WO2019177166A1 - 糞便の保存方法 - Google Patents

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WO2019177166A1
WO2019177166A1 PCT/JP2019/011001 JP2019011001W WO2019177166A1 WO 2019177166 A1 WO2019177166 A1 WO 2019177166A1 JP 2019011001 W JP2019011001 W JP 2019011001W WO 2019177166 A1 WO2019177166 A1 WO 2019177166A1
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acid
feces
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silica gel
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慎之介 村上
伊藤　正樹
友花 森
悠一郎 西本
真嗣 福田
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株式会社メタジェン
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Definitions

  • the present invention relates to a method for storing feces.
  • Non-patent document 1 In order to stably store and appropriately analyze intestinal bacteria and intestinal metabolites contained in stool, it is desirable to freeze immediately after stool collection and maintain a temperature condition of less than 0 ° C. ( Non-patent document 1).
  • storage and transport of stool specimens by cryopreservation is very costly due to the preparation of equipment that can be frozen (especially in the case of long-term storage and transport) and power consumption for freezing.
  • precious specimens may be damaged by accidental thawing treatment of feces stored frozen, and high-accuracy evaluation by microbiome analysis and / or metabolome analysis may be difficult. Therefore, it is desired to develop a non-freezing preservation method capable of preserving fecal specimens more inexpensively and stably.
  • Non-patent Document 2 a guanidine thiocyanic acid-containing solution has been reported as a solution that can stably store genes in feces at room temperature.
  • the object of the present invention is to develop a non-freezing storage method capable of storing feces inexpensively and stably.
  • the present invention is as follows.
  • a method for preserving feces comprising drying the feces in the presence of a solid desiccant.
  • Feces are dried under the contact condition with the solid desiccant, Contact area of the fecal and solid desiccant is is 100 (mm 2 / 1g feces) above, any of the storage methods (1) to (4).
  • Feces are dried under non-contact conditions with a solid desiccant,
  • the heating device is a microwave irradiation device.
  • Fecal analysis method including: (1) drying the stool in the presence of a solid desiccant; and (2) analyzing the dried stool.
  • the intestinal bacterium is one or more microorganisms selected from the group consisting of a microorganism belonging to the order of Clostridia and a microorganism belonging to the genus Parabacteroides.
  • the intestinal bacterium is selected from the group consisting of Fermicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Actinobacteria, and Verrucomicrobia.
  • the method of [12] which is one or more kinds of microorganisms.
  • the intestinal bacterium is one or more microorganisms selected from the group consisting of Bacteroides, Brautia, Prevotella, Ruminococcus, and Barnesiellaceae There is a method of [12].
  • [16] The method according to any one of [12] to [15], wherein the substance comprises one or more substances selected from the group consisting of: (1) 2-hydroxyglutaric acid; (2) 2-hydroxypentanoic acid; (3) 2-aminobenzamide; (4) 3-methylbutyric acid; (5) 4- ( ⁇ -acetylaminoethyl) imidazole; (6) 4-methyl-5-thiazoleethanol; (7) 5-aminopentanoic acid; (8) 7-methylguanine; (9) adipic acid; (10) alanylalanine; (11) ⁇ -aminoadipic acid; (12) Anserine; (13) Aspartic acid; (14) azelaic acid; (15) butyric acid; (16) carnitine; (17) Cholic acid; (18) Choline; (19) citramalic acid; (20) citric acid; (21) citrulline; (22) deoxycholic acid; (23) diethanolamine; (24) dodecanedioic acid; (25) ⁇ -butyrobetaine
  • a sealed container comprising (a) a solid desiccant, and (b) feces under non-contact conditions with the solid desiccant.
  • a stool fixative comprising (a) one or more members containing or fixing a solid desiccant, and (b) stool in contact with the solid desiccant.
  • (a1) a first plate having a first holding surface
  • (a2) a second plate having a second holding surface
  • the feces are in contact with the solid desiccant by being sandwiched between the first and second holding surfaces arranged to face each other, And feces, is contact area between the holding surfaces containing solid desiccant 100 (mm 2 / 1g feces) or more
  • the stool fixed article [22] The stool fixed article.
  • feces can be stored inexpensively and stably. Moreover, according to this invention, feces can be dried rapidly. Furthermore, according to the present invention, since the exposure of the stool to the outside world can be reduced, the contact between the stool and the outside environment can be avoided, and the handling is easy, so that it is also suitable for the storage and transportation of the stool. Moreover, the feces preserve
  • FIG. 1 is a graph showing a 100% stacked bar graph of the analysis results at the genus level of the intestinal flora analysis results under each sampling condition.
  • Enterobacteria obtained by the non-freezing preservation method of the present invention using silica gel is shown on the far left side of “freeze-drying after freezing at ⁇ 80 ° C.” (conventional condition: lyophilization described in Non-Patent Document 1)
  • the plexus analysis results are shown.
  • FIG. 2 is a graph showing 100% stacked bar graphs of the analysis results at the portal level of the intestinal flora analysis results under each sampling condition.
  • FIG. 3 is a diagram showing an average value of weighted UniFrac distance and SD (standard deviation) with respect to storage conditions of sample feces.
  • FIG. 4 shows a comparison of metabolites extracted from the same stool specimen under different drying conditions. For each metabolite, the concentrations calculated by “freezing and drying at ⁇ 80 ° C.
  • FIG. 5 is a diagram showing a comparison (25 ° C.) of the moisture content of unfrozen stool and frozen and thawed stool with respect to the drying time. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • FIG. 6 is a graph showing the transition (4 ° C.) of the moisture content of the sample stool with respect to the drying time. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • FIG. 5 is a diagram showing a comparison (25 ° C.) of the moisture content of unfrozen stool and frozen and thawed stool with respect to the drying time. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • FIG. 7 is a diagram showing a change with time of the temperature in the stool sample when the disposable body warmer is used.
  • FIG. 8 is a diagram showing the change over time in the moisture content of sample feces sandwiched between plate-like silica gels under high temperature conditions (50 ° C. or higher). “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • FIG. 9 is a diagram showing the change over time in the moisture content of sample feces sandwiched between plate-like silica gels when heat-treated in a microwave oven. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • FIG. 8 is a diagram showing the change over time in the moisture content of sample feces sandwiched between plate-like silica gels under high temperature conditions (50 ° C. or higher). “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after ly
  • FIG. 10 is a graph showing the change over time in the moisture content of sample feces sandwiched between plate-like silica gels when the oxygen scavenger is enclosed and when it is not enclosed. “Moisture content (before treatment)” was determined from the weight difference before and after lyophilization of the same sample stool.
  • the present invention provides a method for preserving feces, including drying feces in the presence of a solid desiccant. Since the storage method of the present invention can be dried and stored without freezing the stool, the idea is different from the conventional storage method by freeze-drying of stool.
  • feces derived from any organism can be used.
  • organisms include animals, fish and insects, with animals being preferred.
  • animals include mammals, birds, reptiles, and amphibians, with mammals being preferred.
  • Mammals include, for example, primates (eg, humans, monkeys, chimpanzees), rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits), livestock and working mammals (eg, cows, pigs, sheep, Goat and horse).
  • the stool is human stool.
  • Feces can be used in any shape or state.
  • the stool when the stool is dried under contact conditions with the solid desiccant, the stool can be crushed into a flat plate shape to improve the contact area with the solid desiccant.
  • the stool can be in contact with the solid desiccant in the form of one lump or divided into a plurality of lumpes.
  • the stool When the stool is dried under non-contact conditions with the solid desiccant, the stool may be crushed to improve the ratio of the surface area to the weight of the stool, or it may be divided into multiple lumps.
  • the amount of stool used for drying in the present invention is not particularly limited, but may be appropriately set depending on whether the stool is dried with the solid desiccant under contact or non-contact conditions. it can.
  • the amount of stool is, for example, 0.01 to 10.0 g, preferably 0.02 to 5.0 g, more preferably 0.03 to 1.0 g, Even more preferably, it is 0.04 to 0.5 g, particularly preferably 0.05 to 0.3 g.
  • a small amount of stool is preferred.
  • the amount of stool is, for example, 0.01 to 1.0 g, preferably 0.01 to 0.8 g, more preferably 0.01 to 0.6 g, and still more preferably 0.01 to 0.8 g. 4 g, particularly preferably 0.01 to 0.3 g.
  • any solid desiccant can be used.
  • a solid desiccant include a water-absorbing solid desiccant and a sheet-like desiccant, and a water-absorbing solid desiccant is preferable.
  • the water-absorbing solid desiccant include silica gel, alumina silica gel, allophane, molecular sieve, zeolite, quicklime, calcium chloride, diatomaceous earth, and water-absorbing polymer.
  • silica gel, alumina silica gel, and allophane are preferable, and silica gel is more preferable.
  • the solid desiccant can be of any shape. Examples of such shapes include plates, particles (eg, solids such as spheres having a diameter of 2 to 5 mm), and powders. From the viewpoint of simple operation and the like, a plate may be used as the solid desiccant.
  • the stool can be dried under contact conditions with a solid desiccant.
  • the contact between the stool and the solid desiccant can be performed so that the drying of the stool can be sufficiently promoted.
  • the contact can be performed by appropriately setting conditions such as a contact mode, a contact area, a temperature, and a contact time.
  • the contact mode of stool and solid desiccant can be performed in any manner.
  • a plate when used as the solid desiccant, it can be performed by placing stool on the plate or by holding stool between two or more plates.
  • the stool can be covered with a large number of particles or a large amount of powder (eg, stool is buried in a large number of particles or a large amount of powder).
  • one or more members containing a solid desiccant are used as described later in the stool fixed product of the present invention, stool can be treated in the manner described later.
  • the contact between the stool and the solid desiccant can be performed so as to ensure a sufficient contact area from the viewpoint of sufficiently promoting the drying of the stool.
  • Such contact area, the type and amount of feces and solid desiccant temperature, will vary with factors such as contact time, it may be for example 100 (mm 2 / 1g feces) or more.
  • Contact area is preferably 500 (mm 2 / 1g feces) or more, more preferably 1,000 (mm 2 / 1g feces) or more, still more preferably 1,600 (mm 2 / 1g feces) or more, particularly preferably 2,000 (mm 2 / 1g feces) or may be 2,500 (mm 2 / 1g feces) or more.
  • Contact area also, 10,000 (mm 2 / 1g feces) below, 8,000 (mm 2 / 1g feces) below, 6,000 (mm 2 / 1g feces) or less, or 4,000 (mm 2 / 1g Feces) may be: More specifically, such contact area, 500 ⁇ 10,000 (mm 2 / 1g feces), 800 ⁇ 8,000 (mm 2 / 1g feces), more preferably 1,200 to 6,000 ( mm 2/1 g feces), even more preferably 1,600 ⁇ 4,000 (mm 2 / 1g feces), particularly preferably 2,000 ⁇ 4,000 (mm 2 / 1g feces) or 2,500 to 4, 000 may be a (mm 2 / 1g feces).
  • the temperature for drying can be set to a temperature at which water does not freeze (that is, a temperature exceeding 0 ° C.), but in order to achieve drying more easily, it is not heated (eg, air temperature, room temperature). Or at room temperature).
  • a temperature range of 4 ° C. or higher it has been demonstrated that feces can be sufficiently dried in a temperature range of 4 ° C. or higher. Therefore, in the present invention, feces can be dried within such a temperature range (eg, 4 to 60 ° C., 10 to 45 ° C., 15 ° C. to 37 ° C., or 20 to 35 ° C.).
  • the temperature for drying may be high.
  • the feces may be dried by heating using a heating device.
  • the heating device examples include a microwave irradiation device (eg, a microwave oven), a hot plate, and an oven.
  • a microwave irradiation device for example, a microwave oven
  • a hot plate for example, a hot plate
  • an oven for example, a microwave oven
  • a microwave irradiation device capable of instantaneously performing sterilization of microorganisms in the feces and inactivation of enzymes and drying of the feces by microwave irradiation is used.
  • the stool can be dried under non-contact conditions with a solid desiccant.
  • drying may be performed in a closed system.
  • the closed system include a sealable container (eg, tube, bottle, case).
  • the weight ratio of the stool to the solid desiccant is not particularly limited as long as the stool is sufficiently dried under non-contact conditions with the solid desiccant. It may be 10,000, preferably 0.5 to 5000, more preferably 1 to 1000, even more preferably 5 to 500, and particularly preferably 10 to 300.
  • Fecal drying may also be performed by sealing using an exterior (eg, bag, bag, sheet) under either contact or non-contact conditions.
  • a stool collection tool that has been collected is set in a container that carries a solid desiccant on the wall surface so as to be non-contact, such as a plastic bag having a high gas barrier property (eg, Ziplock (registered trademark)). It may be sealed with a simple exterior.
  • the collected stool collection tool may be protected and dried with a non-sealing protective case carrying a solid desiccant (eg, a fitting case such as a protective case at the tip of a toothbrush or a cap type case).
  • a non-sealing protective case carrying a solid desiccant (eg, a fitting case such as a protective case at the tip of a toothbrush or a cap type case).
  • any stool collection tool can be used.
  • a stick having a stool collection part at the tip of the handle (in terms of shape, one end acts as a functional part like a cotton swab or a toothbrush). May be used.
  • shape of the handle of the stool collection tool those having various shapes such as a rod shape, a spatula shape, a hook shape, a glove, and a mittens can be used.
  • the drying time varies greatly depending on factors such as the type and amount of stool and solid desiccant, temperature, etc., but according to the present invention, for example, 5 minutes or more, preferably 10 minutes or more, more preferably 20 minutes or more, and even more. It may be preferably 30 minutes or longer, particularly preferably 40 minutes or 50 minutes or longer.
  • the degree of drying of stool is not particularly limited as long as the water content is significantly reduced compared to the stool before drying, depending on factors such as the original moisture content of the stool used and the storage period desired for the stool. Different. Taking human feces (solid feces) as an example of feces, the amount of water in human feces is usually about 70 to 85% by weight. Therefore, “drying” of stool can be determined based on the decrease in the amount of water in stool to 30% by weight or less. However, since a further reduction in water content is desired for stable long-term storage of stool, the water content of dried stool is preferably 20% by weight or less, and preferably 10% by weight or less.
  • the measurement of the amount of water in the stool can be determined based on the amount of water removed by freeze-drying the stool and determining the amount of water removal from the difference in weight change before and after lyophilization.
  • the stool after the stool is dried, the stool can be stored in a dry state while maintaining contact or non-contact between the stool and the solid desiccant. Therefore, a long storage period may be set after the stool is dried.
