WO2019198812A1 - 分析方法および分析装置 - Google Patents

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WO2019198812A1
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analysis method
sample
substrate
enzymes
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美砂 田中
渡邉　淳
小林　弘典
飯田　哲生
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株式会社島津製作所
国立大学法人島根大学
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    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method and an analysis apparatus.
  • lysosome disease enzymes that break down proteins, fats, sugars, etc. are reduced or deleted due to genetic causes, or do not function normally, so that substances to be broken down in lysosomes accumulate, causing cell death, organs, etc.
  • a disease that causes tissue dysfunction For example, in mucopolysaccharidosis, glycosaminoglycan, which is a mucopolysaccharide, accumulates in lysosome due to a deficiency of hydrolase acting in lysosome. Many patients with mucopolysaccharidosis die by adults due to various symptoms such as bone and joint abnormalities and intelligence impairment.
  • Lysosomal disease is treated with enzyme replacement therapy or hematopoietic stem cell transplantation, but early detection is important to improve the prognosis. Therefore, it has been proposed to perform screening tests for examining whether or not an enzyme corresponding to a causative gene of lysosomal disease is sufficiently produced for a newborn (see Non-Patent Document 1).
  • a substrate for an enzyme associated with each lysosomal disease is added to a blood sample, and the reaction product of the enzyme reaction is detected using a tandem mass spectrometer or liquid chromatograph-mass spectrometer. The activity of the enzyme is measured (see Patent Document 1).
  • an analysis method comprising a substrate of four or more enzymes that are reduced or missing in a patient's body or not functioning normally in lysosomal disease, and a living body among the four or more enzymes. Reacting with an enzyme contained in a sample obtained from the above to produce a reaction product, separating the reaction product by liquid chromatography, and detecting the separated reaction product by mass spectrometry And the four or more enzymes include iduronic acid-2-sulfatase.
  • the enzyme is five or more enzymes that are decreased or deleted in the body of the patient in lysosomal disease or are not functioning normally. It is preferable.
  • the enzyme in the analysis method of the first or second aspect, is the enzyme decreased or deleted in the body of each of the four or more types of mucopolysaccharidosis? Or it is preferable that 4 or more enzymes which are not working normally are included.
  • the enzyme in the analysis method of the third aspect, is ⁇ -L-iduronidase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and N-acetylgalactosamine- It is preferable to include three or more enzymes selected from the group consisting of 4-sulfatase.
  • the enzyme in the analysis method of the third or fourth aspect, is decreased or deleted in the body of the patient in each of five or more types of mucopolysaccharidosis, or It is preferred to include 5 or more enzymes that are not working properly.
  • the enzyme in the analysis method according to the fifth aspect, is ⁇ -L-iduronidase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and N-acetylgalactosamine- It preferably contains 4-sulfatase.
  • a solution containing the produced reaction product and the substrate is introduced into a liquid chromatograph, and the reaction It is preferred that the product and the substrate are separated by the liquid chromatography.
  • the retention time of at least one of the reaction products is preferably shorter than the retention time of the corresponding substrate.
  • the at least one reaction product is iduronic acid-2-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and N-acetylgalactosamine-4.
  • the length of the column for separating the reaction product is preferably less than 50 mm.
  • the retention time when the liquid chromatography is completed is preferably shorter than 3 minutes.
  • the analyzer comprises a substrate of four or more enzymes that are reduced or missing in a patient's body or not functioning normally in lysosomal disease, and a living body among the four or more enzymes.
  • a sample introduction part for introducing an analysis sample containing a reaction product obtained by reacting with an enzyme contained in the sample obtained from the sample into a liquid chromatograph, and the sample contained in the introduced analysis sample A liquid chromatograph for separating a reaction product; and a mass spectrometer for detecting the reaction product separated by the liquid chromatograph by mass spectrometry, wherein the four or more enzymes include iduronic acid-2-sulfatase.
  • the analytical sample includes the reaction product and the substrate, and the liquid chromatograph is included in the introduced analytical sample. It is preferable to separate the reaction product and the substrate.
  • an output unit that outputs information on an enzyme whose activity in the sample is lower than a reference value among the enzymes of the thirteenth or fourteenth aspect or the lysosomal disease corresponding to the enzyme. It is preferable to further comprise.
  • the activity of four or more enzymes related to lysosomal diseases such as mucopolysaccharidosis can be measured rapidly.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining an analysis method according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram illustrating a schematic configuration of an analyzer according to an embodiment.
  • FIG. 3 (A) is a graph schematically showing the detection intensity when the reaction product and the substrate are eluted almost simultaneously from the liquid chromatograph
  • FIG. 3 (B) is a graph showing the reaction product before the substrate. It is a graph which shows typically the detection intensity in the case of eluting from a liquid chromatograph.
  • FIG. 4 is a flowchart showing a flow of an analysis method according to an embodiment.
  • FIG. 5 is a chromatogram obtained when a sample containing no lysosome disease-related enzyme is analyzed.
  • FIG. 6 is a chromatogram when a sample containing a lysosome disease-related enzyme is analyzed.
  • FIG. 7 is a chromatogram when a sample containing a lysosome disease-related enzyme is analyzed.
  • FIG. 8 is a chromatogram when a sample containing a lysosome disease-related enzyme is analyzed.
  • lysosomal disease-related enzyme an enzyme that is decreased or deleted in a patient's body due to a genetic cause or does not function normally is referred to as a lysosomal disease-related enzyme.
  • disease is defined corresponding to each enzyme related to lysosomal disease, and refers to each of the disease types in mucopolysaccharidosis, for example.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining the analysis method of the present embodiment.
  • the analysis method of the present embodiment was obtained by reacting a substrate of a lysosomal disease-related enzyme corresponding to a predetermined number of lysosomal diseases, particularly mucopolysaccharidosis, with an enzyme contained in a sample.
  • the reaction product is separated by liquid chromatography.
  • sample Sp such as blood collected from a living body with a substrate of these lysosome-related enzymes
  • the sample Sp is not particularly limited to blood as long as the activity of the lysosome disease-related enzyme differs in statistics and the like between a healthy person and a lysosome disease patient.
  • the sample Sp is collected from a human subject, but is not particularly limited.
  • the subject is preferably a child of 5 years old or younger, 3 years old or younger, or a newborn, in order to improve the prognosis by treatment of lysosomal disease by early detection.
  • the sample Sp is blood
  • the sample Sp is reacted with the substrate using a dried blood spot (DBS). Since the dried blood spot can use whole blood as it is, there is an advantage that it is not necessary to perform centrifugation, requires less operation, and requires less blood to be collected.
  • the sample Sp is dropped onto the filter paper C so that the sample Sp soaks into the entire removable part D of the filter paper C using a dispensing instrument such as a pipette P1 or a dispensing device.
  • the sample Sp dropped on the filter paper C is subjected to drying such as several hours (arrow A11).
  • the dried sample Sp becomes a dry blood spot (DBS) on the filter paper C.
  • the removable portion D of the filter paper C is formed so as to be easily removed from the filter paper C main body by a punch or the like.
  • the removable part D is a disk-shaped part having a diameter of 3 mm to 6 mm, for example.
  • a detachable portion D including the sample Sp disposed in the dispensing container W is provided with a plurality of lysosome-related enzyme substrates Sb and a predetermined amount corresponding to a reaction product obtained from the substrate Sb by an enzymatic reaction.
  • a substrate solution containing the internal standard is added.
  • the internal standard is a substance for quantifying ions corresponding to the reaction product when the detection intensity corresponding to the internal standard corresponds to the predetermined amount, and is a reaction product obtained by enzymatic reaction from the substrate Sb. Substitutes in which some atoms are substituted with stable isotopes such as deuterium are used as appropriate.
  • the enzyme reaction may be performed by bringing a solution obtained by dispensing a predetermined amount of blood into contact with a substrate solution.
  • reaction reaction refers to an enzyme reaction between a lysosome-related enzyme and a substrate Sb
  • reaction solution refers to a solution obtained by the enzyme reaction.
  • a component containing the reaction product P of the enzyme reaction is extracted from the reaction solution to prepare an analytical sample Sa (arrow A13).
  • the extraction method of the reaction product P is not particularly limited, but liquid-liquid extraction is preferable for protecting an analytical column or ion source of liquid chromatography, and liquid-liquid extraction using ethyl acetate is preferable for the substrate Sb in the sample Sa for analysis. It is more preferable because the amount can be reduced.
  • the substrate Sb of each lysosome-related enzyme may remain, and the following description will be given on the assumption that the substrate Sb is contained.
  • the prepared analytical sample Sa is introduced into a liquid chromatograph, and the reaction product P and the corresponding substrate Sb are separated by liquid chromatography.
  • the eluted sample eluted from the liquid chromatograph is introduced into a tandem mass spectrometer.
  • a plurality of reaction products P corresponding to different lysosomal disease-related enzymes are separated by liquid chromatography and / or mass separation.
  • the separated reaction product P is detected by the detection unit of the tandem mass spectrometer (arrow A14).
  • Each reaction product P is measured in parallel (simultaneously) by liquid chromatography / tandem mass spectrometry (LC / MS / MS).
