TW201945730A - 分析方法以及分析裝置 - Google Patents

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Abstract

本發明的分析方法包括：使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質、與該四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣所含的酵素反應，生成反應產物；藉由液相層析將反應產物分離；及藉由質譜分析來檢測所分離的反應產物，且所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。

Description

分析方法以及分析裝置
本發明是有關於一種分析方法以及分析裝置。
溶酶體病（lysosome disease）為分解蛋白質、脂肪及糖等的酵素由於遺傳原因而減少或缺損或者未正常工作，由此導致溶酶體中應被分解的物質蓄積，引起細胞死亡或臟器等組織的功能不全的疾病。例如，黏多糖症是由於在溶酶體內工作的水解酵素的缺損等而導致作為黏多糖的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）於溶酶體蓄積。黏多糖症患者由於骨及關節的異常、或癡呆等各種症狀而至成人死亡的例子亦不少。
溶酶體病是藉由酵素補充療法或造血幹細胞移植等而進行治療，但為了使預後良好，重要的是儘早發現。因此，提出有對新生兒進行下述篩查檢查，該篩查檢查研究是否充分產生和溶酶體病的致病基因對應的酵素（參照非專利文獻1）。
於此種篩查檢查中進行下述操作：對血液試樣使用串列式質譜分析計或液相層析質譜分析計，除了檢測和各溶酶體病相關聯的酵素的基質以外，還檢測由酵素反應所得的反應產物，測定生物體內的酵素的活性（參照專利文獻1）。
[現有技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特表2017-526923號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：米歇爾·H·格爾布（Michael H. Gelb）、C·羅納爾多·斯科特（C. Ronald Scott）、及弗蘭蒂斯克·特拉克（Frantisek Turecek），「新生兒的溶酶體儲積症篩查（New born screening for lysosomal storage diseases）」，臨床化學（Clinical chemistry），（美國），美國臨床化學協會（American Association for Clinical Chemistry），2015年1月，第61卷（Volume 61），第二期（Issue 2），pp.335-346
[發明所欲解決之課題]
然而，於質譜分析中存在下述問題：質譜分析用試樣所含的、和溶酶體病相關聯的酵素的基質於離子化後發生解離，經解離的離子難以與反應產物相區分，由於該等原因而無法將反應產物充分地分離並檢測。
[解決課題之手段]
根據本發明的第一態樣，分析方法包括：使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質、與所述四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣所含的酵素反應，生成反應產物；藉由液相層析將所述反應產物分離；及藉由質譜分析來檢測所分離的所述反應產物，且所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶（iduronic acid-2-sulfatase）。
根據本發明的第二態樣，較佳為於第一態樣的分析方法中，所述酵素為於溶酶體病中於所述患者體內減少或缺損或者未正常工作的五種以上的酵素。
根據本發明的第三態樣，較佳為於第一態樣或第二態樣的分析方法中，所述酵素包含於四種以上的黏多糖症的各病型中，於所述患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素。
根據本發明的第四態樣，較佳為於第三態樣的分析方法，所述酵素包含選自由α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase）、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶（α-N-acetyl glucosaminidase）、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶（N-acetylgalactosamine-6-sulfatase）及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的3種以上的酵素。
根據本發明的第五態樣，較佳為於第三態樣或第四態樣的分析方法中，所述酵素包含於五種以上的黏多糖症的各病型中，於患者體內減少或缺損或者未正常工作的五種以上的酵素。
根據本發明的第六態樣，較佳為於第五態樣的分析方法中，所述酵素包含α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶。
根據本發明的第七態樣，較佳為於第一態樣至第六態樣中任一態樣的分析方法中，將包含所生成的所述反應產物與所述基質的溶液導入液相層析儀，藉由所述液相層析將所述反應產物及所述基質分離。
根據本發明的第八態樣，較佳為於第七態樣中，於所述液相層析中，至少一種所述反應產物的保持時間較對應的所述基質的保持時間更短。
根據本發明的第九態樣，較佳為於第八態樣的分析方法中，所述至少一種反應產物包含由選自由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的至少一種酵素所得的反應產物。