  • a storage period for example, 1 day or more, 10 days or more, 20 days or more, 1 month or more, 3 months or more, 6 months or more, 1 year or more, or 3 years or more can be assumed. .
  • the present invention also provides a method for analyzing stool comprising: (1) drying the stool in the presence of a solid desiccant; and (2) analyzing the dried stool.
  • the above step (1) can be performed in the same manner as the preservation method of the present invention.
  • the feces obtained in the step (1) can be analyzed. Feces can be processed prior to fecal analysis.
  • a stool treatment method include a method of obtaining a suspension by crushing and suspending stool with beads.
  • any method known in the art can be used (for example, International Publication No. 2017/043087; Murakami, S. et al., '' The Consumption of Bicarbonate-Rich Mineral Water Improves). Glycemic Control. "Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine; 2015, pp.824395.).
  • the analysis may be performed on intestinal bacteria in feces.
  • Such analysis of intestinal bacteria is known as, for example, metagenome analysis, metatranscriptome analysis, and the like. Therefore, the analysis of intestinal bacteria in feces can be performed, for example, by a method such as a metagenome analysis method known in the art (eg, Non-Patent Document 1; International Publication No. 2017/043087).
  • a metagenome analysis method known in the art (eg, Non-Patent Document 1; International Publication No. 2017/043087).
  • such analysis can be performed by nucleic acid (DNA and / or RNA) extraction and extracted nucleic acid sequences.
  • intestinal bacteria in any feces in feces can be analyzed, but one or more types of intestinal bacteria as shown in Examples described later may be analyzed.
  • microorganisms belonging to the order of Clostridiales and Parabacteroides have been identified as enteric bacteria whose ratios cannot vary greatly regardless of the drying method. Therefore, from the viewpoint of comparatively and universally examining enterobacteria data regardless of the drying / preservation method, as an intestinal bacterium in feces, a microorganism belonging to the order of Clostridia, Parabacteroides (Parabacteroides) It is preferable to analyze one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms belonging to.
  • microorganisms belonging to the order of Clostridia include microorganisms belonging to the family Ruminococcaceae or the family Lachnospiraceae.
  • microorganisms belonging to the family Ruminococcaceae include, for example, the genus Ruminococcus, or the genus Faecalibacterium, the genus Acetanaerobacterium, the genus Hydrogenobacterium, and Examples include microorganisms belonging to the genus Oscillospira, Papillibacter, Ruminoclostridium, and Subdoligranum.
  • microorganisms belonging to the family Lachnospiraceae include, for example, acetomaculum, anaerostypes, butyrivibrio, coprococcus sen, and coprococcus.
  • Eisenbergiella Fusicatenibacter, Lachnoclostridium, Lachnospira, Marvinbriantia, B ), Robinsoniera genus (Robinsoniella), Rozeburia genus (Roseburia), Serimonasu genus (Sellimonas), Gerhard Torre War Shea genus (Shuttleworthia), include a microorganism belonging to the genus Taizera (Tyzzerella).
  • a conventional cryopreservation method (freezing as described in Non-Patent Document 1) is used in a non-freezing storage method other than the storage method of the present invention (eg, room temperature or storage with an RNA stabilizing reagent).
  • the preservation method of the present invention may analyze one or more types of intestinal bacteria that can ensure the same abundance ratio as in the conventional cryopreservation method.
  • enterobacteria include, for example, Fermicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, and Verrucomicrobia.
  • One or more types of microorganisms selected from the group can be mentioned.
  • Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae, and Barnesiellaceae are included.
  • microorganisms belonging to the family Bacteroidesaceae include microorganisms belonging to the genus Bacteroides.
  • microorganisms belonging to the Lacnospiraceae family include microorganisms belonging to the genus Blautia.
  • microorganisms belonging to the family Prevotellaceae include microorganisms belonging to the genus Prevotella.
  • microorganisms belonging to the family Ruminococcaceae include microorganisms belonging to the genus Ruminococcus.
  • the number of microorganisms analyzed in the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 1 or more, 2 or more, 5 or more, 10 or more, or 20 or more.
  • analysis of microorganisms can be performed at any level of eye, family, genus, or species.
  • Analysis may also be performed on material in feces.
  • metabolome analysis or the like. Therefore, the substance in feces can be obtained by a method such as a metabolome analysis method known in the art (eg, Non-Patent Document 1; Misima et al., Kidney Int. 2017 Sep; 92 (3): 634- 645; International Publication No. 2017/043087).
  • a metabolome analysis method known in the art
  • such analysis is performed by appropriately combining methods such as chromatography (eg, liquid chromatography, gas chromatography), capillary electrophoresis, mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy, matrix-assisted laser desorption / ionization, and the like. It can be carried out.
  • any substance in stool can be analyzed, but one or more substances selected from the group consisting of substances shown in Examples described later may be analyzed.
  • a substance having a small amount variation is analyzed as shown below.
  • the substance to be analyzed is preferably a substance having a fluctuation ratio of 0.3 or more among the substances described above, more preferably a substance having a fluctuation ratio of 0.4 or more, still more preferably a substance having a fluctuation ratio of 0.5 or more, Substances with a variation ratio of 0.6 or more, 0.7 or more or 0.8 or more are particularly preferred (see examples).
  • the substance to be analyzed is also preferably a substance having a fluctuation ratio of 3.0 or less, more preferably a substance having a fluctuation ratio of 2.5 or less, and even more preferably a substance having a fluctuation ratio of 2.0 or less. Substances with a variation ratio of 1.5 or less, 1.35 or less, or 1.2 or less are particularly preferred (see examples).
  • the substance to be analyzed is preferably a substance having a fluctuation ratio of 0.3 or more and 3.0 or less, more preferably a substance having a fluctuation ratio of 0.4 or more and 2.5 or less, A substance having a fluctuation ratio of 0.5 or more and 2.0 or less is more preferable, and a substance having a fluctuation ratio of 0.6 or more and 1.5 or less, 0.7 or more and 1.35 or less, or 0.8 or more and 1.2 or less Is particularly preferred (see examples).
  • data can be compared by considering factors such as the variation ratio depending on the drying method. Or you may analyze the specific substance by which the relationship between health and intestinal bacteria is known or suggested.
  • Examples of such specific substances include short chain fatty acids (eg, propionic acid, butyric acid) having 6 or less carbon atoms, bile acids (eg, cholic acid, deoxycholic acid), and trimethylamine.
  • the number of substances analyzed in the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 1 or more, 2 or more, 5 or more, 10 or more, 20 or more, 50 or more, or 100 or more. .
  • the present invention provides an object that can be suitably used in the storage method of the present invention.
  • the thing that can be suitably used in the storage method of the present invention is a sealed container containing (a) a solid desiccant and (b) feces under non-contact conditions with the solid desiccant.
  • a sealed container is useful for suitably drying and storing feces under non-contact conditions with a solid desiccant.
  • the solid desiccant, feces, and sealed container are as described above.
  • the weight ratio of stool to solid desiccant in a closed container is not particularly limited as long as the stool is sufficiently dried under non-contact conditions with the solid desiccant, for example, 0.1 to 10,000, Preferably, it may be 0.5 to 5000, more preferably 1 to 1000, even more preferably 5 to 500, and particularly preferably 10 to 300.
  • an object that can be suitably used in the storage method of the present invention comprises (a) one or more members containing or fixing a solid desiccant, and (b) feces, and the feces are solid.
  • a stool fixture in contact with the desiccant is useful for suitably drying and storing the stool under contact conditions with a solid desiccant.
  • the solid desiccant, feces, and sealed container are as described above.
  • the member containing the solid desiccant may be a molded member of the solid desiccant consisting essentially of the solid desiccant, or a member composed of a mixture of the solid desiccant and other materials. May be. Examples and preferred examples of the solid desiccant are as described above. Any other material that can hold a solid desiccant can be used as the other material. Examples of such other materials include metals, plastics, glass, membranes, and filters. From the viewpoint of use of a simple member, the member containing the solid desiccant may be a solid desiccant molded member consisting essentially of the solid desiccant.
  • any member that can fix or contain stool or can be adsorbed to stool can be used.
  • a member examples include an object that can fix stool (eg, a plate), an object that can be adsorbed on stool (eg, a particle), an object that can accommodate stool (eg, a quadrangular prism, a cylinder, a triangular prism, etc.
  • Examples include containers having a form (eg, tubes, bottles, cases) and stool collection tools as described above.
  • the number of members is not particularly limited as long as it is 1 or more, and varies depending on the type. For example, when the member is a plate, for example, one or two plates can be used.
  • the member when the member is a particle, a sufficient number of particles can be used to cover the stool.
  • the stool When the member is a container, the stool may be accommodated in one container, or the stool may be divided and then individually accommodated in a plurality of containers.
  • each member When two or more members are used, each member may be the same or different.
  • a recess is provided in a predetermined part of one plate so that feces can be easily accommodated in the predetermined part, and a recess is not provided in the other plate. It may be used to play a role like a lid. From the viewpoint of simple operation and ease of handling, a plate may be used as the member.
  • the stool fixed object is sealed using an exterior as described above.
  • a member containing a solid desiccant a member having a stool holding surface and containing a solid desiccant on the holding surface can be used.
  • a member having a stool holding surface and containing a solid desiccant on the holding surface examples include a plate, a container, and a stool collection tool. From the viewpoint of more easily preparing / obtaining a member containing a solid desiccant, a plate is preferable.
  • the stool fixture of the present invention comprises (a1) a first plate having a first holding surface, (a2) a second plate having a second holding surface, and (b) stool.
  • the stool is in contact with the solid desiccant by being sandwiched between the first and second holding surfaces arranged to face each other, and the stool and the holding surface containing the solid desiccant contact area may be not 100 (mm 2 / 1g feces) or more.
  • Such a stool fixed object can hold
  • water can be absorbed efficiently, and the stool can be dried quickly.
  • feces are sandwiched between the first and second plates (first and second holding surfaces), and the feces are less exposed to the outside environment. Therefore, the contact between the stool and the outside environment can be avoided, and it is easy to handle, so that it is also suitable for storing and transporting the stool.
  • the plate described above may be a molded member of a solid desiccant, or may be a member composed of a mixture of a solid desiccant and other materials, but from the viewpoint of using a simple member, etc.
  • the molded member may be a solid desiccant.
  • the plate is preferably a water-absorbing solid desiccant plate, more preferably a silica gel plate.
  • the plates may be the same as or different from each other as described above, but are preferably the same from the viewpoint of general purpose of a uniform plate. .
  • the thickness of the plate can exhibit, for example, a function as a desiccant (e.g., water absorption), and can have a thickness that can secure an appropriate hardness from the viewpoint of ease of handling.
  • a thickness is, for example, 1.0 mm or more, preferably 1.5 mm or more, more preferably 2.0 mm or more, even more preferably 2.5 mm or more, and particularly preferably 3.0 mm or more.
  • the thickness may also be 10 mm or less, 8 mm or less, 6 mm or less, or 5 mm or less.
  • the length and width of the plate can be determined as appropriate according to factors such as the amount of feces held between the two plates.
  • the length and width may be the same (ie, regular square) or different (ie, rectangular).
  • the plate may have any length and width, but may be, for example, 5 mm or more, preferably 20 mm or more, more preferably 30 mm or more.
  • the length and width of the plate may also be 1000 mm or less, 500 mm or less, 250 mm or less, 150 mm or less, or 100 mm or less, respectively.
  • the thickness of the stool sandwiched between the two plates (holding surfaces) is not particularly limited as long as the stool can be dried (eg, as long as the movement of moisture from the inside of the stool (water absorption) is not impaired), for example, 30 mm or less, It may be preferably 15 mm or less, more preferably 5 mm or less, even more preferably 4 mm or less, and particularly preferably 2 mm or less. From the viewpoint of storing a large amount of feces using a plate having a length and width as short as possible and collecting feces having an appropriate thickness (improving the efficiency of collecting dried feces), the thickness of the feces pinched is, for example, 0.1 mm.
  • the thickness may be 1.0 mm or more, more preferably 1.5 mm or more, even more preferably 1.7 mm or more, and particularly preferably 2.0 mm or more.
  • the above-described preferred stool fixed material of the present invention has the first and second holding surfaces arranged so as to face each other from the viewpoint of strict control of the thickness of the stool held by two plates (holding surfaces).
  • a spacer may be further provided in between.
  • the spacer can be set to have a thickness that matches the desired fecal thickness.
  • the spacer can have the dimensions described above for fecal thickness.
  • a plurality eg, 2 to 4
  • the spacers may be clamped by two plates (holding surfaces) on both sides of the clamped feces.
  • spacers When three spacers are used, they may be clamped by two plates (holding surfaces) at the position of an equilateral triangle centered on the clamped feces. When four spacers are used, the four plates (holding surfaces) may be sandwiched by the two plates (holding surfaces) on four sides along the length and width of the two plates (holding surfaces). The use of such four spacers allows the feces to be isolated from the outside environment in addition to strict control of the fecal thickness.
  • (material) (1) Water-absorbing desiccant (a) Desiccant (Power Dry Ultra / X) Obtained from Daybreak Trading. This desiccant is a water-absorbing desiccant containing an inert water-absorbing polymer and calcium chloride (CaCl) as components. (B) Granular silica gel Obtained from Kanto Chemical Co., Inc. Silica gel NeoBLUE (registered trademark) (medium grain) 500 g Cat. No.
  • Example 1 Sample fecal drying test using granular silica gel 1-1. Examination of drying conditions using power dry The experiment was performed as follows. (1) Sample feces were weighed into two 30 mL tubes (labcon). (2) 1.27 g of power dry was applied to a sample stool, accommodated in a 30 mL tube (labcon), and allowed to stand at room temperature (25 ° C.). Power dry and sample feces are sealed in the same closed space (30 mL tube) under contact conditions. (3) After about 20 hours, the package was opened and the state of the sample stool was observed.
  • the experiment was conducted as follows. (1) The sample feces was sufficiently dried using granular silica gel. (2) A sufficiently dry, hard sample stool was crushed with beads. More specifically, the sample stool taken out and four ⁇ 3 mm zirconia beads (TOMY) are sealed in a 2 mL crushing tube, and shake crushing is performed using a shake master NEO (manufactured by Biomedical Science) under conditions of 1500 rpm and 10 min. Tried. (3) The lid of the crushing tube was opened and the contents were observed.
  • TOMY ⁇ 3 mm zirconia beads
  • this method was considered to be effective as a method for crushing non-lyophilized material of sample feces.
  • this method it was confirmed that a lump having a size of about 1-2 mm remained after the sample feces were crushed.
  • the amount of powdery sample stool necessary for analysis can be obtained by this method, there is room for improvement from the viewpoint of obtaining uniform analysis data.
