WO2019197438A1 - Dispositif d'electrophorese capillaire automatisee - Google Patents

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WO2019197438A1
WO2019197438A1 PCT/EP2019/059027 EP2019059027W WO2019197438A1 WO 2019197438 A1 WO2019197438 A1 WO 2019197438A1 EP 2019059027 W EP2019059027 W EP 2019059027W WO 2019197438 A1 WO2019197438 A1 WO 2019197438A1
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analysis
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analysis device
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Jean-Bernard Falmagne
Vincent LUYCKX
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Analis
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Definitions

  • Hemoglobin HbA1c comprises glucose linked to the NH2 group of the N-terminal valine of the beta chain of hemoglobin
  • a measure of glycated hemoglobin is following an extraction of red blood cells from the patient's blood, which after hemolysis and separation can quantify the HbA1 c, compared to the normal HbA level. (or HbAO). Too high levels measured, HbA1 c can characterize a predisposition to diabetes.
  • hemoglobin variants usually, the detection of hemoglobin variants and the analysis of the level of these hemoglobins are done by different reference methods, such as immunological tests, affinity chromatography and ion exchange chromatography.
  • the (size of the) window is narrower than the
  • the vacuum circuit also comprises a buffer tank and optionally a flow restrictor disposed between the reservoir and the vacuum pump.
  • FIG. 2 represents a rear view of an exemplary analysis cartridge according to the invention.
  • This cartridge 8 comprises a detection zone integrated with the groove 3 near the outlet end 6 of the analysis capillary 22.
  • This detection zone comprises a light or detection window 29 for measuring the absorbance
  • the rear of the detection zone comprises means 25 for guiding a detection device 27 or 23 or a light source 26 or 21.
  • means for detecting the fluid flowing in the capillary 22 complementary guides 24 are arranged above the groove, to guide either the light source 26 or 21, or the detection means 27 or 23, depending on the direction in which it is decided to carry out the excitation and the detection Absorbance (or fluorescence, depending on the type of detection chosen).
  • the light source preferably comprises an optical fiber 21 for coupling the primary source of light such as the LED 26. at the detection window.
  • a pressure sensor 18 and a controlled leakage 16 to a vent 15 allowing in use to regulate the pressure measured by the pressure sensor 18.

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Abstract

La présente invention concerne une cartouche d'analyse (8) pour électrophorèse capillaire comprenant une plaque de support (7) adapté à être positionné dans un dispositif d'analyse d'électrophorèse capillaire, ladite plaque comprenant une rainure (3) dans laquelle est positionné un capillaire (22) d'électrophorèse transparent, ladite rainure comprenant une fenêtre d'analyse (29) définissant une zone de détection optique, et ladite cartouche (8) comprenant des moyens d'alignement (24, 25) d'une source lumineuse (26, 21) et d'un détecteur de lumière (27, 23) face à la fenêtre d'analyse (29).

Description

DISPOSITIF D’ELECTROPHORESE CAPILLAIRE AUTOMATISEE
Domaine de l'invention
[0001] La présente invention est dans le domaine de la biotechnologie et concerne un dispositif et un procédé d’électrophorèse capillaire automatisée et comportant la mise en oeuvre de moyens aptes à réaliser de manière automatisée les étapes d’une électrophorèse capillaire suivie d’une détection de composés difficiles à différencier, en particulier la mesure de la détection et du taux d’hémoglobines glyquées. Ce dispositif et cette méthode trouvent en particulier des applications dans le diagnostic et la prévention de pathologies médicales.
Arrière-plan technologique et état de la technique à la base de l’invention
[0002] L’électrophorèse capillaire qui est utilisée pour séparer des espèces ioniques selon leur charge et les forces de frictions qui s’exercent sur elles, a déjà été proposée pour séparer différentes hémoglobines et leurs variantes, dans des processus d’analyse d’échantillons biologiques comme du sang.
