WO2019171012A1 - Procédure de collecte de selles et procédé de préparation d'un échantillon pour transplantation de microbiote fécal - Google Patents

Procédure de collecte de selles et procédé de préparation d'un échantillon pour transplantation de microbiote fécal Download PDF

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absence
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Carole SCHWINTNER
Alice LEROUX
Clémence MADER
Hervé AFFAGARD
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Definitions

  • the present invention relates to a stool collection procedure of several donors and a method for preparing a fecal microbiota sample.
  • the invention also relates to the use of said sample in fecal microbiota transplantation (TMF, also called fecal microbiota transfer), preferably for treating intestinal dysbiosis.
  • TMF fecal microbiota transplantation
  • the human gut microbiota commonly called “intestinal flora” is the set of microorganisms (bacteria, yeasts and fungi) found in the human gastrointestinal system (stomach, intestine and colon). Bacterial diversity is currently estimated at about 10 3 bacterial species constituting the dominant intestinal microbiota of an adult, with an abundance of 10 14 bacteria, representing a bacterial metagenome of 200 000 to 800 000 genes in each individual, that is 10 to 50 times the number of genes in the human genome. Sterile in utero, the intestine colonizes from the first days of life until evolving towards a single individual microbiota.
  • each person has relatively similar bacteria in terms of species, but the exact composition of its microbiota (species, proportions) is to a large extent (more than 2/3 of the species) specific to the host.
  • the human intestinal microbiota is a very diverse ecosystem, complex and specific to each individual.
  • GvHD Graft-Versus-Host Disease
  • Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is an effective treatment for hematopoietic malignancies and inherited hematopoietic disorders, and is considered the most effective tumor immunotherapy to date [Sung, AD and Chao, NJ. (2013), Concise Review: Acute Graft-Versus-Host Disease: Immunobiology, Prevention, and Treatment, Stem Cells Trans. Med. 2: 25-32].
  • T cells derived from transplanted stem cells can attack host receptor tissues resulting in GvHD, a major complication of allo-HSCT associated with significant mortality (15-25% of all-HSCT deaths).
  • fecal microbiota transplantation In order to restore the intestinal microbiota and thus restore homeostasis (ie symbiosis), fecal microbiota transplantation (TMF) is considered and tested. It consists of introducing the stool of a healthy donor into the gastrointestinal tract of a recipient patient in order to rebalance the altered intestinal microbiota of the host.
  • This fecal microbiota transplantation can be allogeneic (that is, from a healthy individual donor to a patient) or autologous (that is, from an individual to himself).
  • the results obtained on Clostridium difficile infections are encouraging, and some patients have been successfully treated (Tauxe et al, Lab Medicine, Winter 2015, Volume 46, Number 1).
  • transplanted sample has an acceptable profile in terms of viability and diversity of the bacteria, since the suspension of microbiota in its diluent represents the active ingredient (active substance) of the drug.
  • Current transplantation methods are often empirical and do not take special precautions to ensure the diversity of bacteria present in the fecal microbiota samples used, or to better preserve the viability of anaerobic bacteria, major components of the gut microbiota.
  • compositions for the restoration of the intestinal microbiota as well as their manufacturing processes and their administration. This document discloses that compositions comprising samples have a Shannon diversity index of about 0.4-2.5 where the calculations are made at the family level. It is of the order of 1-8 depending on the level of taxonomy (phyla, species etc.) according to which diversity is calculated.
  • fecal microbiota samples with optimal bacterial diversity and viability, to be administered for the treatment and prevention of bacterial intestinal dysbiosis (iatrogenic or non-iatrogenic) and / or associated pathologies.
  • the pathologies involved may be graft-versus-host disease (GvHD), Clostridium difficile infection, ulcerative colitis, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, Crohn's disease, type II diabetes , food allergies, cancer, including leukemia, obesity and morbid obesity.
  • GvHD graft-versus-host disease
  • Clostridium difficile infection Clostridium difficile infection
  • ulcerative colitis inflammatory bowel disease
  • irritable bowel syndrome irritable bowel syndrome
  • Crohn's disease type II diabetes
  • food allergies cancer, including leukemia, obesity and morbid obesity.
  • dysbiosis Other conditions associated with dysbiosis include autism, sclerosis, traveler's diarrhea, chronic vaginal infection (cystitis, mycosis), bone and joint infections, intensive care-related dysbiosis in the hospital, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, schizophrenia, intestinal dysbiosis associated with cancer chemotherapy or immunotherapy, dysbiosis related to alcoholic and non-alcoholic liver diseases.
  • fecal microbiota samples for use in the treatment or prevention of iatrogenic intestinal dysbiosis and / or associated pathologies and complications including but not limited to sepsis, septic shock and gastrointestinal disorders.
  • -intestinal including but not limited to diarrhea, mucositis, abdominal pain and gastrointestinal bleeding.
  • the present invention meets the needs described above.
  • an object of the invention is to provide fecal microbiota samples, having optimal diversity and sufficient bacterial viability, for their use in TMF (Fecal Microbiota Transfer), and which can be easily produced from a reliable and reproducible way.
  • the invention relates to a method for preparing a homogeneous mixture of fecal microbiota from at least two preselected donors comprising the following steps:
  • step d filtering the samples obtained at the end of step d) to form a series of inocula
  • step f grouping said inocula to form a mixture of inocula, g. homogenizing said mixture obtained in step f), in particular by manual stirring or with the aid of a stirring device,
  • the donors are preselected according to the following preselection criteria:
  • BMI Body Mass Index
  • xi optionally, having a varied diet.
  • the qualitative criteria of the samples of step c) comprise:
  • the qualitative criteria of the samples of step c) comprise: absence of the following bacteria: Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A / B), Salmonella Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stxl / stx2, multi-resistant bacteria, Spectral beta-lactamase (ESBL) - Enterococci resistant to vancomycin and glycopeptides (ERV, GRE) and Listeria monocytogenes, carbapenemase-resistant bacteria,
  • Adenovirus F40 / 41 Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus and Picornavirus
  • Aichi Virus and enterovirus absence of the following bacteria: enteroaggregative E. coli (EAEC), E. coli enteropathogenic (EPEC), E. enterotoxigenic E. coli (ETEC) It / st, Shigella / Enteroinvasive E. coli (EIEC) and Plesiomonas shigelloides.
  • the at least one cryoprotective agent and / or loading agent of step d) is a polyol, a di-, tri- or polysaccharide or a mixture thereof and a filler.
  • the aqueous saline solution of step d) comprises maltodextrin and trehalose.
  • the filtration in step e) is carried out with a filter comprising pores with a diameter of less than or equal to 0.5 mm, preferably less than or equal to 265 ⁇ m.
  • the time between the collection of the sample and the end of step g) is less than 76 hours.
  • step g) homogenization is carried out at a temperature between 2 ° C and 25 ° C, preferably between about 2 and 6 ° C, more preferably at about 4 ° C.
  • the method comprises the following transfer step:
  • the homogeneous mixture of fecal microbiota comes from at least four donors, preferably from at least five donors.
  • the invention relates to the use of the homogeneous mixture of fecal microbiota obtainable by the method of the invention in the transplantation of fecal microbiota (TMF) allogeneic.
  • TMF fecal microbiota
  • the homogeneous mixture of fecal microbiota comes from at least four donors and contains the following bacterial butyrate producing genera: Blautia, Faecalibacterium, Aiistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter , Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum and Butyrivibrio.
  • said homogeneous mixture of fecal microbiota has a high diversity, having a Simpson index greater than 15, preferably greater than 20.
  • the invention relates to the use of the homogeneous mixture of fecal microbiota obtainable according to the method of the invention of the invention in the treatment of intestinal dysbiosis.
  • the invention relates to the use of the homogeneous mixture of fecal microbiota obtainable according to the method of the invention of the invention in the treatment of graft-versus-host disease (GvHD).
  • GvHD graft-versus-host disease
  • the invention relates to the use of the homogeneous mixture of fecal microbiota obtainable according to the method of the invention in the treatment of the iatrogenic intestinal dysbiosis and / or associated pathologies and complications including sepsis, septic shock and gastrointestinal disorders, including intestinal inflammation, diarrhea, mucositis, abdominal pain and gastrointestinal bleeding.
  • the invention relates to the use of the homogeneous mixture of fecal microbiota obtainable according to the method of the invention of the invention in the treatment of Clostridium difficile infection and associated diarrhea (CDI), intestinal disease.
  • CDI Clostridium difficile infection and associated diarrhea
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • idiopathic constipation celiac disease, Crohn's disease, obesity and morbid obesity, autism, multiple sclerosis, traveler's diarrhea, chronic vaginal infection (including cystitis and mycosis), bone and joint infections
  • Parkinson's disease type II diabetes, food allergies, cancer, refractory leukemia, Alzheimer's disease , schizophrenia and bipolar disorders, intestinal dysbiosis associated with cancer chemotherapy or immunotherapy, and alcoholic and non-alcoholic liver disease.
  • Figure 1 is a schematic representation of the process for preparing a homogeneous mixture of fecal microbiota from fecal microbiota samples from multiple donors for use in allogeneic TMF.
  • Figure 2 is a histogram showing the percentage viability of the microbiota of the inoculum (inoculum 1, 4, 5, 6 and 2 + 8) and the inoculum mixture (active substance) in inoculum pockets 1 to 15 for storage.
  • Figure 3 is a histogram showing the percent viability of the microbiota of individual inocula and pooled inocula mixtures (inocula) for four batches of product.
  • Lot # 4 is the same lot as used for Example 1 (and illustrated in Figure 2).
  • Figures 4a and 4b show the richness and bacterial diversity of the inocula.
  • Figure 4a The richness (number of bacterial species) measured for the individual inocula and also for the inocula mixture for batches, lot # 1 to lot # 4.
  • Operational taxonomy units were evaluated for 16S ribosomal RNA (16S rRNA). For individual donors, the wealth is between 100 and 350 species.
  • Figure 4b Bray Curtis similarity of individual batch inocula ("Donors"), inocula compared between batches (“Inter-batches”) and inocula pooled in pockets in the same lot (“Intra-lot”).
  • FIG. 5 is a diagrammatic representation of the comparative experiments of Example 3, in which the same stools were used for the realization of the two fabrications of batches of samples, a fabrication according to one embodiment of the invention ("Method Inv. "), Identical to the method described for Example 3, and manufacture according to the method described in Paramsothy et al. [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomized placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389 (10075): 1218-1228], or "Ref Method”.
  • Figure 6 represents the diversity measured according to the Simpson's index inverse in the two groups of samples of Example 3 in the form of box plots.
  • Figure 6a shows the diversity of each sample and
  • Figure 6b shows the diversity of the two groups of samples.
  • Figure 7 is a stacked histogram showing the relative abundance of the 10 bacterial families most present in two groups of samples of Example 3.
  • the group on the right (samples lnv-01 to lnv-10) is produced in a embodiment of the invention.
  • the group on the left “Reference” (samples Ref-01-Ref-10), is produced according to a method of the prior art, Paramsothy et al.
  • Figure 8 shows the relative abundance of the 15 butyrate producing bacterial genera, namely Blautia, Faecalibacterium, Aiistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum and Butyrivibrio, in the stool donors (first box on the left), then in batches homogeneous mixtures obtained from the stools of 3, 4, 5 and 6 donors respectively.
  • Blautia Faecalibacterium
  • Aiistipes Eubacterium
  • Bifidobacterium Ruminococcus
  • Clostridium Coprococcus
  • Odoribacter Roseburia
  • Holdemanella Holdemanella
  • Anaerostipes Oscillibacter
  • Subdoligranulum and Butyrivibrio in the stool donors (first box on the left), then in batches homogeneous mixture
  • Figure 9 shows the species richness in the different batches of homogeneous mixture obtained from the stools of 4, 5 and 6 donors.
  • the present invention relates to a method of collecting and preparing a homogeneous mixture of fecal microbiota from several donors.
  • the invention also relates to the use of said homogeneous mixture in the transplantation of allogenic fecal microbiota, in particular for treating intestinal dysbiosis, and in particular the diseases associated with such dysbiosis.
  • the donors are healthy human subjects.
  • healthy subject we mean a subject not suffering from an imbalance of the intestinal microbiota or a pathology diagnosed / recognized by the medical profession.
  • BMI Body Mass Index
  • xi optionally, having a varied diet.
  • the donor selection criteria are based on those commonly used in Europe for blood donation, but with additional criteria specific to stool donation and the context of fecal microbiota transplantation. Thus, criteria (i) to (xi) have been defined to select donors.
  • the optional criterion for various diets is intended to improve the possibility of having significant bacterial diversity in the fecal microbiota sample. It is therefore preferable that the donor has a varied diet.
  • Various diets means a diet consisting of various vegetables and cereals (which will allow the regular supply of fiber), but also fruits and meats.
  • Bacterial diversity refers to the diversity or variability measured at the genus or species level. Bacterial diversity can be expressed with terms such as “wealth” (number of species observed in a sample), “Shannon's index” and “Simpson's index”. The Shannon index gives an idea of the species diversity, ie the number of species in the sample (species richness) and the distribution of individuals within these species (specific equitability). Simpson's index is derived from wealth and takes into account the relative abundance of each species. It ranges from 0 (low diversity) to 1 (high diversity). The inverse of the Simpson index reflects diversity (considering the richness and relative abundance of species such as the Simpson's index) with a range of values from 0 (low diversity) to infinity (high diversity).
  • the method according to the invention typically, comprises a step a) of sampling at least one stool sample, comprising the fecal microbiota, from the donor subject.
  • Step a) of sampling at least one stool sample can thus be performed by the donor himself, for example, at home, or by a health professional.
  • the collection of at least one stool sample is preferably performed with a collection device designed for this function so that the stool sample is enclosed in an anaerobic environment. It is thus possible to cite the collection device described in patent application WO2016 / 170290.
  • a home faeces collection device is provided to the selected donors with a user guide.
  • a stool sample has a mass of at least 20g.
  • step b Following this sampling step, and in a rapid time, for example, less than 5 minutes after the sampling, preferably less than 3 minutes, more preferably less than 1 minute, the sample is placed in a sealed collection device to oxygen: this is step b).
  • the step of sampling at least one faecal microbiota sample is carried out by depositing directly a stool sample in a collection device, such as that described in the application for patent WO2016 / 170290.
  • the process is generally carried out anaerobically (in anaerobic atmosphere) or in confinement where exposure to air is limited.
  • the control step c) can be performed anaerobically or aerobically or in confinement where exposure to air is limited.
  • the sampling of the sample to make the control tests is done aerobically.
  • steps b) and d) to g) of the process are performed in anaerobiosis or in confinement where exposure to air is limited.
  • the airtight collection device is in a form of the type comprising:
  • a container comprising a body that has an interior space adapted to receive the fecal microbiota sample from the donor subject, and a neck that delimits an access opening to the interior space of the body, and
  • a cover adapted to be removably and sealingly mounted on the neck of the container so as to close off the access opening of the neck and to close the internal space of the body, in which the body of the container consists of a flexible pouch, and wherein at least one of the container and the lid is provided with a discharge member adapted to discharge at least a portion of the gas contained in the interior space of the container body.
  • the device discharge member includes a passageway through one of the container and the lid, and a closure member of the passage to prevent external fluids from entering the interior space of the body. of the container.
  • the device discharge member further comprises a microporous filtration membrane disposed in the passage.
  • the airtight collection device is in a form of the type comprising:
  • a container comprising a body that has an interior space adapted to receive the fecal microbiota sample from the donor subject, and a neck that delimits an access opening to the interior space of the body, and
  • a cover adapted to be removably and sealingly mounted on the neck of the container so as to close the access opening of the neck and to close the interior space of the body
  • the interior space of the container body optionally comprises a chemical device that neutralizes oxygen.
  • a collection device provided with at least one auxiliary device, for example a device feeding schedule adapted to feed the internal fluid space (for example, the solution added in step d)), as described in WO 2016/170290.
  • the ancillary device may also be an analysis tube, used to output a sample for analysis (for example, a qualitative control according to step c)).
  • the airtight collection device is used for steps a) and b): the sampling of the sample of step a) is carried out directly in said device, in particular in the container, and the closure of the device, in particular by means of the lid, places the sample in an oxygen-free atmosphere (step b)).
  • step b makes it possible to carry out steps b), d) and e) in anaerobiosis.
  • a transport step can thus take place.
  • This transport step allows the sample to be repatriated from the sampling site to the laboratory for further processing and analysis.
  • step c) is carried out on the samples taken.
  • This qualitative control aims to eliminate faecal microbiota samples that do not meet the predefined qualitative criteria. Thus the samples retained after the control are considered acceptable for forming the desired homogeneous mixture of fecal microbiota.
  • the quality criteria that are controlled include: consistency of the sample between 1 and 6 according to the Bristol scale, by visual inspection,
  • Criteria may also include:
  • Adenovirus F40 / 41 Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus and Picornavirus
  • Aichi Virus and enterovirus absence of the following bacteria: enteroaggregative E. coli (EAEC), E. coli enteropathogenic (EPEC), E. enterotoxigenic E. coli (ETEC) It / st, Shigella / Enteroinvasive E. coli (EIEC) and Plesiomonas shigelloides.
