WO2019160000A1 - 細胞培養装置 - Google Patents

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WO2019160000A1
WO2019160000A1 PCT/JP2019/005203 JP2019005203W WO2019160000A1 WO 2019160000 A1 WO2019160000 A1 WO 2019160000A1 JP 2019005203 W JP2019005203 W JP 2019005203W WO 2019160000 A1 WO2019160000 A1 WO 2019160000A1
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cell culture
dish
cells
culture container
container
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PCT/JP2019/005203
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俊明 千葉
ヤンジン イ
貴樹 牛房
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株式会社フルステム
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture apparatus that enables agitation of a medium, supply of nutrients to cells and oxygenation with a simple operation, and enables large-scale cell culture.
  • Pluripotent stem cells are recognized as an important cell source for regenerative medicine because of their infinite proliferation ability and pluripotency.
  • stem cells for example, liver cirrhosis, blood diseases, treatment of myocardial infarction, construction of blood vessels, regeneration of bones and corneas, securing of skin for transplantation, and the like are considered.
  • target cells and organs are grown from stem cells or the like in a culture dish and transplanted into a person. Recently, angiogenesis from bone marrow-derived stem cells has been successfully performed to treat angina pectoris, myocardial infarction, and the like.
  • FIG. 11 illustrates a conventional cell culture apparatus.
  • the conventional cell culture device includes a first chamber 810, a porous scaffold 820, and a second chamber 830.
  • the second chamber 830 has a bellows shape that can be compressed and decompressed.
  • the second chamber 830 has an uncompressed shape and is in a state where the second chamber is filled with the culture solution, and the scaffold 820 is indirectly exposed to the gas environment, and the cells undergo oxygenation.
  • the second chamber 830 has a compressed shape, so that the culture solution is pushed upward and moves into the first chamber 810, and the scaffold 820 is immersed in the culture solution and the cells receive nutrient supply. .
  • the second chamber 830 becomes an uncompressed shape, so that the culture solution moves downward and the second chamber 830 is filled with the culture solution.
  • the second chamber 830 has a bellows shape, so that the cells that have moved to the second chamber 830 enter the convex portion outward of the bellows shape, and thereafter the second chamber 830 There is a risk that oxygenation is difficult due to the difficulty of being affected by the vertical movement of the culture solution due to compression and non-compression. Further, even if the second chamber 830, particularly the central portion, is in a compressed bellows shape, the culture solution cannot be completely returned to the first chamber 810 from the structure. Therefore, in order to seed cells on the porous scaffold 820, the cell suspension is placed in the first chamber 810 and left to stand, or the cells are adhered while the bellows shape is compressed and uncompressed. Due to space and dead volume, there are cell suspensions that cannot be attached, which is inefficient.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and provides a cell culture apparatus capable of sufficient nutrient supply and oxygenation to cells and capable of culturing stem cells in large quantities while having a simple structure. For the purpose.
  • a cell culture device comprises a cell culture container that is a substantially cylindrical body having a flat bottom at the lower end and a hollow space filled with a medium for culturing cells, and a magnet or a ferromagnetic material.
  • a plurality of magnetized bodies are provided at equal intervals around the periphery, and are arranged horizontally in the hollow space of the cell culture container, and have a substantially disc shape with a diameter smaller than the diameter of the substantially cylindrical body of the cell culture container.
  • a plurality of magnetized bodies each comprising a magnet corresponding to each of the magnetized bodies of the dish-like body so as to attract the dished body and each of the magnetized bodies of the dished body by a magnetic force;
  • the cell culture container is positioned inside the ring and moved upward, and the dish-like body is moved upward in conjunction with the magnetic force by moving upwards in the hollow space of the cell culture container By pushing up the filled medium from below and moving it downward
  • a substantially ring-shaped annular body that moves in the vertical direction, moving the dish-like body downward in conjunction with force, and dropping the medium filled in the hollow space of the cell culture container by gravity. It is characterized by that.
  • the present invention although it has a simple structure, sufficient nutrient supply to cells and oxygenation are possible, and a large amount of stem cells can be cultured.
  • FIG. It is a figure which shows the sugar consumption (mg / dL / day) of the cell for every culture
  • (A) is a photomicrograph before collection from the cell culture vessel on the 6th culture day
  • (B) is a photomicrograph after collection from the cell culture vessel on the 6th culture day.
  • FIG. It is a figure which shows the sugar consumption (mg / dL / day) of the cell for every culture
  • FIG. It is a photographic diagram showing that cells cultured in large quantities using the cell culture device of the present invention can be multi-differentiated, of which (A) is a diagram showing differentiation into chondrocytes, (B) is a fat cell (C) is a diagram showing differentiation into bone cells. It is a figure explaining the conventional cell culture apparatus whose bellows-shaped chamber is an uncompressed shape. It is a figure explaining the conventional cell culture apparatus whose bellows-shaped chamber is a compression shape.
  • the cell culture apparatus 900 includes a cell culture container 100 that is a substantially cylindrical body, a substantially disc-shaped dish 200, and a substantially ring-shaped annular body 300.
  • the substantially cylindrical body is a column whose cross section in the horizontal plane includes not only a circle but also an ellipse, an oval shape, and the like.
  • the substantially disc shape is a shape that includes not only a circle but also an ellipse, an oval shape, and the like in plan view.
  • the substantially ring shape is a shape including not only an annular body but also an elliptical annular body or an oval annular body in plan view.
  • the cell culture container 100 has an opening (not shown) at the upper end and a flat bottom 120 at the lower end.
  • the cell culture container 100 includes a hollow space 130 that is filled with a scaffold for culturing cells. From the opening at the upper end of the cell culture vessel 100, a scaffold, a medium, and cells to be cultured can be put.
  • the cells to be cultured are not particularly limited, and any of cells that are less susceptible to cell damage and cells that are more susceptible to cell damage are possible, preferably cells that are more susceptible to cell damage, more preferably And human embryonic stem (ES) cells, iPS cells, somatic stem cells and the like.
  • ES human embryonic stem
  • iPS iPS cells
  • somatic stem cells for example, mesenchymal stem cells derived from fat or bone marrow are preferable.
  • the culture medium used is a liquid culture medium, for example, glucose etc. are included.