[0003] En effet, les hémoglobines sont des métallo-protéines comprenant
4 sous-unités constituées de chaînes polypeptidiques conjugées à un hème contenant du fer. Ces protéines peuvent être considérées comme normales (comme l’hémoglobine A (HbA) majoritaire chez l’humain, l’hémoglobine A2 (HbA2) et l’hémoglobine foetale (HbF)) ou comporter plusieurs variantes mineures de l’hémoglobine qui sont des hémoglobines glyquées (également appelées hémoglobines glycosylées ou glycohémoglobines) modifiées par addition d’oses, en particulier de glucose sur des fonctions amines de la globine.
[0004] La glycosylation des protéines est provoquée par la trop forte concentration de sucres dans le sang et altère les fonctions des protéines générant des lésions cellulaires et tissulaires et un vieillissement vasculaire précoce. L’identification et la mesure du taux de certaines hémoglobines offre une information importante sur l’équilibre glycémique d’un patient, car il existe une relation entre les taux de certaines hémoglobines élevées et des complications dégénératives du diabète (Diabètes Mellitus) de type 1 insulino dépendant ou de type 2 non-insulino dépendant. Par conséquent, il existe un besoin de développer une nouvelle méthode et des moyens d’analyse efficaces et rapides, pour une discrimination entre différentes hémoglobines, des hémoglobines normales y compris de l’hémoglobine foetale, des hémoglobines anormales ou hémoglobines glyquées, notamment de l’hémoglobine A2, ainsi que les formes HbC, HbD, HbE, HbS, HbF, HbH, Hb J et HbA (en particulier le taux d’HbAl c par rapport à l’HbA). L’hémoglobine HbA1 c comporte du glucose lié au groupement NH2 de la valine N-terminale de la chaîne beta de l’hémoglobine
[0005] Ainsi, une mesure de l’hémoglobine glyquée, se fait suite à une extraction des globules rouges du sang du patient, qui après hémolyse et séparation permet de quantifier le taux d’HbAl c, par rapport au taux d’HbA normale (ou HbAO). Des taux trop élevés mesurés, en HbA1 c permettent de caractériser une prédisposition au diabète.
[0006] En outre, les hémoglobinopathies sont des maladies génétiques comprenant notamment la drépanocytose et la thalassémie affectant les globules rouges et susceptibles de provoquer une anémie grave, y compris l’anémie falciforme. Cette prédisposition est mesurée par une analyse du taux d’hémoglobines HbS, HbE, HbC ou HbD. Cette mesure peut se faire via un screening anténatal, avant la conception chez les parents ou par screening néonatal, avec mesure de la présence de l’hémoglobine foetale.
[0007] Habituellement, la détection des variantes des hémoglobines et l’analyse du taux de ces hémoglobines se font par différentes méthodes de référence, telles que des tests immunologiques, la chromatographie d’affinité et la chromatographie échangeuse d’ions.
[0008] L’avantage d’une électrophorèse capillaire réside dans le fait que de faibles quantités d’échantillons peuvent être analysées. De plus, une séparation des molécules présentes dans les échantillons par électrophorèse capillaire peut être très rapide dans la mesure où des voltages importants peuvent être utilisés sans provoquer un échauffement de l’échantillon lors de la séparation.
[0009] Cependant, il est également utile que ce type de méthode pour discriminer différents composés, en particulier différentes hémoglobines, présentes dans des échantillons biologiques permette d’obtenir un dosage semi-quantitatif ou quantitatif de ces différents composés, que cette méthode soit automatisée pour l’analyse d’un maximum d’échantillons et que les étapes, les moyens et les réactifs impliqués pour effectuer cette méthode soient de conception simple robuste et peu coûteuse énergiquement, afin de faciliter l’utilisation du procédé et dispositif par l’utilisateur dans les pays émergeants, où la demande d’analyse d’échantillons pour la détection ou le suivi de nouvelles pathologies, telles que le diabète ou les hémoglobinopathies, est particulièrement importante et croissante.
[0010] Le brevet EP126621 1 -B1 décrit et revendique un dispositif d’analyse d’échantillons par électrophorèse capillaire comprenant une multiplicité de capillaires, des moyens de réception agencés pour loger au moins une partie centrale des capillaires et des moyens de régulation propre à coopérer avec les moyens de réception pour assurer une régulation de température des capillaires. Dans ce dispositif, les moyens de réception comprennent une multiplicité de cartouches indépendantes, de façon à pouvoir être remplacées indépendamment les unes des autres, chaque cartouche contenant une unité réalisée en un matériau thermiquement conducteur, électriquement isolé et destiné à enrober étroitement la partie centrale d’un capillaire. Dans ce dispositif, les moyens de régulation sont portés par un capot thermiquement conducteur, situé au-dessus des cartouches et au contact de celles-ci de façon à assurer un échange de calories avec l’ensemble des cartouches par voie solide/solide et ainsi réguler la température des capillaires.