  • “measured in parallel” indicates that a plurality of substances contained in the analysis sample Sa introduced into the liquid chromatograph at a time are separated and detected.
  • the lysosomal disease-related enzyme whose activity is measured by the analysis method of the present embodiment is a lysosomal disease-related enzyme associated with each type of mucopolysaccharidosis listed in Table 1 below (hereinafter referred to as mucopolysaccharidosis-related enzyme). It is preferable to contain what was selected from these. Accordingly, whether or not the living body from which the sample Sp is collected suffers from or is suspected of suffering from lysosomal disease corresponding to each lysosomal related enzyme, including any type of mucopolysaccharidosis Information for diagnosing whether or not can be provided.
  • a substrate Sb of a lysosomal disease related enzyme whose activity is to be measured is added to the sample Sp in the substrate solution described above.
  • the type of lysosomal disease-related enzyme for measuring activity is preferably 4 or more, more preferably 5 or more.
  • the more types of lysosome disease-related enzymes whose activity is measured the more information for diagnosing lysosome disease can be provided more quickly. If there are too many types of lysosome disease-related enzymes for measuring activity, separation by liquid chromatography and mass spectrometry becomes difficult. Therefore, the types of lysosome disease-related enzymes for measuring activity are appropriately 50 or less, 20 or less, 10 or less, etc. It is preferable to set to.
  • the lysosomal disease-related enzyme whose activity is measured by the analysis method of the present embodiment is preferably selected from mucopolysaccharidosis-related enzymes.
  • mucopolysaccharidosis-related enzymes thereby, it is possible to provide information for diagnosing whether or not the living body from which the sample Sp is collected suffers from or is suspected of suffering from each mucopolysaccharidosis.
  • the substrate Sb of the mucopolysaccharidosis-related enzyme whose activity is to be measured is added to the sample Sp included in the substrate solution described above.
  • the mucopolysaccharidosis-related enzymes whose activity is measured by the analysis method of this embodiment are ⁇ -L-iduronidase, iduronic acid-2-sulfatase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, N-acetylgalactosamine-6 listed in Table 1. More preferably, it is selected from four or more mucopolysaccharidosis related enzymes selected from the group consisting of sulfatase and N-acetylgalactosamine-4-sulfatase.
  • the mucopolysaccharide selected by the subject is selected from each mucopolysaccharidosis type I, type II, type IIIB, type IV-A, and type VI, which has a higher incidence than other types of mucopolysaccharidosis.
  • Information can be provided to diagnose whether or not a person is suspected of having a disease type.
  • the mucopolysaccharidosis-related enzyme whose activity is measured by the analysis method of the present embodiment further preferably includes ⁇ -L-iduronidase and / or iduronic acid-2-sulfatase listed in Table 1.
  • the mucopolysaccharidosis-related enzyme whose activity is measured by the analysis method of the present embodiment includes iduronic acid-2-sulfatase listed in Table 1.
  • the subject has or is suffering from mucopolysaccharidosis type II, which has a particularly high incidence in certain regions and genders compared to other mucopolysaccharidosis types Information for diagnosing whether or not there is a suspicion can be provided.
  • Mucopolysaccharidosis type II develops in men because it occurs in humans due to X chromosome recessive inheritance.
  • the screening test for male newborns preferably includes a test for mucopolysaccharidosis type II.
  • the mucopolysaccharidosis-related enzymes whose activity is measured by the analysis method of this embodiment are ⁇ -L-iduronidase, iduronic acid-2-sulfatase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, N-acetylgalactosamine-6 listed in Table 1. Most preferred are sulfatase and N-acetylgalactosamine-4-sulfatase or contain these five enzymes.
  • the substrate Sb of the enzyme related to mucopolysaccharidosis used in the analysis method of the present embodiment is not particularly limited as long as the reaction product P can be separated by liquid chromatography, but for example, the substrate represented by the following chemical formula (1) is used. be able to. ... (1)
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing the configuration of the analyzer according to the analysis method of the present embodiment.
  • the analysis apparatus 1 includes a measurement unit 100 and a control unit 40.
  • the measurement unit 100 includes a liquid chromatograph 10 and a mass spectrometer 20.
  • the liquid chromatograph 10 includes mobile phase vessels 11 a and 11 b, liquid feed pumps 12 a and 12 b, a sample introduction unit 13, and an analysis column 14.
  • the mass spectrometer 20 includes an ionization chamber 21 including an ionization unit 211, a first vacuum chamber 22a including an ion lens 221, a tube 212 for introducing ions from the ionization chamber 21 to the first vacuum chamber 22a, and an ion guide 222.
  • a second vacuum chamber 22b and a third vacuum chamber 22c are provided.
  • the third vacuum chamber 22 c includes a first mass separation unit 23, a collision cell 24, a second mass separation unit 25, and a detection unit 30.
  • the collision cell 24 includes an ion guide 240 and a CID gas inlet 241.
  • the information processing unit 40 includes an input unit 41, a communication unit 42, a storage unit 43, an output unit 44, and a control unit 50.
  • the control unit 50 includes a device control unit 51, an analysis unit 52, and an output control unit 53.
  • the liquid chromatograph (LC) 10 uses the difference in the affinity of each reaction product P and substrate Sb for the mobile phase and the stationary phase of the analytical column 14 to separate each reaction product P and substrate Sb. Elute with retention time.
  • the type of the liquid chromatograph 10 is not particularly limited as long as the reaction product P and the substrate Sb can be separated with a desired accuracy by which the reaction product P can be detected by the mass spectrometer 20.
  • nano LC, micro LC, high performance liquid chromatograph (HPLC), ultra high performance liquid chromatograph (UHPLC) or the like can be used.
  • the mobile phase containers 11a and 11b include containers capable of storing liquids such as vials, and store mobile phases having different compositions.
  • the mobile phases stored in the mobile phase containers 11a and 11b are called mobile phase A and mobile phase B, respectively.
  • the composition of the mobile phase A and mobile phase B is not particularly limited as long as the reaction product P and the substrate Sb can be separated with desired accuracy, and water, acetonitrile, etc. are used as a solvent, and formic acid is used as an additive. it can.
  • the liquid feed pumps 12a and 12b feed the mobile phase A and the mobile phase B so as to have a predetermined flow rate, respectively.
  • Mobile phase A and mobile phase B output from the liquid feed pumps 12 a and 12 b are mixed in the middle of the flow path and introduced into the sample introduction unit 13.
  • the liquid feed pumps 12a and 12b change the composition of the mobile phase introduced into the analytical column 14 over time by changing the flow rates of the mobile phase A and the mobile phase B, respectively.
  • the data indicating the composition of the mobile phase at each time from the time corresponding to the start of the analysis such as the introduction of the analysis sample Sa is referred to as gradient data.
  • the liquid feed pumps 12 a and 12 b are controlled based on the gradient data, and the mobile phase having the set composition is introduced into the analytical column 14.
  • the time change of the composition of the mobile phase is not particularly limited as long as the reaction product P and the substrate Sb can be separated with a desired accuracy, but all of the reaction product P is eluted from the analytical column 14 with a retention time of less than 10 minutes. Preferably less than 7 minutes, more preferably less than 3 minutes, even more preferably less than 2 minutes, and even more preferably less than 1.5 minutes.
  • the retention time when the liquid chromatography is terminated by stopping is called the analysis time.
  • the inventors have found that the analysis time can be set to less than 3 minutes, more preferably less than 2.5 minutes, by adjusting the conditions of the analysis column 14 and the like. Thereby, an analysis can be performed efficiently. If the analysis time is too short, it becomes difficult to separate the reaction product P and the substrate Sb in the liquid chromatography. Therefore, the analysis time can be appropriately set to 30 seconds or more or 1 minute or more.
  • the sample introduction unit 13 includes a sample introduction device such as an autosampler, and introduces the analysis sample Sa into the mobile phase (arrow A1).
  • the analysis sample Sa introduced by the sample introduction unit 13 is appropriately introduced into the analysis column 14 through a guard column (not shown).
  • the analytical column 14 includes a stationary phase, and each reaction product P and substrate Sb contained in the introduced analysis sample Sa is different in affinity between each reaction product P and substrate Sb for the mobile phase and the stationary phase. To elute at different times.
  • the type of analytical column 14 is not particularly limited as long as each reaction product P and substrate Sb can be separated with desired accuracy, but a reverse phase column is preferable from the viewpoint of ease of handling and ionization in mass spectrometry.
  • the stationary phase of the analytical column 14 is preferably a silane to which a linear hydrocarbon such as C18 supported on a carrier such as silica gel is bonded.
  • the length of the analytical column 14 is preferably less than 50 mm, more preferably less than 40 mm, and even more preferably 30 mm or less.
  • the analytical column 14 can elute the reaction product P obtained by cleaving the substrate Sb for each lysosomal disease-related enzyme before the elution of the substrate Sb is started, that is, with a short retention time. preferable.
  • FIG. 3A is a chromatogram schematically showing detection intensity in mass spectrometry when the reaction product P and the substrate Sb are eluted from the liquid chromatograph 10 almost simultaneously as a conventional example.
  • the reaction product P is generated by multiple reaction monitoring (MRM) in which ions separated as precursor ions are dissociated to generate product ions, and the product ions are separated and detected.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the substrate Sb is ionized by the ionization unit 21 of the mass spectrometer 20 and may become ions having m / z substantially equal to m / z of the reaction product P by in-source decomposition.