根據本發明的第十態樣，較佳為於第一態樣至第九態樣中任一態樣的分析方法中，於所述液相層析中，分離所述反應產物的管柱的長度小於50 mm。
根據本發明的第十一態樣，較佳為於第一態樣至第十態樣中任一態樣的分析方法中，所述液相層析結束時的保持時間短於3分鐘。
根據本發明的第十二態樣，較佳為於第一態樣至第十一態樣中任一態樣的分析方法中更包括：輸出與所述酵素中於所述試樣中的活性低於基準值的酵素、或和該酵素對應的所述溶酶體病有關的資訊。
根據本發明的第十三態樣，分析裝置包括：試樣導入部，將分析用試樣導入液相層析儀，所述分析用試樣包含使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質、與所述四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣所含的酵素反應而得的反應產物；液相層析儀，將所導入的所述分析用試樣所含的所述反應產物分離；及質譜分析部，藉由質譜分析來檢測由所述液相層析儀所分離的所述反應產物，且所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
根據本發明的第十四態樣，較佳為於第十三態樣的分析裝置中，所述分析用試樣具備所述反應產物及所述基質，所述液相層析儀將所導入的所述分析用試樣所含的所述反應產物及所述基質分離。
根據本發明的第十五態樣，較佳為更包括：輸出部，輸出與第十三態樣或第十四態樣的所述酵素中於所述試樣中的活性低於基準值的酵素、或和該酵素對應的所述溶酶體病有關的資訊。
[發明的效果]
根據本發明，可迅速測定和黏多糖症等溶酶體病關聯的四種以上的酵素的活性。
以下，參照圖對用以實施本發明的形態進行說明。以下的實施形態中，將於溶酶體病的各疾病中因遺傳原因而於患者體內減少或缺損或者未正常工作的酵素稱為溶酶體病關聯酵素。此處，所謂「疾病」，是與每個溶酶體病關聯酵素對應而定義，例如是指黏多糖症的各病型。
圖1為用以說明本實施形態的分析方法的概念圖。本實施形態的分析方法使和既定數量的溶酶體病的疾病、特別是黏多糖症的病型對應的溶酶體病關聯酵素的基質與試樣所含的酵素反應，並藉由液相層析將所得的反應產物分離。
進行下述操作：使自生物體所採集的血液等試樣Sp所含的溶酶體病關聯酵素、與該些溶酶體關聯酵素的基質反應。此處，試樣Sp只要為於健康者與溶酶體病患者之間溶酶體病關聯酵素的活性於統計等中不同的試樣，則不特別限定於血液。以下，設試樣Sp是自人類的受檢者採集，但並無特別限定。為了藉由儘早發現而使溶酶體病的由治療所得的預後良好，受檢者較佳為5歲以下、3歲以下等的兒童或新生兒。
以下，對將試樣Sp設為血液並使用乾燥血斑（Dried Blood Spot，DBS）使試樣Sp與基質反應的例子進行說明。乾燥血斑可直接使用全血，故而有無需離心分離而操作較少便可，採血量亦較少便可等優點。對於試樣Sp，使用吸管P1等分注用器具或分注裝置，以試樣Sp滲入濾紙C的可取下部分D整體的方式滴加至濾紙C。將滴加至濾紙C的試樣Sp乾燥幾小時等（箭頭A11）。
經乾燥的試樣Sp成為濾紙C上的乾燥血斑（DBS）。濾紙C的可取下部分D是以藉由打孔（punch）等而容易自濾紙C本體取下的方式形成。可取下部分D例如為直徑3 mm～6 mm等的圓板狀部分。將包含試樣Sp的可取下部分D取下後，配置於分注用管或孔板（well plate）等分注用容器W（箭頭A12）。
對配置於分注用容器W的包含試樣Sp的可取下部分D添加基質溶液，該基質溶液包含多種溶酶體關聯酵素的基質Sb、及和由基質Sb藉由酵素反應所得的反應產物對應的既定量的未圖示的內標準。內標準為用以藉由和內標準對應的檢測強度與該既定量對應，而進行和反應產物對應的離子的定量的物質，可適當使用由基質Sb藉由酵素反應所得的反應產物的一部分原子經氘等穩定同位素取代而成的取代物等。
再者，亦可不使用乾燥血斑，而藉由使基質溶液與將預定量的血液分注等而得的溶液接觸來進行酵素反應。
添加基質溶液後，為了酵素反應而將分注用容器W培養幾小時～幾天等。以下的實施形態中，所謂「酵素反應」是指溶酶體關聯酵素與基質Sb的酵素反應，所謂「反應溶液」是指藉由酵素反應所得的溶液。然後，自反應溶液提取包含酵素反應的反應產物P的成分而製備分析用試樣Sa（箭頭A13）。反應產物P的提取方法並無特別限定，液液提取於保護液相層析的分析管柱或離子源等的方面而言較佳，使用乙酸乙酯的液液提取可使分析用試樣Sa的基質Sb的量減少，故而更佳。分析用試樣Sa中亦可殘留各溶酶體關聯酵素的基質Sb，設為包含基質Sb而進行以下的說明。
所製備的分析用試樣Sa被導入液相層析儀，藉由液相層析將反應產物P與對應的基質Sb分離。自液相層析儀溶出的溶出試樣被導入串列式質譜分析計。和不同的溶酶體病關聯酵素對應的多種反應產物P是藉由液相層析及/或質量分離而分離。經分離的反應產物P是藉由串列式質譜分析計的檢測部而檢測（箭頭A14）。各反應產物P是藉由液相層析/串列式質譜分析（LC/MS/MS）而同時同步地（Simultaneously）測定。此處，所謂「同時同步地測定」，表示將一次導入液相層析儀的分析用試樣Sa所含的多種物質分離並檢測。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的溶酶體病關聯酵素較佳為包含選自和以下的表1所列舉的黏多糖症的各病型相關聯的溶酶體病關聯酵素（以下稱為黏多糖症關聯酵素）中的溶酶體病關聯酵素。藉此，可提供用以診斷經採集試樣Sp的生物體是否罹患或是否疑似罹患包含黏多糖症的任一病型的、與各溶酶體關聯酵素對應的溶酶體病的資訊。測定活性的溶酶體病關聯酵素的基質Sb是包含於所述基質溶液而添加至試樣Sp。
[表1]
【表1】 表1：黏多糖症的病型（一部分）與黏多糖症關聯酵素