  • the dimensions of the cell culture vessel 100 are not particularly limited.
  • the volume is 250 ml (bore 100 mm, height 50 mm, bottom 100 mm), 500 ml (bore 100 mm, height 100 mm, bottom 100 mm) or 1000 ml. (Diameter 100 mm, height 200 mm, bottom 100 mm), etc.
  • the cell culture container 100 is a cell non-adhesive container in which cells do not easily adhere to the inner wall of the container.
  • the cell culture container 100 is made of a plastic having low adhesion such as polyethylene terephthalate, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, polystyrene, or made of fluorine or silicon. It is a plastic or glass container that has been subjected to such hydrophobic surface processing.
  • the cells cultured in the cell culture vessel 100 are subjected to vertical vibration by the vibration unit 710 of the vibration device 700.
  • the vibration device 700 is not particularly limited, but is, for example, a vortex.
  • the scaffold filled in the space 130 of the cell culture container 100 is, for example, a three-dimensional porous scaffold.
  • the three-dimensional porous scaffold has, for example, an average porosity of 50 to 90%, preferably 80 to 90%, and an average pore size of 10 to 800 ⁇ m, preferably 200 to 400 ⁇ m.
  • the scaffold is a single scaffold or a scaffold composed of a collection of a plurality of cell support pieces.
  • the culture area of the scaffold is not particularly limited, but is, for example, 800 to 900,000 cm 2 , and preferably 800 to 45000 cm 2 .
  • the scaffold is a scaffold composed of an aggregate of a plurality of cell-supporting small pieces
  • it may be a fiber aggregate (nonwoven fabric, woven fabric, knitted fabric, etc.) composed of fibers made of thermoplastic resin, or a thermoplastic resin is kneaded in advance. Then, it may be an assembly of sheets formed by molding.
  • the dish-like body 200 includes a plurality of magnetized bodies 210 at equal intervals around the periphery.
  • the dish 200 has a thickness of 15 mm, an outer diameter of 95 mm, and an inner diameter of 68 mm, for example.
  • the magnetized body 210 is made of a magnet or a ferromagnetic material.
  • the magnet is a permanent magnet or an electromagnet, and the ferromagnetic material is a metal whose main component is, for example, iron, cobalt, or nickel.
  • the shape of the magnetized body 210 is not particularly limited, but can be a cylindrical body having a diameter of 10 mm and a height of 10 mm, for example.
  • six magnetically attached bodies 210 are provided at equal intervals of 60 degrees around the periphery of the substantially disk-shaped dish-like body 200.
  • the magnetic force of the magnetized body 210 is, for example, 4500 to 4800 gauss for a permanent magnet, and 0 gauss for iron.
  • the dish-shaped body 200 is horizontally disposed in the hollow space of the cell culture container 100.
  • the substantially disc-shaped dish 200 has a diameter smaller than the diameter of the substantially cylindrical body of the cell culture container 100. Specifically, when the inner diameter of the substantially cylindrical body of the cell culture vessel 100 and D 1, the diameter D 2 of the substantially disk-shaped dish-like body 200, may be a 0.90D 1 ⁇ 0.998D 1.
  • the substantially disc-shaped dish 200 does not contact the inner surface of the cell culture container 100.
  • the substantially ring-shaped annular body 300 is positioned outside the cell culture container 100 and the cell culture container 100 is positioned inside the ring.
  • the thickness of the annular body 300 is, for example, the same as that of the dish-like body 200 and is 15 mm.
  • the substantially ring-shaped annular body 300 includes a plurality of magnetized bodies 310 made of magnets so as to correspond to the respective magnetized bodies 210 of the dish-shaped body 200.
  • the shape of the magnetized body 310 is not particularly limited, but can be a cylindrical body having a diameter of 10 mm and a height of 10 mm, for example, like the magnetized body 210.
  • the magnetic force of the magnetized body 310 is, for example, 4500 to 4800 gauss for a permanent magnet.
  • Each magnetized body 210 of the dish-shaped body 200 is a magnet, and each magnet is arranged on the dish-shaped body 200 with one pole facing the outer side of the container, and each magnet is a magnet of each of the annular bodies 300.
  • the attached body 310 can be disposed on the annular body 300 so that the other pole faces the inside of the container so as to correspond to the magnet of the dish-shaped body 200.
  • the dish-like body 200 includes six permanent magnets with the south pole facing the outer side of the container
  • the annular body 300 has the north pole facing the inner side of the container so as to correspond to each of these six permanent magnets. With six permanent magnets.
  • the permanent magnet 310 may be either an N pole or an S pole with respect to the inner side of the container. Between one end (for example, the S pole of the magnet) side of the magnetic body 210 of the dish-shaped body 200 and the other end (for example, the N pole of the magnet) side of the magnetic body 310 of the annular body 300.
  • the distance is, for example, 0.1 mm to 10.0 mm. Since each magnetized body 310 of the annular body 300 and each magnetized body 210 of the dish-shaped body 200 correspond to each other, the height of the annular body 300 (that is, the position in the vertical direction) and the height of the dish-shaped body 200 Match.
  • a plurality of through holes 220 are provided in the center of the dish-like body 200.
  • the diameter of the through hole 220 is not particularly limited, but can be set to 1 mm to 5 mm, for example.
  • the annular body 300 is supported by the lifting device 320 and moves up and down. Since the annular body 300 moves up and down, the dish-like body 200 interlocked with the annular body 300 also moves up and down by magnetic force. This makes it possible to agitate the medium and oxygenate and supply nutrients to the cells.
  • the up-and-down movement of the annular body 300 is, for example, a single vibration movement or a substantially single vibration movement.
  • the cycle of the vertical movement of the annular body 300 can be set, for example, to 0.5 times / hour to 12.0 times / hour.
  • the substantially simple vibration motion is, for example, a repetitive motion of moving from below to above and stopping for a certain time, then moving from above to below, stopping for a certain time, and moving again from below to above.
  • the stroke length of the vertical movement of the annular body 300 is smaller than the height of the cell culture vessel 100, and can be set to 20 mm to 120 mm, for example.
  • the moving speed in the upward or downward direction of the annular body 300 can be set to, for example, 0.5 mm / second to 10.0 mm / second.
