WO2019198280A1 - 馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法 - Google Patents

馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a separation column for hippuric acid analysis, a liquid chromatograph for hippuric acid analysis, and a method for analyzing hippuric acids.
  • Toluene and xylene are used in large quantities as solvents for paints and adhesives, and cases of poisoning due to work and cases of poisoning due to youth thinner play have been reported.
  • special health examinations are required to measure organic solvent exposure indicators urinary metabolites (toluene is hippuric acid and xylene is methylhippuric acid) based on the Occupational Health Standards Act. These urinary metabolites have been measured by HPLC-UV methods at clinical laboratory companies.
  • reverse phase analysis is carried out using a C18 column as a separation column and a liquid consisting of a phosphate buffer and acetonitrile as a mobile phase.
  • a C18 column as a separation column
  • a liquid consisting of a phosphate buffer and acetonitrile as a mobile phase.
  • it was not possible to separate all the components to be analyzed such as hippuric acid, o-methylhippuric acid, m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid, and mandelic acid.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to enable the separation and analysis of hippuric acids without using a mobile phase containing cyclodextrin.
  • the separation column for hippuric acid analysis is a column in which a silica base material is filled with a filler formed by chemically bonding ⁇ -cyclodextrin at 123 ⁇ mol / g or more.
  • the present inventors use a silica base material in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more as a packing material for the separation column, so that the horse can be used without using a mobile phase containing cyclodextrin. It has been confirmed that uric acid, o-methylhippuric acid, m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid, and mandelic acid can be separated. Therefore, if the separation column according to the present invention is used, hippuric acids can be separated and analyzed without using a mobile phase containing cyclodextrin.
  • the present inventors adjust the ⁇ -cyclodextrin chemically bonded to the silica base material to 272 ⁇ mol / g or less, whereby hippuric acids as analysis target components, that is, hippuric acid, o-methylhippuric acid, It has been confirmed that all of m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid and mandelic acid can be detected by eluting from the separation column within 4 minutes. That is, from the viewpoint of achieving high-speed analysis of hippuric acids, the separation agent of the separation column according to the present invention chemically binds ⁇ -cyclodextrin to a silica substrate at 123 ⁇ mol / g or more and 272 ⁇ mol / g or less. It is preferable that
  • the liquid chromatograph for hippuric acid analysis comprises the above-described separation column, a mobile phase liquid feeding part for feeding a mobile phase to the separation column, and the separation column from the mobile phase liquid feeding part.
  • a sample injection section for injecting a sample into the mobile phase flowing toward the surface, and a detector connected downstream of the separation column and for detecting components in the eluate from the separation column. is there.
  • Separation and analysis of hippuric acids can be performed without using a mobile phase containing cyclodextrin, because a separation column filled with a filler in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more on a silica substrate is used. Can be done.
  • the method for analyzing hippuric acids uses at least two of hippuric acid, o-methylhippuric acid, m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid and mandelic acid using the liquid chromatograph described above. This is to perform chromatographic analysis of a sample containing components.
  • a liquid containing no cyclodextrin or buffer solution as the mobile phase for example, a solution composed of phosphoric acid water or formic acid water and acetonitrile can be used.
  • a solution composed of phosphoric acid water or formic acid water and acetonitrile can be used.
  • a mass spectrometer can be used as a detector.
  • the separation column of the present invention is a silica base material filled with a filler in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more, hippuric acids can be used without using a mobile phase containing cyclodextrin. It becomes possible to perform separation and analysis.
