WO2019131760A1 - 核酸の回収方法 - Google Patents

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WO2019131760A1
WO2019131760A1 PCT/JP2018/047845 JP2018047845W WO2019131760A1 WO 2019131760 A1 WO2019131760 A1 WO 2019131760A1 JP 2018047845 W JP2018047845 W JP 2018047845W WO 2019131760 A1 WO2019131760 A1 WO 2019131760A1
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WO
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nucleic acid
carrier
solution
recovering
anionic surfactant
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PCT/JP2018/047845
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翔太 関口
大河 荒井
正照 伊藤
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東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering nucleic acid from a body fluid sample in high yield using an aluminum oxide carrier having a water-soluble neutral polymer adsorbed on the surface, and a kit for recovering nucleic acid.
  • RNAs discovered in recent years are generally single-stranded RNAs of 18 bases or more and 25 bases or less, and are biosynthesized from pre-miRNAs of 60 bases or more and 90 bases or less. These are associated with diseases because they have functions of regulating protein synthesis and gene expression, and are attracting attention as targets for gene analysis.
  • cell-free DNA cfDNA
  • cfDNA which has recently been attracting attention, is a double-stranded DNA having a length of about 1 to 4 times the length of 166 bases corresponding to 1 unit of histone, and is generated in the process of cell death and decomposition.
  • circulating tumor DNA ctDNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • Patent Document 1 discloses a method of recovering a nucleic acid characterized by using a carrier of aluminum oxide to which a water-soluble neutral polymer is adsorbed, and it is shown that the method can recover nucleic acid in high yield. It is done. Specifically, as shown in FIG. 2 described later, the nucleic acid is adsorbed to the carrier under the condition where the chaotropic reagent is present, the elution solution is added to the carrier to which the nucleic acid is adsorbed, and the nucleic acid is eluted and recovered. There is.
  • Patent Document 1 can recover nucleic acid in high yield, but when recovering a very small amount of nucleic acid present in body fluid, further improvement of the recovery amount is desired.
  • the above-mentioned cancer-specific gene mutations are often present in very small amounts in body fluids.
  • it is expected that a trace amount of nucleic acid which can not be recovered by the conventional method is still present in the body fluid.
  • a method for recovering nucleic acids with higher yield is required.
  • the present inventors examined a method capable of recovering nucleic acid with higher yield based on the method of recovering nucleic acid disclosed in Patent Document 1.
  • the present inventors recovered nucleic acid by adding a step of mixing the nucleic acid-adsorbed carrier with a solution containing an anionic surfactant as a step before adding the eluate to the nucleic acid-adsorbed carrier. It has been found that the amount is further improved, and the invention has been completed.
  • a method of recovering a nucleic acid from a body fluid sample which comprises the following steps: Step a) mixing a solution containing a chaotropic agent, a carrier of nucleic acid and a carrier of aluminum oxide having a water-soluble neutral polymer adsorbed on the surface, and adsorbing the nucleic acid to the carrier, Step b) separating the carrier adsorbed with the nucleic acid from the solution mixed in step a); Step c) mixing the carrier separated in step b) with a solution containing an anionic surfactant, Step d) separating the carrier adsorbed with the nucleic acid from the solution mixed in step c); Step e) adding the eluate to the carrier separated in step d) to recover the nucleic acid,
  • a method of recovering nucleic acid comprising (2) The method for recovering nucleic acid according to (1), wherein the nucleic acid is microRNA or cell free DNA.
  • nucleic acid recovery method (3) The method for recovering nucleic acid according to (1) or (2), wherein the body fluid sample is whole blood, serum, plasma, urine or saliva. (4) The method for recovering a nucleic acid according to any one of (1) to (3), wherein the anionic surfactant is a carboxylic acid type, a sulfonic acid type or a sulfuric acid ester type. (5) The anionic surfactant of carboxylic acid type is described in (4) which is caprylate, pelargonate, caprate, laurate, N-decanoyl sarcosine salt or N-lauroyl sarcosine salt Nucleic acid recovery method.
  • a kit for nucleic acid recovery comprising a carrier of aluminum oxide with a water-soluble neutral polymer adsorbed on the surface, a solution containing a chaotropic agent and a solution containing an anionic surfactant.
  • nucleic acids it is possible to recover nucleic acids with a higher yield than conventional methods, so it is expected that it will be possible to recover nucleic acids present in extremely small amounts in body fluids and recover new nucleic acids.
  • the present invention is a method of recovering nucleic acid from a body fluid sample comprising the steps of: Step a) mixing a solution containing a chaotropic agent, a carrier of nucleic acid and a carrier of aluminum oxide having a water-soluble neutral polymer adsorbed on the surface, and adsorbing the nucleic acid to the carrier, Step b) separating the carrier adsorbed with the nucleic acid from the solution mixed in step a); Step c) mixing the carrier separated in step b) with a solution containing an anionic surfactant, Step d) separating the carrier adsorbed with the nucleic acid from the solution mixed in step c); Step e) adding the eluate to the carrier separated in step d) to recover the nucleic acid,
  • a method of recovering nucleic acid comprising
  • a support of aluminum oxide having a water-soluble neutral polymer adsorbed on its surface may be described as the support of the present invention.
  • the method for recovering nucleic acid described in Patent Document 1 is a method which basically performs the following steps a), b) and e) as shown in FIG. Step a) mixing a solution containing a chaotropic agent, a carrier of nucleic acid and a carrier of aluminum oxide having a water-soluble neutral polymer adsorbed on the surface, and adsorbing the nucleic acid to the carrier, Step b) separating the carrier adsorbed with the nucleic acid from the solution mixed in step a); Step e) adding the eluate to the carrier separated in step b) to recover the nucleic acid.
  • the present inventors mix the carrier to which the nucleic acid is adsorbed with an anionic surfactant as a step prior to the step of adding the eluate to the carrier to which the nucleic acid is adsorbed in step e) as shown in FIG. It has been found that the amount of recovered nucleic acid is further improved by adding.
  • the present invention will be described step by step.
  • Step a) is a step of mixing a solution containing a chaotropic reagent, the carrier of the present invention and the nucleic acid, and adsorbing the nucleic acid to the carrier of the present invention.
  • the carrier and a solution containing nucleic acid are mixed in the presence of a chaotropic agent, and the nucleic acid is adsorbed to the carrier of the present invention.
  • the method of mixing the solution containing the chaotropic agent, the carrier of the present invention and the nucleic acid is not particularly limited.
  • pipetting or inversion mixing may be performed, and a device such as a mixer or a vortex may be used.
  • the mixing time is not particularly limited, but may be about 5 minutes or more.
  • the order of mixing the solution containing the chaotropic agent, the carrier of the present invention and the nucleic acid is not particularly limited.
  • the carrier of the present invention may be packed in a column and passed through a solution containing a chaotropic reagent and a nucleic acid.
  • the chaotropic agent used in the present invention is a generic term for substances that generate chaotropic ions, and is a chemical substance having the property of destabilizing the molecular structure of proteins and the like.
  • the chaotropic ion is also called a chaotrope.
  • Specific examples of the chaotropic agent include, for example, guanidine salt, sodium isothiocyanate, sodium iodide, potassium iodide, urea, sodium bromide, potassium bromide, calcium bromide, ammonium bromide, sodium perchlorate, thiocyanate Sodium, potassium thiocyanate, ammonium isothiocyanate, sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride and the like can be mentioned.
  • guanidine salt or urea is preferable.
  • guanidine salts include guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate (guanidine thiocyanate), guanidine sulfate, and guanidine isothiocyanate.
  • guanidine hydrochloride or guanidine thiocyanate is preferable.
  • These salts may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the chaotropic reagent in the mixed solution of the solution containing the chaotropic agent, the carrier of the present invention and the nucleic acid may be 0.5 M or more and 8 M or less, preferably 1 M or more and 8 M or less, more preferably 2 M or more and 8 M or less, most Preferably they are 4 M or more and 7 M or less.
  • Step b) is a step of separating the carrier to which the nucleic acid is adsorbed from the mixture mixed in step a).
  • a method of separation a method of centrifuging the mixture obtained in step a), precipitating a carrier to which nucleic acid is adsorbed, and removing a supernatant may be mentioned.
  • the specific gravity of the carrier to which the nucleic acid is adsorbed is heavier than water, so it can be easily precipitated by centrifugation.
  • the conditions for centrifugation may be 6000 G for 1 minute, and more preferably 10000 G for 1 minute.
  • Other separation methods include methods using ultrafiltration membranes and meshes.
  • the mixture obtained in step a) is passed through an ultrafiltration membrane or mesh having a pore diameter smaller than the particle diameter of the carrier on which the nucleic acid is adsorbed, and the carrier on which the nucleic acid is adsorbed is separated.
  • ultrafiltration membranes are provided as a kit, and centrifugal filtration kits represented by UltraFree (registered trademark) of Merck Co., Ltd. and Nanosep (registered trademark) of Pall Corporation can be obtained and used.
  • step b the following washing treatment may be carried out, if necessary.
  • the body fluid sample origin other than the target nucleic acid is adsorbed on the surface of the carrier of the present invention.
  • washing and decomposition treatments can be performed.
  • washing with water to remove non-specifically adsorbed compounds washing with surfactant to remove non-specifically adsorbed proteins, removal of ions and low molecular weight compounds
  • washing with a solution containing a nonionic surfactant washing with an organic solvent to remove nonspecifically adsorbed hydrophobic compounds
  • proteolytic enzyme to degrade nonspecifically adsorbed proteins
  • Various treatments can be performed such as adding RNAse, adding RNAse to isolate only DNA, and adding DNAse to isolate only RNA. This cleaning process is shown as cleaning step 1 in FIG.
  • Step c) is a step of mixing the carrier separated in step b) with a solution containing an anionic surfactant.
  • the anionic surfactant used in the present invention is a generic name of a surfactant in which an atomic group exhibiting surfactant activity is an anion, and is also called an anionic surfactant.
  • Anions form salts with their counter-ions, cations.
  • lithium salts, sodium salts, potassium salts, ammonium salts, amine salts, hydroxyammonium salts (amino alcohol salts) can be preferably used.
  • Anionic surfactants can be classified according to the type of ionic functional group, and are classified into carboxylic acid type, sulfonic acid type, sulfuric ester type, phosphoric ester type and the like.
  • anionic surfactants of carboxylic acid type, sulfonic acid type and sulfuric acid ester type are preferred.
  • anionic surfactants of carboxylic acid type include caprylate, pelargonate, caprate, laurate, myristate, pentadecylate, palmitate, palmitoleate, margarate, Stearate, oleate, bacnate, linoleate, linolenate, eleostearate, arachidinate, behenate, lignoserinate, cholate, N-decanoyl sarcosine salt, N And lauroyl sarcosine salts and the like, among which caprylate, pelargonate, caprate, laurate, N-decanoyl sarcosine or N-lauroyl sarcosine is preferred.
  • Preferred specific examples of these carboxylic acid salts include sodium caprylate, sodium pelargonate, sodium caprate, sodium laurate, sodium N-decanoyl sarcosine and sodium N-lauroyl sarcosine
  • anionic surfactant of sulfonic acid type are 1-nonanesulfonic acid 1-decanesulfonic acid salt, 1-dodecanesulfonic acid salt, 1-octadecanesulfonic acid salt, 1-undecanesulfonic acid salt, cumene sulfonic acid Sodium salt, octyl benzene sulfonate, dodecyl benzene sulfonate, 1-tetradecane sulfonate, 1-pentadecane sulfonate, naphthalene sulfonate, butyl naphthalene sulfonate, 1-hexadecane sulfonate, bis sulfosuccinate
  • Examples thereof include (2-ethylhexyl) ester salt and 5-sulfoisophthalic acid dimethyl ester salt, and among these, octylbenzenesulfonic acid
  • Preferred examples of these sulfonates include sodium octyl benzene sulfonate and sodium dodecyl benzene sulfonate.
