WO2019129909A1 - Benzopiranos prenilados agonistas de ppar - Google Patents

Benzopiranos prenilados agonistas de ppar Download PDF

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WO2019129909A1
WO2019129909A1 PCT/ES2018/070826 ES2018070826W WO2019129909A1 WO 2019129909 A1 WO2019129909 A1 WO 2019129909A1 ES 2018070826 W ES2018070826 W ES 2018070826W WO 2019129909 A1 WO2019129909 A1 WO 2019129909A1
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alkyl
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PCT/ES2018/070826
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Inventor
Diego Miguel Cortés Martínez
María Jesús SANZ FERRANDO
Nuria Cabedo Escrig
Almudena Bermejo Del Castillo
Laura PIQUERAS RUIZ
Aída COLLADO SÁNCHEZ
Patrice GOMES MARQUES
Laura VILA DASÍ
Original Assignee
Universitat De València
Fundación Incliva
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/58—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4
    • C07D311/70—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with two hydrocarbon radicals attached in position 2 and elements other than carbon and hydrogen in position 6
    • C07D311/72—3,4-Dihydro derivatives having in position 2 at least one methyl radical and in position 6 one oxygen atom, e.g. tocopherols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Definitions

  • the present invention relates to compounds comprising a central structure of prenylated benzopyran. Said compounds exhibit activity as PPARa, PPARY agonists, or dual activity agonist of PPARa and PPARY.
  • the invention therefore relates to compounds with such a prenylated benzopyran structure of formula I, their pharmaceutical compositions, first medical use, as well as the use of compounds of prenylated benzopyran structure in the treatment of diseases responsive to the administration of PPARa agonists and / or PPARY.
  • Such diseases are disorders such as type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, cardiovascular disorders, dyslipidemias, such as hypercholesterolemia, familial hypertriglyceridemia (severe and moderate), primary chylomicronemia, familial dysbetalipoproteinemia or hyperlipoproteinemia, inflammation and neurodegenerative diseases, such as Parkinson's, Alzheimer's or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • T2D type 2 diabetes
  • diabetes obesity
  • metabolic syndrome cardiovascular disorders
  • dyslipidemias such as hypercholesterolemia, familial hypertriglyceridemia (severe and moderate)
  • primary chylomicronemia familial dysbetalipoproteinemia or hyperlipoproteinemia
  • inflammation such as Parkinson's, Alzheimer's or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Peroxisome proliferator-activating receptors belong to the family of nuclear hormone receptors. There are three types of PPAR: PPARa (NR1C1), PPARb / d (NUC1, NR1C2), and PPARY (NR1 C3). All act as heterodimers with 9-cis-retinoic acid receptors (X retinoid receptor, RXR) and play a key role in the regulation of various metabolic pathways, including lipid biosynthesis and glucose metabolism, as well as in the differentiation and cell proliferation and apoptosis (Cheang et al, 2015, Ahmadian et al, 2013 and Tan et al., 2017).
  • X retinoid receptor 9-cis-retinoic acid receptors
  • PPARs are considered powerful therapeutic tools in the control of different pathologies, such as type 2 diabetes (DT2), obesity, hyperlipidemia, cardiovascular disorders, inflammation and neurodegenerative diseases.
  • PPARs are of additional importance since they are involved in the control of inflammatory processes, so they can regulate inflammation, vascular function, and vascular remodeling (Cheang et al., 2015, Ahmadian et al., 2013 and Tan et al., 2017).
  • PPARa are found mainly in liver, kidneys, heart, muscle and adipose tissue, and play a fundamental role in the oxidation of fatty acids and the metabolism of lipoproteins. PPARy predominantly predominates in adipose tissue, macrophages, monocytes, intestinal cells, skeletal muscle and endothelium. They are related to lipid metabolism, adipogenesis, glucose homeostasis, and insulin sensitization.
  • the PPAR ligands and in particular the PPARa and PPARy agonists inhibit the activation of the expression of genes of inflammation and can negatively interfere with signaling pathways of proinflammatory transcription factors in vascular and inflammatory cells.
