WO2019177133A1 - 培養細胞の調製方法 - Google Patents

培養細胞の調製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019177133A1
WO2019177133A1 PCT/JP2019/010731 JP2019010731W WO2019177133A1 WO 2019177133 A1 WO2019177133 A1 WO 2019177133A1 JP 2019010731 W JP2019010731 W JP 2019010731W WO 2019177133 A1 WO2019177133 A1 WO 2019177133A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
dispensing
cell
suspension
pipette
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/010731
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
枝莉 野口
智規 菅野
Original Assignee
テルモ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by テルモ株式会社 filed Critical テルモ株式会社
Priority to JP2020506663A priority Critical patent/JPWO2019177133A1/ja
Publication of WO2019177133A1 publication Critical patent/WO2019177133A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present invention relates to a method of dispensing a cell suspension, the method including a step of dispensing the cell suspension into a plurality of dispensing containers so that the number of cells is equal.
  • Non-Patent Document 1 fetal cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc., for repairing myocardial tissue damaged by ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction has been attempted (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 describes viable skeletal myoblasts for use in the formation of stable cardiomyocyte transplants in animals by introducing skeletal myoblasts or cardiomyocytes into the myocardial tissue of animals. Or a cell composition comprising viable cardiomyocytes.
  • transplanted skeletal myoblasts form myofibers in the myocardium, and the elasticity makes the surroundings Mechanically assists with normal myocardial movement to prevent further decline in cardiac function, or transplanted skeletal myoblasts secrete cytokines such as VEGF (vascular endothelial growth factor), etc. Is considered.
  • cytokines such as VEGF (vascular endothelial growth factor), etc.
  • the present invention relates to the following.
  • a method of dispensing a cell suspension the method comprising dispensing the cell suspension into a plurality of dispensing containers so that the number of cells is uniform.
  • Dispensing time per container (X) ⁇ K% of height when dispensing volume per container is sucked into dispensing apparatus and / or dispensing system ⁇ v s ⁇ (number of dispenses ⁇ 1)
  • v s cell sedimentation rate
  • v s D p 2 ( ⁇ p ⁇ f ) g / 18 ⁇ (Stokes equation)
  • D p cell diameter
  • ⁇ p cell density
  • ⁇ f solvent density
  • Gravity acceleration ⁇ solvent viscosity
  • the dispensing step is any of the following steps: 1) Step of taking 3 mL of the cell suspension in a pipette, homogenizing by pipetting five times, and taking 3 mL of the suspension and dispensing 1 mL each into three cryopreservation tubes; 2) Taking 4 mL of the cell suspension into a pipette, homogenizing by pipetting 5 times, taking 4 mL of the suspension and dispensing 1 mL each into four cryopreservation tubes; 3) Take 5 mL of the cell suspension in a pipette, homogenize by pipetting 5 times, and take 5 mL of the suspension and dispense 1 mL each into 5 cryopreservation tubes; 4) Taking 6 mL of the cell suspension in a pipette, homogenizing by pipetting 5 times, and dispensing 6 mL of the suspension into 6 cryopreservation tubes, 1 mL each.
  • the method according to any one of (1) to (9), wherein the cultured cells are any of skeletal myoblasts, fibroblasts, cardiomyocytes or lymphocytes.
  • the method according to any one of (1) to (10), wherein the cultured cells are used for treatment of diseases and injuries.
  • cells can be uniformly dispersed in a suspension, and dispensed from a dispensing device to each dispensing container before the cells settle, so that there is an advantage that each dispensing container can be evenly dispensed. is there.
  • One aspect of the present invention relates to a method of dispensing a cell suspension, the method including a step of dispensing the cell suspension into a plurality of dispensing containers so that the number of cells is uniform.
  • the cultured cells that can be used in the present invention are not particularly limited as long as they can be cultured, and include, for example, adherent cells (adherent cells).
  • Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells, periosteum cells, skin Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, mesenchymal stem cells, etc.) Etc.
  • adherent somatic cells eg, cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal cells, gingival cells,
  • Somatic cells may be differentiated from stem cells, particularly iPS cells.
  • Non-limiting examples of cells that can form a sheet-like cell culture include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots) , Muscle tissue, endometrium, placenta, cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelium) Cells, retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells), hepatocytes (eg, liver parenchymal cells), pancreatic cells (eg, islet cells), kidney cells, adrenal glands Examples include cells, periodontal ligament cells, ging
  • skeletal myoblasts and cardiomyocytes Preferred are skeletal myoblasts and cardiomyocytes, but are not limited thereto.
  • iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells Skin cells, synovial cells, chondrocytes and the like.
  • Cultured cells include non-adherent cells.
  • Non-adherent cells include lymphocytes (T lymphocytes, B lymphocytes) used for immunotherapy and the like, immune cells such as dendritic cells, and blood cells such as leukocytes.
  • the cultured cell may be a gene-introduced cell.
  • myoblast is a progenitor cell of striated muscle cell, and includes skeletal myoblast and cardiac myoblast.
  • skeletal myoblast means a myoblast present in skeletal muscle.
  • Skeletal myoblasts are well known in the art, and can be prepared from skeletal muscle by any known method (for example, the method described in JP-A-2007-89442) or commercially. Also available (eg, Lonza, Cat # CC-2580).
  • Skeletal myoblasts are not limited to markers such as CD56, ⁇ 7 integrin, myosin heavy chain IIa, myosin heavy chain IIb, myosin heavy chain IId (IIx), MyoD, Myf5, Myf6, myogenin, desmin, PAX3, etc. Can be identified.
  • the skeletal myoblast is CD56 positive.
  • the skeletal myoblast is CD56 positive and desmin positive.
  • Skeletal myoblasts can be any organism with skeletal muscle, including but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, It may be derived from mammals such as horses, cows, goats and sheep.
  • the skeletal myoblast is a mammalian skeletal myoblast.
  • the skeletal myoblast is a human skeletal myoblast.
  • cardioblast means a myoblast present in the myocardium.
  • Myocardial blasts are well known in the art and can be identified by markers such as Isl1.
  • Cardiomyocytes can be any organism with a heart muscle, including but not limited to, humans, non-human primates, rodents (mouse, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, dogs, cats, pigs, horses, It may be derived from mammals such as cows, goats and sheep.
  • the cardiac myoblast is a mammalian cardiac myoblast.
  • the cardiac myoblast is a human cardiac myoblast.
  • cardiomyocytes means cells having the characteristics of cardiomyocytes, and the characteristics of the cardiomyocytes include, but are not limited to, expression of a cardiomyocyte marker, presence of autonomous pulsation, and the like.
  • Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (also known as SIRPA or SHPS-1), KDR (also known as CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM, etc. .
  • the cells constituting the cell culture formed in a predetermined shape can be derived from any organism that can be treated with the cell culture formed in the predetermined shape.
  • organisms include, but are not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, and the like. Is included.
  • the number of types of cells constituting the cell culture formed in a predetermined shape is not particularly limited, and may be composed of only one type of cell, but using two or more types of cells. There may be.
  • the most cell content ratio is 50% or more, preferably 60% or more at the end of the formation of the predetermined shape. More preferably, it is 70% or more, and further preferably 75% or more.
  • the cell may be a xenogeneic cell or a homologous cell.
  • the term “heterologous cell” means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the cell is used for transplantation. For example, when the recipient is a human, cells derived from monkeys or pigs correspond to xenogeneic cells.
  • the “same species-derived cell” means a cell derived from an organism of the same species as the recipient. For example, when the recipient is a human, the human cell corresponds to the allogeneic cell.
  • the allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), that is, cells derived from the recipient, and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection even after transplantation. However, it is also possible to use heterologous cells or allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection.
  • cells other than autologous cells that is, heterologous cells and allogeneic nonautologous cells may be collectively referred to as nonautologous cells.
  • the cell is an autologous cell or an allogeneic cell. In one aspect of the present disclosure, the cell is an autologous cell. In another aspect of the present disclosure, the cell is an allogeneic cell.
  • the container used in the present invention is not particularly limited as long as it can store a cell suspension, and examples thereof include a tube-shaped container, a petri dish, a bag, a plate well, and the like.
  • a cryopreservation tube may be used.
  • the dispensing instrument and / or dispensing system used in the present invention is not particularly limited as long as it can dispense a cell suspension.
  • it may be manually operated such as a pipette and a syringe, Even automated equipment such as a note system can be used.
  • the pipette dose may be any of 2-50 mL, preferably 5-25 mL, for example 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, and 50 mL.
  • the upper limit of the small amount is 2 to 60 mL, preferably 5 to 25 mL, and the height of the pipette per 1 mL dose is preferably 5.0 mm to 75 mm, preferably 8.8 mm to 33.8 mm, but is not limited thereto. . Any combination of these can be used and is not particularly limited. For example, the combinations shown in Table 1 below can be mentioned.
