WO2019164194A1 - 신규한 살모넬라 하이델베르그 박테리오파지 sal-hep-1 및 이의 살모넬라 하이델베르그 균 증식 억제 용도 - Google Patents

신규한 살모넬라 하이델베르그 박테리오파지 sal-hep-1 및 이의 살모넬라 하이델베르그 균 증식 억제 용도 Download PDF

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hep
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전수연
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손지수
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강상현
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using a bacteriophage isolated from nature capable of infecting Salmonella Heidelberg bacteria and killing Salmonella Heidelberg bacteria and a composition comprising the same.
  • a bacteriophage isolated from nature capable of infecting Salmonella Heidelberg bacteria and killing Salmonella Heidelberg bacteria and a composition comprising the same.
  • grape viridae bacteriophage Sal-HEP-1 isolated from nature, having the ability to kill Salmonella Heidelberg bacteria and having a genome represented by SEQ ID NO: 1, and the bacteriophage It relates to a method for preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using a composition comprising as an active ingredient.
  • Salmonella Salmonella bacteria antigen component of lipopolysaccharide (O antigen) and flagellar antigen of flagellin (H antigens) on the basis of the diversity determine the serotype, and at least about 2500 kinds of serum to this type of the cell surface with a gram-negative bacillus is Known. Salmonella bacteria are widely present in the natural environment, such as barns, animal and fish farming, and fish and shellfish, and are resistant to the environment and have a strong viability.
  • Salmonella shows various clinical symptoms and lesions after infection with animals or humans. In particular, it is known that pathogenicity differs depending on its ability to adhere to the intestinal mucosa. Salmonella is mainly pathogenic by invading the intestinal mucosa, liver, lung tissue and cells, and the toxin produced by Salmonella causes symptoms such as capillary enlargement, hyperemia and bleeding.
  • Salmonella enteritidis is known to cause food poisoning in humans.
  • Bacteriophages are tiny microorganisms that infect bacteria, often called phage. Bacteriophages have the ability to proliferate inside the cells of a bacterium after infection (infection), and destroy the cell wall of the host bacterium when progeny bacteriophages come out of the bacterium after proliferation.
  • the bacterial infection of bacteriophages is very specific, and the types of bacteriophages that can infect specific bacteria are limited.
  • certain bacteriophages can only infect certain categories of bacteria, thereby allowing certain bacteriophages to provide antimicrobial effects only to certain bacteria. Due to the bacterial specificity of the bacteriophage, the bacteriophage provides an antimicrobial effect only to the target bacteria and does not affect the flora or flora in the animal. Conventional antibiotics, which are commonly used to treat bacteria, have simultaneously affected several types of bacteria. This caused problems such as environmental pollution and disturbance of the normal flora of animals. In contrast, bacteriophage only works for certain bacteria, so the bacteriophage disruption does not occur in the body. Therefore, the use of bacteriophage is very safe compared to the use of antibiotics, and the likelihood of side effects caused by the use is relatively low.
  • Bacteriophage is a British bacteriologist Twort 1915 became discovered while conducting research on Staphylococcus aureus (Micrococcus) melting the colonies are transparent by any developer.
  • French bacteriologist d'Herelle discovered that some of the filtrates of ill feces dissolve Shigella dysenteriae and found that they independently discovered bacteriophages. In the sense, they named it bacteriophage. Since then, bacteriophages have been found for several pathogenic bacteria such as dysentery, typhoid, and cholera.
  • bacteriophages Because of its special ability to kill bacteria, bacteriophages have been expected to be an effective way to combat bacterial infections since their discovery and many studies have been conducted. However, after the discovery of penicillin by Fleming, with the widespread use of antibiotics, research on bacteriophages has been limited to some Eastern European countries and the Soviet Union. However, since 2000, the growth of antibiotic-resistant bacteria has led to the limitation of conventional antibiotics, and the development of antibiotics as alternatives has emerged, and bacteriophages are attracting attention as anti-bacterial agents.
  • bacteriophages have a very high specificity for bacteria. Due to the high specificity of the bacteriophage bacteria, the bacteriophage often exerts an antimicrobial effect against only some strains even if the bacteria belong to the same species. In addition, the antibacterial activity of the bacteriophages may be different depending on the target bacterial strain itself. For this reason, it is necessary to secure various kinds of useful bacteriophages in order to secure effective control methods for specific kinds of bacteria.
  • the present inventors have developed a composition that can be used to prevent and treat diseases caused by Salmonella Heidelberg, using bacteriophages isolated from nature capable of killing Salmonella Heidelberg, and using the composition.
  • the sequence of the genome can be separated from nature and suitable to distinguish the bacteriophages from other bacteriophages.
