WO2019182466A1 - Метод специфического выявления вируса гриппа человека - Google Patents

Метод специфического выявления вируса гриппа человека Download PDF

Info

Publication number
WO2019182466A1
WO2019182466A1 PCT/RU2018/000174 RU2018000174W WO2019182466A1 WO 2019182466 A1 WO2019182466 A1 WO 2019182466A1 RU 2018000174 W RU2018000174 W RU 2018000174W WO 2019182466 A1 WO2019182466 A1 WO 2019182466A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza virus
sln
derivative
influenza
reagent
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000174
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Николай Владимирович БОВИН
Елена Юрьевна КОРЧАГИНА
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр"
Priority to PCT/RU2018/000174 priority Critical patent/WO2019182466A1/ru
Publication of WO2019182466A1 publication Critical patent/WO2019182466A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely to virology, and can be used to quickly detect influenza virus in a sample directly at the treatment site.
  • the gold standard for influenza virus analysis is based on the amplification of nucleic acids, but this method is not fast and affordable. At the same time, it is extremely important to detect the flu within minutes or hours, and not days, since only early detection can make it possible to start treatment with antiviral drugs and avoid further spread of the virus.
  • BAOH a large number of BAOH have been developed, not all of them are commercially available. Most methods are based on the determination of the nucleocapsid protein of the influenza virus using monoclonal antibodies for 30 or more minutes. Moreover, most commercially available BAOHs have low sensitivity, and the accuracy of the analysis is highly dependent on the virus subtype. Among the commercial BAGs used, two methods can be distinguished that demonstrate higher sensitivity (SOFIA from QUIDEL, and Veritor from Becton Dickinson htp: //icm.asni.Org/content/53/4/l 345.full), but they are very expensive and require special laboratory equipment, which significantly limits their use.
  • Ct values are an indicator of the amount of virus in a sample, where lower values indicate higher virus titer values (i.e., more viral material in the sample). Sensitivity was determined as a percentage for commercial assay methods relative to RT-qPCR. Commercial BAOHs achieved a sensitivity of RT-qPCR with a Ct limit of less than 25, but most infected patients could only be detected by PCR with Ct greater than 30. This means that BAOHs with registration have missed more than 50% of infected patients when the viral load was only 400 genomic copies per sample, which indicates that the sensitivity of existing BAOH is significantly lower in situations with a low virus content in the sample.
  • the objective of the present invention is to develop a new method for detecting influenza virus in a sample having high sensitivity and specificity, and which can be used as a BAOH (Rapid Analysis for the Detection of Influenza) method.
  • a fundamentally new approach to the analysis of influenza viruses in a sample was developed, based on measuring the transfer of resonance fluorescence energy (FRET) generated by two fluorescent components, one of which is covalently linked to a reagent that recognizes influenza hemagglutinin, and the second to a reagent recognizing neuraminidase of influenza virus.
  • FRET resonance fluorescence energy
  • the proposed method is the first of its kind, based on the fact that hemagglutinin and neuraminidase proteins, which are unique for the influenza virus, are not only present on the surface of the virus, but alternate at a short distance from each other, almost close to each other, and the distance between them is close to constant.
  • the problem is solved by developing a method for detecting (detecting) the influenza virus in a sample by measuring the FRET signal generated by two fluorescent components, one of which is covalently linked to a reagent capable of recognizing (specifically binding) influenza hemagglutinin, and the second with a reagent capable of recognizing (specifically binding to) an influenza virus neuraminidase.
  • one of the fluorescent components is an organic fluorescent dye, and the other is a quantum dot.
  • the hemagglutinin recognizing agent is a 6’SLN trisaccharide derivative.
  • the 6'SLN trisaccharide derivative is polyvalent. In some embodiments, the 6'SLN trisaccharide derivative is a Neu5Ac ⁇ x2-6Galpi-4GlcNAca-0 (CH 2 ) 3 NH- moiety attached to a water-soluble polyacrylamide.
  • the neuraminidase recognizing reagent is a zanamivir derivative.
  • the zanamivir derivative is polyvalent.
  • the zanamivir derivative is Z 20 -PAA-Cy3 1 .
  • an influenza virus refers to any subtype of human influenza viruses.
  • the problem is also solved by developing a kit for the detection of influenza virus by the proposed method, including:
  • the fluorescent components (a) and (b) are selected in such a way that when bound to the corresponding structures on the surface of the influenza virus, they form FRET-napy.
  • one of the fluorescent components is an organic fluorescent dye, and the second is a quantum dot.
  • the 6’SLN trisaccharide derivative is polyvalent.
  • the neuraminidase recognizing reagent is a zanamivir derivative.
  • the zanamivir derivative is polyvalent.
  • the problem is also solved by applying the proposed kit or method for detecting influenza virus in an animal, human and / or environmental sample.
  • the sample of the animal and / or human is a swab, blood, saliva, nasopharyngeal swabs and aspirates, swabs from the nasopharynx and throat, samples taken from the respiratory tract of patients.
  • the proposed method has a high sensitivity, which is maintained even with a low virus content in the sample, since a small number of viruses may be sufficient to generate and register the FRET signal;
  • the proposed method has high specificity, since the generation of the FRET signal is possible only in the presence of influenza viruses in the sample;
  • the detection method does not require washing / separation stages; the manipulation time is negligible, which in general allows you to quickly get the results of the analysis;
  • the method does not require sophisticated equipment - just test tubes and two fluorescent reagents are enough; measurement of a fluorescent signal is possible using a handheld imaging device, which allows analysis directly at the treatment site.
  • the proposed approach is quick (about a minute), simple, not requiring trained personnel.
  • the proposed diagnostic method is a potential tool to prevent the spread of the virus in the face of the next pandemic. This will save lives and reduce the burden on health by reducing a significant number of hospitalizations.
  • FRET Forster resonance energy transfer (fluorescence resonance energy transfer) - Förster (fluorescence) resonant energy transfer, dipole-dipole energy transfer - the energy transfer mechanism between two chromophores (from donor to acceptor), which occurs without intermediate emission of photons and is the result of a dipole-dipole interaction between a donor and an acceptor.
  • chromophores according to the invention can be a nanocrystal (the so-called quantum dot) as an emitter and an organic dye as a "receiver” of radiation, but not limited to.
  • influenza virus an RNA-containing virus of the orthomyxovirus family that infects humans, certain animal species (horses, pigs, etc.).
  • the present invention refers to any influenza viruses, regardless of their type (i.e., any of types A or B), as well as a subtype (i.e., for example, any of the antigenic subtypes of influenza virus for hemagglutinin (H1-NC) and by neuraminidase (N1-N3)).
  • reagent recognizing hemagglutinin (HA) of influenza virus (“reagent capable of specifically binding to influenza hemagglutinin”) is meant such small (non-protein) molecules that are capable of specifically binding to influenza virus hemagglutinin, regardless of its antigenic specificity. For example, such as trisaccharide 6’SLN or its derivatives, retaining the ability to specifically bind to hemagglutinin, as well as their mimetics.
  • 6 SLN trisaccharide
  • 6'-sialyl- (-acetylactosamine) (6'-Sialyl-N-acetyllactosamine).
  • reagent recognizing neuraminidase (NA) of the influenza virus (“reagent capable of specifically binding to influenza virus neuraminidase”) is meant such small (non-protein) molecules that are capable of specifically binding to influenza virus neuraminidase, regardless of its antigenic specificity.
  • neuraminidase inhibitors zanamivir, oseltamivir, etc.
  • suicidal substrates such as neuraminidase inhibitors (zanamivir, oseltamivir, etc.) or their derivatives, which retain the ability to specifically bind to neuraminidase, as well as the so-called suicidal substrates.
  • the figure 1 shows a schematic representation of a fundamental approach to the analysis method according to the invention, shows the correspondence between the architecture of the surface of the virus and the requirements for effective FRET: (1) a viral particle diagram containing HA and NA;
  • Double arrows show resonant energy transfer (FRET).
  • the figure 2 shows the results of the agglutination test for conjugate K-7.
  • the figure 3 shows the results of the change in fluorescence of the FRET pair K-7 - Z 20 -PAA-Cy3 1 in the presence of the human influenza virus H1N1 (Marburg):
  • the basic principle of the invention is the specific recognition of two components of the viral membrane — hemagglutinin (HA), which is able to bind the carbohydrate receptor of the influenza virus, and neuraminidase (NA), which can hydrolyze sialooligosaccharides; the presence of these two activities is unique to the human influenza virus, that is, it is not characteristic of other viruses.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • FRET Fluorescence Reduction
  • HA and NA alternate at a short distance from each other, that is, they are located almost close [1].
  • FRET is a distance-dependent interaction between two excited states of two dye molecules (chromophores), in which the excitation is transferred from the donor molecule to the acceptor molecule.