  • pipette capacity means the maximum amount of liquid that can be normally held by a pipette
  • the upper limit of weighing means the upper limit of the pipette that can be weighed
  • pipette height per 1 mL volume Means the length from the mouthpiece to the liquid surface in the pipette when 1 mL of liquid is sucked into the pipette, but the accuracy of these values is not particularly limited.
  • the method of preparing cells of the present invention includes the step of evenly dispensing a suspension of cells into a container.
  • the dispensing step of the invention is any of the following steps: (1) Take 3 mL of the cell suspension in a pipette, homogenize by pipetting 5 times, take 3 mL of the suspension, and dispense 1 mL each into three cryopreservation tubes. (2) Taking 4 mL of the cell suspension in a pipette, homogenizing by pipetting 5 times, and dispensing 4 mL of the suspension into 4 cryopreservation tubes.
  • 2 mL, 5 mL, 8 mL, 10 mL, 13 mL, 25 mL, 30 mL, 50 mL, or 80 mL of the cell suspension is taken in a pipette, and pipetting is performed 2 to 10 times, preferably 3 to 7 times, more preferably. Is homogenized by pipetting 4-6 times, most preferably 5 times, and the suspension is 2 mL, 5 mL, 8 mL, 10 mL, 13 mL, 25 mL, 30 mL, 50 mL, or 80 mL, 2 mL, 5 tubes, 1 mL each. It may be dispensed into 8, 10, 13, 25, 30, 50, or 80 cryopreservation tubes.
  • “dispensing” means a general meaning and is not particularly limited as long as it is an operation of pouring separately. For example, in a short time with little influence on cells, it is equivalent to a plurality of containers such as cryopreservation tubes. The method of dispensing into the is used.
  • “equal” means that the number of cells in each container is uniform.
  • “uniform” includes, for example, a difference in the number of cells within 30%, preferably within 20%, more preferably within 15%, and even more preferably within 10%, but is not limited thereto.
  • the number of containers to be dispensed in one operation is not particularly limited, and depends on the dose per container to be dispensed. For example, 1 to 30 mL may be dispensed. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, In some cases, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 ml is dispensed. For example, when dispensing 1 mL at a time, it is 15 or less, preferably 10 or less, more preferably 6 or less.
  • the dispensing speed is not particularly limited. For example, when dispensing 1 ml each into 6 containers, dispensing is preferably performed within 1 minute and a half, preferably within 25 seconds, per 1 mL. If it is slower than this, the number of cells may not be maintained evenly.
  • the dispensing speed at which the difference in the number of cells between containers is K% is the diameter, density, solvent viscosity, solvent viscosity, number of dispenses, and the number of dispenses per container.
  • it can also be calculated with the following formula: Dispensing time per container (X) ⁇ K% of height when dispensing volume per container is sucked into dispensing apparatus and / or dispensing system ⁇ v s ⁇ (number of dispenses ⁇ 1)
  • v s cell sedimentation rate
  • v s D p 2 ( ⁇ p ⁇ f ) g / 18 ⁇ (Stokes equation)
  • v s settling velocity
  • D p cell diameter
  • ⁇ p cell density
  • ⁇ f solvent density
  • Gravity acceleration ⁇ solvent viscosity
  • the K% of the height may be 5%, 10%, 15%, or 20%. Preferably it is 10%.
  • a cell suspension having a volume of 10 to 30 mL is prepared, and it may be pipetted 3 to 5 times to take a necessary amount in a dispensing device, but is not limited thereto.
  • the diameter of the cells is usually about 10 ⁇ m for skeletal myoblasts, about 20 ⁇ m for lymphocytes, and about 50 to 80 ⁇ m for cardiomyocytes, but is not limited thereto.
  • the viscosity of the cell suspension may be 10p or less at room temperature, but is not limited thereto.
  • a growth culture step may be further included.
  • the method for growing and culturing these cells is not particularly limited, and a known method can be used depending on the cells to be cultured.
  • the medium to be used is not particularly limited.
  • antibiotics, buffers, animal sera such as bovine serum may be added to the medium or the like as needed.
  • the culture conditions such as culture pH and temperature are not particularly limited, and conditions suitable for growth may be set according to the selected cells.
  • the culture substrate used for these cultures is not particularly limited as long as cells can grow, and includes, for example, containers of various materials, solid or semi-solid surfaces in containers, and the like.
  • the container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution. Examples of such materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl.
  • the container preferably has at least one flat surface.
  • a container having a bottom surface made of a culture substrate capable of forming a cell culture and a liquid-impermeable side surface.
  • Specific examples of such culture vessels include, but are not limited to, cell culture dishes, cell culture bottles, and the like.
  • the bottom surface of the container may be transparent or opaque. When the bottom surface of the container is transparent, it is possible to observe and count cells from the back side of the container.
  • the container may have a solid or semi-solid surface therein. Examples of solid surfaces include plates and containers of various materials as described above, and examples of semi-solid surfaces include gels and soft polymer matrices.
  • the culture substrate may be prepared using the above materials, or commercially available materials may be used.
  • the method may further include a step of cryopreserving.
  • Freezing of cells in the present invention can be performed by any known technique. Such techniques include, but are not limited to, for example, subjecting the cells in the container to a freezing means such as a freezer, a deep freezer, or a low-temperature medium (for example, liquid nitrogen).
  • the temperature of the freezing means is not particularly limited as long as it is a temperature at which a part of the cell population in the container, preferably the whole can be frozen, but is typically 0 ° C. or lower, preferably ⁇ 20 ° C. or lower, more preferably ⁇ 40 ° C. or lower, more preferably ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the cooling rate in the freezing operation is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after freezing and thawing.
  • the cooling rate is from 1 to 5 until cooling begins at 4 ° C. and reaches ⁇ 80 ° C.
  • the cooling rate is about a time, preferably 2 to 4 hours, particularly about 3 hours.
  • cooling can be performed at a rate of 0.46 ° C./min.
  • Such a cooling rate can be achieved by providing the container containing the cells directly or in a cryopreservation container for freezing means set to a desired temperature.
  • the cryopreservation container may have a function of controlling the temperature lowering speed in the container to a predetermined speed.
  • any known one can be used, for example, BICELL® (Nippon Freezer).
  • the freezing operation may be performed while the cells are immersed in a culture solution or physiological buffer solution, but a cryoprotectant for protecting the cells from freezing and thawing operations is added to the culture solution, or the culture solution is cryoprotected. You may perform after performing the process of replacing with the cryopreservation liquid containing an agent. Therefore, the preparation method of the present invention may further include a step of adding a cryoprotectant to the culture solution or a step of replacing the culture solution with a cryopreservation solution. When replacing the culture solution with a cryopreservation solution, if the solution in which cells are immersed during freezing contains an effective concentration of cryoprotectant, remove the culture solution before adding the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may be added while leaving a part of the culture solution.
  • the “effective concentration” means that the cryoprotectant exhibits a cryoprotective effect without exhibiting toxicity, for example, the viability, vitality, and function of the cell after freeze-thawing compared to the case where the cryoprotectant is not used. This means a concentration that exhibits a decrease-suppressing effect. Such a concentration is known to those skilled in the art or can be appropriately determined by routine experimentation.
  • the cryoprotectant used in the present invention is not particularly limited as long as it exhibits a cryoprotective action on cells.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • glycerol ethylene glycol, propylene glycol, sericin, propanediol, dextran.
  • Polyvinyl pyrrolidone polyvinyl alcohol, hydroxyethyl starch, chondroitin sulfate, polyethylene glycol, formamide, acetamide, adonitol, perseitol, raffinose, lactose, trehalose, sucrose, mannitol and the like.
  • Cryoprotectants may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the cryoprotectant added to the culture solution or the concentration of the cryoprotectant in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as it is an effective concentration as defined above. 2 to 20% (v / v) with respect to the whole stock solution. However, although outside this concentration range, alternative use concentrations known or experimentally determined for each cryoprotectant may be employed, and such concentrations are within the scope of the present invention.
  • the method may further include a thawing step.
  • the frozen cells can be thawed by any known cell thawing technique.
  • frozen cells are thawed, for example, solid, liquid at a temperature higher than the freezing temperature.
  • a gaseous medium for example, water
  • a water bath for example, an incubator, an incubator, etc.
  • immersing a frozen cell in a medium for example, a culture medium
  • the temperature of the thawing means or the immersion medium is not particularly limited as long as the cells can be thawed within a desired time, but typically 4 to 50 ° C., preferably 30 to 40 ° C., more preferably 36 to 38. ° C.
  • the thawing time is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after thawing, but it is typically within 2 minutes, and in particular within 20 seconds can reduce the viability. It can be greatly suppressed.
  • the thawing time can be adjusted, for example, by changing the temperature of the thawing means or the immersion medium, the volume or composition of the culture solution or cryopreservation solution at the time of freezing.