  • the cell culture container 100 has a bottom convex portion 125 whose inside protrudes upward at the center of the bottom portion 120.
  • the cell culture container 100 has a bottom concave portion 126 having a shape corresponding to the bottom convex portion 125 at the center of the bottom portion 120.
  • the diameter of the bottom 120 of the cell culture container 100 is 100 mm
  • the depth of the bottom recess 126 is 8 mm
  • the inside diameter of the bottom recess 126 is 60 mm.
  • the vibration unit 710 of the vibration device 700 is fitted into the bottom recess 126 without a gap.
  • the dish-like body 200 is provided with a dish concave portion 230 into which the bottom convex portion 125 of the cell culture container 100 is fitted at the center of the lower surface thereof.
  • a gap is described between the bottom convex portion 125 of the cell culture container 100 and the dish concave portion 230 of the dish-like body 200, but the bottom convex portion 125 is fitted into the dish concave portion 230 without a gap. It may be.
  • the dish-like body 200 arranged in the hollow space 130 of the cell culture container 100 is positioned near the lower part of the cell culture container 100.
  • the annular body 300 is also located near the lower portion of the cell culture container 100.
  • a scaffold, a medium, and cells to be cultured are put into the space 130 of the cell culture container 100 from an opening (not shown) at the upper end of the cell culture container 100.
  • the annular body 300 located near the lower part of the cell culture vessel 100 is moved upward.
  • Each magnetized body 310 of the annular body 300 and each magnetized body 210 of the dish-shaped body 200 correspond to each other, and the annular body 300 and the dish-shaped body 200 are interlocked with each other by a magnetic force.
  • the dish-shaped body 200 moves upward, the scaffold filled in the hollow space 130 of the cell culture container 100 and the cells attached to the scaffold are pushed up from below by the dish-shaped body 200 and moved upward.
  • a plurality of through holes 220 are provided in the center of the dish-shaped body 200, so that the medium in the space 130 of the cell culture vessel 100 is not pushed upward and penetrates. Passing through the holes 220, the medium is agitated.
  • the annular body 300 stops moving by positioning the dish 200 in the vicinity of the upper part of the cell culture container 100.
  • the height of the cell culture container 100 is L (the height L is the distance from the opening at the top of the cell culture container 100 to the bottom 120). .))
  • the dish-like body 200 is spaced from the upper end of the cell culture vessel 100 downward by a distance of 0.3 L to 0.7 L, for example.
  • the dish-shaped body 200 is located near the upper part of the cell culture container 100, the medium is not pushed upward, and thus, for example, the cells can be oxygenated.
  • the annular body 300 is moved downward.
  • the annular body 300 and the dish-shaped body 200 are interlocked by the magnetic force, and the dish-shaped body 200 is also moved downward.
  • the dish-shaped body 200 moves downward, the scaffold and the cells attached to the scaffold drop by gravity and are immersed in the culture medium to receive nutrient supply.
  • the annular body 300 stops moving by positioning the dish 200 near the lower part of the cell culture vessel 100.
  • the dish-like body 200 When the dish-like body 200 is located in the vicinity of the lower part of the cell culture container 100, it means that the dish-like recess 230 of the dish-like body 200 is inserted into the bottom convex part 125 of the cell culture container 100 without any gap from the cell culture container 100. For example, up to a position spaced apart from the bottom 120 by a distance of, for example, 0.01 L to 0.2 L.
  • the dish recess 230 of the dish-like body 200 is fitted into the bottom convex part 125 of the cell culture container 100 without a gap, and the vibration part 710 of the vibration device 700 is fitted into the bottom concave part 126 of the cell culture container 100 without a gap.
  • the vibration device 700 is operated to transmit, for example, vertical vibration from the vibration unit 710 to the cultured cells in the cell culture container 100. This facilitates the collection of cultured cells buried deep in the three-dimensional porous scaffold.
  • Example 1 The dish-like body arranged in the hollow space of the cell culture container was positioned near the lower part of the cell culture container. From the opening at the upper end of the cell culture container, the scaffold, the medium, and the cells to be cultured were put into the space of the cell culture container. The cells were 5.0 ⁇ 10 7 adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC).
  • the scaffold used 5,000 pieces of CESCO BioNOC II matrix (3D culture).
  • the stroke length of the vertical movement of the annular body was 60 mm, and the moving speed in the upward or downward direction of the annular body was 1.0 mm / second.
  • the cycle of the vertical movement of the annular body was 1.0 times / hour.
  • the culture period was 8 days.
  • FIG. 4 is a diagram showing the sugar consumption (mg / dL / day) of the cells for each culture day.
  • the sugar consumption of the cells was measured using a GlucCell handy glucose monitor (CESCO).
  • CESCO GlucCell handy glucose monitor
  • FIG. 5 (A) is a photomicrograph before collection from the cell culture container on the 8th culture day
  • FIG. 5 (B) is a photomicrograph after collection from the cell culture container on the 8th culture day. It can be understood from FIG. 5 that a large amount of cultured cells could be recovered appropriately by using the cell culture apparatus according to this example.
  • a comparative example 5.0 ⁇ 10 7 ADSCs were seeded in a cell culture petri dish (2D culture) manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and cultured for 8 days.
  • Table 1 shows the properties of cultured cells using the cell culture apparatus (3D culture) according to the present example and the properties of cultured cells using the culture dish (2D culture) according to the comparative example. As shown in Table 1, the cells cultured using the cell culture apparatus according to this example had the same properties as the cells cultured in the conventional culture dish.
  • Example 2 In Example 1, the cells were ADSC, but in Example 2, culture of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) was attempted.
  • BMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the dish-like body arranged in the hollow space of the cell culture container was positioned near the lower part of the cell culture container. From the opening at the upper end of the cell culture container, the scaffold, the medium, and the cells to be cultured were put into the space of the cell culture container. The cells were 3.0 ⁇ 10 7 BMSCs.
  • the scaffold used 2,000 pieces of CESCO BioNOC II matrix (3D culture).
  • the stroke length of the vertical movement of the annular body was 40 mm, and the moving speed in the upward or downward direction of the annular body was 1.0 mm / second.
  • the cycle of the vertical movement of the annular body was 1.0 times / hour.
  • the culture period was 6 days.