  • dodecylbenzenesulfonic acid such as hard type, soft type and mixed type, and any of them can be preferably used.
  • sulfate type anionic surfactant examples include octyl sulfate, decyl sulfate, dodecyl sulfate, tetradecyl sulfate, hexadecyl sulfate and the like, and among these, octyl sulfate, decyl sulfate and dodecyl sulfate preferable.
  • Preferred specific examples of these sulfate ester salts include sodium octyl sulfate, sodium decyl sulfate and sodium dodecyl sulfate.
  • anionic surfactant used by this invention may contain the ether bond in the alkyl side chain of the said compound.
  • the surfactants listed above may be used alone or in combination of two or more.
  • the final concentration of the anionic surfactant is preferably 0.01% by weight or more and 2% by weight or less, more preferably 0.05% by weight or more and 2% by weight or less, based on the mixed solution in step c), and 0.075% by weight % Or more and 2% by weight or less are more preferable, and 0.075% by weight or more and 1.5% by weight or less are particularly preferable.
  • the concentration of the anionic surfactant can be adjusted by adding it to water or a buffer.
  • a solution containing an anionic surfactant a solution in which an anionic surfactant is dissolved can be used.
  • the solvent water, a neutral to alkaline aqueous solution or buffer can be used.
  • the solution containing an anionic surfactant can also be prepared by neutralizing the free body of an anionic surfactant and forming a salt.
  • dodecyl sulfate can be dissolved in an aqueous solution of sodium hydroxide or a buffer containing sodium to prepare a solution containing sodium dodecyl sulfate.
  • the contact of the anionic surfactant with the carrier can be performed at any time.
  • a carrier may be added and mixed, or a solution containing an anionic surfactant may be prepared with the carrier added.
  • the carrier in the method of mixing the carrier with a solution containing an anionic surfactant, can be immersed in a solution containing an anionic surfactant. After immersion, it may stand still or may be stirred. The stirring may be performed by pipetting or tipping, or may be performed using an apparatus such as a mixer or a vortex.
  • the mixing time is not particularly limited, but may be about one minute, or may be mixed for more than one minute.
  • the carrier of the present invention may be packed in a column, and a solution containing nucleic acid may be passed through.
  • Step d) is a step of separating the carrier to which the nucleic acid is adsorbed from the mixture mixed in step c).
  • the separation method can be performed under the same conditions and methods as in step b).
  • washing may be carried out in the same manner as the washing step 1 described above, if necessary. This is because if the anionic surfactant used in step c) remains in the system, the recovered nucleic acid may affect the subsequent measurement system. This cleaning process is shown as cleaning step 2 in FIG.
  • Step e) is a step of adding an eluate to the carrier of the present invention to which the nucleic acid separated in step d) is adsorbed to recover the nucleic acid.
  • step b) When it is desired to separate the carrier of the present invention and the solution in which the nucleic acid has been eluted by adding the above-mentioned eluate and recovering the nucleic acid, the same conditions and method as in step b) can be used.
  • the method of mixing the carrier to which the nucleic acid is adsorbed and the eluate is not particularly limited.
  • pipetting or inversion mixing may be performed, and a device such as a mixer or a vortex may be used.
  • the mixing time is not particularly limited, but may be about 5 minutes or more.
  • the recovered nucleic acid can be subjected to chemical modification as required.
  • Chemical modifications include fluorescent dye modification to the end of nucleic acid, quencher modification, biotin modification, amination, amination, carboxylation, maleimidization, succinimidation, phosphorylation and dephosphorylation, etc., among others by intercalators Staining is mentioned. These modifications may be introduced by chemical reaction or may be introduced by enzymatic reaction. It is possible to indirectly quantify the nucleic acid by quantifying the modifying group introduced through chemical modification, rather than introducing these modifying groups and quantifying the recovered nucleic acid itself before the above quantification. .
  • nucleic acids are recovered, and particularly in the case of short-chain nucleic acids, they are recovered in high yield, so that it is possible to quantify with high sensitivity in the above quantification.
  • the carrier of the present invention is prepared by adsorbing a water-soluble neutral polymer on the surface of aluminum oxide.
  • the coverage of the surface with the polymer is preferably 7% or more, more preferably 10% or more, still more preferably 20% or more, particularly preferably 30% or more, and most preferably 40% or more.
  • the water-soluble neutral polymer may not be adsorbed at a uniform thickness.
  • the coverage of alumina with a polymer in the carrier of the present invention is calculated by analyzing a potential distribution map acquired by a surface potential microscope (also known as Kelvin probe force microscope; KFM).
  • KFM Kelvin probe force microscope
  • the surface potential microscope for example, NanoScope Iva AFM Dimension 3100 stage AFM system manufactured by Bruker AXS Digital Instruments and the like can be used.
  • the visual field scale of the measurement is performed in the range of 0.5 ⁇ m ⁇ 1 ⁇ m.
  • a surface potential image of aluminum oxide is obtained to obtain an average potential in the field of view.
  • a surface potential image of a water-soluble neutral polymer is obtained to determine an average potential in the field of view.
  • a surface potential image of aluminum oxide to which a water-soluble neutral polymer is adsorbed is obtained, and an average potential in the field of view is determined.
  • the coverage of aluminum oxide alone is 0%, coverage of only water-soluble neutral polymer is 100%, and the average potential of aluminum oxide adsorbed by the water-soluble neutral polymer and the average potential of the water-soluble neutral polymer are By taking the ratio, the surface coverage of aluminum oxide to which a water-soluble neutral polymer is adsorbed is calculated.
  • the surface coverage as the average potential in the visual field to be used, three particles of the carrier of the present invention are randomly selected, and the average value of the respective measured values is used.
  • Adobe Photoshop can be used as image analysis software for calculating the surface coverage.
  • the average value of the surface potential of aluminum oxide is the lower end of the scale
  • the average value of the surface potential of the water-soluble neutral polymer is the upper end of the scale
  • the color of the lower end is black (8 bits, RGB value 0)
  • upper end Is set to red (R value 255) or green (G value 255) or blue (B value 255).
  • a surface potential image of aluminum oxide to which a water-soluble neutral polymer is adsorbed is displayed at a set scale, one of R value, G value or B value is divided by 255, and the ratio is defined as the surface coverage.
  • aluminum oxide Before the water-soluble neutral polymer is adsorbed on the surface, aluminum oxide may be washed in advance with a solution such as water or ethanol to remove impurities adsorbed on the surface, and this washing operation is omitted. May be
  • a method of adsorbing a water-soluble neutral polymer to the surface of aluminum oxide for example, a method of dissolving a water-soluble neutral polymer to prepare a water-soluble neutral polymer solution and contacting it with aluminum oxide can be mentioned. Specifically, the aluminum oxide is dipped in a water-soluble neutral polymer solution, the water-soluble neutral polymer solution is dropped onto the aluminum oxide, the water-soluble neutral polymer solution is applied to the aluminum oxide, A water soluble neutral polymer solution can be atomized and sprayed onto aluminum oxide.
  • the method of immersing aluminum oxide in the water-soluble neutral polymer solution is not particularly limited.
  • stirring may be performed by pipetting, inversion mixing, a stirrer, a mixer, a disperser such as a mixer, a vortex, a mill, or a sonication apparatus.
  • the water-soluble neutral polymer concentration is not particularly limited, but is preferably 0.01 wt% or more, more preferably 0.1 wt% or more.
  • the mixing time for stirring is not particularly limited as long as the water-soluble neutral polymer and aluminum oxide are uniformly mixed, but in the case of a vortex, it is preferable to stir for 1 minute or more, preferably 5 minutes or more. .
  • a water soluble neutral polymer can be dip coated on aluminum oxide using a sieve or a sieve.
  • the mixing time at the time of immersion in the solution may be 5 minutes or more if the polymer concentration is 0.1 wt% or more, and preferably 30 minutes or more.
  • a dropper When the water-soluble neutral polymer solution is dropped, a dropper, a dropping funnel or the like can be used.
  • the aluminum oxide When dropping the polymer solution, the aluminum oxide may be vibrated or rotated, or a spin coater may be used.
  • a brush, a roller or a wire bar When applying a water-soluble neutral polymer solution, a brush, a roller or a wire bar can be used.
  • aqueous neutral polymer solution When the aqueous neutral polymer solution is atomized and sprayed, an air spray, an air brush or the like can be used.
  • centrifugation may be performed to remove the polymer solution to be the supernatant, or without performing the centrifugation operation. You may use for collection
  • aluminum oxide may be adsorbed with a water-soluble neutral polymer, and after removing the solvent, it may be dried or may be used for recovery of nucleic acid without drying. It is also good.
  • the carrier of the present invention may be prepared in advance and stored, or may be used after preparation.
  • the water-soluble neutral polymer solution can be prepared by dissolving in water or an organic solvent if the obtained water-soluble neutral polymer is solid, and can be prepared by diluting the solution.
  • heat treatment or ultrasonic treatment may be performed.
  • the organic solvent it is preferable to use, for example, ethanol, acetonitrile, methanol, propanol, tert-butanol, DMF, DMSO, acetone, ethylene glycol, glycerol and the like which are bi-soluble with water.
  • the above-mentioned organic solvent may be added.
  • a carrier produced by covalently bonding aluminum oxide and a water-soluble neutral polymer by a linker molecule or the like does not correspond to the carrier of the present invention.
  • Specific linker molecules include silane coupling agents and the like.
  • a carrier prepared by immobilizing a polymer or the like by forming an amide bond, an ester bond, a Michael addition reaction product of thiol and maleimide, a disulfide bond, a triazole ring and the like after functionalization with such a silane coupling agent is also possible. It does not fall under the carrier of the present invention.
  • the kit for nucleic acid recovery of the present invention can be used to efficiently recover nucleic acid from a body fluid sample.
  • the kit for nucleic acid recovery of the present invention comprises, as its component, a carrier of aluminum oxide in which a water-soluble neutral polymer is adsorbed on the surface, a solution containing a chaotropic reagent, and a solution containing an anionic surfactant A buffer may be included.
  • the kit may also include kit specifications and instructions.
  • the aluminum oxide carrier having a water-soluble neutral polymer adsorbed on its surface which is contained in the kit for nucleic acid recovery of the present invention, may be in a dried state or in a solution of the water-soluble neutral polymer. It may be in an immersed state.
  • a buffer that can be used for the eluate of the above step e) can be used.
  • Nucleic acids include, for example, RNA, DNA, RNA / DNA (chimeric) and artificial nucleic acids.
  • DNA include cDNA, micro DNA (miDNA), genomic DNA, synthetic DNA, cell free DNA (cfDNA), ctDNA, mitochondrial DNA (mtDNA) and the like.
  • RNA also includes total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA or non-coding RNA, their precursors or synthetic RNA, and the like.
  • Synthetic DNA and synthetic RNA can be artificially produced based on a predetermined base sequence (either a natural type sequence or a non-natural type sequence), for example, using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • body fluids such as blood, urine, saliva, mucous membranes, sweat, sputum and semen can be used.
  • the body fluid sample is preferably blood, urine, saliva.
  • Blood includes whole blood, plasma, serum, blood cells and the like.
  • the present invention may be applied to these body fluid samples as they are after collection, or the solution may be added and diluted after collection. If there are many precipitates or floats in the body fluid sample, they may be pelleted by centrifugation and only the supernatant may be used. Also, it may be used after passing through a filter or the like. The supernatant or the body fluid sample after passage may be diluted with water or buffer solution and then used in the present invention.
  • the body fluid sample may be treated as follows, as necessary.
  • nucleic acids are encapsulated in cell membranes, cell walls, vesicles, liposomes, micelles, ribosomes, ribosomes, histones, nuclear membranes, mitochondria, viral capsids, envelopes, endosomes or exosomes etc. And they often interact with each other.