  • the thawing time can be adjusted, for example, by changing the temperature of the thawing means or the immersion medium, the volume or composition of the culture solution or cryopreservation solution at the time of freezing.
  • the frozen cells include cells frozen by any technique, and non-limiting examples thereof include, for example, cells frozen by the step of freezing the above cells.
  • the frozen cell is a cell that has been frozen in the presence of a cryoprotectant.
  • the frozen cells are for use in the production method of the present disclosure.
  • the method for preparing cultured cells of the present invention may include a washing step. Washing of cells can be performed by any known technique. Typically, for example, cells are washed with a washing solution (for example, serum or serum component (serum albumin, etc.), or a culture solution (for example, a medium). Etc.) or a physiological buffer (eg, PBS, HBSS, etc.), centrifuged, and the supernatant is discarded, and the precipitated cells are collected, but not limited thereto. In the step of washing the cells, the suspension, centrifugation, and recovery cycle may be performed once or a plurality of times (for example, 2, 3, 4, 5 times, etc.).
  • the step of washing the cells may be performed immediately after the step of thawing the frozen cells, that is, before the step of seeding the cell population on the culture substrate.
  • the washing may be further performed for the purpose of removing serum derived from animals such as cows.
  • the production method of the present disclosure may further include a step of growing cells.
  • the step of growing the cells may be performed by any known technique, and those skilled in the art are familiar with the culture conditions suitable for the growth of various cells.
  • a step of forming a sheet-shaped cell culture using the present cells after thawing may be further included.
  • the seeded cells can be formed into a sheet by any known technique and conditions.
  • Non-limiting examples of such techniques are described in, for example, Patent Document 1, WO 2014/185517. It is considered that the formation of a cell sheet is achieved when cells adhere to each other via an adhesion molecule or an intercellular adhesion mechanism such as an extracellular matrix. Therefore, sheet formation of the seeded cells can be achieved, for example, by culturing the cells under conditions that form cell-cell adhesion.
  • Such conditions may be any as long as cell-cell adhesion can be formed, but cell-cell adhesion can usually be formed under the same conditions as general cell culture conditions. Examples of such conditions include culture at about 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture can be performed under normal pressure (atmospheric pressure, non-pressurized). Culturing can be performed in containers of any size and shape.
  • the size and shape of the sheet-shaped cell culture can be adjusted by adjusting the size and shape of the cell adhesion surface of the culture vessel, or by placing a mold of the desired size and shape on the cell adhesion surface of the culture vessel, It can be arbitrarily adjusted by, for example, culturing cells therein.
  • the culture for forming the seeded cells into a sheet may be referred to as “sheet culture”. By sheet culture, the thickness of the sheet-like cell culture on the culture substrate (in the culture vessel) is reduced.
  • the thickness of the cell layer on the culture substrate is reduced by subsequent sheet formation, but the sheet-like cell culture shrinks by peeling from the culture substrate and increases again. .
  • the reduction in thickness due to sheeting is about 90% to about 70%, assuming that the thickness of the cell layer immediately after seeding is 100%.
  • the incubation time for forming a sheet is not particularly limited as long as the sheet can be formed.
  • the time during which a sheet can be formed varies depending on the type of cells (particularly the type of sheet-forming cells) contained in the seeded cell population and the state of the cells. For example, cells containing skeletal myoblasts as sheet-forming cells When the population is seeded, a sheet can be formed in about 2 hours. Thus, in one embodiment, the incubation time for sheeting can be 2 hours or more.
  • the present inventors release the sheet-shaped cell culture by releasing it artificially before peeling off from the culture substrate.
  • the present inventors have found that the produced sheet-shaped cell culture can be maintained in high quality by subjecting the sheet-shaped cell culture to the treatment for adhesion prevention. Therefore, the incubation for forming a sheet is terminated before the sheet-shaped cell culture is naturally detached.
  • the time from the start of incubation to the start of spontaneous detachment can vary depending on the type of cells (particularly the type of sheet-forming cells) contained in the seeded cell population and the state of the cells. When a cell population containing myoblasts is seeded, spontaneous detachment often occurs in about 6 to 12 hours. Therefore, in one aspect of the present disclosure, the upper limit of the incubation time for sheeting is 12 hours, 11.5 hours, 11 hours, 10 hours, 9 hours, 8 hours, 7 hours, 6 hours, 5 hours, or 4 hours. possible.
  • the incubation time for sheeting is 2 to 12 hours, 2 to 11.5 hours, 2 to 11 hours, 2 to 10 hours, 2 to 9 hours, 2 to 8 hours, It can be ⁇ 7 hours, 2-6 hours, 2-5 hours or 2-4 hours.
  • the cell culture medium used for the culture (sometimes simply referred to as “culture medium” or “medium”) is not particularly limited as long as it can maintain the survival of the cells. Typically, amino acids, vitamins, electrolytes are used. Can be used.
  • the culture medium is based on a basal medium for cell culture.
  • a basal medium is not limited, for example, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI 1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80 -7 etc. are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used in a standard composition (for example, as it is commercially available), or the composition may be appropriately changed according to the cell type and cell conditions. Therefore, the basal medium used in the present disclosure is not limited to those having a known composition, and includes one in which one or more components are added, removed, increased or decreased.
  • the amino acid contained in the basal medium is not limited, and for example, L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like are not limited to vitamins such as calcium D-pantothenate, choline chloride, folic acid, i Inositol, niacinamide, riboflavin, thiamine, pyridoxine, biotin, lipoic acid, vitamin B12, adenine, thymidine and the like, but not limited to, for example, CaCl 2 , KCl, MgSO 4 , NaCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, Fe (NO 3) 3, FeS 4, CuSO 4, MnSO 4, Na
  • the concentration of the amino acid contained in the basal medium is L-arginine: about 63.2 mg / L to about 84 mg / L, L-cystine: about 35 mg / L to about 63 mg / L, L-glutamine : About 4.4 mg / L to about 584 mg / L, glycine: about 2.3 mg / L to about 30 mg / L, L-histidine: about 42 mg / L, L-isoleucine: about 66 mg / L to about 105 mg / L, L-leucine: about 105 mg / L to about 131 mg / L, L-lysine: about 146 mg / L to about 182 mg / L, L-methionine: about 15 mg / L to about 30 mg / L, L-phenylalanine: about 33 mg / L To about 66 mg / L, L-serine: about 32 mg / L to about 42 mg / L, L-th
  • the concentration of the vitamin preparation contained in the basal medium is as follows: calcium D-pantothenate: about 4 mg / L to about 12 mg / L, choline chloride: about 4 mg / L to about 14 mg / L, folic acid : About 0.6 mg / L to about 4 mg / L, i-inositol: about 7.2 mg / L, niacinamide: about 4 mg / L to about 6.1 mg / L, riboflavin: about 0.0038 mg / L to about 0 .4 mg / L, thiamine: about 3.4 mg / L to about 4 mg / L, pyridoxine: about 2.1 mg / L to about 4 mg / L.
  • the cell culture solution may contain one or more additives such as serum, growth factor, steroid component, and selenium component.
  • these components may be impurities derived from the manufacturing process that cannot be ruled out as side effects such as anaphylactic shock to the recipient in clinical practice. It may be desirable to exclude derived components.
  • the cell culture medium does not contain an effective amount of at least one of these non-autologous additives.
  • the cell culture medium is substantially free of at least one of these non-autologous additives.
  • the cell culture medium is substantially free of non-autologous additives.
  • the cell culture medium may contain only a basal medium.
  • the cell culture medium is substantially free of serum.
  • a cell culture medium substantially free of serum may be referred to herein as “serum-free medium”.
  • “substantially free of serum” means that the serum content in the culture solution does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body (for example, in the sheet-shaped cell culture). It means that the serum albumin content is less than about 50 ng), preferably that these substances are not actively added to the culture medium.
  • the cell culture medium in order to avoid side effects at the time of transplantation, preferably contains substantially no heterogeneous serum, and more preferably contains substantially no non-self serum.
  • the cell culture medium includes serum.
  • the serum may be homologous serum or heterologous serum.
  • the cell culture medium includes autologous serum.
  • the serum contained in the cell culture medium (serum used for culturing cells) may be the same as the serum used to coat the culture substrate. May be.
  • the serum contained in the cell culture medium is the same as that used to coat the culture substrate, and in a particular embodiment, the serum is autologous serum.
  • the serum may be for use in the production method of the present disclosure.
  • the serum may be for use in cell culture or for coating a culture substrate.
  • the cell culture fluid does not contain an effective amount of growth factor.
  • an “effective amount of growth factor” refers to the amount of growth factor that significantly promotes cell proliferation as compared to the absence of growth factor, or, for convenience, cell proliferation in the art. It means the amount usually added for the purpose.
  • the significance of cell growth promotion can be appropriately evaluated, for example, by any statistical method known in the art, for example, t-test, and the usual addition amount is various in the art. It can be known from known literature.