  • the liquid chromatograph of the present invention uses a separation column in which a packing material in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more is packed on a silica substrate, without using a mobile phase containing cyclodextrin, Hippuric acids can be separated and analyzed.
  • a chromatographic analysis is performed using a separation column packed with a filler in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more on a silica substrate. Hippuric acids can be separated and analyzed without using.
  • FIG. 1 is an example of a flow channel configuration of a liquid chromatograph for hippuric acid analysis.
  • the liquid chromatograph of this example includes liquid feed pumps 4 and 6, a mixer 8, a sample injection unit 10, a separation column 12, an ultraviolet absorbance detector (UV) 14, and a mass spectrometer (MS) 16.
  • the liquid feed pump 4 is for feeding phosphoric acid water or formic acid water
  • the liquid feed pump 6 is for feeding acetonitrile.
  • the liquids fed by the liquid feed pumps 4 and 6 are mixed in the mixer 8, and are configured to flow through the analysis flow path 2 connected downstream of the mixer 8.
  • a sample injection unit 10 On the analysis flow path 2, a sample injection unit 10, a separation column 12, a UV 14 and an MS 16 are provided in order from the upstream side.
  • the liquid feeding pumps 4 and 6 constitute a mobile phase liquid feeding unit for feeding the mobile phase to the separation column 12 through the analysis flow path 2.
  • the sample injection unit 10 is for injecting a sample into the mobile phase that is sent to the separation column 12 by the mobile phase liquid supply unit including the liquid feed pumps 4 and 6.
  • the sample injected by the sample injection unit 10 includes at least two components of hippuric acid, o-methylhippuric acid, m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid, and mandelic acid.
  • Separation column 12 is a separation column for hippuric acid analysis in which a silica base material is filled with a filler in which ⁇ -cyclodextrin is chemically bonded to 123 ⁇ mol / g or more.
  • the separation column 12 can separate all components of hippuric acid, o-methylhippuric acid, m-methylhippuric acid, p-methylhippuric acid, and mandelic acid.
  • the UV 14 and the MS 16 are connected downstream of the separation column 12 as detectors for detecting components separated by the separation column 12.
  • a solution that does not contain cyclodextrin or a buffer solution is used as a mobile phase, so that no salt is precipitated in the analysis system. Therefore, analysis using MS16 is possible.
  • MS16 is not an essential component, only UV14 may be provided as a detector.
  • FIG. 2 is a chromatogram showing a verification result on the relationship between the amount of ⁇ -cyclodextrin chemically bound to the silica substrate of the packing column 12 of the liquid chromatograph and the degree of hippuric acid separation.
  • (A) shows the amount of ⁇ -cyclodextrin chemically bonded to the silica substrate at 58 ⁇ mol / g
  • (B) shows 123 ⁇ mol / g ⁇ -cyclodextrin chemically bonded to the silica substrate.
  • (C) shows the amount of ⁇ -cyclodextrin chemically bonded to the silica substrate to 207 ⁇ mol / g
  • (D) shows the amount of ⁇ -cyclodextrin chemically bonded to the silica substrate to 272 ⁇ mol. / G.
  • a separation column having an inner diameter of 3 mm and a length of 100 mm was used.
  • the particle diameter of silica gel of the packing material packed in the separation column is about 2.2 ⁇ m.
  • a liquid in which 0.1% phosphoric acid water and acetonitrile were mixed at a ratio of 9: 1 was used as a mobile phase, the flow rate was 0.8 mL / min, and the temperature of the separation column 12 (setting temperature of the column oven) was 40 ° C. .
  • Each chromatogram (A) to (D) is obtained by measuring the absorbance of light having a wavelength of 230 nm with UV14.
  • the retention of hippuric acids increases as the amount of ⁇ -cyclodextrin chemically bound to the silica substrate increases, but the increase in retention increases the elution of the measurement target component from the separation column 12.
  • the time also becomes longer.
  • the time until all components to be measured are detected is ideally within 5 minutes, more preferably within 4 minutes. According to the verification data of FIG.