  • processing may be performed for the purpose of releasing them.
  • the following treatment can be performed.
  • a mixture of 0.2 M sodium hydroxide and 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) can be added to a body fluid sample containing E. coli (alkaline denaturation method), and a 10% sarcosyl solution It can also be added (non-denaturing method with sarkosyl).
  • lysozyme may be added to these solutions.
  • treatment with proteinase K can be carried out at 37 ° C. for 1 hour. Sonication can also be performed as another method.
  • the following treatment can be performed.
  • 10% SDS can be added after treatment with zymolyase commercially available from Seikagaku Corporation.
  • the following treatment can be performed.
  • 1% SDS or Triton X can be added.
  • guanidinium chloride, guanidine thiocyanate, urea and the like may be added, for example, to a final concentration of 4 M or more.
  • sarkosyl may be added to 0.5% or more.
  • mercaptoethanol may be added to a concentration of 50 mM or more.
  • an inhibitor of nucleic acid degradation enzyme may be added.
  • EDTA can be added at a concentration of 1 mM or less.
  • RNasin Plus Ribonuclease Inhibitor Promega Co., Ltd.
  • Ribonuclease Inhibitor Takara Bio Inc.
  • RNase inhibitor Toyobo Co., Ltd.
  • DNA and RNA are mixed in a body fluid sample, they can also be separated by phenol / chloroform extraction.
  • phenol-chloroform extraction is performed under acidic conditions, RNA is separated into an aqueous layer, DNA is separated into chloroform layers, and under neutral conditions, RNA and DNA are partitioned into an aqueous phase.
  • conditions can be selected according to the type of nucleic acid to be obtained. Chloroform above can also be substituted for p-bromoanisole.
  • Phenol / chloroform extraction is a commercially available reagent ISOGEN (registered trademark: Nippon Gene Co., Ltd.), TRIzol (registered trademark: Life Technologies Japan Co., Ltd.), RNAiso (Takara Bio Inc.), 3D-Gene® RNA extraction reagent It is also possible to use the from liquid sample kit (Toray Industries, Inc.). The above process may be performed only in one process or may be combined with the process in another operation. Also, the concentration of the solution used can be changed as needed.
  • a body fluid sample or a dilution thereof can be used as a solution containing a nucleic acid in the present invention.
  • a solution obtained by mixing a solution in which a nucleic acid, an artificial nucleic acid, or a nucleic acid to which a modification such as a dye or a phosphate group has been made is dissolved can be used.
  • the solution obtained after any of the above treatments may be used as it is for the body fluid sample, or may be diluted as necessary.
  • the solution to be diluted is not particularly limited, but it is preferable to use a solution widely used for a solution containing nucleic acid such as water or HEPES buffer or Tris-hydrochloric acid buffer.
  • the length of the nucleic acid to be recovered is not particularly limited, but is preferably 1000 base pairs or less.
  • the present invention can recover nucleic acids of 300 base pairs or less such as cell free DNA and ctDNA which are difficult in the prior art with high yield, and pre-miRNAs and miRNAs of 100 base pairs or less in high yield. It can be recovered.
  • the recovered amount of nucleic acid can be measured as follows. For example, absorbance measurement, fluorescence measurement, luminescence measurement, electrophoresis, PCR, RT-PCR, analysis using a microarray, analysis using a sequencer, and the like can be mentioned. If it is an unmodified nucleic acid, the amount of nucleic acid can be quantified by measuring the absorbance at 260 nm. In addition, if the fluorescent dye is a modified nucleic acid, the amount of nucleic acid can be quantified by comparing the fluorescence intensity derived from the fluorescent dye with the fluorescence intensity in a solution of known concentration. In addition, it can carry out by electrophoresis. The method of calculating the recovery rate by electrophoresis can be determined by migrating a sample subjected to a recovery operation simultaneously with a sample having a known concentration, staining the gel, and comparing the concentration of bands by image analysis.
  • the yield of nucleic acid can be compared by comparing detection values using a nucleic acid detection method such as a DNA chip or real time PCR.
  • a nucleic acid detection method such as a DNA chip or real time PCR.
  • a detection system such as a DNA chip
  • the yield can be compared by acquiring a fluorescence image using a scanner and digitizing the fluorescence signal intensity for each gene.
  • the fluorescence signal intensity of each gene can be compared, and when different techniques are compared, it can be judged that the higher the signal value, the higher the yield.
  • fluorescence signal sum value the sum of the fluorescence signals for each gene (fluorescence signal sum value)
  • real-time PCR an amplification curve is obtained in which the cycle number is plotted on the abscissa and the fluorescence intensity is plotted on the ordinate. The number of cycles (Cq value, Ct value) at which a constant signal intensity is reached in this amplification curve is determined.
  • RNA such as miRNA or mRNA
  • it can be measured and detected in the same manner as DNA except for adding a reverse transcription step, and it can be judged that the smaller the Ct value or Cq value at that time, the higher the yield.
  • a polymer is a generic name of a monomer as a basic unit and a compound in which a large number of repeating units called a monomer are connected.
  • the polymers used in the carrier of the present invention include both homopolymers consisting of one kind of monomer and copolymers consisting of two or more kinds of monomers, and also polymers of any degree of polymerization. Also included are both natural and synthetic polymers.
  • the water-soluble neutral polymer used in the carrier of the present invention has the property of being soluble in water, and the solubility in water is at least 0.0001 wt% or more, preferably 0.001 wt% or more, and more
  • the polymer is preferably 0.01 wt% or more, more preferably 0.1 wt% or more.
  • the water-soluble neutral polymer used for the carrier of the present invention is preferably a polymer having a zeta potential of ⁇ 10 mV or more and 10 mV or less in a solution of pH 7. It is more preferably ⁇ 8 mV or more and 8 mV or less, still more preferably ⁇ 6 mV or more and 6 mV or less, and particularly preferably a polymer of ⁇ 4.0 mV or more and 1.1 mV or less.
  • the zeta potential is one of values representing the electrical properties of the interface of the colloid in the solution.
  • an electric double layer is formed on the surface of the colloid by the counter ion to the surface charge of the colloid.
  • the potential of the colloid surface at this time is called surface potential.
  • the electric double layer is formed by the electrostatic interaction of the surface charge of the colloid, so the ions are more strongly fixed on the colloid side.
  • a layer in which counter ions are strongly fixed to the colloid surface by electrostatic interaction is called a fixed layer, and the potential of the fixed layer is called a fixed potential.
  • the surface of the colloid can be approximately expressed as a sliding surface.
  • the surface potential of the colloid dispersed in the solution can be regarded as the zeta potential.
  • the zeta potential can be determined using electrokinetic phenomena such as electrophoresis, electroosmosis, backflow potential, precipitation potential, etc., and the electrophoresis by electrophoresis, the rotational electrophoresis, the laser doppler electrophoresis , Ultrasonic vibration potential method, electrokinetic sound method and the like. These measurements can be performed by using a zeta potential measuring device.
  • the zeta potential measuring device is manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd., Malvern Instruments Ltd. , Ranku Brother Ltd. , PenKem Inc. It is marketed from etc.
  • Laser-Doppler electrophoresis is a measurement method using the Doppler effect in which light or sound wave strikes an object moving by electrophoresis, and changes its frequency when it is scattered or reflected.
  • the polymer solution can be prepared as a colloidal dispersion solution, and the zeta potential can be measured.
  • the polymer is dissolved in an electrolyte such as a phosphate buffer solution, a sodium chloride solution, or a citrate buffer solution to prepare a polymer solution, and the scattered light or reflected light of the polymer dispersed in the solution is detected and measured. Do. The larger the size of the colloid, the less light it is possible to detect scattered or reflected light.
  • the specific conditions for measuring the zeta potential of the polymer by the laser Doppler method are not particularly limited, for example, it is dissolved in phosphate buffer (10 mM, pH 7) so that the concentration of the polymer is 1 wt% or more and 10 wt% or less.
  • the solution can be placed in a measuring cell and placed in a zeta potential measuring device based on the laser-Doppler electrophoresis method to measure at room temperature.
  • ELS-Z manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. can be used as the zeta potential measurement device.
  • water-soluble neutral polymer used for the carrier of the present invention include the following.
  • polyvinyl type polymers such as polyvinyl alcohol or polyvinyl pyrrolidone
  • polyacrylamide type polymers such as polyacrylamide, poly (N-isopropyl acrylamide) or poly (N- (hydroxymethyl) acrylamide
  • Polymers of polyalkylene glycol type such as glycol, poly (2-ethyl-2-oxazoline), (hydroxypropyl) methylcellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose such as 2-hydroxyethyl cellulose or hydroxypropyl cellulose can be used.
  • copolymers containing the above-mentioned polymers can also be used.
  • polysaccharides such as ficoll, agarose, chitin and dextran, analogues of these polysaccharides, proteins and peptides such as albumin are also included in the water-soluble neutral polymer used in the carrier of the present invention.
  • a part of the functional group of the water-soluble neutral polymer may be ionized, substituted with a functional group showing positive or negative, or a functional group expressing water solubility such as an acetyl group may be introduced into the side chain.
  • a polymer of 0.4 kD or more can be preferably used, and more preferably 6 kD or more.
  • Aluminum oxide used for the support of the present invention is an amphoteric oxide represented by a composition formula of Al 2 O 3 and is also called alumina.
  • the aluminum oxide one produced naturally may be used, or one produced industrially may be used.
  • the alkoxide method also called sol-gel method
  • a hydroxide of boehmite form neutralization method
  • oil droplet method aluminum salt
  • thermal decomposition method anodic oxidation method.
  • Industrially produced aluminum oxide can be obtained from a reagent manufacturer, a catalyst chemistry manufacturer, or a reference catalyst group of the General Catalyst Association of Japan.
  • Aluminum oxide is classified into alpha aluminum oxide, low aluminum oxide, chilo aluminum oxide, kappa aluminum oxide, eta aluminum oxide, gamma aluminum oxide, delta aluminum oxide, theta aluminum oxide, etc. according to the crystal structure which they have.
  • gamma aluminum oxide having a high specific surface area is preferred.
  • the acid point (Al + , Al—OH 2 + ) and the base point (Al—O ⁇ ) change depending on the firing temperature at the time of preparation.
  • Aluminum oxide is classified into acidic alumina according to the number of acid points and basic points according to the number of acid points and basic points, basic alumina according to the number of basic points, and neutral alumina with the same degree of acid points and basic points.
  • the difference in this property can be confirmed by adding a pH indicator BTB solution.
  • BTB solution By adding the BTB solution, it is possible to confirm that the alumina is acidic alumina if it is colored yellow, neutral alumina if it is colored green, or basic alumina if it is colored blue.
  • any aluminum oxide can be used in the present invention.
  • Aluminum oxide is preferably granular.
  • the particle sizes may be uniform or different particle sizes may be mixed and used.
  • the particle size for example, aluminum oxide of less than 212 ⁇ m can be preferably used, and more preferably aluminum oxide of less than 100 ⁇ m can be used.
  • the particle size is defined by the size of a sieve mesh based on JIS Z-8801-1: 2006 which is standardized to Japanese Industrial Standard.
  • a sieve mesh based on JIS Z-8801-1: 2006 which is standardized to Japanese Industrial Standard.
  • particles that can not pass through a 40 ⁇ m sieve and pass through a 40 ⁇ m sieve according to the above JIS standard and can not pass through a 32 ⁇ m sieve have a particle diameter of 32 ⁇ m or more and less than 40 ⁇ m.
  • the eluate used in step e) is not particularly limited as long as it can elute the nucleic acid adsorbed to the carrier of the present invention, but a buffer is preferred, and the buffer may contain a chelating agent.