  • the present invention was completed by developing a composition containing the bacteriophage as an active ingredient, and then confirming that the composition can be effectively used for the purpose of preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria. .
  • an object of the present invention is the Podoviridae bacteriophage Sal-HEP-1 isolated from nature, which has the ability to specifically kill Salmonella Heidelberg bacteria and has a genome represented by SEQ ID NO: 1. Accession number KCTC 13454BP).
  • another object of the present invention is a disease caused by Salmonella Heidelberg bacteria comprising isolated bacteriophage Sal-HEP-1 (Accession Number KCTC 13454BP) which can infect Salmonella Heidelberg bacteria and kill Salmonella Heidelberg bacteria as an active ingredient. It is to provide a composition that can be utilized for the purpose of preventing and treating.
  • Another object of the present invention is to prevent diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria, including the isolated bacteriophage Sal-HEP-1 (Accession Number KCTC 13454BP), which can infect Salmonella Heidelberg bacteria and kill Salmonella Heidelberg bacteria, as an active ingredient. And it provides a method for preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using the composition available for the purpose of treatment.
  • Still another object of the present invention is to provide a disinfectant used for the purpose of preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using the compositions.
  • Another object of the present invention to provide a negative additive used for the purpose of preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using the compositions.
  • Another object of the present invention to provide a feed additive for the purpose of providing a specification effect through the prevention and treatment of diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using the compositions.
  • the present invention is grape viridae bacteriophage Sal-HEP-1 (Accession No. KCTC 13454BP), isolated from nature, which has the ability to specifically kill Salmonella Heidelberg bacteria and has a genome represented by SEQ ID NO: 1, And it provides a method for preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using a composition comprising the same as an active ingredient.
  • Bacteriophage Sal-HEP-1 was separated by the inventors and deposited in the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center on January 4, 2018 (Accession No. KCTC 13454BP).
  • the present invention also provides a disinfectant, a negative additive and a feed additive comprising bacteriophage Sal-HEP-1 as an active ingredient, which can be used to prevent and treat diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria.
  • Bacteriophage Sal-HEP-1 included in the composition of the present invention effectively kills Salmonella Heidelberg bacteria, and thus is effective in preventing (infection prevention) or treating (infection treatment) of diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria. Therefore, the composition of the present invention can be used for the purpose of preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria.
  • prevention means (i) preventing infection of Salmonella Heidelberg bacteria; And (ii) inhibiting the development into diseases caused by Salmonella Heidelberg bacterial infection.
  • treatment refers to (i) suppression of diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria; And (ii) all actions to alleviate the morbidity of the disease caused by Salmonella Heidelberg.
  • the term “separation”, “separation”, or “separation” refers to the separation of bacteriophages from a natural state by using various experimental techniques and to distinguish the bacteriophages of the present invention from other bacteriophages.
  • the present invention also includes the propagation of the bacteriophage of the present invention to industrial use by biotechnology.
  • compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto. no.
  • the composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • the composition of the present invention includes bacteriophage Sal-HEP-1 as an active ingredient.
  • the bacteriophage Sal-HEP-1 included at this time includes 1 ⁇ 10 1 pfu / ml to 1 ⁇ 10 30 pfu / ml or 1 ⁇ 10 1 pfu / g to 1 ⁇ 10 30 pfu / g, preferably 1 ⁇ . 10 4 pfu / ml to 1 ⁇ 10 15 pfu / ml or 1 ⁇ 10 4 pfu / g to 1 ⁇ 10 15 pfu / g.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by being formulated with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, according to methods which may be readily practiced by those skilled in the art. It may also be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulations here may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the composition of the present invention may be implemented as a disinfectant, a negative additive and a feed additive, but not limited thereto.
  • Bacteriophages that can provide antimicrobial activity against other bacterial species can be added to the composition of the present invention in order to increase the efficiency in this application.
  • other types of bacteriophages having antibacterial activity against Salmonella Heidelberg bacteria may be added. Even bacteriophages having antimicrobial activity against Salmonella Heidelberg bacteria may differ from each other in terms of strength and antimicrobial range of antimicrobial activity, so a proper combination thereof may maximize the effect.
  • the method for preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria using the composition comprising the bacteriophage Sal-HEP-1 of the present invention has a specificity for Salmonella Heidelberg bacteria as compared to the conventional antibiotic-based method. It can provide a very high advantage. This means that it can be used for the purpose of preventing and treating diseases caused by Salmonella Heidelberg without affecting other useful floras, which means that the side effects of its use are very small. In general, the use of antibiotics, such as ordinary flora will also suffer damage, resulting in a decrease in the immunity of the animal, resulting in a variety of side effects.
