WO2019193231A2 - Quimioteca combinatoria dinámica basada en pseudopéptidos y su uso para la detección de cisteína y otros biotioles - Google Patents

Quimioteca combinatoria dinámica basada en pseudopéptidos y su uso para la detección de cisteína y otros biotioles Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a mixture of molecules containing thiol groups that form a dynamic chemical network based on pseudopeptide building units by disulfide bond exchange.
  • Dynamic combinatorial chemistry proposes the creation of a mixture of compounds (dynamic combinatorial chemical libraries, DCL) interconnected through reversible chemical processes.
  • DCL dynamic combinatorial chemical libraries
  • cysteine Small molecules that contain thiols such as cysteine (Cys) play an essential role in cellular function. Therefore, the selective detection of these thiols is of great importance for the clinical diagnosis. However, specific and selective methods for the detection of cysteine are still scarce (D. Zhang, Z. Yang, H. Li, Z. Pe ⁇ , S. Sun, Y. Xu. Chem. Commun., 2016, 52, 749-752).
  • Solá et al. (Chem. Commun., 2014, 50, 4564-4566) described the formation of a specific constitution that arises from the combination of construction units with different topologies (mono, di and tritiols) by disulfide chemistry in a DCL.
  • WO2015 / 097041 discloses a combinatorial chemotherapeutic library based on dynamic peptides capable of carrying out a reversible chemical reaction under physiological conditions. This DCL is useful for the discovery of therapeutically active principles.
  • the present invention describes a dynamic chemical network that mimics the transfer of information and ultimately produces a chemical response, for example a detectable signal. More specifically, the invention describes a dynamic system. capable of detecting an analyte of biological importance, such as cysteine, in its reduced or oxidized forms (cystine) in aqueous medium and in a biological fluid (such as urine) for diagnostic application.
  • an analyte of biological importance such as cysteine
  • cysteine in its reduced or oxidized forms
  • a biological fluid such as urine
  • a first aspect of the present invention relates to a mixture of molecules comprising at least one compound that is defined by formula (I):
  • Ra and Rb are independently selected from H, -CONRR ', -COOR, -NRR', -OH, - C (NH) NH 2 , -CH (OH) CH 3 , aryl (C 6 -C 10 ) or heteroaryl ( C 6 -C 10 );
  • R and R ' are independently selected from H or alkyl (CrC 5 );
  • n is an integer selected from 0, 1, 2, 3 or 4;
  • n is an integer selected from 1 or 2;
  • n ’ is an integer selected from 1 or 2;
  • Re represents an aromatic chromophore
  • Z is selected from H, -NH 2 , -OH or -COOH;
  • p is an integer selected from 0, 1, 2 or 3.
  • the mixture of molecules as described above also comprises at least one compound of formula (IV):
  • Rd is selected from H or -S (CH 2 ) q CH (NH 2 ) COOH;
  • q is an integer selected from 1, 2 or 3.
  • n 1
  • Ra is -CONH 2 .
  • Rb is -CONH 2 .
  • n ’ is 1.
  • m is 1, n is 1 and Ra and Rb are selected from -OH, -COOH, -CONH 2 , NH 2 , 3-indolyl or 4-phenyl.
  • m is 2, n is 1 and Ra and Rb are selected from -COOH or -CONH 2 .
  • m is 3
  • n is 1
  • Ra and Rb are selected from -NHC (NH) NH 2 or NH 2 .
  • n is 4
  • Ra and Rb are NH 2 .
  • n is 1 and Ra and Rb are -CH (OH) CH 3 .
  • Re is selected from the following chromophores:
  • Z is -NH 2 .
  • p is 1.
  • Rd is H.
  • q is 1.
  • aryl refers to a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon groups containing from 6 to 10 carbons in the ring part, such as phenyl, naphthyl (including 1-naphthyl and 2-naphthyl), biphenyl or indenyl.
  • the aryl radicals may be optionally substituted with one or more substituents, such as alkyl, hydroxyl, amines, amide, cyano, halogen (F, Cl, Br and I), etc.
  • heteroaryl refers to a 5 to 10 membered monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon group consisting of carbon atoms and one to three heteroatoms selected from the group consisting of N, O and S , such as benzoimidalozyl, benzothiazolyl, indolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, furanyl or, thiophenyl.
  • Heteroaryl radicals may be optionally substituted with one or more substituents, such as alkyl, hydroxyl, amines, amide, cyano, halogen (F, Cl, Br and I), etc.
  • alkyl refers, in the present invention, to linear or branched saturated hydrocarbon chains that preferably have 1 to 5 carbon atoms, and which are attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl , ethyl, n-propyl, / -propyl, n-butyl, tere-butyl, sec-butyl, n-pentyl, etc.
  • the alkyl groups may be optionally substituted with one or more substituents such as halogen, hydroxyl, alkoxy, carboxyl , carbonyl, cyano, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio.
  • chromophore refers, in the present invention, to a chemical group capable of absorbing or emitting light selectively.
  • Some examples of chromophores can be radicals of a series of alternating single and double bonds, aromatic systems, etc.
  • the chromophores contain polyaromatic systems, formed by two to five aromatic hydrocarbon rings containing from 9 to 22 carbon atoms, and which are attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, naphthyl , anthracenyl, phenanthrenyl, pyrenyl, benzopyrenyl.
  • the radicals of polyaromatic systems may be optionally substituted with one or more substituents, such as alkyl, hydroxyl, amines, amide, cyano, halogen (F, Cl, Br and I), aryl, etc.
  • the compounds of the present invention represented by formulas I, II III and IV may comprise isomers, including optical isomers or enantiomers, depending on the presence of chiral centers. Isomers, enantiomers or diastereomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention. The enantiomers or diastereomers, and mixtures thereof, can be separated by conventional techniques. Another aspect of the invention relates to a dynamic combinatorial library (DCL) comprising the mixture of molecules described above.
  • DCL dynamic combinatorial library
  • dynamic combinatorial library or the term “DCL” is defined herein to refer to a combinatorial library or a mixture that is dynamic in the sense that the molecules of the combinatorial library or mixture can be rearranged with one another by exchanging specific atomic groups or forming dynamic covalent bonds.
  • reorganization can occur when one or more external conditions change, for example such as the change of one or more chemical parameters, such as, for example, the addition of one or more potentially active molecules to the library or mixture, and / or the addition of chemical additives to the library or mixture, or the addition or change of solvent of the library or mixture, and / or one or more physical parameters, such as, for example, temperature, pressure, pH, current electrical, magnetic or electromagnetic radiation, etc.
  • the construction units (BB) I, II and III are mixed at a pH close to neutrality in aqueous medium or any other suitable solvent, such as H 2 0-DMS0.
  • a dynamic chemical library of a mixture of different covalent compounds is formed after exchange of disulfide, that is, homo and / or heterodimers, trimers, or tetramers (DCL1).
  • DCL1 tetramers
  • the dynamic library is reorganized to obtain mainly the most stable compound V, formed by I, II and IV, releasing the fluorophore which is a dimer of III in its oxidized form [lll] 2 ( Scheme 1).
  • the invention relates to a DCL formed by a mixture of compounds of type I, II and III after exchange of disulfide, which forms different dimers, trimers and dynamic tetramers. Accordingly, the invention relates to molecules comprising intramolecular disulfide bonds. The invention also relates to a DCL2 formed by adding compound IV to said mixture of compounds, thereby forming a dynamic library of I, II, III, and IV.
  • the invention also relates to the dynamic exchange between III and IV of the preceding DCL to form a defined heterotrimer formed by I, II and IV and an excited homodimer or excimer [lll] 2 .
  • the heterotrimer formed in DCL2 is that which comprises la, lia and IVa-e and the excimer is [llla-e] 2 .
  • the heterotrimer is Va, which comprises la, lia and IVa and the excimer is [1] 2 (Scheme 2).
  • Another aspect of the invention relates to an in vitro method for the detection of a compound of formula (IV) described above, in a sample, comprising the following steps: a) mixing at least one compound of formula (I ) with at least one compound of formula (II) and at least one compound of formula (III) as described above;
  • step (b) measure the fluorescence emission of the mixture obtained in step (b); d) detect a significant deviation from a pattern and
  • step (d) assign the sample to the group of samples comprising a compound of formula (IV) when a significant difference has been detected in step (d).
  • the fluorescence emission measured in step (c) is due to the formation of the [lll] 2 excimer , which can be read by spectroscopy, preferably fluorescence spectroscopy.
  • the presence of compound IV in the library can be determined by analyzing the ratio between the emission band due to monomer III, in a range between 350 and 425 nm, and the emission band of the excimer, in a range between 450 and 550 nm. More preferably, the ratio is between I l501 / I l38 5.
  • the molecule of formula (IV) is cysteine (IVa or Cys) or its oxidized cystine form (IVb or CySS).
  • the molecule of formula (IV) is in a biological sample. More preferably, the biological sample is urine.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the DCL of the invention for the diagnosis of diseases related to the presence of cysteine or cystine in a biological fluid.