  • PPARa are activated by compounds of fibrate structure: fenofibrate, chlorofibrate, benzafibrate, and similar compounds such as WY-14643:
  • PPARa agonists are able to lower triglyceride levels and increase HDL-c, being very effective in the treatment of hypertriglyceridemia.
  • PPAR ⁇ ligands of these receptors are thiazolidinedione agonists (TZD), among which is rosiglitazone and pioglitazone, which have been used clinically for the treatment of DT2 due to their ability to decrease glucose levels in blood and improve insulin sensitivity (Ahmadian et al., 2013).
  • PPAR ⁇ agonists can produce an increase in creatinine and transaminase levels, and more rarely myopathy, whereas PPAR ⁇ agonists are related to weight gain, edema and myocardial infarction (Cheang et al., 2015).
  • the possibility of finding a single compound capable of activating the two receptors PPARa and PPARy, dual agonist, is presented as a potential alternative in the treatment of T2D and metabolic syndrome, with fewer side effects (Cheang et al., 2015 and Tan et al., 2017).
  • hPPARa and hPPARy allow to combine the properties of PPAR ⁇ agonists (fibrates) on the regulation of lipid metabolism, including triglyceride (TG) reduction, with the additional effect of improving the sensitivity to insulin produced by the agonists of the PPARy (TZD).
  • TG triglyceride
  • these dual hPPARa / g ligands have shown greater efficiency and less toxicity in the treatment of metabolic dysfunctions in animal models than the use of selective compounds for each of the receptors.
  • clinical studies show that dual PPARa / g agonists decrease insulin resistance in type 2 diabetes, blood glucose and TG values in plasma, and participate in the control of vascular inflammation.
  • the search for dual PPARa / g agonists is important for the treatment of various metabolic dysfunctions such as metabolic syndrome, T2D and cardiovascular diseases. Therefore, there is a need to develop agonists of PPARa and / or g that show greater efficacy than the current ones, and / or that also show less toxicity.
  • the present invention describes PPARa and / or PPARy agonist compounds and pharmaceutical compositions comprising them.
  • Said compounds, and the compositions comprising them are useful, in the treatment of diseases that respond to the administration of PPARa and / or PPARy agonists.
  • Said compounds are, therefore, useful in the treatment of cardiovascular disorders, type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, primary chylomicronemia, hyperlipoproteinemia, familial dysbetalipoproteinemia, inflammation and neurodegenerative diseases, such as Parkinson's, Alzheimer's. or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • T2D type 2 diabetes
  • T2D type 2 diabetes
  • metabolic syndrome hypercholesterolemia
  • hypertriglyceridemia primary chylomicronemia
  • hyperlipoproteinemia hyperlipoproteinemia
  • familial dysbetalipoproteinemia familial dysbetalipoproteinemia
  • inflammation such as Parkinson's, Alzheimer'
  • the present invention also describes the uses of said PPARa and / or PPARy agonist compounds and of the pharmaceutical compositions comprising them, in the treatment of a disease that responds to the administration of PPARa and / or PPARy agonists.
  • An embodiment of the disclosed PPAR ⁇ and / or PPAR ⁇ agonist compounds refers to a compound of general formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is independently selected from H or a protecting group of a phenol
  • R 2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, wherein R 7 is independently selected from H, ORs or a C 1-6 alkyl group, and wherein R 3 is an H group or a group C 1-6 alkyl;
  • R 5 is independently selected from H or a carboxylic acid protecting group
  • R 6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl
  • R 3 is H or a C 1-6 alkyl group
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R 10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkylamine, alkylamide, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone.
  • R 1 when R 1 is H and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl, and when R 1 is methyl and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl.
  • One embodiment relates to a compound of general formula I, described above, to its enantiomers, E, Z isomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • protecting group of a phenol is defined as groups that replace the H of the phenol OH group to prevent it from being reactive or groups that favor the pharmacodynamics and pharmacokinetics of the molecule.