  • bacteriophages is like a bacterial species that can exert its antimicrobial activity
  • the antibacterial activity of the bacteriophage against individual bacterial strains in terms of the strength of the antimicrobial activity and the antibacterial range [strains belonging to the Salmonella Heidelberg strain] Range exerted.
  • bacteriophages can exert antimicrobial activity against some strains belonging to the same bacterial species. That is, even if they belong to the same bacterial species, there may be a difference in susceptibility to bacteriophages according to individual bacterial strains].
  • the present invention provides a differential antimicrobial effect compared to other bacteriophages having antibacterial activity against Salmonella Heidelberg bacteria. can do. This makes a big difference in the effectiveness of industrial sites.
  • 1 is an electron micrograph of the bacteriophage Sal-HEP-1.
  • Figure 2 is an experimental result showing the killing ability against Salmonella Heidelberg bacteria of bacteriophage Sal-HEP-1. Based on the middle line of the plate medium, the left side is only a buffer containing no bacteriophage Sal-HEP-1, and the right side is a liquid containing bacteriophage Sal-HEP-1. The transparent part on the right is the lysate plaque that the bacteria under test were lysed by the action of bacteriophage Sal-HEP-1.
  • Example 1 Salmonella Heidelberg Isolation of Bacteriophage Can Kill Bacteria
  • a rate medium Casein Digest, 17 g / L; Soy bean Digest, 3 g / L; dextrose, Samples collected in 2.5 g / L; NaCl, 5 g / L; dipotassium phosphate, 2.5 g / L
  • Salmonella Heidelberg bacteria were inoculated in the recovered supernatant at a ratio of 1 / 1,000 and shaken again at 37 ° C. for 3-4 hours.
  • this process was repeated five times in order to sufficiently increase the number of bacteriophages (Titer).
  • the culture was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the collected supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter. The usual spot assay using the filtrate thus obtained was carried out to determine whether there were bacteriophages capable of killing Salmonella Heidelberg bacteria.
  • the drip experiment was conducted as follows. Salmonella Heidelberg bacteria were inoculated in TSB medium at a ratio of 1 / 1,000 and then shaken at 37 ° C. for one night. In this way the culture medium 3 ml of the finished Salmonella Heidelberg bacteria (the OD 600 1.5) TSA (T ryptic S oy A gar) plate medium (Casein Digest, 15 g / L; Soy bean digest, 5 g / L; NaCl, 5 g / L; agar, 15 g / L). The plated flat medium was left in a clean bench for about 30 minutes to allow the smear to dry. After drying, 10 ⁇ l of the filtrate prepared above was dropped onto a plate medium plated with Salmonella Heidelberg bacteria.
  • TSA T ryptic S oy A gar
  • Separation of pure bacteriophages was carried out using a filtrate which confirmed the presence of bacteriophages with killing ability against Salmonella Heidelberg. Separation of pure bacteriophage was carried out using a conventional Plaque assay. To explain this in detail, one of the lytic plaques formed in the lytic plaque assay was recovered using a sterile tip, and then added to the culture solution of Salmonella Heidelberg bacteria and incubated together at 37 ° C. for 4-5 hours. After incubation, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. Salmonella Heidelberg culture medium was added to the obtained supernatant at a volume of 50/50 and then incubated at 37 ° C for 4-5 hours.
  • this procedure was performed at least five times, and finally, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. Using the obtained supernatant, lysis plate analysis was performed again. Since the separation of the pure bacteriophage is usually not achieved only once in the above process, the previous step was repeated again using the lysate formed. This process was repeated at least five times to obtain a solution containing pure bacteriophage. Typically, the separation of the pure bacteriophage was repeated until both the size and shape of the lysate formed were similar. Finally, electron microscopic analysis confirmed the pure separation of bacteriophages. The procedure described above was repeated until pure separation was confirmed by electron microscopy analysis.
  • Electron microscopic analysis was performed according to a conventional method. This is briefly described as follows. The solution containing the pure bacteriophage was buried in a copper grid, subjected to reverse staining and drying with 2% uranyl acetate, and its shape was observed through a transmission electron microscope. Electron micrographs of purely isolated bacteriophages are shown in FIG. 1. Judging from the morphological features, the newly secured bacteriophages belonged to the Podoviridae bacteriophage.
  • the solution containing pure bacteriophage identified in this way was subjected to the following purification process.
  • a solution containing Salmonella Heidelberg bacteria was added to the solution containing the pure bacteriophage at a volume of 1/50 of the total volume of the solution, followed by further incubation for 4-5 hours. After incubation, the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. This procedure was repeated a total of five times to obtain a solution containing a sufficient number of bacteriophages.
  • the supernatant obtained by the final centrifugation was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, followed by a conventional polyethylene glycol (PEG) precipitation process.