  • EDTA was added to a citrate buffer containing citric acid and sodium citrate, a phosphate buffer containing phosphoric acid and sodium phosphate, and a Tris-hydrochloride buffer containing trishydroxyaminomethane and hydrochloric acid. Tris-EDTA buffer etc. are mentioned.
  • the pH of the buffer solution is preferably 4 or more and 9 or less, and more preferably 5 or more and 8 or less.
  • Water or a buffer can be used for the eluate used in step e), and a buffer is preferred.
  • the buffer solution is a phosphate buffer containing phosphoric acid and sodium phosphate, a citric acid buffer containing citric acid and sodium citrate, and a Tris-hydrochloric acid buffer containing trishydroxyaminomethane and hydrochloric acid, and Tris added with EDTA.
  • -EDTA buffer etc. can be preferably used.
  • a citrate buffer containing citric acid and sodium citrate, and a Tris-EDTA buffer obtained by adding EDTA to Tris-hydrochloride buffer containing trishydroxyaminomethane and hydrochloric acid are buffers having a chelating action.
  • the pH of the buffer solution is preferably 4 or more and 9 or less, and more preferably 5 or more and 8 or less.
  • a chelating agent may be added to the buffer to impart a chelating action to the buffer.
  • a chelating agent is a substance having a ligand having a plurality of coordination sites and capable of binding to a metal ion to form a complex, and a buffer containing a chelating agent has a chelating action.
  • Specific chelating agents added to the buffer include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA), phosphoric acid, polyphosphoric acid, triphosphoric acid, metaphosphoric acid, phytic acid And / or their salts and the like.
  • the final concentration of the chelating agent is preferably 50 mM or more, more preferably 100 mM or more, and still more preferably 500 mM or more.
  • an anionic polymer can be mentioned as a compound to be a chelating agent other than the above.
  • a polymer having a carboxylic acid in its side chain may be contained in a buffer because it coordinates a metal ion.
  • polyvinyl sulfonic acid and / or their salts are mentioned as a polymer which has such a function.
  • the final concentration is not particularly limited, but may be 1 wt% or more, preferably 10 wt% or more.
  • the above chelating agents may be used alone or in combination.
  • Polyethylene glycol is from Merck Co., Ltd.
  • gamma aluminum oxide N 613 N
  • Sodium dodecyl sulfate (SDS) is a 10% aqueous solution from Invitrogen Co., Ltd., sodium dodecyl benzene sulfonate, sodium laurate, N- Lauroyl sarcosine sodium was obtained from Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • the other reagents were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo Kasei Co., Ltd., Sigma-Aldrich Japan GK, and used as they were without particular purification.
  • the mixer used was CUTE MIXER CM-1000 manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd., and the centrifuge used a CT15 RE manufactured by Hitachi.
  • the carrier of the present invention was prepared as follows and used in the following examples and comparative examples. 0.5 mg of aluminum oxide was weighed into 1.5 ml tubes. To this, 50 ⁇ l of a water-soluble neutral polymer polyethylene glycol (PEG, 10 kD) at a concentration of 10 wt% was added as a polymer aqueous solution, and the mixture was stirred for 10 minutes. The supernatant was centrifuged (10000 G, 1 min) to remove 45 ⁇ l of the supernatant to obtain a carrier of aluminum oxide having polyethylene glycol, which is a water-soluble neutral polymer, adsorbed on the surface.
  • PEG water-soluble neutral polymer polyethylene glycol
  • Human serum was used as a solution containing nucleic acid.
  • 7M GTN, 450 ⁇ l of 25 mM HEPES (pH 7) solution, 100 ⁇ l of human serum, and the aluminum oxide carrier prepared above were mixed, and stirred with a mixer for 15 minutes.
  • Step b) The solution mixed in step a) was centrifuged (10000 G, 1 min) to remove the supernatant, and the carrier to which the nucleic acid was adsorbed was separated.
  • step d) The solution mixed in step c) was centrifuged (10000 G, 1 min), the supernatant was discarded, and the carrier to which the nucleic acid was adsorbed was separated.
  • the DNA chip is scanned using a 3D-Gene (registered trademark) scanner (Toray Industries, Inc.), an image is acquired, and the fluorescence signal intensity of each miRNA amount is obtained with 3D-Gene (registered trademark) Extraction (Toray Industries, Inc.) Was quantified.
  • the respective quantified fluorescence signal intensities were divided by the blank value, and this value was taken as the S / N value.
  • S / N values were summed for fluorescence signal intensities of 1.5 or more (fluorescent signal summation values).
  • the results of Examples 1 and 2 are shown in Table 1.
  • Example 3 Nucleic acid was recovered in the process of removing the washing step 1 from the recovery step of Example 1. The other conditions and procedures were the same as in Example 1, and a DNA chip was used to sum the miRNA fluorescence intensities in blood. The results are shown in Table 1.
  • Comparative Examples 1 and 2 In the present comparative examples 1 and 2, nucleic acids were recovered under the same conditions and operations as in the examples 1 and 2 except that the step c) and the step d) were omitted. That is, the present comparative example corresponds to the method for recovering nucleic acid described in Patent Document 1. The results are shown in Table 1.
  • Comparative Examples 1 and 2 namely Patent Document 1 It was found that the fluorescence signal total value was improved and the nucleic acid recovery amount was increased compared to the method.
  • step a) of Example 1 the nucleic acid was recovered under the conditions without using the chaotropic reagent.
  • step a) a mixed solution of 100 ⁇ l of human serum and 450 ⁇ l of 25 mM HEPES (pH 7) solution was used as a solution containing nucleic acid.
  • the other conditions and procedures were the same as in Example 1, and the DNA chip was used to sum the miRNA fluorescence intensities in blood. The results are shown in Table 2.
  • step c) the amount of nucleic acid recovered from the body fluid sample was low and the fluorescence signal total value was also low when no chaotropic reagent was used in step a).
  • step a 0.5% SDS, 25 mM HEPES (pH 7) was used instead of 7 M guanidine thiocyanate (GTN).
  • step c 7 M guanidine thiocyanate (GTN), 25 mM HEPES (pH 7) was used instead of 0.5% SDS, 25 mM HEPES (pH 7).
  • the other conditions and procedures were the same as in Example 1, and the DNA chip was used to calculate the sum of miRNA fluorescence intensities in blood. The results are shown in Table 2.
  • nucleic acid is adsorbed to the carrier in the presence of a chaotropic reagent, and the nucleic acid is adsorbed to the carrier and then the amount of recovered nucleic acid, fluorescence is not obtained by the method of adding an anionic surfactant. An improvement in the signal sum value could not be confirmed.
  • step a) of Example 1 the nucleic acid was adsorbed to the carrier of the present invention using both a chaotropic reagent and an anionic surfactant, and nucleic acid was recovered except for step c) and step d).
  • step a) a mixed solution of 7 M guanidine thiocyanate (GTN) and 0.5% SDS, 25 mM HEPES (pH 7) was used.
  • GTN guanidine thiocyanate
  • SDS 25 mM HEPES
  • step a) when step c) and step d) are not performed, the amount of nucleic acid recovered from the body fluid sample is low and the total value of the fluorescence signal is low. I understand.
  • Example 1 0.5% SDS of step c) in Example 1 is an anionic surfactant 0.5% sodium dodecylbenzene sulfonate (Example 4) 0.5% N-lauroyl sarcosine sodium (Example 5)
  • the nucleic acid was recovered in the same manner as in Example 1 except that each was substituted by 0.25% sodium laurate (Example 6) and the other conditions and procedures were the same. The results are shown in Table 3.
  • step c) increases the nucleic acid recovery amount and improves the fluorescence signal total value.
  • Example 7 The SDS concentration of step c) in Example 1 was set to 1% (Example 7), 0.1% (Example 8), and 0.075% (Example 9), and the nucleic acids were recovered. Other conditions and operations were performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 4.
  • Example 10 In step a) in Example 1, 7 M guanidine hydrochloride (Example 10) or 8 M urea (Example 11) is used instead of 7 M guanidine thiocyanate, and the other conditions and procedures are the same as in Example 1.
  • the nucleic acid was recovered as described above. The results are shown in Table 5.
  • step a) increases the amount of nucleic acid recovered from the body fluid sample and improves the fluorescence signal total value.
  • Example 12 The guanidine thiocyanate concentration of the chaotropic agent used in step a) of Example 1 is 4 M (Example 12), 2 M (Example 13), 1 M (Example 14), and 0.5 M (Example 15).
  • the other conditions and procedures were the same as in Example 1 and nucleic acids were recovered. The results are shown in Table 6.
  • Example 16 Example 2 and Example 2 except that 300 ⁇ l of plasma was used as a body fluid sample, 450 ⁇ l of 7 M guanidine thiocyanate (GTN) was used as a chaotropic agent, and 50 ⁇ l of 0.5 M phosphate buffer (pH 7) was used as an eluent.
  • GTN guanidine thiocyanate
  • pH 7 50 ⁇ l of 0.5 M phosphate buffer
  • SYBR registered trademark
  • CFX 96-Real Time System from Bio-Rad, Inc.
  • SYBR registered trademark
  • CFX 96-Real Time System from Bio-Rad, Inc.
  • a nucleic acid of 93 bp was amplified and analyzed as an amplification cycle number (Cq value).
  • primers for amplifying this nucleic acid based on the description of PrimePCR Assays, Panels, and Controls Instruction Manual (Bio-Rad Laboratories Inc.), the nucleic acids shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 are designed, and these are They were purchased from Fingenomics Co., Ltd. and used as they were without purification.
  • 1.0 ⁇ L of the primers represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 prepared with 12.5 ⁇ L of SYBR Premix Ex Taq on ice on 0.5 ⁇ M, 8.5 ⁇ L of sterile distilled water, a sample of the nucleic acid recovered in this example was diluted 10 times with sterile distilled water, and 2 ⁇ L was mixed in a 1.5 mL tube to a total volume of 25 ⁇ L. The whole amount was added to a plate for real-time PCR, covered with a plate sheet, and set in an apparatus. For the measurement conditions of real-time PCR, after dividing double-stranded DNA into single-stranded DNA at 95 ° C. for 30 sec, the primer was annealed at 95 ° C.
  • Comparative Example 6 A nucleic acid is recovered under the same conditions and procedures as in Example 2 except that steps c) and d) are removed, and the amount of recovered cell-free DNA is analyzed as a Cq value of real-time PCR in the same manner as in Example 16. did.
  • step c) and step d) were not performed, it was found that the recovery amount of cell free DNA from the plasma sample was low and the Cq value was large.