  • the disease is cystinuria or cystinosis. More preferably, the disease is cystinuria.
  • kits for the detection of a compound of formula IV in a sample comprising a mixture of compounds of formulas I, II and III as described above.
  • the kit may comprise other components and reagents necessary to carry out the sample analysis.
  • DCC A / ⁇ / V-dicyclohexylcarbodiimide
  • HOBt 1- hydroxybenzotriazole
  • reaction can be carried out in the presence of a suitable coupling agent, for example 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and HOBt.
  • a suitable coupling agent for example 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and HOBt.
  • a polyamromatic acid (v) or amine (vii) is coupled with the corresponding amine (vi) or acid (viii) with sulfanyl, respectively, using a suitable coupling agent, such as EDC and HOBt in basic conditions.
  • a suitable coupling agent such as EDC and HOBt in basic conditions.
  • the resulting compound 3 can be deprotected under acidic conditions, such as, for example, trifluoroacetic acid.
  • FIG. 1 shows the fluorescence emission spectra of the dynamic library formed by the, lia and Illa (sensor) (25% in DMSO in aqueous bis-tris buffer at pH 6.5) and in increasing concentrations of Cys.
  • [Cys] without L-Cys (dashed line), 0.025 mM, 0.05 mM, 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM.
  • FIG. 2 shows the fluorescence emission spectra of the library formed by the, lia and Illa alone (black line) and in the presence of 0.5 mM Cys (D), 0.25 mM cystine ( ⁇ ), N 0.5 mM acetyl-Cys (o) and 0.5 mM GSH (A).
  • B shows the graph of the excimer / monomer ratio for the different biothiols.
  • C) and (D) show the detection of Cys (0-1, 0 mM) and CySS (0-0.5 mM)) respectively, in the presence of three basic amino acids (Lys, Orn and Arg) for the concentrations of upper non-pathological limit found in the urine.
  • (E) and (F) sample, the same as in (C) and (D), but for pathological concentrations in urine samples (5 mM Lys, 1.4 mM Orn and 1.2 mM Arg).
  • [Cys] or [CySS] without L-Cys (dashed line), 0.05 mM, 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM.
  • (G) shows, the same as in (C) but in a buffer containing (Lys, Orn, Arg, Asn, Gly, Ala, His, Asp, b-Ala, Ser, Tyr and Met).
  • [Cys] without L- Cys (dashed line), 0.05 mM, 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM.
  • FIG. 3 shows the selected normalized urine fluorescence spectra (dashed line), sensor only (solid black line), sensor + urine (o) and after increasing the concentrations of Cys added (0.25, 0.5, 1 mM (gray) to 2.5 M ( ⁇ )).
  • (B) shows the scatter plot of the excimer / monomer emission from the single (white) library, for different urine samples (U) from healthy volunteers and for urine samples plus additional Cys.
  • Stage 1 To a solution of protected amino acid 1 (PG1 is Fmoc and PG2 is Boc or tBu) (7.11 mmol) in anhydrous DMF (15 mL), HOBt (1.25 g, 9.27 mmol) was added and DCC (2.23 g, 10.8 mmol) under a nitrogen atmosphere. The resulting mixture was cooled to 0 ° C and then a solution of m-phenylenediamine (334 mg, 3.09 mmol) in anhydrous DMF (10 mL) was added via a cannula.
  • PG1 is Fmoc and PG2 is Boc or tBu
  • Stage 2 Compounds (i) (0.5 mmol) were dissolved in 4.0 ml of 20% piperidine in anhydrous DMF. The mixture was allowed to react for 4 hours and then diethyl ether was added to the reaction mixture and the product was filtered and washed with diethyl ether to obtain the compounds (ii) that were used without further purification.
  • Step 3 Tritylsulfanilacetic acid (501 mg, 1.50 mmol) was dissolved in anhydrous DMF (20 mL) and EDC HCI (312 mg, 1.63 mmol), HOBt (228 mg, 1.69 mmol) and DIPEA were added (1.6 mL, 4.59 mmol) to the solution.
  • the compounds of formula (II) can be synthesized as previously described in KR West, KD Bake and S. Otto, Org. Lett., 2005, 7, 2615-2618. 2,2, 2 "- (bencenotricarboniltris (azanediyl)) tris (mercaptopropanoic acid-3)
  • the mixture was diluted with DCM, washed with saturated aqueous NaHC0 3 and saturated aqueous NaCl, dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • the crude was purified by column chromatography using AcOEt / hexane / toluene as eluent (from 20/60/20 to 40/40/20) to give 311 mg (51% yield) of 3a as a pink solid Sure.
  • Tritylsulfanilacetic acid 500 mg, 1.50 mmol was dissolved in anhydrous DMF (6 mL) and EDC HCI (383 mg, 2 mmol), HOBt (304 mg, 2.25 mmol) and DI PEA (0.87) were added mi, 5 mmol) to the solution.
  • EDC HCI 383 mg, 2 mmol
  • HOBt 304 mg, 2.25 mmol
  • DI PEA 0.07
  • the mixture was diluted with DCM, washed with saturated aqueous NaHC0 3 and NaCI saturated aqueous, and dried under reduced pressure.
  • the crude was purified by column chromatography using AcOEt / Hexane as eluent (from 30% to 50% AcOEt) to give 287 mg (61% yield) of 3c as a pink solid.
  • N- (5-aminonaphthalen-1-yl) -3-mercaptopropanamide (llld).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • EDT 1,2-ethanedithiol
  • TIS triisobutyl silane
  • the product was purified by reverse phase column chromatography using a mixture of MeCN + 0.07% (v / v) of TFA and H 2 0 + 0.1% (v / v) of TFA as mobile phase (gradient: from 0% to 10% MeCN in H 2 0). After lyophilization, 107 mg (61% yield) of llld 1TFA was obtained as a white solid.
  • the product was purified by reverse phase column chromatography using a mixture of MeCN + 0.07% (v / v) of TFA and H 2 0 + 0.1% (v / v) of TFA as mobile phase (gradient: from 0% to 10% MeCN in H 2 0). After lyophilization, 67 mg (58% yield) of 3e was obtained as a white solid.
  • a 66.7 mM BIS-TRIS methane buffer was prepared by dissolving 1.39 g of the free amine in 100 ml of milli-Q water and adjusting the pH of the solution to 6.5 by adding HCI (aq. ).
  • Individual concentrated stock solutions in DMSO were prepared for the different construction units (BB).
  • Stock solutions of mixtures containing the BBs necessary for the generation of the libraries (I, II and III) were prepared from these individual solutions.
  • the reaction mixtures were then prepared by dilution of the stock solutions ensuring that there was no difference in concentration between reaction mixtures of the same batch.
  • the DCLs used as sensors were prepared in the reaction mixtures at final concentrations of 0.1 mM for the bi and tripodal BBs (I and II) and 0.05 mM for monopodal BB III, in a final 50 mM BISTRIS methane aqueous buffer (pH 6.5) with 25% DMSO.
  • Samples were prepared by adding 15 pl of the stock mixture in DMSO to 45 pl of the 66.7 mM buffered solution, for a final volume of 60 ml.
  • reaction mixtures were analyzed by fluorescence spectroscopy.
  • fluorescence samples were prepared by diluting the reaction mixture to a final volume of 2060 ml with a 50% solution of 100 mM BIS-TRIS aqueous buffer and 50% % of DMSO, to reach a final theoretical concentration of 1.5 mM for III. Mixtures containing a different concentration of III were diluted to reach a final concentration of 1.5 mM. Therefore, for the purpose of measurement, the samples were diluted 1: 34 with H 2 0 / DMSO (1: 1 (v: v)) before data acquisition.
  • the DCL formed by the compounds la, lia and Illa was selected for further studies.
  • the compound Illa has suitable fluorescence spectra of its reduced and oxidized forms ([llla] 2 ).
  • [llla] 2 has an excimer emission band at approximately 500 nm that is not present in the monomer, which is characterized by a low wavelength band with a fine structure (approximately 350-450 nm).
  • a chemical library containing the y lia (0.1 mM each), and Illa (0.05 mM) minimizes the formation of the homodimer [llla] 2 as read by LC-MS and fluorescence spectroscopy, with almost no emission of excimer (Figure 1, dashed line).
  • cysteine (IVa) is added to the reaction medium, the excimer band increases ( Figure 1, gray to black lines) due to the formation of [llla] 2.
  • the emission at 501 nm is detected after the addition of a concentration of Cys as low as 50 mM and the increase in the concentration of Cys (IVa) results in an increase in the fluorescence response ( Figure 2).
  • This can be read by proportional measurement by analyzing the ratio of the emission of the excimer (501 nm) with respect to the monomer (385 nm).
  • the response of the presence of Cys is 1.4 (50 mM) to 3.8 (1 mM) times the target.
  • this method is well suited to these values.
  • cystine behaves similarly to Cys ( Figure 2A, ⁇ and D, respectively).
  • the system of the invention preferably formed by, lia and Illa, gives almost no response to the presence of other biologically relevant cysteine derivatives such as GSH ( Figure 2A, A) or N-acetylcysteine ( Figure 2A, or ), overcoming the possible incidence of false positives.