測定活性的溶酶體病關聯酵素的種類較佳為四種以上，更佳為五種以上。測定活性的溶酶體病關聯酵素的種類越多，越可迅速提供更多的用以診斷溶酶體病的資訊。若測定活性的溶酶體病關聯酵素的種類過多，則難以進行利用液相層析及質譜分析的分離，故而測定活性的溶酶體病關聯酵素的種類較佳為適當設定為50種以下、20種以下、10種以下等。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的溶酶體病關聯酵素較佳為自黏多糖症關聯酵素中選擇。藉此，可提供用以診斷經採集試樣Sp的生物體是否罹患或是否疑似罹患各黏多糖症的資訊。於該情形時，測定活性的黏多糖症關聯酵素的基質Sb是包含於所述基質溶液而添加至試樣Sp。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的黏多糖症關聯酵素更佳為自選自由表1所列舉的α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的四種以上的黏多糖症關聯酵素中選擇。藉此，可提供用以診斷受檢者是否罹患或是否疑似罹患選自與其他黏多糖症的病型相比而發病率高的各黏多糖症I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型中的黏多糖症的病型的資訊。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的黏多糖症關聯酵素進而佳為包含表1所列舉的α-L-艾杜糖醛酸酶及/或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。藉此，可提供用以診斷受檢者是否罹患或是否疑似罹患與其他黏多糖症的病型相比而發病率特別高的黏多糖症I型及/或II型的資訊。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的黏多糖症關聯酵素進一步佳為包含表1所列舉的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。藉此，可提供用以診斷受檢者是否罹患或是否疑似罹患與其他黏多糖症的病型相比而發病率於特定地域或性別特別高的黏多糖症II型的資訊。黏多糖症II型對於人類而言因X染色體隱性遺傳而發病，因而男性多發病。較佳為於對男新生兒的篩查檢查中包括與黏多糖症II型有關的檢查。
藉由本實施形態的分析方法測定活性的黏多糖症關聯酵素最佳為表1所列舉的α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶，或包含該些五種酵素。藉此，可迅速提供用以診斷受檢者是否罹患或是否疑似罹患與其他黏多糖症的病型相比而發病率高的各黏多糖症I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的資訊。
本實施形態的分析方法中所用的黏多糖症關聯酵素的基質Sb只要藉由液相層析而可進行反應產物P的分離，則並無特別限定，例如可使用以下的化學式（1）所示的基質。
[化1]
此處，與所述化學式（1）的X、R1 、R2 及n對應的官能基的一例示於以下的表2。

[表2]
【表2】 表2：基質與反應產物的一例
圖2為表示本實施形態的分析方法的分析裝置的結構的概念圖。分析裝置1具備測定部100及控制部40。測定部100具備液相層析儀10及質譜分析計20。
液相層析儀10具備移動相容器11a、移動相容器11b、送液泵12a、送液泵12b、試樣導入部13及分析管柱14。質譜分析計20具備包含離子化部211的離子化室21、包含離子透鏡221的第一真空室22a、自離子化室21向第一真空室22a導入離子的管212、包含離子導件（ion guide）222的第二真空室22b、及第三真空室22c。第三真空室22c具備第一質量分離部23、碰撞單元（collision cell）24、第二質量分離部25及檢測部30。碰撞單元24具備離子導件240及碰撞誘發解離（Collision-Induced Dissociation，CID）氣體導入口241。
資訊處理部40具備輸入部41、通信部42、記憶部43、輸出部44及控制部50。控制部50具備裝置控制部51、分析部52及輸出控制部53。
液相層析儀（LC）10利用各反應產物P及基質Sb對移動相與分析管柱14的固定相的親和性的差異，將各反應產物P及基質Sb分離並使其以不同的保持時間溶出。液相層析儀10只要能以可藉由質譜分析計20來檢測反應產物P的所期望精度將反應產物P及基質Sb分離，則其種類並無特別限定。作為液相層析儀10，可使用奈米液相層析儀（Liquid Chromatograph，LC）、微米LC、高效液相層析儀（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）及超高效液相層析儀（Ultra-High Performance Liquid Chromatograph，UHPLC）等。
移動相容器11a及移動相容器11b具備小瓶（vial）等可儲存液體的容器，儲存組成各不相同的移動相。將儲存於移動相容器11a及移動相容器11b的移動相分別稱為移動相A及移動相B。移動相A及移動相B只要能以所期望精度將反應產物P及基質Sb分離，則其組成並無特別限定，可使用水、乙腈等作為溶劑，可使用甲酸等作為添加劑。
送液泵12a及送液泵12b分別將移動相A及移動相B以成為既定流量的方式送液。自送液泵12a及送液泵12b分別輸出的移動相A及移動相B於流路的中途混合，導入試樣導入部13。送液泵12a及送液泵12b藉由分別使移動相A及移動相B的流量變化，而使導入分析管柱14的移動相的組成視時間而變化。