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Abstract

本発明の方法は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を用いて、体液試料から核酸を回収する方法であって、カオトロピック試薬の存在下で核酸を担体に吸着させ、核酸が吸着した担体に対し、アニオン性界面活性剤を含む溶液を添加する工程を含む方法である。

Description

核酸の回収方法
　本発明は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体により、体液試料から高収量に核酸を回収する方法及び核酸回収用のキットに関する。
　核酸を用いた実験技術の発展により新規遺伝子探索やその解析が可能となった。がんなどの疾患を特定するためにヒトのゲノムが解析され、病原体の感染を特定するためにそれらのゲノムが解析されるなど、医療現場においても遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われている。特に近年では、血液や尿などの体液試料から遺伝子を回収して検出することが低侵襲な検査として期待されている。
　このような体液中の遺伝子解析の標的としては、ゲノムのような長鎖核酸ばかりではなく、１０００塩基以下の短鎖核酸も注目されている。近年発見されたｍｉＲＮＡは、一般に、１８塩基以上２５塩基以下の１本鎖ＲＮＡであり、６０塩基以上９０塩基以下のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡから生合成される。これらは、タンパク質の合成や遺伝子の発現を調節する機能を持っていることから疾患と関連があるとされ、遺伝子解析の標的として注目されている。また、近年注目されるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、ヒストン１単位に相当する１６６塩基の１～４倍程度の長さを有する２本鎖ＤＮＡであり、細胞が死滅し、分解する過程で生成する。セルフリーＤＮＡの中でも特にがん細胞由来のものは血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）と呼ばれ、がん特有の遺伝子変異を有していることから、治療薬に対する効果の有無を判定したり、がんの有無を検査する標的として注目されている。
　特許文献１には、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの担体を用いることを特徴とする核酸の回収方法が開示されており、その方法によれば高い収量で核酸を回収できることが示されている。具体的には、後述する図２に示すように、カオトロピック試薬が存在する条件下で担体に核酸を吸着させ、核酸が吸着した担体に対して溶出液を加えて核酸を溶出して回収している。
国際公開第２０１６／１５２７６３号
　特許文献１に記載の方法は、高い収量で核酸を回収することができるが、体液中に極微量存在する核酸を回収する場合には、回収量の更なる向上が望まれる。例えば、上記のがん特有の遺伝子変異は、体液中に極微量しか存在していない場合が多い。また、従来方法では回収できていない微量核酸が、体液中はまだ存在していると予想される。このような核酸を解析するためには、より高い収量で核酸を回収する方法が必要となる。
　本発明者らは、特許文献１に開示されている核酸の回収方法を基に、より高い収量で核酸を回収可能な方法を検討した。本発明者らは、核酸が吸着した担体に溶出液を添加する前の工程として、核酸が吸着した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程を追加することによって、核酸の回収量がさらに向上することを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下のとおりである。
（１）体液試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｃ）工程ｂ）において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
工程ｄ）工程ｃ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｅ）工程ｄ）において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含む、核酸の回収方法。
（２）前記核酸が、マイクロＲＮＡまたはセルフリーＤＮＡであることを特徴とする（１）に記載の核酸の回収方法。
（３）前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿または唾液であることを特徴とする（１）または（２）に記載の核酸の回収方法。
（４）前記アニオン性界面活性剤が、カルボン酸型、スルホン酸型または硫酸エステル型である（１）から（３）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（５）前記カルボン酸型のアニオン性界面活性剤が、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、Ｎ－デカノイルサルコシン塩またはＮ－ラウロイルサルコシン塩である（４）に記載の核酸の回収方法。
（６）前記スルホン酸型のアニオン性界面活性剤が、オクチルベンゼンスルホン酸塩またはドデシルベンゼンスルホン酸塩である（４）に記載の核酸の回収方法。
（７）前記硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤が、オクチル硫酸塩デシル硫酸塩またはドデシル硫酸塩である（４）に記載の核酸の回収方法。
（８）前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で－１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする（１）から（７）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（９）前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする（８）に記載の核酸の回収方法。
（１０）前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（１１）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、カオトロピック試薬を含む溶液およびアニオン性界面活性剤を含む溶液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
　本発明によれば、従来方法よりも高い収率で核酸を回収することが可能となるため、体液中に極微量存在する核酸の回収や、新規な核酸の回収が可能になると期待される。
本発明の核酸の回収方法の各工程の概要を示す。 特許文献１に記載の核酸の回収方法の一例を示す。
　本発明は、体液試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：
工程ａ）カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｃ）工程ｂ）において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
工程ｄ）工程ｃ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｅ）工程ｄ）において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含む、核酸の回収方法である。
　本明細書中では、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を本発明の担体と記載する場合がある。
　特許文献１の記載の核酸の回収方法は、図２に示すとおり、以下の工程ａ）、工程ｂ）および工程ｅ）を基本工程する方法である。
工程ａ）カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程ｅ）工程ｂ）において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程。
　本発明者らは、図１に示すとおり、工程ｅ）の核酸が吸着した担体に、溶出液を加える工程の前工程として、核酸が吸着した担体をアニオン性界面活性剤と混合する工程ｃ）を追加することによって、核酸の回収量がさらに向上することを見出した。以下、本発明を工程毎に説明する。
　工程ａ）は、カオトロピック試薬、本発明の担体および核酸を含む溶液を混合し、本発明の担体に核酸を吸着させる工程である。工程ａ）では、カオトロピック試薬の存在下で、担体と、核酸を含む溶液を混合し、本発明の担体に核酸を吸着させる。
　カオトロピック試薬、本発明の担体及び核酸を含む溶液の混合方法は特に限定されないが、例えばピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが、５分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、カオトロピック試薬、本発明の担体及び核酸を含む溶液を混合する順番は特に限定されない。例えば、本発明の担体をカラムに充填し、カオトロピック試薬と核酸を含む溶液を通過させてもよい。
　本発明で用いるカオトロピック試薬は、カオトロピックイオンを生じる物質の総称であり、タンパク質などの分子構造を不安定化する性質を持つ化学物質である。カオトロピックイオンは、カオトロープとも呼ばれる。カオトロピック試薬の具体例としては、例えば、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウムなどが挙げられる。これらの中でも、グアニジン塩または尿素が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジンが挙げられ、これらの中でも、塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は、単独で用いても複数組み合わせて用いてもよい。
　カオトロピック試薬、本発明の担体および核酸を含む溶液を混合液において、カオトロピック試薬の濃度は、０．５Ｍ以上８Ｍ以下であればよく、好ましくは１Ｍ以上８Ｍ以下、更に好ましくは２Ｍ以上８Ｍ以下、最も好ましくは４Ｍ以上７Ｍ以下である。
　工程ｂ）は、工程ａ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程である。分離の方法としては、工程ａ）で得られる混合物を遠心分離し、核酸が吸着した担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。核酸が吸着した担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することがより好ましい。他の分離方法としては、限外ろ過膜やメッシュを用いる方法が挙げられる。核酸が吸着した担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜やメッシュに対し、工程ａ）で得られた混合物を通過させ、核酸が吸着した担体を分離する。このような限外ろ過膜はキット化されており、メルク株式会社のウルトラフリー（登録商標）やＰａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのナノセップ（登録商標）に代表される遠心ろ過キットを入手して利用することができる。
　また、工程ｂ）の操作の後に、必要に応じて以下のような洗浄処理をしてもよい。これは、工程ａ）の後に、本発明の担体の表面に目的となる核酸以外の体液試料由来物が吸着している可能性があるためである。例えば、より高純度に核酸を単離するため、洗浄や分解の処理を行うことができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために非イオン性の界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。本洗浄処理は、図１中で洗浄工程１として示す。
　工程ｃ）は、工程ｂ）において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程である。
　本発明で用いるアニオン性界面活性剤は、界面活性を示す原子団が陰イオンとなる界面活性剤の総称であり、陰イオン性界面活性剤とも呼ばれる。陰イオンは、そのカウンタ－イオンである陽イオンと共に塩を形成している。例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、アミン塩、ヒドロキシアンモニウム塩（アミノアルコール塩）を好ましく用いることができる。
　アニオン性界面活性剤は、イオン性官能基の種類で分類することができ、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型などに分類される。本発明では、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤が好ましい。
　カルボン酸型のアニオン性界面活性剤の具体例は、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、ペンタデシル酸塩、パルミチン酸塩、パルミトレイン酸塩、マルガリン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、バクセン酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、エレオステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、リグノセリン酸塩、コール酸塩、Ｎ－デカノイルサルコシン塩、Ｎ－ラウロイルサルコシン塩などが挙げられ、これらの中でも、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、Ｎ－デカノイルサルコシン塩またはＮ－ラウロイルサルコシン塩が好ましい。これらカルボン酸塩の好ましい具体例としては、カプリル酸ナトリウム、ペラルゴン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、Ｎ－デカノイルサルコシンナトリウムおよびＮ－ラウロイルサルコシンナトリウムが挙げられる。
　スルホン酸型のアニオン性界面活性剤の具体例は、１－ノナンスルホン酸１－デカンスルホン酸塩、１－ドデカンスルホン酸塩、１－オクタデカンスルホン酸塩、１－ウンデカンスルホン酸塩、クメンスルホン酸ナトリウム塩、オクチルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、１－テトラデカンスルホン酸塩、１－ペンタデカンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ブチルナフタレンスルホン酸塩、１－ヘキサデカンスルホン酸塩、スルホコハク酸ビス（２－エチルヘキシル）エステル塩、５－スルホイソフタル酸ジメチルエステル塩などが挙げられ、これらの中でもオクチルベンゼンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸が好ましい。これらスルホン酸塩の好ましい具体例としてはオクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。ドデシルベンゼンスルホン酸は、ハード型、ソフト型、混合型などの種類があるが、いずれも好ましく用いることができる。
　硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤の具体例は、オクチル硫酸塩、デシル硫酸塩、ドデシル硫酸塩、テトラデシル硫酸塩、ヘキサデシル硫酸塩などが挙げられ、これらの中でもオクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸が好ましい。これら硫酸エステル塩の好ましい具体例としては、オクチル硫酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。
　また、本発明で用いるアニオン性界面活性剤は、上記化合物のアルキル側鎖にエーテル結合を含んでいてもよい。
　上記に挙げた界面活性剤は１種類のみを使用してもよく、複数種を混合して用いても良い。
　アニオン性界面活性剤は、工程ｃ）の混合液に対して終濃度として０．０１重量％以上2重量％以下が好ましく、０．０５重量％以上２重量％以下がより好ましく、０．０７５重量％以上２重量％以下がさらに好ましく、０．０７５重量％以上１．５重量％以下が特に好ましい。アニオン性界面活性剤の濃度は、水や緩衝液に添加することで調整できる。
　アニオン性界面活性剤を含む溶液は、アニオン性の界面活性剤を溶解させた溶液を用いることができる。溶媒には、水、中性からアルカリ性の水溶液や緩衝液を用いることができる。また、アニオン性界面活性剤のフリー体を中和して塩を形成させることにより、アニオン性界面活性剤を含む溶液を調製することもできる。例えば、ドデシル硫酸を水酸化ナトリウム水溶液やナトリウムを含む緩衝液に溶解させて、ドデシル硫酸ナトリウムを含む溶液を調製することができる。