  • the effective amount of EGF in cell culture is, for example, about 0.005 ⁇ g / mL or more.
  • the concentration of the growth factor in the culture medium in the present disclosure is less than the effective amount.
  • the concentration of EGF in the culture medium in cell culture is preferably less than about 0.005 ⁇ g / mL, more preferably less than about 0.001 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the growth factor in the culture medium is less than the normal concentration in the living body.
  • the concentration of EGF in the culture medium in cell culture is preferably less than about 5.5 ng / mL, more preferably less than about 1.3 ng / mL, and even more preferably about 0.5 ng / mL. Is less than.
  • the culture medium in the present disclosure is substantially free of growth factors.
  • “substantially free” means that the content of the growth factor in the culture solution is such that it does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body. Means not actively added. Therefore, in this embodiment, the culture solution does not contain a growth factor at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the cell culture solution is substantially free of steroid component.
  • steroid component refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect a living body such as adrenal cortex dysfunction and Cushing's syndrome.
  • Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like.
  • substantially free of steroid component means that the content of these compounds in the culture solution is such that it does not have an adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body, This means that these compounds are not actively added to the culture solution, that is, the culture solution does not contain steroid agent components at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the cell culture solution does not substantially contain a selenium component.
  • the “selenium component” includes a selenium molecule and a selenium-containing compound, in particular, a selenium-containing compound capable of releasing a selenium molecule in vivo, such as selenite. Therefore, “substantially free of selenium component” means that the content of these substances in the culture solution is such that there is no adverse effect when the sheet-shaped cell culture is applied to a living body, This means that these substances are not positively added to the liquid, that is, the culture liquid does not contain selenium components at a concentration higher than that contained in other components such as serum.
  • the selenium concentration in the culture solution is the normal value in human serum (eg, 10.6 ⁇ g / dL to 17.4 ⁇ g / dL), and the concentration of human serum contained in the medium is Lower than the ratio multiplied (ie, if the human serum content is about 10%, the selenium concentration is, for example, about 1.0 ⁇ g / dL to less than about 1.7 ⁇ g / dL).
  • impurities derived from manufacturing processes such as growth factors, steroid components, and heterogeneous serum components, which have been conventionally required when preparing a cell culture to be applied to a living body, are removed by washing or the like. A step becomes unnecessary. Accordingly, one aspect of the method of the present disclosure does not include the step of removing impurities from this manufacturing process.
  • the “manufacturing process-derived impurities” typically include those listed below derived from each manufacturing process. That is, a substance derived from a cell substrate (for example, host cell-derived protein, host cell-derived DNA), a substance derived from a cell culture medium (for example, inducer, antibiotic, medium component), or a step after cell culture It is derived from the extraction, separation, processing, and purification steps of a certain target substance (see, for example, Pharmaceutical Examination No. 571).
  • a substance derived from a cell substrate for example, host cell-derived protein, host cell-derived DNA
  • a substance derived from a cell culture medium for example, inducer, antibiotic, medium component
  • a step after cell culture It is derived from the extraction, separation, processing, and purification steps of a certain target substance (see, for example, Pharmaceutical Examination No. 571).
  • the method for preparing cultured cells of the present invention may further include a step of storing the suspension in the cryopreservation container in the above-described cryopreservation container, refrigerated storage and / or precooling.
  • the method may further include a step of refrigerated storage.
  • the step of refrigerated storage may be performed at any time before freezing, but may be performed, for example, immediately before freezing, or may be preferably precooled after freezing and before freezing. .
  • “refrigeration” means a general meaning and refers to the act of refrigeration, and the actual cell temperature is not limited.
  • the temperature is 0 ° C. to 10 ° C., and the temperature at which the object does not freeze.
  • the temperature is 2 to 8 ° C., but is not limited thereto.
  • Refrigeration includes maintaining the temperature so that the temperature does not rise within a certain temperature range (for example, a range of 0 ° C. to 10 ° C.).
  • the refrigeration may include a time for dropping from the normal temperature to the refrigeration temperature, and does not necessarily reach 2 to 8 ° C.
  • “normal temperature” represents a general meaning, for example, 15 to 25 ° C., but is not limited thereto.
  • preserving while refrigerated refers to preserving while performing the above-described refrigeration
  • preserving refers to placing in the same place for a certain time or period, and is particularly limited to the conditions of preservation. It may be left still or under shaking.
  • the dispensing container (the cryopreservation tube) used in the present invention is not particularly limited as long as the cells can be stored.
  • a commercially available cryopreservation tube such as a cryotube (Nunc) can be used.
  • the volume is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 ml, for example, and preferably 1 to 2 ml.
  • the material is not particularly limited, and metal, plastic, glass or the like can be used.
  • plastic such as polypropylene is preferably used.
  • the refrigerated storage time is not particularly limited.
  • the viability of cells after thawing in order to keep the viability of cells after thawing high, it is 120 minutes or less, preferably 90 minutes or less, more preferably 60 minutes or less, most preferably 30 minutes or less. If the refrigerated storage time exceeds 120 minutes, the viability of the cells after thawing may be reduced.
  • the step of refrigerated storage is performed by dispensing a high-density cell suspension of, for example, 1 to 9.0 ⁇ 10 7 cells / ml into a freezing tube at room temperature before freezing. Thereafter, it can be carried out by storing it in a freezing container such as BICELL that has been refrigerated to a refrigeration temperature of, for example, 2 to 8 ° C. for 60 minutes, preferably shorter than about 30 minutes, and storing it at room temperature. .
  • the concentration of the cell suspension in the freezing container may not drop to the refrigeration temperature depending on the refrigeration time.
  • the effect rate of the temperature of the cell suspension is about 0.12 (60 minutes) to 0.23 (30 minutes) ° C./min, 25 ° C.
  • a precooling step may be further included.
  • Preliminary cooling refers to the action of storing while cooling, and means that the cell suspension is kept for a certain time while cooling before freezing the cells.
  • the cooling temperature is not particularly limited; A temperature at which cells do not freeze, such as 0 ° C. to 10 ° C., 0 ° C. to 8 ° C., 2 ° C. to 8 ° C., or 2 ° C. to 4 ° C., is suitable.
  • Cooling includes setting the temperature to be maintained or lowered within a certain temperature range (for example, a range of 0 ° C. to 10 ° C.). Cooling may occur preliminarily before the freezing step and is referred to as precooling.
  • the time for performing the pre-cooling is not particularly limited, but is, for example, 30 minutes to 120 minutes, preferably 40 minutes to 100 minutes, more preferably about 60 minutes. If it is shorter than 30 minutes or longer than 120 minutes, damage to the cells may not be suppressed.
  • the cell density of the cell suspension is not particularly limited, but it is preferably a relatively high density of 1.0 to 9.0 ⁇ 10 7 cells / ml, preferably about 2.0 to 5 0.0 ⁇ 10 7 cells / ml, more preferably about 3.0 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the precooling step may be performed subsequent to the refrigerated storage step or may be performed without the refrigerated storage step, but preferably by performing the precooling step after passing through the short refrigerated storage step, Smoothly lead to preliminary cooling.
  • a preliminary cooling step may be performed following the refrigerated storage step.
  • the BICELL containing the cryopreservation tube used in the refrigerated storage step is continuously used to freeze the cell suspension for a certain time, for example, 30 minutes to 120 minutes, preferably 40 minutes. It can be carried out by maintaining the cooling temperature, for example, 0 to 10 ° C. for ⁇ 100 minutes, more preferably about 60 minutes.
  • a refrigeration means is not specifically limited, For example, you may store the whole BICELL in the refrigerator compartment of the commercially available refrigerator set to the cooling temperature. This step can prevent cell damage due to rapid freezing when the cell suspension is next frozen.
  • a preliminary cooling step may be performed subsequent to the refrigerated storage step.
  • the pre-cooling step may be carried out for a certain period of time before freezing the cell suspension, for example 30 to 120 minutes, preferably 40 to 100 minutes, more preferably about It can be carried out by maintaining the refrigeration temperature for 60 minutes, for example, 2-8 ° C.
  • a refrigeration means is not specifically limited, For example, you may store the whole BICELL in the refrigerator compartment of a commercially available refrigerator. This step can prevent cell damage due to rapid freezing when the cell suspension is next frozen.
  • tissues to be treated include, but are not limited to, myocardium, cornea, retina, esophagus, skin, joints, cartilage, and liver. , Pancreas, gingiva, kidney, thyroid, skeletal muscle, middle ear and the like.