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Abstract

馬尿酸類分析用の分離カラム（１２）は、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されている充填剤が充填されたものである。分離カラム（１２）の充填剤として、シリカ基材にβ－シクロデキストリンを１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合させたものを用いることにより、シクロデキストリンを含有する移動相を用いなくても、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸分離の分離が可能である。

Description

馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法
　本発明は、馬尿酸類分析用の分離カラム、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ、及び馬尿酸類の分析方法に関するものである。
　トルエン及びキシレンは塗料や接着剤の溶剤として多量に使用されており、作業による中毒例や青少年のシンナー遊びによる中毒例が報告されている。国内では労働衛生基準法に基づき、有機溶剤業務に従事する作業者に対して有機溶剤の曝露指標の尿中代謝物（トルエンは馬尿酸、キシレンはメチル馬尿酸）を測定する特殊健康診断が義務付けられており、これら尿中代謝物測定は臨床検査会社においてＨＰＬＣ－ＵＶ法による検査が行なわれている。
　世界の臨床検査市場は２０２０年に７０４億USD（７兆２０００億円）に達すること、並びに２０１５年からの年平均成長率が２．４％で推移していくことが株式会社富士経済から報告されている。日米欧３極市場は装置の更新需要が殆どだが、新興国（東欧、ロシア、中国、南米、アフリカ）は検査環境が整備途上であることから、装置の新規導入を含めた検査体制の強化が加速し、今後も臨床検査市場を牽引していくことが予想されている。
　国内には大手臨床検査会社（ＳＲＬ、ＢＭＬ、ＬＳＩメディエンス、ファルコバイオシステムズ、江東微生物研究所、保健科学研究所）などが尿中代謝物分析を請け負っている。これら臨床検査会社は、分析業務の効率化や生産性向上を目的として超高速LCシステムの導入や、新規分析法の採用などを盛んに行なっている。これらの尿中代謝物測定は臨床検査会社においてＨＰＬＣ－ＵＶ法による検査が行われている。
　ＨＰＬＣ－ＵＶ法による検査では、Ｃ１８カラムを分離カラムとして用い、リン酸緩衝液とアセトニトリルからなる液を移動相とする逆相分析が実施されている。しかし、このような逆相分析では、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸といった分析対象成分の全てを分離することができなかった。
　そこで、シクロデキストリンを含有する液を移動相として用いる分析も実施されている。しかし、シクロデキストリンや緩衝液は塩として析出しやすいため、分離カラムや装置のトラブルの原因となり得る上、質量分析計を用いた分析を行なうことができないという問題があった。
　本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく馬尿酸類の分離・分析を可能にすることを目的とするものである。
　本発明に係る馬尿酸類分析用の分離カラムは、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填されたものである。本発明者らは、分離カラムの充填剤として、シリカ基材にβ－シクロデキストリンを１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合させたものを用いることにより、シクロデキストリンを含有する移動相を用いなくても、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸分離の分離が可能であることを確認している。したがって、本発明に係る分離カラムを用いれば、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく馬尿酸類の分離・分析が可能となる。
　また、本発明者らが実施した実験では、シリカ基材へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が多いほど馬尿酸類の分離が向上することが確認されている。一方で、同実験では、シリカ基材へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が多いほど、各成分の分離カラムからの溶出時間が長くなることも確認されている。多数の検体の検査を効率よく行なうためには、１検体の分析に要する時間を短くする必要があり、１検体の分析に要する時間は５分以内、より好ましくは４分以内であることが理想的である。
　本発明者らは、前記シリカ基材に化学結合されているβ－シクロデキストリンを２７２μｍｏｌ／ｇ以下に調整することで、分析対象成分である馬尿酸類、すなわち馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸の全てを４分以内に分離カラムから溶出させて検出できることを確認している。すなわち、馬尿酸類の高速分析を達成するという観点でいえば、本発明に係る分離カラムの分離剤は、シリカ基材にβ－シクロデキストリンを１２３μｍｏｌ／ｇ以上、２７２μｍｏｌ／ｇ以下で化学結合させたものであることが好ましい。
　本発明に係る馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフは、上述の分離カラムと、移動相を前記分離カラムへ送液するための移動相送液部と、前記移動相送液部から前記分離カラムに向かって流れる移動相中に試料を注入する試料注入部と、前記分離カラムの下流に接続され、前記分離カラムからの溶出液中の成分を検出するための検出器と、を備えたものである。シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填された分離カラムを用いるため、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく、馬尿酸類の分離・分析を行なうことができる。
　本発明に係る馬尿酸類の分析方法は、上述の液体クロマトグラフを用いて、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸のうちの少なくとも２つの成分を含む試料のクロマトグラフィー分析を行なうというものである。
　本発明では、移動相としてシクロデキストリンや緩衝液を含まない液、例えば、リン酸水又はギ酸水とアセトニトリルからなるものを用いることができる。これにより、塩の析出に起因したカラムや装置のトラブルの発生を防止することができる。
　また、上記のように移動相としてシクロデキストリンや緩衝液を含まない液を用いることで、質量分析計を検出器として用いることが可能となる。
　本発明の分離カラムは、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填されたものであるので、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく馬尿酸類の分離・分析を行なうことが可能となる。
