATTCCATATGGGTGCCGAGGGGGCG　（配列番号：３）
SurE_Rv: CCCAAGCTTTCAGAGCCGGTGCATGGC　（配列番号：４）
　（２）組換えＳｕｒＥタンパク質の調製
　ｐＥＴ２８－ｓｕｒＥを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１へ導入し、組換えＳｕｒＥ発現用大腸菌を作製した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を添加した２ｘＹＴ培地に、上記大腸菌のシングルコロニーを植菌し、３７℃で終夜培養した。これを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を添加した２ｘＹＴ培地に１．０％（ｖ／ｖ）植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．５程度となるまで培養した。これを氷上で５分間氷冷したのち、最終濃度０．１　ｍＭとなるようＩＴＰＧを添加し、１６℃にて終夜培養した。培養液を４０００ｘｇの遠心分離に供し、菌体を回収した。これをバッファーＡ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、再度４０００ｘｇの遠心分離に供した。再び菌体をバッファーＡに再懸濁し、超音波破砕に供した。破砕液を１５，０００ｘｇの遠心分離に供し、得られた上清をバッファーＢ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ８．０）にて予め平衡化したＮｉアフィ二ティカラムクロマトマトグラフィーに供した。レジンをさらにバッファーＢで洗浄したのち、バッファーＣ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５００ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ８．０）によってレジンに結合した組換えＳｕｒＥタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。図１に示すように分子量４７ｋＤａの単一バンドが確認された。得られたＳｕｒＥタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に、それをコードする塩基配列を配列番号：２に示す。
　（３）組換えＳｕｒＥによるペプチド環化反応（ｉ）
　上記の手順によって調製した組換えＳｕｒＥタンパク質と基質ペプチド（ＳＮＡＣ体、図２ａの３）を用いて以下の組成の反応液を調製した：２０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ８．０，１ｍＭ　基質ペプチド、９μｇ　組換えＳｕｒＥ。基質ペプチドは固相合成によって合成したペプチドとＮ－アセチルシステアミンを縮合することにより調製した。反応液を３０℃で２時間インキュベートし、ＨＰＬＣ分析に供した。この際、カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ　４．６×２５０ｍｍカラム（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を用い、移動相は流速０．８　ｍｌ／ｍｉｎの４１％　ＭｅＣＮ＋０．０５％　ＴＦＡを用いた。また、生成物は波長２００ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。
　ＨＰＬＣ分析の結果を図２ｂに示す。組換えＳｕｒＥタンパク質と基質ペプチドの反応液（図２ｂのReaction mix.）は、保持時間約１８．４分のところに単一生成物のピークを生じた。このピークの保持時間はスルガミドＢ標品（図２ａの１）のピーク（図２ｂのSurugamide B 1 (Std.)）の保持時間と同じであった。また、反応液とスルガミドＢ標品を混合したサンプルは、スルガミドＢ標品のピークと同じ保持時間に単一ピークを生じた（図２ｂのReaction mix. + 1 (std.) co-injection）。これらの結果から、本発明のペプチド環化酵素（ＳｕｒＥ）によって基質ペプチドが環化し、環化ペプチド１（Surugamide B）が単一生成物として得られたことが確認された。
　ＳｕｒＥを用いないで、上記基質ペプチドをＥｔ３Ｎの存在下（ｐＨ１２）で２日間インキュベートし、ＨＰＬＣ分析に供した。保持時間約１６．２分のところにピークが認められ、図３の化合物４の標品と保持時間が一致した（データ示さず）。
　これらの結果から、環化ペプチド１（Surugamide B）は本発明のペプチド環化酵素によって得られることがわかった。
　（４）組換えＳｕｒＥによるペプチド環化反応（ｉｉ）
　図４に示す基質ペプチド（ＳＮＡＣ体）にＳｕｒＥを作用させ、反応液をＨＰＬＣおよび質量分析（抽出イオンクロマトグラム）にて分析した。スルガミドＦ（Surugamide F）は検出されず、その環化物に相当する分子量（m/z １０３８．８）を有する生成物（環状スルガミドＦ）が、ＨＰＬＣ保持時間約１３．８分のところに検出された。さらなる基質として、上で用いたペプチドよりも短いペプチド（７アミノ酸残基、ＳＮＡＣ体）および長いペプチド（１１アミノ酸残基、ＳＮＡＣ体）を基質として用いた場合にも、本発明の組換えＳｕｒＥにより環化生成物が得られることが確認された（データ示さず）。これらの結果から、本発明の酵素は、基質の長さに関して寛容である可能性が示された。
　（１）Ｃ末端／Ｎ末端に嵩高いアミノ酸残基を有する基質を用いた環化反応
　図２ａの３に示す化合物のＣ末端Ｄ－Ｌｅｕをより嵩高いＤ－Ｐｈｅに置換した基質、および図２ａの３に示す化合物のＮ末端Ｉｌｅをより嵩高いＬ－Ｔｒｐに置換した基質を用いて実験を行った。使用酵素は実施例１で得た組換えＳｕｒＥであった。基質の濃度を変えて反応を行い、環化生成物をＨＰＬＣで分析し、ＫＭ値およびｋｃａｔ値を算出した。反応速度定数ｋｃａｔ／ＫＭを用いて触媒効率を評価した。
