KR20200130367A - 분변 미생물총 이식을 위한 대변 수집 방법 및 샘플 제조 방법 - Google Patents
분변 미생물총 이식을 위한 대변 수집 방법 및 샘플 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 적어도 2명의 사전선택된 공여자로부터 분변 미생물총의 균질 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이와 같이 수득된 분변 미생물총의 균질 혼합물은 박테리아 다양성 및 증가된 생존율을 갖는다. 분변 미생물총의 균질 혼합물은 장의 미생물 불균형를 치료하고 이러한 미생물 불균형과 연관된 병리상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 여러 공여자로부터 대변을 수집하는 절차 및 분변 미생물총 샘플을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분변 미생물총의 이식 (FMT, 분변 미생물총 이식으로도 불림)에서, 바람직하게는 장 미생물 불균형을 치료하기 위한 상기 샘플의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 "장 미생물무리"라고 불리는 인간 장 미생물총은 인간 위장계 (위, 장 및 결장)에서 발견되는 미생물 (박테리아, 효모 및 진균)의 세트이다. 박테리아 다양성은 현재 성인 개체의 우세한 장 미생물총을 구성하는 대략 103개의 박테리아 종으로 추정되며, 1014개의 박테리아 존재도를 갖고, 각각의 개체에서 200,000 내지 800,000개의 유전자, 즉 인간 게놈의 유전자 수의 10 내지 50배의 박테리아 메타게놈을 나타낸다. 자궁에서 무균 상태인 장은 생후 첫째날부터 특유한 개별 미생물총으로 발달할 때까지 집락화된다. 각각의 인간은 종 측면에서 비교적 가까운 박테리아를 갖지만 그들 미생물총의 정확한 조성 (종, 비율)은 대부분 (종의 2/3 이상) 숙주에 특이적이다. 따라서, 인간의 장 미생물총은 각각의 개체에 따라 매우 다양하고 복잡한 생태계이다.
미생물총의 광범위한 다양성을 유지하면 그의 안정성이 향상된다. 그러나, 특정 병리상태 또는 치료는 미생물총을 불안정하게 한다: 예컨대, 항생제 뿐만 아니라 만성 염증성 장 질환 (CIBD)과 같은 염증 성분을 갖는 질환은 장에서 미생물총의 다양성을 제한할 수 있다. 특히, 항생제 치료 (또는 항생제요법)는 미생물총을 변경시켜 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile)과 같은 병원성 유기체의 증식에 유리할 수 있다.
특정 수의 병리상태, 예컨대 이식편대숙주 질환 (GvHD)이 장 미생물 불균형과 연관된다. 조혈 줄기 세포의 동종이계 이식편 또는 동종이계 이식 (allo-HSCT)은 조혈 악성종양 및 유전성 조혈 장애에 효과적인 치료이며 현재까지 가장 효과적인 암 면역요법으로 간주되고 있다 [Sung, A.D. and Chao, N.J. (2013), Concise Review: Acute Graft-Versus-Host Disease: Immunobiology, Prevention, and Treatment, Stem Cells Transl. Med. 2: 25-32]. 그러나, 이식된 줄기 세포로부터 유도된 T-림프구는 수용자 숙주 조직을 공격하여 상당한 사망률 (allo-HSCT 후 사망의 15 내지 25%)과 연관된 allo-HSCT의 주요 합병증인 GvHD를 유발할 수 있다. allo-HSCT를 받는 환자는 세포독성 화학요법, 전신 방사선조사, 면역억제제 및 넓은-스펙트럼의 항생제에 동시에 노출될 수 있으며, 이는 장 미생물총에 상당한 변경을 유발할 수 있다. 사실, 엔테로코카세애 (Enterococcaceae)의 상당한 풍부화 뿐만 아니라 락토바실라레스 (Lactobacillales)의 증가 및 클로스트리디알레스 (Clostridiales)의 감소가 allo-HSCT 후 환자에서 종종 관찰된다. 결과적으로, 반코마이신-내성 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 비리단스 그룹 스트렙토코쿠스 및 다양한 프로테오박테리아와 같이 일반적으로 접하는 우세한 박테리아가 혈류로 들어가 패혈증을 유발할 수 있다. 이 변화는 이후에 불응성 이식편대숙주 질환 (GvHD)이 발생하는 환자에서 특히 중요하다는 점은 주목할 만하다 [Holler et al. (2014), Biol Blood Marrow Transplant. 20(5): 640-645, and Peled, J. (2017) 59th Annual Meeting of the American Society of Hematology, Atlanta, USA, Dec 9-11].
장 미생물총을 재확립하여 항상성 (즉, 공생)을 재확립하기 위해 분변 미생물총 이식 (FMT)을 계획하고 시험한다. 이는 숙주의 변경된 장 미생물총을 재안정화하기 위해 건강한 공여자로부터의 대변을 수용자 환자의 소화관으로 도입하는 것으로 이루어진다. 이 분변 미생물총 이식은 동종이계 (즉, 건강한 공여자 개체로부터 환자로) 또는 자가 (즉, 개체로부터 그 자신으로)일 수 있다. 클로스트리듐 디피실레 유형의 감염에 대해 수득된 결과가 고무적이며 일부 환자는 성공적으로 치료되었다 (Tauxe et al., Lab Medicine, Winter 2015, volume 46, Issue 1). 또한, 최근 연구에 따르면 FMT로 치료된 GvHD 환자는 미생물총의 재건과 연관된 위장 증상이 개선되고 설사가 감소 또는 중단되는 것으로 나타났다 [Kakihana et al. (2017) Transplantation 128: 2083-2089, and Spindelboeck et al. (2017) Hematologica 102: e210].
동종이계 이식의 경우, 희석액에 있는 미생물총의 현탁액이 약제의 활성 성분 (활성 물질)을 나타내기 때문에 이식된 샘플이 박테리아의 생존율 및 다양성 측면에서 허용가능한 프로필을 갖는 것이 중요하다. 현재의 이식 방법은 종종 경험적이며, 사용된 분변 미생물총 샘플에 존재하는 박테리아의 다양성을 보장하거나 장 미생물총의 주요 구성요소인 혐기성 박테리아의 생존율을 가장 잘 보존하기 위한 특별한 예방 조치를 취하지 않는다.
미국 특허 출원 US 2017/239303은 장 미생물총의 복원을 위한 조성물 뿐만 아니라 그의 제조 및 투여 방법을 기재한다. 이 문서는 계산이 "과 (family)" 수준에서 수행되는 경우 샘플을 포함하는 조성물이 대략 0.4-2.5의 샤논 다양성 지수 (Shannon diversity index)를 갖는다는 것을 개시한다. 계산이 수행되는 분류학적 수준 (문, 종 등)에 따라, 이는 대략 1-8이다.
파람소티 등에 의한 공개문 [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]은 활동성 궤양성 결장염의 치료에서 분변 미생물총 조성물의 제조를 기재한다. 조성물을 3-7명의 공여자로부터의 대변을 혼합하고 균질화하여 생성한 다음, 수득된 혼합물에 식염수 수용액을 첨가한다 (122쪽 왼쪽 컬럼, "방법" 참조). 파람소티 등에 의한 공개문의 도 3 (오른쪽 상단 패널)은 조성물의 계통 발생 다양성을 나타낸다. 공여자 대변 샘플을 풀링한 후에도 생성된 배치 (도면에서 "공여자 배치"로 표시됨) 간에 여전히 큰 격차가 존재한다. 이 격차는 개별 공여자 (도면에서 "개별 공여자"로 표시됨) 간의 격차만큼 큰 것으로 보인다. 따라서, 환자 치료를 위한 샘플 간에 상당한 이질성이 존재한다. 이러한 이질성은 제약 조성물에 바람직하지 않다. 실제로, 환자가 받은 분변 미생물총의 각각의 용량 (또는 샘플)에 대해 동일한 방식으로 반응하도록 하기 위해서는, 용량이 가능한 한 균질하고 배치도 균질해야 한다.
따라서, 특히 산업적 규모에서 안전하고, 재현가능하며, 효과적이고, 실행하기 쉬운 분변 미생물총 이식 방법을 제공할 필요가 있다. 또한, 이식된 제품의 박테리아 다양성이 가능한 한 높고 동일인에게 이식된 제품의 상이한 용량 (샘플)간에 균질성이 있는 분변 미생물총 이식 방법을 제공할 필요가 있다. 따라서, 동일한 배치의 분변 미생물총으로부터 유래하는 상이한 용량 간의 균질성 (배치내 균질성) 및 생성된 상이한 배치 간의 균질성 (배치간 균질성)이 있어야 한다. 박테리아의 생존율은 방법 전반에 걸쳐 및 저장 동안 가능한 한 보존되어야 한다.
박테리아성 장 미생물 불균형 (의원성 또는 비의원성) 및/또는 연관된 병리상태의 치료 및 예방에 투여하기 위한 최적의 박테리아 다양성 및 생존율을 갖는 분변 미생물총 샘플을 제공하는 것이 필요하다. 이러한 샘플을 제조하는 방법을 제공할 필요가 있다. 관련된 병리상태는 불응성 이식편대숙주 질환 (GvHD), 클로스트리듐 디피실레 감염, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 과민성 장 증후군, 크론 질환, II형 당뇨병, 음식 알레르기, 백혈병을 포함하는 암, 비만 및 병적 비만일 수 있다. 미생물 불균형과 연관된 다른 병리상태는 자폐증, 경화증, 여행자 설사, 만성 질 감염 (방광염, 진균증), 골 및 관절 감염, 병원에서의 집중 치료와 연관된 미생물 불균형, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 정신분열병, 항신생물 화학요법 또는 면역요법과 연관된 장 미생물 불균형, 알콜 또는 비알콜-관련된 간 질환과 관련된 미생물 불균형을 포함한다.
패혈증, 패혈 쇼크 및 설사, 점막염, 복통 및 위장 출혈을 포함하나 이에 제한되지 않는 위장 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 의원성 장 미생물 불균형 및/또는 연관된 병리상태 및 합병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 분변 미생물총 샘플을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 전술된 요구에 대응한다.
따라서, 본 발명의 목적은 FMT (분변 미생물총 이식)에 사용하기에 최적의 다양성 및 충분한 박테리아 생존율을 갖고 확실하고 재현가능하며 쉽게 생성될 수 있는 분변 미생물총 샘플을 제공하는 것이다.
본 발명은 적어도 2명의 사전선택된 공여자로부터 유래한 분변 미생물총의 균질 혼합물을 제조하는 방법이며,
a. 상기 사전선택된 공여자로부터 적어도 하나의 분변 미생물총 샘플을 채취하는 단계,
b. 샘플 채취 후 5분 미만의 기간 내에 a)에서 수득된 샘플을 산소-불투과성 수집 장치에 넣는 단계,
c. 채취된 샘플을 품질 관리하고 품질 기준을 충족하지 않는 샘플을 제외시키는 단계,
d. 품질 관리 단계 c) 후에 잔류한 각각의 샘플에, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 수용액를 첨가하는 단계,
e. 단계 d)의 종료 시 수득된 샘플을 여과하여 일련의 접종물을 형성하는 단계,
f. 상기 접종물을 풀링하여 접종물의 혼합물을 형성하는 단계,
g. 단계 f)에서 수득된 상기 혼합물을, 특히 수동 교반에 의해 또는 교반 장치를 사용하여 균질화하는 단계를 포함하고,
단계 b) 및 d) 내지 g)는 혐기생활 하에서 수행되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시양태에 따라, 공여자는 하기의 사전선택 기준에 따라 사전선택된다:
i. 18 내지 60세의 나이,
ii. 18 내지 30의 체질량 지수 (BMI),
iii. 심각한 감염 질환, 예컨대 AIDS, 간염 등, 대사 및 신경계 장애, 또는 우울증에 대한 개인적인 병력의 부재,
iv. 최근 장 미생물총의 조성을 분해할 수 있는 약제 복용의 부재,
v. 최근 위장 질환과 연관된 증상, 예컨대 열, 설사, 구역, 구토, 복통, 황달의 발생의 부재; 심각한 감염 질환, 특히 AIDS, 간염 등의 임의의 병력의 부재,
vi. 최근 열대 국가 여행의 부재,
vii. 위험한 성적 행동의 부재,
viii. 최근 상처, 피어싱 및/또는 문신의 부재 (전형적으로, 지난 3개월 동안),
ix. 최근 만성 피로의 부재 (전형적으로, 지난 3개월 동안),
x. 최근 알레르기 반응의 부재 (전형적으로, 지난 3개월 동안),
xi. 임의적으로, 다양한 식이를 가짐.