  • the consistency check of the sample is generally carried out by visual inspection. If the sample has an appearance between 1 and 6, preferably 5, according to the Bristol scale [Lewis, SJ. ; Heaton, K.W. (September 1997). "Stool form scale as a useful guide to intestinal transit time”. Scand. J. Gastroenterol.], It is acceptable and will be retained.
  • the blood and urine absence control in the sample may be performed by visual inspection or other means.
  • rapid immunoassays may be used.
  • the OC Sensor ® test available from MAST Diagnostic in France
  • a quantitative immunoassay that detects hemoglobin with antibodies specific for human globin.
  • the sample is discarded.
  • a control of the absence of certain parasites, viruses and bacteria of the sample can also be achieved.
  • an absence check of certain parasites, viruses and bacteria in the sample is performed once a week, by donor. This means that, typically, for a donor that provides, for example, five samples in the week, one in five samples will be monitored.
  • the step of checking the absence of certain parasites, viruses and bacteria in the sample is carried out on each sample.
  • the checks of absence of certain bacteria, certain parasites and some viruses of the samples are carried out according to the methods known to those skilled in the art.
  • the following bacteria should be absent from the sample: Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A / B), Salmonella Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin-producing E.
  • EIEC E. coli enterotoxigenic stxl / stx2
  • Listeria monocytogenes and multi-resistant bacteria such as gram-negative bacteria producing extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) and vancomycin and glycopeptide-resistant enterococci (ERV, GRE), Listeria monocytogenes, carbapenemase-resistant bacteria, E Enteroaggregative coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), E. coli enterotoxigenic (ETEC) It / st, Shigella / Enteroinvasive E. coli (EIEC) and Plesiomonas shigelloides.
  • EAEC E Enteroaggregative coli
  • EPEC enteropathogenic E. coli
  • ETEC E. coli enterotoxigenic It / st, Shigella / Enteroinvasive E. coli (EIEC) and Plesiomonas shigelloides.
  • the bacteria mentioned above are pathogens whose presence in the collected faecal microbiota sample will exclude the donor of said sample from the selection.
  • the following parasites should be absent from the fecal microbiota sample: Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica and Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Helminths, Strongyloides stercoralis, Isospora sp., Microsporidia and Dientamoeba fragilis.
  • viruses should be absent from the fecal microbiota sample: Adenovirus F40 / 41, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus and Picornavirus (Aichi Virus and Enterovirus).
  • Controls for the presence of bacteria, parasites and viruses are carried out according to methods known to those skilled in the art. Examples include the following methods: cultivation under selective conditions, detection of bacteria, parasites or viruses with antibodies, amplification (with, for example, PCR) and analysis of DNA sequences present in samples.
  • analysis system DNA sequences include the FilmArray ® BioMerieux (France) an automated system that can be used for the detection of bacteria, parasites and viruses.
  • the following parasites can be detected using this system: Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica and Giardia lamblia.
  • Multi-resistant bacteria such as ESBL, ERV and GRE
  • ESBL, ERV and GRE can be detected by cultures under specific conditions, for example commercially available ESBL, VRE or ALOA medium, for example from BioMerieux.
  • the presence of the following bacteria is not a criterion for the exclusion of the sample: enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropothogenic E. coli (EPEC), E. coli enterotoxigenic (ETEC) It / st, Shigella / Enteroinvasive E.coli (EIEC) and Plesiomonas shigelloides.
  • EAEC enteroaggregative E. coli
  • EPEC enteropothogenic E. coli
  • ETEC E. coli enterotoxigenic
  • It / st It / st
  • Shigella / Enteroinvasive E.coli EIEC
  • Plesiomonas shigelloides Plesiomonas shigelloides.
  • the presence of the EBV virus is not an exclusion criterion because this virus is prevalent today in the general human population.
  • Step d) comprises adding a cryoprotectant diluent.
  • the samples are separately transformed into liquid inocula by adding cryoprotective diluent.
  • cryoprotective diluent In general, an aqueous saline solution comprising at least one cryoprotective agent and / or a filler is added to each of the samples retained after the control step c).
  • any suitable diluent / cryoprotectant may be used for the preparation of the inocula.
  • polyols or di-, tri- or polysaccharides, or a mixture thereof can be used.
  • polyol mention may be made of glycerol, mannitol, sorbitol, propylene glycol or ethylene glycol.
  • di-, tri- or polysaccharides mention may be made of dimers, trimers, tetramers and pentamers of different or identical units, said units being chosen from glucose, fructose, galactose, fucose and N acetylneuraminic acid.
  • cryoprotectant is chosen from glycerol, mannitol, sorbitol, propylene glycol, ethylene glycol, trehalose and its analogues, sucrose, galactose-lactose and their mixtures. More preferably, the cryoprotectant is galactose-lactose or trehalose.
  • the amount of cryoprotectant present in the aqueous saline solution is between 3 and 30% by weight relative to the total volume of the final inoculum (w / v), preferably between 4 and 20% (w / v).
  • Feeders that may be mentioned include, for example, partial hydrolysates of starch, in particular wheat or maize, as well as partial hydrolysates of starchy foods, for example of potato, containing large quantities of maltodextrin.
  • the bulking agent is a mixture of maltodextrins, wherein the maltodextrin is present between 3 and 30%, preferably between 4 and 20% (based on the total volume of the final inoculum weight / volume).
  • the diluent / cryoprotectant is an aqueous saline solution comprising at least one cryoprotectant and a filler.
  • the solution contains water and physiologically acceptable salts.
  • the solution will contain calcium, sodium, potassium or magnesium salts with irons of chloride, gluconate, acetate or hydrogencarbonate.
  • the aqueous saline solution may optionally also contain at least one antioxidant.
  • the antioxidant may be chosen from ascorbic acid and its salts, tocopherols, cysteine and its salts, in particular the hydrochloride, and their mixtures.
  • the aqueous salt solution comprises at least one salt selected from sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, potassium fluoride, sodium gluconate and sodium acetate and optionally at least one selected antioxidant among sodium L-ascorbate, tocopherol, cysteine hydrochloride monohydrate and mixtures thereof.
  • the salt is present in the aqueous saline solution at a concentration of between about 5 and 20 g / L, preferably between 7 and 10 g / L (based on the total volume of the final inoculum).
  • the antioxidant is present in the aqueous saline solution in an amount between 0.3 and 1% w / v, preferably between 0.4 and 0.6% w / v (based on the total volume of the final inoculum).
  • the saline aqueous solution comprising at least one cryoprotective agent and / or a filler is added to the fecal microbiota sample with the ratio of weight (g) / volume (ml) of between 1: 0.5 and 1: 10, preferably between 1: 2 and 1: 8, more preferably 1: 4.
  • a sample weight / volume ratio: solution equal to 0.5 weight: 10 volumes means that the sample is mixed with 0.5 weight (for example 0.5 g) for 10 volumes of solution (for example 10 ml).
  • step d) of adding an aqueous saline solution comprising at least one cryoprotective agent and / or a filler is carried out anaerobically or in confinement where the exposure to air is limited.
  • the saline solution comprising at least one cryoprotective agent and / or a filler is added to the ancillary device of the collection device mentioned below, and the solution is added to the sample. stool via a closed pipe.
  • the mixture of the sample with at least one aqueous saline solution comprising at least one cryoprotective agent and / or a filler may in particular be carried out by kneading in order to obtain a homogeneous mixture.
  • the samples obtained after this dilution step are then filtered in step e).
  • the filtration step is carried out with one (or more, having pores increasingly reduced in size) filter (s) comprising pores with a diameter of less than or equal to 0.5 mm, preferably less than or equal to 265 pm.
  • the pore size gradually decreases.
  • the first filters used comprise pores with a diameter of less than or equal to 2 mm, preferably less than or equal to 1 mm.
  • the last filter used comprises pores with a diameter less than or equal to 0.5 mm, preferably less than or equal to 265 ⁇ m.
  • this filtration step e) is performed in anaerobiosis, or in confinement where exposure to air is limited.
  • the sample from step d) can be pushed through the filters manually, by mechanical action, by gravity, by vacuum or by other appropriate means.
  • the same amount (in terms of weight) of stool per donor is used to form the inoculum, that is to say to perform steps d) and e).
  • suitable amounts are, for example, 25-80g, preferably 40g.
  • each individual inoculum is produced using the same amount of fecal microbiota sample.
  • Step f) consists in grouping the inocula resulting from the filtration step e).
  • the individual inocula are transferred to a container, preferably a flexible pouch.
  • the volume of this container that groups inocula is IL to 5L, preferably 3L or 5L. This volume may be greater depending on the industrialization scale of the process.
  • the transfer can be carried out manually or by using mechanical means.
  • the transfer of the inocula is carried out using mechanical means, for example a syringe, more preferably with a peristaltic pump. Suitable peristaltic pumps are commercially available, for example, from Interscience (France).
  • the inocula are mixed to form a homogeneous mixture (homogenization step g)).
  • This homogeneous mixture is thus considered a "batch" of fecal microbiota.
  • the mixture of inocula can be achieved by any means.
  • the mixture of the inocula can be carried out manually or by mechanical means known to those skilled in the art. For example, there may be mentioned a stirring tray, available, for example, from Stuart (England).
  • a stirring rate of 80-200 rpm, preferably between 90 and 150 rpm, more preferably 100-135 rpm, may be used.
  • the homogenization can take place for a period of time of between 10 minutes and 2 hours, preferably 20 minutes and 1 hour, more preferably for 30 minutes. The duration depends on the stirring speed.
  • a colorimetric test can be used to check if the mixture is homogeneous.
  • a visual inspection can also be used.
  • a colorimetric test followed by a visual inspection is performed to determine if the blend is homogeneous.
  • the homogenization step can be carried out at a temperature between 2 and 25 ° C, preferably between 2 ° C and 8 ° C, more preferably at about 4 ° C.
  • an analysis step can be carried out on the homogeneous mixture obtained after step g), before the mixture is stored or freeze-dried (see details below).
  • PH and pO 2 can be measured.
  • the methods known to those skilled in the art are used to perform these measurements.
  • the pO 2 of the mixture is less than 10%, preferably less than 5%; typically the pH is between 4 and 7, preferably between 4.5 and 6.5.
  • step g there is less than 76 hours between the beginning of step a) and the end of step g).
  • the final product (the homogeneous mixture) meets the following specifications:
  • the viability greater than 20%, preferably greater than 40% for lyophilization.
  • the number of events (bacteria) greater than 10 9 bacteria / ml.
  • Bacterial diversity the inverse of the Simpson's index greater than or equal to 4.
  • the Simpson's index of the mixture of the inocula is greater than or equal to 10, more preferably greater than 15, even more preferentially, greater than at 20.
  • the homogeneous mixture is transferred (transfer step h) for storage or lyophilization. So the mixture can be transferred into pockets:
  • an analysis step i) can be carried out on the homogeneous mixture obtained after the step of transferring step h) of the homogeneous mixture in its storage place (typically a ladle) or in its place of lyophilization (typically in a freeze-drying device).
  • this analysis step includes visual inspection, viability measurements, taxonomic analysis, and event number / ml measurements. This step of analysis aims to determine if the sample meets the qualitative criteria for its use in TMF therapy.
  • the mixture has a yellow / brown color.
  • the viability must be> 20%.
  • the viability is preferably> 40%. If the mixture is to be lyophilized, it is preferable that the viability is> 40%.
  • the cell concentration measured by flow cytometry is greater than 10 6 , preferably greater than 10 7 bacteria / ml, and more preferably greater than 10 9 bacteria / ml.
  • the Shannon index be greater than 3.5, preferably greater than 4.
  • Example 1 The good quality of the mixture resulting from the process according to one embodiment of the invention has been demonstrated by the applicants.
  • Figure 2 is a histogram showing the percent viability of the microbiota of the inocula of Example 1 (inoculum 1, 4, 5, 6 and 2 + 8) and the inoculum mixture (homogeneous mixture) in 1-15 pockets. inoculum to be stored.
  • Figure 2 demonstrates that the individual inocula (inoculum 1, 4, 5, 6, 2 + 8) do not have the same individual viability, but that the inoculum mixture has its own viability, different from the individual inocula.
  • the method according to the invention ensures a good reproducibility of the final mixture pockets, since the viability of the microbiota is approximately the same for each pocket (greater than 40%).
  • Example 2 The results of a qualitative evaluation of the process, according to one embodiment of the invention, carried out with four lots (Lot # 1 to Lot # 4) different from fresh stool of healthy donors, are shown in Example 2 Lot 4 is the same as that used for Example 1 (and illustrated in Figure 2). In Example 2, the number of donors is 2, 7, 4 and 6 for Lot No. 1, Lot No. 2, Lot No. 3 and Lot No. 4, respectively.
  • Figure 3 further demonstrates that the individual inocula vary, but that the inoculum mixture has its own viability, different from the individual inoculum.
  • the viability of batches # 1 to 4 is between 46.1% and 60.1%, which is excellent.
  • Figure 4a demonstrates the richness of the samples.
  • the coefficient of variation (CV) was calculated for each inoculum.
  • CV coefficient of variation or relative difference
  • the CV is used to calculate the degree of variation from one sample to another. The smaller the CV value, the more homogeneous or stable the values are.
  • the CV of the individual inocula of the four batches varies between 16% and 81%. This difference is normal because it is known that individual microbiota are very different.
  • the coefficient of variation, per batch is between 0.3% and 2%. This small variation indicates that the mixture of inocula for each batch is homogeneous and stable.
  • the richness measured at the species or genus level is significantly higher in pooled inocula compared with individual inocula. On average, the richness increases by 64% in lot No. 4 and by 147% in lots No. 1 and 3 in comparison with individual inocula.
  • the percentage of Proteobacteria present in the four pooled inocula was measured (see Table 5). The values are 5.5%, 3.7%, 3.1% and 3.4% for batches Nos. 1, 2, 3 and 4 respectively.
  • the grouping of inocula results in an unexpected increase in microbiota richness.
  • the inocula mixture is a sample of faecal microbiota with unique characteristics.
  • Figure 4b demonstrates that the process involves standardization of the products (homogeneous mixture) obtained for a batch, and intended to be used clinically.
  • the figure demonstrates that the Bray Curtis similarity between pockets (containing pooled inoculum) for each lot is greater than 96%. This result shows that in terms of taxonomic profile, the pockets of inoculum (the homogeneous mixture) are homogeneous.
  • Example 3 how the inventors have characterized samples produced according to the method described in the prior art [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomized placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389 (10075): 1218-1228] and how they were compared with those produced according to one embodiment of the invention.
  • the two production methods are described in Figure 5.
  • the samples produced according to one embodiment of the invention had a better viability and a better diversity compared to those produced according to the method of the prior art.
  • the viability of the products has been measured.
  • the viability of the inoculum grouped according to one embodiment of the invention changes from 41.8% on average over 5 samples to 41.4% after one month of storage at -80 ° C +/- 10 ° C.
  • Samples obtained according to the method of Paramsothy et al. from 38.5% on average to 37.5%. This evolution of viability is not significant according to the Wilcoxon test with the p values of 0.462 for the samples according to the invention and a p value of 0.1732 for the reference samples (according to Paramsothy et al.).
  • the coefficient of variation (CV) for the samples prepared according to the method of the invention at 0 days is 0.010 compared with 0.034 for reference samples according to the prior art (Paramsothy et al.) ⁇
  • the CV of the samples prepared according to the method of the invention is 0.018 compared to 0.028 for the reference samples.
  • Example 1 the inventors have demonstrated that the samples produced for Example 2 have a very small variation which indicates that the mixture of inocula for each batch is homogeneous and stable. By comparison, the reference samples show a higher CV.
  • the inventors analyzed the microbial diversity of the samples of Example 3 by analyzing the 16S rDNA of the samples. Diversity is expressed with the inverse of the Simpson Index which takes into account both the richness (the number of OTUs / species identified) and their respective relative abundance.
  • the diversity observed is therefore greater in the samples prepared according to one embodiment of the invention.
  • the samples prepared according to one embodiment of the invention also have better homogeneity than the "Reference" samples, which is attested by the coefficient of variation, 2.7% for the first and 16.1% for the latter. .
  • the rank test evaluates a "very highly significant" difference between the two methods (p ⁇ 2.2e-16).
  • Figure 7 shows the relative abundance of the 10 bacterial families most present in two groups of samples of Example 3.
  • the lnv-01 to Inv samples showed significantly better homogeneity compared to the replicate samples.
  • 01-Ref-10 produced according to a method of the prior art, Paramsothy et al. Although visual, this representation makes it possible to observe the level of heterogeneity generated by the Paramsothy et al. Method, as well as the differences in abundance for certain families between the two processes. The differences in homogeneity, diversity and abundance are reflected at different levels of the taxonomic scale. Moreover, as shown in Table 6 of Example 3, the inventors have found that certain bacterial species, recognized as being favorable for health, are better preserved in the samples Inv-01 to Inv-10 compared to the samples. 01-Ref-Ref-10.