  • the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the distance, which makes it applicable only at distances comparable to the sizes of biological macromolecules [4].
  • FRET works in the case when both HA and NA simultaneously bind to a fluorescence donor and acceptor.
  • the short distance of the FRET action is a positive factor, since it minimizes the non-specific signal - when the distance between the dyes is large, for example, a solution of two samples (even a high concentration) does not give a signal. It is known that the HA + NA combination (although sial-binding proteins and sialidases are often found frequently) is unique to influenza viruses, therefore, the analysis is highly specific.
  • the main conditions for FRET are:
  • synthetic substances are used that specifically bind to the HA and NA proteins and are able to form a FRET pair; since HA and NA are located adjacent to the surface of the viral particle, the fluorescent label in the first reagent excites the fluorescent signal to the fluorescent label of the second reagent, which emits a signal with a different wavelength. In the absence of the virus, these reagents are in solution far from each other, and therefore are unable to form an FRET signal.
  • the figure 1 shows a diagram of the viral envelope of the influenza virus with the molecules of HA and NA (1), as well as fluorescently-labeled molecules that bind to them ((2) and (3) - see above).
  • the combination of HA + NA is specific (unique) for influenza viruses.
  • HA and NA alternate, and the distance between them is close to constant.
  • HA and NA on a viral particle occupy ⁇ 50% of the total area.
  • fluorescently labeled molecules that bind to HA and NA are located close to each other, provided that several copies of such molecules are attached to the viral particle. Thanks to the proximity two types of fluorescent residues are realized by FRET.
  • One viral particle contains on its surface about 400 HA molecules and about 100 NA molecules, the distance between their centers is approximately 10 nm. Hemagglutinin is a homotrimer, ligand-binding sites are located close to their periphery. A similar picture holds for tetrameric NA. This means that the binding sites of neighboring HA and NA molecules are much closer to each other than 10 nm, namely, at a distance of 1.5 - 2.0 nm. This must be considered when constructing FRET-nap ligands for analysis. It should be noted that fluorescent labels, even quantum dots (QD, one of the types of labels in this invention) have a size of about 2 nm.
  • QD quantum dots
  • the calculations showed that even when using quantum dots, the distance between the fluorescent dye (first sample) and QD (second sample of the FRET pair) will be about 3 nm, i.e. will correspond to the distance required for the manifestation of the FRET effect (1 - 10 nm). It should also be noted that when a virus particle captures two or a limited number of fluorescent residues, the probability of the formation of a fluorescent pair is close to zero; for a guaranteed FRET effect, a viral particle must capture dozens of donors and acceptors. For this purpose, fluorescent donors and acceptors are added to a sample containing a virus in large excess (so that several dozen of each type of molecule binds, which is easy to implement).
  • the optimization of the spacers, the correct choice of the nature of the donor / acceptor pair, and the analysis conditions are the most important points.
  • they are made polyvalent (multivalent) in the part that specifically binds to the HA and NA molecules of the influenza virus, and in order to increase the likelihood of the donor and acceptor and increase the signal intensity, in some embodiments of the invention several units of the dye are introduced into the fluorescently-labeled molecules.
  • fluorescently-labeled molecules can be used a 6'SLN trisaccharide derivative as a hemagglutinin recognizing reagent and zanamivir derivative as a neuraminidase recognizing reagent.
  • any molecules capable of forming an FRET pair can be used as fluorescent components covalently bound to the above reagents.
  • it can be, for example, an organic fluorescent dye and a quantum dot.
  • zanamivir Z
  • 6'SLN trisaccharide b'-Sialyl-N-acetyllactosamine, 6-sialyl- (K-acetylactosamine
  • quantum dots which also made it possible to obtain multivalent derivatives.
  • the trisaccharide can be immobilized on quantum dots with different methods (for this, quantum dots with different functional groups were used), this makes it possible to obtain derivatives with maximum immobilization of the trisaccharide and suitable stability, as well as vary the distance from the trisaccharide to the quantum core howling point (QD), which (as discussed above) could be important for the manifestation of FRET effect.
  • QD quantum core howling point
  • Z 20 -PAA-Cy3 1 is a statistical copolymer representing a substituted polyacryamide (PAA), the mole fractions of monomers A, B and C are equal, respectively 0.2, 0.01 and 0.79 and the number average molecular weight of which is determined by the number of monomers (150-250).
  • PAA substituted polyacryamide
  • QDs Semiconductor nanocrystals (QD) of the composition (CdSe) ZnS with a maximum fluorescence of 550 nm and core-shell structures (QDs) were synthesized according to the protocol [5].
  • the method includes 1) the synthesis of a colloidal hydrophobic CdSe core and 2) the growth of the ZnS epitaxial membrane around the CdSe core.
  • the resulting QDs ( ⁇ 3 mg) were purified from an excess of TORO (trioctylphosphine oxide) by triple dispersion in chloroform (600 ⁇ l) and precipitation in methanol (600 ⁇ l) followed by centrifugation (12,000 rpm / min, 8 min).
  • TORO trioctylphosphine oxide
  • the purified QDs were dispersed in 500 ⁇ l of chloroform, 500 ⁇ l of an aqueous solution of cysteamine hydrochloride (40 mg / ml) was added, vortexed vigorously for 5 min, and the mixture was subjected to ultrasonic treatment several times. Thereafter, the stained supernatant containing cysteamine solubilized QDs (QDS-NH 2 ) was selected, centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes to remove unmodified QDs, then purified from excess unreacted cysteamine by dialysis (Slide-A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) versus Milli-Q water. The concentration of the obtained QDs-NH 2 was determined spectrophotometrically.
  • Scheme 6 Synthesis of 6'SLN 20- PAA-Cystician2 6.
  • QD Semiconductor nanocrystals
  • CdSe composition
  • ZnS core-shell structures
  • the method includes 1) the synthesis of a colloidal hydrophobic CdSe core and 2) the growth of the ZnS epitaxial membrane around the CdSe core.
  • the obtained QDs ( ⁇ 3 mg) were purified from an excess of TORO (triethylphosphine oxide) by triple dispersion in chloroform (600 ⁇ l) and precipitation in methanol (600 ⁇ l) followed by centrifugation (12,000 rpm, 8 min).
  • the purified QDs were dispersed in 500 ⁇ l of chloroform, 500 ⁇ l of aqueous was added a solution of cysteamine hydrochloride (40 mg / ml) was intensively mixed on Vortex for 5 min, and the mixture was subjected to ultrasonic treatment several times.
  • the stained supernatant containing cysteamine solubilized QDs (QDS-NH 2 ) was selected, centrifuged at 14,000 rpm for 30 min to remove ⁇ modified QDs, then purified from excess unreacted cysteamine by dialysis (Slide-A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) versus Milli-Q water.
  • concentration of the obtained QDs-NH 2 was determined spectrophotometrically.
  • QDs-NH 2 ((CdSe) ZnS, em 550 nm), QDs-COOH ((CdSe) ZnS, l ep , 550 nm) (PlasmaChem GmbH), QDs-COOH ( (CdSe) ZnS, Z em 530 nm, PlasmaChem GmbH).
  • conjugates A and B were precipitated by centrifugation (14,000 s 10 min), washed with 3 x 150 ⁇ l of H 2 0. Resuspended in 100 ⁇ l of H 2 0. Both conjugates inhibited the agglutination of red blood cells by the human influenza virus, but were characterized by low colloidal stability and settled after sonication after 15-20 minutes
  • Table 1 provides general information on the synthesized QDs conjugates.
  • Second row first well - 77 ⁇ l of the virus dilution 1: 200 in PBS + 5 ⁇ l of conjugate K-7.
  • titration of 40 ⁇ l in PBS It is seen that there is a decrease in the titer of agglutination in the presence of K-7 by 2 steps.
  • Third and fourth rows - H7N 1. Third row first well - 75 ⁇ l of the virus, 1: 2000 dilution in PBS + 5 ⁇ l of PBS.
  • titration of 40 ⁇ l in PBS The fourth row of the first well is 75 ⁇ l of the virus dilution 1: 2000 in PBS + 10 ⁇ l of K-7.
  • titration of 40 ⁇ l in PBS The agglutination titer in both rows is the same.
  • Z-PAA-Cy3 conjugate was mixed in H1N1 influenza virus in acetate buffer (pH 5.4) or PBS (pH 7.4) and kept at 4 ° C for 15-20 minutes, and then added to 6'SLN-QDs .
  • the measurements were carried out on a fluorimeter, standard cuvette (10 x 10 mm).
  • K-7 QDs conjugate is the most colloidally stable of the conjugates obtained (K-7 conjugate is a fluorescent component covalently linked to an influenza hemagglutinin-recognizing reagent, 6'SLN trisaccharide immobilized on quantum dots (6'SLN-QDs) namely, the quantum dot of the composition (CdSe) of ZnS and the core-shell structure (QDs) having an external polymer shell consisting of 6'SLN-sp-SH formed by replacing the cysteine in QDs-COOH with 6'SLN-sp- SH; (CdSe) ZnS - quantum dot fluorescence maximum I is 550 nm having colloidal ie hydrophobic core of CdSe and ZnS epitaxial shell structure around the CdSe core).
  • FRET pair K-7 - Z 20 -PAA-Cy3 1 Studies were conducted FRET pair K-7 - Z 20 -PAA-Cy3 1 .
  • the FRET experiments were carried out in AcONa / HCl buffer (pH 5.4, 0.1 M, 2 mM CaCl 2 ) (buffer A).
  • Figure 3 shows the results of the observed FRET.
  • a mixture of the virus with the fluorescent polymer conjugate of zanamivir was added to 6'SLN-QDs (K-7) in buffer A (curve QZV16), a second band appears at 562 nm in the diagram, indicating the appearance of the FRET effect.
  • This pair (quantum dot plus dye) in the presence of the influenza virus gives the FRET effect, but in the absence of the virus it does not. That is, this fundamentally new method according to the invention can be the basis for a quick and effective diagnosis of influenza virus.