  • PEG polyethylene glycol
  • bacteriophage precipitate was suspended in 5 ml of buffer (Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 0.1% Gelatin, pH 8.0). This is called bacteriophage suspension or bacteriophage solution.
  • bacteriophage Sal-HEP-1 Purified pure bacteriophage was obtained through the above process, and the bacteriophage was named as bacteriophage Sal-HEP-1, and was deposited at the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center on January 4, 2018 (Accession No. KCTC 13454BP). ).
  • Example 2 bacteriophage Sal - HEP -1 genome isolation and genome sequence analysis
  • the genome of bacteriophage Sal-HEP-1 was isolated as follows. Bacteriophage suspension obtained in the same manner as in Example 1 was used for dielectric separation. First, in order to remove DNA and RNA of Salmonella Heidelberg bacteria, which may be contained in the suspension, 200 U of DNase I and RNase A were added to 10 ml of bacteriophage suspension, and then left at 37 ° C. for 30 minutes. In order to remove the activity of DNase I and RNase A after 30 minutes of standing, 500 ⁇ l of 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added and allowed to stand for another 10 minutes. In addition, the mixture was allowed to stand at 65 ° C.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Ratio of isopropyl alcohol was added thereto, and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The dielectric was precipitated. After the precipitate was recovered, 70% ethanol (Ethanol) was added to the precipitate, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes to wash the precipitate. The washed precipitate was recovered and dried in vacuo and then dissolved in 100 ⁇ l of water. The process was repeated to secure a large amount of the genome of bacteriophage Sal-HEP-1.
  • the genome thus obtained was subjected to next generation sequencing analysis using Pac-bio device at the National Instrumentation Center for Environmental Management at Seoul National University, followed by genome sequence of Sal-HEP-1 bacteriophage. Information was obtained. Finally, the analyzed bacteriophage Sal-HEP-1 genome has a size of 50,109 bp and the entire genome sequence is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the number of open reading frames (ORFs) on the bacteriophage Sal-HEP-1 genome is 90, whereas the Salmonella bacteriophage Bp96115 has 62 open reading frames, and the two bacteriophages differed in this respect.
  • the bacteriophage Sal-HEP-1 was concluded to be a novel bacteriophage different from the previously reported bacteriophages.
  • the different types of bacteriophages usually provide different levels of antimicrobial activity and antimicrobial activity, which can be concluded that bacteriophage Sal-HEP-1 can provide different antimicrobial effects from other previously reported bacteriophages. there was.
  • the killing ability of the isolated bacteriophage Sal-HEP-1 against Salmonella Heidelberg was investigated.
  • the killing ability was investigated in a manner to investigate the formation of transparent rings through the drip experiment shown in Example 1.
  • the Salmonella Heidelberg strains used for killing ability were either obtained from the US ATCC or isolated by the inventors and identified as Salmonella Heidelberg bacteria for a total of 10 weeks.
  • Bacteriophage Sal-HEP-1 was tested in 10 weeks of Salmonella Heidelberg. It had killing ability for a total of 8 weeks including the strain. Representative experimental results are shown in FIG. 2.
  • bacteriophage Sal-HEP-1 has excellent killing ability against Salmonella Heidelberg bacteria, it can be confirmed that it can exert an antimicrobial effect against a number of Salmonella Heidelberg strains. This means that bacteriophage Sal-HEP-1 can be used as an active ingredient of the composition for the prevention and treatment of diseases caused by Salmonella Heidelberg bacteria.
  • Example 4 bacteriophage Sal - HEP Salmonella of -1 Heidelberg For fungal infection prevention Experimental Example
  • Example 5 bacteriophage Sal - HEP -1 with Salmonella Heidelberg Caused by bacteria Preventive Animal Testing for Diseases
  • Weaning piglets were used to investigate the protective effect of bacteriophage Sal-HEP-1 against diseases caused by Salmonella Heidelberg. Twenty-five weaning piglets 25 days old were divided into two groups (10 per group), and then separated and bred in experimental breeding piglets (1.1m ⁇ 1.0m) for 14 days. The surrounding environment was controlled under the thermal insulation facility, the temperature and humidity of the pig room were kept constant, and the floor of the pig room was cleaned every day. From the start of the test to the end of the test, pigs in the test (feed bacteriophage containing group) were fed feed containing 1 ⁇ 10 8 pfu / g of bacteriophage Sal-HEP-1 according to a conventional feed feeding method.
  • pigs of the control group were fed with the same composition of the same composition without bacteriophage Sal-HEP-1 from the start of the test to the end of the test.