  • GSH Figure 2A, A
  • N-acetylcysteine Figure 2A, or
  • the dynamic sensor (la, lia and Illa) is capable of detecting IVa and IVb ( Figures 2C and D) in the presence of these basic amino acids for concentrations in the upper limit than expected in the usual urine samples. More importantly, the sensor also provides a clear reading of IVa (Cys) in the presence of pathological concentrations of these basic amino acids ( Figures 2E and 2F).
  • the senor responded very effectively to very low concentrations of both Cys and cystine in an extremely competitive environment that contained most of the amino acids that can be found in the urine (Lys, Orn, Arg, Asn, Gly , Ala, His, Asp, b-Ala, Ser, Tyr, Met) in their physiological concentrations (Figure 2G).
  • Samples were prepared by adding 15 pl of the stock mixture at 45 mI of the 300 mM buffered urine solution (containing 35 ml of urine sample and 10 ml of 300 mM buffered solution), for a final volume of 60 ml . Additions to the system of different concentrations of Cys (IVa) were made.
  • each reaction mixture was analyzed by fluorescence spectroscopy.
  • Fluorescence samples were prepared by diluting the reaction mixture to a final volume of 2060 ml with a solution of 50% BIS-TRIS 100 mM aqueous buffer and 50% DMSO, to reach a final theoretical concentration of 1 , 5 mM for Illa. Therefore, for the purposes of measurement, the samples were diluted 1: 34 with H 2 0 / DMSO 1: 1 (v: v) before data acquisition. Eleven samples from different volunteers were tested, and three additional measures of the combination of two samples were also tested to avoid cross-response (Table 1). Urine fluorescence spectra were measured without the sensor added to confirm that no other metabolite of this fluid interfered with the analysis. The positive response of the sensor to naturally excreted cysteine was also measured.
  • Table 1 Real urine samples selected from healthy volunteers used to test the described detection system.
  • Urine fluorescence spectra were performed without the sensor added to confirm that no other metabolite of this fluid interfered with the analysis (Figure 3A, dashed line).
  • the positive response of the sensor to naturally excreted cysteine in urine samples was also measured (continuous black line with empty circles in Figure 3A and U samples in Figure 3B).
  • the addition of cysteine (IVa) in the sample resulted in an increase in the band at 501 nm, with a detection range from the Cys that normally appears in the urine (U in Figure 3B) at pathological concentrations (U + 1, 0, 2.5 mM, gray). In this way, anomalous concentrations of cysteine could be detected that would not yet produce stones (U + 0.25, 0.5 mM, black).

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Abstract

La presente invención se refiere a una red química dinámica que mimetiza la transferencia de información y produce en última instancia una respuesta química, por ejemplo una señal legible. Más específicamente, la invención desvela un sistema dinámico capaz de detectar selectivamente un analito biológicamente pertinente, tal como cisteína, en su forma reducida o su forma oxidada (cistina) en medios acuosos y en un fluido biológico (tal como orina) para aplicación diagnóstica. Debido a esta propiedad, dicho sistema dinámico es útil para la detección de cisteína o sus derivados en fluidos biológicos tales como orina.

Description

QUIMIOTECA COMBINATORIA DINÁMICA BASADA EN PSEUDOPÉPTIDOS Y SU
USO PARA LA DETECCIÓN DE CISTEÍNA Y OTROS BIOTIOLES
La invención se refiere a una mezcla de moléculas que contienen grupos tiol que forma una red química dinámica basada en unidades de construcción pseudopeptídicas mediante intercambio de enlaces disulfuro.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La química combinatoria dinámica propone la creación de una mezcla de compuestos (quimiotecas combinatorias dinámicas, DCL) interconectados a través de procesos químicos reversibles. Los cambios de distribución de las especies implicadas en una DCL contienen información valiosa acerca de cambios en la estabilidad, con las correspondientes implicaciones en el campo recientemente emergido de la Química de Sistemas.
Las moléculas pequeñas que contienen tioles tales como cisteína (Cys) desempeñan un papel esencial en la función celular. Por lo tanto, la detección selectiva de estos tioles es de gran importancia para el diagnóstico clínico. Sin embargo, los métodos específicos y selectivos para la detección de cisteína aún son escasos (D. Zhang, Z. Yang, H. Li, Z. Peí, S. Sun, Y. Xu. Chem. Commun., 2016, 52, 749-752).
Solá et al. (Chem. Commun., 2014, 50, 4564-4566) describieron la formación de una constitución especifica que surge de la combinación de unidades de construcción con diferentes topologías (mono, di y tritioles) mediante química de disulfuro en una DCL.
El documento WO2015/097041 divulga una quimioteca combinatoria de moléculas basada en péptidos dinámicos capaces de llevar a cabo una reacción química reversible en condiciones fisiológicas. Esta DCL es útil para el descubrimiento de principios terapéuticamente activos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe una red química dinámica que mimetiza la transferencia de información y produce al final una respuesta química, por ejemplo una señal detectable. Más específicamente, la invención describe un sistema dinámico capaz de detectar un analito de importancia biológica, tal como cisteína, en sus formas reducida u oxidada (cistina) en medio acuoso y en un fluido biológico (tal como orina) para aplicación diagnóstica.
De ese modo, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una mezcla de moléculas que comprende al menos un compuesto que se define mediante la fórmula (I):
Figure imgf000003_0001
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, -CONRR’, -COOR, -NRR’, -OH, - C(NH)NH2, -CH(OH)CH3, arilo (C6-C10) o heteroarilo (C6-C10);
R y R’ se seleccionan independientemente entre H o alquilo (CrC5);
m es un número entero seleccionado entre 0, 1 , 2, 3 o 4;
n es un número entero seleccionado entre 1 o 2;
y al menos un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000003_0002
o un isómero o una sal del mismo, donde:
n’ es un número entero seleccionado entre 1 o 2;
y al menos un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000004_0001
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Re representa un cromóforo aromático;
Y se selecciona entre NHCO o CONH;
Z se selecciona entre H, -NH2, -OH o -COOH;
p es un número entero seleccionado entre 0, 1 , 2 o 3.
Preferiblemente, la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente también comprende al menos un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000004_0002
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Rd se selecciona entre H o -S(CH2)qCH(NH2)COOH;
q es un número entero seleccionado entre 1 , 2 o 3.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, m es 1 y n es 1.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, Ra es -CONH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, Rb es -CONH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, n’ es 1.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, m es 1 , n es 1 y Ra y Rb se seleccionan entre -OH, -COOH, -CONH2, NH2, 3-indolilo o 4-fenilo. Preferiblemente, en la mezcla de moléculas que se ha descrito anteriormente, m es 2, n es 1 y Ra y Rb se seleccionan entre -COOH o -CONH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, m es 3, n es 1 y Ra y Rb se seleccionan entre -NHC(NH)NH2 o NH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, m es 4, n es 1 y Ra y Rb son NH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, m es 0, n es 1 y Ra y Rb son -CH(OH)CH3.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, Re se selecciona entre los siguientes cromóforos:
Figure imgf000005_0001
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente,
Y es NHCO.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, Z es -NH2.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, p es 1.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, Rd es H.
Preferiblemente, en la mezcla de moléculas como se ha descrito anteriormente, q es 1.
En la presente invención, el término “arilo” se refiere a un grupos de hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico que contiene de 6 a 10 carbonos en la parte del anillo, tales como fenilo, naftilo (incluyendo 1-naftilo y 2-naftilo), bifenilo o indenilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, hidroxilo, aminas, amida, ciano, halógeno (F, Cl, Br y I), etc.
En la presente invención, el término“heteroarilo” se refiere a un grupo de hidrocarburo aromático monocíclico o bicíclico de 5 a 10 miembros que consiste en átomos de carbono y de uno a tres heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en N, O y S, tal como benzoimidalozilo, benzotiazolilo, indolilo, piridilo, pirimidilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, furanilo o, tiofenilo. Los radicales heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, hidroxilo, aminas, amida, ciano, halógeno (F, Cl, Br y I), etc.
El término "alquilo” se refiere, en la presente invención, a cadenas de hidrocarburo saturado lineales o ramificadas que tienen preferiblemente de 1 a 5 átomos de carbono, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, /-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
El término "cromóforo" se refiere, en la presente invención, a un grupo químico capaz de absorber o emitir luz selectivamente. Algunos ejemplos de cromóforos pueden ser radicales de una serie de enlaces sencillos y dobles alternados, sistemas aromáticos, etc. Preferiblemente, en la presente invención, los cromóforos contienen sistemas poliaromáticos, formados por dos a cinco anillos de hidrocarburo aromático que contienen de 9 a 22 átomos de carbono, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, naftilo, antracenilo, fenantrenilo, pirenilo, benzopirenilo. Los radicales de sistemas poliaromáticos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como alquilo, hidroxilo, aminas, amida, ciano, halógeno (F, Cl, Br y I), arilo, etc.