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для быстрого обнаружения вируса гриппа в образце, непосредственно на месте лечения. Для этого разработан принципиально новый подход к анализу вирусов гриппа в образце, основанный на измерении переноса резонансной энергии флюоресценции (FRET), генерируемого двумя флуоресцентными компонентами, один из которых ковалентно связан с реагентом, узнающим гемагглютинин вируса гриппа, а второй - с реагентом, узнающим нейраминидазу вируса гриппа. Предлагаемый метод -первый в своем роде, базирующийся на том, что уникальные характерные для вируса гриппа белки гемагглютинин и нейраминидаза не просто присутствуют на поверхности вируса, а чередуются на небольшом расстоянии друг от друга, располагаясь практически вплотную, причем расстояние между ними близко к постоянному.

Description

МЕТОД СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГРИППА
ЧЕЛОВЕКА
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для быстрого обнаружения вируса гриппа в образце, непосредственно на месте лечения.
Уровень техники
Согласно предварительным оценкам, подготовленным экономистами Всемирного Банка [7], глобальная пандемия гриппа может вызвать более 360 миллионов смертельных случаев и будет стоить мировой экономике около 800 миллиардов долларов. Такая оценка основана на предположениях о потерях мирового производства из-за снижения размера и продуктивности рабочей силы в мире из-за болезни и смертей. С целью обеспечения возможности противостояния глобальной пандемии гриппа, в последние годы активно разрабатываются методы Быстрого Анализа для Обнаружения Гриппа - БАОГ (Rapid Influenza Diagnostic Tests - RIDTs), наиболее предпочтительными из которых являются методики, применимые непосредственно на месте лечения. Агентство Frost & Sullivan оценило величину рынка анализа на месте лечения (point of саге, РОС) в 3,93 миллиарда [8]. Согласно данным CDC [9] доступность и использование коммерческих диагностических методов анализа вируса гриппа в лабораториях и клиниках значительно выросли в последние годы. Уже более 10 методов БАОГ были утверждены FDA (США). Известные методы БАОГ различаются по чувствительности и специфичности. При этом чувствительность используемых в настоящее время методов составляет приблизительно 50-70%, что означает, что 30% ложно-отрицательных результатов анализа вируса гриппа могут быть получены при высоком содержании вируса гриппа в образце, что является типичным для пика сезона.
В 2009 г. пандемия гриппа высветила ограничения имеющихся вариантов Быстрого Анализа для Обнаружения Гриппа БАОГ [10]. Ретроспективный отчет HHS указывает на то, что диагностические методы анализа для точного обнаружения гриппа, особенно для подтверждения 2009 H1N1, были недоступны, что приводило к фрустрации клинического сообщества. Низкая чувствительность коммерчески доступных быстрых методов анализа приводила к неправильной постановке диагнозов и неправильному лечению пациентов.
В настоящее время золотой стандарт анализа на вирус гриппа основан на амплификации нуклеиновых кислот, однако этот метод не является быстрым и доступным. При этом чрезвычайно важно обнаруживать грипп в течение минут или часов, а не дней, так как только раннее выявление может дать возможность начать лечение противовирусными препаратами и избежать дальнейшего распространения вируса.
К настоящему времени разработано большое число БАОГ, не все из них коммерчески доступны. Большинство методов основано на определении нуклеокапсидного белка вируса гриппа с помощью моноклональных антител в течение 30 или более минут. При этом большая часть коммерчески доступных БАОГ имеет низкую чувствительность, а точность анализа сильно зависит от подтипа вируса. Среди используемых коммерческих БАОГ можно выделить два метода, демонстрирующих более высокую чувствительность (SOFIA от QUIDEL, и Veritor от Becton Dickinson htp://icm.asni.Org/content/53/4/l 345.full), но они очень дороги и требуют специального лабораторного оборудования, что существенно ограничивает их применение.
В литературе данные о чувствительности коммерчески доступных БАОГ приводятся в сравнении с другими стандартными методами (ИФА, непрямая иммунофлуоресценция и т.д.); согласно приведенным оценкам, она достигает в лучших случаях 80-90%.
Исследования, направленные на оценку чувствительности коммерческих БАОГ, были также проведены в сравнении с методами, основанными на выявлении РНК вирусов гриппа с помощью ПЦР, которые за последние 10 лет стали стандартными методами выявления вирусов. Как известно, нагрузка вируса в природных образцах сильно варьирует и число геномных копий находится в интервале от 2* 108 до всего лишь 400 [6]. В одном из экспериментов клинические образцы исследовали на присутствие вируса гриппа А с использованием ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) (Schweiger В. Influenza rapid tests - advantages and limitations. J Lab Medicine. 2006, 30: 219-25). Число положительных образцов определяли с использованием коммерческих методов анализа и группировали в пределах интервалов порога цикла ПЦР (Ct) (<20, 20-25, 25-30, >30). Значения Ct являются индикатором количества вируса в образце, где более низкие значения указывают на более высокие значения титра вируса (т.е. большее количество вирусного материала в образце). Чувствительность определяли в процентах для коммерческих методов анализа относительно RT-qPCR. Коммерческие БАОГ достигли чувствительности RT-qPCR при пределе Ct меньше 25, но большинство инфицированных пациентов могло быть обнаружено только с помощью ПЦР при Ct больше 30. Это означает, что имеющие регистрацию БАОГ "пропустили" более чем 50% инфицированных пациентов, когда вирусная нагрузка составляла только 400 геномных копий на образец, что свидетельствует о том, что чувствительность существующих БАОГ существенно ниже в ситуациях с низким содержанием вируса в образце.
Поэтому необходимость в разработке реальных БАОГ, обладающих высокой диагностической специфичностью и чувствительстью, очевидна.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового метода обнаружения вируса гриппа в образце, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, и который можно использовать в качестве метода БАОГ (Быстрого Анализа для Обнаружения Гриппа).
Для решения поставленной задачи был разработан принципиально новый подход к анализу вирусов гриппа в образце, основанный на измерении переноса резонансной энергии флюоресценции (FRET), генерируемого двумя флуоресцентными компонентами, один из которых ковалентно связан с реагентом, узнающим гемагглютинин вируса гриппа, а второй - с реагентом, узнающим нейраминидазу вируса гриппа. Предлагаемый метод - первый в своем роде, базирующийся на том, что уникальные характерные для вируса гриппа белки гемагглютинин и нейраминидаза не просто присутствуют на поверхности вируса, а чередуются на небольшом расстоянии друг от друга, располагаясь практически вплотную, причем расстояние между ними близко к постоянному.
Более конкретно, поставленная задача решается путем разработки способа обнаружения (детекции) вируса гриппа в образце с помощью измерения сигнала FRET, генерируемого двумя флуоресцентными компонентами, один из которых ковалентно связан с реагентом, способным узнавать (специфически связываться с) гемагглютинином вируса гриппа, а второй - с реагентом, способным узнавать (специфически связываться с) нейраминидазой вируса гриппа.
В некоторых вариантах изобретения один из флуоресцентных компонентов является органическим флуоресцентным красителем, а другой - квантовой точкой.
В некоторых вариантах изобретения реагентом, узнающим гемагглютинин, является производное трисахарида 6’SLN.
В некоторых частных вариантах изобретения производное трисахарида 6’SLN является поливалентным. В некоторых вариантах воплощения изобретения производное трисахарида 6’SLN представляет собой остаток Neu5Ac<x2-6Galpi-4GlcNAca-0(CH2)3NH-, присоединенный к водорастворимому полиакриламиду.
В некоторых вариантах изобретения реагентом, узнающим нейраминидазу, является производное занамивира.
В некоторых частных вариантах изобретения производное занамивира является поливалентным.
В некоторых вариантах воплощения изобретения производное занамивира представляет собой Z20-PAA-Cy31.