본 발명의 실시양태에 따라, 단계 c)의 샘플의 품질 기준은
- 브리스톨 척도에서 1 내지 6의 샘플 일관성,
- 샘플 중 혈액 또는 소변의 부재
를 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 단계 c)의 샘플의 품질 기준은 하기를 포함한다:
- 하기 박테리아의 부재: 캄필로박터 (Campylobacter), 클로스트리듐 디피실레 (A/B 독소), 살모넬라 (Salmonella), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 비르리오 종 (Vibrio sp.), 시겔라 독소-생성 이. 콜리 (STEC) stx1/stx2, 다중-내성 박테리아, 확장된-스펙트럼의 베타-락타마제 (ESBL) - 글리코펩티드/반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (GRE/VRE) 및 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 카르바페네마제-내성 박테리아,
- 하기 기생충의 부재: 크립토스포리듐 파르붐 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 종 (Cyclospora sp.), 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 기아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 블라스토시스티스 호미니스 (Blastocystis hominis), 연충 (Helminths), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (Strongyloides stercoralis), 이소스포라 종 (Isospora sp.), 마이크로스포리디아 (Microsporidia) 및 디엔타모에바 프라길리스 (Dientamoeba fragilis),
- 하기 바이러스의 부재: 아데노바이러스 F40/41, 아스트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스 A, 사포바이러스 및 피코르나바이러스 (아이치 바이러스 및 엔테로바이러스),
- 하기 박테리아의 부재: 장집적성 이. 콜리 (EAEC), 장병원성 이. 콜리 (EPEC), 장독소원성 이. 콜리 (ETEC) It/st, 시겔라/장침투성 이. 콜리 (EIEC) 및 플레시오모나스 쉬겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides).
본 발명의 실시양태에 따라, 단계 d)의 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제는 폴리올, 이당류, 삼당류 또는 다당류 또는 그의 혼합물 및 증량제이다.
본 발명의 실시양태에 따라, 단계 d)의 식염수 수용액은 말토덱스트린 및 트레할로스를 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 단계 e)의 여과는 0.5 mm 이하, 바람직하게는 265 μm 이하의 직경의 세공을 포함하는 필터로 수행된다.
본 발명의 실시양태에 따라, 샘플 수집과 단계 g)의 종료 사이의 시간은 76시간 미만이다.
본 발명의 실시양태에 따라, 균질화 단계 g)는 2℃ 내지 25℃, 바람직하게는 대략 2 내지 6℃, 보다 우선적으로는 대략 4℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 실시양태에 따라, 방법은
h. 단계 g)에서 수득된 균질화된 혼합물을
i. 대략 -50℃ 내지 -80℃, 바람직하게는 -80℃의 온도에서의 저장, 또는 대략 16시간 이내에 혼합물을 사용하기 위한 대략 2 내지 6℃의 온도에서의 저장, 또는 대략 4시간 이내에 혼합물을 사용하기 위한 10 내지 25℃의 온도에서의 저장을 위해 파우치에,
ii. 동결건조를 위해 동결건조 장치
에 이송하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 분변 미생물총의 균질 혼합물은 적어도 4명의 공여자, 바람직하게는 적어도 5명의 공여자로부터 유래한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 동종이계 분변 미생물총의 이식 (FMT)에서 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 실시양태에 따라, 분변 미생물총의 균질 혼합물은 적어도 4명의 공여자로부터 유래하고 하기 부티레이트-생성 박테리아 속: 블라우티아 (Blautia), 패칼리박테리움 (Faecalibacterium), 알리스티페스 (Alistipes), 유박테리움 (Eubacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 루미노코쿠스 (Ruminococcus), 클로스트리듐 (Clostridium), 코프로코쿠스 (Coprococcus), 오도리박터 (Odoribacter), 로세부리아 (Roseburia), 홀데마넬라 (Holdemanella), 아나에로스티페스 (Anaerostipes), 오실리박터 (Oscillibacter), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 및 부티리비브리오 (Butyrivibrio)를 함유한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 분변 미생물총의 상기 균질 혼합물은 15 초과, 바람직하게는 20 초과의 심슨 지수 (Simpson index)를 갖는 높은 다양성을 갖는다.
본 발명은 장 미생물 불균형의 치료에서 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 이식편대숙주 질환 (GvHD)의 치료에서 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 패혈증, 패혈 쇼크, 및 장 염증, 설사, 점막염, 복통 및 위장 출혈을 포함하는 위장 장애를 포함하는 의원성 장 미생물 불균형 및/또는 연관된 병리상태 및 합병증의 치료에서 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 클로스트리듐 디피실레 감염 및 연관된 설사 (CDI), 염증성 장 질환 (IBD), 과민성 장 증후군 (IBS), 특발성 변비, 복강 질환, 크론 질환, 비만 및 병적 비만, 자폐증, 다발성 경화증, 여행자 설사, 만성 질 감염 (방광염 및 진균증 포함), 골 및 관절 감염, 파킨슨 질환, II형 당뇨병, 음식 알레르기, 암, 저항성 백혈병, 알츠하이머 질환, 정신분열병 및 양극성 장애, 항신생물 화학요법 또는 면역요법과 연관된 장 미생물 불균형 및 알콜- 또는 비알콜-관련된 간 질환의 치료에서 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 동종이계 FMT에 사용하기 위해 여러 공여자의 분변 미생물총 샘플로부터 분변 미생물총의 균질 혼합물을 제조하는 방법의 도식적 표현이다.
도 2는 저장을 위한 접종물 (접종물 1, 4, 5, 6 및 2 + 8) 및 접종물의 파우치 1 내지 15에 있는 접종물의 혼합물 (활성 물질)의 미생물총의 생존율 (백분율)을 나타내는 히스토그램이다.
도 3은 4개의 제품 배치에 대한 개별 접종물 및 접종물의 혼합물 (풀링된 접종물)의 미생물총의 생존율 (백분율)을 나타내는 히스토그램이다. 배치 번호 4는 실시예 1에 사용된 (및 도 2에 도시된) 것과 동일한 배치이다.
도 4a 및 4b는 접종물의 풍부도 및 박테리아 다양성을 나타낸다.
도 4a: 배치 번호 1 내지 배치 번호 4의 배치에 대한 개별 접종물 및 또한 접종물의 혼합물에 대해 측정된 풍부도 (박테리아 종의 수). 운영 분류학적 단위 (OTU)는 16S 리보솜 RNA (16S rRNA)로 평가되었다. 개별 공여자에 대해, 풍부도는 100 내지 350개의 종이다.
도 4b: 배치당 개별 접종물 ("공여자"), 배치 간에 비교된 접종물 ("배치간") 및 동일한 배치 내 파우치의 풀링된 접종물 ("배치내")의 브레이-커티스 (Bray-Curtis) 유사도.
도 5는 실시예 3의 비교 실험의 도식적 표현이며, 2개의 샘플 배치의 제조를 수행하기 위해 동일한 대변이 사용되었으며, 하나의 제조는 실시예 3에 대해 기재된 방법과 동일한 본 발명의 실시양태 ("본 발명 방법")에 따르고, 하나의 제조는 파람소티 등의 문헌 [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive fecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]에 기재된 방법, 또는 "참조 방법"에 따랐다.
도 6은 실시예 3의 2개의 샘플 그룹에서 역 심슨 지수에 따라 측정된 박스-플롯의 형태의 다양성을 나타낸다. 도 6a는 각각의 샘플의 다양성을 나타내고, 도 6b는 2개의 샘플 그룹의 다양성을 나타낸다.
도 7은 실시예 3의 2개의 샘플 그룹에 가장 많이 존재하는 10개의 박테리아 과의 상대적 존재도를 나타내는 누적 히스토그램이다. 오른쪽 그룹 (샘플 Inv-01 내지 Inv-10)은 본 발명의 실시양태에 따라 생성된다. 왼쪽 "참조" 그룹 (샘플 Ref-01-Ref-10)은 파람소티 등의 종래 기술의 방법에 따라 생성된다.
도 8은 공여자 대변 (왼쪽 제1 박스)에서, 이어서 각각 3, 4, 5 및 6명의 공여자의 대변으로부터 수득된 균질 혼합물의 배치에서, 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속, 즉 블라우티아, 패칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움, 비피도박테리움, 루미노코쿠스, 클로스트리듐, 코프로코쿠스, 오도리박터, 로세부리아, 홀데마넬라, 아나에로스티페스, 오실리박터, 수브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오의 상대적 존재도를 나타낸다.
도 9는 4, 5 및 6명의 공여자의 대변으로부터 수득된 균질 혼합물의 상이한 배치에서 종의 풍부도를 나타낸다.
도 2는 저장을 위한 접종물 (접종물 1, 4, 5, 6 및 2 + 8) 및 접종물의 파우치 1 내지 15에 있는 접종물의 혼합물 (활성 물질)의 미생물총의 생존율 (백분율)을 나타내는 히스토그램이다.
도 3은 4개의 제품 배치에 대한 개별 접종물 및 접종물의 혼합물 (풀링된 접종물)의 미생물총의 생존율 (백분율)을 나타내는 히스토그램이다. 배치 번호 4는 실시예 1에 사용된 (및 도 2에 도시된) 것과 동일한 배치이다.
도 4a 및 4b는 접종물의 풍부도 및 박테리아 다양성을 나타낸다.
도 4a: 배치 번호 1 내지 배치 번호 4의 배치에 대한 개별 접종물 및 또한 접종물의 혼합물에 대해 측정된 풍부도 (박테리아 종의 수). 운영 분류학적 단위 (OTU)는 16S 리보솜 RNA (16S rRNA)로 평가되었다. 개별 공여자에 대해, 풍부도는 100 내지 350개의 종이다.
도 4b: 배치당 개별 접종물 ("공여자"), 배치 간에 비교된 접종물 ("배치간") 및 동일한 배치 내 파우치의 풀링된 접종물 ("배치내")의 브레이-커티스 (Bray-Curtis) 유사도.
도 5는 실시예 3의 비교 실험의 도식적 표현이며, 2개의 샘플 배치의 제조를 수행하기 위해 동일한 대변이 사용되었으며, 하나의 제조는 실시예 3에 대해 기재된 방법과 동일한 본 발명의 실시양태 ("본 발명 방법")에 따르고, 하나의 제조는 파람소티 등의 문헌 [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive fecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]에 기재된 방법, 또는 "참조 방법"에 따랐다.
도 6은 실시예 3의 2개의 샘플 그룹에서 역 심슨 지수에 따라 측정된 박스-플롯의 형태의 다양성을 나타낸다. 도 6a는 각각의 샘플의 다양성을 나타내고, 도 6b는 2개의 샘플 그룹의 다양성을 나타낸다.
도 7은 실시예 3의 2개의 샘플 그룹에 가장 많이 존재하는 10개의 박테리아 과의 상대적 존재도를 나타내는 누적 히스토그램이다. 오른쪽 그룹 (샘플 Inv-01 내지 Inv-10)은 본 발명의 실시양태에 따라 생성된다. 왼쪽 "참조" 그룹 (샘플 Ref-01-Ref-10)은 파람소티 등의 종래 기술의 방법에 따라 생성된다.
도 8은 공여자 대변 (왼쪽 제1 박스)에서, 이어서 각각 3, 4, 5 및 6명의 공여자의 대변으로부터 수득된 균질 혼합물의 배치에서, 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속, 즉 블라우티아, 패칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움, 비피도박테리움, 루미노코쿠스, 클로스트리듐, 코프로코쿠스, 오도리박터, 로세부리아, 홀데마넬라, 아나에로스티페스, 오실리박터, 수브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오의 상대적 존재도를 나타낸다.
도 9는 4, 5 및 6명의 공여자의 대변으로부터 수득된 균질 혼합물의 상이한 배치에서 종의 풍부도를 나타낸다.
본 발명은 여러 공여자로부터 분변 미생물총의 균질 혼합물을 수집하고 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 동종이계 분변 미생물총의 이식에서, 특히 장 미생물 불균형, 및 특히 이러한 미생물 불균형과 연관된 질환을 치료하기 위한 상기 균질 혼합물의 용도에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명에 따라, 공여자는 건강한 인간 대상체이다. "건강한 대상체"는 장 미생물총의 불균형 또는 의료 전문가에 의해 진단/인식되는 병리상태를 겪지 않는 대상체를 의미한다.