將距和分析用試樣Sa的導入等分析的開始對應的時間點的各時間的、表示移動相的組成的資料稱為梯度資料（gradient data）。基於梯度資料而控制送液泵12a及送液泵12b，將所設定的組成的移動相導入分析管柱14。移動相的組成的時間變化只要能以所期望精度將反應產物P及基質Sb分離，則並無特別限定，較佳為使反應產物P以小於10分鐘的保持時間全部自分析管柱14溶出，更佳為小於7分鐘，進而佳為小於3分鐘，進一步佳為小於2分鐘，進一步更佳為小於1.5分鐘。反應產物P的保持時間越短，可對越多的受檢者、特別是人類的新生兒迅速進行溶酶體病的篩查檢查。將液相層析因停止而結束時的保持時間稱為分析時間。發明者等人發現，分析時間可藉由調整分析管柱14等的條件而設為小於3分鐘，更佳為可設為小於2.5分鐘。藉此，可高效率地進行分析。若分析時間過短，則液相層析的反應產物P及基質Sb的分離變困難，故而分析時間可適當設為30秒鐘以上或1分鐘以上等。
試樣導入部13具備自動採樣器（autosampler）等試樣導入裝置，將分析用試樣Sa導入移動相（箭頭A1）。由試樣導入部13所導入的分析用試樣Sa適當穿過未圖示的保護管柱而導入分析管柱14。
分析管柱14具備固定相，利用各反應產物P及基質Sb對移動相與固定相的親和性的差異，而使所導入的分析用試樣Sa所含的各反應產物P及基質Sb於不同時間溶出。分析管柱14的種類只要能以所期望精度將各反應產物P及基質Sb分離，則並無特別限定，逆相管柱就操作的容易度或利用質譜分析的離子化的容易度的觀點而言較佳。分析管柱14的固定相例如較佳為擔載於矽膠（silica gel）等載體的、鍵結有C18等的直鏈烴的矽烷。
分析管柱14的長度較佳為小於50 mm，更佳為小於40 mm，進而佳為30 mm以下。其原因在於，分析管柱14越短，則分析所耗的時間越變短，可高效率地進行分析。若分析管柱14過短，則液相層析的反應產物P及基質Sb的分離變困難，故而分析管柱14較佳為長於3 mm，進而佳為長於10 mm，更佳為長於20 mm，進而更佳為長於25 mm。
分析管柱14較佳為針對各溶酶體病關聯酵素，使基質Sb經切斷所得的反應產物P較該基質Sb的溶出開始而先溶出，即以短的保持時間溶出。
圖3（A）為作為現有例而示意性地表示反應產物P與基質Sb大致同時自液相層析儀10溶出的情形的、質譜分析的檢測強度的層析圖。以下的實施形態中，作為一例而表示藉由多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）來檢測反應產物P的例子，所述多反應監測使作為前驅物（precursor）離子而分離的離子解離而生成生成離子，將該生成離子分離並進行檢測。
基質Sb有時於質譜分析計20的離子化部21經離子化後，因源內（in-source）分解而成為具有與反應產物P的質荷比（mass-to-charge ratio，m/z）大致相等的m/z的離子。此時，將和反應產物P的m/z對應的離子作為前驅物離子進行質量分離，並將具有與反應產物P的碎片離子（fragment ion）對應的m/z的離子進行質量分離並檢測的層析圖為圖3（A）上部的曲線圖。該層析圖中，觀察到基質Sb經源內分解的離子的碎片離子的波峰Ps（以下稱為與經源內分解的基質sb對應的波峰Ps）、與反應產物P的碎片離子的波峰Pp（以下稱為與反應產物P對應的波峰Pp）重疊的波峰Pp＋Ps。
將和基質Sb的m/z對應的離子作為前驅物離子進行質量分離，並將具有和基質Sb的碎片離子對應的m/z的離子進行質量分離並檢測的層析圖為圖3（A）下部。如該層析圖所示，基質Sb的碎片離子的波峰Psb相較於和反應產物P對應的波峰Pp，可於更大且更長的保持時間的範圍內檢測到。因此，若於基質Sb自液相層析儀10開始溶出後，反應產物P溶出，則反應產物P與和經源內分解的基質Sb對應的波峰Ps重疊，無法準確地進行反應產物P的檢測。
圖3（B）為示意性地表示於本實施形態的分析方法中，反應產物P於基質Sb之前自液相層析儀10溶出的情形的、質譜分析的檢測強度的層析圖。將作為前驅物離子而將具有和反應產物P及基質Sb對應的m/z的離子進行質量分離，並將具有和反應產物P的碎片離子及基質Sb的碎片離子對應的m/z的離子進行質量分離並檢測的層析圖分別示於圖3（B）的上部及下部。於與和反應產物P的碎片離子對應的m/z有關的層析圖，與基質Sb的碎片離子的波峰Psb的檢測（圖3（B）下部）大致同時而觀察到和經源內分解的基質Sb對應的波峰Ps（圖3（B）上部）。然而，和反應產物P對應的波峰Pp、與和經源內分解的基質Sb對應的波峰Ps未重疊，而可對反應產物P準確地進行檢測及定量。
分析管柱14較佳為使包含選自尤其和黏多糖症II型、IV-A型及VI型分別對應的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的至少一種、更佳為至少兩種、進而佳為三種的酵素的酵素反應的反應產物P，於該酵素反應的基質Sb的溶出開始之前溶出。該些酵素的基質Sb尤其容易發生源內分解，故而藉由使更多的該些酵素的反應產物P較對應的基質Sb先溶出，而可更準確地進行反應產物P的檢測。
再者，就根據分析條件而更準確地進行反應產物P的檢測的觀點而言，可使任意的溶酶體病關聯酵素的反應產物P較基質Sb先溶出。
回到圖2，自分析管柱14溶出的包含反應產物P的溶出試樣被導入質譜分析計20的離子化部21。分析管柱14的溶出液較佳為無需分析裝置1的用戶（以下簡稱為「用戶」）所進行的分注等操作，藉由線上控制而輸入質譜分析計20。
質譜分析計20對自分析管柱14導入的溶出試樣進行串列式質譜分析，檢測反應產物P及反應產物P的內標準。藉由一點鏈線的箭頭A2示意性地表示經離子化的溶出試樣Se的路徑。
再者，質譜分析計20的種類或質譜分析的方法只要能以所期望精度檢測源自各反應產物P的離子，則並無特別限定。