  • Non-limiting examples of phenol protecting groups are, inter alia: C 1-6 alkyl (eg methyl, ethyl, propyl, etc.); allyl; alkylamine (eg methyl isoquinoline); alkylamide (eg acetamide); alkylaryl (eg benzyl, p-fluorobenzyl, p-methoxybenzyl); alkyl ether (eg 2-methoxyethoxymethyl); haloalkyl (eg trifluoromethyl, fluoroethyl, chloroethyl); silyl (eg alkyltrimethylsilane, allytrimethylsilane); carbamate C (0) NR m R, where R m and / or R
  • the R 1 group is a protecting group of a phenol which is independently selected from the group consisting of H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R P, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone.
  • R 1 is independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl, allyl, alkylamide, alkylaryl, alkyl ether, alkylbenzoyl, haloalkyl, silyl, haloalkylsulfone or an acyl group -C ( 0) R a , where R a is an aryl group.
  • R 1 is independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl, alkylamide, alkylaryl, or an acyl group -C (O) R a , wherein R a is an aryl group.
  • protecting group of a carboxylic acid is defined, for the purposes of the present invention, as groups that substitute the H for the carboxylic acid group -COOH to prevent it from being reactive or groups that favor the pharmacodynamics and pharmacokinetics of the molecule .
  • Non-limiting examples of carboxylic acid protecting groups are, inter alia: C 1-6 alkyl, allyl, alkylamide, alkylamine, alkylaryl, alkyl ether, alkyl ester, haloalkyl, silyl, carbamate C (0) NR m R P , where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl, acyl C (0) R a , where R a is an aryl group, alkylsulfone or haloalkylsulfone.
  • R 5 is independently selected from H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R P, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl; alkylsulfone or haloalkylsulfone.
  • R 5 is independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl, alkylaryl or alkyl ester.
  • R 5 is independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl, aryl, alkylaryl, alkyl ether, alkyl ester, alkylsulfone, haloalkyl, silyl, haloalkylsulfone.
  • An embodiment of the invention relates to a compound of general formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is independently selected from H; C 1-6 alkyl; allyl; rented out; rent ina; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • R 2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, wherein R 7 is independently selected from H, ORs or an alkyl C group; and wherein Rs is a group H or a C 1-6 alkyl group;
  • R 5 is independently selected from H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R p , where R m and / or R p are each and independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl; alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • R 6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl
  • R 3 is H or a C 1-6 alkyl group
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R 10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkyla ine, alkylaryl, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone.
  • R 1 when R 1 is H and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl, and when R 1 is methyl and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl.
  • a compound of formula I includes all stereoisomers of said formula I.
  • stereoisomer refers, for purposes of the present invention, to molecules having the same molecular formula and the same sequence of atoms attached (same constitution), with the same bonds between their atoms, but differing in the three-dimensional orientation of its atoms in space. Enantiomers and diastereomers are two different types of stereoisomers.
  • anantiomer refers, for purposes of the present invention, to two stereoisomers that are mirror images and not superimposable with each other.
  • an embodiment of the present invention comprises the R and S enantiomers of the compounds of formula I, wherein said enantiomers are the 2 possible enantiomers with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus, including, therefore, the configuration R and S of the radical R 10 .
  • diastereomer refers, for purposes of the present invention, to two stereoisomers that are not mirror images.
  • the diastereomers include meso compounds, E / Z isomers and non-enantiomeric optical isomers.
  • One embodiment relates to a compound of general formula I, described above, to its enantiomers, E, Z isomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the E-isomer with respect to the double bond at the C-'3 position of the prenylated side chain.
  • One embodiment comprises the Z-isomer with respect to the double bond of the C-'3 position of the prenylated side chain.
  • salts refers to any salt that administered to a patient is capable of providing (directly or indirectly) the compound in question.
  • Said salts are preferably addition salts of organic or inorganic acids, or of organic or inorganic bases.
  • acid addition salts include, but are not limited to, inorganic acid addition salts such as, for example, chloride, bromide, iodide, sulfate, nitrate, phosphate, or organic acid addition salts such as, for example, example, acetate, trifluoroacetate, maleate, fumarate, citrate, oxalate, succinate or tartrate.