따라서, 잠재적인 공여자를 선택하기 위해, 특정 수의 기준이 정의되었다. 이들 기준은 하기와 같다:
i. 18 내지 60세의 나이,
ii. 18 내지 30의 체질량 지수 (BMI),
iii. 심각한 감염 질환, 예컨대 AIDS 또는 바이러스 간염, 대사 및 신경계 장애, 또는 우울증에 대한 개인적인 병력의 부재,
iv. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안) 장 미생물총의 조성을 분해할 수 있는 약제, 예컨대 항생제 복용의 부재,
v. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안) 위장 질환과 연관된 증상, 예컨대 열, 설사, 구역, 구토, 복통, 황달의 발생의 부재; 심각한 감염 질환, 특히 AIDS, 간염 등의 임의의 병력의 부재,
vi. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안) 열대 국가 여행의 부재,
vii. 위험한 성적 행동의 부재,
viii. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안), 예컨대 상처, 피어싱 및/또는 문신을 통한 인간 혈액과의 접촉의 부재,
ix. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안) 만성 피로의 부재,
x. 최근 (공여 전 대략 3개월 동안) 알레르기 반응의 부재,
xi. 임의적으로, 다양한 식이를 가짐.
공여자 선택 기준은 유럽에서 일반적으로 헌혈에 사용되는 기준을 기반으로하지만, 대변 공여에 특정되고 분변 미생물총 이식의 맥락에 따른 추가 기준을 갖는다. 따라서, 공여자 선택 기준 (i) 내지 (xi)가 정의되었다.
다양한 식이와 관련된 임의적인 기준의 목적은 분변 미생물총 샘플에서 광범위한 박테리아 다양성을 갖는 능력을 향상시키는 것이다. 따라서, 공여자는 다양한 식이를 갖는 것이 바람직하다.
"다양한 식이"는 다양한 채소 및 상이한 곡물 (규칙적인 섬유질 섭취를 가능하게 할 것임) 뿐만 아니라 과일 및 육류로 이루어진 식이를 의미한다.
"박테리아 다양성"은 속 또는 종 수준에서 측정된 다양성 또는 가변성을 의미한다. 박테리아 다양성은 "풍부도" (샘플에서 관찰된 종의 수), "샤논 지수" 및 "심슨 지수"와 같은 용어로 표현될 수 있다. 샤논 지수는 특정 다양성, 즉 샘플의 종의 수 (특정 풍부도) 및 이들 종 내의 개체의 분포 (특정 공평성)에 대한 아이디어를 제공한다. 심슨 지수는 풍부도로부터 유도되며 각각의 종의 상대적 존재도를 고려한다. 이는 0 (낮은 다양성) 내지 1 (높은 다양성)로 구성된다. 역 심슨 지수는 (심슨 지수에 대한 종의 풍부도 및 상대적 존재도를 고려함으로써) 0 (낮은 다양성)에서 무한 (높은 다양성) 범위의 값 범위로 다양성을 반영할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 방법은 전형적으로 공여자 대상체로부터 분변 미생물총을 포함하는 적어도 하나의 대변 샘플을 채취하는 단계 a)를 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 대변 샘플을 채취하는 단계 a)는 공여자 자신에 의해, 예컨대 집에서, 또는 건강 전문가에 의해 수행될 수 있다.
적어도 하나의 대변 샘플을 채취하는 것은 바람직하게는 대변 샘플이 혐기성 환경에 둘러싸이는 것과 같은 방식으로 이 기능을 위해 설계된 수집 장치로 수행된다. 따라서, 특허 출원 WO2016/170290에 기재된 수집 장치가 언급될 수 있다. 따라서, 전형적으로, 집에서 대변 수집을 위한 장치는 사용자 가이드와 함께 선택된 공여자에게 전달된다. 바람직하게는, 대변 샘플은 적어도 20 g의 중량을 갖는다.
샘플을 채취하는 이 단계 후에, 예컨대 샘플 채취 후 5분 미만, 바람직하게는 3분 미만, 보다 우선적으로는 1분 미만의 빠른 기간 내에 샘플을 산소-불투과성 수집 장치에 넣는다: 이것이 단계 b)이다.
본 발명의 실시양태에 따라, 적어도 하나의 분변 미생물총 샘플을 채취하는 단계는 대변 샘플을 특허 출원 WO2016/170290에 기재된 것과 같은 수집 장치에 직접적으로 놓음으로써 수행된다.
이어서, 방법은 일반적으로 이 시점부터 혐기생활 하에서 (혐기성 분위기 하에서) 또는 공기에 대한 노출이 제한된 봉쇄 하에서 수행된다. 관리 단계 c)는 혐기생활 하에서 또는 호기생활 하에서 또는 공기에 대한 노출이 제한된 봉쇄 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따라, 품질 관리 시험을 수행하기 위해 샘플을 채취하는 것은 호기생활 하에서 수행된다. 본 발명의 실시양태에 따라, 방법의 단계 b) 및 d) 내지 g)는 혐기생활 하에서 또는 공기에 대한 노출이 제한되는 봉쇄 하에서 수행된다. 공기에 대한 노출을 제한함으로써 분변 미생물총을 구성하고 샘플에 존재하는 박테리아의 생존율이 보존된다.
바람직하게는, 기밀 수집 장치는
- 공여자 대상체로부터 분변 미생물총 샘플을 수용하기에 적합한 내부 공간을 함유하는 바디, 및 바디의 내부 공간으로 접근 개구의 경계를 결정하는 목을 포함하는 용기, 및
- 목의 접근 개구를 닫고 바디의 내부 공간을 닫는 방식으로 용기의 목에 단단하고 제거가능한 방식으로 장착되기에 적합한 뚜껑이며, 여기서 용기의 바디는 가요성 파우치로 구성되고, 용기 및 뚜껑 중 적어도 하나에 용기의 바디의 내부 공간 내에 함유된 가스의 적어도 일부를 배출하기에 적합한 배출 시설이 제공되는 것인 뚜껑
을 포함하는 유형의 형태로 제시된다.
바람직하게는, 장치의 배출 시설은 용기 또는 뚜껑 중 어느 하나를 통과하는 통로, 및 외부 유체가 용기 바디의 내부 공간으로 들어가는 것을 방지하기 위해 통로를 닫는 부품을 포함한다. 바람직하게는, 장치의 배출 시설은 또한 통로에 배열된 미공성 여과막을 포함한다.
대안적으로, 기밀 수집 장치는
- 공여자 대상체로부터 분변 미생물총 샘플을 수용하기에 적합한 내부 공간을 함유하는 바디, 및 바디의 내부 공간으로 접근 개구의 경계를 결정하는 목을 포함하는 용기, 및
- 목의 접근 개구를 닫고 바디의 내부 공간을 닫는 방식으로 용기의 목에 단단하고 제거가능한 방식으로 장착되기에 적합한 뚜껑
을 포함하는 유형의 형태로 제시되고,
- 여기서 용기의 바디의 내부 공간은 임의적으로 산소를 중화시키는 화학 장치를 함유한다.
예컨대, 본 발명의 실시양태에 따라, 방법의 단계 a)에서 d) (또는 e))를 수행하기 위해, 적어도 하나의 추가 장치, 예컨대 문서 WO 2016/170290에 기재된 바와 같이, 내부 공간을 유체 (예컨대, 단계 d)에서 첨가된 용액)로 채우기에 적합한 추가 필러 장치가 장착된 수집 장치를 사용할 수 있다.
또한, 추가 장치는 분석 (예컨대, 단계 c)에 따른 품질 관리)을 위해 샘플을 꺼내는데 사용되는 분석 튜브일 수도 있다.
바람직하게는, 기밀 수집 장치는 단계 a) 및 b)에 사용되며: 단계 a)에서 샘플 채취는 상기 장치, 특히 용기로부터 직접적으로 수행되며, 특히 뚜껑을 통해 장치를 닫는 것은 샘플을 산소가 없는 분위기에 놓이게 한다 (단계 b)).
특히, 단계 b)에서 사용된 상기에서 언급된 장치는 혐기생활 하에서 단계 b), d) 및 e)를 수행할 수 있게 한다.
임의적으로, 따라서, 운송 단계가 발생할 수 있다. 이 운송 단계를 통해 후속 처리 및 분석을 위해 샘플을 채취된 위치에서 실험실로 돌려보낼 수 있다.
단계 b) 후, 바람직하게는 단계 b) 후 24시간 이내에, 채취된 샘플에 대해 품질 관리 단계 c)를 수행한다. 이 품질 관리의 목적은 사전 정의된 품질 기준을 충족하지 않는 분변 미생물총 샘플을 제거하는 것이다. 따라서, 품질 관리 후 잔류한 샘플은 원하는 분변 미생물총의 균질 혼합물을 형성하는데 허용되는 것으로 간주된다.
일반적으로 관리된 품질 기준은 하기를 포함한다:
- 육안 검사에 의한 브리스톨 척도에서 1 내지 6의 샘플 일관성,
- 샘플 중 혈액 또는 소변의 부재.
또한, 기준은 하기를 포함할 수 있다:
- 하기 박테리아의 부재: 캄필로박터, 클로스트리듐 디피실레 (A/B 독소), 살모넬라, 예르시니아 엔테로콜리티카, 비르리오 종, 시겔라 독소-생성 이. 콜리 (STEC) stx1/stx2, 다중-내성 박테리아: 확장된-스펙트럼의 베타-락타마제 (ESBL) - 글리코펩티드/반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (GRE/VRE) 및 리스테리아 모노시토게네스, 카르바페네마제-내성 박테리아,
- 하기 기생충의 부재: 크립토스포리듐 파르붐, 시클로스포라 종, 엔타모에바 히스톨리티카, 기아르디아 람블리아, 블라스토시스티스 호미니스, 연충, 스트론길로이데스 스테르코랄리스, 이소스포라 종, 마이크로스포리디아 및 디엔타모에바 프라길리스,
- 하기 바이러스의 부재: 아데노바이러스 F40/41, 아스트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스 A, 사포바이러스 및 피코르나바이러스 (아이치 바이러스 및 엔테로바이러스),
- 하기 박테리아의 부재: 장집적성 이. 콜리 (EAEC), 장병원성 이. 콜리 (EPEC), 장독소원성 이. 콜리 (ETEC) It/st, 시겔라/장침투성 이. 콜리 (EIEC) 및 플레시오모나스 쉬겔로이데스.
샘플의 일관성 관리는 일반적으로 육안 검사로 수행된다. 샘플이 브리스톨 척도에서 1 내지 6, 바람직하게는 5의 외관을 갖는 경우 [Lewis, S.J.; Heaton, K.W. (September 1997). "Stool form scale as a useful guide to intestinal transit time". Scand. J. Gastroenterol.], 이는 허용가능하며 잔류할 것이다.
샘플 중 혈액 또는 소변의 부재에 대한 관리는 육안 검사에 의해 또는 다른 수단에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 신속한 면역학적 시험을 이용할 수 있다. 예컨대, 인간 글로빈-특이적 항체를 통해 헤모글로빈을 검출하는 정량적인 면역학적 시험인 OC 센서(OC Sensor)® 시험 (프랑스의 마스트 다이아그노스틱 (MAST Diagnostic)으로부터 입수가능).
혈액 및/또는 소변의 존재가 발견되는 경우, 샘플을 제거한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 특정 기생충, 바이러스 및 박테리아의 부재에 대한 샘플의 관리가 또한 수행될 수 있다. 전형적으로 특정 기생충, 바이러스 및 박테리아의 부재에 대한 샘플의 관리는 공여자당 주당 1회 수행된다. 이는 전형적으로, 예컨대 주중에 5개의 샘플을 공급하는 공여자의 경우, 5개 중 1개 샘플이 관리될 것이라는 것을 의미한다. 본 발명의 실시양태에 따라, 특정 기생충, 바이러스 및 박테리아의 부재에 대한 샘플의 관리 단계는 각 샘플에서 수행된다.
샘플로부터 특정 박테리아, 특정 기생충 및 특정 바이러스의 부재에 대한 관리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 수행된다.