質譜分析計20的離子化部21將所導入的包含反應產物P的溶出試樣Se離子化。離子化的方法只要以所期望精度將反應產物P離子化至檢測出反應產物P的程度，則並無特別限定，於如本實施形態般進行LC/MS/MS的情形時，較佳為電灑游離法（Electrospray Ionization，ESI），以下的實施形態中亦設為進行ESI而進行說明。自離子源211出射的經離子化的溶出試樣Se因施加於未圖示的電極的電壓而移動，穿過管212而入射至第一真空室22a。
第一真空室22a、第二真空室22b及第三真空室22c的真空度依次變高，於第三真空室22c中例如排氣至10-2 Pa以下等的高真空。入射至第一真空室22a的離子穿過離子透鏡221而被導入第二真空室22b。入射至第二真空室22b的離子穿過離子導件222之間而被導入第三真空室22c。經導入第三真空室22c的離子向第一質量分離部23出射。於入射至第一質量分離部23為止的期間中，離子透鏡221或離子導件222等藉由電磁學作用使穿過的離子收束。
第一質量分離部23使具有藉由基於對四極施加的電壓的電磁學作用而設定的m/z的離子作為前驅物離子而選擇性地穿過，向碰撞單元24出射。第一質量分離部23使經離子化的反應產物P及和反應產物P對應的內標準作為前驅物離子而選擇性地穿過。
碰撞單元24一方面藉由離子導件240而控制離子的移動，一方面使藉由碰撞誘發解離（Collision Induced Dissociation，CID）而離子化的反應產物P及和反應產物P對應的內標準解離，生成碎片離子。於CID時供離子碰撞的包含氬或氮等的氣體（以下稱為CID氣體）是以於碰撞單元內成為既定壓力的方式自CID氣體導入口241導入（箭頭A3）。所生成的碎片離子向第二質量分離部25出射。
第二質量分離部25使具有藉由基於對四極施加的電壓的電磁學作用而設定的m/z的碎片離子選擇性地穿過，向檢測部30出射。第二質量分離部23使反應產物P及反應產物P的內標準的碎片離子選擇性地穿過。
於質譜分析計20中使用表2所示的基質Sb的情形時，和黏多糖症I型對應的黏多糖症關聯酵素的反應產物P較佳為藉由425.8～426.8的範圍的任一m/z進行分離。更佳為以下述情況為宜：將該反應產物P作為前驅物離子而藉由425.8～426.8的範圍的任一m/z進行分離，且將生成離子藉由316.8～317.8的範圍的任一m/z進行分離並檢測。
於質譜分析計20中使用表2所示的基質Sb的情形時，和黏多糖症II型對應的黏多糖症關聯酵素的反應產物P較佳為藉由643.9～644.9的範圍的任一m/z進行分離。更佳為以下述情況為宜：將該反應產物P作為前驅物離子而藉由643.9～644.9的範圍的任一m/z進行分離，且將生成離子藉由358.9～359.9的範圍的任一m/z進行分離並檢測。
於質譜分析計20中使用表2所示的基質Sb的情形時，和黏多糖症IIIB型對應的黏多糖症關聯酵素的反應產物P較佳為藉由419.8～420.8的範圍的任一m/z進行分離。更佳為以下述情況為宜：將該反應產物P作為前驅物離子而藉由419.8～420.8的範圍的任一m/z進行分離，且將生成離子藉由310.9～311.9的範圍的任一m/z進行分離並檢測。
於質譜分析計20中使用表2所示的基質Sb的情形時，和黏多糖症IV-A型對應的黏多糖症關聯酵素的反應產物P較佳為藉由684.9～685.9的範圍的任一m/z進行分離。更佳為以下述情況為宜：將該反應產物P作為前驅物離子而藉由684.9～685.9的範圍的任一m/z進行分離，且將生成離子藉由372.7～373.7的範圍的任一m/z進行分離並檢測。
於質譜分析計20中使用表2所示的基質Sb的情形時，和黏多糖症VI型對應的黏多糖症關聯酵素的反應產物P較佳為藉由656.9～657.9的範圍的任一m/z進行分離。更佳為以下述情況為宜：將該反應產物P作為前驅物離子而藉由656.9～657.9的範圍的任一m/z進行分離，且將生成離子藉由344.9～345.9的範圍的任一m/z進行分離並檢測。
再者，於質譜分析計20中選擇性地分離的m/z的值是根據經離子化的反應產物P及檢測的反應產物P的碎片離子而適當設定，不限定於所述例子。
檢測部30具備二次電子倍增管或光電子倍增管等離子檢測器，檢測所入射的反應產物P及反應產物P的內標準的碎片離子。檢測模式可為檢測正離子的正離子模式、與檢測負離子的負離子模式的任一種。檢測碎片離子所得的檢測訊號由未圖示的類比-數位（Analog-Digital，A/D）轉換器進行A/D轉換，成為數位訊號而輸入資訊處理部40的控制部50（箭頭A4）。
資訊處理部40具備電子計算機等資訊處理裝置，除了適當成為與用戶的介面（interface）以外，還進行與各種資料有關的通信、記憶、運算等處理。資訊處理部40成為進行測定部100的控制或分析、顯示的處理的處理裝置。
再者，資訊處理部40亦可構成為與液相層析儀10及/或質譜分析計20成一體的一個裝置。另外，用於本實施形態的分析方法的資料的一部分亦可保存於遠程的伺服器（server）等，由該分析方法進行的運算處理的一部分亦可由遠程的伺服器等進行。測定部100的各部的動作的控制可由資訊處理部40進行，亦可由構成各部的裝置分別進行。
資訊處理部40的輸入部41是包含滑鼠（mouse）、鍵盤（keyboard）、各種按鈕及/或觸控面板（touch panel）等輸入裝置而構成。輸入部41自用戶受理要檢測的離子的m/z的值等控制部50進行的處理所需要的資訊等。
資訊處理部40的通信部42是包含經由網際網路（Internet）等網路（network）藉由無線或有線的連接而可通信的通信裝置而構成。通信部42接收測定部100的測定所需要的資料，或發送分析部52的分析結果等控制部50處理後的資料，或適當收發需要的資料。
資訊處理部40的記憶部43具備非揮發性的記憶媒體。記憶部43記憶從測定部100輸出的測定資料、及用以由控制部50執行處理的程式（program）等。
資訊處理部40的輸出部44是由輸出控制部53進行控制，包含液晶監視器等顯示裝置及/或印表機（printer）而構成，將與測定部100的測定有關的資訊、或分析部52的分析結果等顯示於顯示裝置或印刷於印刷媒體而輸出。