  • Salmonella Heidelberg bacteria detection investigation in feces was carried out as follows. A fecal sample Salmonella Heidelberg bacteria selection medium; then plated on (RAMBACH r agar Merck) were cultured at 37 °C for 18 to 24 hours and then the colonies suspected Salmonella Heidelberg bacteria were selected in the colonies (Colony) formed. Thus selected colonies were used as samples for Salmonella Heidelberg bacteria specific polymerase chain reaction (polymerase chain reaction (PCR)) to determine whether the colony finally Salmonella Heidelberg bacteria.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Diarrhea incidence was investigated by measuring diarrhea index. Diarrhea index was measured by measuring the commonly used Fecal Consistency (FC) score (normal: 0, stool: 1, diarrhea: 2, severe diarrhea: 3).
  • FC Fecal Consistency
  • Salmonella Heidelberg bacteria detection result (mean value) division Colony counts of Salmonella Heidelberg bacteria per plate D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 Control group (feed administration without bacteriophage) 26 20 19 16 17 18 14 15 Test group (feed administration including bacteriophage) 13 9 7 4 2 0 0 0
  • Diarrhea index (average) division D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 Control group (feed administration without bacteriophage) 1.5 2.0 1.4 1.4 1.4 1.5 1.1 1.1 Test group (feed administration including bacteriophage) 0.7 0.5 0.3 0 0 0 0 0 0 0
  • Example 6 bacteriophage Sal - HEP -1 with Salmonella Heidelberg For diseases caused by bacteria Treatment example
  • bacteriophage Sal-HEP-1 The effects of bacteriophage Sal-HEP-1 on diseases caused by Salmonella Heidelberg were investigated. Forty two-day-old chicks were divided into two groups, which were separated into two groups, and then tested for 14 days. Feed containing Salmonella Heidelberg bacteria was fed in a conventional feed manner at a level of 1 ⁇ 10 7 cfu / g for 3 days from the 5th day from the start of the test. Bacteriophage Sal-HEP of 1 ⁇ 10 8 pfu / g for chicks in the test group (feed group containing bacteriophage) from the day after the feeding of the feed containing Salmonella Heidelberg for three days (the eighth day from the start of the test). The feed containing -1 was fed according to a conventional feed feeding method.
  • the chicks of the control group were fed with the same composition without the bacteriophage Sal-HEP-1 in the same manner.
  • test animals were measured for Salmonella Heidelberg bacteria in feces.
  • Salmonella Heidelberg Salmonella Heidelberg bacteria measuring bacteria selective medium in order to prevent interference from other bacterial contamination; was used (RAMBACH r agar Merck). Samples were plated in selective medium and incubated at 37 ° C. for 18-24 hours. Colonies presumed to be Salmonella Heidelberg bacteria were selected from the cultured selection medium and purified after separation, and then identified as Salmonella Heidelberg bacteria by polymerase chain reaction.
  • the feed additive was prepared using bacteriophage Sal-HEP-1 solution to include 1 ⁇ 10 8 pfu of bacteriophage Sal-HEP-1 per g of feed additive.
  • the method of preparing a feed additive was prepared by adding maltodextrin to the bacteriophage solution (50%, w / v) and then freeze drying. Finally, it was ground to a fine powder form. The drying process in the manufacturing process may be substituted for reduced pressure drying, warming drying, room temperature drying.
  • the feed additive without bacteriophage also used the buffer used to prepare the bacteriophage solution (Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 0.1% Gelatin, pH 8.0) instead of the bacteriophage solution. It was prepared by.
  • Each of the two feed additives thus prepared was mixed with 1,000 times poultry feed in a weight ratio to prepare the final two feeds.
  • Negative additives or disinfectants differed only in their application and the formulations were identical, and thus were prepared in the same manner.
  • a negative additive (or disinfectant) was prepared using bacteriophage Sal-HEP-1 solution to contain 1 ⁇ 10 9 pfu of bacteriophage Sal-HEP-1 per 1 ml of negative additive (or disinfectant).
  • the method for preparing a negative additive (or disinfectant) is well mixed by adding the bacteriophage Sal-HEP-1 solution so that 1 ⁇ 10 9 pfu of bacteriophage Sal-HEP-1 is included per 1 ml of the buffer used to prepare the bacteriophage solution.
  • the buffer itself used in the preparation of the bacteriophage solution was used as it is.
  • the two negative additives thus prepared were diluted with 1,000 times water by volume and used as final negative or disinfectants.
  • Example 7 and Example 8 Using the feed, negative water and disinfectant prepared in Example 7 and Example 8 was investigated whether the specification result when breeding chicken. In particular, the survey was conducted in terms of mortality. A total of 120 two-day-old chicks, 40 per group, were divided into three groups (group-A fed; group-B fed negative; group-C sterilized) for four weeks. . Each group was subdivided into 20 subgroups, and each subgroup was divided into small groups (small group-1) to which bacteriophage Sal-HEP-1 was applied (small group-1). The chicks in this study were kept separately in each test subgroup. Each subgroup is divided and referred to as Table 5 below.