  • Example 2 Examination of the effects of sample stool drying / storage conditions on the results of intestinal flora analysis DNA extraction from sample stool dried and stored at room temperature using various techniques, and results of intestinal flora analysis was compared with the existing method (Non-Patent Document 1).
  • Intestinal bacterial flora was analyzed by performing DNA extraction and 16S rRNA library preparation and sequence analysis in the same manner as described in the previous report (Non-patent Document 1).
  • Any microorganism whose ratio did not vary greatly depending on the storage conditions belongs to the order of Clostridiae and Parabacteroides, considering the relationship between the eyes, families and genera. Therefore, such microorganism analysis is considered to be a reliable indicator that does not depend on the drying method.
  • the non-freezing preservation method for example, room temperature or storage with an RNA stabilizing reagent
  • the conventional cryopreservation method freeze-drying
  • intestinal bacteria that can ensure the same abundance ratio as in the conventional cryopreservation method
  • Fermicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Actinobacteria Microorganisms belonging to (Actinobacteria) and Verrucomicrobia were found (FIGS. 1 and 2).
  • the microorganisms belonging to the above-mentioned genus include at least microorganisms belonging to the genus Bacteroides, Brautia, Prevotella, Ruminococcus, and Barnesiellaceae Was confirmed (FIG. 1).
  • Example 3 Examination of the influence of drying and storage conditions of sample feces on the analysis results of metabolites in the intestinal flora Among the conditions described in Table 1, sample numbers 01 to 08, 13, and 14 Metabolite extraction was performed in the same manner as described in 2017/043087. In addition, in order to compare the difference in metabolite concentration between sample number 02 “freeze-dried after ⁇ 80 ° C. and freeze-dried_5 days” (conventional conditions) and sample number 14 “silica gel_5 days” (conditions of the present invention), The concentration of each metabolite under the two conditions is shown in a scatter diagram (FIG. 4).
  • the 85 metabolites detected under both the conditions of “freezing and drying at ⁇ 80 ° C. and then freeze-dried_5 days” (conventional conditions) and “silica gel_5 days” (conditions of the present invention) are expressed by the formula ( According to 1), the variation ratio of the number of moles per 1 g (dry weight) of sample feces (nmol / g) was determined, and how much the metabolite changed when silica gel was used was calculated.
  • metabolites with small fluctuations were clarified regardless of the drying method.
  • metabolite groups with small variations in quantity include short-chain fatty acids (eg, propionic acid, butyrate), bile acids (eg, cholic acid, deoxycholic acid (DCA). )], Trimethylamine was found.
  • short-chain fatty acids eg, propionic acid, butyrate
  • bile acids eg, cholic acid, deoxycholic acid (DCA).
  • DCA deoxycholic acid
  • Example 4 Fecal drying test using plate-like silica gel 4-1. Purpose Examples 1 to 3 show that removal of water is effective for stably storing DNA and metabolites in sample feces. Although it was shown that contact between the sample stool and granular silica gel was effective for sufficient drying in the course of the experiment, the sample stool after drying was adhered to the granular silica gel, and separation was complicated. Considering the practical application of this method, the operation of bringing the granular silica gel into close contact with the sample stool is not easy to handle because the granular silica gel may spill out of the container. Therefore, attention was paid to plate-like silica gel obtained by forming silica gel fine powder into a plate shape.
  • a sufficiently large plate-like silica gel can contact the sample stool with only two from the top and bottom. Further, since the plate-like silica gel has a smooth surface, it is expected that it can be easily peeled after drying the sample stool.
  • the contact area between the sample feces and the silica gel on one side of the plate-like silica gel to which the feces adhered was estimated to be about 1350 mm 2 .
  • the contact area when about 1 g of sample stool was sandwiched between two flat plates of 60 mm ⁇ 40 mm was estimated to be about 2700 mm 2 .
  • the platy silica gel used was the easiest to handle among the materials used so far.
  • the sample stool was sufficiently dry after 6 hours.
  • Granular silica gel was difficult to remove silica gel from stool after drying, but plate-like silica gel could be easily separated from sample stool by scraping off using a metal spatula. Thereafter, the conditions of sample fecal drying when plate-like silica gel was used were examined.
  • sample fecal drying experiments using plate-like silica gel were repeated. If sample stool that has been frozen and thawed can be handled in the same way as unfrozen sample stool, it is considered that sample stool can be stably supplied. The sample was dried and the weight change of the sample was examined over time.
  • the experiment was conducted as follows. [1] About 1 g of sample stool was previously weighed into a stool tube and freeze-dried. The ratio of moisture contained in feces was calculated by measuring the weight before and after lyophilization. [2] The same sample stool as the sample stool used in the above step [1] was weighed to be about 1 g using a spatula and a measuring cup. [3] The weighed stool was placed near the center of one plate-like silica gel (30 mm ⁇ 40 mm ⁇ 3.2 mm), and shaped with a spatula according to the shape of the plate-like silica gel. [4] Two pieces of plastic pieces having a height of 2 mm were arranged as spacers around the stool.
  • step [7] the stool was allowed to stand in the refrigerator (4 ° C.). The samples were allowed to stand for 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300, 540, and 720 minutes, and one sample was prepared for each treatment time.
  • the weighed stool was placed near the center of one plate-like silica gel (30 mm ⁇ 40 mm ⁇ 3.2 mm) and shaped with a spatula according to the shape of the plate-like silica gel.
  • Two spacers (height: 2 mm) were placed around the stool.
  • the stool was sandwiched with another plate-like silica gel and lightly pressed to the height of the spacer.
  • a piece of feces sandwiched between plate-like silica gels was sealed in a Unipack (manufactured by Japan Production Co., Ltd., E-8) and sealed with air removed as much as possible.
  • the experiment was conducted as follows. [1] A sample stool was weighed in advance into a stool collection tube and freeze-dried. The ratio of moisture contained in feces was calculated by measuring the weight before and after lyophilization. [2] The same sample stool as the sample stool used in the above step [1] was weighed to be approximately 1 g using a spatula and a measuring cup. [3] The weighed stool was placed near the center of one plate-like silica gel (30 mm ⁇ 40 mm ⁇ 3.2 mm), and shaped with a spatula according to the shape of the plate-like silica gel. [4] Two spacers (height: 2 mm) were placed around the stool.
  • the stool was sandwiched with another plate of silica gel and lightly pressed to the height of the spacer.
  • a piece of feces sandwiched between plate-like silica gels was sealed in a Unipack (manufactured by Production Japan Co., Ltd., E-8) and sealed with the air removed as much as possible.
  • the sample was allowed to stand in the center of the microwave oven, heated for 10, 20, and 30 seconds at an output of 500 W. One sample was prepared for each treatment time, and a total of three samples were opened at each time point.
  • the experiment was conducted as follows. [1] A sample stool was weighed in advance into a stool collection tube and freeze-dried. The ratio of moisture contained in feces was calculated by measuring the weight before and after lyophilization. [2] The same sample stool as the sample stool used in the above step [1] was weighed to be approximately 1 g using a spatula and a measuring cup. [3] The weighed stool was placed near the center of one plate-like silica gel (30 mm ⁇ 40 mm ⁇ 3.2 mm), and shaped with a spatula according to the shape of the plate-like silica gel. [4] Two spacers (height: 2 mm) were placed around the stool.
  • the mixture was allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 10, 30, 60, 90, and 120 minutes. Ten samples were prepared, one for each condition and treatment time, and opened at each time point. [8] The lami zip stand type was opened, the sample was peeled off, and the stool was peeled off from the measuring cup by scraping off the silica gel using the flat side of the spatula. [9] The weight of the removed stool was measured and recorded.