  • base addition salts include, but are not limited to, addition salts of inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, calcium or ammonium, or addition salts of organic bases such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, N, N-dialkylethanolamine, triethanolamine and basic amino acid salts.
  • inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, calcium or ammonium
  • organic bases such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, N, N-dialkylethanolamine, triethanolamine and basic amino acid salts.
  • the salt formation processes are conventional procedures in the state of the art.
  • C 1-6 alkyl refers, for purposes of the present invention, to a fully saturated hydrocarbon chain of 1 to 6 carbon atoms, which may be linear or branched.
  • haloalkyl refers, for the purposes of the present invention, to a hydrocarbon chain, which may be linear or branched, in which at least one H is substituted by one atom of a halogen.
  • alkylamide refers, for the purposes of the present invention, to a hydrocarbon chain, which may be straight or branched, substituted with an amide group.
  • alkylamine refers to effects of the present invention, to a hydrocarbon chain, which may be linear or branched, substituted with an amino group.
  • aryl refers, for purposes of the present invention, to a group derived from an aromatic hydrocarbon that is formed by extracting a hydrogen atom from an aromatic ring in said aromatic hydrocarbon.
  • said aryl groups may be optionally substituted. Examples of non-limiting substitutions are OH, alkoxide, alkyl, halogen, halogenated alkyl, cyano, thiol, amine or alkylamine.
  • alkylaryl refers, for purposes of the present invention, to a hydrocarbon chain substituted with an aryl group, which in turn is defined as described above.
  • alkoxide refers, for purposes of the present invention, to an oxygen atom attached to a hydrocarbon chain, wherein said hydrocarbon chain may comprise an alkyl group and / or an aryl group, as defined above.
  • alkyl ether refers, for the purposes of the present invention, to a saturated hydrocarbon chain substituted with an alkoxide group, as defined above.
  • acyl refers, for purposes of the present invention, to a carbonyl group attached to a hydrocarbon chain, wherein said hydrocarbon chain may comprise an alkyl group and / or an aryl group, as defined above.
  • esters refers to a group derived from a carboxylic acid -COOH, in which the hydroxyl group -OH is substituted by an alkoxide group, as defined in accordance with present invention
  • alkyl ester refers, for purposes of the present invention, to a saturated hydrocarbon chain substituted with an ester group, as defined above.
  • A is an O atom.
  • A is an S atom.
  • A is a group an NR 7 group, wherein R 7 is independently selected from H, -ORs or a C 1-6 alkyl group, and wherein R s is a group H or a C 1-6 alkyl group. More preferably R 7 is H, -OH or -OCH 3.
  • R is H
  • R is a C alkyl group. More preferably R is a methyl or propyl group.
  • R is an alkylaryl group. More preferably R is a benzyl or 4-fluorobenzyl group. In another preferred embodiment R i is an alkylamide group. More preferably R 1 is an acetamide group.
  • R 1 is an acyl group -C (0) R a . More preferably R1 is an acyl group -C (0) R a , where R a is an aryl group. Even more preferably R a is a phenyl group.
  • R 3 is H.
  • R 3 is methyl
  • R 4 is C 1-6 alkyl or an alkoxide group.
  • the alkoxide group is a halogenated alkoxide group.
  • R 4 is methyl
  • R 4 is -OCH 2 CF 3 .
  • R 5 is H.
  • R 5 is C 1-6 alkyl. More preferably R 5 is methyl, ethyl, propyl, butyl or tert-butyl. Even more preferably R 5 is methyl, ethyl or propyl.
  • R 5 is alkylaryl. More preferably R 5 is benzyl.
  • R 5 is alkyl ester. More preferably R 5 is -CH 2 COOCH 3 or -CH (COOCH 3 ) 2.
  • R 6 is methyl
  • R 6 is OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl. More preferably R 9 is ethyl.
  • R 10 is C 1-6 alkyl. More preferably R 10 is methyl.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, independently selected from the group consisting of 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 8, 9, 10, 11 , 12 and 13:
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer of compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the isomer (E, Z) of the compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the pre-layered side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (E, E) of the compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the pre-layered side chain.