Los compuestos de la presente invención representados por las fórmulas I, II III y IV pueden comprender isómeros, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereómeros y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención. Los enantiómeros o diastereómeros, y sus mezclas, se pueden separar mediante técnicas convencionales. Otro aspecto de la invención se refiere a una quimioteca combinatoria dinámica (DCL) que comprende la mezcla de moléculas que se ha descrito anteriormente.
La expresión "quimioteca combinatoria dinámica" o el término "DCL" se definen en el presente documento para referirse a una quimioteca combinatoria o una mezcla que es dinámica en el sentido de que las moléculas de la quimioteca combinatoria o mezcla se pueden reorganizar entre sí intercambiando grupos atómicos específicos o formando enlaces covalentes dinámicos. En particular, tal reorganización se puede producir cuando cambian una o más condiciones externas, por ejemplo tal como el cambio de uno o más parámetros químicos, tal como, por ejemplo, la adición de una o más moléculas potencialmente activas a la quimioteca o mezcla, y/o la adición de aditivos químicos a la quimioteca o mezcla, o la adición o el cambio de disolvente de la quimioteca o mezcla, y/o uno o más parámetros físicos, tales como, por ejemplo, temperatura, presión, pH, corriente eléctrica, radiación magnética o electromagnética, etc.
Para la preparación de las DCL, se mezclan los unidades de construcción (BB) I, II y III a un pH próximo a la neutralidad en medio acuoso o cualquier otro disolvente adecuado, tal como H20-DMS0. Se forma una quimioteca dinámica de una mezcla de diferentes compuestos covalentes tras intercambio de disulfuro, es decir, homo y/o heterodímeros, trímeros, o tetrámeros (DCL1). Una vez se añade el compuesto IV al medio, la quimioteca dinámica se reorganiza para obtener principalmente el compuesto más estable V, formado por I, II y IV, liberando el fluoróforo que es un dímero de III en su forma oxidada [lll]2 (Esquema 1).
Figure imgf000008_0001
iii
Esquema 1
De ese modo, la invención se refiere a una DCL formada por una mezcla de compuestos de tipo I, II y III tras intercambio de disulfuro, que forma diferentes dímeros, trímeros y tetrámeros dinámicos. Por consiguiente, la invención se refiere a moléculas que comprenden enlaces disulfuro intramoleculares. La invención también se refiere a una DCL2 formada por adición del compuesto IV a dicha mezcla de compuestos, formando de ese modo una quimioteca dinámica de I, II, III, y IV.
La invención también se refiere al intercambio dinámico entre III y IV de la DCL anterior para formar un heterotrímero definido formado por I, II y IV y un homodímero excitado o excímero [lll]2. Preferiblemente, el heterotrímero formado en la DCL2 es el que comprende la, lia y IVa-e y el excímero es [llla-e]2. Más preferiblemente, el heterotrímero es Va, que comprende la, lia y IVa y el excímero es [llla]2 (Esquema 2).
Figure imgf000009_0001
Esquema 2.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para la detección de un compuesto de fórmula (IV) que se ha descrito anteriormente, en una muestra, que comprende las siguientes etapas: a) mezclar al menos un compuesto de fórmula (I) con al menos un compuesto de fórmula (II) y al menos un compuesto de fórmula (III) como se han descrito anteriormente;
b) poner en contacto la muestra que comprende el compuesto de fórmula (IV) con la mezcla de la etapa (a);
c) medir la emisión de fluorescencia de la mezcla obtenida en la etapa (b); d) detectar una desviación significativa de un patrón y
e) asignar la muestra al grupo de muestras que comprende un compuesto de fórmula (IV) cuando se haya detectado una diferencia significativa en la etapa (d).
Preferiblemente, la emisión de fluorescencia medida en la etapa (c) se debe a la formación del excímero [lll]2, que se puede leer mediante espectroscopia, preferiblemente espectroscopia de fluorescencia.
De ese modo, la presencia del compuesto IV en la quimioteca se puede determinar analizando la proporción entre la banda de emisión debida al monómero III, en un intervalo entre 350 y 425 nm, y la banda de emisión del excímero, en un intervalo entre 450 y 550 nm. Más preferiblemente, la proporción es entre Il501/I l385.
Preferiblemente, en el método, la molécula de fórmula (IV) es cisteína (IVa o Cys) o su forma oxidada cistina (IVb o CySS).
Preferiblemente, en el método, la molécula de fórmula (IV) está en una muestra biológica. Más preferiblemente, la muestra biológica es orina.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de las DCL de la invención para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la presencia de cisteína o cistina en un fluido biológico. Preferiblemente, la enfermedad es cistinuria o cistinosis. Más Preferiblemente, la enfermedad es cistinuria.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de un compuesto de fórmula IV en una muestra, en particular cisteína o cistina, que comprende una mezcla de compuestos de fórmulas I, II y III como se han descrito anteriormente. Además, el kit puede comprender otros componentes y reactivos necesarios para llevar a cabo el análisis de muestras.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por el experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la práctica de la presente invención. En la descripción y las reivindicaciones, no se pretende que la palabra "comprende" y sus variaciones excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes, o etapas. Otros objetos, ventajas y características de la invención serán evidentes para los expertos en la materia tras el examen de la descripción o se pueden aprender poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención.
Los compuestos de fórmulas I, II, III se pueden preparar siguiendo diferentes métodos conocidos por cualquier experto en el campo de la síntesis orgánica, particularmente siguiendo los procesos generales que se muestran en los siguientes esquemas. Los materiales de partida para los métodos preparativos están disponibles comercialmente o se pueden preparar por medio de métodos de la bibliografía. Compuestos de fórmula I:
De acuerdo con el esquema 3, un ácido carboxílico 1 , en el que PG representa grupos protectores, tales como Fmoc para la amina, se hace reaccionar con 1 ,3- diaminobenceno para obtener la diamida (i), usando un agente de acoplamiento tal como, por ejemplo, la combinación de A/^/V-diciciohexilcarbodiimida (DCC) e 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) en un disolvente apropiado tal como /\/,/\/-dimetilformamida. Después de la desprotección del compuesto (i) obtenida en las condiciones básicas apropiadas, tales como piperidina, el compuesto desprotegido (ii) se acila con un ácido con sulfanilo protegido. La reacción se puede llevar a cabo en presencia de un agente de acoplamiento adecuado, por ejemplo 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y HOBt. Finalmente el compuesto resultante (iii) se desprotege para obtener el correspondiente tiol libre (I).
Figure imgf000011_0001
Esquema 3
Compuestos de fórmula (II):
De acuerdo con el esquema 4, II se puede sintetizar como se ha descrito previamente en K. R. West, K. D. Bake y S. Otto, Org. Lett., 2005, 7, 2615-2618.
Figure imgf000012_0001
ü
Esquema 4
Compuestos de fórmula (III):
De acuerdo con el esquema 5, un ácido (v) o una amina (vii) poliaromático se acopla con la amina (vi) o el ácido (viii) con sulfanilo protegido correspondiente, respectivamente, usando un agente de acoplamiento adecuado, tal como EDC y HOBt en condiciones básicas. El compuesto resultante 3 se puede desproteger en condiciones ácidas, tales como, por ejemplo, ácido trifluoroacético. Acopiamiento peptidico
Figure imgf000013_0001
or
Figure imgf000013_0002
Z(PGS)
Figure imgf000013_0003
iii
Esquema 5
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1 : muestra los espectros de emisión de fluorescencia de la quimioteca dinámica formada por la, lia y Illa (sensor) (al 25 % en DMSO en tampón bis-tris acuoso a pH 6,5) y en concentraciones crecientes de Cys. [Cys] = sin L-Cys (línea discontinua), 0,025 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM.
FIG. 2: (A) muestra los espectros de emisión de fluorescencia de la quimioteca formada por la, lia y Illa solo (línea negra) y en presencia de Cys 0,5 mM (D), cistina 0,25 mM (·), N-acetil-Cys 0,5 mM (o) y GSH 0,5 mM (A). (B) muestra el gráfico de la proporción excímero/monómero para los diferentes biotioles. (C) y (D) muestra la detección de Cys (0-1 ,0 mM) y CySS (0-0,5 mM)) respectivamente, en presencia de tres aminoácidos básicos (Lys, Orn y Arg) para las concentraciones de límite superior no patológico que se encuentran en la orina. (E) y (F) muestra, lo mismo que en (C) y (D), pero para concentraciones patológicas en muestras de orina (Lys 5 mM, Orn 1 ,4 mM y Arg 1 ,2 mM). [Cys] o [CySS] = sin L-Cys (línea discontinua), 0,05 mM, 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM. (G) muestra, lo mismo que en (C) pero en un tampón que contiene (Lys, Orn, Arg, Asn, Gly, Ala, His, Asp, b-Ala, Ser, Tyr y Met). [Cys] = sin L- Cys (línea discontinua), 0,05 mM, 0,1 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM.