  • Example 7 In the case of feed feeding, the feed prepared in Example 7 was fed according to the conventional feed feeding method according to the classification of Table 5, and in the case of negative feeding, the negative water prepared in Example 8 was classified in Table 5 According to the conventional drinking water supply method, and the disinfection treatment was carried out three times a week alternating with the existing disinfection. On the day of spraying the disinfectant of the present invention, disinfection using a conventional disinfectant was not performed. The test results are shown in Table 6.
  • Mortality in Chicken Specification Test group % Mortality A-1 0 A-2 45 B-1 5 B-2 45 C-1 5 C-2 40

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Abstract

본 발명은 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 살모넬라 하이델베르그 박테리오파지 SAL-HEP-1 및 이의 살모넬라 하이델베르그 균 증식 억제 용도
본 발명은 살모넬라 하이델베르그 균에 감염하여 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
살모넬라( Salmonella) 균은 그람음성 간균으로 균체 표면의 항원성분 중 lipopolysaccharide(O 항원)와 편모항원인 flagellin(H 항원)의 다양성에 근거하여 혈청형을 결정하며, 현재까지 약 2,500종 이상의 혈청형이 알려져 있다. 살모넬라 균은 축사, 동물 및 양어 사료, 어패류 등과 같이 자연 환경에 널리 존재하고 있으며, 환경에 대한 저항성과 생존력이 강한 세균이다.
살모넬라 균은 동물이나 인체에 감염 후 다양한 임상 증상과 병변을 나타내는데, 특히 장 점막에 부착하는 능력에 따라 병원성이 다른 것으로 알려져 있다. 살모넬라 균은 주로 장 점막, 간, 폐 조직 및 세포에 침입하여 병원성을 나타내며, 살모넬라 균이 생성한 독소는 모세혈관의 확장, 충혈 및 출혈 등의 증상을 일으킨다.
축종, 지역 및 국가 별로 살모넬라증(Salmonellosis)을 일으키는 살모넬라 균의 strain과 혈청형이 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 전 세계적으로 돼지 살모넬라증의 주된 혈청형은 살모넬라 콜레라수이스( Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스( Salmonella Enteritidis) 및 살모넬라 하이델베르그( Salmonella Heidelberg) 등이며, 닭 살모넬라증의 주된 혈청형은 살모넬라 갈리나룸( Salmonella Gallinarum)과 살모넬라 풀로룸( Salmonella Pullorum) 등이다. 특히 살모넬라 엔테리티디스의 경우 사람에게 식중독을 유발시키는 것으로 알려져 있다.
살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균( Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균( Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 살모넬라 하이델베르그 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 살모넬라 하이델베르그 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 살모넬라 하이델베르그 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대( Podoviridae) 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 하이델베르그 균에 감염하여 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP)을 유효성분으로 포함하는 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 하이델베르그 균에 감염하여 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP)을 유효성분으로 포함하는 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용되는 소독제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용되는 음수첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 살모넬라 하이델베르그 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 포도비리대 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 Sal-HEP-1은 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2018년 1월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13454BP).
또한, 본 발명은 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Sal-HEP-1을 유효성분으로 포함하는 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Sal-HEP-1은 살모넬라 하이델베르그 균을 효과적으로 사멸시키므로 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 살모넬라 하이델베르그 균의 감염 방지; 및 (ii) 살모넬라 하이델베르그 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Sal-HEP-1이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Sal-HEP-1은 1× 10 1 pfu/㎖ 내지 1× 10 30 pfu/㎖ 또는 1× 10 1 pfu/g 내지 1× 10 30 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10 4 pfu/㎖ 내지 1× 10 15 pfu/㎖ 또는 1× 10 4 pfu/g 내지 1× 10 15 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 살모넬라 하이델베르그 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 살모넬라 하이델베르그 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Sal-HEP-1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균 종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[살모넬라 하이델베르그 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Sal-HEP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Sal-HEP-1의 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Sal-HEP-1의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 살모넬라 하이델베르그 균은 미국의 ATCC(American Type CultureCollection)로부터 분양받아 사용하였다(분양번호 ATCC8326).
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 살모넬라 하이델베르그 균을 1/1,000 비율로 접종한 TSB( Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 살모넬라 하이델베르그 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 살모넬라 하이델베르그 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 살모넬라 하이델베르그 균의 배양액 3 ㎖(OD 600이 1.5)을 TSA( Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 살모넬라 하이델베르그 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
살모넬라 하이델베르그 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 살모넬라 하이델베르그 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 살모넬라 하이델베르그 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 포도비리대( Podoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 살모넬라 하이델베르그 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Sal-HEP-1로 명명한 뒤, 2018년 1월 4일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13454BP).