  • the experiment was conducted as follows. [1] Approximately 2 grams of dried granular silica gel was added to the bottom of a stool collection tube in which a rod-like stool collection unit was connected to a screw cap. [2] A ring-shaped paper tape inner surface coated with granular silica gel was laminated on a stool collection tube. [3] The sample stool was previously weighed into a stool collection tube and freeze-dried. The ratio of moisture contained in feces was calculated by measuring the weight before and after lyophilization. [4] The weight of the stool collection tube containing silica gel was measured in advance, and the weight before and after stool collection was measured to calculate the stool collection weight.
  • Example 5 Cultivation experiment of microorganisms contained in stool after drying Cultivation experiment was conducted using stool immediately after excretion, frozen stool, freeze-dried stool, and stool dried on silica gel. The culture experiment was performed as follows. [1] Each sample stool was suspended in a phosphate buffer. At this time, suspensions were prepared so that the weights of fecal elements were equal. That is, considering the water content of stool, 20 mg of stool immediately after excretion and 6 mg of silica gel-dried stool were suspended in 1 mL of phosphate buffer.
  • the fecal drying method using silica gel is effective as a method for preserving microorganisms aiming at utilization in addition to preservation of genetic information and metabolites in feces.
  • the present invention is useful for the preservation and analysis of feces and microorganisms contained therein.

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Abstract

本発明は、糞便を安価かつ安定的に保存できる非凍結保存方法を提供する。より具体的には、本発明は、（Ａ）糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させることを含む、糞便の保存方法；（Ｂ）（ａ）固形乾燥剤、および（ｂ）固形乾燥剤と非接触条件下にある糞便を含む密封容器；（Ｃ）（ａ）固形乾燥剤を含有または固定する１以上の部材、および（ｂ）固形乾燥剤と接触条件下にある糞便を備える、糞便固定物を提供する。固形乾燥剤としては、シリカゲル等の吸水性固形乾燥剤が好ましい。

Description

糞便の保存方法
　本発明は、糞便の保存方法などに関する。
　ヒトの腸管内には多くの腸内細菌が存在しており、複雑な腸内細菌叢を形成している。近年、腸内細菌叢は、ヒトにおける種々の生理学的機能および疾患に関与し得ることが報告されている。したがって、腸内細菌を定性的および定量的に評価するマイクロバイオーム解析（例、メタゲノム解析、メタトランスクリプトーム解析）、ならびに腸内代謝物質を定性的および定量的に評価するメタボローム解析の双方に糞便を供し、それにより得られた情報を統合的に解析することで、腸内環境の評価が可能になると期待されている。
　ところで、糞便中に含まれる腸内細菌および腸内代謝物質を安定的に保存し、適切に解析するためには、採糞便直後に凍結し、０℃未満の温度条件を維持することが望ましい（非特許文献１）。しかしながら、凍結保存による糞便検体の保存および輸送は、凍結可能な機器の準備（特に、長期の保存および輸送の場合）、ならびに凍結のための電力消費により、多大なコストを要する。また、凍結保存された糞便の不慮の融解処理によって貴重な検体が損なわれ、マイクロバイオーム解析および／またはメタボローム解析による高精度な評価が困難になる可能性がある。したがって、糞便検体をより安価かつ安定的に保存できる非凍結保存方法の開発が望まれている。
　これまでに、糞便中の遺伝子を常温で安定的に保存できる溶液として、グアニジンチオシアン酸含有溶液が報告されている（非特許文献２）。
Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ａｎｄ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，ｐｐ．８２４３９５． Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｕｔ．，２０１６，６５（９）：１５７４－５
　本発明は、糞便を安価かつ安定的に保存できる非凍結保存方法を開発することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討したところ、生物一般の代謝反応および物質の分解（例、加水分解）には水の存在が不可欠であることから、糞便中の水分を除くことが排糞便直後の代謝物質組成の保持に有効であることを着想した。そこで、本発明者らは、糞便中の水分を除くために種々の乾燥法を検討したところ、固形乾燥剤を用いた乾燥が、従来技術（グアニジンチオシアン酸含有溶液）よりも糞便中の遺伝子を安定的に保存できることを見出した（図１～３）。
　しかも、従来技術（グアニジンチオシアン酸含有溶液）で糞便検体を保存すると、塩濃度の関係で、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）－飛行時間型質量分析（ＴＯＦＭＳ）によるイオン性代謝物質の解析が非常に困難であるという問題があったところ、本発明によれば、塩濃度の調節が不要であるため、塩濃度に伴う上記問題を解決することもできると考えられる。
　本発明者らは、上述した知見に基づき、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させることを含む、糞便の保存方法。
〔２〕糞便が動物、魚類または昆虫の糞便である、〔１〕の保存方法。
〔３〕固形乾燥剤が吸水性固形乾燥剤である、〔１〕または〔２〕の保存方法。
〔４〕吸水性固形乾燥剤がシリカゲルである、〔３〕の保存方法。
〔５〕固形乾燥剤との接触条件下で糞便の乾燥が行われ、
　糞便および固形乾燥剤の接触面積が１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上である、〔１〕～〔４〕のいずれかの保存方法。
〔６〕固形乾燥剤との非接触条件下で糞便の乾燥が行われ、
　固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）が０．１～１００００である、〔１〕～〔４〕のいずれかの保存方法。
〔７〕乾燥が０℃を超える温度で行われる、〔１〕～〔６〕のいずれかの保存方法。
〔８〕乾燥が４～６０℃で行われる、〔７〕の保存方法。
〔９〕乾燥が加熱機器を用いる加熱により行われる、〔７〕の保存方法。
〔１０〕加熱機器がマイクロ波照射機器である、〔９〕の保存方法。
〔１１〕以下を含む、糞便の解析方法：
（１）糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させること；および
（２）乾燥した糞便を解析すること。
〔１２〕解析が、糞便中の腸内細菌および／または物質に対して行われる、〔１１〕の方法。
〔１３〕腸内細菌が、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）に属する微生物、およびパラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する微生物からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、〔１２〕の方法。
〔１４〕腸内細菌が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、〔１２〕の方法。
〔１５〕腸内細菌が、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、〔１２〕の方法。
〔１６〕物質が、以下からなる群より選ばれる１種以上の物質を含む、〔１２〕～〔１５〕のいずれか一項記載の方法：
（１）２－ヒドロキシグルタル酸；
（２）２－ヒドロキシペンタン酸；
（３）２－アミノベンズアミド；
（４）３－メチル酪酸；
（５）４－（β－アセチルアミノエチル）イミダゾール；
（６）４－メチル－５－チアゾールエタノール；
（７）５－アミノペンタン酸；
（８）７－メチルグアニン；
（９）アジピン酸；
（１０）アラニルアラニン；
（１１）α－アミノアジピン酸；
（１２）アンセリン；
（１３）アスパラギン酸；
（１４）アゼライン酸；
（１５）酪酸；
（１６）カルニチン；
（１７）コール酸；
（１８）コリン；
（１９）シトラマル酸；
（２０）クエン酸；
（２１）シトルリン；
（２２）デオキシコール酸；
（２３）ジエタノールアミン；
（２４）ドデカン二酸；
（２５）γ－ブチロベタイン；
（２６）グルタミン酸；
（２７）グルタル酸；
（２８）グリシルロイシン；
（２９）グリセロリン酸；
（３０）グリコール酸；
（３１）グアニン；
（３２）ヘキサン酸；
（３３）ヒスタミン；
（３４）ホモセリン；
（３５）ヒポキサンチン；
（３６）イミダゾール－４－酢酸；
（３７）イソプロパノールアミン；
（３８）乳酸；
（３９）リジン；
（４０）リンゴ酸；
（４１）マロン酸；
（４２）メチオニン；
（４３）Ｎ－アセチルアスパラギン酸；
（４４）Ｎ－アセチルグルタミン酸；
（４５）Ｎ－メチルアラニン；
（４６）Ｎ－メチルグルタミン酸；
（４７）Ｎ１－アセチルスペルミジン；
（４８）Ｎ１，Ｎ８－ジアセチルスペルミジン；
（４９）オルニチン；
（５０）ペラルゴン酸；
（５１）ペンタン酸；
（５２）フタル酸；
（５３）ピメリン酸；
（５４）ピペコリン酸；
（５５）プロリン；
（５６）プロリンベタイン；
（５７）プロピオン酸；
（５８）ピリドキサミン；
（５９）セバシン酸；
（６０）セリン；
（６１）コハク酸；
（６２）テレフタル酸；
（６３）チアミン；
（６４）トリゴネリン；
（６５）トリメチルアミン；および
（６６）トリプトファン。
〔１７〕（ａ）固形乾燥剤、および（ｂ）固形乾燥剤と非接触条件下にある糞便を含む、密封容器。
〔１８〕固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）が０．１～１００００である、〔１７〕の密封容器。
〔１９〕固形乾燥剤が吸水性固形乾燥剤である、〔１７〕または〔１８〕の密封容器。
〔２０〕吸水性固形乾燥剤がシリカゲルである、〔１９〕の密封容器。
〔２１〕糞便が乾燥している、〔１７〕～〔２０〕のいずれかの密封容器。
〔２２〕（ａ）固形乾燥剤を含有または固定する１以上の部材、および（ｂ）固形乾燥剤と接触条件下にある糞便を備える、糞便固定物。
〔２３〕（ａ１）第１の保持面を有する第１のプレート、（ａ２）第２の保持面を有する第２のプレート、および（ｂ）糞便を備えており、
　糞便が、互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に挟持されることにより、固形乾燥剤と接触しており、
　糞便と、固形乾燥剤を含有する保持面との接触面積が１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上である、
　〔２２〕の糞便固定物。
〔２４〕互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に（ｃ）スペーサーをさらに備える、〔２２〕または〔２３〕の糞便固定物。
〔２５〕第１の部材および第２の部材の少なくとも一方が吸水性固形乾燥剤プレートである、〔２２〕～〔２４〕のいずれかの糞便固定物。
〔２６〕前記吸水性固形乾燥剤プレートがシリカゲルプレートである、〔２５〕の糞便固定物。
〔２７〕糞便が乾燥している、〔２２〕～〔２６〕のいずれかの糞便固定物。
　本発明によれば、糞便を安価かつ安定的に保存することができる。また、本発明によれば、糞便を迅速に乾燥させることができる。さらに、本発明によれば、糞便の外界への露出を少なくできることから、糞便と外界環境との接触を回避でき、取扱い易いため、糞便の保管および輸送にも適している。
　また、本発明により保存された糞便は、マイクロバイオーム解析およびメタボローム解析の双方に好適に使用することができる。
図１は、各サンプリング条件における腸内細菌叢解析結果の属レベルでの解析結果について１００％積み上げ棒グラフを示す図である。「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥」（従来条件：非特許文献１に記載される凍結乾燥）を最も左側に示し、次いでシリカゲルを用いる本発明の非凍結保存方法により得られた腸内細菌叢解析結果を示す。 図２は、各サンプリング条件における腸内細菌叢解析結果の門レベルでの解析結果について１００％積み上げ棒グラフを示す図である。 図３は、試料糞便の保存条件に対するｗｅｉｇｈｔｅｄ　ＵｎｉＦｒａｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅの平均値およびＳＤ（標準偏差）を示す図である。同一の糞便検体を様々な保存条件に置いた後、ＤＮＡ抽出を行って細菌叢解析を実施した。各保存条件は３サンプルずつ実施した。グラフは、「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿１日」の３サンプルと、各条件の３サンプルの総当り（ｎ＝９）におけるｗｅｉｇｈｔｅｄ　ＵｎｉＦｒａｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅの平均値およびＳＤ（標準偏差）を示す。「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿１日」の棒グラフのみは、同一サンプル間の距離を除外したｎ＝６の平均値および標準偏差である。 図４は、異なる乾燥条件下で同一の糞便検体から抽出された代謝物質の比較を示す図である。各代謝物質について、「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日」（従来条件）および「シリカゲル＿５日」（本発明の条件）で算出された濃度を散布図で表した。 図５は、乾燥時間に対する未凍結糞便と凍結融解糞便の水分含有率の比較（２５℃）を示す図である。「水分含有率（処理前）」は、同一の試料糞便の凍結乾燥前後の重量差から求めた。 図６は、乾燥時間に対する試料糞便の水分含有率の推移（４℃）を示す図である。「水分含有率（処理前）」は、同一の試料糞便の凍結乾燥前後の重量差から求めた。 図７は、使い捨てカイロを用いた際の、糞便試料中温度の経時変化を示す図である。 図８は、高温条件（５０℃以上）における、板状シリカゲルに挟んだ試料糞便の水分含有率の経時変化を示す図である。「水分含有率（処理前）」は、同一の試料糞便の凍結乾燥前後の重量差から求めた。 図９は、電子レンジ中で加熱処理した場合における、板状シリカゲルに挟んだ試料糞便の水分含有率の経時変化を示す図である。「水分含有率（処理前）」は、同一の試料糞便の凍結乾燥前後の重量差から求めた。 図１０は、脱酸素剤封入時と未封入時における、板状シリカゲルに挟んだ試料糞便の水分含有率の経時変化を示す図である。「水分含有率（処理前）」は、同一の試料糞便の凍結乾燥前後の重量差から求めた。
　本発明は、糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させることを含む、糞便の保存方法を提供する。本発明の保存方法は、糞便を凍結させることなく乾燥して保存することができるので、糞便の凍結乾燥による従来の保存方法とは思想が異なる。
　糞便としては、任意の生物由来の糞便を用いることができる。このような生物としては、例えば、動物、魚類、昆虫が挙げられるが動物が好ましい。動物としては、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類が挙げられるが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。好ましくは、糞便は、ヒト糞便である。
　糞便は、任意の形状または状態において用いることができる。例えば、糞便が固形乾燥剤と接触条件下で乾燥される場合、糞便は、固形乾燥剤との接触面積を向上させるために、平板状に押しつぶして用いることができる。また、糞便は、一つの塊の状態、または複数の塊に分断された状態において、固形乾燥剤と接触することができる。糞便が固形乾燥剤と非接触条件下で乾燥される場合、糞便は、糞便の重量に対する表面積の割合を向上させるように押しつぶしてもよく、または、複数の塊に分断されてもよい。
　本発明において乾燥に用いられる糞便の量は、特に限定されるものではないが、糞便が固形乾燥剤と接触条件下または非接触条件下のいずれで乾燥されるかに応じて適宜設定することができる。糞便が固形乾燥剤と接触条件下で乾燥される場合、糞便の量は、例えば０．０１～１０．０ｇ、好ましくは０．０２～５．０ｇ、より好ましくは０．０３～１．０ｇ、さらにより好ましくは０．０４～０．５ｇ、特に好ましくは０．０５～０．３ｇである。糞便が固形乾燥剤と非接触条件下で乾燥される場合、糞便は少量が好ましい。このような場合、糞便の量は、例えば０．０１～１．０ｇ、好ましくは０．０１～０．８ｇ、より好ましくは０．０１～０．６ｇ、さらにより好ましくは０．０１～０．４ｇ、特に好ましくは０．０１～０．３ｇである。
　固形乾燥剤としては、例えば、任意の固形乾燥剤を用いることができる。このような固形乾燥剤としては、例えば、吸水性固形乾燥剤、シート状乾燥剤が挙げられるが、吸水性固形乾燥剤が好ましい。吸水性固形乾燥剤としては、例えば、シリカゲル、アルミナシリカゲル、アロフェン、モレキュラーシーブ、ゼオライト、生石灰、塩化カルシウム、珪藻土、吸水ポリマーが挙げられる。吸水性固形乾燥剤のなかでも、シリカゲル、アルミナシリカゲル、アロフェンが好ましく、シリカゲルがより好ましい。