FIG. 3: (A) muestra los espectros de fluorescencia normalizados de orina seleccionados (línea discontinua), sensor solo (línea negra continua), sensor + orina (o) y después de aumentar las concentraciones de Cys añadida (0,25, 0,5, 1 mM (gris) a 2,5 M (·)). (B) muestra el gráfico de dispersión de la emisión de excímero/monómero de la quimioteca sola (blanco), para diferentes muestras de orina (U) de voluntarios sanos y para las muestras de orina más Cys adicional.
EJEMPLOS
1. SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS DE LA MEZCLA DE MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN
A) Compuestos de fórmula (I)
Etapa 1 : a una solución de aminoácido protegido 1 (PG1 es Fmoc y PG2 es Boc o tBu) (7,11 mmol) en DMF anhidra (15 mi), se añadieron HOBt (1 ,25 g, 9,27 mmol) y DCC (2,23 g, 10,8 mmol) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se enfrió a 0 °C y a continuación se añadió una solución de m- fenilendiamina (334 mg, 3,09 mmol) en DMF anhidra (10 mi) mediante una cánula. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 60 horas, se filtró, y el filtrado se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, se secó sobre MgS04 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/hexano como eluyentes para producir los compuestos (i).
Etapa 2: los compuestos (i) (0,5 mmol) se disolvieron en 4,0 mi de piperidina al 20 % en DMF anhidra. Se dejó que la mezcla reaccionara durante 4 horas y a continuación se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico para obtener los compuestos (ii) que se usaron sin purificación adicional. Etapa 3: se disolvió ácido tritilsulfanilacético (501 mg, 1 ,50 mmol) en DMF anhidra (20 mi) y se añadieron EDC HCI (312 mg, 1 ,63 mmol), HOBt (228 mg, 1 ,69 mmol) y DIPEA (1 ,6 mi, 4,59 mmol) a la solución. La mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió (ii) (0,715 mmol) a la mezcla. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y a continuación se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, y se secó a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/hexano como eluyentes para dar los compuestos (iii). Etapa 4: a una solución de (iii) (0, 16 mmol) en DCM (1 ,0 mi), se añadieron TFA (8,5 mi), TIS (332 pl, 1 ,28 mmol) y EDT (160 mI, 1 ,91 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y H20 + 0, 1 % (v/v) de TFA como fase móvil. Los compuestos (I) se obtuvieron después de liofilización de la fase móvil. (2S,2'S)-N1,N1'-(1 ,3-fenilen)bis(2-(2-mercaptoacetamido)succinamida) (la)
(Asn): RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6): d = 9,97 (s, 2H), 8,34 (d, 2H), 7,93 (t, 1 H), 7,36 (s, 2H), 7,29 (dd, 2H), 7,24-7, 15 (m, 1 H), 6,91 (s, 2H), 4,67 (c, 2H), 3, 17 (d, 4H), 2,73 (t, 2H), 2,62-2,41 (m, 4H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C18H24N606S2 [M + H]+ (m/z): 485, 1277, encontrado: 485, 1279.
(2S,2'S)-N1,N1'-(1 ,3-fenilen)bis(2-(2-mercaptoacetamido)pentanodiamida)
(Ib) (Gln): RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6): d = 10,09 (s, 2H), 8,30 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,96 (t, 1 H), 7,35-7,27 (m, 4H), 7,26-7,20 (m, 1 H), 6,77 (s, 2H), 4,39 (td, 2H), 3,25- 3, 12 (m, 4H), 2,75 (t, 2H), 2,22-2,04 (m, 4H), 1 ,99-1 ,88 (m, 2H), 1 ,88-1 ,76 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C20H28N6O6S2 [M + H]+ (m/z): 513, 1590, encontrado: 513, 1592.
(2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(3-hidroxi-2-(2- mercaptoacetamido)propanamida) (le) Ser: RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 7,92 (t, 1 H), 7,37-7,30 (m, 2H), 7,29-7,23 (m, 1 H), 4,56 (t, 2H), 3,93-3,82 (m, 4H), 3,28 (s,
4H) ppm. HRMS (ESI+) cale para Ci6H22N406S2 [M + H]+ (m/z): 431 , 1059, encontrado: 431 , 1054.
(2S,2’S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(3-hidroxi-2-(2- mercaptoacetamido)butanamida) (Id) (Thr): RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 9,80 (s, 2H), 8, 18 (d, 2H), 7,95-7,89 (m, 1 H), 7,36-7,30 (m, 2H), 7,29-7,23 (m, 1 H), 4,48- 4,42 (m, 2H), 4,24 (cd, 2H), 3,35-3,29 (m, 4H), 1 ,24 (d, 6H) ppm. HRMS (ESI+) cale para Ci8H26N406S2 [M + H]+ (m/z): 459, 1372, encontrado: 459, 1371. (2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(3-(4-hidroxifenil)-2-(2
mercaptoacetamido)propanamida) (le) (Tyr): RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6): d = 10, 1 1 (s, 2H), 9, 17 (s a, 2H), 8,34 (d, 2H), 7,88 (t, 1 H), 7,32-7,25 (m, 2H), 7,25-7, 18 (m, 1 H), 7,06 (d, 4H), 6,64 (d, 4H), 4,58 (td, 2H), 3, 12 (d, 4H), 2,92 (dd, 2H), 2,75 (dd, 2H), 2,63 (t, 2H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C28H30N4O6S2 [M + H]+ (m/z): 583, 1685, encontrado: 583, 1696.
(2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(3-(1 H-indol-3-il)-2-(2- mercaptoacetamido)propanamida) (If) (Trp): RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6): d = 10,82 (d, 2H), 10, 17 (s, 2H), 8,37 (d, 2H), 7,93 (s, 1 H), 7,64 (d, 2H), 7,35-7,27 (m, 4H), 7,24-7, 18 (m, 1 H), 7, 16 (d, 2H), 7,05 (ddd, 2H), 6,97 (ddd, 2H), 4,72 (td, 2H), 3,23- 3, 11 (m, 6H), 3,02 (dd, 2H), 2,65 (t, 2H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C32H32N604S2 [M + H]+ (m/z): 629,2004, encontrado: 629,2003.
(3S,3'S)-4,4'-(1,3-fenilenbis(azanodiil))bis(ácido 3-(2-mercaptoacetamido)-
4-oxobutanoico) (Ig) (Asp): RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 7,85 (t, 1 H), 7,35-7,29 (m, 2H), 7,28-7,22 (m, 1 H), 4,90-4,81 (m, 2H), 3,24 (s, 4H), 2,91 (dd, 2H), 2,78 (dd, 2H) ppm. HRMS (ESI+) cale para CI8H22N408S2 [M + H]+ (m/z): 487,0957, encontrado: 487,0956.
(4S,4'S)-5,5'-(1,3-fenilenbis(azanodiil))bis(ácido 4-(2-mercaptoacetamido)-
5-oxopentanoico) (Ih) Glu: RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 7,90 (t, 1 H), 7,35-7,30 (m, 2H), 7,29-7,23 (m, 1 H), 4,53 (dd, 2H), 3,24 (s, 4H), 2,45 (t, 4H), 2,25-2, 12 (m, 2H), 2,08-1 ,96 (m, 2H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C2oH26N408S2 [M + H]+ (m/z): 515, 1270, encontrado: 515, 1271.
(2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(6-amino-2-(2- mercaptoacetamido)hexanamida) (li) (Lys): RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 8,01— 7,96 (m, 1 H), 7,35-7, 19 (m, 3H), 4,49 (dd, 2H), 3,24 (s, 4H), 2,93 (t, 4H), 2,01-1 ,87 (m, 2H), 1 ,86-1 ,63 (m, 6H), 1 ,62-1 ,39 (m, 4H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C22H36N604S2 [M + H]+ (m/z): 513,2318, encontrado: 513,2319.
(2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(5-amino-2-(2- mercaptoacetamido)pentanamida) (Ij) (Orn): RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 8,02-7,97 (m, 1 H), 7,34-7, 18 (m, 3H), 4,54 (dd, 2H), 3,25 (s, 4H), 3,07-2,90 (m, 4H), 2,05-1 ,89 (m, 2H), 1 ,88-1 ,68 (m, 6H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C2oH32N604S2 [M + H]+ (m/z): 485,2005, encontrado: 485,2007.