В частных вариантах воплощения изобретения вирус гриппа относится к любому подтипу вирусов гриппа человека.
Поставленная задача также решается путем разработки набора для обнаружения вируса гриппа предлагаемым способом, включающем:
(а) по меньшей мере один флуоресцентный компонент, ковалентно связанный с реагентом, способным специфически связываться с гемагглютинином вируса гриппа и
(б) по меньшей один флуоресцентный компонент, ковалентно связанный с реагентом, способным специфически связываться с нейраминидазой вируса гриппа,
при этом флуоресцентные компоненты (а) и (б) подобраны таким образом, что при связывании с соответствующими структурами на поверхности вируса гриппа они образуют FRET-napy.
В частных вариантах воплощения изобретения один из флуоресцентных компонентов является органическим флуоресцентным красителем, а второй - квантовой точкой.
В некоторых частных вариантах изобретения производное трисахарида 6’SLN является поливалентным.
В некоторых вариантах изобретения реагентом, узнающим нейраминидазу, является производное занамивира.
В некоторых частных вариантах изобретения производное занамивира является поливалентным.
Поставленная задача также решается при применении предлагаемого набора или способа для обнаружения вируса гриппа в пробе животного, человека и/или в пробе окружающей среды.
В некоторых вариантах изобретения проба животного и/или человека представляет собой мазки, кровь, слюну, носоглоточные смывы и аспираты, мазки из носоглотки и горла, образцы, взятые из дыхательных путей пациентов. В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:
- разработан принципиально новый подход к обнаружению/диагностике вируса гриппа in vitro,·
- при этом принципиальным является достижение высокой скорости прохождения анализа при высокой его специфичности; мы сознательно освобождаемся от дополнительных параметров, таких как дифференцирование гриппа А от В, идентификации подтипов вирусов А и т.д., с целью получить простой, доступный и ультрабыстрый метод анализа вируса гриппа человека и/или животного, «грипп или не грипп»;
- предлагаемый метод имеет высокую чувствительность, которая сохраняется даже при невысоком содержании вирусов в образце, поскольку для генерации и регистрации сигнала FRET может быть достаточно и небольшого количества вирусов;
- предлагаемый метод имеет высокую специфичность, поскольку генерация сигнала FRET возможна только при наличии вирусов гриппа в образце;
- метод обнаружения не требует стадий промывки/разделения; время манипуляций пренебрежимо мало, что в целом позволяет очень быстро получать результаты анализа;
- метод не требует сложного оборудования - достаточно лишь тест-пробирки и двух флуоресцентных реагентов; измерение флуоресцентного сигнала возможно с помощью карманного прибора для визуализации, что позволяет осуществлять анализ непосредственно на месте лечения.
Важным преимуществом является то, что предлагаемый подход является быстрым (около минуты), простым, не требующим обученного персонала. Предлагаемый метод диагностики является потенциальным инструментом предотвращения распространения вируса при угрозе следующей пандемии. Это позволит спасти жизни и снизить нагрузку на здравоохранение путем снижения значительного числа госпитализаций.
Термины и определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют тот же смысл, который общепринят в области, к которой принадлежит изобретение, и может быть понят специалистом, имеющим соответствующие навыки.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». «FRET» - Forster resonance energy transfer (fluorescence resonance energy transfer) - Фёрстеровский (флуоресцентный) резонансный перенос энергии, диполь-дипольный перенос энергии - механизм переноса энергии между двумя хромофорами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором. Примерами хромофоров по изобретению могут быть нанокристалл (так называемая квантовая точка) в качестве излучателя и органический краситель в качестве «приемника» излучения, но не ограничиваясь ими.
«Вирус гриппа» - РНК-содержащий вирус семейства ортомиксовирусов, поражающий человека, некоторые виды животных (лошади, свиньи и др.). В данном изобретении подразумеваются любые вирусы гриппа, независимо от их типа (т.е. любого из типов А или В), а также подтипа (т.е., например, любые из антигенных подтипов вируса гриппа по гемагглютинину (Н1-НЗ) и по нейраминидазе (N1-N3)).
Под «реагентом, узнающим гемагглютинин (hemagglutinin, НА) вируса гриппа» («реагентом, способным специфически связываться с гемагглютинином вируса гриппа») подразумевается такие малые (небелковые) молекулы, которые способны специфически связываться с гемагглютинином вируса гриппа, независимо от его антигенной специфичности. Например, такой как трисахарид 6’SLN или его производные, сохраняющие способность специфически связываться с гемагглютинином, а также их миметики.
Под термином «трисахарид 6’SLN» понимается 6'-сиалил-( -ацетиллактозамин) (6'-Sialyl-N-acetyllactosamine).
Под «реагентом, узнающим нейраминидазу (neuraminidase, NA) вируса гриппа» («реагентом, способным специфически связываться с нейраминидазой вируса гриппа») подразумевается такие малые (небелковые) молекулы, которые способны специфически связываться с нейраминидазой вируса гриппа, независимо от ее антигенной специфичности. Например, такие как ингибиторы нейраминидазы (занамивир, осельтамивир и др.) или их производные, сохраняющие способность специфически связываться с нейраминидазой, а также так называемые суицидные субстраты.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 приведено схематическое изображение принципиального подхода к методу анализа по изобретению, показано соответствие между архитектурой поверхности вируса и требованиями для эффективного FRET: (1) схема вирусной частицы, содержащей НА и NA;
(2) реагент, узнающий гемагглютинин вируса гриппа, конъюгированный с
квантовой точкой;
(3) реагент, узнающий нейраминидазу вируса гриппа, конъюгированный с
флуоресцентным красителем.
Двойные стрелки демонстрируют перенос резонансной энергии (FRET).
На фигуре 2 приведены результаты агглютинационного теста для конъюгата К-7.
На фигуре 3 приведены результаты изменения флуоресценции FRET-пары К-7 - Z20-PAA-Cy31 в присутствии вируса гриппа человека H1N1 (Marburg):
ЕС-16 - конъюгат К-7 (12 пМ) в буфере А;
QZV16 - ЕС-16 + [50 мкл буфера А + 5 мкл
Figure imgf000008_0001
мкл вируса HlNl(~3000 HAU)]
QZV17- контроль.
Подробное описание изобретения
Основным принципом предлагаемого изобретения является специфическое узнавание двух компонентов вирусной мембраны— гемагглютинина (НА) способного связывать углеводный рецептор вируса гриппа, и нейраминидазы (NA) способной гидролизовать сиалоолигосахариды; наличие этих двух активностей уникально для вируса гриппа человека, то есть, не характерно для других вирусов.
Для этого используются два реагента, один из которых специфически связывается с НА, а другой - с NA. В архитектуре вируса гриппа НА и NA чередуются на небольшом расстоянии друг от друга, то есть расположены практически вплотную [1]. Это дает возможность измерять FRET. FRET представляет собой зависящее от расстояния взаимодействие между двумя возбужденными состояниями двух молекул красителей (хромофоров), при котором возбуждение переносится от молекулы донора на молекулу акцептора. Эффективность FRET зависит обратно пропорционально в шестой степени от расстояния, что делает его применимым только при расстояниях, сравнимых с размерами биологических макромолекул [4]. В предлагаемом методе FRET работает в случае, когда и НА и NA одновременно связываются с донором и акцептором флуоресценции. Короткое расстояние действия FRET является положительным фактором, так как минимизирует неспецифический сигнал - когда расстояние между красителями большое, например, раствор двух проб (даже высокой концентрации) не дает сигнала. Известно, что комбинация НА + NA (хотя по отдельности сиалосвязывающие белки и сиалидазы встречаются нередко) является уникальной для вирусов гриппа, поэтому анализ высокоспецифичен.
Основными условиями для FRET являются:
• Молекулы донора и акцептора должны находиться на близком расстоянии (обычно 10-
100А);
• Спектр поглощения акцептора должен перекрываться со спектром испускания донора;
• Ориентации диполей переходов донора и акцептора должны быть приблизительно параллельными.