　本発明の液体クロマトグラフは、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填された分離カラムを用いるため、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく、馬尿酸類の分離・分析を行なうことができる。
　本発明の分析方法は、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填された分離カラムを用いてクロマトグラフィー分析を行なうため、シクロデキストリンを含有する移動相を用いることなく馬尿酸類の分離・分析を行なうことができる。
馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフの一実施例を概略的に示す構成図である。 分離カラム充填剤のシリカ基材へのβ－シクロデキストリンの化学結合量と馬尿酸類の分離度との関係を示すクロマトグラムである。
　以下、本発明に係る馬尿酸類分析用の分離カラム、液体クロマトグラフ及び馬尿酸類の分析方法について、図面を用いて説明する。
　図１は、馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフの流路構成の一例である。
　この実施例の液体クロマトグラフは、送液ポンプ４、６、ミキサ８、試料注入部１０、分離カラム１２、紫外線吸光度検出器（ＵＶ）１４、及び質量分析計（ＭＳ）１６を備えている。送液ポンプ４はリン酸水又はギ酸水を送液するためのものであり、送液ポンプ６はアセトニトリルを送液するためのものである。送液ポンプ４、６により送液される液はミキサ８において混合され、ミキサ８の下流に接続された分析流路２を流れるように構成されている。
　分析流路２上には、上流側から順に、試料注入部１０、分離カラム１２、ＵＶ１４及びＭＳ１６が設けられている。送液ポンプ４、６は分析流路２を通じて分離カラム１２に移動相を送液するための移動相送液部を構成するものである。試料注入部１０は、送液ポンプ４、６からなる移動相送液部により分離カラム１２へ送液される移動相中に試料を注入するためのものである。試料注入部１０により注入される試料は、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸のうちの少なくとも２つの成分を含むものである。
　分離カラム１２は、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填された馬尿酸類分析用の分離カラムである。当該分離カラム１２により、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸のすべての成分を分離することができる。
　分離カラム１２の下流に、ＵＶ１４及びＭＳ１６が、分離カラム１２で分離した成分を検出するための検出器として接続されている。この液体クロマトグラフでは、シクロデキストリンや緩衝液を含有しない液を移動相として使用するため、分析系内での塩の析出が生じない。そのため、ＭＳ１６を用いた分析が可能である。なお、ＭＳ１６は必須の構成要素ではないため、検出器としてＵＶ１４のみが設けられていてもよい。
　図２は、上記液体クロマトグラフの分離カラム１２の充填剤のシリカ基材へのβ－シクロデキストリンの化学結合量と馬尿酸類の分離度との関係についての検証結果を示すクロマトグラムである。同図（Ａ）はシリカ基材に化学結合されたβ－シクロデキストリンの量を５８μｍｏｌ／ｇにした場合、（Ｂ）はシリカ基材に化学結合されたβ－シクロデキストリンの量を１２３μｍｏｌ／ｇにした場合、（Ｃ）はシリカ基材に化学結合されたβ－シクロデキストリンの量を２０７μｍｏｌ／ｇにした場合、（Ｄ）はシリカ基材に化学結合されたβ－シクロデキストリンの量を２７２μｍｏｌ／ｇにした場合である。
　この検証では、内径３ｍｍ、長さ１００ｍｍの分離カラムを用いた。当該分離カラムに充填された充填剤のシリカゲルの粒子径は約２．２μｍである。０．１％リン酸水とアセトニトリルを９：１の割合で混合した液を移動相として用い、流量を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、分離カラム１２の温度（カラムオーブンの設定温度）を４０℃とした。各クロマトグラム（Ａ）～（Ｄ）はＵＶ１４にて２３０ｎｍの波長の光の吸光度を測定して得られたものである。各クロマトグラム（Ａ）～（Ｄ）のピークのうち「＊」はクレアチニン、「１」はｏ－メチル馬尿酸、「２」は馬尿酸、「３」はｍ－メチル馬尿酸、「４」はマンデリン酸、「５」はｐ－メチル馬尿酸である。
　図２を見れば、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が多くなるほど、「１」のｏ－メチル馬尿酸、「２」の馬尿酸、「３」のｍ－メチル馬尿酸、「４」のマンデリン酸、「５」のｐ－メチル馬尿酸の分離が向上していることがわかる。すなわち、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量を多くするほど、馬尿酸類の分離度が向上する。
　また、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が５８μｍｏｌ／ｇのときはピーク１と２、ピーク３と４が結合しており、ｏ－メチル馬尿酸と馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸とマンデリン酸が分離されていない。一方で、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が１２３μｍｏｌ／ｇのときは１～５の５本のピークが現れており、馬尿酸類が分離されている。したがって、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量を１２３μｍｏｌ／ｇ以上に調整することで、移動相中にシクロデキストリンを含有させなくても馬尿酸類の分離・分析を行なうことが可能であることがわかる。
　また、上記のように、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量を多くするほど馬尿酸類の保持力が高まるが、保持力の向上によって測定対象成分が分離カラム１２から溶出するまでの時間も長くなる。高効率に分析を行なうためには、全測定対象成分が検出されるまでの時間は５分以内、より好ましくは４分以内が理想的である。図２の検証データによれば、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が２７２μｍｏｌ／ｇのときに、馬尿酸類のうち分離カラム１２からの溶出が最も遅いｐ－メチル馬尿酸が４分以内に検出されており、シリカ基体へのβ－シクロデキストリンの化学結合量が２７２μｍｏｌ／ｇ以下であれば高速分析を実現できることがわかる。
　なお、図２の検証では、移動相としてリン酸水とアセトニトリルの混合液を用いているが、リン酸水に代えてギ酸水を用いても同様の結果が得られる。
　　　２　　　分析流路
　　　４，６　　　送液ポンプ
　　　８　　　ミキサ
　　　１０　　　試料注入部
　　　１２　　　分離カラム
　　　１４　　　紫外線吸光度検出器（ＵＶ）
　　　１６　　　質量分析計（ＭＳ）