바람직하게는, 하기 박테리아가 샘플로부터 부재해야 한다: 캄필로박터, 클로스트리듐 디피실레 (A/B 독소), 살모넬라, 예르시니아 엔테로콜리티카, 비르리오 종, 시겔라 독소-생성 이. 콜리 (STEC) stx1/stx2, 리스테리아 모노시토게네스 및 다중-내성 박테리아, 예컨대 확장된-스펙트럼의 베타-락타마제 (ESBL)를 생성하는 그람-음성 박테리아 및 글리코펩티드/반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (GRE/VRE), 리스테리아 모노시토게네스, 카르바페네마제-내성 박테리아, 장집적성 이. 콜리 (EAEC), 장병원성 이. 콜리 (EPEC), 장독소원성 이. 콜리 (ETEC) It/st, 시겔라/장침투성 이. 콜리 (EIEC) 및 플레시오모나스 쉬겔로이데스.
바람직하게는, 상기 언급된 박테리아는 수집된 분변 미생물총 샘플에서 그 존재가 상기 샘플의 공여자를 선택에서 제외할 병원체이다.
유사하게, 하기 기생충도 바람직하게는 분변 미생물총 샘플로부터 부재해야 한다: 크립토스포리듐, 시클로스포라 카예타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 엔타모에바 히스톨리티카 및 기아르디아 람블리아, 블라스토시스티스 호미니스, 연충, 스트론길로이데스 스테르코랄리스, 이소스포라 종, 마이크로스포리디아 및 디엔타모에바 프라길리스.
유사하게, 하기 바이러스도 바람직하게는 분변 미생물총 샘플로부터 부재해야 한다: 아데노바이러스 F40/41, 아스트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스 A, 사포바이러스 및 피코르나바이러스 (아이치 바이러스 및 엔테로바이러스).
박테리아, 기생충 및 바이러스의 존재에 대한 관리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 수행된다. 예컨대, 하기 방법이 언급될 수 있다: 선별적 조건 하에서의 배양, 항체에 의한 박테리아, 기생충 또는 바이러스의 검출, 샘플에 존재하는 DNA 서열의 증폭 (예컨대, PCR 사용) 및 분석. DNA 서열에 대한 분석 시스템으로 박테리아, 기생충 및 바이러스 검출에 사용될 수 있는 자동화 시스템인 바이오메리욱스 (BioMerieux) (프랑스)로부터의 필름어레이(FilmArray)® 시스템이 언급될 수 있다. 예컨대, 하기 기생충이 이 시스템으로 검출될 수 있다: 크립토스포리듐, 시클로스포라 카예타넨시스, 엔타모에바 히스톨리티카 및 기아르디아 람블리아. 유로바이오 (Eurobio) (프랑스)로부터 입수가능한 "알플렉스-GI (Allplex-GI)" PCR 시험 시리즈가 또한 언급될 수 있다.
다른 기생충, 예컨대 블라스토시스티스 호미니스, 이소스포라 종, 마이크로스포리디아 및 디엔타모에바 프라길리스는 필요한 경우 샘플 농축과 함께 현미경 검사를 통해 검출될 수 있다. 스트론길로이데스 스테르코랄리스는 필요한 경우 샘플 농축 후, 예컨대 선택적 염색으로 검출될 수 있다.
다중-내성 박테리아, 예컨대 ESBL, VRE 및 GRE는 특정 조건, 예컨대 바이오메리욱스로부터 상업적으로 입수가능한 ESBL, VRE 또는 ALOA 배지 하에서 배양하여 검출될 수 있다.
특정 종의 박테리아 및 바이러스에 대해서는, 샘플로부터 그의 부재가 요구되지 않는다. 본 발명의 실시양태에 따라, 하기 박테리아의 존재는 샘플의 제외 기준이 아니다: 장집적성 이. 콜리 (EAEC), 장병원성 이. 콜리 (EPEC), 장독소원성 이. 콜리 (ETEC) It/st, 시겔라/장침투성 이. 콜리 (EIEC) 및 플레시오모나스 쉬겔로이데스. 본 발명의 실시양태에 따라, EBV 바이러스의 존재는 이 바이러스가 오늘날 일반적인 인간 집단에서 만연하기 때문에 제외 기준이 아니다.
일반적으로, 샘플 중 혈액 또는 소변의 부재에 대한 관리 및 임의적으로 샘플로부터 특정 기생충, 바이러스 및 박테리아의 부재에 대한 관리를 포함하는 관리 단계 c) 후에 잔류한 샘플은 단계 d)로 나아간다. 단계 d)는 동결보호 희석제의 첨가를 포함한다.
일반적으로, 단계 d)에 대해, 샘플은 동결보호 희석제를 첨가함으로써 개별적으로 액체 접종물로 변환된다. 일반적으로, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 수용액은 품질 관리 단계 c) 후에 잔류한 각각의 샘플에 첨가된다.
접종물의 제조를 위해 임의의 적합한 희석제/동결보호제가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 폴리올 또는 이당류, 삼당류 또는 다당류, 또는 그의 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리올, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜로 언급될 수 있다. 이당류, 삼당류 또는 다당류로서, 상이한 또는 동일한 단위의 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체가 언급될 수 있으며, 상기 단위는 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 푸코스 및 N-아세틸뉴라민산으로부터 선택된다. 사용할 수 있는 이당류 중 트레할로스, 또는 그의 유사체 중 하나, 또는 사카로스를 언급할 수 있다. 바람직하게는, 동결보호제는 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 트레할로스 및 그의 유사체, 사카로스, 갈락토스-락토스 및 그의 혼합물로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 동결보호제는 갈락토스-락토스 또는 트레할로스이다.
전형적으로, 식염수 수용액에 존재하는 동결보호제의 양은 최종 접종물의 총 부피에 대해 중량으로 3 내지 30% (wt/vol), 바람직하게는 4 내지 20% (wt/vol)로 구성된다.
증량제로서, 예컨대 전분, 특히 밀 또는 옥수수의 부분 가수분해물 뿐만 아니라 다량의 말토덱스트린을 함유하는 전분 식품, 예컨대 감자의 부분 가수분해물이 언급될 수 있다. 바람직하게는, 증량제는 말토덱스트린의 혼합물이고, 여기서 말토덱스트린은 (최종 접종물의 총 부피에 대해) 3 내지 30%, 바람직하게는 4 내지 20% (중량/부피)로 존재한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 희석제/동결보호제는 적어도 하나의 동결보호제 및 증량제를 포함하는 식염수 수용액이다.
전형적으로, 용액은 물 및 생리학적으로 허용가능한 염을 함유한다. 전형적으로, 용액은 염화제1철, 글루코네이트, 아세테이트 또는 탄산수소염과 함께 칼슘, 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염을 함유할 것이다. 식염수 수용액은 또한 임의적으로 적어도 하나의 항산화제를 함유할 수 있다. 항산화제는 아스코르브산 및 그의 염, 토코페롤, 시스테인 및 그의 염, 특히 히드로클로라이드 및 그의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 우선적으로, 식염수 수용액은 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 불화칼륨, 나트륨 글루코네이트 및 나트륨 아세테이트로부터 선택된 적어도 하나의 염, 및 임의적으로 나트륨 L-아스코르베이트, 토코페롤, 시스테인 히드로클로라이드 일수화물 및 그의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 항산화제를 포함한다. 전형적으로, 염은 (최종 접종물의 총 부피에 대해) 대략 5 내지 20 g/l, 바람직하게는 7 내지 10 g/l를 포함하는 농도로 식염수 수용액에 존재한다. 전형적으로, 항산화제는 (최종 접종물의 총 부피에 대해) 0.3 내지 1% (중량/부피), 바람직하게는 0.4 내지 0.6% (중량/부피)를 포함하는 양으로 식염수 수용액에 존재한다.
일반적으로, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 수용액은 1 : 0.5 내지 1 : 10, 바람직하게는 1 : 2 내지 1 : 8, 보다 우선적으로는 1 : 4를 포함하는 중량 (g)/부피 (ml)의 비율로 분변 미생물총 샘플에 첨가된다. 샘플 : 용액 중량/부피 비율이 0.5 중량 : 10 부피와 같다는 것은 샘플이 10 부피의 용액 (예컨대, 10 ml)에 대해 0.5 중량 (예컨대, 0.5 g)으로 혼합된다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 수용액의 첨가 단계 d)는 혐기생활 하에 또는 공기에 대한 노출이 제한되는 봉쇄 하에 수행된다. 본 발명의 실시양태에 따라, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 용액은 하기에 언급된 수집 장치의 추가 장치에 첨가되고 용액은 닫힌 파이프를 통해 대변 샘플에 첨가된다. 적어도, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는, 식염수 수용액과 샘플의 혼합물은 특히 균질 혼합물을 수득하기 위해 혼합에 의해 수행될 수 있다.
이 희석 단계 후에 수득된 샘플은 단계 e)에서 여과된다. 바람직하게는, 여과 단계는 직경이 0.5 mm 이하, 바람직하게는 265 μm 이하인 세공을 포함하는 하나의 (또는 점점 더 작은 크기의 세공을 갖는 여러개의) 필터(들)로 수행된다. 여러개의 필터를 사용하는 경우, 세공의 크기는 점차 감소한다. 바람직하게는, 사용된 제1 필터는 2 mm 이하, 바람직하게는 1 μm 이하의 직경의 세공을 포함한다. 바람직하게는, 사용된 마지막 필터는 0.5 mm 이하, 바람직하게는 265 μm 이하의 직경의 세공을 포함한다. 따라서, 개별 접종물이 수득된다. 바람직하게는, 이 여과 단계 e)는 혐기생활 하에서 또는 공기에 대한 노출이 제한된 봉쇄 하에서 수행된다. 여과 동안 단계 d)로부터 유래한 샘플은 수동, 기계적 작동, 중력, 진공 또는 다른 적절한 수단에 의해 필터를 통해 압착될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 공여자당 (중량으로) 동일한 양의 대변이 접종물을 형성하기 위해, 즉 단계 d) 및 e)를 수행하기 위해 사용된다. 예컨대, 25-80 g, 바람직하게는 40 g의 적절한 양이 언급될 수 있다. 따라서, 각각의 개별 접종물은 동일한 샘플 양의 분변 미생물총을 사용하여 생성된다.
단계 f)는 여과 단계 e)로부터 유래한 접종물을 풀링하는 것으로 이루어진다. 특히, 전형적으로, 개별 접종물은 용기, 바람직하게는 가요성 파우치로 이송된다. 전형적으로, 접종물을 풀링하는 이 용기의 부피는 1 L 내지 5 L, 바람직하게는 3 L 또는 5 L이다. 이 부피는 방법의 산업화 규모에 따라 더 클 수 있다. 이송은 수동으로 또는 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 접종물의 이송은 기계적 수단, 예컨대 주사기, 보다 우선적으로는 연동 펌프를 사용하여 수행된다. 적합한 연동 펌프는, 예컨대 인터사이언스 (Interscience) (프랑스)로부터 상업적으로 입수가능하다.
풀링 후, 접종물은 균질 혼합물을 형성하기 위해 혼합된다 (균질화 단계 g)). 따라서, 이 균질 혼합물은 분변 미생물총의 "배치"로 간주된다. 접종물의 혼합은 임의의 수단으로 수행될 수 있다. 접종물의 혼합은 수동으로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 스튜어트 (Stuart) (영국)로부터 입수가능한 플랫폼 진탕기가 언급될 수 있다.
일반적으로, 80-200 rpm, 바람직하게는 90 내지 150 rpm, 보다 우선적으로는 100-135 rpm의 교반 속도가 사용될 수 있다. 일반적으로, 균질화는 10분 내지 2시간, 바람직하게는 20분 내지 1시간, 보다 우선적으로는 30분을 포함하는 기간 동안 일어날 수 있다. 지속기간은 교반 속도에 의존한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선택된 균질화 방법의 함수로서 필요한 균질화 시간을 결정하는 방법을 알고 있다. 비색 시험은 혼합물이 균질한지를 확인하는데 이용될 수 있다. 육안 검사도 이용될 수 있다. 바람직하게는, 혼합물이 균질한지를 결정하기 위해 비색 시험 후 육안 검사가 수행된다.