資訊處理部40的控制部50是包含中央處理單元（Central Processing Unit，CPU）等處理器而構成。控制部50進行測定部100的控制，或對自測定部100輸出的測定資料進行分析等，執行記憶於記憶部43等的程式，藉此進行各種處理。
處理部50的裝置控制部51基於根據經由輸入部41的輸入等而設定的分析條件等，來控制測定部100的測定動作。裝置控制部51控制送液泵12a及送液泵12b的流量，或控制試樣導入部13進行的試樣導入，或控制於第一質量分離部23及第二質量分離部25選擇性地穿過的離子的m/z值等。
分析部52基於自測定部100輸出的測定資料來進行反應產物P的定量等分析。分析部52根據自檢測部30輸出的測定資料，獲取和各反應產物P及其內標準的碎片離子對應的檢測強度，並記憶於記憶部43等。
分析部52對將和各反應產物P的碎片離子對應的檢測強度除以和該反應產物P的內標準的碎片離子對應的檢測強度所得之比，乘以該內標準的已知的量，算出所得的值作為各反應產物P的量。分析部52根據所算出的各反應產物P的量、血液量等試樣Sp的體積、及供用於酵素反應的培養的時間等，而算出和各反應產物P對應的試樣Sp中的酵素的活性。另外，分析部52製作和使保持時間與檢測強度對應的層析圖對應的資料。
分析部52基於記憶部43所記憶的基準值，來判定受檢者的各溶酶體病關聯酵素的活性是否低至為溶酶體病的程度、或疑似溶酶體病的程度。該基準值較佳為使用基於健康者、及各溶酶體病患者的溶酶體關聯酵素的活性的值而預先設定的值。分析部52可適當考慮統計值的偏差等而進行所述判定。
輸出控制部53根據測定部100的測定條件及/或分析部52的分析結果等而製作輸出圖像並輸出至輸出部44，所述輸出圖像包含與各溶酶體關聯酵素的活性、各反應產物P的量、層析圖、受檢者罹患或疑似罹患的溶酶體病有關的資訊等。醫師等可基於輸出圖像所含的資訊來進行受檢者是否罹患溶酶體病的診斷等。
圖4為表示本實施形態的分析方法的流程的流程圖。步驟S1001中，由醫療從事者等自人類的新生兒等受檢者獲取血液等試樣Sp。步驟S1001結束後，開始步驟S1003。
步驟S1003中，由醫療從事者或用戶等製備包含既定數量以上的種類的溶酶體病關聯酵素的基質Sb的基質溶液。此處，既定數量例如為4、5等。步驟S1003結束後，開始步驟S1005。步驟S1005中，由醫療從事者或用戶等使試樣Sp與基質溶液接觸，藉此使試樣Sp所含的溶酶體病關聯酵素與基質Sb反應，生成反應產物P。步驟S1005結束後，開始步驟S1007。
步驟S1007中，由醫療從事者或用戶等由包含反應產物P及基質Sb的反應溶液來製備分析用試樣Sa。步驟S1007結束後，開始步驟S1009。步驟S1009中，試樣導入部13將分析用試樣Sa導入液相層析儀10，分析管柱14分離反應產物P與基質Sb。步驟S1009結束後，開始步驟S1011。
步驟S1011中，質譜分析計20藉由質譜分析將所分離的反應產物P分離並檢測。步驟S1011結束後，開始步驟S1013。步驟S1013中，分析部52基於所檢測到的反應產物P的資料，分析試樣Sp中溶酶體關聯酵素的活性是否較基準值而減少。步驟S1013結束後，開始步驟S1015。
步驟S1015中，輸出部44輸出與溶酶體病關聯酵素中於試樣Sp的活性低於基準值的酵素、或和該酵素對應的溶酶體病及/或黏多糖症的病型有關的資訊。步驟S1015結束後，處理結束。
根據所述實施形態，可獲得以下的作用效果。
（1）本實施形態的分析裝置1包括：試樣導入部，導入分析用試樣Sa，該分析用試樣Sa包含使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質Sb、與該四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣Sp所含的酵素反應而得的反應產物P；液相層析儀10，藉由液相層析將所導入的分析用試樣Sa所含的反應產物P分離；及質譜分析計20，藉由質譜分析來檢測由液相層析儀10所分離的反應產物P，且所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。藉此，可迅速提供用以診斷受檢者是否罹患或是否疑似罹患選自與其他黏多糖症的病型相比而發病率高的各黏多糖症I型、IIIB型、IV-A型及VI型中的病型的資訊。進而，關於發病率於男性或特定地域更高的黏多糖症II型，亦可迅速提供同樣的資訊。
（2）本實施形態的分析裝置中，分析用試樣Sa具備反應產物P及基質Sb，液相層析儀10藉由液相層析將所導入的分析用試樣Sa所含的反應產物P及基質Sb分離。藉此，於發生源內分解的情形時亦可準確地檢測基質Sb。
（3）本實施形態的分析裝置更包括：輸出部44，輸出與溶酶體關聯酵素中於試樣Sp的活性低於基準值的酵素、或和該酵素對應的溶酶體病有關的資訊。藉此，可向醫師等迅速傳達用以診斷溶酶體病的資訊。
本發明不限定於所述實施形態的內容。於本發明的技術思想的範圍內可想到的其他態樣亦包含於本發明的範圍內。
[實施例]
（實施例1）
以下的實施例中，對使用所述分析方法分別分析和黏多糖症I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型對應的α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶此五種酵素的活性而得的實驗結果進行說明。
再者，本發明不限定於以下的實施例所示的數值、條件。
試樣與基質的反應
將不含所述五種酵素的試樣（對照試樣）、包含所述五種酵素的試樣（既定濃度的試樣）、及自健康者獲取的試樣（健康者試樣）分別滴加至濾紙後，加以乾燥，製作DBS狀的斑。藉由打孔將該斑以直徑3 mm的圓盤狀切取，配置於96孔的孔板。對配置有該斑的孔添加包含所述五種酵素的基質、及由該基質藉由酵素反應生成的反應產物P的內標準的30 μL的基質溶液，於37℃培養16小時。