  • the disease to be treated is not limited, and for example, heart disease (eg, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac injury), cardiomyopathy, etc.), corneal disease (eg, corneal epithelial stem cell exhaustion, cornea) Injury (heat / chemical corrosion), corneal ulcer, corneal opacity, corneal perforation, corneal scar, Stevens-Johnson syndrome, pemphigoid, etc., retinal diseases (eg retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration) , Esophageal diseases (for example, prevention of esophageal inflammation / stenosis after esophageal surgery (esophageal cancer removal)), skin diseases (for example, skin damage (trauma, burn), etc.), joint diseases (for example, osteoarthritis, etc.) Cartilage disease (eg, cartilage damage), liver disease (eg, chronic liver disease), pancreatic disease (eg, diabetes), dental disease (eg, periodon,
  • treatment of the present invention is intended to encompass all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions intended to cure, temporarily ameliorate or prevent disease.
  • treatment is medically and veterinarily acceptable, including delaying or stopping the progression of a disease associated with a tissue abnormality, regression or disappearance of a lesion, prevention of the onset or recurrence of the disease, etc. Includes interventions for various purposes.
  • Example 1 A suspension of the grown skeletal myoblasts (3.0 ⁇ 10 7 cells / mL) was pipetted 3-5 times with a 5 mL pipette to uniformly disperse. Of this, 6 mL was dispensed into a 5 mL pipette. 1 mL each of 6 mL of the collected cell suspension was dispensed into six cryopreservation tubes, and the difference in the number of cells between the first and sixth cells was measured. At that time, dispensing was performed while changing the dispensing time per dispensing container. As a result, it was confirmed that 1 mL of suspension was dispensed with a dispensing time of 2 to 10 seconds, whereby the number of cells could be evenly dispensed (within 10% difference).
  • Example 2 The lymphocyte suspension (3.0 ⁇ 10 6 cells / mL) was dispersed evenly by pipetting 3-5 times using a 5 mL pipette. Of this, 6 mL was dispensed into a 5 mL pipette. 1 mL each of 6 mL of the collected cell suspension was dispensed into six cryopreservation tubes, and the difference in the number of cells between the first and sixth cells was measured. At that time, dispensing was performed while changing the dispensing time per dispensing container. As a result, it was confirmed that 1 mL of the suspension was dispensed with a dispensing time of 2 to 25 seconds, so that the number of cells could be evenly dispensed (within 10% difference).
  • the cells prepared by the method of the present invention are very useful for medical use and the like where a uniform quality is strictly required.

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明の目的は、吐出器具の一部を培養基材または培養基材上の細胞懸濁液に接触させながら播種することにより、細胞懸濁液が飛散せず、かつ培養基材が落下する等のリスクがなく、ムラのない均質なシート状細胞培養物の製造方法を提供することにある。本発明の一側面は、 シート状細胞培養物を製造する方法であって、吐出器具の一部を培養基材上の細胞懸濁液に接触させながら、吐出器具から細胞懸濁液を培養基材上に吐出させるステップを含む方法に関する。

Description

培養細胞の調製方法
　本発明は、細胞懸濁液を分注する方法であって、細胞の個数が均等になるように複数の分注容器に細胞懸濁液を分注するステップを含む方法に関する。 
　近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。 
　例えば、特許文献１には、動物の心筋組織中への骨格筋芽細胞又は心筋細胞の導入による、動物における安定な心筋細胞性移植体の形成において使用するための、生存可能な骨格筋芽細胞又は生存可能な心筋細胞を含む細胞組成物について記載されている。 
　骨格筋芽細胞の移植により心機能の低下が防止されるメカニズムについてはまだ明らかではないが、概要としては、移植された骨格筋芽細胞が心筋内で筋線維を形成し、その弾力性により周囲の正常な心筋の動きを機械的に助けて心機能の更なる低下を防ぐこと、または移植された骨格筋芽細胞がＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）などのサイトカインを分泌し、その効果によるものなどが考えられている。 
　この骨格筋芽細胞は骨格筋に含まれ、骨格筋からの分離後に培養を行うことで細胞数を確保し、心筋組織の壊死部分に移植される。 
特許第３６４７８６６号公報
Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ., Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ. ２０１２ Ｆｅｂ;１(２):１３６-４１
　本発明者らは、前記の細胞の懸濁液を細胞の個数が均等になるように、すべてのチューブに均等に分注することが困難であるという問題に直面したところ、かかる問題を克服すべく鋭意検討する中で、このような細胞の懸濁液の物理的な特性の関係性を見出すことによりその問題を解決するとの知見を得、さらに検討の結果、本発明を完成するに至った。 
　すなわち本発明は以下に関する。 
（１）細胞懸濁液を分注する方法であって、細胞の個数が均等になるように複数の分注容器に細胞懸濁液を分注するステップを含む方法。 
（２）１つの分注容器に分注する時間が以下の式を満たす（１）に記載の方法。 
容器一個あたりの分注時間（Ｘ）≦分注器具および/または分注システムに一個当たりの分注容量を吸い上げたときの高さのＫ％÷ｖｓ÷(分注個数－１) 
ｖｓ ：細胞の沈降速度 
ｖｓ=Ｄｐ ２(ρｐ-ρｆ)ｇ/１８η(ストークスの式) 
Ｄｐ：細胞の直径 
ρｐ：細胞の密度 
ρｆ：溶媒の密度 
ｇ：重力加速度 
η：溶媒の粘度 
（３）高さのＫ％が５%、１０%、１５%、および２０%のいずれかである（２）に記載の方法。 
（４）細胞懸濁液の粘度が室温で１０ｐ以下である（２）または（３）に記載の方法。 
（５）分注容器が凍結保存用チューブである、（１）～（４）に記載の方法。 
（６）分注容器が、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ、および５０ｍＬのいずれかの容量を有するピペットである、（１）～（５）に記載の方法。 
（７）分注するステップが、下記のステップのいずれかである、（１）～（６）に記載の方法: 
１)ピペットに細胞懸濁液を３ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を３ｍＬとり１ｍＬずつ３本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
２)ピペットに細胞懸濁液を４ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を４ｍＬとり１ｍＬずつ４本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
３)ピペットに細胞懸濁液を５ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を５ｍＬとり１ｍＬずつ５本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
４)ピペットに細胞懸濁液を６ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を６ｍＬを１ｍＬずつ６本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
５)ピペットに細胞懸濁液を７ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を７ｍＬを１ｍＬずつ７本の凍結保存用チューブに分注するステップ、および 
６)ピペットに細胞懸濁液を８ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を８ｍＬを１ｍＬずつ８本の凍結保存用チューブに分注するステップ。 
（８）分注ステップが、使用に供する培養細胞を調製するためのステップである、（１）～（７）に記載の方法。 
（９）増殖培養ステップ、凍結保存するステップ、解凍ステップ、洗浄ステップ、およびシート状細胞培養物の形成ステップのいずれか一つ以上をさらに含む、（１）～（８）に記載の方法。 
（１０）培養細胞が骨格筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞またはリンパ球のいずれかである（１）～（９）に記載の方法。 
（１１）培養細胞が、疾病、傷病の治療に用いるものである（１）～（１０）に記載の方法。 
（１２）自動化された装置において行う（１）～（１１）に記載の方法。 
　本発明の方法により、細胞を懸濁液に均一に分散させ、細胞が沈降する前に分注器具から各分注容器に分注することによって、各分注容器に均等に分注できる利点がある。 
　本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。 
　本発明の一側面は、細胞懸濁液を分注する方法であって、細胞の個数が均等になるように複数の分注容器に細胞懸濁液を分注するステップを含む方法に関する。 
　本発明に用いることができる培養細胞は、培養し得るものであれば特に制限はないが、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。好ましくは骨格筋芽細胞、心筋細胞等であるがこれに限定されない。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。培養細胞は非接着性の細胞を含む。非接着性の細胞としては、免疫療法などに用いるリンパ球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、樹状細胞などの免疫細胞、白血球などの血液細胞を含む。培養細胞は遺伝子導入された細胞であってもよい。 
　本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。 
　本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７－８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ# ＣＣ-２５８０）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。 
　本開示において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。 
　本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ－ＴＮＴ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ－１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。 