  • Bifidobacterium (belonging to Actinobacteria) also confirms the results already observed at other taxonomic levels. Bifidobacterium has a relative decrease in relative abundance (0.9% vs. 0.6%) and homogeneity between Paramsothy et al. is less important than those generated by the method according to one embodiment of the invention (see Table 6 of Example 3).
  • Actinobacteria which include the well-known genus Bifidobacterium
  • the method according to the invention in general, has a better reproducibility compared to that of the prior art, which is very important for a process for the manufacture of medicaments, for which the concept of homogeneous and reproducible batch is
  • the richness values measured for the different batches show a high degree of reproducibility between batches with a coefficient of variation of 3.5%.
  • these results demonstrate that there is a homogeneity of fecal microbiota inter-batches, as well as intra-lot.
  • the inventors have observed that the inocula mixture thus obtained has a higher taxonomic profile and bacterial viability than some individual inocula which imply that it is perfectly suited for use in allogeneic TMF (Fecal Microbiota Transfer).
  • the inocula mixture obtained according to the process of the invention is superior in quality for use in TMF because it is characterized by a high and stable viability, as well as a very high diversity. These features allow for a higher adapted microbiota recolonization potential than would be achieved using an individual inoculum.
  • the method for preparing the microbiota samples makes it possible to obtain a homogeneous mixture of microbiota comprising 15 butyrate-producing bacterial genera, namely Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum and Butyrivibrio.
  • This embodiment is illustrated in Example 4.
  • Example 4 describes the experiments to obtain homogeneous stool mixtures of eight donors meeting the selection criteria (step c)). Each saddle that passed the quality control was then treated separately by adding cryoprotective diluent, followed by filtration. Individual inocula obtained on the same day were then mixed to obtain batches of homogeneous products.
  • the stool analysis of the donors and the batches of mixtures produced show that the concentration of the above-mentioned butyrate-producing bacterial genera is stable in the mixtures, regardless of the number of stools used to produce it.
  • the analysis also shows that the abundance of these 15 butyrate-producing bacterial genera is standardized as the number of stools used increases ( Figure 8 and Table 7).
  • not all butyrate-producing bacterial genera are found in the individual stools of donors, whereas all batches made with a mixture of at least four stools all contain them.
  • the process for preparing a homogeneous mixture of fecal microbiota comes from at least four donors.
  • the homogeneous mixture of microbiota comprises the following bacterial genera, butyrate producers, namely Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum and Butyrivibrio.
  • the presence of the above-mentioned butyrate-producing bacterial genera in the product to be administered to the patient is important because these bacterial genera are associated with anti-inflammatory properties.
  • their presence in homogeneous mixtures is advantageous for the use of these homogeneous mixtures in the treatment of intestinal inflammation, especially that associated with intestinal dysbiosis.
  • the homogeneous mixture can be easily produced in a reliable and reproducible manner.
  • the results of Example 1 show a uniformity of viability and taxonomic profile between all the bags of mixture produced.
  • the quality of the microbiota sample (the homogeneous mixture) administered is reproducible, and is identical between pockets from a group of donors. An almost identical product can be administered with each pocket. The patient can thus receive the same product during several treatments, if more than one treatment is necessary.
  • n donors can give sufficient homogeneous mixture to fill about 3 n, preferably 3.2 n pockets, each pocket being sufficient for TMF treatment.
  • the homogeneous mixture of microbiota (or pooled inocula) can be used in the treatment of intestinal dysbiosis and associated pathologies. It represents the active ingredient.
  • the bacterial diversity of the pooled inoculum, produced with the method of the invention, is high, having a Shannon index between 4 and 4.50, and a Simpson's index between 20.2 and 27.2. Applicants have also demonstrated that individual inocula have very varied viabilities, but that the inoculum mixture (pooled inoculum) has excellent viability (about 41% to 60%).
  • the homogeneous mixture of inoculum has a viability greater than 40%, preferably greater than 45% and, more preferably, greater than 50%, more preferably still greater than 55%.
  • the bacterial diversity and viability criteria are very important in the quality assessment of a product for TMF.
  • the homogeneous mixture of microbiota (or pooled inocula) can be administered rectally.
  • the homogeneous mixture of microbiota (or pooled inocula) can be formulated for oral administration.
  • oral formulation mention may be made of the formulations mentioned in patent application EP 17306602.8.
  • a patient who suffers from GvHD can receive an allogeneic TMF comprising the homogeneous mixture of the invention.
  • the patient may receive an allogeneic TMF rectally. He can also receive it orally.
  • the homogeneous mixture of microbiota can be used in the treatment of iatrogenic intestinal dysbiosis and / or associated pathologies and complications including sepsis, septic shock, and gastrointestinal disorders, including diarrhea, mucositis, abdominal pain, and gastrointestinal bleeding. Moreover, the presence of the above-mentioned butyrate-producing bacterial genera having an anti-inflammatory effect may contribute to the efficacy of the treatment.
  • the homogenous microbiota blend can be used in the treatment of Clostridium difficile infection and associated diarrhea (CDI), inflammatory bowel disease (IBD), irritable bowel syndrome (IBS), idiopathic constipation, celiac disease , Crohn's disease, obesity and morbid obesity, autism, multiple sclerosis, traveler's diarrhea, chronic vaginal infection (including cystitis and mycosis), bone infections and infections. joints, Parkinson's disease, type II diabetes, food allergies, cancer, refractory leukemia, Alzheimer's disease, schizophrenia and bipolar disorders, intestinal dysbiosis associated with cancer chemotherapy or immunotherapy, and alcoholic and non-alcoholic liver disease.
  • CDI Clostridium difficile infection and associated diarrhea
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • idiopathic constipation celiac disease
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • obesity and morbid obesity obesity and morbid obesity
  • autism multiple sclerosis
  • traveler's diarrhea chronic
  • the homogeneous mixture of microbiota can be used in the treatment of complications due to hospitalization in intensive care.
  • the invention is further described with reference to the following examples. It will be appreciated that the invention as claimed is not intended to be limited in any way by these examples.
  • Steps a) and b) Eight fresh stools from six healthy donors were collected in the medical device described in WO2016 / 170290, then stored at + 2 ° C / + 8 ° C for a period of 72 hours, during which qualitative data (step c)) were produced. Based on the results of these tests, the stools of donors 3 and 7 were rejected.
  • Stools 1, 4, 5, 6 and 2+ 8 were separately transformed into a liquid inoculum by adding cryoprotective diluent (saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose) and clarified through a filter. (265 pm). Stool 2 and 8 were combined to form an inoculum because of the small amounts of stool removed.
  • cryoprotective diluent saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose
  • inocula 1, 4, 5, 6 and 2+ 8 The viability of inocula 1, 4, 5, 6 and 2+ 8 (five inocula) was tested.
  • the individual inocula were then transferred to a 5L flexible pouch using a peristaltic pump.
  • the bag was then placed on a shaking plate in a refrigerated incubator set at 4 ° C and the inoculum mixture was run at 125 rpm +/- 5% for 30 minutes.
  • the inoculum mixture was transferred to a series of pouches suitable for lyophilization and stored at -80 ° C. The viability and impact of the preservation under different conditions of the homogeneous mixture were tested for each of the pockets prior to storage.
  • Viability tests were performed using flow cytometry technology using an Accuri 6 cytometer (BD Science).
  • the samples were diluted in a 0.9% saline aqueous solution, with 1: 10 serial dilution, up to 1: 10 3 .
  • the samples were labeled with fluorophores propidium iodide (PI) (10 .mu.l / ml) and SYT09 ® 9 (3 seats / mL).
  • PI propidium iodide
  • SYT09 ® 9 seats / mL
  • SYT09 ® penetrates into all cells, whether they are intact or not, attaches to the DNA and emits at 540nm (green) after excitation at 470nm (blue laser).
  • Samples of stool, inoculum or homogeneous mixture are labeled with the mixture of the two fluorophores before being analyzed by flow cytometry. The percentage of live bacteria in relation to the number of total bacteria (live and dead) makes it possible to obtain the bacterial viability of the sample.
  • Each batch of the assay was validated with a positive control (reference inoculum sample stored at -80 ° C) and a negative control (reference sample stored at -80 ° C and treated with a 10-minute incubation in 70 % isopropanol (ratio 1/9), centrifuged, resuspended in 0.9% NaCl and diluted in 10-fold dilution series to 10 3 ).
  • Table 1 Summary of microbiota viability of allogeneic inoculum analyzed Statistical analysis :
  • the inoculum is left at room temperature for 16 hours, sampling is done to determine the viability of the microbiota, the microbiota / pL events and the measurement of pH and pO 2 then the inoculum is stored at -80 ° C.
  • the inoculum is kept at 4 ° C for 16 hours, sampling is done to determine the viability of the microbiota, the microbiota / pL events and the measurement of pH and pO 2, then the inoculum is stored at -80 ° C.
  • Example 2 Using almost the same conditions as for Example 1, the process was carried out on four batches (batch No. 1 to batch No. 4) of fecal microbiota samples, with 2, 8, 4 and 6 donors for the Lot No 1, Lot No 2, Lot No 3 and Lot No 4 respectively.
  • Lot No. 4 corresponds to the batch of Example 1.
  • two of the six stools were combined to form an inoculum because of the small amounts of stool removed.
  • the stools were separately transformed into a liquid inoculum by adding cryoprotective diluent (saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose) and clarified through a filter (265 ⁇ m).
  • cryoprotective diluent saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose
  • the viability and taxonomic profile of the inocula were tested.
  • the individual inocula were then transferred to a flexible bag of 3L or 5L using a peristaltic pump.
  • the bag was then placed on a stirring plate in a refrigerated incubator set at 4 ° C and the inoculum mixture was run at 130 rpm +/- 5% for 30 minutes in an incubator set at 4 ° C. C.
  • the inoculum mixture was transferred to a series of pockets suitable for freezing and stored at -80 ° C.
  • the viability and taxonomic profile of the homogeneous mixtures were tested before storage. For lot No. 1, 2 stools were collected and 5 bags were filled. For lot 2, 8 stools were collected and 29 bags were filled. For lot 3, 5 stools were collected and 21 bags were filled. For batch No. 4, 6 stools were collected, 2 stools were combined to have enough material to form an inoculum and 15 bags were filled.
  • Genomic DNA was extracted from the samples with the NucleoSpin Soil kit (Machery Nagel). A sequencing library was constructed for each sample with the MyTaq HS-Mix kit (Bioline). The banks were then sequenced on a MiSeq V3 2x300 bp run.
  • the Clustering of the sequences was done with VSEARCH and the taxonomic assignment was then performed using the Silva 128 database. Taxonomic analyzes and diversity measurements were performed with the R software (R Core Team 2015, version 3.4. 4, http://www.r-project.org). For the diversity measurements, 20 subsamples of 60,000 sequences were made for each sample and the median was measured.
  • Table 4 shows the viability of the batches.
  • the viability assessment of individual inocula ranged from 16.8% to 67.6%.
  • the viability of batches of pooled inocula is given in the Table below, and is between 46.1 and 60.2%.
  • the aim of this study is to compare two methods of preparing faecal microbiota samples from multiple donors:
  • Viability analyzes and metagenomic analyzes were performed to compare the viability of the final products obtained and their taxonomic homogeneity.
  • the "Inv" stools were separately transformed into a liquid inoculum by adding cryoprotective diluent (saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose) and clarified through a filter (265 ⁇ m).
  • cryoprotective diluent saline aqueous solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose
  • the individual inocula were then transferred to a flexible bag of IL using a peristaltic pump.
  • the bag was then placed on a shaking plate in a refrigerated incubator set at 4 ° C and the inoculum mixture was run at 125 rpm +/- 5% for 30 minutes.
  • the inoculum mixture was transferred to a series of 10 cryotubes and stored at -80 ° C.
  • Table 6 below shows the relative abundance of Actinobacteria, Prevotella and Bifidobacteria in the “Inv” and “Ref” samples.
  • a production campaign aimed at obtaining homogeneous mixtures of stools was carried out as described in Example 1.
  • the stools of 8 donors meeting the selection criteria of step c) were collected daily over a period of 5 days. weeks.
  • the stools were separately transformed into a liquid inoculum by adding cryoprotective diluent (aqueous saline solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose), and clarified through a filter (265 ⁇ m).
  • cryoprotective diluent aqueous saline solution containing a mixture of 20% maltodextrin and trehalose
  • Genomic DNA was extracted from the stool mixtures with the Nucleospin Soil Kit (Macherey Nagel).
  • a sequencing library was constructed for each genomic DNA sample using the TruSeq kit (Illumina) according to the supplier's recommendations. The banks were then sequenced simultaneously in "paired-end" on a run HiSeq2500 (Illumina).
  • Figure 8 shows the relative abundance of the 15 butyrate-producing bacterial genera, namely Blautia, Faecalibacterium, Astipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum and Butyrivibrio, in the stool donors (first bar left), then in the batches homogeneous mixtures obtained from the stools of 3, 4, 5 and 6 donors respectively.
  • the relative abundance of these genera is stable in each lot and is standardized when the number of stools used to obtain the homogeneous mixture increases (see Table 7 below).
  • Table 7 Coefficients of variation of 15 butyrate-producing bacterial genera in donors and in different lots While not all butyrate-producing bacterial genera are found in all individual stools, batches made with a mixture of at least four stools all contain them (data not shown).

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal provenant d'au moins deux donneurs présélectionnés. Le mélange homogène de microbiote fécal ainsi obtenu a une diversité bactérienne et une viabilité élevées. Le mélange homogène de microbiote fécal peut être utilisé pour le traitement de la dysbiose intestinale et pour le traitement des pathologies associées à une telle dysbiose.

Description

PROCEDURE DE COLLECTE DE SELLES ET PROCEDE DE PREPARATION
D'UN ECHANTILLON POUR TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FECAL
La présente invention se rapporte à une procédure de collecte de selles de plusieurs donneurs et un procédé de préparation d'un échantillon de microbiote fécal.
L'invention se rapporte également à l'utilisation dudit échantillon dans la transplantation de microbiote fécal (TMF, aussi appelé transfert de microbiote fécal), de préférence pour traiter les dysbioses intestinales.
Le microbiote intestinal humain, couramment appelé « flore intestinale », est l'ensemble des micro-organismes (bactéries, levures et champignons) qui se trouvent dans le système gastro-intestinal humain (estomac, intestin et côlon). La diversité bactérienne est estimée à l'heure actuelle à environ 103 espèces bactériennes composant le microbiote intestinal dominant d'un individu adulte, avec une abondance de 1014 bactéries, représentant un métagénome bactérien de 200 000 à 800 000 gènes chez chaque individu, soit 10 à 50 fois le nombre de gènes du génome humain. Stérile in utero, l'intestin se colonise dès les premiers jours de vie jusqu'à évoluer vers un microbiote individuel unique. Chaque personne possède des bactéries relativement proches en termes d'espèces, mais la composition exacte de son microbiote (espèces, proportions) est pour une large part (plus de 2/3 des espèces) spécifique de l'hôte. Ainsi, le microbiote intestinal humain est un écosystème très diversifié, complexe et spécifique de chaque individu.
Le maintien d'une grande diversité du microbiote favorise sa stabilité. Cependant, certaines pathologies ou traitements déséquilibrent le microbiote : les antibiotiques par exemple, ainsi que les maladies à composante inflammatoire, telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), peuvent limiter la diversité du microbiote dans l'intestin. Les traitements antibiotiques (ou antibiothérapie), notamment, résultent en une altération du microbiote, ce qui peut favoriser la prolifération d'organismes pathogènes comme Clostridium difficile. Un certain nombre de pathologies sont associées à une dysbiose intestinale, par exemple la maladie du greffon contre l'hôte (Graft-Versus-Host Disease - GvHD). La greffe ou transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (allo-HSCT) est un traitement efficace contre les malignités hématopoïétiques et les troubles hématopoïétiques héréditaires, et elle est considérée comme l'immunothérapie tumorale la plus efficace à ce jour [Sung, A.D. and Chao, NJ. (2013), Concise Review: Acute Graft-Versus-Host Disease: Immunobiology, Prévention, and Treatment, Stem Cells Transi. Med. 2: 25-32]. Cependant, les lymphocytes T dérivés de cellules souches transplantées peuvent attaquer les tissus récepteurs hôtes entraînant la GvHD, complication majeure de l'allo-HSCT associée à une mortalité significative (15 à 25% des décès après une allo-HSCT). Les patients subissant une allo-HSCT peuvent être simultanément exposés à une chimiothérapie cytotoxique, à une irradiation corporelle totale, à des immunosuppresseurs et à des antibiotiques à large spectre pouvant causer des altérations importantes du microbiote intestinal. En effet, un enrichissement important des Enterococcaceae, ainsi qu'une augmentation de Lactobacillales et une diminution de Clostrid iales, est souvent observé chez les patients après une allo-HSCT. En conséquence, des bactéries dominantes communément rencontrées telles que Enterococcus résistant à la vancomycine, Streptococcus du groupe des viridans et diverses protéobactéries, peuvent entrer dans le sang et provoquer une septicémie. Il est intéressant de noter que ce changement est particulièrement important chez les patients qui développent ensuite une maladie réfractaire du greffon contre l'hôte (GvHD) [Holler et al. (2014), Biol Blood MarrowTransplant. 20(5): 640-645, et Peled, J. (2017) 59th Annual Meeting of the American Society of Hematology, Atlanta, USA, Dec 9-11].