　アニオン性界面活性剤と担体との接触は任意のタイミングで行うことができる。アニオン性界面活性剤を含む溶液を調製したあと、担体を添加して混合してもよいし、担体を添加した状態でアニオン性界面活性剤を含む溶液を調製してもよい。
　担体と、アニオン性界面活性剤を含む溶液とを混合する方法は、具体的には、担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液に浸漬することができる。浸漬後は、静置してもよいし、撹拌してもよい。撹拌は、ピペッティングや転倒撹拌により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用して行ってもよい。混合時間は、特に限定されないが、１分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。また、本発明の担体をカラムに充填し、核酸を含む溶液を通過させてもよい。
　工程ｄ）は、工程ｃ）において混合した混合物から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程である。分離の方法は、工程ｂ）と同様の条件、方法で行うことができる。
　さらに、工程ｄ）の操作の後に、必要に応じて、上記の洗浄工程１と同様の方法で洗浄処理をしてもよい。これは、工程ｃ）の際に使用したアニオン性界面活性剤が系中に残存していると、回収した核酸をその後の測定系に影響する可能性があるためである。本洗浄処理は、図１中で洗浄工程２として示す。
　工程ｅ）は、工程ｄ）において分離した前記核酸が吸着した本発明の担体に溶出液を加えて核酸を回収する工程である。
　上記溶出液を加えて核酸を回収するにあたって、本発明の担体と、核酸を溶出させた溶液を分離したい場合には、工程ｂ）と同様の条件、方法で行うことができる。
　核酸が吸着した担体と溶出液との混合方法は特に限定されないが、例えばピペッティングや転倒混合により行ってもよく、ミキサー、ボルテックスなどの装置を使用してもよい。混合時間は、特に限定されないが、５分程度であればよく、それ以上の時間混合してもよい。
　回収された核酸は、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、核酸の末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。上記定量の前にこれらの修飾基を導入し、回収された核酸自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的に核酸を定量することができる。本発明により核酸が回収され、特に短鎖核酸においては高収率に回収されるため、上記定量において高感度に定量することが可能となる。
　本発明の担体は、酸化アルミニウムの表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることにより作製する。ポリマーによる表面の被覆率は、７％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上である。また、水溶性の中性ポリマーは、均一の厚さで吸着していなくてもよい。
　本発明の担体における、ポリマーによるアルミナの被覆率は、表面電位顕微鏡（別名ケルビンプローブフォース顕微鏡；ＫＦＭ）によって取得した電位分布図を解析することで算出する。表面電位顕微鏡は、例えば、Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＸＳ社のＤｉｇｉｔａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のＮａｎｏＳｃｏｐｅ　Ｉｖａ　ＡＦＭ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　３１００　ステージＡＦＭシステム等が利用できる。
　表面電位顕微鏡から表面被覆率を算出するにあたり、測定の視野スケールは、０．５μｍ×１μｍの範囲で行う。表面被覆率の算出方法は、まず酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。次に水溶性の中性ポリマーの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。そして、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。酸化アルミニウムのみの被覆率を０％、水溶性の中性ポリマーのみの被覆率を１００％とし、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの平均電位と水溶性の中性ポリマーの平均電位の比をとることで、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面被覆率を算出する。表面被覆率を求めるにあたり、使用する視野内の平均電位は、本発明の担体の粒子をランダムに３つ選んで、それぞれの測定値の平均値を使用する。
　また、本発明では、表面被覆率を算出する際の画像解析ソフトとして、Ａｄｏｂｅ社のＰｈｏｔｏｓｈｏｐを使用できる。この場合、画像解析にあたって、酸化アルミニウムの表面電位の平均値をスケール下端、水溶性の中性ポリマーの表面電位の平均値をスケール上端とし、下端の色を黒（８ｂｉｔ、ＲＧＢ値０）、上端の色を赤（Ｒ値２５５）または緑（Ｇ値２５５）または青（Ｂ値２５５）などに設定する。設定したスケールで水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を表示し、Ｒ値、Ｇ値またはＢ値のいずれかの値を２５５で割り、その比を表面被覆率とする。
　水溶性の中性ポリマーを表面に吸着させる前段階として、予め酸化アルミニウムを水やエタノールなどの溶液で洗浄し、表面に吸着している不純物を除いておいてもよく、本洗浄操作を省略してもよい。
　水溶性の中性ポリマーを酸化アルミニウムの表面に吸着させる方法は、例えば、水溶性の中性ポリマーを溶解させて水溶性の中性ポリマー溶液を調製し、酸化アルミニウムに接触させる方法が挙げられる。具体的には、水溶性の中性ポリマー溶液に酸化アルミニウムを浸漬させたり、水溶性の中性ポリマー溶液を酸化アルミニウムに滴下したり、水溶性の中性ポリマー溶液を酸化アルミニウムに塗布したり、水溶性の中性ポリマー溶液を霧状にして酸化アルミニウムに吹き付けたりすることができる。
　水溶性の中性ポリマー溶液に、酸化アルミニウムを浸漬させる方法は特に限定されない。例えば、ピペッティング、転倒混合、スターラー、ミキサー、ボルテックス、ミル等の分散機や超音波処理装置などで撹拌してもよい。
　水溶性の中性ポリマー濃度は、特に限定されないが、０．０１ｗｔ％以上が好ましく、より好ましくは、０．１ｗｔ％以上である。
　攪拌する際の混合時間は、水溶性の中性ポリマーと酸化アルミニウムが均一に混合されれば、特に混合時間は限定されないが、ボルテックスの場合１分以上、好ましくは５分以上撹拌することが好ましい。
　また、ふるいや、ざる等を用いて水溶性の中性ポリマーを酸化アルミニウムにディップコートすることもできる。溶液に浸す際の混合時間は、０．１ｗｔ％以上のポリマー濃度であれば５分以上であればよく、３０分以上であることが好ましい。
　水溶性の中性ポリマー溶液を滴下する場合には、スポイト、滴下漏斗などを用いることができる。ポリマー溶液を滴下する際には、酸化アルミニウムを振動させたり、回転させたりしてもよく、スピンコーターなどを用いてもよい。
　水溶性の中性ポリマー溶液を塗布する場合には、刷毛、ローラー、ワイヤーバーを用いることができる。
　水溶性の中性ポリマー溶液を霧状にして吹き付ける場合には、エアースプレーやエアブラシなどを用いることができる。
　上記に例示した方法で、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させた後は、遠心分離操作を行って、上清となるポリマー溶液を取り除いてもよいし、遠心分離操作を行わずにそのまま核酸の回収に用いてもよい。また、ポリマー溶液を溶媒に溶解させている場合、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させ、溶媒を取り除いた後、乾燥させてもよいし、乾燥させずに、核酸の回収に用いてもよい。
　本発明の担体は、事前に作製して保存しておいたものを使用してもよく、用時調製して使用してもよい。
　水溶性の中性ポリマー溶液は、入手した水溶性の中性ポリマーが固体であれば水や有機溶媒に溶解することで調製でき、溶液であれば希釈することで調製できる。ポリマーが溶解しにくい場合や、溶液の粘度が高く混合しにくい場合、加熱処理や超音波処理を行ってもよい。有機溶媒は、例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、エチレングリコール、グリセロールなど、水と双溶性のあるものを使用することが好ましい。また、水に溶解しにくい場合には、上記の有機溶媒を添加してもよい。
　酸化アルミニウムと水溶性の中性ポリマーを、リンカー分子などによって共有結合させて作製した担体は、本発明の担体に該当しない。具体的なリンカー分子には、シランカップリング剤などが挙げられる。このようなシランカップリング剤による官能化の後に、アミド結合、エステル結合、チオールとマレインイミドのマイケル付加反応物、ジスルフィド結合、トリアゾール環などを形成させ、ポリマー等を固定化して作製した担体も、本発明の担体に該当しない。
　本発明の核酸回収用のキットは、体液試料から、核酸を効率的に回収するために利用することができる。本発明の核酸回収用のキットは、その構成成分として、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、カオトロピック試薬を含む溶液、アニオン性界面活性剤を含む溶液が含まれ、さらに緩衝液が含まれてもよい。また、キットには、これらの他に、キットの仕様書や説明書などが含まれていてもよい。
　本発明の核酸回収用のキットに含まれる、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体は、乾燥させた状態であってもよいし、水溶性の中性ポリマーの溶液中に浸漬された状態であってもよい。
　本発明の核酸回収用のキットに含まれる緩衝液には、上記工程ｅ）の溶出液に用いることができる緩衝液が利用できる。
　本発明で用いる体液試料は、核酸を含む任意の体液試料を使用できる。核酸には、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ（ｍｉＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ｃｔＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）などが挙げられる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ＲＮＡ、それらの前駆体又は合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製できる。
　体液試料としては、例えば血液、尿、唾液、粘膜、汗、痰、精液などの体液などを利用することができる。上記体液試料は、好ましくは血液、尿、唾液である。血液には全血、血漿、血清、血球などが含まれる。
　これらの体液試料は、採取後そのまま本発明を適用してもよいし、採取後に溶液を加えて希釈してもよい。体液試料に沈殿物や浮遊物が多い場合には、遠心操作によってこれらをペレットにし、上清のみを使用してもよい。また、フィルターなどを通過させてから使用してもよい。この上清や通過後の体液試料は、水や緩衝液で希釈してから本発明に用いてもよい。
　体液試料は、必要に応じて、以下のような処理をしてもよい。これは、一般に、体液を含む生物学的試料において、核酸が細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソームまたはエキソソームなどに内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。より収率よく核酸を回収するために、これらから遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
　具体的には、大腸菌が含まれている体液試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、大腸菌が含まれる体液試料に対して０．２Ｍの水酸化ナトリウムと１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の混合液を加えることができ（アルカリ変性法）、また、１０％のサルコシル溶液を加えることもできる（サルコシルによる非変性法）。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理を行うこともできる。他の方法として超音波処理を行うこともできる。
　酵母が含まれている体液試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、生化学工業株式会社から市販されているザイモリエースで処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。
　細胞が含まれている体液試料から核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、１％のＳＤＳやＴｒｉｔｏｎＸを加えることができる。他の方法として、塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、及び尿素などを、例えば各終濃度が４Ｍ以上になるように加えてもよい。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるよう加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えてもよい。
　上記の操作において、体液試料に含まれる核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。ＤＮＡ分解酵素の阻害剤として、ＥＤＴＡを１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されているＲＮａｓｉｎ　Ｐｌｕｓ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ株式会社）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社）、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
　体液試料にＤＮＡとＲＮＡが混在している場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することもできる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件で行えばＲＮＡは水層、ＤＮＡはクロロホルム層に分離され、中性条件で行えばＲＮＡとＤＮＡは水相に分配される。この性質を利用して、取得したい核酸の種類に応じて条件を選択できる。上記のクロロホルムは、ｐ－ブロモアニソールに置換することもできる。
　フェノール・クロロホルム抽出は、市販試薬であるＩＳＯＧＥＮ（登録商標：株式会社ニッポンジーン）、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ株式会社）、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｋｉｔ（東レ株式会社）を利用することもできる。以上の処理は、その一工程のみを行ってもよく、他の操作における工程と組み合わせることもできる。また、それに用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることもできる。
　本発明において核酸を含む溶液としては、体液試料やその希釈液を用いることができる。また、核酸、人工核酸、色素やリン酸基等の修飾が施された核酸を溶解させた溶液と体液試料とを混合した溶液を用いることもできる。体液試料に対し、上記のいずれかの処理を行った後に得られる溶液をそのまま用いてもよいし、必要に応じて希釈してもよい。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液などの核酸を含む溶液に汎用される溶液を使用することが好ましい。
　本発明において、回収する核酸の長さは特に限定されないが、１０００塩基対以下であることが好ましい。また、本発明は、従来技術では難しかったセルフリーＤＮＡやｃｔＤＮＡなどの３００塩基対以下の核酸も高収率で回収することができ、１００塩基対以下のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡやｍｉＲＮＡも高収率で回収することができる。