 

Claims (9)

  1. 　シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されてなる充填剤が充填された馬尿酸類分析用の分離カラム。
  2. 　前記シリカ基材に化学結合されているβ－シクロデキストリンは２７２μｍｏｌ／ｇ以下である、請求項１に記載の分離カラム。
  3. 　シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されている充填剤が充填された馬尿酸類分析用の分離カラムと、
    　移動相を前記分離カラムへ送液するための移動相送液部と、
    　前記移動相送液部から前記分離カラムに向かって流れる移動相中に試料を注入する試料注入部と、
    　前記分離カラムの下流に接続され、前記分離カラムからの溶出液中の成分を検出するための検出器と、を備えた馬尿酸類分析用の液体クロマトグラフ。
  4. 　前記分離カラムの前記シリカ基材に化学結合されているβ－シクロデキストリンは２７２μｍｏｌ／ｇ以下である、請求項３に記載の液体クロマトグラフ。
  5. 　前記移動相はリン酸水又はギ酸水とアセトニトリルからなるものである、請求項３に記載の液体クロマトグラフ。
  6. 　前記検出器は質量分析計を含む、請求項５に記載の液体クロマトグラフ。
  7. 　分離カラムとして、シリカ基材にβ－シクロデキストリンが１２３μｍｏｌ／ｇ以上化学結合されている充填剤が充填された馬尿酸類分析用の分離カラムを用い、馬尿酸、ｏ－メチル馬尿酸、ｍ－メチル馬尿酸、ｐ－メチル馬尿酸、マンデル酸のうちの少なくとも２つの成分を含む試料のクロマトグラフィー分析を行なう馬尿酸類の分析方法。
  8. 　前記分離カラムの前記シリカ基材に化学結合されているβ－シクロデキストリンは２７２μｍｏｌ／ｇ以下である、請求項７に記載の分析方法。
  9. 　前記クロマトグラフィー分析において使用する移動相はリン酸水又はギ酸水とアセトニトリルからなるものである、請求項７に記載の分析方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022017547A1 (zh) * 2020-07-21 2022-01-27 宁波大学 一种基于β环糊精的氨基苯磺酸位置异构体的分析试剂和方法
US11709156B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
US12180581B2 (en) 2017-09-18 2024-12-31 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12181452B2 (en) 2017-09-18 2024-12-31 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12352734B2 (en) 2020-09-24 2025-07-08 Waters Technologies Corporation Chromatographic hardware improvements for separation of reactive molecules

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102047881B1 (ko) * 2018-04-12 2019-11-22 고한결 광축키보드
US11626016B2 (en) * 2019-03-15 2023-04-11 Ford Global Technologies, Llc Systems and methods of vehicular operation
CN115999197B (zh) * 2022-12-16 2024-11-22 天津大学 用于邻、间、对二甲苯分离的反相色谱分离方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07113797A (ja) * 1993-10-13 1995-05-02 Kaken Pharmaceut Co Ltd ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤
JPH07225225A (ja) * 1994-02-15 1995-08-22 Showa Denko Kk クロマトグラフィー用吸着担体
JP2010037261A (ja) * 2008-08-05 2010-02-18 Yamada Bee Farm Corp 降圧ペプチド