基質及內標準
關於基質溶液所含的基質，使用表2所示的基質。關於內標準，設反應產物P為表2所示，且使用將表2所示的反應產物P取代而成的以下的取代物。
I型：表2的黏多糖症I型的反應產物的R2 經5個氘取代而成的取代物。
II型：表2的黏多糖症II型的反應產物的R2 經5個氘取代而成的取代物。
IIIB型：表2的黏多糖症IIIB型的反應產物的R2 經3個氘取代而成的取代物。
IV-A型：表2的黏多糖症IV-A型的反應產物的R2 經5個氘取代而成的取代物。
VI型：表2的黏多糖症VI型的反應產物的R2 經5個氘取代而成的取代物。
分析用試樣的製備
培養結束後，使用乙酸乙酯自所得的反應溶液提取包含反應產物的成分。將所提取的包含反應產物的乙酸乙酯配置於其他容器後，加以乾燥。然後，加入添加有0.1%的甲酸的水55%/乙腈45%溶液製成分析用試樣。
液相層析的條件
於以下的條件下藉由液相層析將分析用試樣分離。
系統：LCMS-8060系統（島津製作所）
分析管柱：基尼泰薩（Kinetex）XB-C18（菲羅門（Phenomenex））（內徑2.1 mm、長度150 mm、粒徑1.7 μm）
注入量：1 μL
管柱溫度：40℃
移動相：
（A）0.1%甲酸（溶解於水）
（B）0.1%甲酸（溶解於乙腈）
流速：0.4 mL/min
梯度程式：
時間（分鐘） 移動相B的濃度（%）
0 30
0.5 30
3.5 100
5.0 100
5.01 30
6.0 停止
質譜分析的條件
藉由直接連接於溶出口的串列式質譜分析來檢測於所述液相層析中溶出的溶出試樣。
系統：LCMS-8060系統（島津製作所）
離子化的方法：電噴霧法，正離子模式
測定模式：多反應監測（MRM）
溫度：
脫溶劑管（Desolvation Line，DL）溫度：250℃
加熱塊溫度：100℃
介面溫度：-
氣體流量：
霧化氣體流量：3 L/min
乾燥氣體流量：5 L/min
加熱氣體流量：15 L/min
溶出試樣的保持時間、及MRM的測定條件（CE為碰撞能量電壓）示於以下的表3。
[表3]
【表3】 表3：MRM的測定條件
分別將與對照試樣有關的層析圖示於圖5，將與既定濃度的試樣有關的層析圖示於圖6，將與健康者試樣有關的層析圖示於圖7。於和各黏多糖症的病型對應的層析圖中，上段為和反應產物對應的過渡（transition），下段為和內標準對應的過渡（表3）的層析圖。將和I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的經源內分解的基質對應的波峰分別設為P1s、P2s、P3s、P4s及P6s。將I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的內標準的碎片離子的波峰分別設為P1is、P2is、P3is、P4is及P6is。將I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的反應產物的碎片離子的波峰分別設為P1p、P2p、P3p、P4p及P6p。
對照試樣中，未觀察到反應產物的碎片離子的波峰，但觀察到和II型、IIIB型、IV-A型及VI型的經源內分解的基質分別對應的波峰P2s、波峰P3s、波峰P4s及波峰P6s（圖5）。
於既定濃度的試樣（圖6）及健康者試樣（圖7）中，觀察到I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的反應產物的碎片離子的波峰P1p、波峰P2p、波峰P3p、波峰P4p及波峰P6p。其中，II型、IV-A型及VI型的反應產物的碎片離子的波峰P2p、波峰P4p及波峰P6p以較對應的經源內分解的基質的波峰P2s、波峰P4s及波峰P6s更短的保持時間而溶出。關於五種黏多糖症關聯酵素，藉由液相層析及質譜分析將反應產物分離並進行檢測。
（實施例2）
如以下般改變液相層析的條件，進而以與對反應產物進行質量分離時的條件不同的質量分離的條件來直接檢測黏多糖症I型的基質，除此以外，以與實施例1相同的條件來進行對照試樣（無酵素）的LC/MS/MS。
管柱：Kinetex XB-C18（Phenomenex）（內徑2.1 mm、長度30 mm、粒徑1.7 μm）
梯度程式：
時間（分鐘） 移動相B的濃度（%）
0 30
0.01 30
1.30 100
1.50 100
1.51 30
2.50 停止
圖8為表示實施例2中所得的質量層析圖的圖。分別觀察到和I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的經源內分解的基質對應的波峰P1s、波峰P2s、波峰P3s、波峰P4s及波峰P6s。I型、II型、IIIB型、IV-A型及VI型的內標準的碎片離子的波峰P1is、波峰P2is、波峰P3is、波峰P4is及波峰P6is是與所述基質在時間上分離並檢測到。因此顯示，於將分析時間設為2.50分鐘的條件下，亦可進行利用液相層析的反應產物及基質的分離。
將下述優先權基礎申請案的揭示內容作為引用文獻而併入本文。
日本專利申請案2018年第077555號（2018年4月13日提出申請）
1‧‧‧分析裝置
10‧‧‧液相層析儀
11a、11b‧‧‧移動相容器
12a、12b‧‧‧送液泵
13‧‧‧試樣導入部
14‧‧‧分析管柱
20‧‧‧質譜分析計
21‧‧‧離子化部
22a‧‧‧第一真空室
22b‧‧‧第二真空室
22c‧‧‧第三真空室
23‧‧‧第一質量分離部
24‧‧‧碰撞單元
25‧‧‧第二質量分離部
30‧‧‧檢測部
40‧‧‧資訊處理部
41‧‧‧輸入部
42‧‧‧通信部
43‧‧‧記憶部
44‧‧‧輸出部
50‧‧‧處理部
51‧‧‧裝置控制部
52‧‧‧分析部
53‧‧‧輸出控制部
100‧‧‧測定部
211‧‧‧離子化部/離子源