Для проведения анализа используются синтетические вещества (реагенты), специфически связывающиеся с белками НА и NA, и способные сформировать FRET- пару; так как НА и NA расположены рядом на поверхности вирусной частицы, флуоресцентная метка в составе первого реагента возбуждает флуоресцентный сигнал на флуоресцентную метку второго реагента, которая испускает сигнал с другой длиной волны. В отсутствие вируса эти реагенты находятся в растворе далеко один от другого, и поэтому неспособны формировать FRET-сигнал.
При применении предлагаемого метода анализа для обнаружения вируса гриппа в пробе животного, человека и/или в пробе окружающей среды необходима только тест- пробирка, две флуоресцентные пробы, способные связываться с вирусом, и флуоресцентный ридер, позволяющий измерить сигнал FRET. Результат измеряется за минуту с помощью недорогого ручного прибора для определения флуоресценции, например, такого как карманное устройство для определения флуоресценции, производимое компанией DCN Diagnostics (Карлсбад, Калифорния, США).
Технологическое решение
На фигуре 1 приведена схема вирусной оболочки вируса гриппа с молекулами НА и NA (1), а также флуоресцентно-мечеными молекулами, связывающимися с ними ((2) и (3) - см. выше). Как уже указывалось, комбинация НА + NA является специфичной (уникальной) для вирусов гриппа. На поверхности вируса гриппа НА и NA чередуются, причем расстояние между ними близко к постоянному. НА и NA на вирусной частице занимают ~50% от общей площади. Это означает, что флуоресцентно-меченые молекулы, связывающиеся с НА и NA, расположены близко друг к другу, при условии, что к вирусной частице присоединены несколько копий таких молекул. Благодаря близости флуоресцентных остатков двух типов реализуется FRET. Тем не менее, чтобы реализовать осуществление FRET-сигнала, необходим тщательный подбор структуры спейсерных групп, размера частицы в случае квантовой точки) и т.д., чтобы компоненты пары не оказались на слишком большом расстоянии друг от друга, или не обрели слишком высокую конформационную подвижность. Все это необходимо учитывать при конструировании FRET-nap для проведения анализа предлагаемым способом.
Одна вирусная частица содержит на своей поверхности около 400 молекул НА и около 100 молекул NA, расстояние между их центрами составляет приблизительно 10 нм. Гемагглютинин представляет собой гомотример, лиганд-связывающие сайты расположены близко к их периферии. Похожая картина справедлива для тетрамерной NA. Это означает, что сайты связывания соседних молекул НА и NA расположены гораздо ближе друг к другу, чем 10 нм, а именно, на расстоянии 1,5 - 2,0 нм. Это необходимо учитывать при конструировании лигандов FRET-nap для проведения анализа. Нужно отметить, что флуоресцентные метки, даже квантовые точки (QD, один из типов меток в данном изобретении) обладают размером около 2 нм. Поэтому проведенные расчеты показали, что даже при использовании квантовых точек расстояние между флуоресцентным красителем (первая проба) и QD (вторая проба FRET-пары) составит около 3 нм, т.е. будет соответствовать расстоянию, необходимому для проявления эффекта FRET (1 - 10 нм). Необходимо также отметить, что при захвате вирусной частицей двух или ограниченного количества флуоресцентных остатков вероятность образования флуоресцентной пары близка к нулю; для гарантированного FRET эффекта вирусная частица должна захватить несколько десятков доноров и акцепторов. С этой целью к образцу, содержащему вирус, флуоресцентные доноры и акцепторы добавляют в большом избытке (так, чтобы связалось несколько десятков каждого типа молекул, что несложно осуществить практически). Оптимизация спейсеров, правильный выбор природы пары донор/акцептор и условия анализа являются наиболее важными моментами. В частных вариантах осуществления изобретения, для того чтобы обеспечить наиболее сильное связывание флуоресцентно-меченых молекул с вирусной частицей их делают поливалентными (мультивалентными) в той части, которая специфически связывается с молекулами НА и NA вируса гриппа, а для того чтобы повысить вероятность сближения донора и акцептора и повысить интенсивность сигнала, в некоторых вариантах изобретения в флуоресцентно-меченые молекулы вводят несколько единиц красителя. В некоторых вариантах осуществления изобретения, но не ограничиваясь ими, в качестве флуоресцентно-меченых молекул могут быть использованы производное трисахарида 6’SLN - в качестве реагента, узнающего гемагглютинин, и производное занамивира - в качестве реагента, узнающего нейраминидазу. Как уже указывалось, в качестве флуоресцентных компонентов, ковалентно связанных с вышеуказанными реагентами, могут быть использованы любые молекулы, способные сформировать FRET- пару. В частности, это могут быть, например, органический флуоресцентный краситель и квантовая точка.
Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Производные занамивира (Z) синтезировали в виде поливалентных производных полиакриламида, по методу, разработанному ранее для других гликоконъюгатов [11]. Трисахарид 6’SLN (б'-Sialyl-N-acetyllactosamine, 6 -сиалил-(К-ацетиллактозамин) иммобилизовали на квантовых точках, что также позволило получить мультивалентные производные. В результате проведенных экспериментов было показано, что трисахарид можно иммобилизовать на квантовых точках разными способами (для этого использовались квантовые точки с разными функциональными группами), это дает возможность получить производные с максимальной иммобилизацией трисахарида и подходящей стабильностью, а также варьировать расстояние от трисахарида до ядра квантовой точки (QD), что (как обсуждалось выше) могло быть важным для проявления эффекта FRET.
Примеры.
1. Синтез флуоресцентного поливалентного субстрата нейраминидазы вируса гриппа Z20-PAA-Cy31 (Схема 1). К раствору поли(4-нитрофенил акрилата) - PNPA (2.5 мг) в ДМСО (0.15 мл) прибавили аминогексил-7- карбамат производное занамивира - Zan (1.2 мг), 80 мкл 0.1% раствора цианинового красителя Су3 в ДМСО и 0.5 мкл триэтиламина. Реакционную смесь выдержали 3 ч при 40°С, прибавили 10 мкл моноэтаноламина и оставили на ночь при комнатной температуре. Гель-хроматографией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1:1) выделили 2.5 мг Z20-PAA-Cy31 (выход - 80 %).
Figure imgf000012_0001
PNPA
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0002
г ^-РАА-СуЗ1
Схема 1. Синтез флуоресцентного полимерного субстрата нейраминид зы вируса гриппа Z^-PAA-CyS1, где sp - спейсер -(CH2)6-NH-, п - количество молей полимера Z20- РАА-СуЗ1, принятое за единицу (100%), Z - занамивир, (2R,3R,4S)-4-ryaHHflHHo-3-(npon- 1 -ен-2-иламино)-2-(( 1 R,2R)- 1 ,2,3 -тригидроксипропил)-3 ,4-дигидро-2Н-пиран-6- карбоновая кислота, СуЗ1 - цианиновый краситель.
Z20-PAA-Cy31 - статистический сополимер, представляющий собой замещенный полиакриамид (РАА), мольные доли мономеров А, В и С которого равны, соответственно 0.2, 0.01 и 0.79 и среднечисловая молекулярная масса которого определяется количеством мономеров (150-250).
2. Химический синтез лиганда гемагглютинина вируса гриппа со спейсерами разной длины.
1) Синтез активированного производного 6’SLN-Ad-pNPh (Схема 2). К раствору бис-паранитрофенилового эфира адипиновой кислоты Ad(plVPh)2 (102 мг, 287 мкмоль) в 10 мл ДМСО при перемешивании прибавили 30 мг (41 мкмоль) сухого трисахарида 6’SLN и 5 мкл триэтиламина Et3N. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч и нейтрализовали уксусной кислотой АсОН (10 мкл). Гель-фильтрацией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1 :1, 0.5 % АсОН) и последующей хроматографией на силикагеле (изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2, 0.5 % АсОН) выделили 32 мг (выход -
81%) 6’SLN-Ad-pNPh, R/0.55 (изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2, 0.5 % АсОН). 1 Н NMR (700 MHz), D20 (0.05 % АсОН): S 1.65-1.78 (m, 7Н, Neu Н-3 ах, 3 -СН2- ), 2.00, 2.02 (2s,
2хЗН, 2xNC(0)CH3 Neu, GN), 2.28 (t, 6.9 Hz, a-CH2- Ad) 2.63 (dd, 1H, J4,3eq 4.6 Hz, J3ax q 12.5 Hz, Neu П-Зед), 2.71 (t, J 6.9 Hz, a-CH2- Ad), 3.12-3.29 (m, 2H, -NCH2), 3.52-4.08 (m:
21H), 4.40 (d, 1H, Ju 7.9 Hz, H-l Gal), 4.49 (m, 1H, GN), 7.36, 8.32 (2d, 2x2H, J9.1, Ar).
Figure imgf000013_0001
6'SLN-Ad-pNPh