  • One embodiment comprises the isomer (Z, Z) of the compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the pre-layered side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (Z, E) of the compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the pre-layered side chain.
  • One embodiment comprises the E isomer of compounds 9 and 13, relative to the C- '3 position of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the Z-isomer of compounds 9 and 13, relative to the C- '3 position of the prenylated side chain.
  • the compounds of formula I, their stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts, with PPAR agonist activity comprise a common structure derived from the natural prenylated benzopyrans, policerasoidol and policerasoidin (González et al., 1995 and 1996), natural isomers of compounds 1 and 2 here described:
  • the isomer (3 E, 7Z) of compound 1 corresponds to the natural compound policerasoidol
  • the isomer (3 AXE) is the natural compound isopolicerasoidol
  • the policerasoidin corresponds to the isomer (3E, 7Z) of compound 2:
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of compounds 1 and 2, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer of compounds 1 and 2, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the isomer (E, E) of compounds 1 and 2, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (E, Z) of the compounds 1 and 2, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • One embodiment comprises the (Z, Z) isomer of compounds 1 and 2, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (Z, E) of the compounds 1 and 2, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • a preferred embodiment refers to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 3 is methyl and R 2 is a derivative of a prenyl group of structure:
  • Said compounds of formula II include, therefore, compounds 1, 2 and compounds derived with different groups R 1 and R 5 .
  • R 5 when R 1 is H, R 5 is other than H or methyl, and when R 1 is Me, R 5 is other than H or methyl.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula II, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula II, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the isomer (E, Z) of the compounds of formula II, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (E, E) of the compounds of formula II, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • One embodiment comprises the (Z, Z) isomer of the compounds of formula II, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (Z, E) of the compounds of formula II, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • R 1 is H and R 5 is H.
  • R 1 is C 1-6 alkyl and R 5 is H. More preferably R 1 is methyl and R 5 is H.
  • R 1 is H and R 5 is C 1-6 alkyl. More preferably R 1 is H and R 5 is methyl or propyl.
  • R 1 is H and R 5 is alkylaryl. More preferably R 1 is H and R 5 is benzyl. In another preferred embodiment, R 1 is alkylamide and R 5 is alkylaryl. More preferably R 1 is acetamide, and R 5 is benzyl.
  • R 1 and R 5 are alkylaryl. More preferably R 1 and R 5 are benzyl.
  • R 1 is C 1-6 alkyl and R 5 is H. More preferably R 1 is propyl is R 5 is H.
  • R 1 is an acyl group -C (0) R a , wherein R a is an aryl group, and R 5 is an alkyl ester group. More preferably R 1 is a benzoyl group and R 5 is a group - CH 2 COOCH 3.
  • R 1 is a C 1-6 alkyl group and R 5 is an alkyl ester group. More preferably R 1 is a methyl group and R 5 is a group -CH 2 COOCH 3 or a group -CH (COOCH 3 ) 2 .
  • Both compounds 1 and 2 show a similar structure and differ only in the functional group of the C-6 position, a hydroxyl in the compound 1 and a methoxyl in the compound 2. From the compounds 1 and 2 the compounds can be synthesized 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 or 8 of formula I, by substitution of the C-9 'and C-6 positions, as described in Example 1, below.
  • An embodiment of the compound of formula II, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, as described above, is a compound that is independently selected from compound 1, 2, 3, 4, 4a, 4, b, 4c, 6, 7 u 8.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a compound of formula II, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, independently selected from the group consisting of 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 and 8.
  • the compounds 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 and 8 are isomers (E, Z), in relation to the double bonds of the prenylated side chain at positions C-3 'and C-7'.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 3 is H, R 4 and R 10 are methyl and R 2 is a derivative of a prenyl group of structure:
  • Ri, R 5 , and R 6 are defined according to the embodiments of the present invention described above.
  • Said compounds of formula III also have a structure derived from compounds 1 and 2, but unlike the compounds of formula II, they have H instead of methyl as group R 3 , and in addition to the modifications at positions C-6 ( -OR 1 ) and C-9 '(- COOR 5 ), also present modifications in the position C-8' (Re).