(2S,2'S)-N,N'-(1 ,3-fenilen)bis(5-guanidino-2-(2- mercaptoacetamido)pentanamida) (Ik) Arg: RMN 1 H (400 MHz, MeOD-d4): d = 7,99 (s, 1 H), 7,33-7,20 (m, 3H), 4,52 (dd, 2H), 3,29-3, 1 1 (m, 8H), 2,00-1 ,87 (m, 2H), 1 ,86— 1 ,57 (m, 6H) ppm. HRMS (ESI+) cale para C^HMNIOC^SZ [M + H]+ (m/z): 569,2441 , encontrado: 569,2435. B) Compuestos de fórmula (II)
Los compuestos de fórmula (II) se pueden sintetizar como se ha descrito previamente en K. R. West, K. D. Bake y S. Otto, Org. Lett., 2005, 7, 2615-2618. 2,2,,2"-(bencenotricarboniltris(azanodiil))tris(ácido 3-mercaptopropanoico)
(lia) RMN 1 H (500 MHz, DMSO-d6): d 9,04 (d, 1 H), 8,52 (s, 1 H), 4,58 (m, 1 H) 3,03 (m, 1 H), 2,93 (m, 1 H), 2,61 (t, 1 H) ppm. HRMS: cale para 018H21 N30983 [M + H]+ 520,0518, encontrado 520,0526. C) Compuestos de fórmula (III)
Los compuestos de fórmula (III) se pueden sintetizar como sigue a continuación:
-Síntesis del Compuesto Illa
Figure imgf000017_0001
(R)-2-amino-N-(piren-1 -il)-3-(tritiltio)propanamida (3a): se disolvió Boc- Cys(Trt)-OH (2, 134 g, 4,60 mmol) en DMF anhidra (6 mi) y a continuación se añadieron HBTU (2,094 g, 5,52 mmol) y HOBt (0,746 g, 5,52 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min y después se añadió 1-aminopireno (200 mg, 0,92 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte de Ar durante 5 horas (monitorización por TLC). La mezcla se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, se secó sobre MgS04 y se concentró a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/hexano/tolueno como eluyente (de 20/60/20 a 40/40/20) para dar 311 mg (51 % de rendimiento) de 3a en forma de un sólido de color rosa claro.
RMN 1 H (400 MHz, CDCI3-d): d = 8,90 (s, 1 H, NHCOC*H), 8,46 (d, 1 H, CHAr), 8, 19 - 8, 1 1 (m, 3H, CHAr), 8,09 - 7,96 (m, 4H, CHAr)), 8,00 (s, 1 H, CHAr), 7,52 (dd, 6H, CHAr), 7,33 (dd, 6H, CHAr), 7,26 (d, 3H, CHAr), 4,98 (d, 1 H, C*HNHCO), 4,24 - 4, 11 (m, 1 H, C*H), 2,89 (ddd, 2H, 0*HOH2), 1 ,53 (s, 9H, CH3) ppm. HRMS (ESI ) cale para C43H38N2O3S [M -H ] (m/z): 661 ,2575, encontrado: 661 ,2525.
(R)-2-amino-3-mercapto-N-(piren-1-il)propanamida (Illa): a una solución de 3a (280 mg, 0,42 mmol) en DCM (1 ,5 mi), se añadieron 1 mi de ácido trifluoroacético (TFA), 1 ,2-etanoditiol (EDT, 0,64 ml, 7,61 mmol) y triisopropilsilano (TIS, 1 ,30 ml, 6,34 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y
H20 + 0,1 % (v/v) de TFA como fase móvil (gradiente: de un 0 % a un 10 % de MeCN en H20). Después de liofilización, se obtuvieron 75 mg (55 % de rendimiento) de Illa- 1 TFA en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1H (400 MHz, MeOH-d4): d = 8,29 - 8,17 (m, 6H, H5, H6, H8, H10, H12, H13), 8,11 (c, 2H, H2, H3), 8,05 (t, 1 H, Hg), 4,48 (dd, 1 H, C*HCH2), 3,38- 3,24 (dd, 2H,
C*HCH2) ppm. HRMS (ESI+) cale para C19H16N2OS [M + H]+ (m/z): 321 ,1061 , encontrado: 321 ,1041.
- Síntesis del Compuesto lllb
Figure imgf000018_0001
(R)-(1 -((5-aminonaftalen-1 -il)amino)-1 -oxo-3-(tritiltio)propan-2-il)carbamato de tere-butilo (3b). A una solución de Boc-Cys(Trt)-OH (1 g, 2,15 mmol) en DMF anhidra (10 mi) y EDC HCI (0,723 g, 3,77 mmol), se añadieron HOBt (0,597 g, 4,42 mmol) y DI PEA (1 ,32 mi, 9,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min y se añadió a la mezcla 1 ,5-diaminonaftaleno (170 mg, 1 ,08 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte de Ar durante 48 horas, y la formación del producto se siguió por TLC. La mezcla se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, y se secó a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/Hexano como eluyente (de un 30 % a un 50 % AcOEt) para dar 356 mg (55 % de rendimiento) de 3b en forma de un sólido de color rosa oscuro. RMN 1 H (400 MHz, CDCI 3-d): d = 8,51 (s, 1 H, CONH), 7,99 (d, 1 H, CHAr), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 1 H, CHAr), 7,46 (d, 5H), 7,39 (t, 1 H), 7,32 - 7, 19 (m, 12H, CHAr, CONH), 6,80 - 6,73 (m, 2H, CHAr), 4,90 (d, 1 H, C*HCH2), 2,80 (ddd, 2H, CH2STrt), 1 ,46 (s, 9H, CH3) ppm. HRMS (ESI+) cale para C37H37N3O3S [M + H]+ (m/z): 604,2634, encontrado: 604,2637.
(R)-2-amino-N-(5-aminonaftalen-1 -il)-3-mercaptopropanamida (lllb). A una solución de 3b (200 mg, 0, 191 mmol) en DCM (1 mi), se añadieron 1 mi de ácido trifluoroacético (TFA), 1 ,2-etanoditiol (EDT, 0,3 mi, 3,44 mmol) y triisopropilsilano (TIS, 0,6 mi, 2,29 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y H20 + 0, 1 % (v/v) de TFA como fase móvil (gradiente: de un 0 % a un
10 % MeCN en H20). Después de liofilización, se obtuvieron 77 mg (83 % de rendimiento) de lllb 2TFA en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1 H (400 MHz, MeOH-d4): d = 7,92 (d, 2H, CHAr), 7,75 (d, 1 H, CHAr), 7,61 (t, 1 H, CHAr), 7,50 (t, 1 H, CHAr), 7,36 (d, 1 H, CHAr), 4,38 (t, 1 H, C*HCH2), 3,30 - 3, 12 (dd, 2H, CH2SH) ppm. HRMS (ESI+) cale para C13H15N3OS [M + H]+ (m/z): 262, 1014, encontrado: 262, 1001.
-Síntesis del Compuesto lile
Figure imgf000019_0001
N-(5-aminonaftalen-1 -il)-2-(tritiltio)acetamida (3c). Se disolvió ácido tritilsulfanilacético (500 mg, 1 ,50 mmol) en DMF anhidra (6 mi) y se añadieron EDC HCI (383 mg, 2 mmol), HOBt (304 mg, 2,25 mmol) y DI PEA (0,87 mi, 5 mmol) a la solución. La mezcla de reacción se agitó durante 2 min y se añadió a la mezcla 1 ,5- diaminonaftaleno (158 mg, 1 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte de Ar durante 48 horas, y la formación del producto se siguió por TLC. La mezcla se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, y se secó a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/Hexano como eluyente (de un 30 % a un 50 % AcOEt) para dar 287 mg (61 % de rendimiento) de 3c en forma de un sólido de color rosa.
RMN 1 H (400 MHz, CDCI3-d): d = 8,44 (s, 1 H, CH2CONH), 7,83 (d, 1 H, CHAr), 7,61 (d, 1 H, CHAr), 7,48 (d, 6H, CHAr), 7,37 (t, 1 H, CHAr), 7,30-7,23 (m, 7H, CHAr), 7, 18
(t, 3H, CHAr), 7,06 (d, 1 H, CHAr), 6,78 (d, 1 H, CHAr), 3,46 (s, 2H, CH2CONH) ppm. HRMS (ESI+) cale para C31 H26N2OS [M + H]+ (m/z): 475, 1844, encontrado: 475, 1815.
N-(5-aminonaftalen-1 -il)-2-mercaptoacetamida (lile). A una solución de 3c (166 mg, 0,35 mmol) en DCM (1 mi), se añadieron 1 mi de ácido trifluoroacético (TFA),
1 ,2-etanoditiol (EDT, 0,53 mi, 6,30 mmol) y triisopropilsilano (TIS, 1 ,07 mi, 5,24 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y H20 + 0, 1 % (v/v) de TFA como fase móvil (gradiente: de un 0 % a un 8 % MeCN en H20). Después de liofilización, se obtuvieron 60 mg (51 % de rendimiento) de lile- 1TFA en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1 H (400 MHz, MeOH-d4): d = 7,96 (d, 1 H, CHAr), 7,88 (d, 1 H, CHAr), 7,74
(d, 1 H, CHAr), 7,63 (t, 1 H, CHAr), 7,53 (t, 1 H, CHAr), 7,41 (d, 1 H, CHAr), 3,48 (s, 2H, CH2SH) ppm. HRMS (ESI+) cale para C12H12N2OS [M + H]+ (m/z): 233,3035, encontrado: 233,3015. -Síntesis del Compuesto llld
Figure imgf000020_0001
N-(5-aminonaftalen-1 -il)-3-(tritiltio)propanamida (3d). A una solución de ácido 3-(tritilsulfanil)propanoico (500 mg, 1 ,43 mmol) en DMF anhidra (10 mi), se añadieron EDC HCI (383 mg, 2 mmol), HOBt (304 mg, 2,25 mmol) y DIPEA (0,87 mi, 5 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min y se añadió a la mezcla 1 ,5- diaminonaftaleno (158 mg, 1 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte de Ar durante 48 horas, y la formación del producto se siguió por TLC. La mezcla se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, y se secó a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/Hexano como eluyente (de un 30 % a un 50 % AcOEt) para dar 301 mg (62 % de rendimiento) de 3d en forma de un sólido de color rosa oscuro.