Afin de rétablir le microbiote intestinal et ainsi rétablir l'homéostasie (i.e. la symbiose), la transplantation de microbiote fécal (TMF) est envisagée et testée. Elle consiste en l'introduction des selles d'un donneur sain dans le tube digestif d'un patient receveur, afin de rééquilibrer le microbiote intestinal altéré de l'hôte. Cette transplantation de microbiote fécal peut être allogénique (c'est-à-dire d'un individu donneur sain vers un patient) ou autologue (c'est-à-dire d'un individu vers lui-même). Les résultats obtenus sur les infections de type Clostridium difficile sont encourageants, et certains patients ont été traités avec succès (Tauxe et al, Lab Medicine, Winter 2015, volume 46, Numéro 1). Des études récentes ont aussi démontré que les patients GvHD traités avec TMF ont eu une amélioration des symptômes gastro-intestinaux et ont eu une réduction ou disparition des diarrhées, associée à une reconstruction du microbiote [Kakihana et al. (2017) Transplantation 128 : 2083-2089, et Spindelboeck et al. (2017) Hematologica 102 : e210].
Dans le cas de la transplantation allogénique, il est important que l'échantillon transplanté ait un profil acceptable en termes de viabilité et de diversité des bactéries, car la suspension de microbiote dans son diluant représente le principe actif (substance active) du médicament. Les méthodes de transplantation actuelles sont souvent empiriques et ne prennent pas de précautions particulières pour assurer la diversité des bactéries présentes dans les échantillons de microbiote fécal utilisés, ni pour préserver au mieux la viabilité des bactéries anaérobies, composants majoritaires du microbiote intestinal.
La demande de brevet américaine US 2017/239303 décrit des compositions pour la restauration du microbiote intestinal, ainsi que leurs procédés de fabrication et leur administration. Ce document divulgue que les compositions comprenant des échantillons ont un indice de diversité de Shannon d'environ 0.4-2.5 où les calculs sont effectués au niveau de la famille. Il est de l'ordre de 1-8 selon le niveau de taxonomie (phyla, espèces etc.) en fonction duquel la diversité est calculée.
La publication Paramsothy et al. [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo- controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228] décrit la préparation des compositions de microbiote fécal dans le traitement de la colite ulcéreuse active. Les compositions sont produites par le mélange et l'homogénéisation des selles de 3-7 donneurs, puis une solution aqueuse saline est ajoutée au mélange obtenu (voir page 122, colonne de gauche, « Procédures »). La Figure 3 de la publication de Paramsothy et al. (panneau de droite en haut) montre la diversité phylogénétique des compositions. Une variance importante existe toujours entre les lots produits (indiqué par « Donor batches » dans la Figure), même après avoir regroupé les échantillons de selles des donneurs. Cette variance semble aussi importante que celle entre les donneurs individuels (indiqué par « Individual Donors» dans la Figure). Ainsi, une hétérogénéité importante existe entre les échantillons destinés à traiter les patients. Une telle hétérogénéité n'est pas souhaitable pour une composition pharmaceutique. En effet, pour s'assurer que le patient répond de la même manière à chaque dose (ou échantillon) de microbiote fécal qu'il reçoit, il est nécessaire que les doses soient aussi homogènes que possible, et que les lots soient homogènes également.
Il existe donc un besoin de fournir un procédé de transplantation de microbiote fécal qui soit sécurisé, reproductible, efficace et facile à mettre en oeuvre, notamment à l'échelle industrielle. En outre, il existe un besoin pour un procédé de transplantation de microbiote fécal dans lequel la diversité bactérienne des produits transplantés est la plus élevée possible et dans lequel une homogénéité existe entre les différentes doses (échantillons) de produits transplantés à la même personne. Ainsi, il est nécessaire qu'il existe de l'homogénéité entre les différentes doses issues du même lot de microbiote fécal (homogénéité intra-lot) et entre les différents lots produits (homogénéité inter- lots). La viabilité des bactéries doit être conservée autant que possible au cours du procédé et pendant le stockage.
Il existe un besoin de fournir des échantillons de microbiote fécal ayant une diversité et une viabilité bactérienne optimales, à administrer pour le traitement et la prévention de la dysbiose intestinale bactérienne (iatrogène ou non-iatrogène) et/ou des pathologies associées. Il existe un besoin de fournir un procédé de préparation de tels échantillons. Les pathologies concernées peuvent être la maladie réfractaire du greffon contre l'hôte (GvHD), l'infection à Clostridium difficile, la rectocolite hémorragique, la maladie intestinale inflammatoire, le syndrome du côlon irritable, la maladie de Crohn, le diabète de type II, les allergies alimentaires, le cancer, y compris la leucémie, l'obésité et l'obésité morbide. D'autres pathologies associées à la dysbiose comprennent l'autisme, la sclérose, la diarrhée du voyageur, l'infection vaginale chronique (cystite, mycoses), les infections osseuses et articulaires, la dysbiose liée aux soins intensifs à l'hôpital, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie, la dysbiose intestinale associée à une chimiothérapie anticancéreuse ou à une immunothérapie, la dysbiose liée aux maladies alcooliques et non-alcooliques du foie.
Il est nécessaire de fournir des échantillons de microbiote fécal à utiliser dans le traitement ou la prévention de la dysbiose intestinale iatrogène et/ou des pathologies et complications associées comprenant, mais sans s'y limiter, la septicémie, le choc septique et les troubles gastro-intestinaux, y compris mais non limités à la diarrhée, la mucite, les douleurs abdominales et les saignements gastro-intestinaux.
La présente invention répond aux besoins décrits ci-dessus.
Par conséquent, un objet de l'invention est de fournir des échantillons de microbiote fécal, ayant une diversité optimale et une viabilité bactérienne suffisante, pour leur utilisation dans le TMF (Transfert de Microbiote Fécal), et qui peuvent être facilement produits d'une manière fiable et reproductible.
L'invention concerne un procédé de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal provenant d'au moins deux donneurs présélectionnés comprenant les étapes suivantes :
a. le prélèvement d'au moins un échantillon de microbiote fécal desdits donneurs présélectionnés,
b. dans un délai inférieur à 5 minutes suivant le prélèvement, le placement de l'échantillon obtenu en a) dans un dispositif de collecte étanche à l'oxygène, c. le contrôle qualitatif des échantillons prélevés et l'exclusion des échantillons ne répondant pas aux critères qualitatifs,
d. l'ajout à chacun des échantillons retenus après l'étape de contrôle c) d'une solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge,
e. la filtration des échantillons obtenus à l'issue de l'étape d) pour former une série d'inocula,
f. le regroupement desdits inocula pour former un mélange d'inocula, g. l'homogénéisation dudit mélange obtenu à l'étape f), notamment par agitation manuelle ou à l'aide d'un dispositif d'agitation,
les étapes b) et d) à g) étant réalisées en anaérobiose. Selon un mode de réalisation de l'invention, les donneurs sont présélectionnés selon les critères de présélection suivants :
i. ayant entre 18 et 60 ans,
ii. ayant un Indice de Masse Corporel (IMC) entre 18 et 30,
iii. absence d'antécédents personnels de maladies infectieuses graves, telles que le SIDA, l'hépatite etc., de troubles métaboliques et neurologiques, ou de dépression,
iv. absence de prise récente de médicaments pouvant détériorer la composition du microbiote intestinal,
v. absence d'apparition récente de symptômes associés à une maladie gastro intestinale, tels que fièvre, diarrhée, nausée, vomissement, douleur abdominale, jaunisse, absence d'historique de maladies infectieuses graves, notamment le SIDA, l'hépatite etc .
vi. absence de voyages récents dans des pays tropicaux,
vii. absence de comportement sexuel à risque,
viii. absence de blessure, piercing et/ou tatouage récent(s) (typiquement, dans les dernier trois mois),
ix. absence de fatigue chronique récente (typiquement, dans les dernier trois mois),
x. absence de réaction allergique récente (typiquement, dans les dernier trois mois),
xi. optionnellement, ayant un régime alimentaire divers.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les critères qualitatifs des échantillons de l'étape c) comprennent :
consistance de l'échantillon entre 1 et 6 selon l'échelle de Bristol, absence de sang et d'urine dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les critères qualitatifs des échantillons de l'étape c) comprennent : absence des bactéries suivantes : Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A/B), Salmonella Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin- producing E.coli (STEC) stxl/stx2, des bactéries multi résistantes, Bêta- lactamase à spectre étendu (BLSE) - Entérocoques résistant à la vancomycine et aux glycopeptides (ERV, GRE) et Listeria monocytogenes, bactéries résistantes aux carbapénémases,
absence des parasites suivants : Cryptosporidium parvum, Cyclospora sp Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Helminths, Strongyloides stercoraiis, Isospora sp., Microsporidies et Dientamoeba fragilis,
absence des virus suivants : Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus et Picornavirus (Aichi Virus and enterovirus), absence des bactéries suivantes : E.coli enteroaggregative (EAEC), E.coli enteropathogenic (EPEC), E.coli enterotoxigenic (ETEC) It/st, Shigella/Enteroinvasive E.coli (EIEC) et Plesiomonas shigelloides.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'au moins un agent cryoprotecteur et/ou agent de charge de l'étape d) est un polyol, un di-, tri- ou polysaccaride ou leur mélange et un agent de charge.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la solution aqueuse saline de l'étape d) comprend maltodextrine et tréhalose.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la filtration à l'étape e) est réalisée avec un filtre comprenant des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,5 mm, de préférence inférieur ou égal à 265 pm.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le temps entre la collecte de l'échantillon et la fin de l'étape g) est moins de 76 heures.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape g) d'homogénéisation est réalisée à une température entre 2°C et 25°C, de préférence entre environ 2 et 6°C, plus préférentiellement à environ 4°C. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend l'étape de transfert suivante :
h. le transfert du mélange homogénéisé obtenu à l'étape g) :
i. dans des poches pour stockage à une température d'environ -50°C à -80°C, de préférence, à -80°C, ou pour stockage à une température entre environ 2 à 6 °C pour utilisation du mélange sous 16 heures environ, ou pour stockage à une température entre 10 à 25 °C pour utilisation du mélange sous 4 heures environ,
ii. dans un dispositif de lyophilisation pour lyophilisation.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange homogène de microbiote fécal provient d'au moins quatre donneurs, de préférence d'au moins cinq donneurs.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation du mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention dans la transplantation de microbiote fécal (TMF) allogénique.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange homogène de microbiote fécal provient d'au moins quatre donneurs et contient les genres bactériens producteurs de butyrate suivants : Blautia , Faecalibacterium , Aiistipes, Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus, Clostridium , Coprococcus, Odoribacter, Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter , Subdoligranulum et Butyrivibrio.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit mélange homogène de microbiote fécal a une diversité élevée, ayant un indice de Simpson supérieur à 15, de préférence, supérieur à 20.
L'invention concerne l'utilisation du mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention de l'invention dans le traitement des dysbioses intestinales.
L'invention concerne l'utilisation du mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention de l'invention dans le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD).
L'invention concerne l'utilisation du mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention dans le traitement de la dysbiose intestinale iatrogène et/ou des pathologies et complications associées comprenant la septicémie, le choc septique et les troubles gastro-intestinaux, y compris l'inflammation intestinale, la diarrhée, la mucite, les douleurs abdominales et les saignements gastro-intestinaux.
L'invention concerne l'utilisation du mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention de l'invention dans le traitement de l'infection à Clostridium difficile et la diarrhée associée (CDI), la maladie intestinale inflammatoire (IBD), le syndrome du côlon irritable (IBS), la constipation idiopathique, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, l'obésité et l'obésité morbide, l'autisme, la sclérose en plaques, la diarrhée du voyageur, l'infection vaginale chronique (y compris la cystite et les mycoses), les infections des os et des articulations, la maladie de Parkinson, le diabète de type II, les allergies alimentaires, le cancer, la leucémie réfractaire, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et les troubles bipolaires, la dysbiose intestinale associée à une chimiothérapie anticancéreuse ou à une immunothérapie et la maladie alcoolique et non-alcoolique du foie.
Description des Figures
La Figure 1 est une représentation schématique du procédé de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal à partir des échantillons de microbiote fécal de plusieurs donneurs pour utilisation en TMF allogénique.
La Figure 2 est un histogramme représentant le pourcentage de viabilité du microbiote de l'inoculum (inoculum 1, 4, 5, 6 et 2 + 8) et du mélange d'inoculum (substance active) dans des poches 1 à 15 d'inoculum pour le stockage.
La Figure 3 est un histogramme représentant le pourcentage de viabilité du microbiote des inocula individuels et des mélanges d'inocula (inocula regroupés) pour quatre lots de produit. Le lot N° 4 est le même lot que celui utilisé pour l'Exemple 1 (et illustré dans la Figure 2).
Les Figures 4a et 4b montrent la richesse et la diversité bactérienne des inocula. Figure 4a : La richesse (nombre d'espèces bactériennes) mesurée pour les inocula individuels et aussi pour le mélange d'inocula pour des lots, lot N° 1 à lot N°4. Les unités taxonomiques opérationnelles (en anglais, operational taxonomie units (OTUs)) ont été évaluées en ARN ribosomique 16S (ARNr 16S). Pour des donneurs individuels, la richesse est entre 100 et 350 espèces.
Figure 4b : La similarité Bray Curtis des inocula individuels par lot (« Donneurs »), des inocula comparés entre lots (« Inter-lots ») et des inocula regroupés dans les poches dans le même lot (« Intra-lot »).
La Figure 5 est une représentation schématique des expériences comparatives de l'Exemple 3, dans lesquelles les mêmes selles ont été utilisées pour la réalisation des deux fabrications de lots d'échantillons, une fabrication selon un mode de réalisation de l'invention (« Méthode Inv. »), identique à la méthode décrite pour l'Exemple 3, et une fabrication selon la méthode décrite dans Paramsothy et al. [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228], ou « Méthode Réf ».
La Figure 6 représente la diversité mesurée selon l'inverse de l'indice de Simpson dans les deux groupes d'échantillons de l'Exemple 3 sous forme de boites à moustaches. La Figure 6a montre la diversité de chaque échantillon et la Figure 6b montre la diversité des deux groupes d'échantillons.
La Figure 7 est un histogramme empilé représentant l'abondance relative des 10 familles bactériennes les plus présentes dans deux groupes d'échantillons de l'Exemple 3. Le groupe à droite (échantillons lnv-01 à lnv-10) est produit selon un mode de réalisation de l'invention. Le groupe à gauche, « Référence » (échantillons Ref-01-Ref-10), est produit selon une méthode de l'art antérieur, Paramsothy et al.
La Figure 8 montre l'abondance relative des 15 genres bactériens producteurs de butyrate, à savoir Blautia , Faecalibacterium , Aiistipes, Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus, Clostridium , Coprococcus, Odoribacter, Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter , Subdoligranulum et Butyrivibrio , dans les selles des donneurs (première boite à gauche), puis dans les lots des mélanges homogènes obtenus à partir des selles de 3, 4, 5 et 6 donneurs respectivement.
La Figure 9 montre la richesse en espèces dans les différents lots de mélange homogène obtenus à partir des selles de 4, 5 et 6 donneurs.
Description Détaillée
La présente invention se rapporte à un procédé de collecte et de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal de plusieurs donneurs. L'invention se rapporte également à l'utilisation dudit mélange homogène dans la transplantation de microbiote fécal allogénique, notamment pour traiter les dysbioses intestinales, et en particulier les maladies associées à de telles dysbioses.
En général, selon l'invention, les donneurs sont des sujets humains sains. Par sujet « sain », on entend un sujet non atteint d'un déséquilibre du microbiote intestinal ou d'une pathologie diagnostiquée/reconnue par le corps médical.