Схема 2. Синтез активированного производного 6’SLN-Ad-pNPh 2) Синтез спейсерированного производного 6’SLN, содержащего концевую тиольную группу 6’SLN-sp-SH (Схема 3). К раствору 11 мг (11 мкмоль) 6’SLN-Ad-pNPh в 0.5 мл ДМФА прибавили 2 мг (18 мкмоль) гидрохлорида моноэтаноламина и 2 мкл триэтиламина. Через 30 мин на ТСХ отсутствовало пятно исходного 6’SLN-Ad-pNPh (R/ 0.5, изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2) и появилось 2 новых пятна с R/ 0.3 и на старте
(изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2). Гель-фильтрацией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1 :1) выдели смесь веществ с указанными выше R/, которую обработали 2,4- дитиотреитолом (DTT) в фосфатном буфере (pH 7.8). Пятно на старте исчезло и в реакционной смеси осталось одно вещество с R/0.3 (изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2). Реакционную смесь вновь подвергли гель-фильтрации в тех же условиях и выделили 7.7 мг (выход 73%) 6’SLN-sp-SH, R/ 0.3 (изопропанол-этилацетат-вода, 4:3:2); 1H NMR (700 MHz), D20: d 1.54-1.67 (m, 4H, 2х -СЯ2- Ad), 1.73 (dd, 1Н, /4>зах ~^3ax,3eq 12.2 Hz, Neu Н- Ъах), 1.76-1.83 (m, 2Н, NCH2C^CH20 spacer) 2.06, 2.08 (2s, 2c3H, 2xNC(0)CH3 Neu, GN), 2.26-2.34 (m, 4 H, 2 x a-CH2- Ad) 2.66-2.72 (ш, 3H, Neu H-3eq, -CH2-NHC(0)), 3.17-3.32 (m, 2H, -(0)CNCH2), 3.4 (t, 2H, J 6.5, -CH2-SH), 3.53-4.04 (m, 21H), 4.47 (d, 1H, J 2 7.9 Hz, H-l
Gal), 4.56 (d, J 7.7 Hz,IH, GN).
Сй С 3еоинз спсерирхатеем.
Figure imgf000015_0001
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 3) Синтез 6’SLN-PEG4-PDP (Схема 4). К раствору 7.7 мг (10.5 мкмоль) 6’SLN в 0.5 мл ДМСО прибавили 15 мг (26.8 мкмоль) ПЭГ4 N -су кциними ди л 3-(2-пиридилдитио) пропионата PEG4-SPDP и 2 мкл триэтиламина, оставили на ночь при комнатной температуре. На ТСХ есть пятно исходного 6’SLN. Прибавили еще 4 мг (7.1 мкмоль) PEG4-SPDP, через 30 мин реакция прошла полностью. Гель-фильтрацией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1 : 1) выделили 9.6 мг (выход 76%) 6’SLN-PEG4-PDP, R/ 0.7 (метанол-ацетонитрил-вода, 6:10:3). 1H NMR (700 MHz, D20), d: 1.68 (dd, 1H, J4,3ax ~J3 x, eq 12.2 Hz, Neu H-3ac), 1.72-1.76 (m, 2H, -CH2- spacer), 2.00, 2.03 (2s, 2x3H, 2xNC(0)CH3 Neu, GN), 2.47 (t, 2H, ,76.15 Hz,-CH2-SS) 2.61-2.67 (m, 3H, Neu H-3 eq, -CH2- C(O)NH), 3.05 (t, 2H, J 6.65 Hz, - СН2-С(0) ), 3.13-3.26 (m, 2H, -NCH2), 3.33 (t, 2H, J 6.15 Hz, -CH2-
NHC(O) (3.48-4.00 (m, 39H), 4.42 (d, 1H, J1 2 7.4 Hz, H-l Gal), 4.51 (d, 1H, J 7.9 Hz GN), 7.28-7.31 (ш, Ш, Ar), 7.80-7.87 (m, 2H, Ar), 8.37-8.40 (m, 1H, Ar).
Figure imgf000016_0001
6'SLN-PEG4-PDP
Схема 4. Синтез PEG-производного 6’SLN (6’SLN-PEG4-PDP).
3. Синтез активированного полимерного производного 6’SLN (6’SLN 20 -
PNPA, Схема 5). К раствору 2,2 мг (13.7 мкмоль) PNPA в 0.5 мл ДМСО прибавили 2 мг (2.73 мкмоль) сухого 6’SLN и 0.5 мкл триэтиламина, оставили на 30 мин при 40°С. Через 30 минут в реакционной смеси нет исходного 6’SLN (ТСХ-контроль). Гель-фильтрацией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1 :1, 0.3% АсОН) выделили 4 мг (выход 94%) 6’SLN20-PNPA.
Figure imgf000017_0001
Схема 5. Синтез активированного полимерного производного 6’SLN 20 -PNPA: sp - спейсер (структура понятна из приведенной схемы), п - количество молей полимера 6’SLN20-PNPA, принятое за единицу (100%) 6’SLN20-PNPA - статистический сополимер, мольные доли мономеров которого (см. схему) равны, соответственно 0,2 и 0,8 и среднечисловая молекулярная масса которого определяется количеством мономеров (150-250).
4. Синтез полимерного конъюгата, содержащего остатки 6’SLN и 2- аминоэтантиола (6’SLN20-PAA-Cys2, Схема 6). К раствору PNPA (5.3 мг, 27 мкмоль) в
ДМСО (0.25 мл) прибавили 6’SLN (4 мг, 5.5 мкмоль), 14 мкл 0.3% раствора 2- аминоэтантиола в ДМСО и 4.6 мкл триэтиламина. Реакционную смесь выдержали 24 ч при 40°С. Затем прибавили 45 мкл моноэтаноламина (ЕА) и выдержали еще 24 ч при 40°С. Гель-хроматографией на Сефадексе LH-20 (элюция MeCN-H20, 1 :1) выделили 7.1 мг (100 %) 6’ SLN20-P АА-Су s2.
5. Получение QDs с аминированной поверхностью. Полупроводниковые нанокристаллы (QD) состава (CdSe)ZnS с максимумом флуоресценции 550 нм и структуры ядро-оболочка (QDs) синтезировали согласно протоколу [5]. Способ включает 1) синтез коллоидного гидрофобного ядра CdSe и 2) наращивание эпитаксиальной оболочки состава ZnS вокруг ядра CdSe. Полученные QDs (~3 мг) очищали от избытка ТОРО (триоктилфосфин оксид) трехкратным диспергированием в хлороформе (600 мкл) и осаждением в метаноле (600 мкл) с последующим центрифугированием (12,000 об ./мин, 8 мин). Очищенные QDs диспергировали в 500 мкл хлороформа, добавляли 500 мкл водного раствора цистеамина гидрохлорида (40 мг/мл), интенсивно перемешивали на Vortex в течение 5 мин, при этом несколько раз смесь подвергали ультразвуковой обработке. После этого окрашенный супернатант, содержащий QDs, солюбилизированные цистеамином (QDS-NH2), отбирали, центрифугировали при 14,000 об./мин в течение 30 мин для удаления немодифицированных QDs, затем очищали от избытка непрореагировавшего цистеамина диализом (Slide- A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) против воды Milli-Q. Концентрацию полученных QDs-NH2 определяли спектрофотометрически.
Figure imgf000019_0001
6'SLN20-PAA-Cys2
Схема 6. Синтез 6’SLN20-PAA-Cys „2 6. Получение QDs с аминированной поверхностью. Полупроводниковые нанокристаллы (QD) состава (CdSe)ZnS с максимумом флуоресценции 550 нм и структуры ядро-оболочка (QDs) синтезировали согласно протоколу [5]. Способ включает 1) синтез коллоидного гидрофобного ядра CdSe и 2) наращивание эпитаксиальной оболочки состава ZnS вокруг ядра CdSe. Полученные QDs (~3 мг) очищали от избытка ТОРО (трио тилфосфин оксид) трехкратным диспергированием в хлороформе (600 мкл) и осаждением в метаноле (600 мкл) с последующим центрифугированием (12,000 об./мин, 8 мин). Очищенные QDs диспергировали в 500 мкл хлороформа, добавляли 500 мкл водного раствора цистеамина гидрохлорида (40 мг/мл), интенсивно перемешивали на Vortex в течение 5 мин, при этом несколько раз смесь подвергали ультразвуковой обработке. После этого окрашенный супернатант, содержащий QDs, солюбилизированные цистеамином (QDS-NH2), отбирали, центрифугировали при 14,000 об./мин в течение 30 мин для удаления ^модифицированных QDs, затем очищали от избытка непрореагировавшего цистеамина диализом (Slide-A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) против воды Milli-Q. Концентрацию полученных QDs-NH2 определяли спектрофотометрически.
7. Получение QD-конъюгатов из квантовых точек, имеющих аминогруппы
Для получения конъюгатов QDs с синтезированными лигандами гемагглютинина вируса гриппа использовали QDs-NH2 ((CdSe)ZnS, em 550 нм), QDs-COOH ((CdSe)ZnS, lep, 550 нм) (PlasmaChem GmbH), QDs-COOH ((CdSe)ZnS, Zem 530 нм, PlasmaChem GmbH).
6-1. Конъюгация QDs-NH2 c 6’SLN20-PNPA (K-l и K-2).
A. К водному раствору QDs-NH2 (90 мкл, с 50 мкМ) прибавляли 10 мкл 0.2М раствор NaHC03 (pH 8.2) и 20 мкл раствора 6’SLN20-PNPA (с 2 мг/мл) в ДМСО. Перемешивали 2 ч на качалке, затем прибавляли 2 мкл моноэтаноламина и перемешивали еще в течение часа. (К-1)
B. К водному раствору QDs-NH2 (90 мкл, с 50 мкМ) прибавляли 10 мкл 0.2 М раствор NaHC03 (pH 8.2) и 10 мкл раствора 6’SLN20-PNPA (с 2 мг/мл) в ДМСО. Перемешивали 2 ч на качалке, затем прибавляли 2 мкл моноэтаноламина и перемешивали еще в течение часа. (К-2)
Полученные конъюгаты А и В осаждали центрифугированием (14 000 c 10 мин), промывали 3 х 150 мкл Н20. Ресуспендировали в 100 мкл Н20. Оба конъюгата ингибировали агглютинацию эритроцитов вирусом гриппа человека, однако характеризовались низкой коллоидной стабильностью, оседали после озвучивания через 15-20 мин.
6-2. Конъюгация QDs-NH2 с 6’SLN-Ad-pNPh (К-3). К 50 мкл QDs-NH2 (90 мкМ) в воде прибавили 0.45 мг 6’SLN-Ad-pNPh в 50 мкл PBS (pH 7.4), перемешивали 48 час на качалке, затем прибавили 5 мкл 3% водного раствора аммиака и перемешивали еще 30 мин. Полученный конъюгат очищали диализом (Slide-A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) против воды Milli-Q. Конъюгат К-3 ингибировал агглютинацию эритроцитов вирусом гриппа, однако характеризовался низкой коллоидной стабильностью. 7. Получение QD-конъюгатов из квантовых точек, имеющих группы СООН.
7-1. Замещение цистеина в QDs-СООН (lep,= 550 нм) на 6’SLN20-PAA-Cys2
(К-4).