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d): d = 9,70 (s, 1 H, CONH), 7,90 (d, 1 H, CHAr), 7,54
(d, 1 H, CHAr), 7,38 - 7,32 (m, 12H, CHAr), 7,30 - 7, 17 (m, 6H, CHAr), 6,69 (dd, 1 H, CHAr), 5,73 (s, 2H, NH2), 2,56 (t, 2H, COCH2CH2), 2,39 (t, 2H, Ch^Ch STrt) ppm. HRMS (ESI+) cale para C32H28N2OS [M + H]+ (m/z): 489,2001 , encontrado: 489,2003.
N-(5-aminonaftalen-1 -il)-3-mercaptopropanamida (llld). A una solución de 3d (240 mg, 0,49 mmol) en DCM (1 mi), se añadieron 1 mi de ácido trifluoroacético (TFA), 1 ,2-etanoditiol (EDT, 0,74 mi, 8,84 mmol) y triisobutilsilano (TIS, 1 ,52 mi, 5,89 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y H20 + 0, 1 % (v/v) de TFA como fase móvil (gradiente: de un 0 % a un 10 % MeCN en H20). Después de liofilización, se obtuvieron 107 mg (61 % de rendimiento) de llld 1TFA en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1 H (400 MHz, MeOH-d4): d = 8,01 (d, 1 H, CHAr), 7,87 (d, 1 H, CHAr), 7,69 (d, 1 H, CHAr), 7,63 (t, 1 H, CHAr), 7,52 (t, 1 H, CHAr), 7,43 (d, 1 H, CHAr), 3,28 (dt, 2H, COCH2CH2), 2,86 (d, 2H, CH2CH2SH) ppm. HRMS (ESI+) cale para C13H14N2OS [M + H]+ (m/z): 233,3035, encontrado: 233,3015.
- Síntesis del Compuesto lile
Figure imgf000021_0001
(R)-2-(8,10-dihidropireno-1 -carboxamido)-3-(tritiltio)propanoato de tere- butilo (3e). A una solución de ácido pirenocarboxílico (250 mg, 1 ,06 mmol) en DMF anhidra (6 mi) se añadieron EDC HCI (681 mg, 3,55 mmol), HOBt (562 mg, 4, 16 mmol) y DIPEA (1 ,25 mi, 9, 13 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 min y a continuación se añadió H-Cys(Trt)-OtBu (468 mg, 1 , 12 mmol). La solución se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera inerte de Ar durante 48 horas, y la formación del producto se siguió por TLC. La mezcla se diluyó con DCM, se lavó con NaHC03 acuoso saturado y NaCI acuoso saturado, y se concentró por destilación a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando AcOEt/Hexano como eluyente (de un 10 % a un 30 % AcOEt) para dar 470 mg (77 % de rendimiento) de 5e en forma de un sólido de color amarillo.
RMN 1 H (400 MHz, CDCI3-d): d = 8,72 (d, 1 H, CONHC*H ), 8,32 - 8,08 (m, 8H,
CHAr), 7,47 (dd, 6H, CHAr), 7,32 - 7, 15 (m, 9H, CHAr), 6,64 (d, 1 H, CHAr), 4,98 (dt, 1 H, C*H), 2,96 - 2,81 (m, 2H, C*HCH2), 1 ,58 (s, 9H, CH3) ppm. HRMS (ESI+) cale para C43H37N03S [M + H]+ (m/z): 647,8330, encontrado: 647,8310. Ácido (R)-2-(8,10-dihidropireno-1 -carboxamido)-3-mercaptopropanoico
(lile). A una solución de 5e (215 mg, 0,33 mmol) en DCM (1 ,5 mi), se añadieron 1 mi de ácido trifluoroacético (TFA), 1 ,2-etanoditiol (EDT, 0,5 mi, 5,97 mmol) y triisobutilsilano (TIS, 1 ,30 mi, 4,98 mmol) rápidamente y con agitación. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se evaporaron parcialmente los disolventes usando un flujo de N2. Se añadió éter dietílico a la mezcla de reacción y el producto se filtró y se lavó con éter dietílico. El producto se purificó por cromatografía en columna de fase reversa usando una mezcla de MeCN + 0,07 % (v/v) de TFA y H20 + 0,1 % (v/v) de TFA como fase móvil (gradiente: de un 0 % a un 10 % MeCN en H20). Después de liofilización, se obtuvieron 67 mg (58 % de rendimiento) de 3e en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1 H (400 MHz, DMSO-d6) d = 13,04 (s, 1 H, OH), 8,99 (d, 1 H, CONH), 8,60 (d, 1 H, CHAr), 8,36 (dd, 3H, CHAr), 8,30 - 8,22 (m, 3H, CHAr), 8, 19 (d, 1 H, CHAr), 8, 13 (t, 1 H, CHAr), 4,71 (td, 1 H, C*H), 3, 14 - 2,89 (m, 2H, CH2SH), 2,70 (s, 1 H, SH) ppm. HRMS (ESI+) cale para C20H15NO3S [M + H]+ (m/z): 350,0851 , encontrado: 350,0839.
2. PROCEDIMIENTO GENERAL PARA LA PREPARACIÓN DE SENSORES DCL Y ANÁLISIS DE FLUORESCENCIA DE LAS DCL a) Procedimiento general para la preparación de DCLs:
Se preparó un tampón BIS-TRIS metano 66,7 mM por disolución de 1 ,39 g de la amina libre en 100 mi de agua mili-Q y ajuste del pH de la solución a 6,5 mediante la adición de HCI (ac.). Se prepararon soluciones stock concentradas individuales en DMSO para los diferentes unidades de construcción (BB). Se prepararon soluciones stock de mezclas que contenían los BB necesarios para la generación de las quimiotecas (I, II y III) a partir de estas soluciones individuales. A continuación se prepararon las mezclas de reacción por dilución de las soluciones stock asegurando que no hubiera ninguna diferencia en la concentración entre las mezclas de reacción del mismo lote.
A menos que se especifique de otro modo, las DCL usadas como sensores se prepararon en las mezclas de reacción a concentraciones finales de 0,1 mM para los BB bi y tripodales (I y II) y 0,05 mM para BB monopodal III, en un tampón acuoso BIS- TRIS metano 50 mM final (pH 6,5) con un 25 % de DMSO.
Las muestras se prepararon por adición de 15 pl de la mezcla stock en DMSO a 45 pl de la solución tamponada 66,7 mM, para un volumen final de 60 mI.
De acuerdo con este procedimiento general, se prepararon los siguientes sensores basados en quimiotecas dinámicas de compuestos por una mezcla de compuestos:
- la, lia, Illa
- la, lia, lllb
- la, lia, lile
- la, lia, I lid
- la, lia, lile b) Procedimiento general para el análisis por fluorescencia de las DCL:
Una vez se completó la oxidación de los tioles libres (medida por HPLC o L- MS), las mezclas de reacción se analizaron por espectroscopia de fluorescencia. Para las DCL realizadas a 0,05 mM de III, las muestras de fluorescencia se prepararon por dilución de la mezcla de reacción hasta un volumen final de 2060 mI con una solución de un 50 % de tampón acuoso BIS-TRIS 100 mM y un 50 % de DMSO, para alcanzar una concentración teórica final de 1 ,5 mM para III. Se diluyeron mezclas que contenían una concentración diferente de III para alcanzar una concentración final de 1 ,5 mM. Por lo tanto, para los fines de la medición, las muestras se diluyeron 1 :34 con H20/DMSO (1 :1 (v:v)) antes de la adquisición de datos. Después de estudiar el efecto del DMSO en el sistema de detección, se descubrió que el uso de una solución tamponada a 50 mM con un 50 % de DMSO para llevar a cabo las mediciones fue óptimo para evitar procesos de precipitación/agregación y la alteración de la señal del excímero.
Después de medir los diferentes espectros de fluorescencia para todas las DCL, se seleccionó la DCL formada por los compuestos la, lia y Illa para estudios posteriores.
3. EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Y LA SELECTIVIDAD DEL MÉTODO DE LA INVENCIÓN
El compuesto Illa presenta espectros de fluorescencia adecuados de sus formas reducida y oxidada ([llla]2). De ese modo, [llla]2 presenta una banda de emisión de excímero a aproximadamente 500 nm que no está presente en el monómero, que se caracteriza por una banda de baja longitud de onda con estructura fina (aproximadamente 350-450 nm). Una quimioteca que contiene la y lia (0,1 mM cada uno), y Illa (0,05 mM) minimiza la formación del homodímero [llla]2 según se lee mediante LC-MS y espectroscopia de fluorescencia, sin casi ninguna emisión de excímero (Figura 1 , línea discontinua). Cuando se añade cisteína (IVa) al medio de reacción, la banda de excímero aumenta (Figura 1 , líneas grises a negras) debido a la formación de [llla]2.