  • FIG. 6 is a graph showing the sugar consumption (mg / dL / day) of the cells for each culture day.
  • the sugar consumption of the cells was measured using a GlucCell handy glucose monitor (CESCO).
  • CESCO GlucCell handy glucose monitor
  • FIG. 7A is a photomicrograph before collection from the cell culture container on the 6th culture day
  • FIG. 7B is a photomicrograph after collection from the cell culture container on the 6th culture day. It can be understood from FIG. 7 that a large amount of cultured cells could be appropriately recovered by using the cell culture apparatus according to this example.
  • BMSCs As a comparative example, 3.0 ⁇ 10 7 BMSCs were seeded in a cell culture petri dish (2D culture) manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and cultured for 6 days.
  • Table 2 shows the properties of the cultured cells using the cell culture apparatus (3D culture) according to the present example and the properties of the cultured cells using the culture dish (2D culture) according to the comparative example. As shown in Table 2, the cells cultured using the cell culture apparatus according to this example had the same properties as the cells cultured on the conventional culture dish.
  • Example 3 Synovial mesenchymal stem cells have a very high ability to differentiate and proliferate cartilage and are useful for regeneration of cartilage and meniscus.
  • Example 3 attempts to culture synovial mesenchymal stem cells.
  • the dish-like body arranged in the hollow space of the cell culture container was positioned near the lower part of the cell culture container. From the opening at the upper end of the cell culture container, the scaffold, the medium, and the cells to be cultured were put into the space of the cell culture container. The cells were 1.5 ⁇ 10 7 synovial-derived mesenchymal stem cells.
  • the scaffold used 3,000 pieces of CESCO BioNOC II matrix (3D culture).
  • the stroke length of the vertical movement of the annular body was 45 mm, and the moving speed in the upward or downward direction of the annular body was 1.0 mm / second.
  • the cycle of the vertical movement of the annular body was 1.0 times / hour.
  • the culture period was 7 days.
  • FIG. 8 is a graph showing the sugar consumption (mg / dL / day) of the cells for each culture day.
  • the sugar consumption of the cells was measured using a GlucCell handy glucose monitor (CESCO). As shown in FIG. 8, it was shown that the cells were appropriately cultured by using the cell culture apparatus according to this example.
  • CESCO GlucCell handy glucose monitor
  • FIG. 9 (A) is a photomicrograph before collection from the cell culture container on the 7th culture day
  • FIG. 9 (B) is a photomicrograph after collection from the cell culture container on the 7th culture day. From FIG. 9, it can be understood that a large amount of cultured cells could be appropriately recovered by using the cell culture apparatus according to this example.
  • Example 4 In order to confirm the retention and pluripotency of stem cell properties in synovial cell-derived mesenchymal stem cells after mass culture, using the synovial cell-derived mesenchymal stem cells after mass culture and recovery according to Example 3, fat cells, cartilage Differentiation into cells and bone cells was performed.
  • Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit of R & D System was used for differentiation induction. After 10 4 cells were attached to each 24-well culture plate, differentiation induction into adipocytes was performed for 14 days using a differentiation medium in which Adipogenic Supplement and ITS Supplement included in the kit were added to 50 ml of DMEM basal medium. Culture was performed.