　所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞は、所定の形状に形成された細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、所定の形状に形成された細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみの細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。所定の形状に形成された細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、所定の形状の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。 
　細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、該細胞が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。 
　本発明に用いる容器は、細胞懸濁液を格納することができれば特に限定されないが、例えばチューブ状の容器、シャーレ、バッグ、プレートのウェル等があげられ、チューブ状の容器としては細胞保存用チューブ、好ましくは凍結保存用チューブが用いられる場合がある。 
　本発明に用いる分注器具および/または分注システムは、細胞懸濁液を分注できるものであればとくに限定されず、例えばピペット、シリンジ等の手動で操作するものでもよいし、市販の分注システム等の自動化された装置であっても使用することができる。ピペットの例としては具体的には、ピペットの用量が２～５０ｍＬ、好ましくは５～２５ｍＬ、例えば２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ、および５０ｍＬのいずれかである場合がある。少量上限は２～６０ｍＬ、好ましくは５～２５ｍＬ、１ｍＬ用量あたりのピペットの高さは５．０ｍｍ～７５ｍｍ、好ましくは８．８ｍｍ～３３．８ｍｍのものが好適に使用されるがこれらに限定されない。これらの組合せとしては任意の組合せが使用でき特に限定されないが、例えば以下の表１の組合せが挙げられる。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　本開示において「ピペット容量」とは、ピペットが通常保持し得る液体の最大量を言い、秤量上限とは、そのピペットが有する秤量可能な上限値を言い、「１ｍＬ容量あたりのピペット高さ」とは、ピペットに１ｍＬの液体を吸い上げたときの、吸い口からピペット内の液体表面までの長さを言うが、これらの数値の精度は特に問わない。 
　本発明の細胞を調製する方法は、細胞の懸濁液を容器に均等に分注するステップを含む。 
　本発明の一態様において、本発明の分注ステップは、下記のステップのいずれかである方法: 
(１)ピペットに細胞懸濁液を３ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を３ｍＬとり１ｍＬずつ３本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
(２)ピペットに細胞懸濁液を４ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を４ｍＬとり１ｍＬずつ４本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
(３)ピペットに細胞懸濁液を５ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を５ｍＬとり１ｍＬずつ５本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
(４)ピペットに細胞懸濁液を６ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を６ｍＬを１ｍＬずつ６本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
(５)ピペットに細胞懸濁液を７ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を７ｍＬを１ｍＬずつ７本の凍結保存用チューブに分注するステップ、および 
(６)ピペットに細胞懸濁液を８ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を８ｍＬを１ｍＬずつ８本の凍結保存用チューブに分注するステップに関する。 
　また本発明において、ピペットに細胞懸濁液を２ｍＬ、５ｍＬ、８ｍＬ、１０ｍＬ，１３ｍＬ，２５ｍＬ，３０ｍＬ、５０ｍＬ、または８０ｍＬずつとり、ピペッティングを２～１０回、好ましくは３～７回、さらに好ましくは４～６回、最も好ましくは５回ピペッティングをして均一化し、懸濁液を２ｍＬ、５ｍＬ、８ｍＬ、１０ｍＬ、１３ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬ、または８０ｍＬを１ｍＬずつ２本、５本、８本、１０本，１３本，２５本，３０本、５０本、または８０本の凍結保存用チューブに分注する場合もある。 
　本発明において「分注」とは、一般的な意味を表し、分けて注ぐ操作であれば特に限定されないが、たとえば細胞に影響が少ない短時間に、複数の凍結保存用チューブ等の容器に均等に分注する方法が用いられる。本発明において「均等」とは各容器の細胞数が、均一であることを意味する。本発明において「均一」とは、たとえば細胞数の差が３０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１５％以内、さらに好ましくは１０％以内が挙げられるが、これに限定されない。 
　本発明において、一度の操作で分注する容器の個数は特に制限されず、分注する容器の一個あたりの用量にも依存するが、例えば１～３０ｍＬずつ分注する場合があり、具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍｌずつを分注する場合がある。例えば１ｍＬずつ分注する場合は、１５本以下、好ましくは１０本以下、より好ましくは６本以下である。分注速度としては、特に制限されないが、例えば６本の容器に１ｍｌずつ分注する場合、１ｍＬあたり１分半以内、好ましくは２５秒以内で分注するのが好ましい。これより遅いと均等に細胞個数を保つことができない場合がある。 
　本発明の別の態様において、各容器間の細胞数の差がＫ％となる分注速度は、細胞種による直径、密度、溶媒の粘度、溶媒の粘度、分注個数、容器一個当たりの分注用量に依存して、以下の式で算出することもできる： 
容器一個あたりの分注時間（Ｘ）≦分注器具および/または分注システムに一個当たりの分注容量を吸い上げたときの高さのＫ％÷ｖｓ÷(分注個数－１) 
ｖｓ ：細胞の沈降速度 
ｖｓ=Ｄｐ ２(ρｐ-ρｆ)ｇ/１８η(ストークスの式) 
ｖｓ：沈降速度 
Ｄｐ：細胞の直径 
ρｐ：細胞の密度 
ρｆ：溶媒の密度 
ｇ：重力加速度 
η：溶媒の粘度 
　高さのＫ％が５％、１０％、１５％、２０％のいずれかである場合がある。好ましくは１０%である。具体的な例として、１０～３０ｍＬ容量の細胞懸濁液を調製し、それを３～５回ピペッティングし、分注器具に必要量とる場合があるがこれに限定されない。細胞の直径は、通常骨格筋芽細胞が約１０μｍ、リンパ球が約２０μｍ、心筋細胞約が５０～８０μｍであるがこれに限定されない。細胞懸濁液の粘度が室温で１０ｐ以下である場合があるがこれに限定されない。 
　本発明の別の側面において、増殖培養ステップをさらに含んでいてもよい。 
　これらの細胞を増殖培養する方法は、特に限定されず、培養する細胞によって既知の方法を用いることができる。使用する培地は、特に限定されないが、たとえばＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７培地等に適宜、抗生物質、バッファー、ウシ血清等の動物血清を必要に応じて加えればよい。培養ｐＨ、温度等の培養条件は特に限定されず、選択された細胞に応じて増殖に適した条件を設定すればよいが、動物細胞の場合は、例えばｐＨ６．０～８．０、好ましくはｐＨ７.２-７.４で行われる場合がある。これらの培養に用いる培養基材は、細胞が増殖し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。 
　本発明の一側面において、さらに凍結保存するステップを含んでいてもよい。 
　本発明における細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には０℃以下、好ましくは－２０℃以下、より好ましくは－４０℃以下、さらに好ましくは－８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて－８０℃に達するまで１～５時間、好ましくは２～４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結保存用容器に収容して供することにより達成することができる。凍結保存用容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結保存用容器としては、既知の任意のもの、例えば、ＢＩＣＥＬＬ(Ｒ)（日本フリーザー）などを用いることができる。 
　凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、本発明の調製方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。 
　本発明に用いる凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。 
　培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して２～２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本発明の範囲内である。 
　本発明の一側面において、解凍ステップをさらに含んでいてもよい。 
　本発明において、凍結した細胞の解凍は、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には４～５０℃、好ましくは３０℃～４０℃、より好ましくは３６～３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には２分以内であり、特に２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。 
　本発明の培養細胞を調製する方法は、洗浄ステップを含んでもよい。 
細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後、すなわち細胞集団を培養基材に播種するステップの前に行われる場合がある。 洗浄はさらにウシ等の動物由来血清を除去する目的で行われることがある。 
　本開示の製造方法は、さらに細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。 
　本発明において、解凍後に本細胞を用いてシート状細胞培養物を形成するステップをさらに含んでいてもよい。 
　播種した細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、ＷＯ ２０１４/１８５５１７などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞のシート化は、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。シート化培養により、培養基材上（培養容器内）のシート状細胞培養物の厚みは減少する。すなわち、播種後、細胞が沈降した後、その後のシート化により培養基材上で細胞層の厚みは減少するが、シート状細胞培養物は培養基材からの剥離により収縮し、再び厚みを増す。シート化による厚みの減少は、播種直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約９０％～約７０％程度である。 
　シート化のためのインキュベート時間は、シートが形成され得る時間であれば特に限定されない。シートが形成され得る時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、２時間程度でシートが形成され得る。したがって一態様において、シート化のためのインキュベート時間は、２時間以上であり得る。 
　上述のとおり本発明者らは、シート状細胞培養物が形成された後、形成されたシート状細胞培養物が自然に培養基材から剥離する前に人為的に剥離することにより、剥離後遊離したシート状細胞培養物に癒着防止の処理を施すことで、製造されたシート状細胞培養物を高品質に保つことが可能であることを見出したものである。したがってシート化のためのインキュベートは、シート状細胞培養物が自然剥離されるより前に終了される。インキュベート開始から自然剥離が開始されるまでの時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、６～１２時間程度で自然剥離が生じる場合が多い。したがって本開示の一態様において、シート化のためのインキュベート時間の上限は１２時間、１１．５時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間または４時間であり得る。 
　したがって本開示の製造方法において、シート化のためのインキュベート時間は、２～１２時間、２～１１．５時間、２～１１時間、２～１０時間、２～９時間、２～８時間、２～７時間、２～６時間、２～５時間または２～４時間であり得る。 
　培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と称することもある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本開示の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０－７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。 
　基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本開示に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。 
　基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ－グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。 