　固形乾燥剤は、任意の形状のものを用いることができる。このような形状としては、例えば、プレート、粒子（例、直径２～５ｍｍである球状物等の固形物）、粉末が挙げられる。簡便な操作等の観点からは、固形乾燥剤として、プレートを用いてもよい。
　一実施形態では、糞便の乾燥は、固形乾燥剤との接触条件下で行うことができる。このような場合、糞便および固形乾燥剤の接触は、糞便の乾燥を十分に促進できるように行うことができる。例えば、接触は、接触様式、接触面積、温度、および接触時間等の条件を適宜設定することにより行うことができる。
　糞便および固形乾燥剤の接触様式は、任意の様式で行うことができる。例えば、固形乾燥剤としてプレートが用いられる場合には、プレート上に糞便を載置することにより、あるいは２以上のプレート間に糞便を挟持することにより行うことができる。固形乾燥剤として、粒子または粉末を用いる場合には、多数の粒子または多量の粉末で糞便を覆うこと（例、多数の粒子または多量の粉末中に糞便を埋没させること）により行うことができる。また、本発明の糞便固定物において後述するような、固形乾燥剤を含有する１以上の部材が用いられる場合には、後述する様式において、糞便を処理することができる。
　糞便および固形乾燥剤の接触は、糞便の乾燥を十分に促進する観点から、十分な接触面積が確保されるように行うことができる。このような接触面積は、糞便および固形乾燥剤の種類および量、温度、接触期間等の因子によって変動するが、例えば１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上であってもよい。接触面積は、好ましくは５００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上、より好ましくは１，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上、さらにより好ましくは１，６００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上、特に好ましくは２，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）または２，５００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上であってもよい。接触面積はまた、１０，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以下、８，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以下、６，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以下、または４，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以下であってもよい。より具体的には、このような接触面積は、５００～１０，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）、８００～８，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）、より好ましくは１，２００～６，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）、さらにより好ましくは１，６００～４，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）、特に好ましくは２，０００～４，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）または２，５００～４，０００（ｍｍ２／１ｇ糞便）であってもよい。
　乾燥のための温度は、水が凍結しない温度（すなわち、０℃を超える温度）に設定することができるが、より簡便に乾燥を達成するためには、非加熱条件下（例、気温、室温または常温）で行うことができる。本発明の保存方法によれば、４℃以上の温度範囲において糞便を十分に乾燥できることが実証されている。したがって、本発明では、このような温度範囲内（例、４～６０℃、１０～４５℃、１５℃～３７℃、または２０～３５℃）で糞便を乾燥させることができる。あるいは、乾燥のための温度は高温であってもよい。例えば、加熱機器を用いて加熱することによって糞便の乾燥を促してもよい。加熱機器としては、例えば、マイクロ波照射機器（例、電子レンジ）、ホットプレート、オーブンが挙げられる。好ましくは、乾燥機器としては、マイクロ波の照射による糞便中の微生物の死滅および酵素の失活ならびに糞便の乾燥を瞬時に行うことができるマイクロ波照射機器（例、電子レンジ）が用いられる。
　別の実施形態では、糞便の乾燥は、固形乾燥剤との非接触条件下で行うことができる。このような場合、乾燥は、閉鎖系において行われてもよい。閉鎖系としては、例えば、密封可能な容器（例、チューブ、ボトル、ケース）が挙げられる。このような場合、固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）は、糞便が固形乾燥剤との非接触条件下で十分に乾燥される限り特に限定されないが、例えば０．１～１００００、好ましくは０．５～５０００、より好ましくは１～１０００、さらにより好ましくは５～５００、特に好ましくは１０～３００であってもよい。
　糞便の乾燥はまた、接触条件または非接触条件のいずれであっても、外装（例、バック、袋、シート）を利用して密閉することにより行われてもよい。例えば、採便済の採便用具を、壁面に固形乾燥剤を担持する容器中に非接触となるようにセットしたものをガスバリア性の高いプラスチックバッグ（例、ジップロック（登録商標））のような外装で密封してもよい。あるいは、採便済の採便用具を、固形乾燥剤を担持する非密封性の保護ケース（例、歯ブラシ先端の保護ケース等のはめ込み式ケース、またはキャップ式ケース）で保護・乾燥されてもよい。採便用具としては、採便可能な任意の用具を用いることができるが、例えば、柄の先端に採便部を有する棒（形状としては、綿棒や歯ブラシのように片端が機能部として作用するもの）を利用してもよい。採便用具の持ち手の形状としては、棒状、ヘラ状、鋏状、手袋、ミトン等の種々の形状を備えるものを利用することができる。
　乾燥時間は、糞便および固形乾燥剤の種類および量、温度等の因子によって大きく変動するが、本発明によれば、例えば５分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは２０分以上、さらにより好ましくは３０分以上、特に好ましくは４０分または５０分以上であってもよい。
　糞便の乾燥の程度は、乾燥前の糞便に比し水分量が有意に減少する限り特に限定されず、用いた糞便の元々の水分量、および糞便について所望される保存期間等の因子に応じて異なる。糞便としてヒト糞便（固形糞便）を例に挙げて説明すると、ヒト糞便の水分量は通常、約７０～８５重量％である。したがって、糞便の「乾燥」は、糞便の水分量が３０重量％以下に減少することを基準にして判定することができる。しかしながら、糞便の安定的な長期保存のためには水分量のさらなる減少が所望されるため、乾燥した糞便の水分量は、２０重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましく、８重量％以下であることがさらにより好ましく、５重量％以下であることが特に好ましい。糞便の水分量の測定は、糞便を凍結乾燥し、凍結乾燥前後における重量変化の差分から除水分量を求めることにより、除水分量に基づき決定することができる。
　本発明の保存方法では、糞便の乾燥後、糞便および固形乾燥剤の接触または非接触が維持されたまま、糞便を乾燥状態で保存することができる。したがって、糞便の乾燥後、長期の保存期間が設定されてもよい。このような保存期間としては、例えば、１日以上、１０日以上、２０日以上、１ヶ月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または３年以上を想定することができる。
　本発明はまた、以下を含む、糞便の解析方法を提供する：
（１）糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させること；および
（２）乾燥した糞便を解析すること。
　上記（１）の工程は、本発明の保存方法と同様にして行うことができる。
　上記（２）の工程では、上記（１）の工程で得られた糞便の解析を行うことができる。糞便の解析前に、糞便を処理することができる。このような糞便の処理方法としては、例えば、糞便をビーズで破砕・懸濁処理して懸濁液を得る方法が挙げられる。このような処理方法としては、当該分野で公知の任意の方法を用いることができる（例、国際公開２０１７／０４３０８７号；Ｍｕｒａｋａｍｉ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，‘‘Ｔｈｅ　Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｒｉｃｈ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｗａｔｅｒ　Ｉｍｐｒｏｖｅｓ　Ｇｌｙｃｅｍｉｃ　Ｃｏｎｔｒｏｌ．’’　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ａｎｄ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１５，　ｐｐ．８２４３９５．）。
　例えば、解析は、糞便中の腸内細菌に対して行われてもよい。このような腸内細菌の解析は、例えば、メタゲノム解析、メタトランスクリプトーム解析等として知られている。したがって、糞便中の腸内細菌の解析は、例えば、当該分野で公知のメタゲノム解析方法等の方法により行うことができる（例、非特許文献１；国際公開２０１７／０４３０８７号）。例えば、このような解析は、核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）抽出、および抽出した核酸のシーケンスにより行うことができる。
　本発明の解析方法では、糞便中の任意の糞便中の腸内細菌を解析することができるが、後述する実施例において示されるような１種以上の腸内細菌を解析してもよい。このうち、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する微生物については、乾燥方法によらず比率が大きく変動し得ない腸内細菌として同定されている。したがって、腸内細菌のデータを乾燥・保存方法によらずシンプルかつ汎用的に比較検討する観点からは、糞便中の腸内細菌として、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）に属する微生物、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する微生物からなる群より選ばれる１種以上の微生物を解析することが好ましい。クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）に属する微生物としては、例えば、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、またはラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）に属する微生物が挙げられる。ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、またはフィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトアナエロバクテリウム属（Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ハイドロジェノアナエロバクテリウム属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オシロスピラ属（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ）、パピリバクター属（Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）、ルミノクロストリジウム属（Ｒｕｍｉｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サブドリグラニュラム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）に属する微生物が挙げられる。ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、アセチトマキュラム属（Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、アナエロスタイプ属（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、コプロコッカス属（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ドレア属（Ｄｏｒｅａ）、アーセンバージエラ属（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ）、フシカテニバクター属（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ）、ラクノクロストリジウム属（Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、マーバインブリアンティア属（Ｍａｒｖｉｎｂｒｙａｎｔｉａ）、モリエラ属（Ｍｏｒｙｅｌｌａ）、シュードブチリビブリオ属（Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ロビンソニエラ属（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、セリモナス属（Ｓｅｌｌｉｍｏｎａｓ）、シュトレウォーシア属（Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ）、タイゼラ属（Ｔｙｚｚｅｒｅｌｌａ）に属する微生物が挙げられる。
　また、本発明の解析方法では、本発明の保存方法以外の非凍結保存方法（例、常温またはＲＮＡ安定化試薬による保存）では従来の凍結保存方法（非特許文献１に記載されるような凍結乾燥）と比較して変化してしまうにも関わらず、本発明の保存方法では従来の凍結保存方法と同等の存在比率を担保できる１種以上の腸内細菌を解析してもよい。このような腸内細菌としては、例えば、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物が挙げられる。より具体的には、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）に属する微生物が挙げられる。バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する微生物が挙げられる。ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）に属する微生物が挙げられる。プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）に属する微生物が挙げられる。ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）に属する微生物としては、例えば、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。
　勿論、上記で具体的に述べた微生物以外の腸内細菌についても、乾燥方法による変動比率等の因子を考慮することで、データの比較検討が可能である。本発明において解析される微生物の数は、特に限定されないが、例えば１種以上、２種以上、５種以上、１０種以上、または２０種以上であってもよい。また、微生物の解析は、目、科、属、または種のいずれのレベルでも行うことができる。
　解析はまた、糞便中の物質に対して行われてもよい。このような物質の解析は、メタボローム解析等として知られている。したがって、糞便中の物質は、当該分野で公知のメタボローム解析方法等の方法により行うことができる（例、非特許文献１；Ｍｉｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．　２０１７　Ｓｅｐ；９２（３）：６３４－６４５；国際公開２０１７／０４３０８７号）。例えば、このような解析は、クロマトグラフィー（例、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、キャピラリー電気泳動、質量分析法、核磁気共鳴分光法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法等の方法を適宜組み合わせて行うことができる。
　本発明の解析方法では、糞便中の任意の物質を解析することができるが、後述する実施例において示される物質からなる群より選ばれる１種以上の物質を解析してもよい。好ましくは、乾燥・保存方法にかかわらず、量の変動が小さい、以下に示されるような物質が解析される。
（１）２－ヒドロキシグルタル酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｕｔａｒａｔｅ）
（２）２－ヒドロキシペンタン酸（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎｏａｔｅ）
（３）２－アミノベンズアミド（２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ：２ＡＢ）
（４）３－メチル酪酸（３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏａｔｅ）
（５）４－（β－アセチルアミノエチル）イミダゾール〔４－（β－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌｅ〕
（６）４－メチル－５－チアゾールエタノール（４－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｔｈｉａｚｏｌｅｅｔａｎｏｌ）
（７）５－アミノペンタン酸（５－ａｍｉｎｏｖａｌｅｒａｔｅ）
（８）７－メチルグアニン（７－Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ）
（９）アジピン酸（ａｄｉｐａｔｅ）
（１０）アラニルアラニン（Ａｌａ－Ａｌａ）
（１１）α－アミノアジピン酸（α－ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ）
（１２）アンセリン（ａｎｓｅｒｉｎｅ）
（１３）アスパラギン酸（Ａｓｐ）
（１４）アゼライン酸（ａｚｅｌａｔｅ）
（１５）酪酸（ｂｕｔｙｒａｔｅ）
（１６）カルニチン（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）
（１７）コール酸（ｃｈｏｌａｔｅ）
（１８）コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）
（１９）シトラマル酸（ｃｉｔｒａｍａｌａｔｅ）
（２０）クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）
（２１）シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）
（２２）デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ：ＤＣＡ）
（２３）ジエタノールアミン（ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）
（２４）ドデカン二酸（ｄｏｄｅｃａｎｅｄｉｏａｔｅ）