　上記２種類の基質を用いた場合、図２ａの３に示す化合物を基質とした場合よりも２～５倍高いｋｃａｔ／ＫＭ値が示された。この結果により、基質のＣ末端および／またはＮ末端のアミノ酸残基が嵩高いアミノ酸および／または疎水性の高いアミノ酸残基である場合に、環化反応が促進されることが示された。本発明のＳｕｒＥを用いることにより、化学合成では難しい嵩高いアミノ酸残基間での縮合反応が可能となることが示された。
　（２）メチルエステル体を基質とした組換えＳｕｒＥの環化反応
　Ｆｍｏｃ固相合成によるペプチド鎖の伸長と、ＭｅＩを用いたメチルエステル化と、Ｂｏｃ基の脱保護によって、図２ａの３に示す化合物のメチルエステル体を得た。このメチルエステル体を基質とした場合にも、ＳＮＡＣ体を用いた場合と同じ環化生成物の生成が確認された。ＳＮＡＣ体よりも簡便かつ安価に供給可能なメチルエステル体を基質とした場合でも本発明のＳｕｒＥは環化生成物を生じさせることができることから、本発明のＳｕｒＥは経済的にも有利な酵素であるといえる。
　上記実施例に示す実験結果から、本発明のペプチド環化酵素は組成や長さの異なる基質ペプチドを環化できる有用な酵素であることがわかった。
　（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ以外の微生物からの組換えペプチド環化酵素の調製
　Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ　ｃｏｅｒｕｌｅｏｖｉｏｌａｃｅａ　ＮＢＲＣ１４９８８およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｕｒｓｅｉ　ＮＢＲＣ１５４５２から、実施例１と同様にして環化酵素を得た。
　クローニングに使用したプライマーは以下のものであった：
　Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ　ｃｏｅｒｕｌｅｏｖｉｏｌａｃｅａ　ＮＢＲＣ１４９８８の場合
フォワードプライマー：　ccggaattcgtgcccaacgagcaggatctcggg（配列番号：７）
リバースプライマー：　cccaagctttcatccggtcacctgccgccgc（配列番号：８）、
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｕｒｓｅｉ　ＮＢＲＣ１５４５２の場合
フォワードプライマー：　ccggaattcgtgcacggggactcagcggatcc（配列番号：１１）
リバースプライマー：　cccaagcttttagtgcggccgtgcgccgtgg（配列番号：１２）。
　上記２株の微生物から得られたペプチド環化酵素のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図５および図６に示す。Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ　ｃｏｅｒｕｌｅｏｖｉｏｌａｃｅａ　ＮＢＲＣ１４９８８のペプチド環化酵素は４９．２ｋＤａの単一バンド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｕｒｓｅｉ　ＮＢＲＣ１５４５２の環化酵素は４９．０ｋＤａの単一バンドを生じた。
　Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ　ｃｏｅｒｕｌｅｏｖｉｏｌａｃｅａ　ＮＢＲＣ１４９８８のペプチド環化酵素のアミノ酸配列を配列番号：５に、その塩基配列を配列番号：６に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｕｒｓｅｉ　ＮＢＲＣ１５４５２の環化酵素のアミノ酸配列を配列番号：９に、その塩基配列を配列番号：１０に示す。Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｅｌｌａ　ｃｏｅｒｕｌｅｏｖｉｏｌａｃｅａ　ＮＢＲＣ１４９８８のペプチド環化酵素のアミノ酸配列の配列番号：１のアミノ酸配列に対する同一性は３８％、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｕｒｓｅｉ　ＮＢＲＣ１５４５２のペプチド環化酵素のアミノ酸配列の配列番号：１のアミノ酸配列に対する同一性は３７％であった。
　（２）組換えペプチド環化酵素によるペプチド環化反応
　上で得られた２種の組換えペプチド環化酵素と基質ペプチド（ＳＮＡＣ体：図２ａの３「ＳＢ－ＳＮＡＣ」、ＳＢ－ＳＮＡＣのＣ末端Ｄ－ＬｅｕをＤ－Ａｌａに置換したペプチド「ＳＢ（Ｌ８Ａ）－ＳＮＡＣ」、およびＳＢ－ＳＮＡＣのＣ末端Ｄ－ＬｅｕをＤ－Ｐｈｅに置換したペプチド「ＳＢ（Ｌ８Ｆ）－ＳＮＡＣ」）を、実施例１と同様にして反応させ、生成物をＨＰＬＣで確認した。ＳＢ－ＳＮＡＣを基質とした場合、ＳＢ（Ｌ８Ａ）－ＳＮＡＣを基質とした場合、およびＳＢ（Ｌ８Ｆ）－ＳＮＡＣを基質とした場合のＨＰＬＣのクロマトグラムを、図７、図８、および図９にそれぞれ示す。
　図７～図９からわかるように、上記２種の酵素は３種の基質から環化ペプチドを生じた。図７の保持時間約１１．７分のピークがhead-to-tailの環化ペプチドである。図８の保持時間約１０．３分のピークがhead-to-tailの環化ペプチドである。図９の保持時間約１１．８分のピークがhead-to-tailの環化ペプチドである。図８および図９において、２種の環化ペプチドのピークが見られたが、保持時間の遅い方は基質ペプチド中のリジン残基とＣ末端アミノ酸残基との間で非酵素的に環化したイソペプチドであった。