К водному раствору QDs-СООН (100 мкл, с 50 мкМ) прибавляли 0.5 мг 6’SLN - PAA-Cys2 в 300 мкл PBS (pH 7.4). Перемешивали 48 ч на качалке. Конъюгат осаждали центрифугированием 14 000 х 7 мин), промывали 3x150 мкл Н20. Ресуспендировали в 100 мкл Н20. Конъюгат с низкой коллоидной стабильностью, оседал после озвучивания через 30 мин.
7-2. Замещение цистеина в QDs-СООН на 6’SLN-sp-SH (К-5). К 100 мкл QDs- СООН (18 мкМ) прибавляли 0.7 мг (0.73 мкмоль) 6’SLN-sp-SH в 50 мкл фосфатного буфера (0.1М, pH 7.5), перемешивали на качалке при +4 °С в течение 30 ч. Отобрали 50 мкл, диализовали против Н20 в течение 3 ч. Оставили реакционную смесь перемешиваться в тех же условиях на 72 ч. Очищали QDs-конъюгат от непрореагировавшего 6’SLN-sp-SH диализом (Slide-A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) против воды Milli-Q. Полученный конъюгат К-5 характеризовался низкой коллоидной стабильностью.
8. Получение QD-конъюгатов из гидрофобных квантовых точек
8-1. Солюбилизация гидрофобных QDs тиольным производным 6’SLN-sp- SH (К-6). Гидрофобные QDs (~2 мг) очищали от избытка ТОРО следующим образом: диспергировали в 0.2 мл хлороформа, осаждали метанолом (0.6 мл) и центрифугировали (9,000 об./мин, 5 мин). Процедуру повторяли три раза. Очищенные QDs диспергировали в 1 мл хлороформа. Отбирали 300 мкл очищенных QDs в хлороформе, добавляли 0.5 мг 6'SLN~SH в 50 мкл воды и 50 мкл метанола, интенсивно перемешивали на Vortex в течение 10 мин, при этом несколько раз смесь подвергали ультразвуковой обработке. После этого смесь центрифугировали (9,000 об./мин, 5 мин), хлороформ удаляли, полученный осадок высушивали в течение 24 ч при комнатной температуре и диспергировали в 120 мкл PBS. Полученный конъюгат характеризовался низкой коллоидной стабильностью.
8-2. Замещение цистеина в QDs-СООН на 6’SLN-sp-SH (К-7, конъюгат 6’SLN-QDs). Суспендировали 2.7 мг лиофилизованных QDs-СООН в 200 мкл фосфатного буфера (pH 7.5) и прибавили к 0.5 мг сухого 6’SLN-sp-SH. Перемешивали 50 ч при +4 °С. Прибавляли 0.7 мл метанола и осаждали конъюгат центрифугированием (12000 об/мин, 30 мин). Осадок ресуспендировали в 0.9 мл метанола и еще раз осаждали центрифугированием, затем растворяли в 250 мкл Н20. Полученный конъюгат ингибировал агглютинацию эритроцитов только вирусом гриппа человека (фигура 2). Результаты FRET-экспериментов приведены на фигуре 3.
9. Использование карбодиимидного метода активирования карбоксильных групп для получения конъюгатов 6’SLN-QDs (К-8). К 1.2 мг QDs- СООН в 50 мкл МЕБ-буфера (0.1 М, pH 5.8) прибавили свежеприготовленный раствор 1 мг (5 мкмоль) Su-NHS и 0.6 мг (3.8 мкмоль) EDC в МЕБ-буфера. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при комнатной температуре и активированные QDs осаждали центрифугированием (8 000 об/мин/5 мин). Промывали водой (2 c 0.5 мл, 8 000 об/мин/5 мин). К осадку прибавили 0.2 мг 6’SLN-sp-NH2 в 100 мкл PBS, озвучили 5 сек и оставили при перемешивании на 18 ч. Затем прибавили 2 мкл моноэтано ламина и перемешивали еще 30 мин. Конъюгат очищали диализом (Slide- A-lyzer, 7,000 MWCO, Thermo scientific) против воды Milli-Q. Полученный конъюгат характеризовался низкой коллоидной стабильностью при нейтральных значениях pH. Добавление моноэтаноламина стабилизировало конъюгат.
В таблице 1 приведена общая информация о синтезированных QDs-конъюгатах.
Таблица 1. QDs-конъюгаты (знаком «+» отмечены исходные QDs и лиганды, которые использовались для получения соответствующих конъюгатов)
Figure imgf000022_0001
Как уже указывалось выше, из синтезированных QDs-конъюгатов К-1 - К-8 не все оказались стабильными.
10. Проверка эффективности иммобилизации различных лигандов, содержащих б’-SLN на QDs. Успешность иммобилизации различных лигандов, содержащих 6’SLN, на квантовых точках проверяли по способности полученных конъюгатов ингибировать реакцию агглютинации эритроцитов вирусом гриппа человека. Использовали человеческий вирус H1N1 (Marburg 2013) и птичий вирус H7N1 (FPV/Rostoc). В случаях успешной иммобилизации наблюдалось ингибирование агглютинации эритроцитов человеческим вирусом гриппа. В качестве примера на фигуре. 2 приведены результаты агглютинационного теста для конъюгата К-7.
На фигуре. 2 верхние два ряда - H1N1. Первый ряд первая лунка - 75 мкл вируса разведение 1:200 в PBS + 5 мкл PBS. Далее: титрование по 40 мкл в PBS. Второй ряд: первая лунка- 77 мкл вируса разведение 1 :200 в PBS + 5 мкл конъюгата К-7. Далее титрование по 40 мкл в PBS. Видно, что происходит снижение титра агглютинации в присутствии К-7 на 2 ступени. Третий и четвертый ряды - H7N 1. Третий ряд первая лунка - 75 мкл вируса, разведение 1 :2000 в PBS + 5 мкл PBS. Далее: титрование по 40 мкл в PBS. Четвертый ряд первая лунка- 75 мкл вируса разведение 1 :2000 в PBS + 10 мкл К-7. Далее: титрование по 40 мкл в PBS. Титр агглютинации в обоих рядах одинаков.
11. Проведение FRET в присутствии вируса гриппа
Возбуждение QDs lec = 405 нм
Эмиссия К-7 Zem = 530 нм
При наличии FRET эмиссия Z20-PAA-Cy31 - Zem =562 нм
Эксперимент с вирусом: конъюгат Z -РАА-СуЗ смешивали в вирусом гриппа H1N1 в ацетатном буфере (pH 5.4) или PBS (pH 7.4) и выдерживали при 4°С в течение 15- 20 мин, а затем прибавляли к 6’SLN-QDs.
Измерения проводили на флюориметре, кювета стандартная (10 х 10 мм).
QDs-конъюгат К-7 - наиболее коллоидно стабильный из полученных конъюгатов (конъюгат К-7 представляет собой флуоресцентный компонент, ковалентно связанный реагентом, узнающим гемагглютинин вируса гриппа, представляет собой трисахарид 6’SLN, иммобилизованный на квантовых точках (6’SLN-QDs), а именно на квантовую точку состава (CdSe)ZnS и структуры ядро-оболочка (QDs), имеющую внешнюю полимерную оболочку, состоящую из 6’SLN-sp-SH, образованную путем замещения цистеина в QDs-COOH на 6’SLN-sp-SH; (CdSe)ZnS - квантовая точка с максимумом флуоресценции Яет 550 нм, имеющая коллоидное гидрофобное ядро CdSe и эпитаксиальную оболочку состава ZnS вокруг ядра CdSe). Были проведены исследования FRET-пары К-7 - Z20-PAA-Cy31. Эксперименты по FRET проводились в буфере AcONa/HCl (pH 5.4, 0.1 М, 2 mM СаС12) (буфер А). На фигуре 3 приведены результаты наблюдаемого FRET. При прибавлении смеси вируса с флуоресцентным полимерным конъюгатом занамивира к 6’SLN-QDs (К-7) в буфере А (кривая QZV16) на диаграмме появляется вторая полоса при 562 нм, свидетельствующая о появлении FRET эффекта. ЕС-16 - конъюгат К-8 (12 пМ) в буфере А; QZV16 - ЕС- 16 + [50 мкл буфера А + 5 мкл Z20-PAA-Cy3’ (5 мг/мл) + 3 мкл вируса HlNl(~3000 HAU)]
QZV17- контроль (в отсутствии вируса гриппа).
Данная пара (квантовая точка плюс краситель) в присутствии вируса гриппа дает FRET-эффект, а в отсутствие вируса - нет. То есть, данный принципиально новый способ по изобретению может быть положен в основу быстрой и эффективной диагностики вируса гриппа.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
1. M.Yamaguchi et al., J. Struct. Biol. 162(2008), 271-276.
2. Leiser, R.-M. M. Kliihr, V. Lugmayr, A. Heider, E. Korchagina, N. Bovin, B.
Schweiger G. Brem: (2012) Method for detection and distinction of different influenza virus variants. EP 12 180 070.0, 2012.
3. Bovin, N.V., I. Lyubavina, R.-M. Leiser, (2007) Detection method for Influenza viruses“.
PCT/EP2007/054835
4. The molecular probes Handbook a guide to molecular probes and labelling technologies l lth editions 2010. Chapter 1 : Fluorrophores and their amine-reactive derivatives, page 39-40.
5. A. Sukhanova, K. Even-Desrumeaux, P.Chames, D. Baty, M. Artemyev, V. Oleinikov, I.
Nabiev. Engineering of ultra-small diagnostic nanoprobes through oriented conjugation of single-domain antibodies and quantum dots. Protocol Exchange (2012) doi:l0.l038/protex.20l2.042
6. Schweiger B. Influenza rapid tests - advantages and limitations. J Lab Medicine. 2006, 30: 219-25.
7. http://www.economv.com/dismal/article free.asp?cid=T 8829 8. Frost & Sullivan: Point-of-Care Testing Market Finds Expanded Opportunities with Higher End-User Demand.
9. http://www.cdc.gov/flu/professionals/diagnosis/rapidlab.htm
10. CDRH Microbiology Devices Advisory Committee Meeting. Executive Summary. 2013 11. N.V.Bovin, E.Yu.Korchagina, T.V.Zemlyanukhina, N.E.Byramova, O.E.Galanina,
A.E.Zemlyakov, A.E.Ivanov, V.P.Zubov, L.V.Mochalova. Synthesis of polymeric neoglycoconjugates based on N-substituted polyacrylamide. Glycoconj. J., 10, 142-151 (1993)