Résumé de l'invention
[0011] Un premier aspect de l’invention concerne une cartouche d’analyse pour électrophorèse capillaire comprenant une plaque de support adapté à être positionné dans un dispositif d’analyse d’électrophorèse capillaire, ladite plaque comprenant une rainure dans laquelle est positionné un capillaire d’électrophorèse transparent, ladite rainure comprenant une fenêtre d’analyse définissant une zone de détection optique, et ladite cartouche comprenant des moyens d’alignement d’une source lumineuse et d’un détecteur de lumière face à la fenêtre d’analyse.
[0012] Avantageusement, la (taille de la) fenêtre est plus étroite que le
(diamètre du) capillaire, de façon à empêcher un éclairage direct du détecteur de lumière.
[0013] De préférence, le capillaire (en particulier la surface extérieure du capillaire) est recouvert d’une couche d’un matériau isolant électrique et conducteur thermique, tel que de la pâte thermique ou un film thermique mince, présentant une conductivité de préférence supérieure à 1W/mK, mesuré selon l’ASTM D5470.
[0014] Un second aspect de l’invention concerne un dispositif d’analyse par électrophorèse capillaire comprenant (au moins) une cartouche selon l’invention, une source lumineuse alignée face à la fenêtre d’analyse et un détecteur de lumière aligné sur la face opposée de ladite cartouche, de façon à pouvoir mesurer en utilisation l’absorbance du fluide contenu dans le capillaire. [0015] Avantageusement, le détecteur est un détecteur bidimensionnel, tel qu’un détecteur de type CMOS, définissant une matrice de point d’analyse. De préférence, ce détecteur est couplé à la fenêtre de détection via une fibre optique.
[0016] La source lumineuse comprend de préférence une LED émettant dans l’UV, de préférence entre 350 et 430 nm, ou dans le bleu, de préférence entre 420 et 460 nm ; ladite LED étant avantageusement couplée à la fenêtre d’analyse, via une fibre optique.
[0017] Le dispositif d’analyse de l’invention comprend aussi avantageusement un circuit sous vide connecté à un réservoir d’électrolyte dans lequel plonge la sortie du capillaire, de façon à faciliter le remplissage dudit capillaire avec un tampon d’analyse provenant d’un second réservoir d’électrolyte dans lequel plonge l’entrée du capillaire.
[0018] Le circuit sous vide comprend préférablement une pompe à vide, un senseur de pression et une fuite commandée permettant en utilisation de réguler la pression, telle que mesurée par le senseur de pression.
[0019] Avantageusement, le circuit sous vide comprend aussi un réservoir tampon et, optionnellement un limiteur de débit disposé entre le réservoir et la pompe à vide.
[0020] Afin de limiter l’augmentation de température résultant de l’effet joule lors de l’analyse, le dispositif de l’invention comprend de préférence des moyens de refroidissement et/ou de régulation de température du capillaire en contact avec la couche de matériau isolant électrique et conducteur thermique.
Brève description des figures
[0021] La figure 1 représente une vue de face d’un exemple de cartouche d’analyse selon l’invention.
[0022] La figure 2 représente une vue arrière d’un exemple de cartouche d’analyse selon l’invention.
[0023] La figure 3 représente une vue d’un exemple de circuit sous vide aidant au remplissage du capillaire.
[0024] La figure 4 représente un agrandissement de la zone de détection du dispositif d’analyse de l’invention.