  • the chromatogram detected by mass-separating ions corresponding to m / z of the reaction product P as precursor ions and mass-separating ions having m / z corresponding to the fragment ions of the reaction product P It is a graph of the upper part of Drawing 3 (A).
  • a peak Ps of fragment ions of ions obtained by in-source decomposition of the substrate Sb (hereinafter referred to as a peak Ps corresponding to the substrate sb subjected to in-source decomposition) and a peak Pp of fragment ions of the reaction product P
  • a peak Pp + Ps (hereinafter referred to as a peak Pp corresponding to the reaction product P) is observed.
  • FIG. 3A shows a chromatogram detected by mass separation of ions corresponding to m / z of the substrate Sb as precursor ions and mass separation of ions having m / z corresponding to the fragment ions of the substrate Sb. .
  • the peak Psb of the fragment ion of the substrate Sb is larger than the peak Pp corresponding to the reaction product P and can be detected over a long retention time range. Therefore, when the reaction product P elutes after the substrate Sb starts to elute from the liquid chromatograph 10, the reaction product P and the peak Ps corresponding to the in-source decomposed substrate Sb overlap, and the reaction product P Detection cannot be performed accurately.
  • FIG. 3B is a chromatogram schematically showing the detection intensity in mass spectrometry when the reaction product P elutes from the liquid chromatograph 10 before the substrate Sb in the analysis method of the present embodiment. .
  • Mass separation of ions having m / z corresponding to reaction product P and substrate Sb as precursor ions, and mass separation of ions having m / z corresponding to fragment ions of reaction product P and fragment ions of substrate Sb The chromatograms detected in this way are shown in the upper and lower parts of FIG.
  • the analytical column 14 preferably comprises iduronic acid-2-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and N-acetylgalactosamine-4-, which correspond in particular to mucopolysaccharidosis type II, type IV-A and type VI, respectively.
  • the reaction product P of the enzyme reaction comprising at least one selected from the group consisting of sulfatases, more preferably at least two, and even more preferably three than the elution of the substrate Sb of the enzyme reaction is started. Elute before.
  • the reaction product P can be detected more accurately by eluting more of the reaction products P of these enzymes before the corresponding substrate Sb. It can be carried out. From the viewpoint of more accurately detecting the reaction product P depending on the analysis conditions, the reaction product P of any lysosomal disease-related enzyme can be eluted before the substrate Sb.
  • the eluted sample containing the reaction product P eluted from the analysis column 14 is introduced into the ionization unit 21 of the mass spectrometer 20.
  • the eluate of the analysis column 14 is preferably input to the mass spectrometer 20 by online control without requiring an operation such as dispensing by a user of the analyzer 1 (hereinafter simply referred to as “user”).
  • the mass spectrometer 20 performs tandem mass spectrometry on the eluted sample introduced from the analysis column 14 to detect the reaction product P and the internal standard of the reaction product P.
  • the path of the ionized elution sample Se is schematically shown by a one-dot chain line arrow A2.
  • the kind of mass spectrometer 20 and the method of mass spectrometry will not be specifically limited if the ion derived from each reaction product P can be detected with a desired precision.
  • the ionization unit 21 of the mass spectrometer 20 ionizes the eluted sample Se containing the introduced reaction product P.
  • the ionization method is not particularly limited as long as the reaction product P is ionized to such an extent that the reaction product P can be detected with a desired accuracy.
  • the ionization method is not limited.
  • the spray method (ESI) is preferable, and the following embodiment will be described as performing ESI.
  • the ionized elution sample Se emitted from the ion source 211 is moved by a voltage applied to an electrode (not shown), passes through the tube 212, and enters the first vacuum chamber 22a.
  • the first vacuum chamber 22a, the second vacuum chamber 22b, and the third vacuum chamber 22c have a higher degree of vacuum in this order, and the third vacuum chamber 22c is exhausted to a high vacuum, such as 10 ⁇ 2 Pa or less. .
  • Ions entering the first vacuum chamber 22a pass through the ion lens 221 and are introduced into the second vacuum chamber 22b.
  • the ions incident on the second vacuum chamber 22b pass between the ion guides 222 and are introduced into the third vacuum chamber 22c.
  • the ions introduced into the third vacuum chamber 22 c are emitted to the first mass separation unit 23.
  • the ion lens 221, the ion guide 222, and the like converge the passing ions by an electromagnetic action.
  • the first mass separation unit 23 selectively passes ions having m / z set by an electromagnetic action based on a voltage applied to the quadrupole as precursor ions and emits the ions toward the collision cell 24. .
  • the first mass separation unit 23 selectively passes the ionized reaction product P and the internal standard corresponding to the reaction product P as precursor ions.
  • the collision cell 24 dissociates the reaction product P ionized by collision-induced dissociation (CID) and the internal standard corresponding to the reaction product P while controlling the movement of ions by the ion guide 240, and fragments Generate ions.
  • a gas containing argon, nitrogen or the like (hereinafter referred to as CID gas) with which ions collide during CID is introduced from the CID gas inlet 241 so as to have a predetermined pressure in the collision cell (arrow A3). .
  • the generated fragment ions are emitted toward the second mass separation unit 25.
  • the second mass separator 25 selectively emits fragment ions having m / z set by the electromagnetic action based on the voltage applied to the quadrupole and emits them toward the detector 30.
  • the second mass separation unit 23 selectively allows the reaction product P and fragment ions of the internal standard of the reaction product P to pass through.
  • the reaction product P of the mucopolysaccharidosis-related enzyme corresponding to mucopolysaccharidosis type I is in any of the ranges of 425.8 to 426.8. It is preferable to separate by m / z. More preferably, the reaction product P is separated as a precursor ion by any m / z in the range of 425.8 to 426.8, and the product ion is any of m in the range of 316.8 to 317.8. It is preferable to detect by separating by / z.
  • the reaction product P of the mucopolysaccharidosis-related enzyme corresponding to mucopolysaccharidosis type II is in any of the ranges of 643.9 to 644.9. It is preferable to separate by m / z. More preferably, the reaction product P is separated as a precursor ion by any m / z in the range of 643.9 to 644.9, and the product ion is any of m in the range of 358.9 to 359.9. It is preferable to detect by separating by / z.
  • the reaction product P of the mucopolysaccharidosis-related enzyme corresponding to mucopolysaccharidosis type IIIB is any of 419.8 to 420.8. It is preferable to separate by m / z. More preferably, the reaction product P is separated as a precursor ion by any m / z in the range from 419.8 to 420.8, and the product ion is any m in the range from 310.9 to 311.9. It is preferable to detect by separating by / z.
  • the reaction product P of the mucopolysaccharidosis-related enzyme corresponding to mucopolysaccharidosis type IV-A is in the range of 684.9 to 685.9. It is preferable to separate by any of m / z. More preferably, the reaction product P is separated as a precursor ion by any m / z in the range of 684.9 to 685.9, and the product ion is any of m in the range of 372.7 to 373.7. It is preferable to detect by separating by / z.
  • the reaction product P of the mucopolysaccharidosis-related enzyme corresponding to mucopolysaccharidosis type VI is any of those in the range of 656.9 to 657.9. It is preferable to separate by m / z. More preferably, the reaction product P is separated as a precursor ion by any m / z in the range of 656.9 to 657.9, and the product ion is any m in the range of 344.9 to 345.9. It is preferable to detect by separating by / z. In addition, the value of m / z selectively separated in the mass spectrometer 20 is appropriately set according to the ionized reaction product P and the fragment ion of the detected reaction product P, and is not limited to the above example.
  • the detection unit 30 includes an ion detector such as a secondary electron multiplier or a photomultiplier, and detects fragment ions between the incident reaction product P and the internal standard of the reaction product P.
  • the detection mode may be either a positive ion mode for detecting positive ions or a negative ion mode for detecting negative ions.
  • the detection signal obtained by detecting the fragment ions is A / D converted by an A / D converter (not shown), and is input as a digital signal to the control unit 50 of the information processing unit 40 (arrow A4).
  • the information processing unit 40 includes an information processing apparatus such as an electronic computer, and appropriately performs an interface with a user and performs processing such as communication, storage, and calculation regarding various data.
  • the information processing unit 40 is a processing device that performs control of the measurement unit 100, analysis, and display processing.
  • the information processing unit 40 may be configured as one device integrated with the liquid chromatograph 10 and / or the mass spectrometer 20.
  • a part of the data used in the analysis method of this embodiment may be stored in a remote server or the like, and a part of the arithmetic processing performed by the analysis method may be performed in a remote server or the like.
  • Control of the operation of each unit of the measurement unit 100 may be performed by the information processing unit 40 or may be performed by an apparatus constituting each unit.
  • the input unit 41 of the information processing unit 40 includes an input device such as a mouse, a keyboard, various buttons, and / or a touch panel.
  • the input unit 41 receives information necessary for processing performed by the control unit 50 such as the m / z value of ions to be detected from the user.
  • the communication unit 42 of the information processing unit 40 includes a communication device that can communicate by wireless or wired connection via a network such as the Internet.