  • differentiation induction into chondrocytes culture was performed for 21 days using a differentiation medium supplemented with 50 ml of DMEM basal medium with Chondrogenic Supplement and ITS Supplement included in the kit.
  • differentiation medium for induction of differentiation into bone cells, cultivation was performed for 21 days using a differentiation medium in which Osteogenic Supplement and ITS Supplement included in the kit were added to 50 ml of DMEM basal medium.
  • OilRed-O, Alcian Blue, and Alizarin Red staining were performed after fixation with 4% paraformaldehyde.
  • FIG. 10 is a photographic diagram showing that cells cultured in large quantities using the cell culture apparatus of the present invention can be multi-differentiated, of which (A) is a diagram showing differentiation into chondrocytes, (B ) Is a diagram showing differentiation into fat cells, and (C) is a diagram showing differentiation into bone cells. (A) is staining with Alcian Blue, (B) is staining with Oil Red O, and (C) is staining with Alizarin Red. As shown in FIG. 10, the synovial stem cells after mass culture maintained stem cell properties and pluripotency, and differentiated into adipocytes, chondrocytes, and bone cells.

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Abstract

簡易な構造で、細胞への十分な栄養供給及び酸素化を可能とすることで細胞の大量培養を可能とする細胞培養装置を提供する。下端に平坦な底部を有する略円柱体である細胞培養容器と、複数の磁着体を周辺部に等間隔で備え、細胞培養容器の中空な空間部内に非接触状態で水平に配置される略円盤状の皿状体と、複数の磁着体を備えて細胞培養容器の外側に位置して環内部に細胞培養容器を位置させる環状体と、を有する。環状体と皿状体とは磁力により連動して上下移動をし、培地の攪拌及び細胞への栄養供給を行う。

Description

細胞培養装置
　本発明は、単純な動作で培地の攪拌並びに細胞への栄養供給及び酸素化を可能とし、大量の細胞培養を可能とする細胞培養装置に関する。
　多能性幹細胞(胚性幹細胞、人工多能性幹(iPS)細胞)は、その無限増殖能及び多分化能から、再生医療の重要な細胞ソースとして認識されている。幹細胞を利用した再生医療としては、例えば、肝硬変や血液疾患、心筋梗塞の治療、血管の構築、骨や角膜の再生、移植用皮膚の確保等が考えられている。再生医療では、培養皿内で幹細胞等から目的とする細胞や臓器を増殖させ、人に移植するようにしている。最近では、骨髄由来の幹細胞から血管新生を行い、狭心症、心筋梗塞等の治療に成功している。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、幹細胞を人工的な環境下で効率良く大量に培養する細胞培養装置が求められている。
　図１１は従来の細胞培養装置を説明するものである。図１１に示されるように従来の細胞培養装置は第１のチャンバー８１０と、多孔性の足場８２０と、第２のチャンバー８３０と、を備える。第２のチャンバー８３０は、圧縮及び減圧可能なベロー形状を有する。図１１では、第２のチャンバー８３０は非圧縮形状であり、第２のチャンバーに培養溶液が充填された状態であり、足場８２０はガス環境に間接的にさらされて細胞は酸素化を受ける。図１２では、第２のチャンバー８３０が圧縮形状となることで、培養溶液は上方へ押し上げられて第１のチャンバー８１０内に移動し、足場８２０は培養溶液に浸漬されて細胞は栄養供給を受ける。再び、図１２にもどり、第２のチャンバー８３０が非圧縮形状となることで、培養溶液は下方へ移動して第２のチャンバー８３０に培養溶液が充填された状態となる。
　しかし、上述の細胞培養装置では、第２のチャンバー８３０はベロー形状であるため、第２のチャンバー８３０へ移動した細胞がベロー形状の外側への凸部分に入り込み、以後は第２のチャンバー８３０の圧縮及び非圧縮による培養溶液の上下の移動の影響を受けにくくなり、酸素化が困難となる虞がある。また、第２のチャンバー８３０、特に中心部は、圧縮状態のベロー形状であっても、その構造から培養液を第１のチャンバー８１０へ完全に戻す事が出来ない。故に、多孔性の足場８２０に対して細胞を播種するには、第１のチャンバー８１０に細胞懸濁液を入れ静置、もしくはベロー形状を圧縮及び非圧縮させながら細胞接着させるが、発生する死空間および死容量により、接着させる事ができない細胞懸濁液が存在することになり非効率である。
特許４４３０３１７号
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、簡易な構造でありながらも細胞への十分な栄養供給及び酸素化を可能とし、幹細胞の大量培養が可能な細胞培養装置を提供することを目的とする。
　本発明にかかる細胞培養装置は、下端に平坦な底部を有し、細胞を培養する培地が充填される中空な空間部を備える略円柱体である細胞培養容器と、磁石又は強磁性体からなる複数の磁着体を周辺部に等間隔で備え、前記細胞培養容器の中空な空間部内に水平に配置された、前記細胞培養容器の略円柱体の直径よりも微小な直径の略円盤状の皿状体と、前記皿状体の各々の磁着体を磁力により引き付けるように、前記皿状体の各々の磁着体と対応する磁石からなる複数の磁着体を備え、前記細胞培養容器の外側に位置して環内部に前記細胞培養容器を位置させ、上方向に移動することで磁力により連動して前記皿状体を上方向に移動させて前記細胞培養容器の中空な空間部内に充填された培地を下方から押し上げ、下方向に移動することで磁力により連動して前記皿状体を下方向に移動させ、前記細胞培養容器の中空な空間部内に充填された培地を重力落下させる、上下方向に移動する略リング状の環状体と、を有することを特徴とする。
　本発明によれば、簡易な構造でありながらも細胞への十分な栄養供給及び酸素化を可能とし、幹細胞の大量培養が可能となる。