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
[0025] La figure 1 représente une cartouche 8 considérée comme un consommable, c’est-à-dire une pièce remplaçable, ou un élément jetable, après un certain nombre limité de manipulations et d’utilisations, de préférence après plus de 200 électrophorèses au sein du même capillaire. Cette cartouche 1 est de préférence réalisée en un polymère thermoplastique, tel que l’Acrylonitrile Butadiène Styrène (ABS) qui a l’avantage de pouvoir être moulé et obtenu par injection plastique, tout en étant rigide, léger et résistant aux chocs. Cette cartouche 8 incorpore dans une rainure 3, un capillaire 22 comportant une extrémité d’entrée 1 et une extrémité de sortie 6.
[0026] Cette cartouche 8 comprend une zone de détection intégrée à la rainure 3 à proximité de l’extrémité de sortie 6 du capillaire d’analyse 22. Cette zone de détection comprend une lumière ou fenêtre de détection 29 permettant de mesurer l’absorbance optique du fluide circulant dans le capillaire 22. L’arrière de la zone de détection comprend des moyens de guidage 25 d’un dispositif de détection 27 ou 23 ou d’une source lumineuse 26 ou 21. De la même manière, des moyens de de guidages complémentaires 24 sont disposés au-dessus de la rainure, pour guider soit la source lumineuse 26 ou 21 , soit les moyens de détection 27 ou 23, selon le sens dans lequel il est décidé de procéder à l’excitation et à la détection de l’absorbance (ou de la fluorescence, selon le type de détection choisie).
[0027] Les moyens de guidages situés sur la face avant (la face comprenant la rainure 3) peuvent soit être moulés d’une seule pièce avec la plaque de support 7, auquel cas, ils doivent prévoir une fente ou une lumière permettant de laisser passer le capillaire, soit être assemblés à la plaque 7 après assemblage du capillaire. Une telle pièce de guidage 4 clipsée est par exemple représentée à la figure 1. Une pièce correspondante 5 peut être clipsée à l’arrière de la plaque 7. L’avantage de moyens de guidage assemblés à postériori est de permettre une introduction plus aisée du capillaire 22, lequel est délicat à manipuler.
[0028] L’analyse par électrophorèse capillaire comprend la caractéristique de faire circuler une densité de courant importante dans le capillaire, ce qui a pour effet de chauffer l’électrolyte, ce qui peut modifier les temps d’élution et donc, peut fausser les résultats d’analyse. Par ailleurs, le principe de l’analyse est d’imposer une différence de potentiel importante entre l’entrée et la sorte du capillaire. Il convient donc à la fois de couvrir de préférence le capillaire d’un matériau isolant électrique, mais ce matériau doit aussi être conducteur thermique. On couvre donc avantageusement la rainure 3 d’une couche 2 d’un matériau à la fois isolant électrique et conducteur thermique. On utilisera donc par exemple une pâte thermique telle que celles utilisées en micro- électronique ou un film tel que les films commercialisés sous la dénomination Tgard™ 200 Sériés. [0029] De préférence, la fenêtre d’analyse 29 et la fenêtre 28 dans le moyen de guidage 24 de la face avant, c’est-à-dire les tailles desdites fenêtres sont plus étroites que le capillaire 22, c’est-à-dire que le diamètre externe du capillaire proprement dit, de façon à éviter tout éclairage direct du détecteur par la source lumineuse. Par exemple, pour un capillaire de silice de 365 pm de diamètre externe, la fente dans le dispositif de guidage de la source lumineuse est avantageusement de 75 où 100 pm. Notons que cette ouverture peut être plus large que le diamètre interne du capillaire, la forme cylindrique de celui-ci focalisant naturellement la lumière sur son centre. Par exemple, une fente de 100 pm a montré un bon rapport signal/bruit pour un capillaire ayant un diamètre externe de 365 pm et un diamètre interne de 50 pm. Bien entendu, pour que ce masquage de la source par les bords de la fenêtre soit efficace, il convient d’utiliser un matériau opaque au niveau des bords de cette fenêtre.
[0030] La cartouche de l’invention est destinée à être intégrée (de façon interchangeable) à un dispositif d’analyse par électrophorèse capillaire comprenant une cartouche 8, une source lumineuse alignée face aux fenêtres d’analyse 28,29 et un détecteur de lumière aligné sur la face opposée de la cartouche 8, de façon à pouvoir mesurer en utilisation l’absorbance ou la fluorescence du fluide contenu dans le capillaire. On comprend aisément que le sens face avant/face arrière dans lequel excitation et détection ont lieu présente peu d’importance et est aisément inversible sans modifier fondamentalement le dispositif.