  • the communication unit 42 receives data necessary for measurement by the measurement unit 100, transmits data processed by the control unit 50 such as an analysis result of the analysis unit 52, and appropriately transmits and receives necessary data.
  • the storage unit 43 of the information processing unit 40 includes a nonvolatile storage medium.
  • the storage unit 43 stores measurement data output from the measurement unit 100, a program for the control unit 50 to execute processing, and the like.
  • the output unit 44 of the information processing unit 40 is controlled by the output control unit 53 and includes a display device such as a liquid crystal monitor and / or a printer, and includes information related to measurement by the measurement unit 100, analysis results of the analysis unit 52, and the like. Are displayed on a display device or printed on a print medium and output.
  • the control unit 50 of the information processing unit 40 includes a processor such as a CPU.
  • the control unit 50 performs various processes by executing programs stored in the storage unit 43 and the like, such as control of the measurement unit 100 and analysis of measurement data output from the measurement unit 100.
  • the device control unit 51 of the processing unit 50 controls the measurement operation of the measurement unit 100 based on the analysis conditions set according to the input via the input unit 41 and the like.
  • the apparatus control unit 51 controls the flow rates of the liquid feed pumps 12a and 12b, controls sample introduction by the sample introduction unit 13, and selectively passes through the first mass separation unit 23 and the second mass separation unit 25. Control the m / z value of ions, etc.
  • the analysis unit 52 performs analysis such as quantification of the reaction product P based on the measurement data output from the measurement unit 100.
  • the analysis unit 52 acquires the detection intensity corresponding to each reaction product P and its internal standard fragment ions from the measurement data output from the detection unit 30 and stores the detection intensity in the storage unit 43 or the like.
  • the analysis unit 52 divides the known amount of the internal standard by a ratio obtained by dividing the detection intensity corresponding to the fragment ion of each reaction product P by the detection intensity corresponding to the fragment ion of the internal standard of the reaction product P. The multiplied value is calculated as the amount of each reaction product P.
  • the analysis unit 52 calculates the amount of each reaction product P, the volume of the sample Sp such as the blood volume, the time used for incubation for the enzyme reaction, and the like in the sample Sp corresponding to each reaction product P. Calculate the enzyme activity.
  • the analysis unit 52 creates data corresponding to the chromatogram in which the retention time and the detection intensity are associated with each other.
  • the analysis unit 52 determines whether or not the subject has low activity of each lysosomal disease-related enzyme to some extent with lysosomal disease or suspected of lysosomal disease. Determine.
  • the reference value is preferably set in advance based on the activity value of the lysosome-related enzyme in the healthy subject and each lysosomal disease patient.
  • the analysis unit 52 can make the above determination in consideration of variations in statistical values as appropriate.
  • the output control unit 53 determines whether the activity of each lysosome-related enzyme, the amount of each reaction product P, the chromatogram, the subject is affected by the measurement conditions of the measurement unit 100 and / or the analysis result of the analysis unit 52, An output image including information on lysosomal disease suspected of being ill is created and output to the output unit 44. A doctor or the like can diagnose whether or not the subject suffers from lysosomal disease based on information included in the output image.
  • FIG. 4 is a flowchart showing the flow of the analysis method of this embodiment.
  • a sample Sp such as blood is obtained from a subject such as a human newborn by a medical worker or the like.
  • step S1003 is started.
  • step S1003 a medical solution, a user, or the like prepares a substrate solution containing a predetermined number or more types of substrates Sb of lysosome disease-related enzymes.
  • the predetermined number is, for example, 4, 5 or the like.
  • step S1005 a medical worker, a user, or the like brings the sample Sp and the substrate solution into contact with each other to react the lysosomal disease-related enzyme and the substrate Sb contained in the sample Sp, thereby generating a reaction product P.
  • step S1007 is started.
  • Step S1007 a sample for analysis Sa is prepared from a reaction solution containing the reaction product P and the substrate Sb by a medical worker or a user.
  • step S1009 is started.
  • the sample introduction unit 13 introduces the analysis sample Sa into the liquid chromatograph 10, and the analysis column 14 separates the reaction product P and the substrate Sb.
  • step S1011 is started.
  • step S1011 the mass spectrometer 20 separates and detects the separated reaction product P by mass spectrometry.
  • step S1013 is started.
  • step S1013 the analysis unit 52 analyzes whether the activity of the lysosome-related enzyme in the sample Sp is decreased from the reference value based on the detected reaction product P data.
  • step S1015 is started.
  • step S1015 the output unit 44 outputs information on an enzyme whose activity in the sample Sp is lower than a reference value among lysosomal disease-related enzymes or a lysosomal disease and / or mucopolysaccharidosis type corresponding to the enzyme.
  • step S1015 ends, the process ends.
  • the analysis apparatus 1 includes a substrate Sb of four or more enzymes that are reduced or missing in a patient's body or not functioning normally in lysosomal disease, and a living body among these four or more enzymes.
  • the sample introduction part into which the analysis sample Sa containing the reaction product P obtained by reacting with the enzyme contained in the sample Sp obtained from the sample is introduced, and the reaction contained in the introduced analysis sample Sa A liquid chromatograph 10 that separates the product P by liquid chromatography; and a mass spectrometer 20 that detects the reaction product P separated by the liquid chromatograph 10 by mass spectrometry. Contains 2-sulfatase.
  • the subject suffers from a disease type selected from each of mucopolysaccharidosis type I, type IIIB, type IV-A, and type VI, which has a higher incidence than other types of mucopolysaccharidosis. It is possible to quickly provide information for diagnosing whether or not a person is suspected of being afflicted. Furthermore, similar information can be quickly provided for mucopolysaccharidosis type II, which has a higher incidence in men and specific areas.
  • the analysis sample Sa includes the reaction product P and the substrate Sb
  • the liquid chromatograph 10 includes the reaction product P and the substrate included in the introduced analysis sample Sa.
  • Sb is separated by liquid chromatography. Thereby, even when in-source decomposition occurs, the substrate Sb can be accurately detected.
  • the analyzer according to the present embodiment further includes an output unit 44 that outputs information on an enzyme whose activity in the sample Sp is lower than a reference value among lysosome-related enzymes or lysosomal disease corresponding to the enzyme. As a result, information for diagnosis of lysosome disease can be quickly transmitted to a doctor or the like.
  • the present invention is not limited to the contents of the above embodiment.
  • Other embodiments conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • Example 1 In the following examples, ⁇ -L-iduronidase, iduronic acid-2-sulfatase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, N corresponding to mucopolysaccharidosis type I, type II, type IIIB, type IV-A and type VI, respectively. Experimental results obtained by analyzing the activities of five kinds of enzymes, -acetylgalactosamine-6-sulfatase and N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, using the above-described analytical method will be described. The present invention is not limited to the numerical values and conditions shown in the following examples.
  • Sample and Substrate Sample that does not contain the above five types of enzymes (control sample), sample that contains the above five types of enzymes (sample with a predetermined concentration), and sample obtained from a healthy person ( Each of the healthy subjects was dropped on a filter paper and dried to create a DBS-like spot. The spot was cut into a disk shape with a diameter of 3 mm by punching and placed in a 96-well plate. To the well in which the spot is placed, 30 ⁇ L of a substrate solution containing the above-mentioned five kinds of enzyme substrates and an internal standard of the reaction product P generated from the substrates by enzymatic reaction is added, and incubated at 37 ° C. for 16 hours. did.
  • Substrate and internal standard The substrate shown in Table 2 was used as the substrate contained in the substrate solution.
  • the reaction product P shown in Table 2 was used, and the following substitution product in which the reaction product P shown in Table 2 was substituted was used.
  • Type I A substitution product in which R 2 of the reaction product of mucopolysaccharidosis type I in Table 2 is substituted with 5 deuterium atoms.
  • Type II a substitution product in which R 2 of the reaction product of mucopolysaccharidosis type II in Table 2 is substituted with five deuterium atoms.
  • Type IIIB A substitution product in which R 2 of the reaction product of mucopolysaccharidosis type IIIB in Table 2 is substituted with three deuterium atoms.
  • Type IV-A a substitution product in which R 2 of the reaction product of mucopolysaccharidosis type IV-A in Table 2 is substituted with 5 deuterium.
  • Type VI A substitution product in which R 2 of the reaction product of mucopolysaccharidosis type VI in Table 2 is substituted with 5 deuterium atoms.
  • CE collision energy voltage
  • FIG. 5 shows the chromatogram for the control sample
  • FIG. 6 shows the chromatogram for the sample having a predetermined concentration
  • FIG. 7 shows the chromatogram for the healthy subject sample.
  • the upper row is the transition corresponding to the reaction product
  • the lower row is the chromatogram of the transition corresponding to the internal standard (Table 3).
  • the peaks corresponding to the in-source decomposed substrates of type I, type II, type IIIB, type IV-A and type VI were designated as P1s, P2s, P3s, P4s and P6s, respectively.
  • the peaks of type I, II, IIIB, IV-A and VI internal standard fragment ions were P1is, P2is, P3is, P4is and P6is, respectively.
  • the fragment ion peaks of the reaction products of type I, type II, type IIIB, type IV-A and type VI were P1p, P2p, P3p, P4p and P6p, respectively.