212‧‧‧管
221‧‧‧離子透鏡
222、240‧‧‧離子導件
241‧‧‧CID氣體導入口
A1～A4、A11～A14‧‧‧箭頭
C‧‧‧濾紙
D‧‧‧可取下部分
DBS‧‧‧乾燥血斑
P‧‧‧反應產物
P1、P2‧‧‧吸管
P1is、P2is、P3is、P4is、P6is‧‧‧反應產物的內標準的碎片離子的波峰
Pp、P1p、P2p、P3p、P4p、P6p‧‧‧反應產物的碎片離子的波峰
Ps、P1s、P2s、P3s、P4s、P6s‧‧‧基質離子經源內分解的離子的碎片離子的波峰
Psb‧‧‧基質離子的碎片離子的波峰
S1001、S1003、S1005、S1007、S1009、S1011、S1013、S1015‧‧‧步驟
Sa‧‧‧分析用試樣
Sb‧‧‧基質
Se‧‧‧溶出試樣
Sp‧‧‧試樣
W‧‧‧分注用容器
圖1為用以說明一實施形態的分析方法的概念圖。
圖2為表示一實施形態的分析裝置的概略結構的概念圖。
圖3（A）為示意性地表示反應產物與基質自液相層析儀大致同時溶出的情形的檢測強度的曲線圖，圖3（B）為示意性地表示反應產物於基質之前自液相層析儀溶出的情形的檢測強度的曲線圖。
圖4為表示一實施形態的分析方法的流程的流程圖。
圖5為對不含溶酶體病關聯酵素的試樣進行分析的情形的層析圖。
圖6為對包含溶酶體病關聯酵素的試樣進行分析的情形的層析圖。
圖7為對包含溶酶體病關聯酵素的試樣進行分析的情形的層析圖。
圖8為對包含溶酶體病關聯酵素的試樣進行分析的情形的層析圖。

Claims (15)

  1. 一種分析方法，包括： 使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質、與所述四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣所含的酵素反應，生成反應產物； 藉由液相層析將所述反應產物分離；及 藉由質譜分析來檢測所分離的所述反應產物，且 所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的分析方法，其中所述酵素為於溶酶體病中於所述患者體內減少或缺損或者未正常工作的五種以上的酵素。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的分析方法，其中所述酵素為於四種以上的黏多糖症的各病型中，於所述患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的分析方法，其中所述酵素包含選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的3種以上的酵素。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的分析方法，其中所述酵素為於五種以上的黏多糖症的各病型中，於患者體內減少或缺損或者未正常工作的五種以上的酵素。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的分析方法，其中所述酵素包含α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的分析方法，其中將包含所生成的所述反應產物與所述基質的溶液導入液相層析儀， 藉由所述液相層析將所述反應產物及所述基質分離。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的分析方法，其中於所述液相層析中，至少一種所述反應產物的保持時間較對應的所述基質的保持時間更短。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的分析方法，其中所述至少一種反應產物包含由選自由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙醯基胺基半乳糖-6-硫酸酯酶及N-乙醯基胺基半乳糖-4-硫酸酯酶所組成的群組中的至少一種酵素所得的反應產物。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的分析方法，其中於所述液相層析中，分離所述反應產物的管柱的長度小於50 mm。
  11. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的分析方法，其中所述液相層析結束時的保持時間短於3分鐘。
  12. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的分析方法，更包括：輸出與所述酵素中於所述試樣的活性低於基準值的酵素、或和所述酵素對應的所述溶酶體病有關的資訊。
  13. 一種分析裝置，包括： 試樣導入部，將分析用試樣導入液相層析儀，所述分析用試樣包含使於溶酶體病中於患者體內減少或缺損或者未正常工作的四種以上的酵素的基質、與所述四種以上的酵素中自生物體獲取的試樣所含的酵素反應而得的反應產物； 液相層析儀，將所導入的所述分析用試樣所含的所述反應產物分離；及 質譜分析部，藉由質譜分析來檢測由所述液相層析儀所分離的所述反應產物，且 所述四種以上的酵素包含艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的分析裝置，其中所述分析用試樣包括所述反應產物及所述基質， 所述液相層析儀將所導入的所述分析用試樣所含的所述反應產物及所述基質分離。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的分析裝置，更包括：輸出部，輸出與所述酵素中於所述試樣的活性低於基準值的酵素、或和所述酵素對應的所述溶酶體病有關的資訊。
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