[0031] La source lumineuse peut avantageusement comprendre une source de type LED 26 émettant dans l’UV, par exemple entre environ 350 et environ 430 nm, pour des mesures d’absorbance, ou dans l’UV proche ou le bleu pour des mesures de fluorescence, typiquement d’environ 420 nm à environ 460 nm.
[0032] De façon à faciliter le déplacement de la cartouche 8, par exemple pour passer d’un échantillon à l’autre, la source lumineuse comprend de préférence une fibre optique 21 permettant de coupler la source primaire de lumière telle que la LED 26 à la fenêtre de détection.
[0033] Sur la face opposée à la source est disposé un détecteur permettant de déterminer l’intensité lumineuse ayant traversé le capillaire. Cette intensité permet alors de déterminer soit l’absorbance, soit la fluorescence (soit les deux) du fluide dans le capillaire.
[0034] Le détecteur est de préférence un détecteur bidimensionnel 27 (de type CMOS) définissant une matrice de point d’analyse. Un tel détecteur bidimensionnel présente l’avantage de ne pas devoir être aligné, l’alignement pouvant être fait de façon numérique en sélectionnant uniquement les points de la matrice présentant une intensité supérieure à un seuil prédéterminé.
[0035] Le détecteur bidimensionnel peut avantageusement comprendre différends canaux tel que rouge/vert/bleu (RGB), ce qui permet de discriminer par exemple entre une composante d’absorbance via le canal bleu, une composante de fluorescence via le canal vert et éventuellement la présence de bruit en provenance de l’environnement via le canal rouge.
[0036] Tel que représenté à la figure 3, les réactifs (initiateur de conditionnement, tampon de rinçage, ...) utilisés pour le conditionnement et le rinçage du capillaire, ainsi que les échantillons à tester sont de préférence incorporés dans une barrette 30, comprenant une série de cuvettes ou puits 20. Ces cuvettes 20 sont jointes l’une à l’autre pour former une rangée, et sont initialement recouvertes d’un film polymérique 31 protecteur, scellant les ouvertures de chaque cuvette 20. Ce film protecteur 31 possède une épaisseur et une résistance apte à éviter toute contamination des réactifs, mais suffisamment faibles pour être facilement percé par un poinçon, lors des manipulations au sein de l’appareillage. Ce film 31 ou cette barrette 30 peut également comporter un ou plusieurs codes-barres ou moyen d’identification des échantillons ou réactifs présents dans chaque cuvette 20. Le remplissage de chaque cuvette 20 est effectué avant utilisation au sein d’une installation de production, afin de fournir à l’utilisateur un consommable et limiter toute manipulation par l’utilisateur et éviter ainsi toute erreur de manipulation.
[0037] le Lors de l’utilisation, le dispositif d’analyse dispose de moyens de déplacement des barrettes 30 et/ou de la cartouche, de façon à pouvoir successivement plonger l’extrémité d’entrée du capillaire d’analyse dans les différentes cuvettes selon une séquence prédéfinie (typiquement : tampon initiateur/échantillon/tampon d’analyse/rinçage/initiateur/échantillon,... ). Pour ce faire, par exemple, la cartouche peut être déplacée verticalement, tandis que les barrettes peuvent effectuer un mouvement quelconque dans le plan horizontal lorsque la cartouche est en position haute.
[0038] S’agissant de mesures par électrophorèse capillaire, le dispositif d’analyse comprend aussi une source de haute tension dont l’une des électrode est en contact avec le liquide du flacon 19 dans lequel plonge l’extrémité de sortie 6 du capillaire, et l’autre électrode est en contact avec le liquide dans lequel plonge l’extrémité d’entrée 1 du capillaire.
[0039] L’appareillage comporte également les moyens utiles pour l’introduction des réactifs et des échantillons dans le capillaire, facilitant le déplacement de ces échantillons et de ces réactifs lors des étapes d’initiation et de rinçage. Ces moyens comprennent de préférence un circuit sous vide connecté au réservoir d’électrolyte 19 dans lequel plonge la sortie du capillaire 6. Ce circuit peut aisément être isolé du réservoir 19 par une vanne commandée 17. Par exemple pour isoler le circuit sous-vide lors des phases d’analyse.