本実施形態にかかる細胞培養装置の外観を説明する図である。 本実施形態にかかる細胞培養装置の皿状体付近を詳細に説明する図である。 本実施形態にかかる細胞培養装置の細胞培養容器の底部付近を詳細に説明する図である。 脂肪由来間葉系幹細胞について、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。 脂肪由来間葉系幹細胞について、(A)は培養日数８日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、(B)は培養日数８日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。 骨髄由来間葉系幹細胞について、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。 骨髄由来間葉系幹細胞について、(A)は培養日数６日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、(B)は培養日数６日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。 滑膜由来間葉系幹細胞について、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。 滑膜由来間葉系幹細胞について、(A)は培養日数７日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、(B)は培養日数７日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。 本発明の細胞培養装置を使用して大量培養した細胞が多分化可能であることを示す写真図であり、そのうち(A)は軟骨細胞への分化を示す図であり、(B)は脂肪細胞への分化を示す図であり、(C)は骨細胞への分化を示す図である。 ベロー形状のチャンバーが非圧縮形状である従来の細胞培養装置を説明する図である。 ベロー形状のチャンバーが圧縮形状である従来の細胞培養装置を説明する図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかる細胞培養装置９００は、図１に示されるように、略円柱体である細胞培養容器１００と、略円盤状の皿状体２００と、略リング状の環状体３００と、を有する。略円柱体とは、水平面での断面が円のみならず、楕円や小判形状等も包含する柱体である。略円盤状とは、平面視にて円のみならず、楕円や小判形状等も包含する形状である。略リング状とは、平面視にて円環状体のみならず、楕円環状体や小判形状の環状体も包含する形状である。
　細胞培養容器１００は、上端に図示されない開口部を有し、下端に平坦な底部１２０を有する。細胞培養容器１００は、細胞を培養するための足場が充填される中空な空間部１３０を備える。細胞培養容器１００の上端の開口部からは足場、培地、培養対象である細胞を入れることができる。
　培養対象となる細胞は、特に限定されるものでなく、細胞障害を受けにくい細胞及び細胞障害を受けやすい細胞のいずれも可能であるが、好ましくは細胞障害を受けやすい細胞であり、より好ましくは、ヒト胚性幹(ES)細胞、iPS細胞、体性幹細胞等が挙げられる。体性幹細胞としては、例えば脂肪由来や骨髄由来の間葉系幹細胞が好ましい。また使用される培地は液体培地であり、例えばグルコース等を包含する。
　細胞培養容器１００の寸法は、特に限定されるものではないが、例えば容積が250 ml(口径100mm、高さ50mm、底100mm)、500 ml(口径100mm、高さ100mm、底100mm)又は1000 ml(口径100mm、高さ200mm、底100mm)等とすることができる。
　細胞培養容器１００は、細胞が容器内壁に付着しにくい細胞非接着性の容器であり、例えばポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の付着性の低いプラスチック製あるいは、フッ素加工、シリコン加工のような疎水性表面加工を施したプラスチック製又はガラス製の容器である。
　細胞培養容器１００で培養された細胞は、振動装置７００の振動部７１０により上下方向の振動が加えられる。振動装置７００は、特に限定されるものではないが例えばボルテックスである。
　細胞培養容器１００の空間部１３０に充填される足場は、例えば三次元多孔性足場である。３次元多孔性足場は、例えば平均間隙率が50～90％、好ましくは80～90％であり、平均ポアサイズが10～800μm、好ましくは200～400μmである。足場は、単一の足場、又は、複数の細胞支持小片の集合体からなる足場である。足場の培養面積は特に限定されるものではないが、例えば800～900000 cm2であり、好ましくは800～45000 cm2である。足場が複数の細胞支持小片の集合体からなる足場の場合、例えば、熱可塑性樹脂製の繊維からなる繊維集合体（不織布、織物、編み物等）であってもよいし、熱可塑性樹脂を予め混練した後、成形して作製したシートの集合体であってもよい。
　図２に示されるように、皿状体２００は、複数の磁着体２１０を周辺部に等間隔で備える。皿状体２００は、例えば厚み15 mm、外径95 mm、内径68 mmである。磁着体２１０は磁石又は強磁性体からなる。磁石は永久磁石又は電磁石であり、強磁性体は、例えば鉄、コバルト、ニッケルを主成分とする金属である。磁着体２１０の形状は、特に限定されるものではないが、例えば直径10 mm高さ10 mmの円柱体とすることができる。本実施形態においては、６個の磁着体２１０を略円盤状の皿状体２００の周辺部に６０度の等間隔で備える。磁着体２１０の磁力は、例えば永久磁石では4500～4800ガウスであり、鉄の場合には0ガウスである。皿状体２００は、細胞培養容器１００の中空な空間部内に水平に配置される。略円盤状の皿状体２００は、細胞培養容器１００の略円柱体の直径よりも微小な直径を有する。具体的には、細胞培養容器１００の略円柱体の内径をＤ１とすると、略円盤状の皿状体２００の直径Ｄ２は、0.90Ｄ１～0.998Ｄ１とすることが可能である。そのため略円盤状の皿状体２００は、細胞培養容器１００の内面に接触しない。なお、略円盤状の皿状体２００の外周部に等間隔で配置された車輪を設け、それらの車輪と細胞培養容器１００の内面とは接触させることは可能である。
　略リング状の環状体３００は、細胞培養容器１００の外側に位置して環内部に細胞培養容器１００を位置させる。環状体３００の厚みは、例えば皿状体２００と同じであり15 mmである。略リング状の環状体３００は、皿状体２００の各々の磁着体２１０と対応するように磁石からなる複数の磁着体３１０を備える。磁着体３１０の形状は、特に限定されるものではないが、磁着体２１０と同じように例えば直径10 mm高さ10 mmの円柱体とすることができる。磁着体３１０の磁力は、例えば永久磁石では4500～4800ガウスである。皿状体２００の各々の磁着体２１０が磁石であり、各々の磁石は一方の極を容器外側方向へ向けて皿状体２００に配置され、そして、環状体３００の各々の磁石である磁着体３１０は皿状体２００の磁石と対応するように、他方の極を容器内側方向へ向けて環状体３００に配置されることも可能である。例えば皿状体２００が、Ｓ極を容器外側方向へ向けた６個の永久磁石を備える場合、環状体３００は、これらの６個の永久磁石と各々対応するように、Ｎ極を容器内側方向へ向けた６個の永久磁石を備える。また例えば磁性体２１０が鉄であり、極性を持たない場合は、永久磁石３１０は容器内側方向に対して、N極もしくはS極のどちらでも構わない。皿状体２００の磁着体２１０の一方(例えば磁石のＳ極)側の端部と、環状体３００の磁着体３１０の他方の(例えば磁石のＮ極)側の端部との間の距離は、例えば0.1ｍｍ～10.0ｍｍである。環状体３００の各々の磁着体３１０と皿状体２００の各々の磁着体２１０とは対応するため、環状体３００の高さ(即ち、鉛直方向の位置)と皿状体２００の高さとは一致する。
　皿状体２００の中央部には複数の貫通孔２２０が設けられている。貫通孔２２０の孔径は、特に限定されるものではないが例えば1ｍｍ～5ｍｍとすることが可能である。
　環状体３００は、昇降装置３２０により支持され且つ上下移動を行う。環状体３００は上下移動を行うため、磁力により環状体３００と連動する皿状体２００も上下移動を行う。これにより培地の攪拌、並びに、細胞への酸素化及び栄養供給が可能となる。環状体３００の上下移動の運動は、例えば単振動運動、又は、略単振動運動である。環状体３００の上下移動の周期は、例えば0.5回/時間～12.0回/時間とすることが可能である。略単振動運動は、例えば、下方から上方へ移動しで一定時間停止し、次に上方から下方へ移動し一定時間停止し、再び下方から上方へ移動する運動の繰返しの運動である。環状体３００の上下移動のストローク長さは、細胞培養容器１００の高さよりも小さく、例えば20ｍｍ～120ｍｍとすることが可能である。環状体３００の上方向又は下方向への移動速度は、例えば0.5ｍｍ/秒～10.0ｍｍ/秒とすることが可能である。