　核酸の回収量は、以下のように測定することができる。例えば、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析などが挙げられる。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸量を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。その他、電気泳動により行うことができる。電気泳動による回収率の算出方法は、濃度既知のサンプルと同時に回収操作を行ったサンプルを泳動し、ゲルを染色してバンドの濃度を画像解析により比較することで決定することができる。
　核酸量が極微量で定量が難しい場合は、ＤＮＡチップ、リアルタイムＰＣＲなどの核酸の検出方法を用い、検出値を比較することによって、核酸の収量を比較することができる。例えば、ＤＮＡチップのような検出反応において、蛍光測定や発光測定を原理とした測定系であればそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。例えば、ＤＮＡチップであれば、スキャナーを用いて蛍光画像を取得し、遺伝子ごとの蛍光シグナル強度を数値化することで収量を比較することができる。ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡのような発現量の網羅解析であれば、遺伝子ごとの蛍光シグナル強度を比較することができ、異なる手法を比較したときそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。また、複数種類の遺伝子を解析する場合は、遺伝子ごとの蛍光シグナルの総和（蛍光シグナル総和値）をとり、異なる手法を比較したときそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。リアルタイムＰＣＲでは、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした増幅曲線が得られる。この増幅曲線において一定のシグナル強度に達したときのサイクル数（Ｃｑ値、Ｃｔ値）をそれぞれ求める。この場合、Ｃｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。ｃｆＤＮＡやゲノムＤＮＡであれば、測定対象の遺伝子に対するプライマーを設計し、同一のプライマーで異なる回収方法を比較したときＣｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡのようなＲＮＡである場合、逆転写の工程を加える以外はＤＮＡと同様に測定、検出することができ、その際のＣｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。
　本発明においてポリマーは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。本発明の担体に用いるポリマーは、１種類の単量体からなるホモポリマーと２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれもが含まれ、任意の重合度のポリマーも含まれる。また、天然ポリマーと合成ポリマーのいずれもが含まれる。
　本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーは、水に対して溶解可能な性質を有し、水に対する溶解度が、少なくとも０．０００１ｗｔ％以上であり、好ましくは、０．００１ｗｔ％以上、より好ましくは０．０１ｗｔ％以上、さらに好ましくは０．１ｗｔ％以上のポリマーである。
　本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーは、好ましくは、ｐＨ７の溶液中でゼータ電位が－１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のポリマーである。より好ましくは－８ｍＶ以上＋８ｍＶ以下であり、さらに好ましくは－６ｍＶ以上＋６ｍＶ以下、特に好ましくは－４．０ｍＶ以上＋１．１ｍＶ以下のポリマーである。
　ゼータ電位とは、溶液中におけるコロイドの界面の電気的性質を表す値の１つである。荷電したコロイドが溶液に分散していると、コロイドの表面ではコロイドの表面荷電に対する対イオンにより電気二重層が形成されている。このときのコロイド表面の電位を表面電位と呼ぶ。電気二重層は、コロイドの表面電荷の静電相互作用により形成されているため、コロイド側ほどイオンが強く固定されている。電気二重層の中でも静電相互作用により対イオンがコロイド表面に強く固定されている層を固定層、固定層の電位を固定電位と呼ぶ。溶液に対してコロイドを移動させると固定層はコロイドと共に移動する。このとき、コロイドから見て固定層よりも外側に、溶液が持つ粘性のためにコロイドと共に移動する境界面がある。これを、すべり面、または、ずり面と呼ぶ。コロイドから充分に離れた地点の電位をゼロ点としたときの、このすべり面の電位はゼータ電位と定義されている。このように、ゼータ電位はコロイドの表面電荷に依存して変化し、表面電荷はｐＨに依存するプロトンの着脱によって変化するため、本発明ではｐＨ７の溶液中での値を基準とする。また、一般にコロイドのサイズと比べてすべり面までの距離は小さいので、コロイドの表面をすべり面と近似的に表現することもできる。本発明で用いる水溶性の中性ポリマーの場合も同様に、溶液中に分散したコロイドの表面電位をゼータ電位とみなすことができる。
　ゼータ電位は、電気泳動、電気浸透、逆流電位、沈殿電位などの界面動電現象を利用して求めることができ、顕微鏡電気泳動法、回転回折格子法による電気泳動法、レーザー・ドップラー電気泳動法、超音波振動電位法、動電音響法などの方法により測定できる。これらの測定は、ゼータ電位測定装置を使用することで行うことができる。ゼータ電位測定装置は、大塚電子株式会社、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．、Ｒａｎｋｕ　Ｂｒｏｔｈｅｒ　Ｌｔｄ．、ＰｅｎＫｅｍ　Ｉｎｃ．などから市販されている。
　上記のいずれの装置を用いても、ゼータ電位を測定することができるが、レーザー・ドップラー電気泳動法が一般的である。レーザー・ドップラー電気泳動法は、光や音波が電気泳動により運動している物体に当たり、散乱あるいは反射するとその周波数が変化するドップラー効果を利用した測定方法である。
　ポリマーのゼータ電位を測定する場合には、コロイド分散溶液としてポリマー溶液を調製し、ゼータ電位を測定することができる。ポリマーを例えば、リン酸緩衝液や、塩化ナトリウム溶液、クエン酸緩衝液などの電解質に溶解させてポリマー溶液を調製し、溶液中に分散したポリマーの散乱光や、反射光を検出して測定を行う。コロイドのサイズが大きいほど、低い濃度で散乱光や反射光を検出することが可能となる。
　ポリマーのゼータ電位をレーザー・ドップラー法で測定する具体的な条件は特に限定されないが、例えば、ポリマーの濃度を１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ，　ｐＨ７）に溶解し、この溶液を測定用セルに入れて、レーザー・ドップラー電気泳動法を原理とするゼータ電位測定装置に設置して室温で測定することができる。ゼータ電位測定装置は例えば、大塚電子株式会社のＥＬＳ－Ｚ等が利用できる。
　本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーとしては、具体的には、以下のものが挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンなどのポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）又はポリ（Ｎ－（ヒドロキシメチル）アクリルアミドなどのポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、２－ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース等を用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。
　また、フィコール、アガロース、キチン、デキストランなどのポリサッカライド、これらポリサッカライドの類縁体、アルブミンなどのタンパク質やペプチドも本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーに含まれる。
　水溶性の中性ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基など水溶性を発現する官能基を導入してもよい。
　水溶性の中性ポリマーの分子量としては、例えば、０．４ｋＤ以上のポリマーを好ましく用いることができ、より好ましくは６ｋＤ以上である。
　本発明の担体に用いる酸化アルミニウムは、Ａｌ２Ｏ３の組成式で表される両性酸化物であり、アルミナとも呼ばれる。
　酸化アルミニウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製したものを用いてもよい。酸化アルミニウムを作製する方法としては、例えば、ギブサイトを出発原料とするバイヤー法や、ベーマイト形態の水酸化物を経由するアルコキシド法（ゾルーゲル法とも呼ばれる）・中和法・オイルドロップレット法、アルミニウム塩熱分解法や陽極酸化法などが挙げられる。
　工業的に作製した酸化アルミニウムは、試薬メーカーや、触媒化学メーカー、一般社団法人触媒学会の参照触媒部会などから入手することができる。
　酸化アルミニウムは、それらが持つ結晶構造によって、アルファ酸化アルミニウム、ロー酸化アルミニウム、カイ酸化アルミニウム、カッパ酸化アルミニウム、イータ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、デルタ酸化アルミニウム、シータ酸化アルミニウムなどに分類される。本発明では、高比表面積を持つガンマ酸化アルミニウムが好ましい。
　酸化アルミニウムは、作製時の焼成温度に応じて、酸点（Ａｌ＋、Ａｌ－ＯＨ２ ＋）と塩基点（Ａｌ－Ｏ－）が変化する。酸化アルミニウムはこの酸点と塩基点の数に応じて、酸点が多ければ酸性アルミナ、塩基点が多ければ塩基性アルミナ、酸点と塩基点が同程度の中性アルミナと分類される。この特性の違いは、ｐＨ指示薬であるＢＴＢ溶液を添加することで確認できる。ＢＴＢ溶液を加えて、酸化アルミニウムが黄色に呈色すれば酸性アルミナ、緑色に呈色すれば中性アルミナ、青色に呈色すれば塩基性アルミナであることが確認できる。このような特性上の違いがあるが、本発明においては、いずれの酸化アルミニウムも使用することができる。
　酸化アルミニウムは粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径を混合して利用してもよい。粒径は、例えば、２１２μｍ未満の酸化アルミニウムを好ましく用いることができ、より好ましくは１００μｍ未満の酸化アルミニウムを用いることができる。
　粒径は、本発明では日本工業規格に規格するＪＩＳ　Ｚ－８８０１－１：２００６に基づいたふるい目開きの寸法で定義する。例えば、上記ＪＩＳ標準による目開きにして４０μｍのふるいを通過し、３２μｍのふるいを通過できない粒子は、３２μｍ以上４０μｍ未満の粒径となる。
　工程ｅ）で用いる溶出液は、本発明の担体に吸着した核酸を溶出させることができれば、特に限定されないが、緩衝液が好ましく、緩衝液にはキレート剤が含まれていてもよい。具体的には、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液や、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ－塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液などが挙げられる。
　緩衝液のｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、より好ましくはｐＨ５以上ｐＨ８以下である。
　工程ｅ）で用いる溶出液には、水や緩衝液を用いることができ、緩衝液が好ましい。
　緩衝液は、リン酸とリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液や、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ－塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液などを好ましく用いることができる。これらのうち、クエン酸とクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液、トリスヒドロキシアミノメタンと塩酸を含むＴｒｉｓ－塩酸緩衝液にＥＤＴＡを添加したＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液は、キレート作用を有する緩衝液であるため特に好ましい。緩衝液のｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、ｐＨ５以上ｐＨ８以下がより好ましい。
　緩衝液には、キレート剤を添加して、緩衝液にキレート作用を付与しても良い。キレート剤は、複数の配位座を持つ配位子を持っており、金属イオンへ結合し、錯体を形成する物質を用いることができる物質であり、キレート剤が含まれる緩衝液は、キレート作用を有する。
　緩衝液に添加する具体的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、リン酸、ポリリン酸、トリリン酸、メタリン酸、フィチン酸及び／又はそれらの塩などが挙げられる。キレート剤の終濃度は、５０ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは１００ｍＭ以上、さらに好ましくは５００ｍＭ以上である。
　また、上記以外のキレート剤となる化合物として、陰イオン性のポリマーを挙げることができる。カルボン酸を側鎖に持つポリマーは金属イオンを配位するため、これらが緩衝液に含まれていてもよい。このような機能を有するポリマーとして、ポリビニルスルホン酸および／またはそれらの塩が挙げられる。その終濃度は特に限定されないが、１ｗｔ％以上であればよく、好ましくは１０ｗｔ％以上である。
　上記キレート剤はその１種類を使用してもよく、混合して使ってもよい。本発明においては、リン酸―ポリリン酸混合液、リン酸―トリリン酸混合液、リン酸―メタリン酸混合液、リン酸―フィチン酸混合液を使用することが好ましい。
　本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。
　＜材料と方法＞
　ポリエチレングリコールはメルク株式会社より、ガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ）は日揮触媒化成株式会社より、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は１０％水溶液としてインビトロジェン株式会社より、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウムは東京化成株式会社より入手した。
　その他の試薬については、和光純薬株式会社、東京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社から購入し、特に精製することなくそのまま用いた。
　ミキサーは東京理化器械株式会社のＣＵＴＥ　ＭＩＸＥＲ　ＣＭ－１０００を、遠心機は日立のＣＴ１５ＲＥを用いた。
　ヒト血清およびヒト血漿は、インフォームドコンセントを得た健常者からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社製）を用いて採取した。
　本発明の担体は以下のとおり調製し、以降の実施例および比較例に用いた。１．５ｍｌチューブに、０．５ｍｇずつ酸化アルミニウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，　１０ｋＤ）を１０ｗｔ％の濃度で５０μｌ加えてミキサーで１０分間攪拌した。遠心機で遠心（１００００Ｇ，　１ｍｉｎ）して上清４５μｌを除き、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコールが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を得た。
　＜実施例１、２＞
　アニオン製界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて核酸の回収を行った。以下、工程毎に実験方法を説明する。
　工程ａ）
　カオトロピック試薬として７Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）を用いた。核酸を含む溶液としてヒト血清を用いた。７Ｍ　ＧＴＮ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）溶液４５０μｌ、ヒト血清１００μｌ、上記で調製した酸化アルミニウムの担体とを混合し、１５分間ミキサーで攪拌した。
　工程ｂ）