[0040] Ce circuit sous vide comprend avantageusement une pompe à vide
9, un senseur de pression 18 et une fuite 16 commandée vers une mise à l’air 15 permettant en utilisation de réguler la pression mesurée par le senseur de pression 18.
[0041] Afin de stabiliser au mieux la sous-pression du circuit, le circuit sous vide comprend un réservoir tampon 14 connecté au circuit via une vanne commandée 13.
[0042] Un limiteur de débit 12 est aussi de préférence disposé entre le réservoir 14 et la pompe à vide 9. Avantageusement, tel que représenté à la figure 3, le circuit sous vide peut soit être directement lié à la pompe à vide via la vanne commandée 1 1 , soit via le limiteur de débit 12, via la vanne commandé 10.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Cartouche d’analyse (8) pour électrophorèse capillaire comprenant une plaque de support (7) adapté à être positionné dans un dispositif d’analyse d’électrophorèse capillaire, ladite plaque comprenant une rainure (3) dans laquelle est positionné un capillaire (22) d’électrophorèse transparent, ladite rainure comprenant une fenêtre d’analyse (29) définissant une zone de détection optique, et ladite cartouche (8) comprenant des moyens d’alignement (4, 24, 25) d’une source lumineuse (26, 21 ) et d’un détecteur de lumière (27, 23) face à la fenêtre d’analyse (29).
2 . La cartouche d’analyse (8) selon la revendication 1 , dans laquelle ladite fenêtre (29) est plus étroite que ledit capillaire (22), de façon à empêcher un éclairage direct du détecteur de lumière (27, 23).
3 . La cartouche d’analyse (8) selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le capillaire (22) est recouvert d’une couche (2) d’un matériau isolant électrique et conducteur thermique (pâte thermique ou film thermique mince, conductivité >1 W/mK, ASTM D5470)
4 . Dispositif d’analyse par électrophorèse capillaire comprenant une cartouche (8) selon l’une quelconque des revendications précédentes 1 à 3, une source lumineuse (26,21 ) alignée face à la fenêtre d’analyse (29) et un détecteur de lumière (27, 23) aligné sur la face opposée de ladite cartouche, de façon à pouvoir mesurer en utilisation l’absorbance ou la fluorescence du fluide contenu dans le capillaire (22).
5 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 4, dans lequel le détecteur (27) est un détecteur bidimensionnel définissant une matrice de point d’analyse.
6 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 5, dans lequel le détecteur (27) est couplé à la fenêtre de détection via une fibre optique (21 ).
7 . Le dispositif d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes 4 à 6, dans lequel la source lumineuse comprend une LED (26) émettant dans l’U ou le bleu.
8 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 7, dans lequel la source lumineuse comprend une LED (26) émettant entre 350 nm et 430 nm.
9 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 8, dans lequel ladite LED (26) est couplée à la fenêtre d’analyse, via une fibre optique (21 ).
10 . Le dispositif d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes 4 à 8, comprenant un circuit sous vide connecté à un réservoir d’électrolyte (19) dans lequel plonge la sortie du capillaire (6), de façon à faciliter le remplissage dudit capillaire (22) avec un tampon d’analyse provenant d’un second réservoir d’électrolyte (20) dans lequel plonge l’entrée du capillaire (1 ).
11 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 10, dans lequel ledit circuit sous vide comprend une pompe à vide (9), un senseur de pression (18) et une fuite (16) commandée permettant en utilisation de réguler la pression mesurée par le senseur de pression (18).
12 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 11 , dans lequel ledit circuit sous vide comprend un réservoir tampon (14).
13 . Le dispositif d’analyse selon la revendication 12, dans lequel un limiteur de débit (12) est disposé entre le réservoir (14) et la pompe à vide (9).
14 . Le dispositif d’analyse selon l’une quelconque des revendications 4 à 12, comprenant une cartouche selon la revendication 3, le dispositif comprenant en outre des moyens de refroidissement et de régulation de température du capillaire (22) en contact avec la couche (2) de matériau isolant électrique et conducteur thermique.
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