  • Example 2 Example 1 except that the conditions of liquid chromatography were changed as follows, and the substrate of mucopolysaccharidosis type I was directly detected under conditions of mass separation different from the conditions for mass separation of the reaction product.
  • the control sample (without enzyme) was subjected to LC / MS / MS under the same conditions as in.
  • Gradient program Time (min) Concentration of mobile phase B (%) 0 30 0.01 30 1.30 100 1.50 100 1.51 30 2.50 Stop
  • FIG. 8 is a diagram showing a mass chromatogram obtained in Example 2.
  • FIG. Peaks P1s, P2s, P3s, P4s and P6s corresponding to in-source decomposed substrates of type I, type II, type IIIB, type IV-A and type VI were observed, respectively.
  • Peaks P1is, P2is, P3is, P4is and P6is of internal standard fragment ions of type I, type II, type IIIB, type IV-A and type VI were detected separately from the substrate. Therefore, it was shown that the reaction product and the substrate can be separated by liquid chromatography even under the condition where the analysis time is 2.50 minutes.

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Abstract

分析方法は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、この４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、分離された反応生成物を質量分析により検出することとを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。

Description

分析方法および分析装置
　本発明は、分析方法および分析装置に関する。
　ライソゾーム病は、タンパク質、脂肪および糖等を分解する酵素が、遺伝的原因により減少または欠損したり、正常に働かなくなることで、ライソゾームにおいて分解されるべき物質が蓄積し、細胞死や臓器等の組織の機能不全を起こす病気である。例えば、ムコ多糖症では、ライソゾーム内で働く加水分解酵素の欠損等により、ライソゾームにムコ多糖であるグリコサミノグリカンが蓄積する。ムコ多糖症の患者は骨および関節の異常や、知能障害等の様々な症状により、成人までに死亡する例も少なくない。
　ライソゾーム病は、酵素補充療法や造血幹細胞移植等により治療がなされるが、予後をよくするためには早期の発見が重要である。従って、新生児に対してライソゾーム病の原因遺伝子に対応する酵素が十分に産生されているかを調べるスクリーニング検査を行うことが提案されている（非特許文献１参照）。
　このようなスクリーニング検査において、血液試料に各ライソゾーム病と関連する酵素の基質を加え、酵素反応による反応生成物をタンデム質量分析計や液体クロマトグラフ－質量分析計を用いて検出し、生体内での酵素の活性を測定することが行われている（特許文献１参照）。
日本国特表２０１７－５２６９２３号公報
Michael H. Gelb, C. Ronald Scott, and Frantisek Turecek. "New born screening for lysosomal storage diseases," Clinical chemistry,（米国）, American Association for Clinical Chemistry, 2015年1月、Volume 61, Issue 2, pp.335-346
　しかしながら、質量分析において、質量分析用試料に含まれる、ライソゾーム病に関連する酵素の基質がイオン化された後に解離を起こし、解離されたイオンが反応生成物と区別が難しくなってしまう等の理由で、反応生成物を十分に分離して検出することができない問題があった。
　本発明の第１の態様によると、分析方法は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、分離された前記反応生成物を質量分析により検出することとを備え、前記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。
　本発明の第２の態様によると、第１の態様の分析方法において、前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素であることが好ましい。
　本発明の第３の態様によると、第１または第２の態様の分析方法において、前記酵素は、４以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素を含むことが好ましい。
　本発明の第４の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される３以上の酵素を含むことが好ましい。
　本発明の第５の態様によると、第３または第４の態様の分析方法において、前記酵素は、５以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素を含むことが好ましい。
　本発明の第６の態様によると、第５の態様の分析方法において、前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを含むことが好ましい。
　本発明の第７の態様によると、第１から第６のいずれかの態様の分析方法において、生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離されることが好ましい。
　本発明の第８の態様によると、第７の態様において、前記液体クロマトグラフィにおいて、少なくとも一つの前記反応生成物の保持時間は、対応する前記基質の保持時間より短いことが好ましい。
　本発明の第９の態様によると、第８の態様の分析方法において、前記少なくとも一つの反応生成物は、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される少なくとも一つの酵素による反応生成物を含むことが好ましい。
　本発明の第１０の態様によると、第１から第９までのいずれかの態様の分析方法において、前記液体クロマトグラフィにおいて、前記反応生成物を分離するカラムの長さは５０ｍｍ未満であることが好ましい。
　本発明の第１１の態様によると、第１から第１０までのいずれかの態様の分析方法において、前記液体クロマトグラフィが終了するときの保持時間は３分より短いことが好ましい。
　本発明の第１２の態様によると、第１から第１１までのいずれかの態様の分析方法において、前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低かった酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力することをさらに備えることが好ましい。
　本発明の第１３の態様によると、分析装置は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得された試料に含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物を含む分析用試料を液体クロマトグラフに導入する試料導入部と、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物を分離する液体クロマトグラフと、前記液体クロマトグラフにより分離された前記反応生成物を質量分析により検出する質量分析部とを備え、前記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。
　本発明の第１４の態様によると、第１３の態様の分析装置において、前記分析用試料は、前記反応生成物および前記基質を備え、前記液体クロマトグラフは、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物および前記基質を分離することが好ましい。
　本発明の第１５の態様によると、第１３または第１４の態様の前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力する出力部をさらに備えることが好ましい。
　本発明によれば、ムコ多糖症等のライソゾーム病に関連する４以上の酵素の活性を、迅速に測定することができる。
図１は、一実施形態の分析方法を説明するための概念図である。 図２は、一実施形態に係る分析装置の概略構成を示す概念図である。 図３（Ａ）は、反応生成物と基質とが液体クロマトグラフから略同時に溶出する場合の検出強度を模式的に示すグラフであり、図３（Ｂ）は、反応生成物が基質の前に液体クロマトグラフから溶出する場合の検出強度を模式的に示すグラフである。 図４は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。 図５は、ライソゾーム病関連酵素が含まれていない試料を分析した場合のクロマトグラムである。 図６は、ライソゾーム病関連酵素を含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。 図７は、ライソゾーム病関連酵素が含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。 図８は、ライソゾーム病関連酵素を含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態では、ライソゾーム病の各疾患において、遺伝的原因により患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない酵素を、ライソゾーム病関連酵素と呼ぶ。ここで、「疾患」とは、ライソゾーム病関連酵素ごとに対応して定義され、例えばムコ多糖症における病型のそれぞれを指すものとする。
　図１は、本実施形態の分析方法を説明するための概念図である。本実施形態の分析方法は、所定の数のライソゾーム病の疾患、特にムコ多糖症の病型に対応するライソゾーム病関連酵素の基質と、試料に含まれている酵素とを反応させ、得られた反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離するものである。
　生体から採取された血液等の試料Ｓｐに含まれるライソゾーム病関連酵素と、これらのライソゾーム関連酵素の基質とを反応させる操作が行われる。ここで、試料Ｓｐは、健常者とライソゾーム病患者との間でライソゾーム病関連酵素の活性が統計等において異なる試料であれば、特に血液に限定されない。以下では、試料Ｓｐは、人間の被検者から採取されたものとするが、特に限定されない。被検者は、５歳以下、３歳以下等の子供または新生児であることが、早期発見によりライソゾーム病の治療による予後をよくするために好ましい。
　以下では、試料Ｓｐを血液とし、乾燥血液スポット（Ｄｒｉｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｐｏｔ；ＤＢＳ）を用いて試料Ｓｐと基質とを反応させる例を説明する。乾燥血液スポットは、全血をそのまま使用することができるため、遠心分離が不要で操作が少なくて済み、採血量も少なくて済む等の利点がある。試料Ｓｐは、ピペットＰ１等の分注用器具または分注装置を用い、ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄ全体に試料Ｓｐがしみ込むようにろ紙Ｃに滴下される。ろ紙Ｃに滴下された試料Ｓｐは、数時間等乾燥に供される（矢印Ａ１１）。
　乾燥した試料Ｓｐは、ろ紙Ｃ上における乾燥血液スポット（ＤＢＳ）となる。ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄは、パンチ等によりろ紙Ｃ本体から取り外しが容易となるように形成されている。取り外し可能部分Ｄは、例えば直径３ｍｍ～６ｍｍ等の円板状の部分である。試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄが取り外されると、分注用チューブまたはウェルプレート等の分注用容器Ｗに配置される（矢印Ａ１２）
　分注用容器Ｗに配置された、試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄに、複数のライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂと、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物に対応する所定の量の不図示の内部標準を含む基質溶液が加えられる。内部標準は、内部標準に対応する検出強度が当該所定の量に対応することにより反応生成物に対応するイオンの定量を行うための物質であり、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物の一部の原子を重水素等の安定同位体で置換した置換体等が適宜用いられる。
　なお、乾燥血液スポットを用いずに、予め定められた量の血液を分注等して得られた溶液と基質溶液を接触させることにより酵素反応を行ってもよい。
　基質溶液が加えられた後、酵素反応のために数時間～数日等、分注用容器Ｗがインキュベーションされる。以下の実施形態で「酵素反応」とはライソゾーム関連酵素と基質Ｓｂとの酵素反応を指し、「反応溶液」とは酵素反応により得られた溶液を指す。その後、反応溶液から酵素反応の反応生成物Ｐを含む成分が抽出され分析用試料Ｓａが調製される（矢印Ａ１３）。反応生成物Ｐの抽出方法は特に限定されないが、液液抽出が液体クロマトグラフィの分析カラムやイオン源等を保護する上で好ましく、酢酸エチルを用いる液液抽出が、分析用試料Ｓａにおける基質Ｓｂの量を減少させることができるためより好ましい。分析用試料Ｓａには、各ライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂが残っていてもよく、基質Ｓｂが含まれているものとして以下の説明を行う。