La emisión a 501 nm se detecta después de la adición de una concentración de Cys tan baja como 50 mM y el aumento de la concentración de Cys (IVa) da como resultado un aumento de la respuesta de fluorescencia (Figura 2). Esto se puede leer mediante medida proporcional analizando la relación de la emisión del excímero (501 nm) con respecto al monómero (385 nm). De ese modo, teniendo en cuenta esta proporción, la respuesta de la presencia de Cys es de 1 ,4 (50 mM) a 3,8 (1 mM) veces el blanco. Considerando que la presencia normal de Cys en orina es ~35 mM y la aparición de cistinuria productora de cálculos comienza desde aproximadamente 0,8 mM, este método se adecúa bien de ese modo a estos valores.
Gracias a la naturaleza dinámica del sistema de detección basado en formación e intercambio de disulfuro, la presencia de cistina (CySS o IVb) se comporta de forma similar a Cys (Figura 2A, · y D, respectivamente).
Esta capacidad permite que este sensor dinámico detecte cisteína en sus formas reducida u oxidada en medios acuosos sin la necesidad de una etapa de preparación adicional. SELECTIVIDAD
- Selectividad en presencia de otros tioles tales como GSH o N-acetilcisteína
El sistema de la invención, preferiblemente el formado por la, lia y Illa, no da casi ninguna respuesta a la presencia de otros de derivados de cisteína biológicamente pertinentes tales como GSH (Figura 2A, A) o N-acetilcisteína (Figura 2A, o), superando la posible incidencia de falsos positivos.
La selectividad para IVa y IVb se ilustra en la Figura 2B mediante la representación de la proporción excímero/monómero.
- Reactividad cruzada
Además, también se sometió a ensayo el comportamiento el sistema sensor dinámico en presencia de los aminoácidos que se pueden encontrar típicamente en la orina, a concentraciones normales o patológicas.
Se inició con los aminoácidos básicos (Lys, Orn, Arg), debido a que también muestran valores elevados en pacientes con cistinuria. El sensor dinámico (la, lia y Illa) es capaz de detectar IVa y IVb (Figuras 2C y D) en presencia de estos aminoácidos básicos para concentraciones en el límite superior del esperado en las muestras de orina habituales. De forma más importante, el sensor también proporciona una lectura clara de IVa (Cys) en presencia de concentraciones patológicas de estos aminoácidos básicos (Figuras 2E y 2F).
Esto destaca la robustez del sensor de red, que es capaz de detectar concentraciones muy inferiores de los tioles analitos en presencia de concentraciones elevadas potencialmente competidoras de aminoácidos básicos.
De forma análoga, el sensor respondió de forma muy eficaz a concentraciones muy bajas tanto de Cys como de cistina en un medio extremadamente competitivo que contenía la mayoría de los aminoácidos que se pueden encontrar en la orina (Lys, Orn, Arg, Asn, Gly, Ala, His, Asp, b-Ala, Ser, Tyr, Met) en sus concentraciones fisiológicas (Figura 2G).
4. MEDICIÓN DE LOS NIVELES DE CISTINA EN MUESTRAS DE ORINA
Una vez evaluadas la sensibilidad y la selectividad del método, se sometió a ensayo el sistema de detección dinámico en muestras reales de orina de voluntarios sanos.
Procedimiento general para la preparación de las DCL en orina humana:
Se preparó tampón BIS-TRIS metano 300 mM como se ha explicado anteriormente.
Se prepararon soluciones stock individuales de los unidades de construcción (BB) la, lia y Illa en DMSO. Las DCL se prepararon en las mezclas de reacción a concentraciones finales de 0,1 mM para la y lia y 0,05 mM de Illa en una solución de orina de tampón acuoso BIS-TRIS metano 50 mM final (pH 6,5) con un 25 % de DMSO.
Las muestras se prepararon por adición de 15 pl de la mezcla stock a 45 mI de la solución de orina tamponada 300 mM (que contenía 35 mI de muestra de orina y 10 mI de solución tamponada 300 mM), para un volumen final de 60 mI. Se realizaron adiciones al sistema de diferentes concentraciones de Cys (IVa).
Procedimiento general para el análisis de fluorescencia de las DCL:
Una vez se completó la oxidación de los tioles libres, cada mezcla de reacción se analizó por espectroscopia de fluorescencia.
Las muestras de fluorescencia se prepararon por dilución de la mezcla de reacción hasta un volumen final de 2060 mI con una solución de un 50 % de tampón acuoso BIS-TRIS 100 mM y un 50 % de DMSO, para alcanzar una concentración teórica final de 1 ,5 mM para Illa. Por lo tanto, para los fines de la medición, las muestras se diluyeron 1 :34 con H20/DMSO 1 :1 (v:v) antes de la adquisición de datos. Se sometieron a ensayo once muestras de voluntarios diferentes, y también se sometieron a ensayo tres medidas adicionales de la combinación de dos muestras para evitar respuesta cruzada (Tabla 1). Se midieron los espectros de fluorescencia de la orina sin el sensor añadido para confirmar que no interfiriera ningún otro metabolito de este fluido con el análisis. También se midió la respuesta positiva del sensor a la cisteína excretada de forma natural.
Figure imgf000027_0001
Tabla 1 : muestras de orina reales seleccionadas entre voluntarios sanos usadas para someter a ensayo el sistema de detección descrito.
Se llevaron a cabo los espectros de fluorescencia de la orina sin el sensor añadido para confirmar que no interfiriera ningún otro metabolito de este fluido con el análisis (Figura 3A, línea discontinua). También se midió la respuesta positiva del sensor a la cisteína excretada de forma natural en las muestras de orina (línea negra continua con círculos vacíos de la Figura 3A y muestras U de la Figura 3B). Además, la adición de cisteína (IVa) en la muestra produjo el aumento de la banda a 501 nm, con un intervalo de detección que va desde la Cys que aparece normalmente en la orina (U en la Figura 3B) a concentraciones patológicas (U + 1 ,0, 2,5 mM, gris). De ese modo, se podrían detectar concentraciones anómalas de cisteína que aún no producirían cálculos (U + 0,25, 0,5 mM, negro).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una mezcla de moléculas que comprende al menos un compuesto que se define mediante la fórmula (I):
Figure imgf000028_0001
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, -CONRR’, -COOR, -NRR’, -OH, - C(NH)NH2, -CH(OH)CH3, arilo (C6-C10) o heteroarilo (C6-C10);
R y R’ se seleccionan independientemente entre H o alquilo (CrC5);
m es un número entero seleccionado entre 0, 1 , 2, 3 o 4;
n es un número entero seleccionado entre 1 o 2;
y al menos un compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000028_0002
o un isómero o una sal del mismo, donde:
n’ es un número entero seleccionado entre 1 o 2;
y al menos un compuesto de fórmula (III):
Figure imgf000028_0003
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Re representa un cromóforo aromático;
Y se selecciona entre NHCO o CONH;
Z se selecciona entre H, -NH2, -OH o -COOH;
p es un número entero seleccionado entre 0, 1 , 2 o 3.
2. La mezcla de moléculas de acuerdo con la reivindicación 1 , que también comprende al menos un compuesto de fórmula (IV):
Figure imgf000029_0002
o un isómero o una sal del mismo, donde:
Rd se selecciona entre H o S(CH2)qCH(NH2)COOH;
q es un número entero seleccionado entre 1 , 2 o 3.
3. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde m es 1 y n es 1.
4. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ra es CONH2.
5. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Rb es CONH2.
6. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde n’ es 1.
7. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, donde Re se selecciona entre los siguientes cromóforos:
Figure imgf000029_0001
8. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde Y es -NHCO.
9. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde Z es -NH2.
10. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde p es 1.
11. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde Rd es H.
12. La mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde q es 1.
13. Una quimioteca combinatoria dinámica que comprende la mezcla de moléculas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un método in vitro para la detección de un compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 2 en una muestra que comprende las siguientes etapas: a) mezclar al menos un compuesto de fórmula (I) con al menos un compuesto de fórmula (II) y al menos un compuesto de fórmula (III) de acuerdo con la reivindicación 1 ;
b) poner en contacto la muestra que comprende el compuesto de fórmula (IV) con la mezcla de la etapa (a);
c) medir la emisión de fluorescencia de la mezcla obtenida en la etapa (b); d) detectar una desviación significativa de un patrón y
e) asignar la muestra al grupo de muestras que comprende un compuesto de fórmula (IV) cuando se haya detectado una diferencia significativa en la etapa
(d).
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la molécula de fórmula (IV) se selecciona entre cisteína o cistina.
16. Un kit para la detección de un compuesto de fórmula (IV) de acuerdo con la reivindicación 2 en una muestra, que comprende una mezcla de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) que se describen en la reivindicación 1.
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