Ainsi, pour sélectionner des donneurs potentiels, un certain nombre de critères ont été définis. Ces critères sont les suivants :
i. ayant entre 18 et 60 ans,
ii. ayant un Indice de Masse Corporel (IMC) entre 18 et 30,
iii. absence d'antécédents personnels de maladies infectieuses graves telles que le SIDA ou l'hépatite virale, de troubles métaboliques et neurologiques, ou de dépression,
iv. absence de prise récente (au cours des 3 mois environ précédant le don) de médicaments pouvant détériorer la composition du microbiote intestinal, tels que des antibiotiques,
v. absence d'apparition récente (au cours des 3 mois environ précédant le don) de symptômes associés à une maladie gastro intestinale, tels que fièvre, diarrhée, nausée, vomissement, douleur abdominale, jaunisse, absence d'historique des maladies infectieuses graves, notamment le SIDA, l'hépatite etc . vi. absence de voyages récents (au cours des 3 mois environ précédant le don) dans des pays tropicaux,
vii. absence de comportement sexuel à risque,
viii. absence de contact récent (au cours des 3 mois environ précédant le don) avec du sang humain, par exemple, via une blessure, piercing et/ou tatouage,
ix. absence de fatigue chronique récente (au cours des 3 mois environ précédant le don),
x. absence de réaction allergique récente (au cours des 3 mois environ précédant le don),
xi. optionnellement, ayant un régime alimentaire divers.
Les critères de sélection des donneurs sont basés sur ceux utilisés couramment en Europe pour le don de sang, mais avec des critères additionnels spécifiques au don de selles et au contexte de la transplantation de microbiote fécal. Ainsi, des critères (i) à (xi) ont été définis pour sélectionner les donneurs.
Le critère optionnel relatif au régime alimentaire divers a pour objectif d'améliorer la possibilité d'avoir une diversité bactérienne importante dans l'échantillon de microbiote fécal. Il est donc préférable que le donneur ait un régime alimentaire divers.
Par « régime alimentaire divers », on entend un régime alimentaire composé de légumes variés et de différentes céréales (qui permettront l'apport régulier de fibres), mais aussi de fruits et de viandes.
Par « diversité bactérienne », on entend la diversité ou variabilité mesurée au niveau du genre ou de l'espèce. La diversité bactérienne peut être exprimée avec des termes tels que « richesse » (nombre d'espèces observées dans un échantillon), « Indice de Shannon » et « Indice de Simpson ». L'indice de Shannon donne une idée de la diversité spécifique, c'est à dire du nombre d'espèces de l'échantillon (richesse spécifique) et de la répartition des individus au sein de ces espèces (équitabilité spécifique). L'indice de Simpson est dérivé de la richesse et tient compte de l'abondance relative de chaque espèce. Il est compris entre 0 (faible diversité) et 1 (diversité élevée). L'inverse de l'indice de Simpson permet de refléter la diversité (en considérant la richesse et l'abondance relative des espèces comme pour l'indice de Simpson) avec une gamme de valeurs allant de 0 (faible diversité) à l'infini (diversité élevée).
Le procédé selon l'invention, typiquement, comprend une étape a) de prélèvement d'au moins un échantillon de selles, comprenant le microbiote fécal, du sujet donneur. L'étape a) de prélèvement d'au moins un échantillon de selles peut ainsi être réalisée par le donneur lui-même, par exemple, chez lui, ou par un professionnel de santé.
Le prélèvement d'au moins un échantillon de selles est, de préférence, réalisé avec un dispositif de collecte conçu pour cette fonction de sorte que l'échantillon de selles est enfermé dans un environnement anaérobie. On peut ainsi citer le dispositif de collecte décrit dans la demande de brevet W02016/170290. Ainsi, typiquement, un dispositif de collecte de fèces à domicile est remis aux donneurs sélectionnés avec un guide d'utilisation. De préférence, un échantillon de selles présente une masse d'au moins 20g.
Suite à cette étape de prélèvement, et dans un délai rapide, par exemple, inférieur à 5 minutes suivant le prélèvement, de préférence inférieur à 3 minutes, plus préférentiellement, inférieur à 1 minute, l'échantillon est placé dans un dispositif de collecte étanche à l'oxygène : c'est l'étape b).
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape de prélèvement d'au moins un échantillon de microbiote fécal est réalisée par le dépôt directement d'un échantillon de selles dans un dispositif de collecte, tel que celui décrit dans la demande de brevet W02016/170290.
Par la suite, généralement le procédé s'effectue désormais en anaérobiose (en atmosphère anaérobie) ou en confinement où l'exposition à l'air est limitée. L'étape de contrôle c) peut être réalisée en anaérobiose ou en aérobiose ou en confinement où l'exposition à l'air est limitée. Selon un mode de réalisation de l'invention, le prélèvement de l'échantillon pour faire les tests de contrôles se fait en aérobiose. Selon un mode de réalisation de l'invention, les étapes b) et d) à g) du procédé sont réalisées en anaérobiose ou en confinement où l'exposition à l'air est limitée. En limitant l'exposition à l'air, la viabilité des bactéries constitutives du microbiote fécal et présentes dans l'échantillon est ainsi préservée. De préférence, le dispositif de collecte étanche à l'air se présente sous une forme du type comprenant :
- un conteneur comprenant un corps qui comporte un espace intérieur adapté pour recevoir l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur, et un col qui délimite une ouverture d'accès à l'espace intérieur du corps, et
- un couvercle adapté pour être monté de manière amovible et étanche sur le col du conteneur de manière à obturer l'ouverture d'accès du col et à fermer l'espace intérieur du corps, dans lequel le corps du conteneur est constitué d'une poche souple, et dans lequel au moins l'un parmi le conteneur et le couvercle est pourvu d'un organe d'évacuation adapté pour évacuer au moins une partie des gaz contenus dans l'espace intérieur du corps du conteneur.
De préférence, l'organe d'évacuation du dispositif comprend un passage ménagé au travers de l'un parmi le conteneur et le couvercle, et un élément d'obturation du passage pour empêcher des fluides extérieurs de pénétrer dans l'espace intérieur du corps du conteneur. De préférence, l'organe d'évacuation du dispositif comprend en outre une membrane de filtration microporeuse disposée dans le passage.
Alternativement, le dispositif de collecte étanche à l'air se présente sous une forme du type comprenant :
- un conteneur comprenant un corps qui comporte un espace intérieur adapté pour recevoir l'échantillon de microbiote fécal du sujet donneur, et un col qui délimite une ouverture d'accès à l'espace intérieur du corps, et
- un couvercle adapté pour être monté de manière amovible et étanche sur le col du conteneur de manière à obturer l'ouverture d'accès du col et à fermer l'espace intérieur du corps,
- dans lequel l'espace intérieur du corps du conteneur comprend éventuellement un dispositif chimique neutralisant l'oxygène.
Par exemple, pour réaliser les étapes a) à d) (voire e)) du procédé, selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser un dispositif de collecte muni d'au moins un dispositif annexe par exemple, un dispositif annexe d'alimentation adapté pour alimenter l'espace intérieur en fluide (par exemple, la solution ajoutée à l'étape d)), tel que décrit dans le document WO 2016/170290.
Par ailleurs, le dispositif annexe peut également être un tube d'analyse, utilisé pour sortir un échantillon pour analyse (par exemple, un contrôle qualitatif selon l'étape c)).
De préférence, le dispositif de collecte étanche à l'air est utilisé pour les étapes a) et b) : le prélèvement de l'échantillon de l'étape a) s'effectue directement dans ledit dispositif, notamment dans le conteneur, et la fermeture du dispositif, notamment grâce au couvercle, place l'échantillon en atmosphère sans oxygène (étape b)).
En particulier, le dispositif mentionné ci-dessus, utilisé à l'étape b), permet de réaliser les étapes b), d) et e) en anaérobiose.
De façon optionnelle, une étape de transport peut ainsi avoir lieu. Cette étape de transport permet de rapatrier l'échantillon du lieu de prélèvement au laboratoire, pour traitement ultérieur et analyse.
Après l'étape b), de préférence, en moins de 24 heures après l'étape b), l'étape c) de contrôle qualitatif est réalisée sur les échantillons prélevés. Ce contrôle qualitatif a pour objet d'éliminer des échantillons de microbiote fécal qui ne répondent pas aux critères qualitatifs prédéfinis. Ainsi les prélèvements retenus après le contrôle sont considérés comme acceptables pour former le mélange homogène de microbiote fécal souhaité.
De manière générale, les critères de qualité qui sont contrôlés comprennent : consistance de l'échantillon entre 1 et 6 selon l'échelle de Bristol, par inspection visuelle,
absence de sang et d'urine dans l'échantillon,
Les critères peuvent également inclure :
absence des bactéries suivantes : Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A/B), Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin- producing, E.coli (STEC) stxl/stx2, des bactéries multi résistantes : Bêta- lactamase à spectre étendu (BLSE) - Entérocoques résistant à la vancomycine et aux glycopeptides (ERV, GRE) et Listeria monocytogenes, bactéries résistantes aux carbapénémases, absence des parasites suivants : Cryptosporidium parvum, Cyclosporasp, Entomoeba histolytica, Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Helminths, Strongyloides stercoralis, Isospora sp., Microsporidies et Dientamoeba fragilis,
absence des virus suivants : Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus et Picornavirus (Aichi Virus and enterovirus), absence des bactéries suivantes : E.coli enteroaggregative (EAEC), E.coli enteropathogenic (EPEC), E.coli enterotoxigenic (ETEC) It/st, Shigella/Enteroinvasive E.coli (EIEC) et Plesiomonas shigelloides.
Le contrôle de consistance de l'échantillon est réalisé, de manière générale, par inspection visuelle. Si l'échantillon a un aspect entre 1 et 6, de préférence 5, selon l'échelle de Bristol [Lewis, SJ. ; Heaton, K.W. (September 1997). "Stool form scale as a useful guide to intestinal transit time". Scand. J. Gastroenterol.], il est acceptable et sera retenu.
Le contrôle d'absence de sang et d'urine dans l'échantillon peut être réalisé, par inspection visuelle ou par des autres moyens. Par exemple, des tests immunologiques rapides peuvent être utilisés. Par exemple, le test OC Sensor® (disponible chez MAST Diagnostic en France), un test immunologique quantitatif qui détecte l'hémoglobine grâce à des anticorps spécifiques de la globine humaine.
Si la présence du sang et/ou d'urine est constatée, l'échantillon est éliminé.
Selon un mode de réalisation de l'invention, un contrôle de l'absence de certains parasites, virus et bactéries de l'échantillon peut être également réalisé. Typiquement, un contrôle d'absence de certains parasites, virus et bactéries de l'échantillon est réalisé une fois par semaine, par donneur. Cela signifie que, typiquement, pour un donneur qui fournit, par exemple, cinq échantillons dans la semaine, un échantillon sur cinq sera contrôlé. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'étape de contrôle d'absence de certains parasites, virus et bactéries de l'échantillon est réalisée sur chaque échantillon.
Les contrôles d'absence de certaines bactéries, de certains parasites et de certains virus des échantillons sont réalisés selon les méthodes connues de l'homme de métier. De préférence, les bactéries suivantes doivent être absentes de l'échantillon : Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A/B), Salmonella Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin-producing E.coli (STEC) stxl/stx2, Listeria monocytogenes et les bactéries multi résistantes, telles que les bactéries gram négatif produisant de la Bêta- lactamase à spectre étendu (BLSE) et les Entérocoques résistant à la vancomycine et aux glycopeptides (ERV, GRE), Listeria monocytogenes, bactérie résistante aux carbapénémase, E.coli enteroaggregative (EAEC), E.coli enteropathogenic (EPEC), E.coli enterotoxigenic (ETEC) It/st, Shigella/Enteroinvasive E.coli (EIEC) et Plesiomonas shigelloides.
De préférence, les bactéries citées ci-dessus sont des pathogènes dont la présence dans l'échantillon de microbiote fécal recueilli exclura le donneur dudit échantillon de la sélection.
De manière similaire, de préférence, les parasites suivants doivent être absents de l'échantillon de microbiote fécal : Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica et Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Helminths, Strongyloides stercoralis, Isospora sp., Microsporidies et Dientamoeba fragilis.
De manière similaire, de préférence, les virus suivants doivent être absents de l'échantillon de microbiote fécal : Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus et Picornavirus (Aichi Virus and enterovirus).
Des contrôles de présence de bactéries, de parasites et de virus sont réalisés selon des méthodes connues de l'homme de métier. On peut citer comme exemples les méthodes suivantes : culture dans des conditions sélectives, détection des bactéries, des parasites ou des virus avec des anticorps, amplification (avec par exemple, PCR) et analyse des séquences d'ADN présentes dans des échantillons. Comme système d'analyse des séquences d'ADN, on peut citer le FilmArray® de BioMerieux (France) un système automatisé qui peut être utilisé pour la détection de bactéries, de parasites et de virus. Par exemple, on peut détecter les parasites suivants au moyen de ce système : Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica et Giardia lamblia. On peut également citer la série de tests PCR « Allplex-GI » disponible de Eurobio (France). D'autres parasites tels que Blastocystis hominis, Isopora sp, Microsporidies et Dientamoeba fragilis peuvent être détectés par examen microscopique avec concentration de l'échantillon si nécessaire. Strongyloides stercoralis peut être détecté avec, par exemple coloration élective, après concentration de l'échantillon si nécessaire.
Des bactéries multi résistantes, telles que BLSE, ERV et GRE, peuvent être détectées par cultures dans des conditions spécifiques, par exemple le milieu ESBL, VRE ou ALOA disponibles dans le commerce, par exemple de BioMerieux.
Pour certaines espèces de bactéries et de virus, leur absence de l'échantillon n'est pas requise. Selon un mode de réalisation de l'invention, la présence des bactéries suivantes n'est pas un critère pour l'exclusion de l'échantillon : E.coli enteroaggregative (EAEC), E.coli enteropothogenic (EPEC), E.coli enterotoxigenic (ETEC) It/st, Shigella/Enteroinvasive E.coli (EIEC) et Plesiomonas shigelloides. Selon un mode de réalisation de l'invention, la présence du virus EBV n'est pas un critère d'exclusion car ce virus est prévalant aujourd'hui dans la population humaine générale.
De manière générale, les échantillons retenus après l'étape de contrôle c) qui comprend un contrôle d'absence de sang et d'urine dans l'échantillon, et, éventuellement, un contrôle de l'absence de certains parasites, virus et bactéries dans l'échantillon, passent à l'étape d). L'étape d) comprend l'ajout d'un diluant cryoprotecteur.
De manière générale, pour l'étape d), les échantillons sont transformés séparément en des inocula liquides en ajoutant du diluant cryoprotecteur. De manière générale, une solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge est ajoutée à chacun des échantillons retenus après l'étape de contrôle c).
Tout diluant/cryoprotecteur approprié peut être utilisé pour la préparation des inocula. De préférence, des polyols ou des di-, tri- ou polysaccharides, ou un mélange de ceux-ci peuvent être utilisés. Comme polyol, on peut citer le glycérol, le mannitol, le sorbitol, le propylène glycol ou l'éthylène glycol. Comme di-, tri- ou polysaccharides, on peut citer des dimères, trimères, tétramères et pentamères d'unités différentes ou identiques, lesdites unités étant choisies parmi le glucose, le fructose, le galactose, le fucose et l'acide N acétylneuraminique. Parmi les disaccharides pouvant être utilisés, on peut citer le tréhalose ou l'un de ses analogues ou saccharose. De préférence, le cryoprotecteur est choisi parmi le glycérol, le mannitol, le sorbitol, le propylène glycol, l'éthylène glycol, le tréhalose et ses analogues, le saccharose, le galactose-lactose et leurs mélanges. Plus préférablement, le cryoprotecteur est le galactose-lactose ou le tréhalose.
Typiquement, la quantité de cryoprotecteur présente dans la solution aqueuse saline est comprise entre 3 et 30% en poids par rapport au volume total de l'inoculum final (p / v), de préférence entre 4 et 20% (p / v).
Comme agents de charge, on peut citer par exemple les hydrolysats partiels d'amidon, notamment de blé ou de maïs, ainsi que les hydrolysats partiels de féculents, par exemple, de pomme de terre, contenant de grandes quantités de maltodextrine. De préférence, l'agent de charge est un mélange de maltodextrines, dans lequel la maltodextrine est présente entre 3 et 30%, de préférence entre 4 et 20% (par rapport au volume total de l'inoculum final poids / volume).
Selon un mode de réalisation de l'invention, le diluant/cryoprotecteur est une solution saline aqueuse comprenant au moins un cryoprotecteur et un agent de charge.
Typiquement, la solution contient de l'eau et des sels physiologiquement acceptables. Typiquement, la solution contiendra des sels de calcium, de sodium, de potassium ou de magnésium avec des fers de chlorure, de gluconate, d'acétate ou d'hydrogénocarbonate. La solution aqueuse saline peut éventuellement contenir également au moins un antioxydant. L'antioxydant peut être choisi parmi l'acide ascorbique et ses sels, les tocophérols, la cystéine et ses sels, notamment le chlorhydrate, et leurs mélanges. Préférentiellement, la solution aqueuse saline comprend au moins un sel choisi parmi le chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le fluorure de potassium, le gluconate de sodium et l'acétate de sodium et éventuellement au moins un antioxydant choisi parmi le L-ascorbate de sodium, le tocophérol, le chlorhydrate de cystéine monohydraté et leurs mélanges. Typiquement, le sel est présent dans la solution aqueuse saline à une concentration comprise entre environ 5 et 20 g / L, de préférence entre 7 et 10 g / L (par rapport au volume total de l'inoculum final). Typiquement, l'antioxydant est présent dans la solution aqueuse saline en une quantité comprise entre 0,3 et 1% en poids / volume, de préférence entre 0,4 et 0,6% en poids / volume (par rapport au volume total de l'inoculum final).