（２５）γ－ブチロベタイン（γ－ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ）
（２６）グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（２７）グルタル酸（ｇｌｕｔａｒａｔｅ）
（２８）グリシルロイシン（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）
（２９）グリセロリン酸（Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
（３０）グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）
（３１）グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）
（３２）ヘキサン酸（ｈｅｘａｎｏａｔｅ）
（３３）ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）
（３４）ホモセリン（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）
（３５）ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）
（３６）イミダゾール－４－酢酸（ｉｍｉａｄｚｏｌｅ－４－ａｃｅｔａｔｅ）
（３７）イソプロパノールアミン（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌａｍｉｎｅ）
（３８）乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）
（３９）リジン（ｌｙｓｉｎｅ：Ｌｙｓ）
（４０）リンゴ酸（ｍａｌａｔｅ）
（４１）マロン酸（ｍａｌｏｎａｔｅ）
（４２）メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：Ｍｅｔ）
（４３）Ｎ－アセチルアスパラギン酸（Ｎ－ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ）
（４４）Ｎ－アセチルグルタミン酸（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）
（４５）Ｎ－メチルアラニン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）
（４６）Ｎ－メチルグルタミン酸（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）
（４７）Ｎ１－アセチルスペルミジン（Ｎ１－ａｃｅｔｙｌｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）
（４８）Ｎ１，Ｎ８－ジアセチルスペルミジン（Ｎ１，Ｎ８－ｄｉａｃｅｔｙｌｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）
（４９）オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）
（５０）ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎａｔｅ）
（５１）ペンタン酸（ｐｅｎｔａｎｏａｔｅ）
（５２）フタル酸（ｐｈｔｈａｌａｔｅ）
（５３）ピメリン酸（ｐｉｍｅｌａｔｅ）
（５４）ピペコリン酸（ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅ）
（５５）プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ：Ｐｒｏ）
（５６）プロリンベタイン（ｐｒｏｌｉｎｅ　ｂｅｔａｉｎｅ）
（５７）プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）
（５８）ピリドキサミン（ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ）
（５９）セバシン酸（ｓｅｂａｃａｔｅ）
（６０）セリン（ｓｅｒｉｎｅ：Ｓｅｒ）
（６１）コハク酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）
（６２）テレフタル酸（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）
（６３）チアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）
（６４）トリゴネリン（ｔｒｉｇｏｎｅｌｌｉｎｅ）
（６５）トリメチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
（６６）トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ：Ｔｒｐ）
これらの物質については、乾燥方法によらず量の変化が小さい代謝物質として同定されている。したがって、代謝物質のデータを乾燥・保存方法によらずシンプル、汎用的かつ信頼性が高いものとして比較検討する観点からは、糞便中の物質として、上記に示されるような１種以上の物質を解析することが好ましい。解析される物質としては、上記物質のうち変動比が０．３以上の物質が好ましく、変動比が０．４以上の物質がより好ましく、変動比が０．５以上の物質がさらにより好ましく、変動比が０．６以上、０．７以上または０．８以上の物質が特に好ましい（実施例を参照）。解析される物質としてはまた、上記物質のうち変動比が３．０以下の物質が好ましく、変動比が２．５以下の物質がより好ましく、変動比が２．０以下の物質がさらにより好ましく、変動比が１．５以下、１．３５以下、または１．２以下の物質が特に好ましい（実施例を参照）。より具体的には、解析される物質としては、上記物質のうち変動比が０．３以上３．０以下の物質が好ましく、変動比が０．４以上２．５以下の物質がより好ましく、変動比が０．５以上２．０以下の物質がさらにより好ましく、変動比が０．６以上１．５以下、０．７以上１．３５以下、または０．８以上１．２以下の物質が特に好ましい（実施例を参照）。勿論、これらの物質以外の物質についても、乾燥方法による変動比等の因子を考慮することで、データの比較検討が可能である。あるいは、健康と腸内細菌との関係が知られている、または示唆されている特定の物質を解析してもよい。このような特定の物質としては、例えば、炭素原子数６個以下である短鎖脂肪酸（例、プロピオン酸、酪酸）、胆汁酸（例、コール酸、デオキシコール酸）、トリメチルアミンが挙げられる。本発明において解析される物質の数は、特に限定されないが、例えば１種以上、２種以上、５種以上、１０種以上、２０種以上、５０種以上、または１００種以上であってもよい。
　本発明は、本発明の保存方法に好適に用いることができる物を提供する。
　一実施形態では、本発明の保存方法に好適に用いることができる物は、（ａ）固形乾燥剤、および（ｂ）固形乾燥剤と非接触条件下にある糞便を含む密封容器である。このような密閉容器は、糞便の乾燥および保存を固形乾燥剤との非接触条件下で好適に行うために有用である。固形乾燥剤、糞便、および密封容器は、上述したとおりである。
　密閉容器における固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）は、糞便が固形乾燥剤との非接触条件下で十分に乾燥される限り特に限定されないが、例えば０．１～１００００、好ましくは０．５～５０００、より好ましくは１～１０００、さらにより好ましくは５～５００、特に好ましくは１０～３００であってもよい。
　別の実施形態では、本発明の保存方法に好適に用いることができる物は、（ａ）固形乾燥剤を含有または固定する１以上の部材、および（ｂ）糞便を備えており、糞便が固形乾燥剤と接触している糞便固定物を提供する。このような糞便固定物は、糞便の乾燥および保存を固形乾燥剤との接触条件下で好適に行うために有用である。固形乾燥剤、糞便、および密封容器は、上述したとおりである。
　固形乾燥剤を含有する部材は、本質的に固形乾燥剤のみからなる、固形乾燥剤の成形部材であってもよく、また、固形乾燥剤および他の材料との混合物から構成される部材であってもよい。固形乾燥剤の例および好ましい例は、上述したとおりである。他の材料としては、固形乾燥剤を保持できる任意の材料を用いることができる。このような他の材料としては、例えば、金属、プラスチック、ガラス、膜、フィルターが挙げられる。シンプルな部材の利用等の観点から、固形乾燥剤を含有する部材は、本質的に固形乾燥剤のみからなる、固形乾燥剤の成形部材であってもよい。
　部材としては、糞便を固定もしくは収容できる、または糞便に吸着できる任意の部材を用いることができる。このような部材としては、糞便を固定可能な物（例、プレート）、糞便に吸着可能な物（例、粒子）、便を収容可能な物（例、四角柱状、円柱状、三角柱状等の形態を有する容器（例、チューブ、ボトル、ケース）、上述したような採便用具）が挙げられる。部材の数は、１以上である限り特に限定されず、その種類に応じて、変動する。例えば、部材がプレートの場合には、例えば１個または２個のプレートを用いることができる。一方、部材が粒子の場合には、糞便を覆うのに十分な個数の粒子を用いることができる。また、部材が容器の場合には、糞便を１個の容器に収容してもよいし、糞便を分割した上で、複数の容器に個別に収容してもよい。２以上の部材が用いられる場合には、それぞれの部材は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、２個のプレートが用いられる場合には、一方のプレートの所定の部位にくぼみを設けることにより、当該所定の部位に糞便を収容し易くした上で、他方のプレートにはくぼみを設けず、蓋のような役割を果たすように用いてもよい。簡便な操作および取扱い易さ等の観点からは、部材として、プレートを用いてもよい。糞便固定物は、上述したように外装を利用して密閉されることも好ましい。あるいは、糞便固定物（例、採便済の採便用具）を、上述したような非密封性の保護ケース中で保護・乾燥させることも好ましい。
　好ましくは、固形乾燥剤を含有する部材として、糞便の保持面を有する部材であって、保持面において固形乾燥剤を含有しているものを用いることができる。このような部材としては、例えば、プレート、容器、および採便用具が挙げられるが、固形乾燥剤を含有する部材をより容易に調製・入手する等の観点からは、プレートが好ましい。
　好ましくは、本発明の糞便固定物は、（ａ１）第１の保持面を有する第１のプレート、（ａ２）第２の保持面を有する第２のプレート、および（ｂ）糞便を備えており、糞便が、互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に挟持されることにより、固形乾燥剤と接触しており、糞便と、固形乾燥剤を含有する保持面との接触面積が１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上であってもよい。
　このような糞便固定物は、２個のプレートの保持面により糞便を確実に保持することができる。また、糞便および固形乾燥剤が十分な接触面積で接触しているため、効率的に吸水することができ、糞便を迅速に乾燥させることができる。さらに、糞便が第１および第２のプレート（第１および第２の保持面）間に挟持されており、糞便の外界環境への露出が少ない。したがって、糞便と外界環境との接触を回避でき、取扱い易いことから、糞便の保管および輸送にも適している。
　上述したプレートは、固形乾燥剤の成形部材であってもよく、また、固形乾燥剤および他の材料との混合物から構成される部材であってもよいが、シンプルな部材の利用等の観点から、固形乾燥剤の成形部材であってもよい。プレートは、好ましくは、吸水性固形乾燥剤プレートであり、より好ましくは、シリカゲルプレートである。第１および第２のプレートが用いられる場合、プレートは、上述したように同一であっても異なっていてもよいが、画一的なプレートの汎用等の観点からは、同一であることも好ましい。
　プレートの厚みは、例えば、乾燥剤としての機能（例、吸水性）を発揮でき、また、取扱い易さ等の観点から、適度な固さを確保できる程度の厚みを備えることができるのであれば特に限定されない。このような厚みは、例えば１．０ｍｍ以上、好ましくは１．５ｍｍ以上、より好ましくは２．０ｍｍ以上、さらにより好ましくは２．５ｍｍ以上、特に好ましくは３．０ｍｍ以上である。厚みはまた、１０ｍｍ以下、８ｍｍ以下、６ｍｍ以下、または５ｍｍ以下であってもよい。
　プレートの長さおよび幅は、２つのプレートにより挟持される糞便の量等の因子によって適宜決定することができる。例えば、長さおよび幅は、同じであってもよいし（すなわち、正四角形）、または異なっていてもよい（すなわち、長方形）。プレートの長さおよび幅はそれぞれ、任意のサイズを採用することができるが、例えば５ｍｍ以上、好ましくは２０ｍｍ以上、より好ましくは３０ｍｍ以上であってもよい。プレートの長さおよび幅はまたそれぞれ、１０００ｍｍ以下、５００ｍｍ以下、２５０ｍｍ以下、１５０ｍｍ以下、または１００ｍｍ以下であってもよい。
　２つのプレート（保持面）により挟持される糞便の厚みは、糞便を乾燥できる限り（例、糞便内部からプレートへの水分の移動（吸水）を損なわない限り）特に限定されず、例えば３０ｍｍ以下、好ましくは１５ｍｍ以下、より好ましくは５ｍｍ以下、さらにより好ましくは４ｍｍ以下、特に好ましくは２ｍｍ以下であってもよい。極力短い長さおよび幅のプレートによる多量の糞便の保存、および適度な厚みの糞便の回収（乾燥糞便の回収効率の向上）等の観点からは、挟持される糞便の厚みは、例えば０．１ｍｍ以上、好ましくは１．０ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上、さらにより好ましくは１．７ｍｍ以上、特に好ましくは２．０ｍｍ以上であってもよい。
　上述した好ましい本発明の糞便固定物は、２つのプレート（保持面）により挟持される糞便の厚みの厳密な制御等の観点から、互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に（ｃ）スペーサーをさらに備えていてもよい。スペーサーは、所望される糞便の厚みと一致する厚みを有するように設定することができる。したがって、スペーサーは、糞便の厚みについて上述した寸法を有することができる。また、スペーサーとしては、複数（例、２～４個）のスペーサーが用いられてもよい。例えば、２個のスペーサーが用いられる場合、スペーサーは、挟持された糞便の両側において、２つのプレート（保持面）により挟持されていてもよい。３個のスペーサーが用いられる場合、挟持された糞便を中心とする正三角形の位置において、２つのプレート（保持面）により挟持されていてもよい。４個のスペーサーが用いられる場合、２つのプレート（保持面）の長さおよび幅に沿う四辺において、２つのプレート（保持面）により挟持されていてもよい。このような４個のスペーサーの使用は、糞便の厚みの厳密な制御に加えて、糞便の外界環境からの隔離も可能にする。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（材料）
（１）吸水性乾燥剤
（ａ）乾燥剤（パワードライ　ウルトラ・Ｘ）
　デイブレイク・トレーディングから入手した。
　本乾燥剤は、不活性吸水ポリマーと塩化カルシウム（ＣａＣｌ）を成分として含む吸水性乾燥剤である。
（ｂ）粒状シリカゲル
　関東化学株式会社から入手した。
　シリカゲル　ＮｅｏＢＬＵＥ（登録商標）（中粒）５００ｇ　Ｃａｔ．Ｎｏ．３７４８９－０８）
（ｃ）板状シリカゲル
　トヨタプレート　不織布包装タイプ　ＴＰＦ３０４０　３０ｍｍｘ４０ｍｍ，厚み３．２ｍｍ
　トヨタプレート　裸タイプ　ＴＰ６０４０　６０ｍｍｘ４０ｍｍ，厚み３．２ｍｍ
　トヨタプレート　裸タイプ　ＴＰ３０４０　３０ｍｍｘ４０ｍｍ，厚み３．２ｍｍ
　トヨタプレート　裸タイプ　ＴＰ３０４０　３０ｍｍｘ４０ｍｍ，厚み５ｍｍ
（２）採糞便容器「スプーン型（保存液あり）」
　株式会社テクノスルガ・ラボから入手した。
試料糞便
　以降の実験では、１検体のヒト糞便を１条件あたり３個となるよう分割して用いた（すなわち、ｎ＝３）。通常、ヒト糞便の水分量は、約７０～８５重量％である。
実施例１：粒状シリカゲルを用いた試料糞便乾燥試験
１－１．パワードライを用いた乾燥条件の検討
　以下のとおり実験を行った。
（１）３０ｍＬチューブ（ｌａｂｃｏｎ）２本に試料糞便を量り取った。
（２）パワードライ１．２７ｇを試料糞便にまぶすようにして３０ｍＬチューブ（ｌａｂｃｏｎ）中に収容し、室温（２５℃）で静置した。パワードライと試料糞便は、接触条件下で同一閉鎖空間（３０ｍＬチューブ）内に封入されている。
（３）およそ２０時間後に開封し、試料糞便の様子を観察した。
　その結果、試料糞便が固くなっていたことから、接触条件下で水分が除かれたことが推察された。試料糞便の固さの程度は、金属製のスパチュラを用いた破砕を試みても、かなり力を必要とするほどであった。したがって、試料糞便の乾燥のためには、試料糞便と吸水性固形乾燥剤との接触が有効であることが実証された。
１－２．粒状シリカゲルを用いた乾燥方法の検討
　以下のとおり実験を行った。
（１）３０ｍＬチューブ（ｌａｂｃｏｎ）に粒状シリカゲルを加えて水平にならし、次いで、潰して平たくした試料糞便をその上に載せ、最後に、試料糞便の上に粒状シリカゲルを充填した（Ｄ３）。すなわち、Ｄ３では、潰して平たくした試料糞便は、粒状シリカゲルとの接触条件下で、粒状シリカゲル中に埋没している。
（２）３０ｍＬチューブ（ｌａｂｃｏｎ）にパワードライを加えて水平にならし、次いで、潰して平たくした試料糞便をその上に載せ、最後に、試料糞便の上にパワードライを充填した（Ｄ４）。すなわち、Ｄ４では、潰して平たくした試料糞便は、パワードライとの接触条件下で、パワードライ中に埋没している。
（３）３０ｍＬチューブの蓋にパラフィルムを巻き、室温でおよそ４０時間静置した。
（４）３０ｍＬチューブを開封し、試料糞便を観察した。
　その結果、Ｄ３（粒状シリカゲルとの接触条件）では、試料糞便の脱水が進み、試料糞便は乾燥したコンブのように変化した。一方、Ｄ４（パワードライとの接触条件）では、試料糞便のうち、乾燥剤と触れていた部分はよく脱水されているが、試料糞便の内部に水分が残存しているように感じられた。したがって、試料糞便の乾燥において、シリカゲルは、パワードライに比し、吸水性固形乾燥剤として好ましいことが実証された。
１－３．粒状シリカゲルと糞便の量比および経時変化が及ぼす影響の検討
　以下のとおり実験を行った。
（１）３０ｍＬチューブ（ｌａｂｃｏｎ）に約１ｇの試料糞便を量り取った。
（２）粒状シリカゲルを試料糞便のおよそ２倍、３倍、６倍重量加え、３、６、１２、２４時間、室温（２５℃）で静置した。
（３）３０ｍＬチューブを開封した後、試料糞便のみ取り出して重量を計測した。
（４）「乾燥率（％）＝１００×（乾燥前重量－乾燥後重量）／乾燥前重量」として乾燥率を算出し、比較した。
　その結果、２４時間後の乾燥率（％）は、シリカゲルの量が多いほうが最終的な乾燥率が高くなることが明らかとなった（６倍重量では約８３％の乾燥率）。特に、糞便の６倍重量のシリカゲルを用いると６時間程度でかなり乾燥した（約７６％）。
１－４．粒状シリカゲルを用いて乾燥させた糞便の破砕
　試料糞便から代謝物質の抽出等の操作を行う際、試料糞便の凍結乾燥物をビーズにより粉砕する手法が用いられている（国際公開第２０１７／０４３０８７号の実施例２－１－１）。そこで、試料糞便の非凍結乾燥物についても、ビーズによる粉砕が可能か検討した。
　以下のとおり実験を行った。
（１）粒状シリカゲルを用いて試料糞便を十分に乾燥させた。
（２）十分に乾燥した固い試料糞便をビーズで破砕した。より具体的には、取り出した試料糞便と４個のφ３ｍｍジルコニアビーズ（ＴＯＭＹ）を２ｍＬ破砕チューブに封入し、Ｓｈａｋｅ　ｍａｓｔｅｒ　ＮＥＯ（バイオメディカルサイエンス社製）を用いて１５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で振盪破砕を試みた。