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula III, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula III, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the isomer (E, Z) of the compounds of formula III, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the isomer (E, E) of the compounds of formula III, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • One embodiment comprises the isomer (Z, Z) of the compounds of formula III, with respect to the C-'3 and C-7 positions of the prenylated side chain.
  • R 1 is an alkylaryl group
  • R 6 is a group -OR 9 , wherein R 9 is C 1-6 alkyl, and R 5 is H or a C 1-6 alkyl group. More preferably R 1 is a benzyl group, R 6 is a group -OCH 2 CH 3 , and R 5 is H or ethyl.
  • R 1 is a 4-fluorobenzyl group
  • R 6 is an -OCH 2 CH 3 group
  • R 5 is ethyl.
  • An embodiment of the compound of formula III, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, as described above, is a compound that is independently selected from the group consisting of compounds 10, 11 and 12:
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof: wherein R 3 is H, R 4 and R 10 are methyl and R 2 is an alkyl ester group of structure:
  • R 1 and R 5 are defined according to the embodiments of the present invention described above.
  • Said compounds of formula IV also have a structure derived from the compounds of formula I 1 and 2.
  • the compounds of formula IV are compounds of formula I wherein the radical R 3 is H, and not methyl as presented by compounds 1 and 2, and the radical R 2 is an alkyl ester group which, unlike compounds 1 and 2, does not have a second prenyl group.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula IV, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer of the compounds of formula IV, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the E isomer of the compounds of formula IV, with respect to the double bond of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the Z-isomer of the compounds of formula IV, with respect to the double bond of the prenylated side chain.
  • R 1 is alkylaryl and R 5 is C 1-6 alkyl. More preferably R 1 is 4-fluorobenzyl and R 5 is ethyl.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 3 is H, R 10 is methyl and R 2 is -C (0) 0R b , and wherein said compound of formula I is a compound of formula V, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R b is a C 1-6 alkyl group and, R 1 and R 4 are defined according to the embodiments of the present invention described above.
  • Said compounds of formula V also have a structure derived from the compounds of formula 11 and 2, but where in said formula I the radical R 2 is an ester group instead of a prenylated alkyl ester group having compounds 1 and 2.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer of the compounds of formula V, relative to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer of the compounds of formula V, with respect to the C-2 position of the benzopyran nucleus.
  • One embodiment comprises the E isomer of the compounds of formula V, with respect to the double bond of the prenylated side chain.
  • Another embodiment comprises the Z isomer of the compounds of formula V, with respect to the double bond of the prenylated side chain.
  • R 1 is alkylaryl, R b is C 1-6 alkyl and R 4 is an alkoxide group. More preferably R 1 is benzyl, R b is ethyl and R 4 is -OCH 2 CF 3 .
  • An embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of at least one compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, as described above, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the effective amount for the purposes of the present invention, is defined as that amount of the compound that provides an objectively identifiable improvement in the condition of the patient, recognized by a qualified observer, and wherein said patient is treated with a pharmaceutical composition comprising said amount of compound.
  • compositions for the purposes of the present invention, are inert ingredients such as, but not limited to, co-solvents, surfactants, oils, humectants, emollients, preservatives, stabilizers and antioxidants.
  • inert ingredients such as, but not limited to, co-solvents, surfactants, oils, humectants, emollients, preservatives, stabilizers and antioxidants.
  • R 1 is H or a protecting group of a phenol
  • R 2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • - A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, where R 7 is independently selected from H, ORs or a C 1-6 alkyl group, and where R s is an H group or a group C 1-6 alkyl;
  • R 5 is independently selected from H or a carboxylic acid protecting group
  • R6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl;
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R 10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkylamine, alkylamide, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone; Y
  • R 1 is H and R 3 is methyl
  • R 5 is other than H or methyl
  • R 1 is methyl and R 3 is methyl
  • R 5 is other than H or methyl
  • a pharmaceutical composition comprising it, for use as a medicament.