De manière générale, la solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge est ajoutée à l'échantillon de microbiote fécal avec le rapport de poids (g) / volume (ml) compris entre 1 : 0,5 et 1 : 10, de préférence entre 1 : 2 et 1 : 8, plus préférentiellement 1 : 4. Un rapport poids/volume échantillon : solution égal à 0,5 poids : 10 volumes signifie que l'échantillon est mélangé à 0,5 poids (par exemple 0,5g) pour 10 volumes de solution (par exemple 10ml).
De préférence, l'étape d) d'ajout d'une solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge est réalisée en anaérobiose, ou en confinement où l'exposition à l'air est limitée. Selon un mode de réalisation de l'invention, la solution saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge est ajoutée dans le dispositif annexe du dispositif de collecte mentionné ci-dessous, et la solution est ajoutée à l'échantillon de selles via une conduite fermée. Le mélange de l'échantillon avec au moins une solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge peut notamment être réalisé par malaxage, afin d'obtenir un mélange homogène.
Les échantillons obtenus après cette étape de dilution sont ensuite filtrés, à l'étape e). De préférence, l'étape de filtration se réalise avec un (ou plusieurs, ayant des pores de plus en plus réduits en taille) filtre(s) comprenant des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,5mm, de préférence inférieur ou égal à 265 pm. Dans le cas où plusieurs filtres sont utilisés, la taille des pores diminue progressivement. De préférence, les premiers filtres utilisés comprennent des pores de diamètre inférieur ou égal à 2mm, de préférence inférieur ou égal à 1mm. De préférence, le dernier filtre utilisé comprend des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,5mm, de préférence inférieur ou égal à 265 pm. Ainsi, on obtient les inocula individuels. De préférence, cette étape de filtration e) est réalisée en anaérobiose, ou en confinement où l'exposition à l'air est limitée. Lors de la filtration, l'échantillon issu de l'étape d) peut être poussé au travers des filtres manuellement, par action mécanique, par gravité, par vacuum ou par d'autres moyens appropriés. Selon un mode de réalisation de l'invention, la même quantité (en termes de poids) de selles par donneur est utilisée pour former l'inoculum, c'est-à-dire pour réaliser les étapes d) et e). On peut citer comme quantité appropriée, par exemple, 25-80g, de préférence, 40g. Ainsi, chaque inoculum individuel est produit en utilisant la même quantité d'échantillon de microbiote fécal.
L'étape f) consiste à regrouper les inocula issus de l'étape de filtration e). En particulier, typiquement, les inocula individuels sont transférés dans un conteneur, de préférence, une poche souple. Typiquement, le volume de ce conteneur qui regroupe des inocula est de IL à 5L, de préférence de 3L ou de 5L. Ce volume peut être plus important selon l'échelle d'industrialisation du procédé. Le transfert peut être réalisé manuellement ou en utilisant des moyens mécaniques De préférence, le transfert des inocula est effectué en utilisant des moyens mécaniques, par exemple, une seringue, plus préférentiellement, avec une pompe péristaltique. Des pompes péristaltiques appropriées sont disponibles dans le commerce, par exemple, chez Interscience (France).
Une fois regroupés, les inocula sont mélangés de manière à former un mélange homogène (étape d'homogénéisation g)). Ce mélange homogène est ainsi considéré comme « un lot » de microbiote fécal. Le mélange des inocula peut être réalisé par tous moyens. Le mélange des inocula peut être réalisé manuellement ou par des moyens mécaniques connus de l'homme de métier. Par exemple, on peut citer un plateau d'agitation, disponible, par exemple, chez Stuart (Angleterre).
En général, un taux d'agitation de 80-200 rpm, de préférence entre 90 et 150 rpm, plus préférentiellement 100-135 rpm, peut être utilisé. En général, l'homogénéisation peut avoir lieu pendant une période de temps comprise entre 10 minutes et 2 heures, de préférence, 20 minutes et 1 heure, plus préférentiellement pendant 30 minutes. La durée dépend de la vitesse d'agitation. L'homme du métier sait déterminer le temps d'homogénéisation nécessaire en fonction de la méthode d'homogénéisation qu'il utilise. Un test colorimétrique peut être utilisé pour vérifier si le mélange est homogène. Une inspection visuelle peut aussi être utilisée. De préférence, un test colorimétrique suivi par une inspection visuelle sont réalisés pour déterminer si le mélange est homogène. L'étape d'homogénéisation peut se faire à une température entre 2 et 25°C, de préférence entre 2°C et 8°C, plus préférentiellement à environ 4°C.
Selon un mode de réalisation de l'invention, une étape d'analyse peut être réalisée sur le mélange homogène obtenu après l'étape g), avant que le mélange soit stocké ou lyophilisé (voir détails ci-dessous). Le pH et le p02 peuvent être mesurés. Les méthodes connues de l'homme de métier sont utilisées pour effectuer ces mesures. Typiquement, le p02 du mélange est à moins de 10%, de préférence à moins de 5% ; typiquement le pH est entre 4 et 7, de préférence entre 4,5 et 6,5.
De préférence, il se passe moins de 76 heures entre le début de l'étape a) et la fin de l'étape g).
De manière générale, le produit final (le mélange homogène) répond aux spécifications suivantes :
L'aspect : suspension colorée, homogène, qui a une couleur jaune/marron.
La viabilité : supérieure à 20%, de préférence, supérieure à 40% pour lyophilisation.
Le nombre d'événements (de bactéries) : supérieur à 109 bactéries/ml.
La diversité bactérienne : l'inverse de l'indice de Simpson supérieur ou égal à 4. De préférence, l'indice de Simpson du mélange des inocula est supérieur ou égal à 10, plus préférentiellement, supérieur à 15, encore plus préférentiellement, supérieur à 20.
De manière générale, le mélange homogène est transféré (étape h) de transfert) pour stockage ou lyophilisation. Ainsi le mélange peut être transféré dans des poches :
- pour stockage à une température d'environ -50°C à -80°C, de préférence à environ -80°C, pour utilisation du mélange au-delà de 16 heures, ou
- pour stockage à une température entre 2 à 6 °C pour utilisation sous 16 heures environ, ou
- pour stockage à une température entre 10 à 25 °C pour utilisation du mélange dans les quatre prochaines heures. Au-delà de quatre heures à température ambiante, le nombre de bactéries augmente et l'homogénéité de l'inoculum peut être réduite.
Sinon, le mélange homogène peut être transféré dans un dispositif de lyophilisation pour lyophilisation ultérieure ou immédiate. Selon un mode de réalisation de l'invention, une étape d'analyse i) peut être réalisée sur le mélange homogène obtenu après l'étape de transfert l'étape h) du mélange homogène dans son lieu de stockage (typiquement une poche) ou dans son lieu de lyophilisation (typiquement dans un dispositif de lyophilisation). Spécifiquement, cette étape d'analyse comprend une inspection visuelle, des mesures de viabilité, une analyse taxonomique et des mesures de nombres d'évènements /ml. Cette étape d'analyse a pour but de déterminer si l'échantillon répond aux critères qualitatifs pour son utilisation en thérapie TMF.
Typiquement, le mélange a une couleur jaune/brun. Typiquement, la viabilité doit être >20%. Selon un mode de réalisation de l'invention, la viabilité est de préférence > 40%. Si le mélange doit être lyophilisé, il est préférable que la viabilité soit > 40%. En général, la concentration cellulaire mesurée par cytométrie en flux est supérieure à 106, de préférence, supérieure à 107 bactéries /ml, et plus préférentiellement supérieure à 109 bactéries /ml. En termes d'analyse taxonomique, en général, il est préférable que l'indice de Shannon soit supérieur à 3,5, de préférence supérieur à 4.
La bonne qualité du mélange issu du procédé selon un mode de réalisation de l'invention a été démontrée par les demandeurs. Les résultats d'une évaluation qualitative du procédé, selon un mode de réalisation de l'invention, réalisée avec six selles fraîches de donneurs sains, sont montrés dans l'Exemple 1. Des tests de viabilité du microbiote ont été effectués sur chaque inoculum avant l'étape f) de regroupement et après l'étape g) d'homogénéisation.
Les demandeurs ont constaté que le mélange homogène constitué des inocula regroupés avait une viabilité bactérienne qui lui est propre, et qui est plus élevée que ce que l'on peut attendre.
La Figure 2 est un histogramme représentant le pourcentage de viabilité du microbiote des inocula de l'Exemple 1 (inoculum 1, 4, 5, 6 et 2 + 8) et du mélange d'inoculum (mélange homogène) dans des poches 1 à 15 d'inoculum destinées à être stockées. La Figure 2 démontre que les inocula individuels (inoculum 1, 4, 5, 6, 2 + 8) n'ont pas la même viabilité individuelle, mais que le mélange d'inoculum a sa propre viabilité, différente des inocula individuels. De plus, le procédé selon l'invention assure une bonne reproductibilité des poches de mélange final, puisque la viabilité du microbiote est approximativement la même pour chaque poche (supérieure à 40%).
Une analyse statistique sur les poches de mélange homogène indique qu'il n'existe pas de différence significative selon un test-t et selon un test de rang, que ce soit pour la viabilité du microbiote que pour le nombre d'événements/pL. Ainsi, les demandeurs ont montré que toutes les poches de mélange préparées sont homogènes entre elles.
Les résultats d'une évaluation qualitative du procédé, selon un mode de réalisation de l'invention, réalisée avec quatre lots (Lot N°1 à Lot N°4) différents de selles fraîches de donneurs sains, sont montrés dans l'Exemple 2. Le lot N° 4 est le même que celui utilisé pour l'Exemple 1 (et illustré dans la Figure 2). Dans l'Exemple 2, le nombre de donneurs est de 2, 7, 4 et 6 pour le lot N°l, le lot N°2, le lot N°3 et le lot N° 4, respectivement. Les demandeurs ont mesuré la viabilité et la diversité bactérienne des inocula individuels (à l'issue de l'étape e)), des inocula regroupés homogénéisés (à l'issue de l'étape g)) et des poches remplies avant stockage.
La Figure 3 démontre encore que les inocula individuels varient, mais que le mélange d'inoculum a sa propre viabilité, différente de l'inoculum individuel. La viabilité des lots N°1 à 4 se situe entre 46,1% et 60,1%, ce qui est excellent.
La Figure 4a démontre la richesse des échantillons. Le coefficient de variation (CV) a été calculé pour chaque inoculum. Le CV (coefficient de variation ou écart relatif) est une mesure de dispersion des données autour de la moyenne. Il s'agit du calcul de rapport entre l'écart-type sur la moyenne. Le CV permet de calculer le degré de variation d'un échantillon à un autre. Plus la valeur du CV est petite, plus les valeurs sont homogènes ou stables. Le CV des inocula individuels des quatre lots varie entre 16% et 81%. Cette différence est normale parce qu'il est connu que des microbiotes individuels sont très différents. Pour chaque inoculum regroupé (à l'issue de l'étape g)), le coefficient de variation, par lot, est entre 0,3% et 2%. Cette faible variation indique que le mélange des inocula pour chaque lot est homogène et stable.
La richesse mesurée au niveau de l'espèce ou du genre est nettement supérieure dans les inocula regroupés, en comparaison avec les inocula individuels. En moyenne, la richesse augmente de 64% dans le lot N° 4 et de 147% dans les lots N° 1 et 3 en comparaison avec les inocula individuels.
En moyenne, la richesse mesurée au niveau du genre de l'inoculum regroupé augmente de 25% pour le lot N° 4 et de 61 % pour les lots N° 1 et 3 en comparaison avec les inocula individuels. La richesse des lots 1 à 4 est surprenante, et ne pourra pas être déduite des richesses individuelles des inocula individuels ; c'est-à-dire que cette richesse des mélanges d'inocula (les inocula regroupés) n'est pas la moyenne, ni directe ni pondérée par la masse des inocula individuels, ni même par fraction des richesses individuelles mesurées. Ce résultat est inattendu.
Le pourcentage de Proteobacteria présente dans les quatre inocula regroupés a été mesuré (voir tableau 5). Les valeurs sont de 5,5%, 3,7%, 3,1% et 3,4% pour les lots N° 1, 2, 3 et 4 respectivement.
En conclusion, le regroupement des inocula résulte en une augmentation inattendue de la richesse du microbiote. Ainsi, le mélange d'inocula est un échantillon de microbiote fécal ayant des caractéristiques qui lui sont propres.
La Figure 4b démontre que le procédé implique une standardisation des produits (mélange homogène) obtenus pour un lot, et destinés à être utilisés en clinique. La Figure démontre que la similarité Bray Curtis entre les poches (contenant l'inoculum regroupé) pour chaque lot est supérieure à 96%. Ce résultat montre qu'en termes de profil taxonomique, les poches d'inoculum (le mélange homogène) sont homogènes.
La diversité bactérienne a été mesurée en utilisant l'inverse de l'indice de Simpson et l'indice de Shannon (Tableau 5).
Les résultats indiquent que l'inverse de l'indice de Simpson pour les donneurs varie entre 5 et 30. Cette différence est normale puisque chaque microbiote est différent. D'après les données présentées dans le Tableau 5, nous pouvons observer que l'inverse de l'indice de Simpson pour l'inoculum regroupé se situe entre 20,2 et 27,2. La diversité bactérienne de l'inoculum regroupé (après l'étape g)) est plus élevée que celle des donneurs individuels, (à l'exception du lot N°3 où la diversité d'un donneur est supérieure à celle pour l'inoculum regroupé). L'indice de Shannon est entre 2,4 et 4,2 pour les donneurs. Cette différence est normale puisque chaque microbiote est différent. L'indice de Shannon pour l'inoculum regroupé est compris entre 4 et 4,50 (voir Tableau 5).
Nous pouvons également observer que pour chaque lot la diversité de l'inoculum regroupé est plus élevée que celle des donneurs individuels. Les valeurs obtenues, comme pour les richesses, ne pouvaient être prédites et constituent pour chacune une caractéristique propre du mélange homogène.
Les inventeurs ont réalisé des tests comparatifs pour démontrer que, de manière générale, le mélange d'inocula susceptible d'être obtenu selon la méthode de l'invention présente des caractéristiques avantageuses par rapport aux échantillons de microbiote fécal obtenus selon des méthodes connues, et en particulier, les méthodes avec des multi-donneurs. Ainsi, il est décrit dans l'Exemple 3 comment les inventeurs ont caractérisé des échantillons produits selon la méthode décrite dans l'art antérieur [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228] et comment ils les ont comparés avec ceux produits selon un mode de réalisation de l'invention. Les deux méthodes de production sont décrites dans la Figure 5. Les échantillons produits selon un mode de réalisation de l'invention présentaient une meilleure viabilité et une meilleure diversité par rapport à ceux produits selon la méthode de l'art antérieur.
La viabilité des produits a été mesurée. La viabilité de l'inoculum regroupé selon un mode de réalisation de l'invention évolue de 41,8 % en moyenne sur 5 échantillons à 41,4% après un mois de stockage à -80°C +/-10°C. Les échantillons obtenus selon la méthode de Paramsothy et al. évoluent de 38,5% en moyenne à 37,5%. Cette évolution de viabilité n'est pas significative selon le test de Wilcoxon avec les valeurs de p de 0.462 pour les échantillons selon l'invention et une valeur de p de 0.1732 pour les échantillons de référence (selon Paramsothy et al.).
Cependant, le test de Wilcoxon montre une différence significative entre la viabilité entre les deux groupes d'échantillons à T0 (jour 0), avec une valeur de p égale à 0,01193, ainsi qu'à 1 mois (p=0.007937). De plus, le coefficient de variation (CV) pour les échantillons préparés selon la méthode de l'invention à 0 jours est de 0,010 comparé avec 0,034 pour des échantillons de référence selon l'art antérieur (Paramsothy et al.)· A un mois, le CV des échantillons préparés selon la méthode de l'invention est de 0,018 comparé à 0,028 pour les échantillons de référence. Comme pour l'Exemple 1, les inventeurs ont démontré que les échantillons produits pour l'Exemple 2 possèdent une très faible variation qui indique que le mélange des inocula pour chaque lot est homogène et stable. Par comparaison, les échantillons de référence montrent un CV plus important.
Les inventeurs ont analysé la diversité microbienne des échantillons de l'Exemple 3 en analysant l'ADNr-16S des échantillons. La diversité est exprimée avec l'inverse de l'indice de Simpson qui prend en compte à la fois la richesse (le nombre d'OTU/espèces identifiées) et leur abondance relative respective.