（３）破砕チューブの蓋を開け、内容物を観察した。
　その結果、試料糞便はある程度粉末状に破砕することができた。したがって、本方法は、試料糞便の非凍結乾燥物の破砕法として有効であると考えられた。
　しかし、本方法では、試料糞便の破砕後に、１－２ｍｍほどの大きさの塊の残存が確認された。本方法により解析に必要な量の粉末状試料糞便は得られると考えられるが、均一な解析資料を得るという観点から改善の余地があると考えられた。
実施例２：試料糞便の乾燥・保管条件が腸内細菌叢解析の結果に及ぼす影響の検討
　常温で乾燥・保管した試料糞便から様々な手法でＤＮＡ抽出を実施し、腸内細菌叢解析の結果を既存の手法（非特許文献１）と比較した。
サンプリング条件
　単一の試料糞便（排糞便１回分）を全体が均一になるように混ぜ、以下の条件に振り分けてそれぞれの処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＤＮＡ抽出ならびに１６Ｓ　ｒＲＮＡライブラリーの調製およびそのシークエンス解析を、既報（非特許文献１）に記載の方法と同様に行うことにより、腸内細菌叢を解析した。
　その結果、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）の比率は、保存条件によって大きく変動した（図１）。一方、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、およびルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物の比率は、保存条件によって大きく変動しなかった（図１）。シリカゲルを用いた試料糞便の常温保存は「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日」（従来条件：非特許文献１に記載される凍結乾燥）と比較して、腸内細菌叢の解析結果にほぼ変化がなかった（図２）。保存条件によって比率が大きく変動しなかった微生物はいずれも、それらの目・科・属の関係を考慮すると、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する。したがって、このような微生物の解析は、乾燥方法に依存しない信頼性の高い指標となると考えられる。
　また、本発明の保存方法以外の非凍結保存方法（例、常温またはＲＮＡ安定化試薬による保存）では従来の凍結保存方法（凍結乾燥）と比較して変化してしまうにも関わらず、本発明の保存方法では従来の凍結保存方法と同等の存在比率を担保できる１種以上の腸内細菌として、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）に属する微生物が見出された（図１、２）。より詳細に解析した結果、上記門に属する微生物としては、少なくともバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、およびバルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）に属する微生物が存在することが確認された（図１）。
　また、Ｗｅｉｇｈｔｅｄ　ＵｎｉＦｒａｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅにより腸内細菌叢のプロファイルを比較したところ、従来条件（上記と同じ）と最も類似のプロファイルとなった条件は「液体窒素（乾燥あり）」であったが、常温で保存した条件の中では「シリカゲル＿１日」が最も類似のプロファイルであり、「シリカゲル＿５日」においても同様のプロファイルを得た（図３）。
　以上より、シリカゲルを用いた試料糞便の常温保存は、常温で行われるにもかかわらず従来法（非特許文献１）と同等の良好な方法であること、および腸内細菌叢の解析結果に殆ど影響を与えないことが示唆された。
実施例３：試料糞便の乾燥・保管条件が腸内細菌叢の代謝物質の解析結果に及ぼす影響の検討
　表１に記載の条件のうち、試料番号０１～０８、１３および１４について、国際公開第２０１７／０４３０８７号に記載の方法と同様にして代謝物質抽出を行った。また、試料番号０２「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日」（従来条件）と、試料番号１４「シリカゲル＿５日」（本発明の条件）による代謝物質濃度の違いを比較するため、これら２条件における各代謝物質の濃度を散布図で表した（図４）。
　その結果、検出対象とした５１３種の代謝物質のうち、「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥５日」（従来条件）では１０３種、「シリカゲル＿５日」（本発明の条件）では１０８種が検出された。そのうち従来条件のみから検出された代謝物質は１８種、本発明の条件のみから検出された代謝物質は２３種、いずれの条件においても検出された代謝物質は８５種であった。
　つぎに、「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日」（従来条件）と「シリカゲル＿５日」（本発明の条件）のいずれの条件においても検出された８５種の代謝物質について、式（１）に従い試料糞便１ｇ（乾燥重量）当たりのｍｏｌ数［ｎｍｏｌ／ｇ］の変動比を求め、シリカゲルを用いた際にどの代謝物質がどれだけ変化するかを算出した。
（変動比）＝（シリカゲル＿５日）／（－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日）　式（１）
　変動比による分類の結果は、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、乾燥方法によらず、表３－１および３－２に示されるように、量の変動が小さい代謝物質が明らかとなった。注目すべきことに、量の変動が小さい代謝物質群として、短鎖脂肪酸〔例、プロピオン酸（Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、酪酸（Ｂｕｔｙｒａｔｅ）〕、胆汁酸〔例、コール酸（Ｃｈｏｌａｔｅ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）〕、トリメチルアミン（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）が見出された。これらの代謝物質は健康と腸内細菌との関わりを考える上で重要な指標となりうる。したがって、表３－１および３－２に示される代謝物質の定量解析は、乾燥方法に依存しない信頼性の高い指標となるだけではなく、健康と腸内細菌との関わりを考える上での重要な指標となりうると考えられる。
　なお、「－８０℃で冷凍ののち凍結乾燥＿５日」（従来条件）と「シリカゲル＿５日」（本発明の条件）において量が増加または減少する代謝物質が存在する理由を考察すると、多くの細菌の代謝反応に必要とされる液体状態の水に起因する可能性が考えられる。従来条件では、採糞便後即座に冷凍し、乾燥時も凍結乾燥によって水分を除去するため、分析に至る間に液体状態の水が存在する時間は極めて短い。一方、シリカゲルによる乾燥においては、液体状態の水が存在する時間が従来条件と比較して長くなると考えられるため、細菌の代謝が完全に停止するまでにある程度の時間を要する。したがって、液体状態の水が存在する間に、細菌によって生産または消費される代謝物質があるために、従来条件と比較して増加する代謝物質と減少する代謝物質の両方が存在すると考えられる。
実施例４：板状シリカゲルを用いた糞便乾燥試験
４－１．目的
　実施例１～３では、試料糞便中のＤＮＡや代謝物質を安定的に保存するには水分の除去が有効であることが示されている。実験の過程において充分な乾燥には試料糞便と粒状シリカゲルとの接触が有効であることが示されたものの、乾燥後の試料糞便は粒状シリカゲルと癒着しており、分離が煩雑であった。また、本手法の実用化を考えると、粒状シリカゲルを試料糞便に密着させる操作は、粒状シリカゲルが容器よりこぼれる恐れがあるなど、取扱いが容易ではない。
　そこでシリカゲル微粉末を板状に成形した板状シリカゲルに着目した。ひと塊の試料糞便の埋没に多数を必要とする粒状シリカゲルと異なり、十分な大きさの板状シリカゲルであれば試料糞便に対し上下より２枚のみで接触することが可能である。さらに板状シリカゲルは平滑な表面を有することから、試料糞便を乾燥させたのちに簡糞便に剥離できることが期待される。
４－２．板状シリカゲル（不織布包装タイプ）を用いた試料糞便の乾燥
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕板状シリカゲル（不織布包装タイプ）に約１ｇの試料糞便を載せ、もう１枚の板状シリカゲルで全体に広がるようプレスして室温（２５℃）に約６時間静置した。
〔２〕静置した試料を剥離したのち、試料糞便を観察した。
　その結果、試料糞便は全く乾燥しなかった。これはシリカゲル表面が不織布に覆われていることで糞便とシリカゲル本体とが接触しなかったことにより乾燥が妨げられたものと推察された。したがって、使用する乾燥剤を再検討することとした。また、試料糞便の乾燥にはシリカゲルとの接触が有効であることが示唆されたため、不織布なしのシリカゲルの使用を検討することとした。
４－３．板状シリカゲル（裸タイプ）を用いた試料糞便乾燥
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕板状シリカゲルに約１ｇの試料糞便を載せ、もう１枚の板状シリカゲルで全体に広がるようプレスして室温（２５℃）に静置した。これを２セット作成した。
〔２〕上記工程〔１〕で作成したセットのうち１つを約２時間後に試料を剥離して試料糞便を観察した。
〔３〕上記工程〔１〕で作成したセットの残りの１つを、試料調製から約６時間後に剥離して観察した。
　なお、乾燥後に剥離したシリカゲルによれば、糞便が付着している板状シリカゲル片面における試料糞便とシリカゲルとの接触面積はおよそ１３５０ｍｍ２と推察された。糞便が板状シリカゲル両面に同様に接触していたことを考慮すると、約１ｇの試料糞便を６０ｍｍｘ４０ｍｍの平板２枚に挟み込んだ場合の接触面積は約２７００ｍｍ２と見積もられた。
　その結果、用いた板状シリカゲルは、これまでに使用した素材の中で最も扱い易かった。また、試料糞便は６時間経過後には十分に乾燥していた。粒状シリカゲルは乾燥後の糞便からシリカゲルを除去する作業が困難であったが、板状シリカゲルは金属製のスパチュラを用いた削ぎ落としにより容易に試料糞便との分離が可能であった。
　以降、板状シリカゲルを用いた場合の試料糞便乾燥条件について検討した。
４－４．脱水実験のための試料として用いる糞便の検討
　板状シリカゲルによる試料糞便乾燥実験を繰り返し行った。一度凍結し、融解した試料糞便が未凍結の試料糞便と同様に取り扱うことができるならば、試料糞便を安定的に供給できると考え、未凍結の糞便と凍結融解した糞便をそれぞれ板状シリカゲルで乾燥させ、試料の重量変化を経時的に調べた。
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕あらかじめ試料糞便を約１ｇ採糞便管に量り取り、凍結乾燥した。
凍結乾燥前後の重量を測定することで糞便に含有される水分の割合を算出した。
〔２〕上記工程〔１〕で用いた試料糞便と同じ試料糞便を、スパチュラと計量カップを用い、約１ｇとなるよう計量した。
〔３〕量り取った糞便を１枚の板状シリカゲル（３０ｍｍｘ４０ｍｍｘ３．２ｍｍ）中央付近に載せ、板状シリカゲルの形状にあわせてスパチュラで整形した。
〔４〕糞便の周囲にスペーサーとして、高さ２ｍｍのプラスチック片を２枚配置した。
〔５〕糞便の上からもう１枚の板状シリカゲルで挟み込み、糞便の厚みがスペーサーの厚みとなるよう手で上方より軽く押し付けた。
〔６〕糞便を板状シリカゲルで挟み込んだものをチャック付きビニール袋（ユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８））に封入し、空気をできる限り除いて密閉した。
〔７〕室温（２５℃）にて糞便を１０，３０，６０，９０，１２０分間静置した。
試料は各条件と処理時間に対し１個、計１０個用意し、タイムポイントごとに開封した。
〔８〕ユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）を開封して試料を剥がし、スパチュラの平たい側を用いてシリカゲルから削ぎ落とすようにして糞便を計量カップに剥がし取った。
〔９〕剥がし取った糞便の重量を計測、記録した。シリカゲル処理後の水分含有率は、（ａ）シリカゲル処理後の試料を凍結乾燥し、凍結乾燥前後の重量変化から除水分量を求め、除水分量に基づき決定した。
　その結果、未凍結糞便と凍結融解糞便との間では乾燥挙動に大きな差異は確認されなかった（表５、図５）。よって以降の実験では利糞便性を考慮し、凍結融解糞便を用いることとした。また、水分含有率が１０％を下回るには室温で９０分以上の静置が有効であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
４－５．低温（４℃）における乾燥挙動
　板状シリカゲルを用いて試料糞便を処理する際、低温条件（４℃）での乾燥挙動を経時的に評価した。
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕４－４と同様の実験操作を行った（工程〔７〕を除く）。
〔２〕工程〔７〕において冷蔵庫内（４℃）で糞便を静置した。また試料は１０，３０，６０，９０，１２０，１５０，１８０，３００，５４０，７２０分間静置し、各処理時間に対し１個、計１０個用意した。
　その結果、試料糞便中の水分含有率は５４０分間の静置で１０％を下回り、９０分を要した常温（２５℃）よりも乾燥が遅延することが明らかになった（表６、図６）。また、最終的な水分含有率も、常温（２５℃）では３．１％であったのに対し、４℃では６．６％と高い値となった（表６、図６）。したがって、低温条件でシリカゲルを使用した場合、水分含有率低下に時間を要することが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４－６．高温（５０℃以上）における乾燥挙動
　板状シリカゲルを用いて試料糞便を処理する際、高温条件（５０℃以上）での乾燥挙動を経時的に評価した。実験温度帯を簡糞便に再現する手法として、カイロ（ウイング社製、暖ま～るカイロ、貼るタイプ、１０コ入り）をユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）の外側表面に貼り付けたもので試料を加熱する手法を採用した。
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕あらかじめ試料糞便を採糞便管に量り取り、凍結乾燥した。
凍結乾燥前後の重量を測定することで糞便に含有される水分の割合を算出した。
〔２〕ユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）の表裏両面にカイロを貼り付け、内部温度の経時変化をデジタル式温度計を用いて記録した。
〔３〕カイロ製品仕様で示された維持可能温度５０℃に到達したことを確認した。
〔４〕上記工程〔１〕で用いた試料糞便と同じ試料糞便を、スパチュラと計量カップを用い、およそ１ｇとなるよう計量した。
〔５〕量り取った糞便を１枚の板状シリカゲル（３０ｍｍｘ４０ｍｍｘ３．２ｍｍ）中央付近に載せ、板状シリカゲルの形状にあわせてスパチュラで整形した。
〔６〕糞便の周囲にスペーサー（高さ：２ｍｍ）を２枚配置した。
〔７〕糞便の上からもう１枚の板状シリカゲルで挟み込み、スペーサーの高さまで軽く押し付けた。
〔８〕糞便を板状シリカゲルで挟み込んだものをユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）に封入し、空気をできる限り除いて密閉した。
〔９〕遮熱板として敷いた板状発泡スチロールを土台とし、その上にキムタオル、カイロ付試料、キムタオル、発泡スチロール、アルミブロックの順で重ねた状態で室温下にて１０，３０，６０，９０，１２０分間静置した。試料は各処理時間に対し１個、計５個用意し、タイムポイントごとに開封した。
〔１０〕ユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）を開封して試料を剥がし、スパチュラの平たい側を用いてシリカゲルから削ぎ落とすようにして糞便を計量カップに剥がし取った。
〔１１〕剥がし取った糞便の重量を計測、記録した。
　その結果、カイロ開封後およそ５０分でカイロの内部温度は５０℃に達し、最大測定時間２５０分までは５０℃以上を維持することが明らかになった（表７、図７）。また、およそ１００分後まで温度上昇は続き最高温度６０．０℃（実測値）を記録した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　また、カイロを用いた加熱と１２０分以上の静置により、試料糞便中の水分はほぼ除かれることが明らかになった（表８、図８）。試料糞便中の水分含有率は３０分間の静置で１０％を下回り、９０分を要した常温（２５℃）よりも急速に試料糞便を乾燥できることが明らかになった（表８、図８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
４－７．電子レンジを使用した乾燥方法の検討
　試料糞便を瞬間的に加熱し、菌体の生命活動を停止させることで細菌叢と代謝物質の割合を固定できると考えた。そこで身近にある機器のうち水分を電磁波により加温する電子レンジに着目し、板状シリカゲルによる乾燥と併用することで乾燥挙動にどのような影響をおよぼすかについて検討した。
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕あらかじめ試料糞便を採糞便管に量り取り、凍結乾燥した。
凍結乾燥前後の重量を測定することで糞便に含有される水分の割合を算出した。
〔２〕上記工程〔１〕で用いた試料糞便と同じ試料糞便を、スパチュラと計量カップを用い、およそ１ｇとなるよう計量した。
〔３〕量り取った糞便を１枚の板状シリカゲル（３０ｍｍｘ４０ｍｍｘ３．２ｍｍ）中央付近に載せ、板状シリカゲルの形状にあわせてスパチュラで整形した。
〔４〕糞便の周囲にスペーサー（高さ：２ｍｍ）を２枚配置した。
〔５〕糞便の上からもう１枚の板状シリカゲルで挟み込み、スペーサーの高さまで軽く押し付けた。
〔６〕糞便を板状シリカゲルで挟み込んだものをユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）に封入し、空気をできる限り除いて密閉した。
〔７〕試料を電子レンジ中央に静置し、出力５００Ｗで１０，２０，３０秒間加熱した試料は各処理時間に対し１個、計３個用意し、タイムポイントごとに開封した。
〔８〕ユニパック（株式会社生産日本社製、Ｅ－８）を開封して試料を剥がし、スパチュラの平たい側を用いてシリカゲルから削ぎ落とすようにして糞便を計量カップに剥がし取った。
〔９〕剥がし取った糞便の重量を計測、記録した。
　その結果、板状シリカゲルと電子レンジを用いた試料糞便の乾燥（５００Ｗ，３０秒）によって試料糞便中の水分は急速に除かれることが明らかになった（表９、図９）。処理時間１０秒で水分含有量はおよそ１０％に到達し、２０秒では１０％を下回ることが明らかになった（表９、図９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
４－８．嫌気条件下での乾燥条件の検討（１）
　糞便中に含まれる菌には代謝活動するに際し水分のほかに酸素を必要とするものが含まれることが知られている。大気中の酸素を除くことで代謝活動を抑制するため、まず脱酸素剤の存在が板状シリカゲルを用いた試料糞便の乾燥にどのような影響を与えるかについて検討した。
　以下のとおり実験を行った。
〔１〕あらかじめ試料糞便を採糞便管に量り取り、凍結乾燥した。
凍結乾燥前後の重量を測定することで糞便に含有される水分の割合を算出した。