　本開示の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ－アルギニン：約６３．２ｍｇ／Ｌ～約８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン：約３５ｍｇ／Ｌ～約６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン：約４．４ｍｇ／Ｌ～約５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：約２．３ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン：約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－イソロイシン：約６６ｍｇ／Ｌ～約１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン：約１０５ｍｇ／Ｌ～約１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－リジン：約１４６ｍｇ／Ｌ～約１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン：約１５ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ－フェニルアラニン：約３３ｍｇ／Ｌ～約６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－セリン：約３２ｍｇ／Ｌ～約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トレオニン：約１２ｍｇ／Ｌ～約９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン：約４．１ｍｇ／Ｌ～約１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン：約１８．１ｍｇ／Ｌ～約１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－バリン：約９４ｍｇ／Ｌ～約１１７ｍｇ／Ｌである。 
　また、本開示の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ－パントテン酸カルシウム：約４ｍｇ／Ｌ～約１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：約４ｍｇ／Ｌ～約１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：約０．６ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌ、ｉ－イノシトール：約７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：約４ｍｇ／Ｌ～約６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：約０．００３８ｍｇ／Ｌ～約０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：約３．４ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：約２．１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌである。 
　細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分が自己由来のものではない場合は、臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物となり得るため、臨床への適用にあたってはかかる非自己由来成分を排除することが望ましい場合がある。したがって、本開示の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本開示のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本開示の特に好ましい態様において、細胞培養液は、非自己由来の添加物を実質的に含まない。一態様において、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。 
　本開示の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、シート状細胞培養物中の血清アルブミン含量が約５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本開示においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。 
　本開示の一態様において、細胞培養液は血清を含む。血清は、同種血清であっても異種血清であってもよい。特定の態様において、細胞培養液は自己血清を含む。血清でコートされた培養基材上で細胞を培養する場合、細胞培養液に含まれる血清（細胞の培養に用いる血清）は、培養基材をコートするために用いる血清と同じであっても異なってもよい。一態様において、細胞培養液に含まれる血清は、培養基材をコートするために用いる血清と同一であり、特定の態様において、該血清は自己血清である。血清は、本開示の製造方法に用いるためのものであってもよい。例えば、血清は、細胞の培養に用いるためのものであっても、培養基材をコートするためのものであってもよい。 
　本開示の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、細胞培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば約０．００５μｇ／ｍＬ以上である。 
　したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本開示における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本開示の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本開示における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。 
　本開示の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。 
　本開示の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６μｇ／ｄＬ～１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が約１０％であれば、セレン濃度は、例えば、約１．０μｇ／ｄＬ～約１．７μｇ／ｄＬ未満である）。 
　本開示の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去するステップが不要となる。したがって、本開示の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去するステップを含まない。 
　ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。 
　本発明の培養細胞を調製する方法は、さらに凍結保存用容器中の懸濁液を、前述の凍結保存用容器中に格納し冷蔵保存および/または予備冷却するステップを含んでもよい。 
　本発明の一側面において、さらに冷蔵保存するステップを含んでもよい。冷蔵保存するステップは、凍結する前であれば、いつ行ってもよいが、例えば凍結する直前に行ってもよいし、好ましくは冷蔵した後、凍結する前に予備冷却するステップを加えてもよい。 
　本発明において「冷蔵」とは、一般的な意味を表し、冷蔵する行為そのものを指し、実際の細胞の温度は問わないが、たとえば０℃～１０℃であって、対象物が凍結しない温度が挙げられ、好ましくは２～８℃であるがこれに限定されない。冷蔵とはある一定の温度の範囲（例えば、０℃～１０℃の範囲）で温度が上昇しないように温度を維持することを含む。また冷蔵には、常温から冷蔵温度まで降下する時間を含む場合もあり、必ずしも２～８℃に到達する必要はない。ここで「常温」とは、一般的な意味を表し、例えば１５～２５℃であるがこれに限定されない。 
本発明において「冷蔵しながら保存する」とは前記の冷蔵する行為を行いながら保存することを指し、「保存」とは一定時間または期間に同じ場所へ置くことを言い、保存の条件に特に制限はなく、静置であっても振盪下であってもよい。 
　本発明において用いられる分注容器（凍結保存用チューブ）は、該細胞が保存できれば特に限定されず、たとえばクライオチューブ（Ｎｕｎｃ社）等市販の凍結保存用チューブを用いることができる。容量は特に限定されないが、例えば１～１０ｍｌが好ましく、１～２ｍｌのものが好適に用いられる。材質は特に限定されず、金属、プラスチック、ガラス等を用いることができるが、例えば、ポリプロピレン等のプラスチックが好適に用いられる。 
　本発明において、冷蔵保存する時間は特に限定されないが、例えば、解凍後の細胞のバイアビリティを高く保つためには、１２０分以下、好ましくは９０分以下、さらに好ましくは６０分以下、最も好ましくは３０分以下である。冷蔵保存時間が１２０分を超えると、解凍後の細胞のバイアビリティの低下を招く場合がある。 
　本発明の一の態様において、冷蔵保存するステップは、凍結する前に、例えば１～９.０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌの高密度の細胞懸濁液を、凍結用チューブに常温で分注した後、例えば６０分間、好ましく約３０分間より短く、あらかじめたとえば２～８℃の冷蔵温度まで冷蔵しておいたＢＩＣＥＬＬ等の凍結処理容器の中に格納し、室温で保存することによって行うことができる。この場合凍結処理容器中の細胞懸濁液の濃度はその冷蔵時間によって冷蔵温度まで降下しない場合があってもよい。また細胞懸濁液の温度の効果速度は、例えば１５℃から８℃までの場合、６０分～３０分で約０．１２（６０分）～０．２３（３０分）℃/分、２５℃～８℃までの場合、６０分～３０分で約０.２８(６０分）～０．５７（３０分）℃/分であるがこれに限定されない。これにより、室温で同じ時間放置する場合に比べて、細胞へのダメージが軽減される効果を得ることができる。 
　本発明の一側面において、さらに予備冷却ステップを含んでもよい。「予備冷却」とは、冷却しながら保存する行為を指し、該細胞を凍結する前に、細胞懸濁液を冷却しながら一定時間保持することを言い、冷却温度は特に限定されないが、例えば０℃～１０℃、０℃～８℃、２℃～８℃、または２℃～４℃等であって細胞が凍結しない温度が好適である。冷却とはある一定の温度の範囲（例えば、０℃～１０℃の範囲）で温度が維持または低下するように設定することを含む。冷却は凍結ステップの前に予備的におこなわれることがあり、予備冷却と呼ばれる。予備冷却を行う時間は、特に限定されないが、たとえば３０分～１２０分、好ましくは４０分～１００分、より好ましくは約６０分等である。３０分より短いか、あるいは１２０分より長いと細胞への障害を抑えることができない場合がある。 
　本発明において該細胞懸濁液の細胞密度に特に制限はないが、１．０～９．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌの比較的高密度であるのが好ましく、好ましくは約２．０～５．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌ、より好ましくは約３．０×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌである。 
　本発明において、予備冷却ステップは冷蔵保存ステップに続いて行ってもよいし、冷蔵保存ステップを経ずに行ってもよいが、好ましくは短い冷蔵保存ステップを経た後予備冷却ステップを行うことによって、スムーズに予備冷却に導くことができる。 
　本発明の他の態様において、冷蔵保存ステップに引き続いて、予備冷却ステップを行ってもよい。予備冷却ステップは、例えば冷蔵保存ステップで使用した凍結保存用チューブが格納されたＢＩＣＥＬＬを引き続き使用して、細胞懸濁液を冷凍する前に一定時間、例えば３０分～１２０分、好ましくは４０分～１００分、より好ましくは約６０分間、冷却温度、例えば０～１０℃に維持することにより行うことができる。冷蔵手段は特に限定されないが、例えば冷却温度に設定した市販の冷蔵庫の冷蔵室にＢＩＣＥＬＬごと保管してもよい。このステップにより、つぎに細胞懸濁液を凍結する場合に、急激な凍結による細胞の障害を防止することができる。 
　本発明の他の態様において、冷蔵保存ステップに引き続いて予備冷却ステップを行ってもよい。予備冷却ステップは、例えば冷蔵保存ステップで使用したＢｉｃｅｌｌを引き続き使用して、細胞懸濁液を冷凍する前に一定時間、例えば３０分～１２０分、好ましくは４０分～１００分、より好ましくは約６０分間、冷蔵温度、例えば２～８℃に維持することにより行うことができる。冷蔵手段は特に限定されないが、例えば市販の冷蔵庫の冷蔵室にＢＩＣＥＬＬごと保管してもよい。このステップにより、つぎに細胞懸濁液を凍結する場合に、急激な凍結による細胞の障害を防止することができる。 
　本発明の培養細胞が用いられる疾病、傷病等は特に限定されないが、例えば処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）が挙げられる。 
　本発明の用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、医学的および獣医学的に許容される種々の目的の介入を包含する。 
例１ 
　増殖させた骨格筋芽細胞の懸濁液（３．０×１０７個／ｍＬ）を５ｍＬピペットを用いて３～５回ピペッティングして均一に分散させた。そのうち６ｍＬを５ｍＬピペットに分取した。分取した６ｍＬの細胞懸濁液を６本の凍結保存用チューブに１ｍＬずつ分注し、１本目と６本目の細胞数の差を計測した。 
その際、分注容器一個あたりの分注時間を変化させて分注した。 
　その結果、１ｍＬの懸濁液を、２～１０秒の分注時間で分注することで、細胞数を均等（１０％以内の差）に分注できることを確認した。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
例２ 
　リンパ球の懸濁液（３．０×１０６個／ｍＬ）を５ｍＬピペットを用いて３～５回ピペッティングして均一に分散させた。そのうち６ｍＬを５ｍＬピペットに分取した。分取した６ｍＬの細胞懸濁液を６本の凍結保存用チューブに１ｍＬずつ分注し、１本目と６本目の細胞数の差を計測した。 
その際、分注容器一個あたりの分注時間を変化させて分注した。 
　その結果、１ｍＬの懸濁液を２～２５秒の分注時間で分注することで、細胞数を均等（１０％以内の差）に分注できることを確認した。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
上記実験結果と理論値との比較 
　各容器間の細胞数の差が１０％となるためには、理論上以下の式が成り立つ： 
容器一個あたりの分注時間（Ｘ）≦分注器具および/または分注システムに一個当たりの分注容量を吸い上げたときの高さの１０％÷ｖｓ÷(分注個数－１) 
ｖｓ ：細胞の沈降速度 
ｖｓ=Ｄｐ ２(ρｐ-ρｆ)ｇ/１８η(ストークスの式) 
ｖｓ：沈降速度 
Ｄｐ：細胞の直径 
ρｐ：細胞の密度 
ρｆ：溶媒の密度 
ｇ：重力加速度 
η：溶媒の粘度 
（例１の分注時間の理論値） 
・ヒト骨格筋芽細胞を保存液に懸濁した際の沈降速度算出結果 
　: ｖｓ＝０.００３３ｃｍ/ｓ 
・１つの容器当たりの分注容量の１０％の高さ 
　: ５ｍＬピペットの分注容量(１ｍＬ)の１０％の高さ＝０.３６ｃｍ 
・分注個数: ６本 
この場合の算出結果以下のとおりである： 
細胞数の誤差が１０％となるための１個当たりの分注時間≦２２.１ｓｅｃ. 