La Figure 6 montre des valeurs de l'inverse de l'indice de Simpson comprises entre 30,96 et 33,69 (médiane = 32,56) pour les échantillons préparés selon un mode de réalisation de l'invention et entre 13,70 et 23,18 (médiane = 19,31) pour les échantillons « Référence » préparés selon Paramsothy et al. La diversité observée est donc supérieure dans les échantillons préparés selon un mode de réalisation de l'invention. Les échantillons préparés selon un mode de réalisation de l'invention présentent par ailleurs une meilleure homogénéité que les échantillons « Référence », ce qui est attesté par le coefficient de variation, 2,7% pour les premiers contre 16,1% pour les derniers. Le test de rang évalue une différence « très hautement significative » entre les deux méthodes (p<2,2e-16).
La Figure 7 montre l'abondance relative des 10 familles bactériennes les plus présentes dans deux groupes d'échantillons de l'Exemple 3. Les échantillons lnv-01 à Inv- 10 présentaient une homogénéité nettement meilleure par rapport aux échantillons Ref-
01-Ref-10 produits selon une méthode de l'art antérieur, Paramsothy et al. Bien que visuelle, cette représentation permet d'observer le niveau d'hétérogénéité généré par la méthode Paramsothy et al., ainsi que les écarts d'abondance pour certaines familles entre les deux procédés. Les écarts d'homogénéité, de diversité et d'abondance se concrétisent aux différents niveaux de l'échelle taxonomique. D'ailleurs, comme le montre le Tableau 6 de l'Exemple 3, les inventeurs ont constaté que certaines espèces bactériennes, reconnues comme étant favorables pour la santé sont mieux conservées dans les échantillons Inv- 01 à lnv-10 en comparaison avec les échantillons Ref-01-Ref-10. Par exemple, pour le phylum des Actinobactéries, l'abondance relative chute très significativement en utilisant la méthode selon Paramsothy et al. puisque cette abondance médiane est de 3,6% pour les échantillons lnv-01-lnv-10 contre 0,9% pour les échantillons Ref-01 à Ref-10. En termes d'homogénéité, les inventeurs ont observé des coefficients de variation respectifs de 7,8% et 14,5%. D'ailleurs, dans la Figure 7, on observe une diminution importante de l'abondance relative des Coriobacteriaceae, famille du phylum des Actinobacteria, entre les échantillons de l'invention et les échantillons de référence.
Des résultats similaires sont observés au niveau du genre Prevotella (genre relié au phylum des Bacteroidetes) et confirment les différences tant en maintien de certains taxa qu'en matière d'homogénéité des deux méthodes. L'abondance relative de Prevotella est plus élevée dans les échantillons lnv-01-lnv-10 (médiane à 13%) par rapport aux échantillons Ref-01 à Ref-10 (médiane à 11%). En termes d'homogénéité, les inventeurs ont observé des coefficients de variation respectifs de 3,3% et 8 ,5%.
Enfin, le genre Bifidobacterium (appartenant aux Actinobactéries) confirme également les résultats déjà observés aux autres niveaux taxonomiques. Bifidobacterium voit son abondance relative diminuer de façon significative (0,9% vs 0,6%) et l'homogénéité entre les échantillons générés par la méthode Paramsothy et al. est moins importante que pour ceux générés par la méthode selon un mode de réalisation de l'invention (voir le Tableau 6 de l'Exemple 3).
Ces éléments montrent donc que, de manière générale, la méthode revendiquée permet une meilleure conservation de ce phylum associée à une bien meilleure homogénéité au niveau des échantillons fabriqués pour chaque lot, surtout les échantillons produits selon un mode de réalisation de l'invention par rapport à ceux produits selon la méthode de l'art antérieur. Cette meilleure homogénéité est primordiale pour la caractérisation du produit final en tant que produit pharmaceutique. Ainsi, un patient qui reçoit plusieurs échantillons de microbiote fécal du même lot, reçoit chaque fois un produit homogène ayant la même diversité et la même viabilité microbienne. Cette reproductibilité est assurée grâce à la méthode utilisée pour produire les échantillons.
En conclusion, l'analyse métagénomique (séquençage de l'ADNr 16S) de l'Exemple 3 a permis de démontrer que les échantillons obtenus selon un mode de réalisation de l'invention présentaient:
- une meilleure conservation de la diversité illustrée par l'inverse de l'indice de
Simpson très supérieur,
- une conservation significativement supérieure de certains taxa d'intérêt comme les Actinobactéries, qui incluent le genre bien connu Bifidobacterium,
- un niveau d'homogénéité entre les échantillons plus important par rapport à celui obtenu pour l'ensemble des échantillons produits avec la méthode selon Paramsothy et al.
La méthode selon l'invention, de manière générale, a une meilleure reproductibilité par rapport à celle de l'art antérieur, ce qui est très important pour un procédé destiné à la fabrication de médicaments, pour lesquels la notion de lot homogène et reproductible est à la base de la réglementation, Les valeurs de richesse mesurées pour les différents lots (voir Figure 9) montrent en effet une grande reproductibilité entre les lots avec un coefficient de variation de 3,5%. Ainsi, ces résultats démontrent qu'il existe une homogénéité de microbiote fécal inter-lots, ainsi qu'intra-lot. Les inventeurs ont observé que le mélange d'inocula ainsi obtenu a un profil taxonomique et une viabilité bactérienne supérieurs à ceux de certains inocula individuels qui impliquent qu'il est parfaitement adapté pour une utilisation dans le TMF (Transfert de Microbiote Fécal) allogénique. Le mélange d'inocula obtenu selon le procédé de l'invention est supérieur en qualité pour utilisation en TMF car il est caractérisé par une viabilité haute et stable, ainsi qu'une très haute diversité. Ces caractéristiques permettent un potentiel de recolonisation de microbiote adapté plus élevé par rapport à ce qu'on obtiendrait en utilisant un inoculum individuel. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, le procédé de préparation des échantillons de microbiote permet d'obtenir un mélange homogène de microbiote comprenant 15 genres bactériens producteurs de butyrate, à savoir Blautia , Faecalibacterium , Alistipes, Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus, Clostridium , Coprococcus, Odoribacter, Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum et Butyrivibrio. Ce mode de réalisation est illustré dans l'Exemple 4.
L'Exemple 4 décrit les expériences visant à obtenir des mélanges homogènes de selles de huit donneurs répondant aux critères de sélection (l'étape c)). Chaque selle ayant passé le contrôle qualité a ensuite été traitée séparément par ajout de diluant cryoprotecteur, puis filtration. Les inocula individuels obtenus un même jour ont ensuite été mélangés de sorte à obtenir des lots de produits homogènes.
L'analyse des selles des donneurs et des lots de mélanges produits montre que la concentration des 15 genres bactériens précités producteurs de butyrate est stable dans les mélanges, quel que soit le nombre de selles utilisées pour le produire. L'analyse montre également que l'abondance de ces 15 genres bactériens producteurs de butyrate se standardise quand le nombre de selles utilisées augmente (Figure 8 et Tableau 7). De plus, les 15 genres bactériens producteurs de butyrate ne se retrouvent pas tous dans les selles individuelles des donneurs, alors que tous les lots fabriqués avec un mélange d'au moins quatre selles les contiennent tous.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal provient d'au moins quatre donneurs. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le mélange homogène de microbiote comprend les 15 genres bactériens suivants, producteurs de butyrate, à savoir Blautia , Faecalibacterium , Alistipes , Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus , Clostridium , Coprococcus , Odoribacter , Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes , Oscillibacter , Subdoligranulum et Butyrivibrio.
La présence des 15 genres bactériens précités producteurs de butyrate dans le produit destiné à être administré au patient est importante car ces genres bactériens sont associés à des propriétés anti-inflammatoires. Ainsi, d'un point de vue thérapeutique, leur présence dans les mélanges homogènes est avantageuse pour l'utilisation de ces mélanges homogènes dans le traitement de l'inflammation intestinale, notamment, celle associée à la dysbiose intestinale.
Le mélange homogène peut être facilement produit d'une manière fiable et reproductible. Les résultats de l'Exemple 1 montrent une homogénéité de viabilité et de profil taxonomique entre toutes les poches de mélange produit. La qualité de l'échantillon de microbiote (le mélange homogène) administré est reproductible, et est identique entre poches issues d'un groupe de donneurs. Un produit quasi-identique peut être administré avec chaque poche. Le patient peut ainsi recevoir le même produit lors de plusieurs traitements, si plus d'un traitement est nécessaire.
En général, n donneurs peuvent donner suffisamment de mélange homogène pour remplir environ 3 n, de préférence 3,2 n poches, chaque poche étant suffisante pour un traitement de TMF.
Le mélange homogène de microbiote (ou inocula regroupés) peut être utilisé dans le traitement des dysbioses intestinales et des pathologies associées. Il en représente en effet le principe actif. La diversité bactérienne de l'inoculum regroupé, produit avec le procédé de l'invention, est élevée, pouvant avoir un indice de Shannon entre 4 et 4,50, et un indice de Simpson située entre 20,2 et 27,2. Les demandeurs ont aussi démontré que les inocula individuels ont des viabilités très variées, mais que le mélange d'inoculum (inoculum regroupé) a une excellente viabilité (de 41% à 60% environ). Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange homogène d'inoculum a une viabilité supérieure à 40%, de préférence supérieure à 45% et, plus préférentiellement, supérieure à 50%, plus préférentiellement encore, supérieure à 55%. Les critères diversité bactérienne et viabilité sont très importants dans l'évaluation de qualité d'un produit pour TMF.
Il est aussi important que les produits soient homogènes, selon des critères règlementaires pour des produits pharmaceutiques. Les données dans les exemples ci- dessous démontrent que les produits selon l'invention sont homogènes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange homogène de microbiote (ou inocula regroupés) peut être administré par voie rectale. Selon un mode de réalisation de l'invention, le mélange homogène de microbiote (ou inocula regroupés) peut être formulé pour administration par voie orale. Comme formulation orale, on peut mentionner les formulations mentionnées dans la demande de brevet EP 17306602.8.
Comme mentionné plus haut, des études montrent que le TMF peut être efficace dans le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD). Ainsi, le mélange homogène de microbiote de l'invention peut être utilisé dans le traitement de GvHD. Par ailleurs, la présence des 15 genres bactériens précités producteurs de butyrate peut contribuer à l'efficacité du traitement de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD). Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, un patient qui souffre de GvHD peut recevoir un TMF allogénique comprenant le mélange homogène de l'invention. Par exemple le patient peut recevoir un TMF allogénique par voie rectale. Il peut également le recevoir par voie orale.
Le mélange homogène de microbiote peut être utilisé dans le traitement de la dysbiose intestinale iatrogène et/ou des pathologies et complications associées comprenant la septicémie, le choc septique et les troubles gastro-intestinaux, y compris la diarrhée, la mucite, les douleurs abdominales et les saignements gastro-intestinaux. Par ailleurs, la présence des 15 genres bactériens précités producteurs de butyrate ayant un effet anti-inflammatoire peut contribuer à l'efficacité du traitement.
Le mélange homogène de microbiote peut être utilisé dans le traitement de l'infection à Clostridium difficile et la diarrhée associée (CDI), la maladie intestinale inflammatoire (IBD), le syndrome du côlon irritable (IBS), la constipation idiopathique, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, l'obésité et l'obésité morbide, l'autisme, la sclérose en plaques, la diarrhée du voyageur, l'infection vaginale chronique (y compris la cystite et les mycoses), les infections des os et des articulations, la maladie de Parkinson, le diabète de type II, les allergies alimentaires, le cancer, la leucémie réfractaire, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et les troubles bipolaires, la dysbiose intestinale associée à une chimiothérapie anticancéreuse ou à une immunothérapie et la maladie alcoolique et non-alcoolique du foie.
Le mélange homogène de microbiote peut être utilisé dans le traitement des complications dues à l'hospitalisation en soins intensifs. L'invention est en outre décrite en référence aux exemples suivants. Il sera apprécié que l'invention telle que revendiquée n'est pas destinée à être limitée de quelque manière que ce soit par ces exemples.
EXEMPLES
Exemple 1 :
Etapes a) et b) : Huit selles fraîches de six donneurs sains ont été collectées dans le dispositif médical décrit dans W02016/170290, puis conservées à +2°C/+ 8°C pendant une période de 72 heures, pendant laquelle des contrôles qualitatifs (étape c)) ont été réalisés. Sur la base des résultats de ces contrôles, les selles des donneurs 3 et 7 ont été rejetées.
Les selles 1, 4, 5, 6 et 2+ 8 ont été transformées séparément en un inoculum liquide en ajoutant du diluant cryoprotecteur (solution aqueuse saline contenant un mélange de maltodextrine et de tréhalose à hauteur de 20%) et clarifiées à travers un filtre (265 pm). Les selles 2 et 8 ont été combinées pour former un inoculum étant donné les faibles quantités de selles prélevées.
La viabilité des inocula 1, 4, 5, 6 et 2+ 8 (cinq inocula) a été testée. Les inocula individuels ont ensuite été transférés dans une poche souple de 5L en utilisant une pompe péristaltique. La poche a ensuite été posée sur une plaque d'agitation dans un incubateur réfrigéré réglé à 4°C et le mélange d'inoculum a été réalisé à 125 tr/min +/- 5% pendant 30 minutes.
Une fois l'homogénéisation terminée, le mélange d'inoculum a été transféré dans une série de 15 poches adaptées à une lyophilisation et conservées à -80°C. La viabilité et l'impact de la conservation dans différentes conditions du mélange homogène ont été testés pour chacune des 15 poches avant stockage.
Analyse de viabilité :
Les tests de viabilité ont été réalisés en utilisant la technologie de cytométrie en flux utilisant un cytomètre Accuri 6 (BD Science). Les échantillons ont été dilués dans une solution aqueuse saline à 0,9%, avec dilution en série 1 : 10, jusqu'à 1 : 10 3. Les échantillons ont été marqués avec des fluorophores l'iodure de propidium (PI) (10pL/mL) et du SYT09® 9 (3pL/mL). Le PI cible également l'ADN mais pénètre uniquement dans les cellules dont les membranes sont endommagées ; il émet à 635nm (rouge) après excitation à 470nm. Le SYT09® pénètre dans toutes les cellules intègres ou non, se fixe à l'ADN et émet à 540nm (vert) après excitation à 470nm (laser bleu). Les échantillons de selles, d'inoculum ou de mélange homogène sont marqués avec le mélange des deux fluorophores avant d'être analysés par cytométrie de flux. Le pourcentage de bactéries vivantes par rapport au nombre de bactéries totales (vivantes et mortes) permet d'obtenir la viabilité bactérienne de l'échantillon. Chaque lot de l'analyse a été validé avec un témoin positif (échantillon d'inoculum de référence conservé à -80°C) et un témoin négatif (échantillon de référence conservé à -80°C et traité par incubation de 10 minutes dans 70% d'isopropanol (rapport 1/9), centrifugé, remis en suspension dans 0,9% de NaCI et dilué en séries de dilution de 10 fois jusqu'à 10 3).
Résultats :
L'évaluation de la viabilité des inocula individuels varie de 30,5% à 67,6%. Les 15 poches préparées avec les mêmes mélanges d'inocula montrent une viabilité moyenne de 47,1% avec un écart-type de 1,98. Les pourcentages de viabilité du microbiote des inocula individuels (inoculum 1, 4, 5, 6 et 2 + 8, colorés en gris clair) et du mélange d'inoculum dans la poche de stockage 1 à 15 (colorés en noir) sont présentés sur la Figure 2.
Les résultats résumés sont présentés dans le Tableau 1.
Figure imgf000035_0001
Tableau 1: Résumé de la viabilité du microbiote de l'inoculum allogénique analysé Analyse Statistique :
La viabilité et le nombre d'événements ont été mesurés sur les 15 poches de mélange homogène. Afin d'évaluer si ces deux mesures étaient homogènes entre les poches, une assignation aléatoire de mesures au Groupe A pour 7 poches et au Groupe B pour les poches restantes a été effectuée 500 fois.
Pour chaque itération, un test-t et un test de rang ont été utilisés pour comparer le Groupe A au Groupe B. Les résultats finaux présentés ci-dessous correspondent à la proportion d'itérations où le test statistique considéré n'était pas significatif (> 0,1). La conclusion est que les poches sont homogènes en termes de viabilité et en termes de nombre d'événements/pL.
Figure imgf000036_0001
Tableau 2: Résultats statistiques
Les résultats montrent qu'il n'existe pas de différence significative pour le test-t et le test de rang, que ce soit pour la viabilité du microbiote que pour le nombre d'événements/pL.
On peut conclure que les 15 poches de mélange préparées sont homogènes entre elles. Conservation :
Pendant le procédé de préparation du mélange, un stockage intermédiaire doit être effectué pendant que les contrôles qualitatifs sont effectués. Afin de déterminer l'impact de ce stockage intermédiaire sur la viabilité du microbiote, une évaluation a été réalisée :
- condition de contrôle : une fois préparé, l'inoculum est instantanément conservé à -80°C.
- condition de conservation à température ambiante : une fois préparé, l'inoculum est laissé à température ambiante pendant 16 heures, un échantillonnage est effectué pour déterminer la viabilité du microbiote, les événements du microbiote/pL et la mesure du pH et de la p02, puis l'inoculum est conservé à -80°C.