균질화 단계는 2 내지 25℃, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃, 보다 우선적으로는 대략 4℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 혼합물이 저장되거나 동결건조되기 전에 단계 g) 후에 수득된 균질 혼합물에 대해 분석 단계를 수행할 수 있다 (하기의 세부 사항 참조). pH와 PO2를 측정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 이러한 측정을 수행한다. 전형적으로, 혼합물의 PO2는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만이고, 전형적으로 pH는 4 내지 7, 바람직하게는 4.5 내지 6.5이다.
바람직하게는, 단계 a)의 시작과 단계 g)의 종료 사이에 76시간 미만이 경과된다.
일반적으로, 최종 제품 (균질 혼합물)은 하기 사양을 충족한다:
외관: 균질한 황색/갈색 현탁액.
생존율: 동결건조의 경우 20% 초과, 바람직하게는 40% 초과.
(박테리아) 이벤트의 수: 109개 박테리아/ml 초과.
박테리아 다양성: 4 이상인 역 심슨 지수. 바람직하게는, 접종물의 혼합물의 심슨 지수는 10 이상, 보다 우선적으로는, 15 초과, 보다 더 우선적으로는 20 초과이다.
일반적으로, 균질 혼합물은 저장 또는 동결건조를 위해 이송된다 (이송 단계 h). 따라서, 혼합물은
- 혼합물을 16시간을 지나 사용하기 위해, 대략 -50℃ 내지 -80℃, 바람직하게는 대략 -80℃의 온도에서 저장하기 위해, 또는
- 대략 16시간 이내에 사용하기 위해, 2 내지 6℃의 온도에서 저장하기 위해, 또는
- 다음 4시간 이내에 혼합물을 사용하기 위해, 10 내지 25℃의 온도에서 저장하기 위해 파우치로 이송될 수 있다. 주위 온도에서 4시간이 지나면 박테리아의 수가 증가하고 접종물의 균질성이 감소될 수 있다.
대안적으로, 균질 혼합물은 후속 또는 즉시 동결건조를 위해 동결건조 장치로 이송될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 분석 단계 i)는 균질 혼합물의 그의 저장 위치 (전형적으로 파우치) 또는 그의 동결건조 위치 (전형적으로는 동결건조 장치)로의 이송 단계 h) 후에 수득된 균질 혼합물에 대해 수행될 수 있다. 특히, 이 분석 단계는 육안 검사, 생존율 측정, 분류학적 분석 및 이벤트의 수/ml 측정을 포함한다. 이 분석 단계의 목적은 샘플이 FMT 요법에서 사용하기 위한 품질 기준을 충족하는지를 결정하는 것이다.
전형적으로, 혼합물은 황색/갈색을 갖는다. 전형적으로 생존율은 >20%이어야 한다. 본 발명의 실시양태에 따라, 생존율은 바람직하게는 >40%이다. 혼합물을 동결건조해야 하는 경우, 생존율이 >40%인 것이 바람직하다. 일반적으로, 유동 세포측정에 의해 측정된 세포 농도는 106개 초과, 바람직하게는 107개 초과 박테리아/ml, 더욱 바람직하게는 109개 초과 박테리아/ml이다. 분류학적 분석 측면에서, 일반적으로, 샤논 지수는 3.5 초과, 바람직하게는 4 초과인 것이 바람직하다.
본 발명의 실시양태에 따른 방법으로부터 유래한 혼합물의 우수한 품질은 본 출원인에 의해 입증되었다. 본 발명의 실시양태에 따라, 건강한 공여자로부터의 6개의 신선한 대변으로 수행된 본 발명의 방법의 정성적 평가의 결과가 실시예 1에 제시된다. 미생물총 생존율 시험은 풀링 단계 f) 전 및 균질화 단계 g) 후에 각각의 접종물에 대해 수행되었다.
본 출원인은 풀링된 접종물로 구성된 균질 혼합물이 예상보다 더 높은 자체 박테리아 생존율을 가졌다는 점에 주목하였다.
도 2는 저장을 위한 실시예 1의 접종물 (접종물 1, 4, 5, 6 및 2 + 8) 및 접종물의 파우치 1 내지 15에 있는 접종물의 혼합물 (균질 혼합물)의 미생물총의 생존율 백분율을 나타내는 히스토그램이다. 도 2는 개별 접종물 (접종물 1, 4, 5, 6, 2 + 8)은 동일한 개별 생존율을 갖지 않지만 접종물의 혼합물은 개별 접종물과 상이한 자체 생존율을 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 미생물총의 생존율이 각각의 파우치에 대해 거의 동일하기 때문에 (40% 초과) 최종 혼합물의 파우치의 우수한 재현성을 보장한다.
균질 혼합물의 파우치에 대한 통계 분석은 미생물총의 생존율에 대한 것이든 또는 이벤트의 수/μL에 대한 것이든 t-검정 및 순위 시험에 따른 유의한 차이가 없음을 나타낸다. 따라서, 본 출원인은 혼합물의 모든 제조된 파우치가 서로 균질하다는 것을 입증하였다.
본 발명의 실시양태에 따라, 건강한 공여자로부터의 신선한 대변의 4개의 상이한 배치 (배치 번호 1 내지 배치 번호 4)로 수행된 본 발명의 방법의 정성적 평가 결과가 실시예 2에 제시된다. 배치 번호 4는 실시예 1에 사용된 것 (및 도 2에 나타낸 것)과 동일한 배치이다. 실시예 2에서, 공여자의 수는 각각 배치 번호 1, 배치 번호 2, 배치 번호 3 및 배치 번호 4에 대해 2, 7, 4 및 6명이다. 본 출원인은 저장 전 개별 접종물 (단계 e) 후), 균질화된 풀링된 접종물 (단계 g) 후) 및 채워진 파우치의 박테리아 생존율 및 다양성을 측정하였다.
도 3은 개별 접종물은 다양하지만 접종물의 혼합물은 개별 접종물과 상이한 자체 생존율을 갖는다는 것을 다시 나타낸다. 배치 번호 1 내지 4의 생존율은 46.1% 내지 60.1%로 우수하다.
도 4a는 샘플의 풍부도를 나타낸다. 변동 계수 (CV)는 각각의 접종물에 대해 계산되었다. CV (변동 계수 또는 상대적 편차)는 평균 주변의 데이터 분산을 측정한 것이다. 이것은 평균에 대한 표준 편차의 비율의 계산이다. CV를 사용하면 한 샘플에서 다른 샘플의 변동 정도를 계산할 수 있다. CV 값이 작을수록 값이 더 균질하거나 안정적이다. 4개 배치의 개별 접종물의 CV는 16% 내지 81%로 다양하다. 이 차이는 개별 미생물총이 매우 상이하다는 것이 알려져 있기 때문에 정상이다. 각각의 풀링된 접종물 (단계 g)로부터 유래함)에 대해, 배치당 변동 계수는 0.3% 내지 2%이다. 이 낮은 변동은 각각의 배치에 대한 접종물의 혼합물이 균질하고 안정하다는 것을 나타낸다.
종 또는 속 수준에서 측정된 풍부도는 개별 접종물에 비해 풀링된 접종물에서 현저하게 더 크다. 평균적으로, 풍부도는 개별 접종물과 비교하여 배치 번호 4에서 64%로부터 배치 번호 1 및 3에서 147%로 증가한다.
평균적으로, 풀링된 접종물의 속 수준에서 측정된 풍부도는 개별 접종물과 비교하여 배치 번호 4의 경우 25%, 배치 번호 1 및 3의 경우 61%로 증가한다. 배치 1 내지 4의 풍부도는 놀랍고, 개별 접종물의 개별 풍부도로부터 추론될 수 없다; 즉, 접종물의 혼합물 (풀링된 접종물)의 이러한 풍부도는 직접적이든 또는 개별 접종물의 중량에 의해 가중된 것이든 또는 측정된 개별 풍부도의 일부에 의한 것이든 평균이 아니다. 이 결과는 예상치 못한 것이다.
4개의 풀링된 접종물에 존재하는 프로테오박테리아의 백분율을 측정하였다 (표 5 참조). 값은 각각 배치 번호 1, 2, 3 및 4에 대해 5.5%, 3.7%, 3.1% 및 3.4%이다.
결론적으로, 접종물의 풀링은 미생물총의 풍부도를 예기치 않게 증가시킨다. 따라서, 접종물의 혼합물은 자체 특징을 갖는 분변 미생물총 샘플이다.
도 4b는 본 발명의 방법이 배치를 위해 수득되고 임상 사용이 의도된 제품 (균질 혼합물)의 표준화를 포함한다는 것을 나타낸다. 도면은 각각의 배치에 대한 파우치 (풀링된 접종물 함유) 간의 브레이-커티스 유사도가 96% 초과임을 나타낸다. 이 결과는 분류학적 프로필 측면에서 접종물의 파우치 (균질 혼합물)가 균질하다는 것을 나타낸다.
박테리아 다양성은 역 심슨 지수 및 샤논 지수를 사용하여 측정되었다 (표 5).
결과는 공여자에 대한 역 심슨 지수가 5 내지 30으로 다양하다는 것을 나타낸다. 이 차이는 각각의 미생물총이 상이하므로 정상이다. 표 5에 제시된 데이터에 따라, 풀링된 접종물에 대한 역 심슨 지수가 20.2 내지 27.2임을 알 수 있다. 풀링된 접종물 (단계 g) 후)의 박테리아 다양성은 개별 공여자의 것보다 높다 (공여자의 다양성이 풀링된 접종물의 다양성보다 큰 배치 번호 3은 제외).
공여자에 대한 샤논 지수는 2.4 내지 4.2이다. 각각의 미생물총이 상이하므로 이 차이는 정상이다. 풀링된 접종물에 대한 샤논 지수는 4 내지 4.50으로 구성된다 (표 5 참조).
또한, 각 배치에 대해 풀링된 접종물의 다양성이 개별 공여자의 것보다 높다는 것을 알 수 있다. 풍부도에 대해 수득된 값은 예측될 수 없으며 각각의 것이 균질 혼합물에 특유한 특징을 구성한다.
본 발명자들은 일반적으로 본 발명의 방법에 따라 수득될 수 있는 접종물의 혼합물이 공지된 방법 및 특히 다중-공여자 방법에 따라 수득된 분변 미생물총의 샘플에 비해 유리한 특징을 갖는다는 것을 입증하기 위한 비교 시험을 수행하였다. 따라서, 본 발명자들이 종래 기술 [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomized placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]에 기재된 방법에 따라 생성된 샘플을 어떻게 특성화하였는지 및 그들을 본 발명의 실시양태에 따라 생성된 샘플과 어떻게 비교하였는지가 실시예 3에 기재된다. 2개의 생성 방법이 도 5에 기재된다. 본 발명의 실시양태에 따라 생성된 샘플은 종래 기술의 방법에 따라 생성된 것에 비해 개선된 생존율 및 개선된 다양성을 나타내었다.
제품의 생존율이 측정되었다. 본 발명의 실시양태에 따라 풀링된 접종물의 생존율은 -80℃ +/- 10℃에서 1개월 저장 후 5개 샘플에 대해 평균 41.8%에서 41.4%로 변화한다. 파람소티 등의 방법에 따라 수득된 샘플은 평균 38.5%에서 37.5%로 변화한다. 이러한 생존율 변화는 윌콕슨 시험 시험에 따르면 유의하지 않으며, 본 발명에 따른 샘플의 경우 p 값은 0.462이고 참조 샘플의 경우 (파람소티 등에 따름) p 값은 0.1732이다.
그러나, 윌콕슨 시험은 p 값이 0.01193인 T0 (제0일) 뿐만 아니라 1개월 (p=0.007937)에 2개의 샘플 그룹 간에 유의한 생존율 차이를 나타낸다.
또한, 0일에 본 발명의 방법에 따라 제조된 샘플의 변동 계수 (CV)는, 종래 기술 (Paramsothy et al.)에 따른 참조 샘플의 0.034에 비해, 0.010이다. 1개월에, 본 발명의 방법에 따라 제조된 샘플의 CV는, 참조 샘플의 0.028에 비해, 0.018이다. 실시예 1과 관련하여, 본 발명자들은 실시예 2에 대해 생성된 샘플이 매우 낮은 변동을 갖는다는 것을 입증하였으며, 이는 각각의 배치에 대한 접종물의 혼합물이 균질하고 안정하다는 것을 나타낸다. 이에 비해, 참조 샘플은 더 높은 CV를 나타낸다.