　この計算結果は例１の実測値と一致していることがわかった。なお理論値によると自動化等により均一な量を分注できるのであれば、１秒も範囲に入り得る。 
（例２の分注時間の理論値） 
・リンパ球様細胞を保存液に懸濁した際の沈降速度算出結果 
　: ｖｓ＝０.０００８ｃｍ/ｓ 
・１つ容器当たりの分注容量の１０%の高さ 
　: ５ｍＬピペットの分注容量(１ｍＬ)の１０%の高さ＝０.３６ｃｍ 
・分注個数: ６本 
この場合の算出結果は以下のとおりである： 
細胞数の差が１０%となるための１個当たりの分注時間≦８７.２ｓｅｃ. 
　この計算結果は例１の実測値と一致していることがわかった。なお理論値によると自動化等により均一な量を分注できるのであれば、１秒も範囲に入り得る。 
　本発明の方法によって調整された細胞は、均一な品質を厳密に求められる医療用途等に非常に有用である。 

Claims (12)

  1. 　細胞懸濁液を分注する方法であって、細胞の個数が均等になるように複数の分注容器に細胞懸濁液を分注するステップを含む方法。 
  2. 　１つの分注容器に分注する時間が以下の式を満たす請求項１に記載の方法。 
    容器一個あたりの分注時間（Ｘ）≦分注器具および/または分注システムに一個当たりの分注容量を吸い上げたときの高さのＫ％÷ｖｓ÷(分注個数－１) 
    ｖｓ ：細胞の沈降速度 
    ｖｓ=Ｄｐ ２(ρｐ-ρｆ)ｇ/１８η(ストークスの式) 
    Ｄｐ：細胞の直径 
    ρｐ：細胞の密度 
    ρｆ：溶媒の密度 
    ｇ：重力加速度 
    η：溶媒の粘度 
  3. 　高さのＫ％が５%、１０%、１５%、および２０%のいずれかである請求項２に記載の方法。 
  4. 　細胞懸濁液の粘度が室温で１０ｐ以下である請求項２または３に記載の方法。 
  5. 　分注容器が凍結保存用チューブである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 
  6. 　分注容器が、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ、および５０ｍＬのいずれかの容量を有するピペットである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 
  7. 　分注するステップが、下記のステップのいずれかである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法: 
    (１)ピペットに細胞懸濁液を３ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を３ｍＬとり１ｍＬずつ３本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
    (２)ピペットに細胞懸濁液を４ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を４ｍＬとり１ｍＬずつ４本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
    (３)ピペットに細胞懸濁液を５ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を５ｍＬとり１ｍＬずつ５本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
    (４)ピペットに細胞懸濁液を６ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を６ｍＬを１ｍＬずつ６本の凍結保存用チューブに分注するステップ、 
    (５)ピペットに細胞懸濁液を７ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を７ｍＬを１ｍＬずつ７本の凍結保存用チューブに分注するステップ、および 
    (６)ピペットに細胞懸濁液を８ｍＬとり、ピペッティングを５回して均一化し、該懸濁液を８ｍＬを１ｍＬずつ８本の凍結保存用チューブに分注するステップ。 
  8. 　分注ステップが、使用に供する培養細胞を調製するためのステップである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 
  9. 　増殖培養ステップ、凍結保存するステップ、解凍ステップ、洗浄ステップ、およびシート状細胞培養物の形成ステップのいずれか一つ以上をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 
  10. 　培養細胞が骨格筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞またはリンパ球のいずれかである請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。 
  11. 　培養細胞が、疾病、傷病の治療に用いるものである請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。 
  12. 　自動化された装置において行う、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。 
PCT/JP2019/010731 2018-03-15 2019-03-15 培養細胞の調製方法 WO2019177133A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020506663A JPWO2019177133A1 (ja) 2018-03-15 2019-03-15 培養細胞の調製方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-047906 2018-03-15
JP2018047906 2018-03-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019177133A1 true WO2019177133A1 (ja) 2019-09-19

Family

ID=67906701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/010731 WO2019177133A1 (ja) 2018-03-15 2019-03-15 培養細胞の調製方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2019177133A1 (ja)
WO (1) WO2019177133A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06133758A (ja) * 1992-10-22 1994-05-17 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 沈降防止注出装置
JP2007183174A (ja) * 2006-01-06 2007-07-19 Matsushita Electric Ind Co Ltd 懸濁液分注装置及び懸濁液分注方法
JP2013102723A (ja) * 2011-11-11 2013-05-30 Kawasaki Heavy Ind Ltd 送液方法、送液ユニット、及び自動培養システム
WO2016147898A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 ロート製薬株式会社 培養細胞製品の製造装置及び製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06133758A (ja) * 1992-10-22 1994-05-17 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 沈降防止注出装置
JP2007183174A (ja) * 2006-01-06 2007-07-19 Matsushita Electric Ind Co Ltd 懸濁液分注装置及び懸濁液分注方法
JP2013102723A (ja) * 2011-11-11 2013-05-30 Kawasaki Heavy Ind Ltd 送液方法、送液ユニット、及び自動培養システム
WO2016147898A1 (ja) * 2015-03-18 2016-09-22 ロート製薬株式会社 培養細胞製品の製造装置及び製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IDE, TOSHINORI: "Exercise 1 Accurate dispensing of cell suspension", INVINCIBLE BIOTECHNICAL SERIES SPECIAL EDITION, CELL CULTURE INTRODUCTION NOTE, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 63 - 65 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019177133A1 (ja) 2021-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5730433B2 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
CN105324480B (zh) 含有海藻糖及葡聚糖的哺乳动物细胞移植用溶液
JP5702060B2 (ja) 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
CA3046169C (en) Mammalian cell cryopreservation liquid
KR102391629B1 (ko) 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법
US20240110157A1 (en) Low temperature-managed cell aggregate and cell aggregate maintaining method
JP2019154360A (ja) 培養細胞の調製方法
WO2019177133A1 (ja) 培養細胞の調製方法
WO2018168983A1 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
JP6670040B2 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
JP6412696B2 (ja) 血清調製方法および器具
JP2019154359A (ja) 培養細胞の調製方法
JP7262443B2 (ja) 貫通構造を有するシート状細胞培養物
JP6130868B2 (ja) 単離されたシート状細胞培養物の製造方法
JP2019154363A (ja) 医療用細胞培養物
WO2019177135A1 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
JP7307408B2 (ja) シート状細胞培養物の製造方法
CN113728089A (zh) 含海藻糖的哺乳动物细胞保存用液
WO2020067442A1 (ja) 細胞の凍結保存方法
WO2020067434A1 (ja) 細胞の凍結保存方法
JP2015062348A (ja) 細胞からエンドトキシンを除去する方法
WO2021065971A1 (ja) 凍結保存細胞の希釈用緩衝液
JP2023173802A (ja) 細胞凝集塊組成物の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19768485

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020506663

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19768485

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1