  • Another embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is independently selected from the group consisting of H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R P, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • R 2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • - A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, where R 7 is independently selected from H, ORs or a C 1-6 alkyl group, and where R s is an H group or a group C 1-6 alkyl;
  • R 5 is independently selected from H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • R 6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl
  • R 3 is H or a C 1-6 alkyl group
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkyla ine, alkylaryl, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone; and wherein when R 1 is H and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl, and when R 1 is methyl and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl; or a pharmaceutical composition comprising it, for use as a medicament.
  • An embodiment of the compound of formula I, or of a composition comprising it, for use as a medicament, as described above, comprises any of its enantiomers or mixtures thereof, and any of its E / Z isomers and mixtures thereof, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer.
  • One embodiment comprises the E-isomer.
  • Another embodiment comprises the Z-isomer.
  • Another preferred embodiment relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, which is independently selected from the group consisting of 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, or a pharmaceutical composition comprising it, for use as a medicament.
  • the compounds of formula I described are PPARa and / or PPARy agonists. Therefore, said compounds are useful in the treatment of diseases that respond to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, that is, in diseases mediated by PPARa and / or PPARy agonists, which is equivalent to diseases whose treatment benefits from the administration of PPARa and PPARy agonists.
  • PPARs are considered powerful therapeutic tools in the control of cardiovascular disorders, type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, primary chylomicronemia, hyperlipoproteinemia, familial dysbetalipoproteinemia, inflammation and neurodegenerative diseases.
  • PPARs are of additional importance since they are involved in the control of inflammatory processes, so they can regulate inflammation, vascular function, and vascular remodeling.
  • An embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is H or a protecting group of a phenol
  • R 2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • R b is a C 1-6 alkyl group, wherein - A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, where R 7 is independently selected from H, ORs or a C 1-6 alkyl group, and where R s is an H group or a group C 1-6 alkyl;
  • R 5 is H or a protective group of a carboxylic acid
  • R 6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl
  • R3 is H or a C 1-6 alkyl group
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkylamine, alkylamide, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • a pharmaceutical composition comprising it, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of PPARa and / or PPARy agonists.
  • the disease responding to the administration of PPAR ⁇ agonists and / or PPAR ⁇ is independently selected from cardiovascular disorders, type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, primary chylomicronemia, hyperlipoproteinemia, familial dysbetalipoproteinemia, inflammation. and neurodegenerative diseases.
  • cardiovascular disorders refer to atherosclerosis.
  • neurodegenerative diseases are independently selected from Parkinson's, Alzheimer's or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • An embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is independently selected from the group consisting of H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R P, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone; R2 is independently selected from an alkyl ester group of structure:
  • - A is independently selected from an O atom, an S atom or a NR 7 group, where R 7 is independently selected from H, ORs or a C 1-6 alkyl group, and where R s is an H group or a group C 1-6 alkyl;
  • R 5 is independently selected from H; C 1-6 alkyl; allyl; alkylamide; alkylamine; alkylaryl; alkyl ether; haloalkyl; silyl; C (0) NR m R, where R m and / or R p are each independently H, C 1-6 alkyl or aryl; acyl C (0) R a , where R a is an aryl group; alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • R 6 is C 1-6 alkyl or OR 9 where R 9 is C 1-6 alkyl
  • R3 is H or a C 1-6 alkyl group
  • R 4 is a C 1-6 alkyl group or an alkoxide
  • R10 is independently selected from a group C 1-6 alkyl, allyl, alkylamine, alkylamide, alkylaryl, alkyl ether, haloalkyl, silyl, carbamate, alkylsulfone or haloalkylsulfone;
  • the disease responding to the administration of PPAR ⁇ agonists and / or PPAR ⁇ is independently selected from cardiovascular disorders, type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, primary chylomicronemia, hyperlipoproteinemia, familial dysbetalipoproteinemia, inflammation. and neurodegenerative diseases.
  • neurodegenerative diseases are independently selected from Parkinson's, Alzheimer's or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • An embodiment refers to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of autoimmune diseases, such as type 2 diabetes (DT2).