　調製された分析用試料Ｓａは、液体クロマトグラフに導入され、液体クロマトグラフィにより反応生成物Ｐと対応する基質Ｓｂとが分離される。液体クロマトグラフから溶出された溶出試料は、タンデム質量分析計に導入される。異なるライソゾーム病関連酵素に対応する複数の反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィおよび／または質量分離により分離される。分離された反応生成物Ｐはタンデム質量分析計の検出部により検出される（矢印Ａ１４）。各反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、同時並行に（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）測定される。ここで、「同時並行に測定される」とは液体クロマトグラフに一度に導入された分析用試料Ｓａに含まれる複数の物質が分離されて検出されることを示す。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、以下の表１に挙げられたムコ多糖症の各病型に関連するライソゾーム病関連酵素（以下、ムコ多糖症関連酵素と呼ぶ）から選択されたものを含むことが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、ムコ多糖症のいずれかの病型を含む、各ライソゾーム関連酵素に対応するライソゾーム病に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂが、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、４以上が好ましく、５以上がより好ましい。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多い程、より多くのライソゾーム病の診断のための情報を迅速に提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多すぎると、液体クロマトグラフィおよび質量分析での分離が難しくなるため、活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、適宜５０以下、２０以下、１０以下等に設定されることが好ましい。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、ムコ多糖症関連酵素から選択されることが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、各ムコ多糖症に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。この場合、活性を測定するムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂが、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される４以上のムコ多糖症関連酵素から選択されることがより好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型から選択されるムコ多糖症の病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα－Ｌ－イズロニダーゼおよび／またはイズロン酸－２－スルファターゼを含むことがさらに好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が特に高いムコ多糖症Ｉ型および／若しくはＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたイズロン酸－２－スルファターゼを含むことが一層好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して、特定の地域や性別において発症率が特に高いムコ多糖症ＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。ムコ多糖症ＩＩ型は、人間においてＸ染色体劣性遺伝により発症するため、男性において多く発症する。男の新生児に対するスクリーニング検査にはムコ多糖症ＩＩ型についての検査を含めることが好ましい。
　本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼであるか、これら５つの酵素を含むことが最も好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。
　本実施形態の分析方法において用いるムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂは、液体クロマトグラフィにより反応生成物Ｐの分離が可能であれば特に限定されないが、例えば以下の化学式（１）で示されるものを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
…（１）
　ここで、上記化学式（１）におけるＸ、Ｒ１、Ｒ２およびｎに対応する官能基の一例は、以下の表２に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図２は、本実施形態の分析方法に係る分析装置の構成を示す概念図である。分析装置１は、測定部１００と、制御部４０とを備える。測定部１００は、液体クロマトグラフ１０と、質量分析計２０とを備える。
　液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１ａ，１１ｂと、送液ポンプ１２ａ，１２ｂと、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入する管２１２と、イオンガイド２２２を備える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。
　情報処理部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３とを備える。
　液体クロマトグラフ（ＬＣ）１０は、移動相と分析カラム１４の固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して、各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離し異なる保持時間で溶出させる。液体クロマトグラフ１０は、質量分析計２０により反応生成物Ｐを検出することが可能な、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特にその種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。
　移動相容器１１ａおよび１１ｂは、バイアル等の液体を格納可能な容器を備え、それぞれ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。移動相Ａおよび移動相Ｂは、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができればその組成は特に限定されず、溶媒として水、アセトニトリル等、添加剤としてギ酸等を用いることができる。
　送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂを所定の流量になるように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ出力された移動相Ａおよび移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。
　分析用試料Ｓａの導入等の分析の開始に対応する時点からの各時間における、移動相の組成を示すデータをグラジエントデータと呼ぶ。グラジエントデータに基づいて送液ポンプ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入される。移動相の組成の時間変化は、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、１０分未満の保持時間で反応生成物Ｐの全てを分析カラム１４から溶出することが好ましく、７分未満がより好ましく、３分未満がさらに好ましく、２分未満が一層好ましく、１．５分未満がより一層好ましい。反応生成物Ｐの保持時間が短い程、多くの被検者、特に人間の新生児に対して迅速にライソゾーム病のスクリーニング検査を行うことができる。液体クロマトグラフィが停止により終了する際の保持時間を分析時間と呼ぶ。分析時間は、分析カラム１４等の条件を調整することにより、３分未満とすることができ、より好ましくは２．５分未満とすることができる点が、発明者らにより見出された。これにより、効率よく分析を行うことができる。分析時間が短すぎると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析時間は、適宜３０秒以上または１分以上等とすることができる。
　試料導入部１３は、オートサンプラー等の試料導入装置を備え、分析用試料Ｓａを移動相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された分析用試料Ｓａは、適宜不図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。
　分析カラム１４は、固定相を備え、導入された分析用試料Ｓａに含まれる各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを、移動相と固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して異なる時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、逆相カラムが取扱いの容易さや質量分析でのイオン化の容易さの観点から好ましい。分析カラム１４の固定相は、例えばシリカゲル等の担体に担持された、Ｃ１８等の直鎖炭化水素が結合されたシランが好ましい。
　分析カラム１４の長さは、５０ｍｍ未満が好ましく、４０ｍｍ未満がより好ましく、３０ｍｍ以下がさらに好ましい。分析カラム１４が短いほど、分析にかかる時間が短くなり、効率よく分析を行うことができるため好ましい。分析カラム１４が短すぎると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析カラム１４は、３ｍｍより長いことが好ましく、１０ｍｍより長いことがさらに好ましく、２０ｍｍより長いことが一層好ましく、２５ｍｍより長いことがより一層好ましい。
　分析カラム１４は、各ライソゾーム病関連酵素について、基質Ｓｂが切断されて得られた反応生成物Ｐを、当該基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも先に、すなわち短い保持時間で溶出させることが好ましい。
　図３（Ａ）は、従来の例として、反応生成物Ｐと基質Ｓｂとが略同時に液体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラムである。以下の実施形態では、一例として、プリカーサーイオンとして分離したイオンを解離させて生成イオンを生成し、この生成イオンを分離して検出する、多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）により反応生成物Ｐを検出する例を示す。
　基質Ｓｂは、質量分析計２０のイオン化部２１でイオン化された後、インソース分解により反応生成物Ｐのｍ／ｚと略等しいｍ／ｚを有するイオンとなる場合がある。この場合に、反応生成物Ｐのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムが図３（Ａ）上部のグラフである。このクロマトグラムでは、基質Ｓｂがインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピークＰｓ（以下、インソース分解された基質ｓｂに対応するピークＰｓと呼ぶ）と、反応生成物ＰのフラグメントイオンのピークＰｐ（以下、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと呼ぶ）とが重なったピークＰｐ＋Ｐｓが観察される。
　基質Ｓｂのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、基質Ｓｂのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムが図３（Ａ）下部である。このクロマトグラムに示されるように、基質ＳｂのフラグメントイオンのピークＰｓｂは、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐよりも、大きく、また長い保持時間の範囲にわたって検出され得る。従って、基質Ｓｂが液体クロマトグラフ１０から溶出を始めた後に、反応生成物Ｐが溶出すると、反応生成物Ｐとインソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとが重なり、反応生成物Ｐの検出を正確に行うことができない。
　図３（Ｂ）は、本実施形態の分析方法において、反応生成物Ｐが基質Ｓｂよりも前に液体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラムである。プリカーサーイオンとして反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンおよび基質Ｓｂのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムをそれぞれ図３（Ｂ）の上部および下部に示す。基質ＳｂのフラグメントイオンのピークＰｓｂの検出（図３（Ｂ）下部）と略同時にインソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓが反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚについてのクロマトグラムに観察される（図３（Ｂ）上部）。しかし、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと、インソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとは重ならず、反応生成物Ｐを正確に検出および定量することができる。
　分析カラム１４は、好ましくは、特にムコ多糖症ＩＩ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型にそれぞれ対応する、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは３つを含む酵素の酵素反応の反応生成物Ｐを当該酵素反応の基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも前に溶出させる。これらの酵素の基質Ｓｂは、インソース分解を特に起こしやすいため、より多くのこれらの酵素の反応生成物Ｐを対応する基質Ｓｂより先に溶出させることでより正確に反応生成物Ｐの検出を行うことができる。
　なお、分析条件に応じてより正確に反応生成物Ｐの検出を行う観点から、任意のライソゾーム病関連酵素の反応生成物Ｐを基質Ｓｂよりも先に溶出させることができる。
　図２に戻って、分析カラム１４から溶出された反応生成物Ｐを含む溶出試料は、質量分析計２０のイオン化部２１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユーザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。
　質量分析計２０は、分析カラム１４から導入された溶出試料に対してタンデム質量分析を行い反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準を検出する。イオン化された溶出試料Ｓｅの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。
　なお、質量分析計２０の種類や質量分析の方法は、各反応生成物Ｐに由来するイオンを所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。
　質量分析計２０のイオン化部２１は、導入された反応生成物Ｐを含む溶出試料Ｓｅをイオン化する。イオン化の方法は、所望の精度で反応生成物Ｐが検出される程度に反応生成物Ｐがイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行うものとして説明する。イオン源２１１から出射されイオン化された溶出試料Ｓｅは、不図示の電極に印加された電圧により移動し、管２１２を通過して第１真空室２２ａに入射する。
　第１真空室２２ａ、第２真空室２２ｂおよび第３真空室２２ｃは、この順に真空度が高くなっており、第３真空室２２ｃでは例えば１０－２Ｐａ以下等の高真空まで排気されている。第１真空室２２ａに入射したイオンは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射したイオンは、イオンガイド２２２の間を通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入されたイオンは、第１質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレンズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過するイオンを電磁気学的作用により収束させる。
　第１質量分離部２３は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定されたｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、イオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準をプリカーサイオンとして選択的に通過させる。
　コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０によりイオンの移動を制御しながら、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）によりイオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準を解離させ、フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際にイオンが衝突させられるアルゴンや窒素等を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるようにＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンは、第２質量分離部２５に向けて出射される。
　第２質量分離部２５は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定されたｍ／ｚを有するフラグメントイオンを選択的に通過させて検出部３０に向けて出射する。第２質量分離部２３は、反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンを選択的に通過させる。
　質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症Ｉ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４２５．８～４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして４２５．８～４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３１６．８～３１７．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
　質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６４３．９～６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６４３．９～６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３５８．９～３５９．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
　質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４１９．８～４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして４１９．８～４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３１０．９～３１１．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
　質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＶ－Ａ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６８４．９～６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６８４．９～６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３７２．７～３７３．７の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
　質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＶＩ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６５６．９～６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６５６．９～６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３４４．９～３４５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
　なお、質量分析計２０において選択的に分離するｍ／ｚの値は、イオン化された反応生成物Ｐおよび検出する反応生成物Ｐのフラグメントイオンに応じて適宜設定され、上記の例に限定されない。
　検出部３０は、二次電子増倍管や光電子増倍管等のイオン検出器を備え、入射した反応生成物Ｐと反応生成物Ｐの内部標準とのフラグメントイオンを検出する。検出モードは正イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでもよい。フラグメントイオンを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に入力される（矢印Ａ４）。
　情報処理部４０は、電子計算機等の情報処理装置を備え、適宜ユーザーとのインターフェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う処理装置となる。
　なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および／または質量分析計２０と一体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデータの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行ってもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
　情報処理部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出するイオンのｍ／ｚの値等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。
　情報処理部４０の通信部４２は、インターネット等のネットワークを介して無線や有線の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
　情報処理部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、測定部１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。
　情報処理部４０の出力部４４は、出力制御部５３により制御され、液晶モニタ等の表示装置および／またはプリンターを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、解析部５２の解析結果等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。
　情報処理部４０の制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成される。制御部５０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
　処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１を介した入力等に応じて設定された分析条件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。装置制御部５１は、送液ポンプ１２ａおよび１２ｂの流量を制御したり、試料導入部１３による試料導入を制御したり、第１質量分離部２３および第２質量分離部２５で選択的に通過させるイオンのｍ／ｚ値を制御したり等する。
　解析部５２は、測定部１００から出力された測定データに基づいて反応生成物Ｐの定量等の解析を行う。解析部５２は、検出部３０から出力された測定データから各反応生成物Ｐおよびその内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度を取得して記憶部４３等に記憶させる。
　解析部５２は、各反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応する検出強度を、当該反応生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度で割った比に、当該内部標準の既知の量を掛けた値を、各反応生成物Ｐの量として算出する。解析部５２は算出した各反応生成物Ｐの量と、血液量等の試料Ｓｐの体積と、酵素反応のためのインキュベーションに供した時間等とから、各反応生成物Ｐに対応する試料Ｓｐ中の酵素の活性を算出する。また、解析部５２は、保持時間と検出強度とを対応させたクロマトグラムに対応するデータを作成する。
　解析部５２は、記憶部４３に記憶された基準値に基づいて、被検者が、ライソゾーム病である程度に、またはライソゾーム病の疑いが有る程度に各ライソゾーム病関連酵素の活性が低いか否かを判定する。当該基準値は、健常者と各ライソゾーム病患者におけるライソゾーム関連酵素の活性の値に基づいて予め設定されたものを用いることが好ましい。解析部５２は、適宜統計値のばらつき等を考慮して、上記判定を行うことができる。
　出力制御部５３は、測定部１００の測定条件および／または解析部５２の解析結果等から各ライソゾーム関連酵素の活性、各反応生成物Ｐの量、クロマトグラム、被検者が罹患しているか、罹患している疑いのあるライソゾーム病についての情報等を含む出力画像を作成し、出力部４４に出力させる。医師等は、出力画像に含まれる情報に基づいて、被検者がライソゾーム病に罹患しているか否かの診断等を行うことができる。
　図４は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、医療従事者等により、人間の新生児等の被検者から、血液等の試料Ｓｐが取得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。
　ステップＳ１００３において、医療従事者やユーザー等により、所定の数以上の種類のライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂを含む基質溶液が調製される。ここで、所定の数は、例えば４、５等である。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。ステップＳ１００５において、医療従事者やユーザー等により、試料Ｓｐと基質溶液とを接触させることにより、試料Ｓｐに含まれているライソゾーム病関連酵素と基質Ｓｂとを反応させ、反応生成物Ｐが生成される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。
　ステップＳ１００７において、医療従事者やユーザー等により、反応生成物Ｐと、基質Ｓｂとを含む反応溶液から分析用試料Ｓａが調製される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、試料導入部１３は分析用試料Ｓａを液体クロマトグラフ１０に導入し、分析カラム１４は反応生成物Ｐと基質Ｓｂとを分離する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。
　ステップＳ１０１１において、質量分析計２０は、分離された反応生成物Ｐを質量分析により分離して検出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。ステップＳ１０１３において、解析部５２は、検出された反応生成物Ｐのデータに基づいて、試料Ｓｐにおいてライソゾーム関連酵素の活性が基準値より減少しているかについて解析する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。
　ステップＳ１０１５において、出力部４４は、ライソゾーム病関連酵素のうち、試料Ｓｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病および／またはムコ多糖症の病型についての情報を出力する。ステップＳ１０１５が終了したら、処理が終了される。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態に係る分析装置１は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質Ｓｂと、この４以上の酵素のうち生体から取得された試料Ｓｐに含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物Ｐを含む分析用試料Ｓａが導入される試料導入部と、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成物Ｐを液体クロマトグラフィにより分離する液体クロマトグラフ１０と、液体クロマトグラフ１０により分離した反応生成物Ｐを質量分析により検出する質量分析計２０とを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型から選択される病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。さらに、男性や特定の地域においてさらに発症率の高いムコ多糖症ＩＩ型についても同様の情報を迅速に提供することができる。
（２）本実施形態に係る分析装置において、分析用試料Ｓａは、反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを備え、液体クロマトグラフ１０は、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを液体クロマトグラフィにより分離する。これにより、インソース分解が起こる場合でも基質Ｓｂを正確に検出することができる。
（３）本実施形態に係る分析装置は、ライソゾーム関連酵素のうち、試料Ｓｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病についての情報を出力する出力部４４をさらに備える。これにより、医師等に、ライソゾーム病の診断のための情報を迅速に伝えることができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
（実施例１）
　以下の実施例では、それぞれムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型に対応するα－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼの５種類の酵素の活性を上述の分析方法を用いて分析した実験結果が説明される。
　なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。
　試料と基質との反応
　上記５種類の酵素が含まれていない試料（コントロール試料）、上記５種類の酵素が含まれている試料（所定の濃度の試料）、および、健常者から取得した試料（健常者試料）のそれぞれをろ紙に滴下した後、乾燥させ、ＤＢＳ様のスポットを作成した。当該スポットをパンチにより直径３ｍｍの円盤状に切り取り、９６ウェルのウェルプレートに配置した。当該スポットが配置されたウェルに、上記５種類の酵素の基質と、当該基質から酵素反応により生成される反応生成物Ｐの内部標準とを含む３０μＬの基質溶液を加え、３７℃で１６時間インキュベーションした。
　基質および内部標準
　基質溶液に含まれる基質は、表２に示されたものを用いた。内部標準は、反応生成物Ｐが表２に示されたものとし、表２に示された反応生成物Ｐを置換した以下の置換体を用いた。
Ｉ型：表２のムコ多糖症Ｉ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩ型：表２のムコ多糖症ＩＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩＩＢ型：表２のムコ多糖症ＩＩＩＢ型の反応生成物のＲ２を３つの重水素で置換した置換体。
ＩＶ－Ａ型：表２のムコ多糖症ＩＶ－Ａ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＶＩ型：表２のムコ多糖症ＶＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
　分析用試料の調製
　インキュベーションが終了した後、得られた反応溶液から反応生成物を含む成分を酢酸エチルを用いて抽出した。抽出された反応生成物を含む酢酸エチルを別の容器に配置した後、乾燥させた。その後、０．１％のギ酸が添加された水５５％／アセトニトリル４５％溶液を加え分析用試料とした。
　液体クロマトグラフィの条件
　分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
分析カラム：　Kinetex XB-C18（Phenomenex）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ）
注入量：　１μＬ
カラム温度：　４０℃