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4539399A (en) * 1984-07-27 1985-09-03 Advanced Separation Technologies Inc. Bonded phase material for chromatographic separations
DE4006923A1 (de) * 1990-03-06 1991-09-12 Merck Patent Gmbh Trennmaterialien fuer die chromatographie
JP3181711B2 (ja) * 1992-08-31 2001-07-03 信和化工株式会社 カラム用分離剤
JP4030195B2 (ja) * 1998-07-31 2008-01-09 株式会社資生堂 光学分割用カラム充填剤
CN101745371A (zh) * 2008-12-17 2010-06-23 中国科学院大连化学物理研究所 一种环糊精键合固定相的制备方法
CN102343258B (zh) * 2011-08-22 2013-08-14 南京新珞美新型材料有限公司 三唑基键合环糊精-硅胶手性固定相及其制备方法
EP2768666A4 (en) * 2011-10-17 2015-07-15 Univ Temple BETA-CYCLODEXTRIN-COATED SILICONE ACID PARTICLE FOR THE REMOVAL OF POLLUTION EMITTED FROM WASTEWATER
CN104053990B (zh) * 2012-01-24 2015-11-25 株式会社岛津制作所 有机太阳能电池用色素材料的分析方法以及纯化方法
CN103007906A (zh) * 2012-11-19 2013-04-03 江苏易谱恒科技有限公司 一种聚合物包覆硅胶手性色谱固定相及其制备方法
CN104558255A (zh) * 2015-01-30 2015-04-29 北京理工大学 一类含噁唑啉片段的环糊精衍生物及其键合的氢化硅胶固定相的制备及应用
JP2017023963A (ja) * 2015-07-24 2017-02-02 株式会社住化分析センター カラム充填剤、カラムおよび光学異性体の分離方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07113797A (ja) * 1993-10-13 1995-05-02 Kaken Pharmaceut Co Ltd ヘパリン親和性物質の分離、精製用充填剤
JPH07225225A (ja) * 1994-02-15 1995-08-22 Showa Denko Kk クロマトグラフィー用吸着担体
JP2010037261A (ja) * 2008-08-05 2010-02-18 Yamada Bee Farm Corp 降圧ペプチド

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "CYCLOBOND Series HPLC Column Operating Instructions", 1 January 2006 (2006-01-01), pages 1 - 3, XP055642852, Retrieved from the Internet <URL:https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Supelco/Product_Information_Sheet/t706018.pdf> [retrieved on 20190301] *
LI, X. M. ET AL.: "Design of a ruthenium (III) immobilized affinity material based on a beta - cyclodextrin-functionalized poly (glycidyl methacrylate-ethylene dimethacrylate) monolith for the enrichment of hippuric acid", JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE, vol. 40, no. 18, 26 June 2017 (2017-06-26), pages 3696 - 3702, XP055642854, DOI: 10.1002/jssc.201700436 *
MATSUI, HISAO ET AL.: "High-performance liquid chromatographic separation of urinary hippuric and o-, m- and p-methylhippuric acids with a beta- cyclodextrin-bonded column", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 496, 1989, pages 189 - 193, XP026728345, DOI: 10.1016/S0378-4347(00)82565-7 *
SAITO, TAKESHI ET AL.: "Simultaneous detection of hippuric acid and methylhippuric acid in urine by empore disk and gas chromatography-mass spectrometry", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, vol. 30, no. 2, 1 September 2002 (2002-09-01), pages 365 - 370, XP055642853, ISSN: 0731-7085, DOI: 10.1016/S0731-7085(02)00268-6 *
SAKAI, TADASHI ET AL.: "Simultaneous determination of hippuric acid and o-, m-and p-methylhippuric acids in urine by high-performance liquid chromatography", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 276, 1 January 1983 (1983-01-01), pages 182 - 188, XP026727641, DOI: 10.1016/S0378-4347(00)85080-X *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11709156B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12180581B2 (en) 2017-09-18 2024-12-31 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12181452B2 (en) 2017-09-18 2024-12-31 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12416607B2 (en) 2017-09-18 2025-09-16 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US12510520B2 (en) 2017-09-18 2025-12-30 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
WO2022017547A1 (zh) * 2020-07-21 2022-01-27 宁波大学 一种基于β环糊精的氨基苯磺酸位置异构体的分析试剂和方法
US12352734B2 (en) 2020-09-24 2025-07-08 Waters Technologies Corporation Chromatographic hardware improvements for separation of reactive molecules

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