　これらの結果から、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ以外の微生物からもペプチド環化酵素が得られることが確認された。
　本発明は、医薬品や研究試薬の製造等に利用することができる。
　配列番号：１は本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：２は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）をコードする塩基配列を示す。
　配列番号：３は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）のクローニングに使用したフォワードプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号：４は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces albidoflavus NBRC12854由来）のクローニングに使用したリバースプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号：５は本発明のペプチド環化酵素（Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来）のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：６は、本発明のペプチド環化酵素（Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来）をコードする塩基配列を示す。
　配列番号：７は、本発明のペプチド環化酵素（Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来）のクローニングに使用したフォワードプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号：８は、本発明のペプチド環化酵素（Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988由来）のクローニングに使用したリバースプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号：９は本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces noursei NBRC15452由来）のアミノ酸配列を示す。
　配列番号：１０は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces noursei NBRC15452由来）をコードする塩基配列を示す。
　配列番号：１１は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces noursei NBRC15452由来）のクローニングに使用したフォワードプライマーの塩基配列を示す。
　配列番号：１２は、本発明のペプチド環化酵素（Streptomyces noursei NBRC15452由来）のクローニングに使用したリバースプライマーの塩基配列を示す。

Claims (7)

  1. 　（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列、
    　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
    　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１個ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列
    を含むペプチド環化酵素。
  2. 　（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
    　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    を含むＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含むペプチド環化酵素。
  3. 　（ａ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
    　（ｂ）配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して３５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
    　（ｃ）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１個ないし数十個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、または
    　（ｄ）配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    を含むＤＮＡ。
  4. 　（ａ）配列番号：２に示す塩基配列、または
    　（ｂ）配列番号：２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
    を含むＤＮＡ。
  5. 　請求項３または４に記載のＤＮＡを含むベクター。
  6. 　請求項３または４に記載のＤＮＡあるいは請求項５に記載のベクターを導入した細胞を培養し、次いで、培養物からペプチド環化酵素を得ることを含む、ペプチド環化酵素の製造方法。
  7. 　請求項１または２に記載のペプチド環化酵素を基質ペプチドに作用させることを含む、環状ペプチドの製造方法。
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