　図３に示されるように、細胞培養容器１００は、その底部１２０の中央部に上方へ突出する内部が空間部である底部凸部１２５を有する。換言すれば、細胞培養容器１００は、その底部１２０の中央部に底部凸部１２５に対応する形状の底部凹部１２６を有する。例えば、細胞培養容器１００の底部１２０の直径が100 mmの場合、底部凹部１２６の深さは8 mmであり、底部凹部１２６の内部の直径は60 mmである。振動装置７００の振動部７１０は、底部凹部１２６に隙間無くはめ込まれる。
　皿状体２００は、細胞培養容器１００の底部凸部１２５がはめ込まれる皿凹部２３０をその下面の中央部に備える。なお、図３においては、細胞培養容器１００の底部凸部１２５と皿状体２００の皿凹部２３０との間には間隙が記載されているが、底部凸部１２５は皿凹部２３０に隙間無くはめ込まれるものであっても良い。
　次に本実施形態にかかる細胞培養装置の使用態様について説明する。
　まず、細胞培養容器１００の中空な空間部１３０内に配置された皿状体２００を、細胞培養容器１００の下部近傍に位置させる。この場合、環状体３００の高さと皿状体２００の高さとは一致するため、環状体３００も細胞培養容器１００の下部近傍に位置する。そして、細胞培養容器１００の上端の図示されない開口部から、細胞培養容器１００の空間部１３０へ足場、培地、及び、培養対象である細胞を入れる。
　次に、細胞培養容器１００の下部近傍に位置していた環状体３００を上方向に移動させる。環状体３００の各々の磁着体３１０と皿状体２００の各々の磁着体２１０とは対応しており、磁力により環状体３００と皿状体２００とが連動して、皿状体２００も上方向に移動する。皿状体２００が上方向へ移動することで、細胞培養容器１００の中空な空間部１３０内に充填された足場及び足場に付着している細胞は、皿状体２００により下方から押し上げられて上方へ移動する。皿状体２００は上方へ移動するが、皿状体２００の中央部には複数の貫通孔２２０が設けられているため、細胞培養容器１００の空間部１３０内の培地は上方へ押し上げられず貫通孔２２０を通過し、その際には培地が撹拌される。
　次に、環状体３００は、皿状体２００を細胞培養容器１００の上部近傍にて位置させて移動を止める。皿状体２００が細胞培養容器１００の上部近傍にて位置するとは、細胞培養容器１００の高さをＬ(高さＬは、細胞培養容器１００の上端の開口部から底部１２０までの距離とする。)とすると、皿状体２００が細胞培養容器１００の上端から下方へ例えば0.3Ｌ～0.7Ｌの距離だけ離間した位置である。皿状体２００が細胞培養容器１００の上部近傍にて位置する場合、培地は上方へ押し上げられていないため、例えば細胞は酸素化を受けることが可能である。
　次に、環状体３００を下方向に移動させる。磁力により環状体３００と皿状体２００とが連動して、皿状体２００も下方向に移動する。皿状体２００が下方向へ移動することで、足場及び足場に付着している細胞は重力落下し、培地に浸漬されて細胞は栄養供給を受ける。
　環状体３００は、皿状体２００を細胞培養容器１００の下部近傍にて位置させて移動を止める。皿状体２００が細胞培養容器１００の下部近傍にて位置するとは、皿状体２００の皿凹部２３０が細胞培養容器１００の底部凸部１２５に隙間無くはめ込まれた位置から、細胞培養容器１００の底部１２０から上方へ例えば0.01Ｌ～0.2Ｌの距離だけ離間した位置までを含む。
　その後、再び、環状体３００を上方向に移動させる。このように、環状体３００及び磁力により連動する皿状体２００は、共に上下移動を行う。
　培養後は、皿状体２００の皿凹部２３０を細胞培養容器１００の底部凸部１２５に隙間無くはめ込み、そして、振動装置７００の振動部７１０を細胞培養容器１００の底部凹部１２６に隙間無くはめ込む。この状態で振動装置７００を作動させ、振動部７１０から例えば上下方向の振動を細胞培養容器１００内の培養細胞へ伝える。これにより３次元多孔性足場の奥深くに埋没した培養細胞を回収し易くなる。
　（実施例１）
　細胞培養容器の中空な空間部内に配置された皿状体を、細胞培養容器の下部近傍に位置させた。細胞培養容器の上端の開口部から、細胞培養容器の空間部へ足場、培地、及び、培養対象である細胞を入れた。細胞は5.0×10７個の脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)であった。足場はCESCO社のBioNOC IIマトリックスを5,000枚使用した(３Ｄ培養)。環状体の上下移動のストローク長さは60ｍｍ、環状体の上方向又は下方向への移動速度は1.0ｍｍ/秒とした。環状体の上下移動の周期は1.0回/時間とした。培養日数は８日であった。
　図４は、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。細胞の糖消費量は、GlucCellハンディ・グルコースモニター（CESCO社）を用いて測定した。図４に示されるように、本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、適切に細胞が培養されたことが示された。
　８日目に、細胞培養容器内から3.2×108個の大量のADSCを回収した。なお、３次元多孔性足場の奥深くに埋没した培養細胞にダメージを与えることなく効率的に回収することは困難であるが、培養後に、細胞培養容器内に、トリプシン-EDTA及びカゼイナーゼを有する酵素溶液を添加して培養細胞に酵素処理を行うことにより大量に培養細胞を細胞培養容器から回収できる。図５(A)は培養日数８日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、図５(B)は培養日数８日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。図５から本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、大量の培養細胞が適切に回収できたことが理解できる。
　比較例として、住友ベークライト社の細胞培養用シャーレ(２Ｄ培養)に5.0×10７個のADSCを播種し、培養日数８日で培養した。下記表１は、本実施例にかかる細胞培養装置(３Ｄ培養)を使用した培養細胞の性質と、比較例にかかる培養皿(２Ｄ培養)を使用した培養細胞の性質とを示す。表１に示されるように本実施例にかかる細胞培養装置を使用して培養された細胞は、従来の培養皿による培養された細胞と性質は同じであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例２）
　実施例１では細胞はADSCであったが、実施例２では骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）の培養を試みる。
　細胞培養容器の中空な空間部内に配置された皿状体を、細胞培養容器の下部近傍に位置させた。細胞培養容器の上端の開口部から、細胞培養容器の空間部へ足場、培地、及び、培養対象である細胞を入れた。細胞は3.0×10７個のBMSCであった。足場はCESCO社のBioNOC IIマトリックスを2,000枚使用した(３Ｄ培養)。環状体の上下移動のストローク長さは40ｍｍ、環状体の上方向又は下方向への移動速度は1.0ｍｍ/秒とした。環状体の上下移動の周期は1.0回/時間とした。培養日数は６日であった。
　図６は、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。細胞の糖消費量は、GlucCellハンディ・グルコースモニター（CESCO社）を用いて測定した。図６に示されるように、本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、適切に細胞が培養されたことが示された。