본 발명자들은 샘플의 16S rDNA를 분석하여 실시예 3의 샘플의 미생물 다양성을 분석하였다. 다양성은 풍부도 (OTU의 수/확인된 종) 및 그의 각각의 상대적 존재도 둘 다를 고려하는 역 심슨 지수로 표현된다.
도 6은 역 심슨 지수 값이 본 발명의 실시양태에 따라 제조된 샘플에 대해 30.96 내지 33.69 (중앙값 = 32.56) 및 파람소티 등에 따라 제조된 "참조" 샘플에 대해 13.70 내지 23.18 (중앙값 = 19.31)을 포함한다는 것을 나타낸다. 관찰된 다양성은 본 발명의 실시양태에 따라 제조된 샘플에서 더 크다. 본 발명의 실시양태에 따라 제조된 샘플은 또한 "참조" 샘플에 비해 개선된 균질성을 가지며, 이는 변동 계수에 의해 입증되며, 전자의 경우 2.7%, 후자의 경우 16.1%이다. 순위 시험은 2개의 방법 간의 "매우 상당한" 차이를 평가한다 (p <2,2e-16).
도 7은 실시예 3에서 2개의 샘플 그룹에 가장 많이 존재하는 10개의 박테리아 과의 상대적 존재도를 나타낸다. 샘플 Inv-01 내지 Inv-10은 파람소티 등의 종래 기술의 방법에 따라 생성된 샘플 Ref-01-Ref-10에 비해 현저하게 개선된 균질성을 갖는다. 시각적이지만 이러한 표현은 파람소티 등의 방법에 의해 생성된 이질성의 수준 뿐만 아니라 특정 과에 대한 2개의 방법 간의 존재도 편차를 관찰할 수 있게 한다.
균질성, 다양성 및 존재도의 편차는 다른 분류학적 수준에서 명확하게 나타난다. 또한, 실시예 3의 표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 건강에 유리한 것으로 인식된 특정 박테리아 종이 샘플 Ref-01-Ref-10과 비교하여 샘플 Inv-01 내지 Inv-10에서 개선된 보존성을 가지고 있음을 주목하였다. 예컨대, 악티노박테리아 (Actinobacteria) 문에 대해, 파람소티 등에 따른 방법을 사용하는 경우, 이 중앙값 존재도가 샘플 Inv-01-Inv-10에 대해서는 3.6%이고 샘플 Ref-01 내지 Ref-10에 대해서는 0.9%이므로, 상대적 존재도가 매우 현저하게 떨어진다. 균질성 측면에서, 본 발명자들은 각각 7.8% 및 14.5%의 변동 계수를 관찰하였다. 또한, 도 7에서, 본 발명의 샘플과 참조 샘플 간에 악티노박테리아 문의 과인 코리오박테리아세애 (Coriobacteriaceae)의 상대적 존재도가 현저히 감소하는 것이 관찰되었다.
유사한 결과가 프레보텔라 (Prevotella) 속 (박테로이데테스 (Bacteroidetes) 문과 관련된 속)에서도 관찰되었으며, 특정 분류군의 유지 및 균질성 측면 둘 모두에서 2개의 방법 간의 차이점을 확증한다. 프레보텔라의 상대적 존재도는 Ref-01 내지 Ref-10 샘플 (중앙값 11%)에 비해 Inv-01-Inv-10 샘플 (중앙값 13%)에서 더 높다. 균질성 측면에서, 본 발명자들은 각각 3.3% 및 8.5%의 변동 계수를 관찰하였다.
마지막으로, 비피도박테리움 속 (악티노박테리아에 속함)은 다른 분류학적 수준에서 이미 관찰된 결과를 확증한다. 비피도박테리움의 상대적 존재도가 상당히 감소하는 것으로 나타나며 (0.9% 대 0.6%), 파람소티 등의 방법에 의해 생성된 샘플 간의 균질성이 본 발명의 실시양태에 따른 방법에 의해 생성된 것보다 낮다 (실시예 3의 표 6 참조).
따라서, 이들 항목은 일반적으로 청구된 방법이 각 배치에 대해 제조된 샘플 수준에서 훨씬 개선된 균질성과 연관하여 이 문의 개선된 보존을 가능하게 한다는 것을 나타내며; 특히, 본 발명의 실시양태에 따라 제조된 샘플은 종래 기술의 방법에 따라 제조된 샘플과 비교된다. 이러한 개선된 균질성은 최종 제품을 제약품으로 특징규명하는데 근본적으로 중요하다. 따라서, 동일한 배치로부터 여러개의 분변 미생물총 샘플을 받는 환자는 매번 동일한 다양성 및 동일한 미생물 생존율을 갖는 균질한 제품을 받는다. 이러한 재현성은 샘플 생성에 이용되는 방법을 통해 보장된다.
결론적으로, 실시예 3의 메타게놈 분석 (16S rDNA 시퀀싱)을 통해 본 발명의 실시양태에 따라 수득된 샘플이 하기를 가짐을 입증할 수 있었다:
- 훨씬 더 높은 역 심슨 지수에 의해 입증된, 개선된 다양성 보존,
- 널리 공지된 비피도박테리움 속을 포함하는 악티노박테리아와 같은 특정한 관심 분류군의 훨씬 더 큰 보존,
- 파람소티 등에 따른 방법으로 생성된 샘플 세트에 대해 수득된 것에 비해 샘플 간의 더 높은 수준의 균질성.
일반적으로, 본 발명에 따른 방법은 종래 기술에 비해 균질하고 재현가능한 배치의 개념이 규제의 기본인 약제 제조를 위한 방법에 매우 중요한 개선된 재현성을 갖는다. 상이한 배치에 대해 측정된 풍부도 값 (도 9 참조)은 실제로 3.5%의 변동 계수로 배치 간에 큰 재현성을 나타낸다. 따라서, 이들 결과는 배치간 뿐만 아니라 배치내에서 분변 미생물총의 균질성이 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 이렇게 수득된 접종물의 혼합물이 특정한 개별 접종물보다 큰 분류학적 프로필 및 박테리아 생존율을 갖는다는 것을 관찰하였으며, 이는 동종이계 FMT (분변 미생물총 이송)에 사용하기에 완벽하게 적합하다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 수득된 접종물의 혼합물은, 높고 안정한 생존율 뿐만 아니라 매우 높은 다양성을 특징으로 하기 때문에, FMT에서 사용하기 위한 품질면에서 우수하다. 이들 특징은 개별 접종물을 사용하여 수득될 수 있는 것에 비해 적합한 미생물총의 재집락화에 대해 더 높은 가능성을 허용한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 미생물총 샘플의 제조 방법은 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속, 즉 블라우티아, 패칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움, 비피도박테리움, 루미노코쿠스, 클로스트리듐, 코프로코쿠스, 오도리박터, 로세부리아, 홀데마넬라, 아나에로스티페스, 오실리박터, 수브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오를 포함하는 미생물총의 균질 혼합물을 수득할 수 있게 한다. 이 실시양태는 실시예 4에 예시된다.
실시예 4는 선택 기준을 충족하는 8명의 공여자로부터 대변의 균질 혼합물을 수득하기 위한 실험을 기재한다 (단계 c)). 품질 관리를 통과한 각각의 대변은 개별적으로 동결보호 희석제를 첨가한 후 여과함으로서 처리되었다. 이어서, 균질한 배치 제품을 수득하기 위해 동일한 날에 수득된 개별 접종물이 혼합되었다.
공여자의 대변과 생성된 혼합물 배치의 대변의 분석은, 전술된 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속의 농도가 그의 생성에 사용된 대변의 수에 관계 없이 혼합물에서 안정하다는 것을 나타낸다. 분석은 또한 사용된 대변의 수가 증가하는 경우 이들 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속의 존재도가 표준화된다는 것을 나타낸다 (도 8 및 표 7). 또한, 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속은 공여자의 개별 대변에서는 모두가 발견되지 않지만, 적어도 4개의 대변의 혼합물로 제조된 모든 배치는 이들을 모두 함유한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 분변 미생물총의 균질 혼합물의 제조 방법은 적어도 4명의 공여자로부터 유래한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 미생물총의 균질 혼합물은 하기 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속, 즉 블라우티아, 패칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움, 비피도박테리움, 루미노코쿠스, 클로스트리듐, 코프로코쿠스, 오도리박터, 로세부리아, 홀데마넬라, 아나에로스티페스, 오실리박터, 수브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오를 포함한다.
환자에게 투여하기 위한 제품에 전술된 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속의 존재는, 이들 박테리아 속이 항-염증 특성과 연관되기 때문에 중요하다. 따라서, 치료적 관점에서, 균질 혼합물에서 그의 존재는 장 염증, 특히 장 미생물 불균형과 연관된 치료에서 이들 균질 혼합물의 사용에 유리하다.
균질 혼합물은 확실하고 재현가능하게 쉽게 생성될 수 있다. 실시예 1의 결과는 생성된 혼합물의 모든 파우치 간의 생존율 및 분류학적 프로필의 균질성을 나타낸다. 투여된 미생물총 (균질 혼합물) 샘플의 품질은 재현가능하며 공여자 그룹으로부터 유래하는 파우치 간에 동일하다. 거의 동일한 제품이 각각의 파우치로 투여될 수 있다. 따라서, 환자는 하나 초과의 치료가 필요한 경우 여러 치료에서 동일한 제품을 받을 수 있다.
일반적으로, n명의 공여자는 대략 3n개, 바람직하게는 3.2n개의 파우치를 채우기에 충분한 균질 혼합물을 제공할 수 있으며, 각각의 파우치는 하나의 TMF 치료에 충분하다.
미생물총 (또는 풀링된 접종물)의 균질 혼합물은 장 미생물 불균형 및 연관된 병리상태의 치료에 사용될 수 있다. 사실, 이는 그의 활성 성분을 나타낸다. 본 발명의 방법으로 생성된 풀링된 접종물의 박테리아 다양성은 높고, 4 내지 4.50의 샤논 지수 및 20.2 내지 27.2의 심슨 지수를 가질 수 있다. 본 출원인은 또한 개별 접종물은 매우 다양한 생존율을 가지고 있지만 접종물의 혼합물 (풀링된 접종물)은 뛰어난 생존율 (대략 41% 내지 60%)을 가지고 있음을 입증하였다. 본 발명의 실시양태에 따라, 접종물의 균질 혼합물은 40% 초과, 바람직하게는 45% 초과, 보다 우선적으로는 50% 초과, 보다 더 우선적으로는 55% 초과의 생존율을 갖는다. 박테리아 다양성 및 생존율에 대한 기준은 FMT를 위한 제품의 품질 평가에서 매우 중요하다.
또한, 제약품 규제 기준에 따라 제품이 균질한 것이 중요하다. 하기 실시예의 데이터는 본 발명에 따른 제품이 균질하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 실시양태에 따라, 미생물총 (또는 풀링된 접종물)의 균질 혼합물은 직장 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따라, 미생물총 (또는 풀링된 접종물)의 균질 혼합물은 경구 경로를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 제형으로 특허 출원 EP 17306602.8에 언급된 제형이 언급될 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 연구는 FMT가 이식편대숙주 질환 (GvHD)의 치료에 효과적일 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 미생물총의 균질 혼합물은 GvHD의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 전술된 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속의 존재는 이식편대숙주 질환 (GvHD)의 치료 효능에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태에 따라, GvHD를 겪는 환자는 본 발명의 균질 혼합물을 포함하는 동종이계 FMT를 받을 수 있다. 예컨대, 환자는 직장 경로를 통해 동종이계 FMT를 받을 수 있다. 또한, 환자는 경구 경로를 통해 이를 받을 수 있다.
미생물총의 균질 혼합물은 패혈증, 패혈 쇼크 및 설사, 점막염, 복통 및 위장 출혈을 포함하는 위장 장애를 포함하는 의원성 장 미생물 불균형 및/또는 연관된 병리상태 및 합병증의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 항-염증 효과를 갖는 언급된 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속의 존재는 치료의 효능에 기여할 수 있다.
미생물총의 균질 혼합물은 클로스트리듐 디피실레 감염 및 연관된 설사 (CDI), 염증성 장 질환 (IBD), 과민성 장 증후군 (IBS), 특발성 변비, 복강 질환, 크론 질환, 비만 및 병적 비만, 자폐증, 다발성 경화증, 여행자 설사, 만성 질 감염 (방광염 및 진균증 포함), 골 및 관절 감염, 파킨슨 질환, II형 당뇨병, 음식 알레르기, 암, 저항성 백혈병, 알츠하이머 질환, 정신분열병 및 양극성 장애, 항신생물 화학요법 또는 면역요법과 연관된 장 미생물 불균형 및 알콜- 또는 비알콜-관련된 간 질환의 치료에 사용될 수 있다.