실시예 2: 박테리오파지 Sal - HEP -1의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 Sal-HEP-1의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 살모넬라 하이델베르그 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate;SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Sal-HEP-1의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체는 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 Pac-bio 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 Sal-HEP-1의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Sal-HEP-1 유전체는 50,109 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Sal-HEP-1의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 Sal-HEP-1의 유전체 서열은 살모넬라 박테리오파지 Bp96115의 부분 서열(Genbank Accession No. MG407615.1)과 비교적 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(identity: 95%). 그러나 박테리오파지 Sal-HEP-1은 환형의 유전체를 가짐에 반하여 살모넬라 박테리오파지 Bp96115는 선형의 유전체를 가져 두 박테리오파지의 유전체 사이에는 서열 외에도 형태적으로도 큰 차이가 있음을 알 수 있었다. 또한, 박테리오파지 Sal-HEP-1 유전체 상의 개방형해독틀(Open Reading Frame, ORF)의 개수는 90개임에 반하여, 살모넬라 박테리오파지 Bp96115는 62개의 개방형해독틀을 가지고 있어 이 점에서도 두 박테리오파지는 차이가 있었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Sal-HEP-1은 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Sal-HEP-1은 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예 3: 박테리오파지 Sal - HEP -1의 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 사멸능 조사
분리된 박테리오파지 Sal-HEP-1의 살모넬라 하이델베르그 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 살모넬라 하이델베르그 균주들은 미국 ATCC로부터 분양을 받거나 본 발명자들에 의해 분리되어 살모넬라 하이델베르그 균으로 동정된 것들로 총 10주였다. 박테리오파지 Sal-HEP-1은 실험에 대상이 된 살모넬라 하이델베르그 10주 중에 ATCC8326 균주를 포함하여 총 8주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Sal-HEP-1의 보데텔라 브론치셉티카( Bordetella bronchiseptica), 엔테로코쿠스 패칼리스( Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘( Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 미티스( Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스( Streptococcus uberis) 및 슈도모나스 애루기노사( Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Sal-HEP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Sal-HEP-1은 살모넬라 하이델베르그 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 살모넬라 하이델베르그 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Sal-HEP-1이 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예 4: 박테리오파지 Sal - HEP -1의 살모넬라 하이델베르그 균 감염 예방에 대한 실험예
9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10 8 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Sal-HEP-1 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 살모넬라 하이델베르그 균의 배양액을 넣어 주었다. 살모넬라 하이델베르그 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 살모넬라 하이델베르그 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Sal-HEP-1 액을 첨가해 준 튜브에서는 살모넬라 하이델베르그 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 살모넬라 하이델베르그 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
살모넬라 하이델베르그 균의 성장 억제
구분 OD 600 흡광도 값
배양 0분 배양후 60분 배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가 0.5 0.8 1.5
박테리오파지 액 첨가 0.5 0.3 0.1
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 살모넬라 하이델베르그 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 살모넬라 하이델베르그 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Sal-HEP-1이 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 5: 박테리오파지 Sal - HEP -1을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 동물시험
이유자돈을 이용하여 박테리오파지 Sal-HEP-1의 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 효과를 조사하였다. 생후 25일령의 이유자돈 20마리를 총 2 그룹(그룹 당 10마리)으로 나눈 후 실험사육돈방(1.1m × 1.0m)에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 보온시설 하에 주위환경을 통제하였고 돈방의 온도와 습도는 일정하게 유지시켰으며 돈방 바닥의 청소를 매일 실시하였다. 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 1× 10 8 pfu/g의 박테리오파지 Sal-HEP-1을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간에 걸쳐 실험군(박테리오파지 포함 사료 투여군) 및 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들 모두에게 1× 10 8 cfu/g 수준으로 살모넬라 하이델베르그 균을 급이하는 사료에 추가 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 살모넬라 하이델베르그 균 감염을 유도하였다. 살모넬라 하이델베르그 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행일(시험 개시일로부터 7일째가 되는 날)부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 분변에서의 살모넬라 하이델베르그 균 검출 정도를 조사하였고 돼지들의 설사 발생 정도도 조사하였다.
분변에서의 살모넬라 하이델베르그 균 검출 조사는 다음과 같이 수행하였다. 분변 시료를 살모넬라 하이델베르그 균 선택배지(RAMBACH agar; Merck)에 도말한 후에 37℃에서 18-24시간 동안 배양한 다음에 형성된 콜로니(Colony) 중에 살모넬라 하이델베르그 균으로 추정되는 콜로니를 선별하였다. 이렇게 선별된 콜로니들을 각각 시료로 하여 살모넬라 하이델베르그 균 특이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여 최종적으로 해당 콜로니가 살모넬라 하이델베르그 균인지를 확인하였다.