　６日目に、細胞培養容器内から5.42×108個の大量のBMSCを回収した。培養後に、細胞培養容器内に、トリプシン-EDTA及びカゼイナーゼを有する酵素溶液を添加して培養細胞に酵素処理を行うことにより大量に培養細胞を細胞培養容器から回収した。図７(A)は培養日数６日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、図７(B)は培養日数６日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。図７から本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、大量の培養細胞が適切に回収できたことが理解できる。
　比較例として、住友ベークライト社の細胞培養用シャーレ(２Ｄ培養)に3.0×10７個のBMSCを播種し、培養日数６日で培養した。下記表２は、本実施例にかかる細胞培養装置(３Ｄ培養)を使用した培養細胞の性質と、比較例にかかる培養皿(２Ｄ培養)を使用した培養細胞の性質とを示す。表２に示されるように本実施例にかかる細胞培養装置を使用して培養された細胞は、従来の培養皿による培養された細胞と性質は同じであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例３）
　滑膜由来間葉系幹細胞は非常に高い軟骨分化能及び増殖能を有するため、軟骨や半月板の再生に有用である。実施例３では滑膜由来間葉系幹細胞の培養を試みる。
　細胞培養容器の中空な空間部内に配置された皿状体を、細胞培養容器の下部近傍に位置させた。細胞培養容器の上端の開口部から、細胞培養容器の空間部へ足場、培地、及び、培養対象である細胞を入れた。細胞は1.5×10７個の滑膜由来間葉系幹細胞であった。足場はCESCO社のBioNOC IIマトリックスを3,000枚使用した(３Ｄ培養)。環状体の上下移動のストローク長さは45ｍｍ、環状体の上方向又は下方向への移動速度は1.0ｍｍ/秒とした。環状体の上下移動の周期は1.0回/時間とした。培養日数は７日であった。
　図８は、培養日数毎の細胞の糖消費量(mg/dL/日)を示す図である。細胞の糖消費量は、GlucCellハンディ・グルコースモニター（CESCO社）を用いて測定した。図８に示されるように、本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、適切に細胞が培養されたことが示された。
　７日目に、細胞培養容器内から1.2×108個の大量の滑膜由来間葉系幹細胞を回収した。培養後に、細胞培養容器内に、トリプシン-EDTA、カゼイナーゼ及びコラゲナーゼを有する酵素溶液を添加して培養細胞に酵素処理を行うことにより大量に培養細胞を細胞培養容器から回収した。酵素溶液中においてトリプシン-EDTAは1mg/ml、カゼイナーゼは3.334mg/ml、コラゲナーゼは1mg/mlであった。図９(A)は培養日数７日目における細胞培養容器から回収前の顕微鏡写真図であり、図９(B)は培養日数７日目における細胞培養容器から回収後の顕微鏡写真図である。図９から本実施例にかかる細胞培養装置を使用することにより、大量の培養細胞が適切に回収できたことが理解できる。
　（実施例４）
　大量培養後の滑膜由来間葉系幹細胞における幹細胞性質の保持及び多分化能を確認するため、実施例３による大量培養及び回収後の滑膜由来間葉系幹細胞を用いて、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞への分化誘導を実施した。分化誘導にはR&D System社のHuman Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kitを用いた。24ウエル培養プレートにそれぞれ104個の細胞を接着させた後、脂肪細胞への分化誘導には、キット付属のAdipogenic SupplementとITS SupplementをDMEM基礎培地50mlに添加した分化培地を用いて14日間の培養を行った。軟骨細胞への分化誘導には、キット付属のChondrogenic SupplementとITS SupplementをDMEM基礎培地50mlに添加した分化培地を用いて21日間の培養を行った。骨細胞への分化誘導には、キット付属のOsteogenic SupplementとITS SupplementをDMEM基礎培地50mlに添加した分化培地を用いて21日間の培養を行った。分化誘導後の脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞を同定するため、4％パラフォルムアルデヒド固定後にOilRed-O、Alcian Blue、Alizarin Red染色を実施した。図１０は、本発明の細胞培養装置を使用して大量培養した細胞が多分化可能であることを示す写真図であり、そのうち(A)は軟骨細胞への分化を示す図であり、(B)は脂肪細胞への分化を示す図であり、(C)は骨細胞への分化を示す図である。(A)はAlcian Blueによる染色であり、(B)はOil Red Oによる染色であり、(C)はAlizarin Redによる染色である。図１０の通り、大量培養後の滑膜由来間葉系幹細胞は、幹細胞性質及び多分化能を保持しており、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞へと分化した。
　細胞の培養に利用できる。
　１１０：細胞培養容器
　１２０：底部
　１２５：底部凸部
　１２６：底部凹部
　１３０：空間部
　２００：皿状体
　２２０：貫通孔
　２３０：皿凹部
　２１０：磁着体
　３００：環状体
　３１０：磁着体
　３２０：昇降装置
　７００：振動装置
　７１０：振動部
　９００：細胞培養装置

Claims (5)

  1. 　下端に平坦な底部を有し、細胞を培養するための足場が充填される中空な空間部を備える略円柱体である細胞培養容器と、
    　磁石又は強磁性体からなる複数の磁着体を周辺部に等間隔で備え、前記細胞培養容器の中空な空間部内に前記細胞培養容器の内壁と非接触状態で水平に配置される、前記細胞培養容器の略円柱体の直径よりも微小な直径の略円盤状の皿状体と、
    　前記皿状体の各々の磁着体を磁力により引き付けるように、前記皿状体の各々の磁着体と対応する磁石からなる複数の磁着体を備え、前記細胞培養容器の外側に位置して環内部に前記細胞培養容器を位置させ、上方向に移動することで磁力により連動して前記皿状体を上方向に移動させて前記細胞培養容器の中空な空間部内に充填された足場を下方から押し上げ、下方向に移動することで磁力により連動して前記皿状体を下方向に移動させ、前記細胞培養容器の中空な空間部内に充填された足場を重力落下させる、上下方向に移動する略リング状の環状体と、を有することを特徴とする細胞培養装置。
  2. 　前記皿状体の各々の磁着体は磁石であり、各々の磁石は一方の極を容器外側方向へ向けて前記皿状体に配置されており、
    　前記環状体の各々の磁石は前記皿状体の磁石と対応するように、他方の極を容器内側方向へ向けて前記環状体に配置されている、ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記細胞培養容器は、その底部の中央部に上方へ突出する内部が空間部である底部凸部を有するとともに、培養された細胞に上下方向の振動を加える振動装置の振動部がはめ込まれる前記底部凸部に対応する形状の底部凹部を前記底部の中央部に有し、
    　前記皿状体は、前記細胞培養容器の底部凸部がはめ込まれる皿凹部をその下面の中央部に備える、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
  4. 　前記細胞培養容器内に充填される足場は、複数の細胞支持小片の集合体である、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記培養される細胞は間葉系幹細胞である、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の細胞培養装置。
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