- condition de conservation à 4°C : une fois préparé, l'inoculum est conservé à 4°C pendant 16 heures, un échantillonnage est effectué pour déterminer la viabilité du microbiote, les événements du microbiote/pL et la mesure du pH et de la p02, puis l'inoculum est conservé à -80°C.
Puis, les trois inocula sont décongelés et la viabilité du microbiote est mesurée.
Les données montrent que la médiane de viabilité du microbiote est la même pour l'inoculum conservé pendant 16 heures à température ambiante ou à 4°C. Après décongélation, la médiane de viabilité du microbiote diminue à la fois pour l'inoculum conservé à 4°C et conservé à température ambiante. Il est attendu que la viabilité baisse après congélation. Ici, on constate que dans les deux cas (4°C et température ambiante), on observe le même phénomène.
On peut observer que le nombre d'événements/pL est le même pour l'inoculum et pour l'inoculum conservé à 4°C, mais, comme on peut s'y attendre, il augmente pour l'inoculum conservé à température ambiante. La même observation est faite après décongélation de l'inoculum. Tous ces résultats montrent que la conservation pendant 16 heures n'a pas d'impact sur la viabilité du microbiote lorsqu'il est conservé à 4°C ou à température ambiante ; le nombre d'événements/pL augmente à température ambiante indiquant que le microbiote évolue, alors qu'à 4°C le microbiote est à l'état latent. Les résultats de mesure du pH et de la p02 sont indiqués dans le Tableau 3.
Figure imgf000038_0001
Tableau 3: Résultats de la mesure du pH et de la p02 Ces résultats montrent que la conservation pendant 16 heures n'a pas d'impact sur le pH et sur la p02 de l'inoculum conservé à 4°C.
Exemple 2 :
En utilisant presque les mêmes conditions que pour l'Exemple 1, le procédé a été réalisé sur quatre lots (lot N°1 à lot N°4) d'échantillons de microbiote fécal, avec 2, 8, 4 et 6 donneurs pour le lot N°l, le lot N°2, le lot N°3 et le lot N° 4 respectivement. Le lot N° 4 correspond au lot de l'Exemple 1. Ainsi, pour le lot N°4, deux des six selles ont été combinées pour former un inoculum étant donné les faibles quantités de selles prélevées. Les selles ont été transformées séparément en un inoculum liquide en ajoutant du diluant cryoprotecteur (solution aqueuse saline contenant un mélange de maltodextrine et de tréhalose à hauteur de 20%) et clarifiées à travers un filtre (265 pm).
La viabilité et le profil taxonomique des inocula ont été testés. Les inocula individuels ont ensuite été transférés dans une poche souple de 3L ou 5L en utilisant une pompe péristaltique. La poche a ensuite été posée sur une plaque d'agitation dans un incubateur réfrigéré réglé à 4°C et le mélange d'inoculum a été réalisé à 130 tr/min +/- 5% pendant 30 minutes dans un incubateur réglé à 4°C.
Une fois l'homogénéisation terminée, pour chaque lot, le mélange d'inoculum a été transféré dans une série de poches adaptées à une congélation et conservées à -80°C. La viabilité et le profil taxonomique des mélanges homogènes ont été testés avant stockage. Pour le lot N°l, 2 selles ont été collectées et 5 poches ont été remplies. Pour le lot N°2, 8 selles ont été collectées et 29 poches ont été remplies. Pour le lot N°3, 5 selles ont été collectées et 21 poches ont été remplies. Pour le lot N°4, 6 selles ont été collectées, 2 selles ont été combinées pour avoir assez de matière pour former un inoculum et 15 poches ont été remplies.
Analyse de viabilité :
Les tests de viabilité ont été réalisés comme pour l'Exemple 1.
Analyse métagénomique :
L'ADN génomique a été extrait des échantillons avec le kit NucleoSpin Soil (Machery Nagel). Une banque de séquençage a été construite pour chaque échantillon avec le kit MyTaq HS-Mix (Bioline). Les banques ont ensuite été séquencées sur un run MiSeq V3 2x300 pb.
Après un contrôle qualité des séquences démultiplexées avec Trimmomatic [Bolger et al., (2014) 'Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data', Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btul70], les séquences humaines ont été éliminées en utilisant le logiciel Bowtie2 (Langmead, Ben and Salzberg, (2013) 'Fast gapped-read alignment with Bowtie2', Nature methods, 9(4), pp. 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923. Fast). Pour permettre la comparaison des données, le nombre de séquences a été normalisé à 60 000 séquences par échantillon. Le clustering des séquences a été réalisé avec VSEARCH et l'assignation taxonomique a ensuite été réalisée en utilisant la base de données Silva 128. Les analyses taxonomiques et les mesures de diversité ont été réalisées avec le logiciel R (R Core Team 2015, version 3.4.4, http://www.R-project.org). Pour les mesures de diversité, 20 sous- échantillonnages de 60 000 séquences ont été réalisés pour chaque échantillon et la médiane a été mesurée.
Résultats : Viabilité :
Le Tableau 4, ci-dessous, montre la viabilité des lots. L'évaluation de la viabilité des inocula individuels varie de 16,8% à 67,6%. La viabilité des lots des inocula regroupés est donnée dans le Tableau ci-dessous, et se situe entre 46,1 et 60,2%.
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Tableau 4
Le Tableau 5 ci-dessous montre les résultats.
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Tableau 5
Exemple 3 :
Cette étude a pour objectif de comparer deux méthodes de préparation d'échantillons de microbiote fécal de donneurs multiples :
- la méthode décrite dans l'Exemple 2 et
la méthode de l'art antérieur de Paramsothy et al. [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]. La figure 5 montre les deux méthodes utilisées.
Des analyses de viabilité et des analyses métagénomiques ont été réalisées afin de comparer la viabilité des produits finaux obtenus, ainsi que leur homogénéité taxonomique.
Quatre selles fraîches de quatre donneurs sains ont chacune été collectées dans le dispositif médical décrit dans W02016/170290, puis conservées à +2°C/+ 8°C pendant une période de 72 heures, pendant laquelle des contrôles qualitatifs (étape c)) ont été réalisés.
Les quatre selles ont été divisées en deux fractions, l'une destinée au traitement selon un mode de réalisation de l'invention (« Inv ») et l'autre selon la méthode de l'art antérieur de Paramsothy et al. (« Ref »).
Les selles « Inv » ont été transformées séparément en un inoculum liquide en ajoutant du diluant cryoprotecteur (solution aqueuse saline contenant un mélange de maltodextrine et de tréhalose à hauteur de 20%) et clarifiées à travers un filtre (265 pm).
Les inocula individuels ont ensuite été transférés dans une poche souple de IL en utilisant une pompe péristaltique. La poche a ensuite été posée sur une plaque d'agitation dans un incubateur réfrigéré réglé à 4°C et le mélange d'inoculum a été réalisé à 125 tr/min +/- 5% pendant 30 minutes.
Une fois l'homogénéisation terminée, le mélange d'inoculum a été transféré dans une série de 10 cryotubes et conservé à -80°C.
Les selles « Ref » ont été mélangées de sorte à obtenir un produit visuellement homogène, clarifiées dans une solution saline isotonique (0,9% de NaCI), puis filtrées. 10% de glycérol ont ensuite été ajoutés à la préparation pour le stockage. Puis, l'échantillon ainsi produit a été transféré dans une série de 10 cryotubes et conservé à - 80°C.
La viabilité et l'analyse métagénomique 16S ont été réalisées comme décrit dans l'Exemple 2. Les résultats sont commentés dans le texte ci-dessous.
Le Tableau 6 ci-dessous montre l'abondance relative de Actinobacteria, Prevotella et Bifidobacteria dans les échantillons « Inv » et « Ref ».
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Tableau 6
Exemple 4 :
Une campagne de production visant à obtenir des mélanges homogènes de selles a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1. Les selles de 8 donneurs répondant aux critères de sélection de l'étape c) ont été collectées de façon quotidienne sur une période de 5 semaines. Les selles ont été transformées séparément en un inoculum liquide en ajoutant du diluant cryoprotecteur (solution aqueuse saline contenant un mélange de maltodextrine et de tréhalose à hauteur de 20%), et clarifiées à travers un filtre (265 pm).
Les inocula individuels obtenus un même jour ont ensuite été mélangés de sorte à obtenir des lots de produits homogènes.
Extraction d'ADN, séquençage métagénomigue et analyse bio-informatique
L'ADN génomique a été extrait des mélanges de selles avec le kit Nucleospin Soil Kit (Macherey Nagel). Une banque de séquençage a été construite pour chaque échantillon d'ADN génomique en utilisant le kit TruSeq (Illumina) selon les recommandations du fournisseur. Les banques ont ensuite été séquencées simultanément en « paired-end » sur un run HiSeq2500 (Illumina).
Après un contrôle qualité des séquences démultiplexées avec Trimmomatic [Bolger et al., (2014) 'Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data', Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btul70], les séquences humaines ont été éliminées en utilisant le logiciel Bowtie2 (Langmead, Ben and Salzberg, (2013) 'Fast gapped-read alignment with Bowtie2', Nature methods, 9(4), pp. 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923. Fast). Pour permettre la comparaison des données, le nombre de séquences a été normalisé à 20 000000 séquences « paired-end » par échantillon. L'assignation taxonomique a ensuite été réalisée avec Kraken v.0.10.5- beta (Wood and Salzberg, 2014 'Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments', Genome Biology, 15(3), pp. R46. doi: 10.1186/gb-2014-15-3-r46) en utilisant la base de données RefSeq genomic (Septembre 2017, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
Résultats :
La Figure 8 montre l'abondance relative des 15 genres bactériens producteurs de butyrate, à savoir Blautia , Faecalibacterium , AUstipes, Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus, Clostridium , Coprococcus, Odoribacter, Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter , Subdoligranulum et Butyrivibrio , dans les selles des donneurs (première barre à gauche), puis dans les lots des mélanges homogènes obtenus à partir des selles de 3, 4, 5 et 6 donneurs respectivement. L'abondance relative de ces genres est stable dans chaque lot et se standardise quand le nombre de selles utilisées pour obtenir le mélange homogène augmente (voir Tableau 7 ci-dessous).
Figure imgf000044_0001
Tableau 7 : Coefficients de variation de 15 genres bactériens producteurs de butyrate chez les donneurs et dans les différents lots Si les 15 genres bactériens producteurs de butyrate ne se retrouvent pas tous dans toutes les selles individuelles, en revanche, les lots fabriqués avec un mélange d'au moins quatre selles les contiennent tous (données non montrées).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un mélange homogène de microbiote fécal provenant d'au moins deux donneurs présélectionnés comprenant les étapes suivantes : a. le prélèvement d'au moins un échantillon de microbiote fécal desdits donneurs présélectionnés,
b. dans un délai inférieur à 5 minutes suivant le prélèvement, le placement de l'échantillon obtenu en a) dans un dispositif de collecte étanche à l'oxygène, c. le contrôle qualitatif des échantillons prélevés et l'exclusion des échantillons ne répondant pas aux critères qualitatifs,
d. l'ajout à chacun des échantillons retenus après l'étape de contrôle c) d'une solution aqueuse saline comprenant au moins un agent cryoprotecteur et/ou un agent de charge,
e. la filtration des échantillons obtenus à l'issue de l'étape d) pour former une série d'inocula,
f. le regroupement desdits inocula pour former un mélange d'inocula, g. l'homogénéisation dudit mélange obtenu à l'étape f), notamment par agitation manuelle ou à l'aide d'un dispositif d'agitation,
les étapes b) et d) à g) étant réalisées en anaérobiose.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange homogène de microbiote fécal provient d'au moins quatre donneurs.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les donneurs sont présélectionnés selon les critères de présélection suivants :
i. ayant entre 18 et 60 ans,
ii. ayant un Indice de Masse Corporel (IMC) entre 18 et 30,
iii. absence d'antécédents personnels de maladies infectieuses graves, de troubles métaboliques et neurologiques, ou de dépression, iv. absence de prise récente de médicaments pouvant détériorer la composition du microbiote intestinal,
v. absence d'apparition récente de symptômes associés à une maladie gastro intestinale, tels que fièvre, diarrhée, nausée, vomissement, douleur abdominale, jaunisse, absence d'historique de maladies infectieuses graves, notamment le SIDA, l'hépatite etc.
vi. absence de voyages récents dans des pays tropicaux
vii. absence de comportement sexuel à risque,
viii. absence de blessure, piercing et/ou tatouage récent(s),
ix. absence de fatigue chronique récente,
x. absence de réaction allergique récente,
xi. optionnellement ayant un régime alimentaire divers.
4. Procédé selon la revendication 1,2 ou 3, caractérisé en ce que les critères qualitatifs des échantillons de l'étape c) comprennent :
consistance de l'échantillon entre 1 et 6 selon l'échelle de Bristol, absence de sang et d'urine dans l'échantillon,
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les critères qualitatifs des échantillons de l'étape c) comprennent :
absence des bactéries suivantes : Campylobacter, Clostridium difficile (toxin A/B), Salmonella Yersinia enterocolitica, Vibrio sp., Shiga-like toxin- producing E.coli (STEC) stxl/stx2, des bactéries multi résistantes, Bêta- lactamase à spectre étendu (BLSE) - Entérocoques résistant à la vancomycine et aux glycopeptides (ERV, GRE) et Listeria monocytogenes, bactéries résistantes aux carbapénémases,
absence des parasites suivants : Cryptosporidium parvum, Cyclospora sp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Blastocystis hominis, Helminths, Strongyloides stercoraiis, Isospora sp., Microsporidies et Dientamoeba fragilis, absence des virus suivants : Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus, Rotavirus A, Sapovirus et Picornavirus (Aichi Virus and enterovirus), absence des bactéries suivantes : E.coli enteroaggregative (EAEC), E.coli enteropathogenic (EPEC), E.coli enterotoxigenic (ETEC) It/st, Shigella/Enteroinvasive E.coli (EIEC) et Plesiomonas shigelloides.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'au moins un agent cryoprotecteur et/ou agent de charge est un polyol, un di-, tri- ou polysaccaride ou leur mélange et un agent de charge.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution aqueuse saline comprend maltodextrine et tréhalose.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la filtration à l'étape e) est réalisée avec un filtre comprenant des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,5 mm, de préférence, inférieur ou égal à 265 pm.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le temps entre la collecte de l'échantillon et la fin de l'étape g) est moins de 76 heures.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape g) d'homogénéisation est réalisée à une température entre 2°C et 25°C, de préférence entre environ 2 et 6°C, plus préférentiellement à environ 4°C.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de transfert suivante : h. le transfert du mélange homogénéisé obtenu à l'étape g) :
i. dans des poches d'inoculum pour stockage à une température d'environ -50°C à -80°C, de préférence, à -80°C, ou pour stockage à une température entre environ 2 à 6 °C pour utilisation du mélange sous 16 heures environ, ou pour stockage à une température entre 10 à 25 °C pour utilisation du mélange sous 4 heures environ, ii. dans un dispositif de lyophilisation pour lyophilisation.
12. Procédé selon l'une des revendications 2 à 11, caractérisé en ce que le mélange homogène de microbiote fécal contient 15 genres bactériens Blautia , Faecalibacterium , Aiistipes, Eubacterium , Bifidobacterium , Ruminococcus, Clostridium , Coprococcus, Odoribacter, Roseburia , Holdemanella , Anaerostipes, Oscillibacter Subdoligranulum et Butyrivibrio.
13. Mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications 1 à 12 pour son utilisation dans la transplantation de microbiote fécal allogénique.
14. Mélange homogène de microbiote fécal susceptible d'être obtenu selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le mélange a un indice de Simpson supérieur à 15, de préférence 20.
15. Mélange homogène de microbiote selon la revendication 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement des dysbioses intestinales.
16. Mélange homogène de microbiote selon la revendication 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD).
17. Mélange homogène de microbiote selon la revendication 13 ou 14 pour son utilisation dans le traitement de la dysbiose intestinale iatrogène et/ou des pathologies et complications associées comprenant la septicémie, le choc septique et les troubles gastro-intestinaux, y compris l'inflammation intestinale, la diarrhée, la mucite, les douleurs abdominales et les saignements gastro-intestinaux.
18. Mélange homogène de microbiote selon la revendication 13 ou 14 pour son utilisation pour le traitement de l'infection à Clostridium difficile et la diarrhée associée (CDI), la maladie intestinale inflammatoire (I BD), le syndrome du côlon irritable (IBS), la constipation idiopathique, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, l'obésité et l'obésité morbide, l'autisme, la sclérose en plaques, la diarrhée du voyageur, l'infection vaginale chronique (y compris la cystite et les mycoses), les infections des os et des articulations, la maladie de Parkinson, le diabète de type II, les allergies alimentaires, le cancer, la leucémie réfractaire, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et les troubles bipolaires, la dysbiose intestinale associée à une chimiothérapie anticancéreuse ou à une immunothérapie et la maladie alcoolique et non-alcoolique du foie.
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