〔２〕上記工程〔１〕で用いた試料糞便と同じ試料糞便を、スパチュラと計量カップを用い、およそ１ｇとなるよう計量した。
〔３〕量り取った糞便を１枚の板状シリカゲル（３０ｍｍｘ４０ｍｍｘ３．２ｍｍ）中央付近に載せ、板状シリカゲルの形状にあわせてスパチュラで整形した。
〔４〕糞便の周囲にスペーサー（高さ：２ｍｍ）を２枚配置した。
〔５〕糞便の上からもう１枚の板状シリカゲルで挟み込み、スペーサーの高さまで軽く押し付けた。
〔６〕上記工程〔２〕～〔５〕を２セット作成し、そのうち１つを酸素透過性の低いラミジップスタンドタイプ（株式会社生産日本社製、ＡＬ－９）に封入し、空気をできる限り除いて密閉した。もう一方は脱酸素剤（鳥繁産業製、エバーフレッシュ、ＱＪ－３０）と共にラミジップスタンドタイプ（株式会社生産日本社製、ＡＬ－９）に封入し、空気をできる限り除いて密閉した。
〔７〕室温（２５℃）にて１０，３０，６０，９０，１２０分間静置した。試料は各条件と処理時間に対し１個ずつ、計１０個用意し、タイムポイントごとに開封した。
〔８〕ラミジップスタンドタイプを開封して試料を剥がし、スパチュラの平たい側を用いてシリカゲルから削ぎ落とすようにして糞便を計量カップに剥がし取った。
〔９〕剥がし取った糞便の重量を計測、記録した。
　その結果、脱酸素剤封入時と未封入時では乾燥挙動に大きな差異は確認されなかった（表１０、図１０）。水分含有率が１０％を下回る時間も脱酸素剤未封入時と同様に９０分以上の静置を要することが明らかになった（表１０、図１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
４－９．粒状シリカゲルを用い、糞便とシリカゲルとが直接接触しない乾燥方法の検討
　糞便に板状シリカゲルを接触させることで室温での乾燥が可能であることが実証されてきたが、実際乾燥糞便を試料として取り扱う際には板状シリカゲルからの剥離の工程が作業の律速段階となる。そこで糞便をシリカゲルとともに密閉し封入することで乾燥可能か検討した。
　以下のとおり、実験を行った。
〔１〕スクリューキャップに棒状の採便部が連結した採便チューブに、乾燥した粒状シリカゲルおよそ２グラムを底部に添加した。
〔２〕リング状の紙テープ内側表面に粒状シリカゲルを塗布したものを採便チューブに積層した。
〔３〕あらかじめ試料糞便を採糞便管に量り取り、凍結乾燥した。凍結乾燥前後の重量を測定することで糞便に含有される水分の割合を算出した。
〔４〕あらかじめシリカゲル入り採便チューブの重量を測定し、採便前後の重量を測定することで採便重量を算出した。
〔５〕上記工程〔３〕で用いた試料糞便と同じ試料糞便を、スクリューキャップ付採便棒で採取した。
〔６〕採便チューブ壁面のシリカゲルに便が触れぬように注意して挿入し、容器を密閉し室温（２５℃）にて１２０分間静置した。
〔７〕採便チューブを開封して試料を回収した。
〔８〕回収した糞便の重量を計測、記録した。
　その結果、１００．５ｍｇ採便した場合３１．２ｍｇ（水分含有率６．８％）まで乾燥されることが明らかとなった。このことから、少量の糞便試料であればシリカゲルと接触せずとも求める乾燥程度を達成できることが明らかとなった。
実施例５：乾燥後の糞便に含まれる微生物の培養実験
　排泄後すぐの便、凍結した便、凍結乾燥した糞便、およびシリカゲルで乾燥した糞便を用いた培養実験を実施した。培養実験は、以下のとおり行った。
〔１〕それぞれの試料糞便をリン酸緩衝液に懸濁した。このとき糞便要素の重量が等しくなるよう懸濁液を調製した。すなわち糞便の水分含有量を考慮して、１ｍＬのリン酸緩衝液に対して排泄後すぐの糞便は２０ｍｇ、シリカゲル乾燥糞便は６ｍｇを懸濁した。
〔２〕得られた懸濁液をビフィドバクテリウム属の生育に特化した培地（ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社））に塗布し、アネロパックを使用した嫌気条件において３７℃で一晩静置した。
〔３〕培地上に発生した菌のコロニーを確認し、コロニー数を計測した。
〔４〕培養効率を求めた。培養効率は下記の式に従って算出した。
　（培養効率）＝（各条件でのコロニー計測数）／（排泄後すぐの糞便を使用した際のコロニー計測数）ｘ１００（％）
〔５〕培養効率は次のように求められた。
　排泄後すぐの糞便：１００％、凍結した糞便：３７．６％、凍結乾燥した糞便：０．１％、シリカゲルで乾燥した糞便：１５．６％
　以上より、シリカゲルによる糞便の乾燥手法は、糞便中の遺伝子情報や代謝物質の保存に加え、利活用を目指した微生物の保存方法としても有効であることが明らかとなった。
　例えば、本発明は、糞便およびその中に含まれる微生物の保存、ならびにその解析に有用である。

Claims (27)

  1. 　糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させることを含む、糞便の保存方法。
  2. 　糞便が動物、魚類または昆虫の糞便である、請求項１記載の保存方法。
  3. 　固形乾燥剤が吸水性固形乾燥剤である、請求項１または２記載の保存方法。
  4. 　吸水性固形乾燥剤がシリカゲルである、請求項３記載の保存方法。
  5. 　固形乾燥剤との接触条件下で糞便の乾燥が行われ、
    　糞便および固形乾燥剤の接触面積が１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上である、請求項１～４のいずれか一項記載の保存方法。
  6. 　固形乾燥剤との非接触条件下で糞便の乾燥が行われ、
    　固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）が０．１～１００００である、請求項１～４のいずれか一項記載の保存方法。
  7. 　乾燥が０℃を超える温度で行われる、請求項１～６のいずれか一項記載の保存方法。
  8. 　乾燥が４～６０℃で行われる、請求項７記載の保存方法。
  9. 　乾燥が加熱機器を用いる加熱により行われる、請求項７記載の保存方法。
  10. 　加熱機器がマイクロ波照射機器である、請求項９記載の保存方法。
  11. 　以下を含む、糞便の解析方法：
    （１）糞便を固形乾燥剤の存在下で乾燥させること；および
    （２）乾燥した糞便を解析すること。
  12. 　解析が、糞便中の腸内細菌および／または物質に対して行われる、請求項１１記載の方法。
  13. 　腸内細菌が、クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）に属する微生物、およびパラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属する微生物からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、請求項１２記載の方法。
  14. 　腸内細菌が、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、請求項１２記載の方法。
  15. 　腸内細菌が、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ブラウティア属（Ｂｌａｕｔｉａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バルネシエラ科（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、請求項１２記載の方法。
  16. 　物質が、以下からなる群より選ばれる１種以上の物質を含む、請求項１２～１５のいずれか一項記載の方法：
    （１）２－ヒドロキシグルタル酸；
    （２）２－ヒドロキシペンタン酸；
    （３）２－アミノベンズアミド；
    （４）３－メチル酪酸；
    （５）４－（β－アセチルアミノエチル）イミダゾール；
    （６）４－メチル－５－チアゾールエタノール；
    （７）５－アミノペンタン酸；
    （８）７－メチルグアニン；
    （９）アジピン酸；
    （１０）アラニルアラニン；
    （１１）α－アミノアジピン酸；
    （１２）アンセリン；
    （１３）アスパラギン酸；
    （１４）アゼライン酸；
    （１５）酪酸；
    （１６）カルニチン；
    （１７）コール酸；
    （１８）コリン；
    （１９）シトラマル酸；
    （２０）クエン酸；
    （２１）シトルリン；
    （２２）デオキシコール酸；
    （２３）ジエタノールアミン；
    （２４）ドデカン二酸；
    （２５）γ－ブチロベタイン；
    （２６）グルタミン酸；
    （２７）グルタル酸；
    （２８）グリシルロイシン；
    （２９）グリセロリン酸；
    （３０）グリコール酸；
    （３１）グアニン；
    （３２）ヘキサン酸；
    （３３）ヒスタミン；
    （３４）ホモセリン；
    （３５）ヒポキサンチン；
    （３６）イミダゾール－４－酢酸；
    （３７）イソプロパノールアミン；
    （３８）乳酸；
    （３９）リジン；
    （４０）リンゴ酸；
    （４１）マロン酸；
    （４２）メチオニン；
    （４３）Ｎ－アセチルアスパラギン酸；
    （４４）Ｎ－アセチルグルタミン酸；
    （４５）Ｎ－メチルアラニン；
    （４６）Ｎ－メチルグルタミン酸；
    （４７）Ｎ１－アセチルスペルミジン；
    （４８）Ｎ１，Ｎ８－ジアセチルスペルミジン；
    （４９）オルニチン；
    （５０）ペラルゴン酸；
    （５１）ペンタン酸；
    （５２）フタル酸；
    （５３）ピメリン酸；
    （５４）ピペコリン酸；
    （５５）プロリン；
    （５６）プロリンベタイン；
    （５７）プロピオン酸；
    （５８）ピリドキサミン；
    （５９）セバシン酸；
    （６０）セリン；
    （６１）コハク酸；
    （６２）テレフタル酸；
    （６３）チアミン；
    （６４）トリゴネリン；
    （６５）トリメチルアミン；および
    （６６）トリプトファン。
  17. 　（ａ）固形乾燥剤、および（ｂ）固形乾燥剤と非接触条件下にある糞便を含む、密封容器。
  18. 　固形乾燥剤に対する糞便の重量比（固形乾燥剤／糞便）が０．１～１００００である、請求項１７記載の密封容器。
  19. 　固形乾燥剤が吸水性固形乾燥剤である、請求項１７または１８記載の密封容器。
  20. 　吸水性固形乾燥剤がシリカゲルである、請求項１９記載の密封容器。
  21. 　糞便が乾燥している、請求項１７～２０のいずれか一項記載の密封容器。
  22. 　（ａ）固形乾燥剤を含有または固定する１以上の部材、および（ｂ）固形乾燥剤と接触条件下にある糞便を備える、糞便固定物。
  23. 　（ａ１）第１の保持面を有する第１のプレート、（ａ２）第２の保持面を有する第２のプレート、および（ｂ）糞便を備えており、
    　糞便が、互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に挟持されることにより、固形乾燥剤と接触しており、
    　糞便と、固形乾燥剤を含有する保持面との接触面積が１００（ｍｍ２／１ｇ糞便）以上である、
    　請求項２２記載の糞便固定物。
  24. 　互いに対向するように配置された第１および第２の保持面の間に（ｃ）スペーサーをさらに備える、請求項２２または２３記載の糞便固定物。
  25. 　第１の部材および第２の部材の少なくとも一方が吸水性固形乾燥剤プレートである、請求項２２～２４のいずれか一項記載の糞便固定物。
  26. 　前記吸水性固形乾燥剤プレートがシリカゲルプレートである、請求項２５記載の糞便固定物。
  27. 　糞便が乾燥している、請求項２２～２６のいずれか一項記載の糞便固定物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022050374A1 (ja) * 2020-09-05 2022-03-10 株式会社メタジェン 評価方法、評価用培地

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116430049B (zh) * 2023-04-03 2023-10-31 汕头大学医学院 食管癌的代谢标志物及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001221721A (ja) * 2000-02-09 2001-08-17 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 乾燥濾紙便による遺伝子診断
CN101143757A (zh) * 2007-08-28 2008-03-19 林江 粪尿分集式厕所粪便加热干燥灭菌方法
JP2008256389A (ja) * 2007-04-02 2008-10-23 Olympus Corp 乾燥処理がなされた糞便試料及び糞便試料の調製方法、及び、該糞便試料を用いた核酸又はタンパク質の抽出並びに検出方法
JP2011019505A (ja) * 2009-01-29 2011-02-03 Mukogawa Gakuin 特定遺伝子を検出する方法
WO2017043087A1 (ja) 2015-09-11 2017-03-16 学校法人慶應義塾 糞便試料から物質を抽出する方法
WO2017104132A1 (ja) * 2015-12-16 2017-06-22 協和メデックス株式会社 採便器、便検体中の成分の測定方法、便検体中の成分の安定化方法、及び、便検体の保存方法
CN107586772A (zh) * 2017-09-21 2018-01-16 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 一种用于dna提取的川金丝猴粪便样品保存方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5030560A (en) * 1988-11-04 1991-07-09 Immucor, Inc. Method for drying mammalian cells for use in solid phase immunoassays and articles incorporating same
JPH0525358U (ja) * 1991-09-17 1993-04-02 東洋製罐株式会社 検体検査具
JPH05126827A (ja) * 1991-11-05 1993-05-21 Sanko Junyaku Kk 採便保存方法
JP3263933B2 (ja) * 1993-02-25 2002-03-11 ニプロ株式会社 乾燥剤入り採便容器
US6299842B1 (en) * 1999-03-05 2001-10-09 Meridian Bioscience, Inc. Biological sampling and storage container utilizing a desiccant
JP4979410B2 (ja) * 2007-02-23 2012-07-18 宣雄 杉野 植物の乾燥方法
SG183891A1 (en) * 2011-03-09 2012-10-30 Sahu Anuradha An improved process of floral botannical collage decoupage
CN104931314B (zh) * 2015-06-02 2018-09-25 杭州诺辉健康科技有限公司 一种粪便样品的处理方法及其应用
FR3078627B1 (fr) * 2018-03-09 2020-11-13 Maat Pharma Procedure de collecte de selles et procede de preparation d'un echantillon pour transplantation de microbiote fecal
AU2021227572A1 (en) * 2020-02-26 2022-09-01 Chr. Hansen A/S Spray freeze drying of strict anaerobic bacteria
CN217459177U (zh) * 2022-05-30 2022-09-20 南京茂泽新能源设备有限公司 一种畜禽粪便发酵用除臭装置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001221721A (ja) * 2000-02-09 2001-08-17 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 乾燥濾紙便による遺伝子診断
JP2008256389A (ja) * 2007-04-02 2008-10-23 Olympus Corp 乾燥処理がなされた糞便試料及び糞便試料の調製方法、及び、該糞便試料を用いた核酸又はタンパク質の抽出並びに検出方法
CN101143757A (zh) * 2007-08-28 2008-03-19 林江 粪尿分集式厕所粪便加热干燥灭菌方法
JP2011019505A (ja) * 2009-01-29 2011-02-03 Mukogawa Gakuin 特定遺伝子を検出する方法
WO2017043087A1 (ja) 2015-09-11 2017-03-16 学校法人慶應義塾 糞便試料から物質を抽出する方法
WO2017104132A1 (ja) * 2015-12-16 2017-06-22 協和メデックス株式会社 採便器、便検体中の成分の測定方法、便検体中の成分の安定化方法、及び、便検体の保存方法
CN107586772A (zh) * 2017-09-21 2018-01-16 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 一种用于dna提取的川金丝猴粪便样品保存方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MISHIMA ET AL., KIDNEY INT., vol. 92, no. 3, September 2017 (2017-09-01), pages 634 - 645
MURAKAMI, S. ET AL.: "The Consumption of Bicarbonate-Rich Mineral Water Improves Glycemic Control", EVIDENCE-BASED COMPLEMENTARY AND ALTERNATIVE MEDICINE, 2015, pages 824395
NECHVATAL, J. M. ET AL.: "Fecal collection, ambient preservation,and DNA extraction for PCR amplification of bacterial and human markers from human feces", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, vol. 72, 2008, pages 124 - 132, XP022420001, doi:10.1016/j.mimet.2007.11.007 *
NISHIMOTO ET AL., GUT., vol. 65, no. 9, 2016, pages 1574 - 5
See also references of EP3766959A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022050374A1 (ja) * 2020-09-05 2022-03-10 株式会社メタジェン 評価方法、評価用培地
JP7051175B1 (ja) * 2020-09-05 2022-04-11 株式会社メタジェン 評価方法

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