미생물총의 균질 혼합물은 집중 치료를 위한 입원에 기인한 합병증 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 실시예를 참조하여 설명된다. 청구된 본 발명은 이들 실시예에 의해 어떤식으로든 제한되도록 의도되지 않음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1:
단계 a) 및 b): 6명의 건강한 공여자로부터 8개의 신선한 대변을 WO2016/170290에 기재된 의료 장치에 수집한 후, +2℃/+8℃에서 72시간 동안 저장하고, 그 동안 품질 관리 (단계 c))가 수행되었다. 이들 관리의 결과에 근거하여, 공여자 3 및 7의 대변은 거부되었다.
대변 1, 4, 5, 6 및 2 + 8은 개별적으로 동결보호 희석제 (말토덱스트린과 트레할로스의 혼합물을 20% 함유하는 식염수 수용액)를 첨가하여 액체 접종물로 변환되고 필터 (265μm)를 통해 정화되었다. 대변 2 및 8은 소량의 대변이 채취된 것을 감안하여 이들을 합하여 접종물을 형성하였다.
접종물 1, 4, 5, 6 및 2 + 8 (5가지의 접종물)의 생존율을 시험하였다. 이어서, 개별 접종물을 연동 펌프를 사용하여 5 L 가요성 파우치로 이송하였다. 이어서 파우치를 4℃로 설정된 냉장 인큐베이터의 교반 플레이트에 놓고 접종물의 혼합을 125 rpm +/- 5%에서 30분 동안 수행하였다.
균질화가 완료된 후, 접종물의 혼합물을 동결건조에 적합한 일련의 15개의 파우치로 이송하고 -80℃에서 저장하였다. 저장 전에 15개의 파우치 각각에 대해 상이한 조건 하에서 균질 혼합물의 생존율 및 저장 영향을 시험하였다.
생존율 분석:
아쿠리 6 세포측정기 (Accuri 6 cytometer) (BD 사이언스 (BD Science))를 사용하여 유동 세포측정 기술을 이용하여 생존율 시험을 수행하였다. 샘플은 0.9%의 식염수 수용액에서 1:10의 연속 희석으로 1:10-3까지 희석되었다. 샘플은 프로피듐 아이오다이드 형광단 (PI) (10 μL/mL) 및 SYTO9® 9 (3 μL/mL)로 염색되었다. PI는 또한 DNA를 표적으로 하지만 막이 손상된 세포에만 침투하며; 470 nm에서 여기 후 635 nm (적색)에서 방출한다. SYTO9®는 손상과 관계 없이 모든 세포에 들어가 DNA에 결합하여 470nm (파란색 레이저)에서 여기 후 540nm (녹색)에서 방출한다. 대변 샘플인 접종물 또는 균질 혼합물은 유동 세포측정에 의해 분석되기 전에 2개의 형광단의 혼합물로 표지된다. 박테리아 (살아있는 박테리아 및 죽은 박테리아)의 총 수에 대한 살아있는 박테리아의 백분율은 샘플의 박테리아 생존율을 수득할 수 있게 한다. 분석의 각 배치는 양성 대조군 (-80℃에 저장된 접종물의 참조 샘플) 및 음성 대조군 (-80℃에 저장되고, 70% 이소프로판올 (비율 1/9)에서 10분 동안 인큐베이션하여 처리되고, 원심분리되고, 0.9% NaCl에 현탁액에 넣고, 10-3까지 10배 연속 희석으로 희석된 참조 샘플)으로 검증되었다.
결과:
개별 접종물의 생존율 평가는 30.5% 내지 67.6%로 다양하다. 동일한 접종물의 혼합물로 제조된 15개의 파우치는 1.98의 표준 편차와 함께 47.1%의 평균 생존율을 나타낸다. 개별 접종물 (접종물 1, 4, 5, 6 및 2 + 8, 연한 회색) 및 저장 파우치 1 내지 15에 있는 접종물의 혼합물 (검은색)의 미생물총의 생존율 (백분율)이 도 2에 제시된다.
요약 결과는 표 1에 제시된다.
<표 1>
통계 분석:
생존율 및 이벤트의 수는 균질 혼합물의 15개의 파우치에서 측정되었다. 이들 2개의 측정이 파우치 간에 균질한지를 평가하기 위해, 7개의 파우치에 대한 그룹 A 및 및 나머지 파우치에 대한 그룹 B에 대한 측정의 무작위 할당이 500회 수행되었다.
각각의 반복에 대해, t-검정 및 순위 시험을 이용하여 그룹 A와 그룹 B를 비교하였다. 하기에 제시된 최종 결과는 해당 통계 시험이 유의하지 않은 (> 0.1) 반복 비율에 해당한다.
결론은 파우치가 생존율 및 이벤트의 수/μL 측면에서 균질하다는 것이다.
<표 2>
결과는 미생물총의 생존율 또는 이벤트의 수/μL에 관계 없이 t-검정 및 순위 시험에 대해 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
제조된 15개의 혼합물 파우치는 서로 균질하다는 결론을 내릴 수 있다.
보존:
혼합물을 제조하는 동안, 중간 저장은 품질 관리를 수행하면서 수행되어야 한다. 이 중간 저장이 미생물총의 생존율에 미치는 영향을 결정하기 위해 평가가 수행되었다:
- 관리 조건: 제조 후, 접종물은 즉시 -80℃에서 저장된다.
- 주위 온도에서의 보존 조건: 제조 후, 접종물을 주위 온도에서 16시간 동안 유지하고, 미생물총의 생존율, 미생물총 이벤트/μL 및 pH 및 PO2 측정을 결정하기 위해 샘플링을 수행한 후, 접종물을 -80℃에서 저장한다.
- 4℃에서의 보존 조건: 제조 후, 접종물을 4℃에서 16시간 동안 저장하고, 미생물총의 생존율, 미생물총 이벤트/μL 및 pH 및 PO2 측정을 결정하기 위해 샘플링을 수행한 후, 접종물을 -80℃에서 저장한다.
이어서, 3개의 접종물을 해동하고 미생물총의 생존율을 측정한다.
데이터는 접종물을 16시간 동안 주위 온도에서 저장하든 또는 4℃에서 저장하든 미생물총의 중앙값 생존율이 동일하다는 것을 나타낸다. 해동 후, 미생물총의 중앙값 생존율은 4℃에서 저장하든 주위 온도에서 저장하든 접종물에 대해 감소한다. 동결 후 생존율이 떨어질 것으로 예상된다. 두 경우 (4℃ 및 주위 온도) 모두에서 동일한 현상이 관찰된다는 것이 주목된다.
이벤트의 수/μL는 접종물 및 4℃에서 저장된 접종물에 대해 동일하지만, 예상대로 주위 온도에서 저장된 접종물에 대해 증가하는 것이 관찰될 수 있다. 접종물 해동 후에도 동일한 관찰이 이루어진다.
모든 이들 결과는 16시간 동안의 저장이 4℃에서 저장하든 주위 온도에서 저장하든 미생물총의 생존율에 영향을 미치지 않음을 나타내고; 이벤트의 수/μL는 주위 온도에서 증가하며, 이는, 4℃에서의 미생물총은 잠복 상태에 있는 반면, 미생물총이 발달하고 있음을 나타낸다. pH 및 PO2의 측정 결과는 표 3에 제시된다.
<표 3>
이들 결과는 16시간 동안 저장해도 4℃에서 저장된 접종물의 pH 또는 PO2에 대해 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 2:
방법은, 실시예 1과 거의 동일한 조건을 사용하여, 배치 번호 1, 배치 번호 2, 배치 번호 3 및 배치 번호 4에 대해 각각 2, 8, 4 및 6명의 공여자와 함께, 분변 미생물총 샘플의 4개의 배치 (배치 번호 1 내지 배치 번호 4)에 대해 수행되었다. 배치 번호 4는 실시예 1의 배치에 해당한다. 따라서, 배치 번호 4의 경우, 소량의 대변이 채취된 것을 감안하여 6개의 대변 중 2개의 대변은 합하여 접종물을 형성하였다.
대변은 개별적으로 동결보호 희석제 (말토덱스트린과 트레할로스의 혼합물을 20% 함유하는 식염수 수용액)를 첨가하여 액체 접종물로 변환되고 필터 (265μm)를 통해 정화되었다.
접종물의 생존율 및 분류학적 프로필을 시험하였다. 이어서, 개별 접종물을 연동 펌프를 사용하여 3 L 또는 5 L 가요성 파우치로 이송하였다. 이어서 파우치를 4℃로 설정된 냉장 인큐베이터의 교반 플레이트에 놓고, 접종물의 혼합을 4℃로 설정된 인큐베이터에서 30분 동안 130 rpm +/- 5%로 수행하였다.
균질화가 완료된 후, 각각의 배치에 대해, 접종물의 혼합물을 동결에 적합한 일련의 파우치로 이송하고 -80℃에서 저장하였다. 균질 혼합물의 생존율 및 분류학적 프로필을 저장 전에 시험하였다. 배치 번호 1의 경우, 2개의 대변을 수집하고, 5개의 파우치를 채웠다. 배치 번호 2의 경우, 8개의 대변을 수집하고, 29개의 파우치를 채웠다. 배치 번호 3의 경우, 5개의 대변을 수집하고, 21개의 파우치를 채웠다. 배치 번호 4의 경우, 6개의 대변을 수집하고, 접종물을 형성하기에 충분한 재료를 갖기 위해 2개의 대변을 합하고, 15개의 파우치를 채웠다.
생존율 분석:
생존율 시험은 실시예 1과 같이 수행되었다.
메타게놈 분석:
게놈 DNA를 뉴클레오스핀 소일 키트 (NucleoSpin Soil kit) (마체리 나겔 (Machery Nagel))를 사용하여 샘플로부터 추출하였다. 시퀀싱 라이브러리를 마이태크 HS-믹스 키트 (MyTaq HS-Mix kit) (바이오라인 (Bioline))를 사용하여 각각의 샘플에 대해 컴파일링하였다. 이어서, 라이브러리를 MiSeq V3 2x300 pb 실행에서 시퀀싱하였다.
역다중화된 서열을 트림모마틱 (Trimmomatic)으로 품질 관리한 후 [Bolger et al., (2014) 'Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data', Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170], 인간 서열을 보우타이2 (Bowtie2) 소프트웨어를 사용하여 제거하였다 (Langmead, Ben and Salzberg, (2013) 'Fast gapped-read alignment with Bowtie2', Nature methods, 9(4), pp. 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923.Fast). 데이터를 비교할 수 있도록 서열 수는 샘플 당 60,000개 서열로 정규화되었다. 서열의 클러스터링은 VSEARCH를 사용하여 수행되었으며 분류학적 할당은 실바 128 (Silva 128) 데이터베이스를 사용하여 수행되었다. 분류학적 분석 및 다양성 측정은 R 소프트웨어로 수행되었다 (R Core Team 2015, version 3.4.4, http://www.R-project.org). 다양성 측정을 위해, 각각의 샘플에 대해 60,000개 서열의 20개 서브-샘플링을 수행하고, 중앙값을 측정하였다.
결과:
생존율:
하기 표 4는 배치의 생존율을 나타낸다. 개별 접종물의 생존율 평가는 16.8% 내지 67.6%로 다양하다. 접종물의 풀링된 배치의 생존율은 하기 표에 제시되며 46.1 내지 60.2%이다.
<표 4>
하기 표 5는 결과를 나타낸다
<표 5>
실시예 3:
이 연구의 목적은 다수의 공여자로부터 분변 미생물총 샘플을 제조하는 2개의 방법을 비교하는 것이다.
- 실시예 2에 기재된 방법 및
- 파람소티 등에 의한 종래 기술의 방법 [Paramsothy S., et al. (2017), Multidonor intensive faecal microbiota transplantation for active ulcerative colitis: a randomised placebo-controlled trial, Lancet, Mar 25; 389(10075): 1218-1228]. 도 5는 이용된 2개의 방법을 나타낸다.