Claims

Формула изобретения
1. Способ детекции вируса гриппа в образце с помощью измерения сигнала FRET, генерируемого двумя флуоресцентными компонентами, один из которых ковалентно связан с реагентом, узнающим гемагглютинин вируса гриппа, а второй - с реагентом, узнающим нейраминидазу вируса гриппа.
2. Способ по п. 1, в котором один из флуоресцентных компонентов является органическим флуоресцентным красителем, а второй - квантовой точкой.
3. Способ по п. 1, в котором реагентом, узнающим гемагглютинин, является производное трисахарида 6’SLN.
4. Способ по п. 3, в котором производное трисахарида 6’SLN является поливалентным .
5. Способ по п. 3, в котором производное трисахарида 6’SLN представляет собой остаток Neu5Aca2-6Galpl-4GlcNAcP-0(CH2)3NH-, присоединенный к водорастворимому полиакриламиду.
6. Способ по п. 1, в котором реагентом, узнающим нейраминидазу, является производное занамивира.
7. Способ по п. 6, в котором производное занамивира является поливалентным.
8. Способ по п. 6, в котором производное занамивира представляет собой Z 20 - РАА-СуЗ1.
9. Способ по п.1, в котором вирус гриппа относится к любому подтипу вирусов гриппа человека.
10. Набор для детекции вируса гриппа способом по любому из п.п.1-7, включающий
(а) по меньшей мере один флуоресцентный компонент, ковалентно связанный с реагентом, узнающим гемагглютинин вируса гриппа и
(б) по меньшей один флуоресцентный компонент, ковалентно связанный с реагентом, узнающим нейраминидазу вируса гриппа,
при этом флуоресцентные компоненты (а) и (б) подобраны таким образом, что при связывании с соответствующими структурами на поверхности вируса гриппа они образуют FRET-napy.
11. Набор по п.10, в котором один из флуоресцентных компонентов является органическим флуоресцентным красителем, а второй - квантовой точкой.
12. Набор по п. 10, в котором реагентом, узнающим гемагглютинин, является производное трисахарида 6’SLN.
13. Набор по п. 12, в котором производное трисахарида 6’SLN является поливалентным .
14. Набор по п. 10, в котором реагентом, узнающим нейраминидазу, является производное занамивира.
15. Набор по п. 14, в котором производное занамивира является поливалентным.
16. Применение набора по любому из п.п.10-15 для детекции вируса гриппа в пробе животного, человека и/или в пробе окружающей среды.
17. Применение по п.16, в котором проба животного и/или человека представляет собой мазки, кровь, слюну, носоглоточный смыв, аспират, мазок из носоглотки и горла, образец, взятый из дыхательных путей пациента.
PCT/RU2018/000174 2018-03-21 2018-03-21 Метод специфического выявления вируса гриппа человека WO2019182466A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000174 WO2019182466A1 (ru) 2018-03-21 2018-03-21 Метод специфического выявления вируса гриппа человека

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2018/000174 WO2019182466A1 (ru) 2018-03-21 2018-03-21 Метод специфического выявления вируса гриппа человека

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019182466A1 true WO2019182466A1 (ru) 2019-09-26

Family

ID=67987468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000174 WO2019182466A1 (ru) 2018-03-21 2018-03-21 Метод специфического выявления вируса гриппа человека

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2019182466A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6627396B1 (en) * 1999-10-28 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Influenza sensor
WO2007049276A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Mnd Diagnostic Ltd. Compositions for- detecting of influenza viruses and kits and methods using same
ES2345790T3 (es) * 2006-05-18 2010-10-01 Veterinarmedizinische Universitat Wien Procedimiento de deteccion de virus de gripe.
WO2017105295A1 (ru) * 2015-12-16 2017-06-22 Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр" Блокаторы вируса гриппа

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6627396B1 (en) * 1999-10-28 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Influenza sensor
WO2007049276A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Mnd Diagnostic Ltd. Compositions for- detecting of influenza viruses and kits and methods using same
ES2345790T3 (es) * 2006-05-18 2010-10-01 Veterinarmedizinische Universitat Wien Procedimiento de deteccion de virus de gripe.
WO2017105295A1 (ru) * 2015-12-16 2017-06-22 Общество с ограниченной ответственностью "Синтавр" Блокаторы вируса гриппа

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHOLAKIA DHWANI ET AL.: "Molecular modeling and lead design of substituted zanamivir derivatives as potent anti-influenza drugs", BMC BIOINFORMATICS, vol. 17, no. 19, 2016, pages 512, XP021265234, doi:10.1186/s12859-016-1374-1 *
MOCHALOVA LARISA ET AL.: "Shift in oligosaccharide specificities of hemagglutinin and neuraminidase of influenza B viruses resistant to neuraminidase inhibitors", GLYCOCONJUGATE JOURNAL, vol. 27, no. 3, 2010, pages 321 - 327, XP019789421 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Robust and highly sensitive fluorescence approach for point-of-care virus detection based on immunomagnetic separation
Hu et al. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor
Zheng et al. Detection and differentiation of influenza viruses with glycan-functionalized gold nanoparticles
Ahmadi et al. Green chemistry and coronavirus
Shojaei et al. A review on emerging diagnostic assay for viral detection: the case of avian influenza virus
Chen et al. Dual-color fluorescence and homogeneous immunoassay for the determination of human enterovirus 71
Erdem et al. Amperometric immunosensor developed for sensitive detection of SARS-CoV-2 spike S1 protein in combined with portable device
CN102135543A (zh) 实时灵敏生物大分子检测新方法及试剂盒制备
Sajjanar et al. Peptide-activated gold nanoparticles for selective visual sensing of virus
Zhang et al. A novel enhanced substrate for label-free detection of SARS-CoV-2 based on surface-enhanced Raman scattering
Wang et al. Rapid detection of avian leukosis virus using a fluorescent microsphere immunochromatographic test strip assay
CN114107019B (zh) 一种同时检测核酸和蛋白质的微流控芯片、检测方法及用途
EP1745291A1 (en) Detection of west nile virus
Zhang et al. Second near-infrared fluorescent dye for lateral flow immunoassays rapid detection of influenza A/B virus
KR20170063000A (ko) 바이러스 특이적 핵산앱타머-나노입자 복합체를 이용한 바이러스 검출방법
EP2161576B1 (en) Method of predicting risk of acquiring influenza
Shan et al. Rapid on-site PEDV detection using homogeneous fluorescence resonance energy transfer-based ELISA
JP2002508193A (ja) インフルエンザウイルスを検出および診断するためのスクリーニングアッセイ
WO2019182466A1 (ru) Метод специфического выявления вируса гриппа человека
CN111239390A (zh) 一种新型抗原检测试剂及其制备方法
CN112255212B (zh) 检测h5n1甲型流感病毒血凝素的方法
US11609229B2 (en) Fluorescence counting system for quantifying viruses or antibodies on an immobilized metal substrate by using an antigen-antibody reaction
Xu et al. Direct conjugation of bacterial polysaccharides to proteins by squaric acid chemistry
KR101799142B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 감염진단용 형광면역진단키트
US20230116817A1 (en) Device and method for detection of viruses by xrf

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18910939

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18910939

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1