移動相：
　（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
　（Ｂ）０．１％ギ酸（アセトニトリルに溶解）
流速：　０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分）　　　　移動相Ｂの濃度（％）
０　　　　　　　　３０
０．５　　　　　　３０
３．５　　　　　　１００
５．０　　　　　　１００
５．０１　　　　　３０
６．０　　　　　　停止
　質量分析の条件
　上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
イオン化の方法：　エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード：　多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
　脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ　Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度：　２５０℃
　ヒートブロック温度：　１００℃
　インターフェース温度：　－
ガス流量：
　ネブライザーガス流量：　３Ｌ／ｍｉｎ
　ドライングガス流量：　５Ｌ／ｍｉｎ
　ヒーティングガス流量：　１５Ｌ／ｍｉｎ
　溶出試料の保持時間と、ＭＲＭの測定条件（ＣＥはコリジョンエネルギー電圧）とは以下の表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　コントロール試料についてのクロマトグラムを図５に、所定の濃度の試料についてのクロマトグラムを図６に、健常者試料についてのクロマトグラムを図７にそれぞれ示した。各ムコ多糖症の病型に対応するクロマトグラムにおいて、上段は、反応生成物に対応するトランジションであり、下段は内部標準に対応するトランジション（表３）のクロマトグラムである。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークをそれぞれＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓとした。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークをそれぞれＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓとした。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークをそれぞれＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐとした。
　コントロール試料では、反応生成物のフラグメントイオンのピークは観察されなかったが、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質にそれぞれ対応するピークＰ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓが観察された（図５）。
　所定の濃度の試料（図６）および健常者試料（図７）においては、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐが観察された。このうち、ＩＩ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ２ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐは、対応するインソース分解された基質のピークＰ２ｓ、Ｐ４ｓおよびＰ６ｓよりも短い保持時間で溶出された。５種類のムコ多糖症関連酵素について、液体クロマトグラフィおよび質量分析により反応生成物が分離されて検出された。
（実施例２）
　以下のように液体クロマトグラフィの条件を変え、さらに、ムコ多糖症Ｉ型の基質を、反応生成物を質量分離する際の条件とは別の質量分離の条件で直接検出した他は、実施例１と同様の条件で、コントロール試料（酵素なし）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
カラム：Kinetex XB-C18（Phenomenex）(内径２．１ｍｍ、長さ３０ｍｍ、粒径１．７μｍ)
グラジエントプログラム：
時間（分）　　　　移動相Ｂの濃度（％）
０　　　　　　　　３０
０．０１　　　　　３０
１．３０　　　　　１００
１．５０　　　　　１００
１．５１　　　　　３０
２．５０　　　　　停止
　図８は、実施例２で得られたマスクロマトグラムを示す図である。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓがそれぞれ観察された。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓは、上記基質とは時間的に分離されて検出された。従って、分析時間を２．５０分とする条件でも、液体クロマトグラフィによる反応生成物および基質の分離が可能であることが示された。
　次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
　日本国特許出願２０１８年第０７７５５５号（２０１８年４月１３日出願）
１…分析装置、１０…液体クロマトグラフ、１４…分析カラム、２０…質量分析計、２１…イオン化部、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、３０…検出部、４０…情報処理部、５０…処理部、５１…装置制御部、５２…解析部、５３…出力制御部、１００…測定部、Ｃ…ろ紙、Ｄ…取り外し可能部分、ＤＢＳ…乾燥血液スポット、Ｐ…反応生成物、Ｐ１，Ｐ２…ピペット、Ｐ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓ，Ｐ６ｉｓ…反応生成物の内部標準のフラグメントイオンのピーク、Ｐｐ，Ｐ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐ，Ｐ６ｐ…反応生成物のフラグメントイオンのピーク、Ｐｓ，Ｐ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓ，Ｐ６ｓ…基質イオンがインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピーク、Ｐｓｂ…基質イオンのフラグメントイオンのピーク、Ｓａ…分析用試料、Ｓｂ…基質、Ｓｐ…試料。

Claims (15)

  1. 　ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、　
    　前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、
    　分離された前記反応生成物を質量分析により検出することと
    を備え、
    　前記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む分析方法。
  2. 　請求項１に記載の分析方法において、
    　前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である分析方法。
  3. 　請求項１に記載の分析方法において、
    　前記酵素は、４以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素を含む分析方法。
  4. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される３以上の酵素を含む分析方法。
  5. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記酵素は、５以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素を含む分析方法。
  6. 　請求項５に記載の分析方法において、
    　前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを含む分析方法。
  7. 　請求項１に記載の分析方法において、
    　生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、
    　前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される分析方法。　
  8. 　請求項７に記載の分析方法において、
    　前記液体クロマトグラフィにおいて、少なくとも一つの前記反応生成物の保持時間は、対応する前記基質の保持時間より短い分析方法。
  9. 　請求項８に記載の分析方法において、
    　前記少なくとも一つの反応生成物は、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される少なくとも一つの酵素による反応生成物を含む分析方法。
  10. 　請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記液体クロマトグラフィにおいて、前記反応生成物を分離するカラムの長さは５０ｍｍ未満である分析方法。
  11. 　請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記液体クロマトグラフィが終了するときの保持時間は３分より短い分析方法。
  12. 　請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低かった酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力することをさらに備える分析方法。
  13. 　ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得された試料に含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物を含む分析用試料を液体クロマトグラフに導入する試料導入部と、
    　導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物を分離する液体クロマトグラフと、
    　前記液体クロマトグラフにより分離された前記反応生成物を質量分析により検出する質量分析部と
    を備え、
    　前記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む分析装置。
  14. 　請求項１３に記載の分析装置において、
    　前記分析用試料は、前記反応生成物および前記基質を備え、
    　前記液体クロマトグラフは、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物および前記基質を分離する分析装置。
  15. 　請求項１３に記載の分析装置において、
    　前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力する出力部をさらに備える分析装置。
    　
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113281397A (zh) * 2021-05-19 2021-08-20 中国科学技术大学 追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023504585A (ja) * 2019-11-27 2023-02-03 サーモ フィッシャー サイエンティフィック （ブレーメン） ゲーエムベーハー サンプルを画像化およびアブレーションするためのシステムおよび方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532442A (ja) * 2011-11-08 2014-12-08 ユニヴァーシティ オブ ワシントン リソソーム酵素アッセイ法および組成物
JP2016529910A (ja) * 2013-09-05 2016-09-29 ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション Ｍｐｓ ｉ、ｉｉ、ｉｉｉａ、ｉｉｉｂ、ｉｖａ、ｖｉ、およびｖｉｉをスクリーニングするための試薬および方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6749851B2 (en) * 2001-08-31 2004-06-15 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations of digestive enzymes
EP2783748B1 (en) 2013-03-27 2019-05-08 Biotage AB Use of a sorbent for extracting mycotoxins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014532442A (ja) * 2011-11-08 2014-12-08 ユニヴァーシティ オブ ワシントン リソソーム酵素アッセイ法および組成物
JP2016529910A (ja) * 2013-09-05 2016-09-29 ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション Ｍｐｓ ｉ、ｉｉ、ｉｉｉａ、ｉｉｉｂ、ｉｖａ、ｖｉ、およびｖｉｉをスクリーニングするための試薬および方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUCCIARDI, ANTONINA ET AL.: "A column-switching HPLC-MS/MS method for mucopolysaccharidosis type I analysis in a multiplex assay for the simultaneous newborn screening of six lysosomal storage disorders", BIOMEDICAL CHROMATOGRAPHY, vol. 28, 2014, pages 1131 - 1139, XP055304261, DOI: 10.1002/bmc.3133 *
LIU, YANG ET AL.: "Multiplex Tandem Mass Spectrometry Enzymatic Activity Assay for Newborn Screening of the Mucopolysaccharidoses and Type 2 Neuronal Ceroid Lipofuscinosis", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 63, no. 6, 2017, pages 1118 - 1126, XP055521743, DOI: 10.1373/clinchem.2016.269167 *
OHIRA, MARI ET AL.: "Quantification of 11 enzyme activities of lysosomal storage disorders using liquid chromatography-tandem mass spectrometry", MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM REPORTS, vol. 17, 7 September 2018 (2018-09-07), pages 9 - 15, XP055521737, DOI: 10.1016/j.ymgmr.2018.08.005 *
SPACIL, ZDENEK ET AL.: "High-Throughput Assay of 9 Lysosomal Enzymes for Newborn Screening", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 59, no. 3, 11 January 2013 (2013-01-11) - 1 March 2013 (2013-03-01), pages 502 - 511, XP055192193 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113281397A (zh) * 2021-05-19 2021-08-20 中国科学技术大学 追踪单溶酶体中亲溶酶体内容物的方法

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