수득된 최종 제품의 생존율 뿐만 아니라 그의 분류학적 균질성을 비교하기 위해 생존율 분석 및 메타게놈 분석을 수행하였다.
4명의 건강한 공여자로부터 4개의 신선한 대변을 각각 WO2016/170290에 기재된 의료 장치에 수집한 후, + 2℃/+ 8℃에서 72시간 동안 저장하고, 이 동안 품질 관리 (단계 c))를 수행하였다.
4개의 대변을 2개의 분획으로 분할하였으며, 하나는 본 발명의 실시양태에 따른 처리를 위한 것이고 ("Inv"), 다른 하나는 파람소티 등의 종래 기술의 방법에 따른 처리를 위한 것이다 ("Ref").
대변 ("Inv")은 개별적으로 동결보호 희석제 (말토덱스트린과 트레할로스의 혼합물을 20% 함유하는 식염수 수용액)를 첨가하여 액체 접종물로 변환되고 필터 (265μm)를 통해 정화되었다.
이어서, 개별 접종물을 연동 펌프를 사용하여 1 L 가요성 파우치로 이송하였다. 이어서, 파우치를 4℃로 설정된 냉장 인큐베이터의 교반 플레이트에 놓고, 접종물의 혼합을 125 rpm +/- 5%에서 30분 동안 수행하였다.
균질화가 완료된 후, 접종물의 혼합물을 일련의 10개의 동결튜브로 이송하고 -80℃에서 저장하였다.
"Ref" 대변을 시각적으로 균질한 제품을 수득하기 위해 혼합하고, 등장성 식염수 용액 (0.9% NaCl)에서 정화한 후, 여과하였다. 이어서, 10% 글리세롤을 저장을 위해 제제에 첨가하였다. 이어서, 이렇게 생성된 샘플을 일련의 10개의 동결튜브로 이송하고 -80℃에서 저장하였다.
생존율 및 16S 메타게놈 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 결과에 대한 설명은 하기 텍스트에 제공된다.
표 6은 "Inv" 및 "Ref" 샘플에서 악티노박테리아, 프레보텔라 및 비피도박테리아의 상대적 존재도를 나타낸다.
<표 6>
실시예 4:
대변의 균질 혼합물을 수득하기 위한 생성 캠페인은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 단계 c)의 선택 기준을 충족하는 8명의 공여자로부터의 대변은 5주에 걸쳐 매일 수집되었다. 대변은 개별적으로 동결보호 희석제 (말토덱스트린과 트레할로스의 혼합물을 20% 함유하는 식염수 수용액)를 첨가하여 액체 접종물로 변환되고 필터 (265μm)를 통해 정화되었다.
동일한 날에 수득된 개별 접종물을 제품의 균질한 배치를 수득하기 위해 혼합하였다.
DNA 추출, 메타게놈 시퀀싱 및 생물정보학 분석
게놈 DNA를 대변의 혼합물로부터 뉴클레오스핀 소일 키트 (마체리 나겔)로 추출하였다. 시퀀싱 라이브러리를 공급업체의 권장 사항에 따라 트루세크 키트 (TruSeq kit) (일루미나 (Illumina))를 사용하여 게놈 DNA의 각각의 샘플에 대해 컴파일링하였다. 이어서, 라이브러리를 하이세크2500 (HiSeq2500) (일루미나)에서 "페어드-엔드 (paired-end)" 실행으로 동시에 시퀀싱하였다.
역다중화된 서열을 트림모마틱으로 품질 관리한 후 [Bolger et al., (2014) 'Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data', Bioinformatics, 30(15), pp. 2114-2120. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170], 인간 서열을 보우타이2 소프트웨어를 사용하여 제거하였다 (Langmead, Ben and Salzberg, (2013) 'Fast gapped-read alignment with Bowtie2', Nature methods, 9(4), pp. 357-359. doi: 10.1038/nmeth.1923.Fast). 데이터를 비교할 수 있도록 서열 수는 샘플 당 20,000,000개의 "페어드-엔드" 서열로 정규화되었다. 분류학적 할당은 레프세크 (RefSeq) 게놈 데이터베이스 (2017년 9월, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)를 사용하여 크라켄 v.0.10.5-베타 (Kraken v.0.10.5-beta) (Wood and Salzberg, 2014 Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments', Genome Biology, 15(3), pp. R46. doi: 10.1186/gb-2014-15-3-r46)로 수행되었다.
결과:
도 8은 각각 공여자 대변 (왼쪽의 첫 번째 막대), 이어서 3, 4, 5 및 6명의 공여자의 대변으로부터 수득된 균질 혼합물의 배치에서 15개의 부티레이트-생성 박테리아 속, 즉 블라우티아, 패칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움, 비피도박테리움, 루미노코쿠스, 클로스트리듐, 코프로코쿠스, 오도리박터, 로세부리아, 홀데마넬라, 아나에로스티페스, 오실리박터, 수브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오의 상대적 존재도를 나타낸다. 이들 속의 상대적 존재도는 각각의 배치에서 안정하며, 균질 혼합물을 수득하기 위해 사용되는 대변의 수가 증가하는 경우 표준화된다 (하기 표 7 참조).
<표 7>
15개의 부티레이트-생성 박테리아 속은 모든 개별 대변에서는 모두가 발견되지 않지만, 적어도 4개의 대변의 혼합물로 제조된 배치는 이들을 모두 함유한다 (데이터는 표시되지 않음).
Claims (18)
- 적어도 2명의 사전선택된 공여자로부터 유래한 분변 미생물총의 균질 혼합물을 제조하는 방법이며,
a. 상기 사전선택된 공여자로부터 적어도 하나의 분변 미생물총 샘플을 채취하는 단계,
b. 샘플 채취 후 5분 미만의 기간 내에 a)에서 수득된 샘플을 산소-불투과성 수집 장치에 넣는 단계,
c. 채취된 샘플을 품질 관리하고 품질 기준을 충족하지 않는 샘플을 제외시키는 단계,
d. 품질 관리 단계 c) 후에 잔류한 각각의 샘플에, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제를 포함하는 식염수 수용액를 첨가하는 단계,
e. 단계 d)의 종료 시 수득된 샘플을 여과하여 일련의 접종물을 형성하는 단계,
f. 상기 접종물을 그룹화하여 접종물의 혼합물을 형성하는 단계,
g. 단계 f)에서 수득된 상기 혼합물을, 특히 수동 교반에 의해 또는 교반 장치를 사용하여 균질화하는 단계
를 포함하고, 단계 b) 및 d) 내지 g)는 혐기생활 하에서 수행되는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 분변 미생물총의 균질 혼합물이 적어도 4명의 공여자로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 공여자가 하기의 사전선택 기준에 따라 사전선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
i. 18 내지 60세의 나이,
ii. 18 내지 30의 체질량 지수 (BMI),
iii. 심각한 감염 질환, 대사 및 신경계 장애, 또는 우울증에 대한 개인적인 병력의 부재,
iv. 최근 장 미생물총의 조성을 분해할 수 있는 약제 복용의 부재,
v. 최근 위장 질환과 연관된 증상, 예컨대 열, 설사, 구역, 구토, 복통, 황달의 발생의 부재; 심각한 감염 질환, 특히 AIDS, 간염 등의 임의의 병력의 부재,
vi. 최근 열대 국가 여행의 부재,
vii. 위험한 성적 행동의 부재,
viii. 최근 상처, 피어싱 및/또는 문신의 부재,
ix. 최근 만성 피로의 부재,
x. 최근 알레르기 반응의 부재,
xi. 임의적으로, 다양한 식이를 가짐. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 샘플의 품질 기준이
- 브리스톨 척도에서 1 내지 6의 샘플 일관성,
- 샘플 중 혈액 또는 소변의 부재
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서, 단계 c)의 샘플의 품질 기준이 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
-하기 박테리아의 부재: 캄필로박터 (Campylobacter), 클로스트리듐 디피실레 (A/B 독소), 살모넬라 (Salmonella), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비르리오 종 (Vibrio sp.), 시겔라 독소-생성 이. 콜리 (STEC) stx1/stx2, 다중-내성 박테리아, 확장된-스펙트럼의 베타-락타마제 (ESBL) - 글리코펩티드/반코마이신 내성 엔테로코쿠스 (GRE/VRE) 및 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 카르바페네마제-내성 박테리아,
- 하기 기생충의 부재: 크립토스포리듐 파르붐 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 종 (Cyclospora sp.), 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 기아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 블라스토시스티스 호미니스 (Blastocystis hominis), 연충 (Helminths), 스트론길로이데스 스테르코랄리스 (Strongyloides stercoralis), 이소스포라 종 (Isospora sp.), 마이크로스포리디아 (Microsporidia) 및 디엔타모에바 프라길리스 (Dientamoeba fragilis),
- 하기 바이러스의 부재: 아데노바이러스 F40/41, 아스트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스 A, 사포바이러스 및 피코르나바이러스 (아이치 바이러스 및 엔테로바이러스),
- 하기 박테리아의 부재: 장집적성 이. 콜리 (EAEC), 장병원성 이. 콜리 (EPEC), 장독소원성 이. 콜리 (ETEC) It/st, 시겔라/장침투성 이. 콜리 (EIEC) 및 플레시오모나스 쉬겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides). - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 동결보호제 및/또는 증량제가 폴리올, 이당류, 삼당류 또는 다당류 또는 그의 혼합물 및 증량제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 식염수 수용액이 말토덱스트린 및 트레할로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)의 여과가 0.5 mm 이하, 바람직하게는 265 μm 이하의 직경의 세공을 포함하는 필터로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 수집과 단계 g)의 종료 사이의 시간이 76시간 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 균질화 단계 g)가 2℃ 내지 25℃, 바람직하게는 대략 2 내지 6℃, 보다 우선적으로는 대략 4℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
h. 단계 g)에서 수득된 균질화된 혼합물을
i. 대략 -50℃ 내지 -80℃, 바람직하게는 -80℃의 온도에서의 저장, 또는 대략 16시간 이내에 혼합물을 사용하기 위한 대략 2 내지 6℃의 온도에서의 저장, 또는 대략 4시간 이내에 혼합물을 사용하기 위한 10 내지 25℃의 온도에서의 저장을 위해 접종물 파우치에,
ii. 동결건조를 위해 동결건조 장치
에 이송하는
이송 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 분변 미생물총의 균질 혼합물이 15개의 박테리아 속 블라우티아 (Blautia), 패칼리박테리움 (Faecalibacterium), 알리스티페스 (Alistipes), 유박테리움 (Eubacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 루미노코쿠스 (Ruminococcus), 클로스트리듐 (Clostridium), 코프로코쿠스 (Coprococcus), 오도리박터 (Odoribacter), 로세부리아 (Roseburia), 홀데마넬라 (Holdemanella), 아나에로스티페스 (Anaerostipes), 오실리박터 (Oscillibacter), 수브돌리그라눌룸 (Subdoligranulum) 및 부티리비브리오 (Butyrivibrio)를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 동종이계 분변 미생물총의 이식에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물.
- 15 초과, 바람직하게는 20의 심슨 지수를 갖는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 수득될 수 있는 분변 미생물총의 균질 혼합물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 장 미생물 불균형의 치료에 사용하기 위한 미생물총의 균질 혼합물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 이식편대숙주 질환 (GvHD)의 치료에 사용하기 위한 미생물총의 균질 혼합물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 패혈증, 패혈 쇼크, 및 장 염증, 설사, 점막염, 복통 및 위장 출혈을 포함하는 위장 장애를 포함하는 의원성 장 미생물 불균형 및/또는 연관된 병리상태 및 합병증의 치료에 사용하기 위한 미생물총의 균질 혼합물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 클로스트리듐 디피실레 감염 및 연관된 설사 (CDI), 염증성 장 질환 (IBD), 과민성 장 증후군 (IBS), 특발성 변비, 복강 질환, 크론 질환, 비만 및 병적 비만, 자폐증, 다발성 경화증, 여행자 설사, 만성 질 감염 (방광염 및 진균증 포함), 골 및 관절 감염, 파킨슨 질환, II형 당뇨병, 음식 알레르기, 암, 저항성 백혈병, 알츠하이머 질환, 정신분열병 및 양극성 장애, 항신생물 화학요법 또는 면역요법과 연관된 장 미생물 불균형 및 알콜- 또는 비알콜-관련된 간 질환의 치료에 사용하기 위한 미생물총의 균질 혼합물.
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