설사 발생 정도 조사는 설사지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 설사지수 측정은 통상 사용되는 Fecal Consistency(FC) score(정상: 0, 연변: 1, 묽은 설사: 2, 심한 설사: 3)를 측정하는 방식으로 실시하였다.
그 결과는 표 2 및 표 3과 같았다.
살모넬라 하이델베르그 균 검출 결과(평균치)
구분 평판배지 접시 당 검출된 살모넬라 하이델베르그 균의 콜로니 수
D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) 26 20 19 16 17 18 14 15
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여) 13 9 7 4 2 0 0 0
설사지수(평균치)
구분 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) 1.5 2.0 1.4 1.4 1.4 1.5 1.1 1.1
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여) 0.7 0.5 0.3 0 0 0 0 0
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 박테리오파지 Sal - HEP -1을 이용한 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료예
박테리오파지 Sal-HEP-1의 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 2일령 병아리 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 시험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 10 7 cfu/g 수준으로 살모넬라 하이델베르그 균을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 3일간의 살모넬라 하이델베르그 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 1× 10 8 pfu/g의 박테리오파지 Sal-HEP-1을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 또한, 시험 개시일로부터 8일째가 되는 날부터는 시험동물들을 대상으로 분변에서의 살모넬라 하이델베르그 균수를 측정하였다. 본 실시예의 살모넬라 하이델베르그 균수 측정에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 살모넬라 하이델베르그 균 선택배지(RAMBACH agar; Merck)를 사용하였다. 시료를 선택배지에 도말한 후에 37℃에서 18-24시간 동안 배양하였다. 배양한 선택배지로부터 살모넬라 하이델베르그 균으로 추정되는 콜로니를 선별하여 순수분리한 후에 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 하이델베르그 균인가를 확인하는 방식(중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 하이델베르그 균으로 확인된 콜로니의 수가 10 2 cfu/ml 수준 이상일 경우: 2, 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 하이델베르그 균으로 확인된 콜로니의 수가 10 1~10 2 cfu/ml 수준인 경우: 1, 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 하이델베르그 균으로 확인된 콜로니의 수가 10 0~10 1 cfu/ml 수준인 경우:0)으로 실시하였다. 참고로, 살모넬라 하이델베르그 균을 포함하고 있는 사료 투여 종료 다음 날(시험 개시일로부터 8일째)부터 분변에서 살모넬라 하이델베르그 균이 두 그룹 모두에서 확인되어, 강제 감염이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다. 살모넬라 하이델베르그 균수 측정 결과 결과는 표 4와 같았다.
살모넬라 하이델베르그 균수 측정 결과(평균치)
날짜 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) 1.2 1.2 1.2 1.1 1.0 1.0 1.1
실험군(박테리오파지 포함 사료 투여) 0.3 0.3 0.2 0 0 0 0
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Sal-HEP-1 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 10 8 pfu의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 양계용 사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예 8: 음수첨가제 및 소독제의 제조
음수첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 박테리오파지 Sal-HEP-1 액을 이용하여 음수첨가제(또는 소독제) 1 ml당 1× 10 9 pfu의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되도록 음수첨가제(또는 소독제)를 제조하였다. 음수첨가제(또는 소독제)의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 10 9 pfu의 박테리오파지 Sal-HEP-1이 포함되도록 상기 박테리오파지 Sal-HEP-1 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수첨가제(또는 소독제)로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 음수첨가제(또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.
실시예 9: 닭 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 음수 및 소독제를 이용하여 닭 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 120 마리의 2일령 병아리를 한 군당 40 마리씩으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 20마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Sal-HEP-1이 적용된 소그룹(소그룹-①) 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 병아리들은 각 시험 소그룹 별로 분리되어 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 5와 같이 구분되고 지칭되었다.
닭 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시
적용 소그룹 구분 및 표시
박테리오파지 Sal-HEP-1 적용 박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹 A-① A-②
음수로 공급한 그룹 B-① B-②
소독 처리한 그룹 C-① C-②
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 5의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 음수를 표 5의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 6에 제시되어 있다.
닭 사양 시험에서의 폐사율
그룹 폐사율(%)
A-① 0
A-② 45
B-① 5
B-② 45
C-① 5
C-② 40
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료 및 음수의 급이와 본 발명에 따른 소독 처리가 닭 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 닭의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
기탁기관명: KCTC
수탁번호: KCTC 13454BP
수탁일자: 20180104
Figure PCTKR2019001896-appb-img-000001

Claims (5)

  1. 살모넬라 하이델베르그 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 포도비리대 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP).
  2. 제1항의 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP)을 유효성분으로 포함하는, 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환 예방용 및 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환 예방용 및 치료용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 Sal-HEP-1(수탁번호 KCTC 13454BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 용도로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 하이델베르그 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법.
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