　工程ａ）において混合した溶液を遠心（１００００Ｇ，１ｍｉｎ）して上清を除き、当該核酸が吸着した担体を分離した。
　洗浄工程１
　工程ｂ）で得られた核酸が吸着した担体に対して、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ水溶液（ｐＨ７）（実施例１）または０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（実施例２）を４００μｌ加え、ボルテックスした。溶液を遠心（１００００Ｇ，１ｍｉｎ）して上清を除き、担体を分離した。
　工程ｃ）
　分離した担体に、アニオン性界面活性剤を含む溶液として、０．５％　ＳＤＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を４００μｌ加えボルテックスした。
　工程ｄ）
　工程ｃ）で混合した溶液を遠心（１００００Ｇ，１ｍｉｎ）して上清を捨て、当該核酸が吸着した担体を分離した。
　洗浄工程２
　工程ｄ）で得られた核酸が吸着した担体に対して２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ水溶液（ｐＨ７）（実施例１）または０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（実施例２）を４００μｌ加え、ボルテックスした。溶液を遠心（１００００Ｇ，１ｍｉｎ）して上清を除き、担体を分離した。
　工程ｅ）
　分離した担体に、溶出液として１０μｌの１２５ｍＭリン酸－１２５ｍＭポリリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、１５分間ミキサーで攪拌した。次に、攪拌した溶液を遠心（１００００Ｇ，　１ｍｉｎ）して、上清を核酸溶液として回収した。
　核酸の回収量（蛍光シグナル総和値）の測定
　上記の工程を経て血清から回収した核酸に対して、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　ｍｉＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコールに基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、ｍｉＲＢａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２１に登録されているｍｉＲＮＡの中で、２５６５種のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した３Ｄ?Ｇｅｎｅ（登録商標）　Ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にてそれぞれのｍｉＲＮＡ量の蛍光シグナル強度を数値化した。数値化されたそれぞれの蛍光シグナル強度をブランク値で割り、この値をＳ／Ｎ値とした。Ｓ／Ｎ値が１．５以上の蛍光シグナル強度に関して総和を取った（蛍光シグナル総和値）。実施例１、２の結果を表１に示す。
　＜実施例３＞
　実施例１の回収工程から洗浄工程１を除いた工程で核酸の回収を行った。その他の条件・操作は実施例１と同様に行い、ＤＮＡチップを使って血液中のｍｉＲＮＡ蛍光強度の総和を取った。結果を表１に示す。
　これらの結果から、洗浄工程１を除いた工程で核酸を回収した場合にも、実施例１と同程度に核酸を回収できることがわかった。
　＜比較例１、２＞
　本比較例１、２では、工程ｃ）と工程ｄ）を除いた以外は、実施例１、２と同様の条件および操作で核酸を回収した。つまり、本比較例は、特許文献１に記載の核酸の回収方法に対応する。結果を表１に示す。
　実施例１、２と比較例１、２の結果から、アニオン性界面活性剤を添加する工程ｃ）を実施する実施例１、２の方法によれば、比較例１、２すなわち特許文献１の方法よりも、蛍光シグナル総和値が向上し、核酸回収量が増加することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜比較例３＞
　実施例１の工程ａ）において、カオトロピック試薬を用いない条件で核酸の回収を行った。工程ａ）では、核酸を含む溶液としてヒト血清１００μｌと２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）溶液４５０μｌの混合液を用いた。その他の条件・操作は、実施例１と同様に行い、ＤＮＡチップを使って血液中のｍｉＲＮＡ蛍光強度の総和を取った。結果を表２に示す。
　これらの結果から、工程ａ）においてカオトロピック試薬を用いない場合、工程ｃ）を実施しても体液試料からの核酸回収量が低く、蛍光シグナル総和値も低いことが分かった。
　＜比較例４＞
　大腸菌、酵母、細胞などが体液試料に含まれている場合、核酸の回収効率を高めるために、核酸の遊離処理を行っている場合がある。このようなとき、工程ａ）においてＳＤＳ等のアニオン性界面活性剤が核酸を含む溶液に含まれることになる。そこで、工程ａ）でアニオン性界面活性剤を用い、工程ｃ）でカオトロピック試薬を用いて以下のように核酸の回収を行った。
　実施例１の回収工程のうち、工程ａ）では、７Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）の代わりに０．５％　ＳＤＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を用いた。工程ｃ）では、０．５％　ＳＤＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）の代わりに７Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を用いた。そのほかの条件・操作は、実施例１と同様に行い、ＤＮＡチップを使って血液中のｍｉＲＮＡ蛍光強度の総和を取った。結果を表２に示す。
　これらの結果から、カオトロピック試薬の存在下で核酸を担体に吸着させること、そして担体に核酸を吸着させた後、アニオン性界面活性剤を添加する方法によらない場合には、核酸回収量、蛍光シグナル総和値の向上が確認できなかった。
　＜比較例５＞
　実施例１の工程ａ）において、カオトロピック試薬とアニオン性界面活性剤の両方を用いて核酸を本発明の担体に吸着させ、さらに工程ｃ）と工程ｄ）を除いて核酸の回収を行った。工程ａ）においては、７Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）と０．５％　ＳＤＳ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）を混合した溶液を用いた。その他の条件・操作は、比較例１と同様に行った。結果を表２に示す。
　これらの結果から、工程ａ）でアニオン性界面活性剤を用いても、工程ｃ）、工程ｄ）を実施しない場合は、体液試料からの核酸回収量が低いく、蛍光シグナル総和値が低いことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜実施例４、５、６＞
　実施例１における工程ｃ）の０．５％　ＳＤＳを、アニオン性界面活性剤である、０．５％ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（実施例４）、０．５％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（実施例５）、０．２５％ラウリン酸ナトリウム（実施例６）にそれぞれ置換しこれ以外の条件・操作は実施例１と同様にして、核酸の回収を行った。結果を表３に示す。
　これらの結果から、工程ｃ）において各種アニオン性界面活性を使用することで核酸回収量は増加し、蛍光シグナル総和値が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜実施例７、８、９＞
　実施例１における工程ｃ）のＳＤＳ濃度を、１％(実施例７）、０．１％（実施例８）、０．０７５％（実施例９）とし、それぞれ核酸の回収を行った。その他の条件・操作は実施例１と同様に行った。結果を表４に示す。
　これらの結果から、いずれのアニオン性界面活性剤の濃度においても核酸回収量は増加し、蛍光シグナル総和値が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜実施例１０、１１＞
　実施例１における工程ａ）において、７Ｍグアニジンチオシアン酸塩の代わりに、７Ｍグアニジン塩酸塩（実施例１０）または８Ｍ尿素（実施例１１）をそれぞれ用い、これ以外の条件・操作は、実施例１と同様にして、核酸の回収を行った。結果を表５に示す。
　これらの結果から、工程ａ）において各種のカオトロピック試薬を使用することで体液試料からの核酸回収量は増加し、蛍光シグナル総和値が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　＜実施例１２、１３、１４、１５＞
　実施例１の工程ａ）で用いたカオトロピック試薬のグアニジンチオシアン酸塩濃度を、４Ｍ（実施例１２）、２Ｍ（実施例１３）、１Ｍ（実施例１４）、０．５Ｍ（実施例１５）とし、これ以外の条件・操作は、実施例１と同様にして、それぞれ核酸を回収した。結果を表６に示す。
　これらの結果から、いずれのカオトロピック試薬の濃度においても体液試料からの核酸回収量は増加し、蛍光シグナル総和値が向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　＜実施例１６＞
　体液試料として３００μｌの血漿を用い、カオトロピック試薬として４５０μｌの７Ｍグアニジンチオシアン酸塩（ＧＴＮ）を用い、溶出液として５０μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いた以外は、実施例２と同様の条件及び操作で核酸を回収した。続いて回収した核酸にセルフリーＤＮＡが含まれているかを、以下の方法で確認した。
　セルフリーＤＮＡが回収できているかを確認する手段として、血漿中に含まれるセルフリーＤＮＡのアクチン－βをコードする遺伝子配列の一部からなる核酸をリアルタイムＰＣＲにより測定する方法（Ｗ．ＳＵＮら、Ｔｈｅ ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅＤＮＡ　ｄｅｔeｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｃｈｅｍｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＯＮＣＯＬＯＧＹ　ＲＥＰＯＲＴＳ　３１：１４６６－１４７２，２０１４）が知られている。本実施例では、同文献中に記載されるアクチン－βをコードする遺伝子のうち１００ｂｐ分の遺伝子配列を増幅してセルフリーＤＮＡを検出する方法に基づき、アクチン－βをコードする遺伝子配列のうち、９３ｂｐ分の塩基配列を増幅するプライマー１および２を設計し、リアルタイムＰＣＲによる測定に用いた。
　リアルタイムＰＣＲ測定には、タカラバイオ株式会社のＳＹＢＲ（商標登録）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＩＩ、バイオラッド社のＣＦＸ９６－Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍを用いた。アクチン－βをコードする遺伝子配列のうち、９３ｂｐ分の核酸を増幅させ、増幅サイクル数（Ｃｑ値）として解析した。この核酸を増幅させるためのプライマーとして、ＰｒｉｍｅＰＣＲ　Ａｓｓａｙｓ，Ｐａｎｅｌｓ，ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社）の記載を基に、配列番号１および２で示される核酸を設計し、これらをユーロフィンジェノミクス株式会社より購入し、特に精製することなくそのまま用いた。
　まず、氷上にてＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑを１２．５μＬ、０．５μＭに調製した配列番号１および２で示されるプライマーを１．０μＬ、滅菌蒸留水８．５μＬ、本実施例で回収した核酸のサンプルを滅菌蒸留水で１０倍希釈したもの２μＬを、１．５ｍＬチューブ内で混合して全量２５μＬとした。この全量をリアルタイムＰＣＲ用プレートに添加し、プレートシートで蓋をし、装置へセットした。リアルタイムＰＣＲの測定条件は、９５℃３０ｓｅｃで２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分かれさせた後、９５℃５ｓｅｃでアプライマーをアニーリングさせ、５６℃１ｍｉｎで伸長反応を行うサイクルを４０サイクル行った。得られたＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｃｕｒｖｅから、増幅サイクル数を得た。ＰＣＲ反応後、反応液の温度を６０℃から９５℃まで徐々に上昇させ融解曲線分析を行い、得られたＭｅｌｔＣｕｒｖｅからプライマーダイマーができていないことを確認した。また、リアルタイムＰＣＲでの測定後のサンプルを電気泳動して、１００ｂｐ付近にメインバンドがあることで、アクチン－βをコードする遺伝子配列のうち、９３ｂｐ分の塩基配列を増幅させたことを確認した。
　結果を表７に示す。Ｃｑ値は、２８．６であった。
　＜比較例６＞
　工程ｃ）および工程ｄ）を除いた以外は、実施例２と同様の条件および操作で核酸を回収し、実施例１６と同様の方法でセルフリーＤＮＡの回収量をリアルタイムＰＣＲのＣｑ値として解析した。
　結果を表７に示す。この結果、Ｃｑ値は、３０．１であった。
　実施例１６と比較して、工程ｃ）、工程ｄ）を実施しない場合は、血漿試料からのセルフリーＤＮＡの回収量が低く、Ｃｑ値が大きいことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (11)

  1. 　体液試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程：
    工程ａ）カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
    工程ｂ）工程ａ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
    工程ｃ）工程ｂ）において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
    工程ｄ）工程ｃ）において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
    工程ｅ）工程ｄ）において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
    を含む、核酸の回収方法。
  2. 　前記核酸が、マイクロＲＮＡまたはセルフリーＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸の回収方法。
  3. 　前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿または唾液であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸の回収方法。
  4. 　前記アニオン性界面活性剤が、カルボン酸型、スルホン酸型または硫酸エステル型である請求項１から３のいずれかに記載の核酸の回収方法。
  5. 　前記カルボン酸型のアニオン性界面活性剤が、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、Ｎ－デカノイルサルコシン塩またはＮ－ラウロイルサルコシン塩である請求項４に記載の核酸の回収方法。
  6. 　前記スルホン酸型のアニオン性界面活性剤が、オクチルベンゼンスルホン酸塩またはドデシルベンゼンスルホン酸塩である請求項４に記載の核酸の回収方法。
  7. 　前記硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤が、オクチル硫酸塩、デシル硫酸塩またはドデシル硫酸塩である請求項４に記載の核酸の回収方法。
  8. 　前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で－１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の核酸の回収方法。
  9. 　前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする請求項８に記載の核酸の回収方法。
  10. 　前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の核酸の回収方法。
  11. 　水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、カオトロピック試薬を含む溶液およびアニオン性界面活性剤を含む溶液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
     
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