  • autoimmune diseases such as type 2 diabetes (DT2).
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of atherosclerosis. Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of atherogenesis.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of inflammation and diseases related to inflammatory processes.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of hypercholesterolemia.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of hypertriglyceridemia.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of the metabolic syndrome.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of obesity.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of primary chylomicronemia. Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of hyperlipoproteinemia.
  • Another embodiment relates to a compound of formula I or a pharmaceutical composition comprising it, as described above, for use in the treatment of dysbetalipoproteinemia.
  • R 1 when R 1 is H and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl, and when R 1 is methyl and R 3 is methyl, R 5 is other than H or methyl.
  • An embodiment of the compound of formula I, or of a composition comprising it, for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, as described above, comprises any of its enantiomers or mixtures thereof, and any of their E / Z isomers and mixtures thereof, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • One embodiment comprises the R-enantiomer.
  • Another embodiment comprises the S-enantiomer.
  • One embodiment comprises the E-isomer.
  • Another embodiment comprises the Z-isomer.
  • Another embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, which is independently selected from the group consisting of II, III, IV or V:
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 and R b are defined as described above, or a pharmaceutical composition comprising it, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of PPAR ⁇ agonists and / or PPARy.
  • An embodiment of the compounds of formula II, III, IV or V, or of a composition comprising one of said compounds, for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, such as described above, comprises any of its enantiomers or mixtures thereof, and any of its E / Z isomers and mixtures thereof, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • Another embodiment of the present invention relates to a compound of formula I, stereoisomers and pharmaceutically acceptable salts thereof, which is independently selected from a compound 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13, or a pharmaceutical composition comprising it, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of PPARa and / or PPARy agonists.
  • the compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, for use in the treatment of a disease responsive to administration of PPARa and / or PPARy agonists, described above, comprise the R-enantiomer.
  • the compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, described above, comprise the S enantiomer.
  • the compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of agonists of PPARa and / or PPARy, described above comprise the (E, Z) isomer.
  • compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa agonists and / or PPARy, described above, comprise the (E, E) isomer.
  • the compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of PPARa agonists and / or PPARy, described above comprise the (Z, Z) isomer.
  • compounds 1, 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 and 12, for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa agonists and / or PPARy, described above, comprise the (Z, E) isomer.
  • compounds 9 and 13 for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, described above, comprise the E-isomer.
  • compounds 9 and 13 for use in the treatment of a disease responsive to the administration of PPARa and / or PPARy agonists, described above, comprise the Z-isomer.
  • Another embodiment relates to the use of the compounds of formula I in the treatment of diseases that respond to the administration of PPARa and / or PPARy agonists.
  • Another embodiment relates to a method of treatment comprising the administration of an effective amount of at least one compound of formula I, or of a pharmaceutical composition comprising it, to a patient of a disease that responds to the administration of PPARa agonists. and / or PPARy.
  • Another embodiment of the present invention relates to a compound of formula I independently selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, for use in the treatment of a disease that responds to the administration of dual PPARa and PPARy agonists.
  • the disease responding to the administration of dual PPARa / g agonists is independently selected from cardiovascular disorders, type 2 diabetes (T2D), obesity, metabolic syndrome, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, primary chylomicronemia, hyperlipoproteinemia, familial dysbetalipoproteinemia, inflammation and neurodegenerative diseases.
  • T2D type 2 diabetes
  • obesity obesity
  • metabolic syndrome hypercholesterolemia
  • hypertriglyceridemia hypertriglyceridemia
  • primary chylomicronemia hyperlipoproteinemia
  • familial dysbetalipoproteinemia familial dysbetalipoproteinemia
  • inflammation neurodegenerative diseases.
  • neurodegenerative diseases are independently selected from Parkinson's, Alzheimer's or amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Another embodiment relates to a method of treatment comprising the administration of an effective amount of at least one compound of formula I selected independently between the group consisting of 1, 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, or of a pharmaceutical composition comprising it, to a patient of a disease that responds to the administration of dual PPARa and PPARy agonists.
  • An embodiment of the invention relates to the process of synthesis of the compounds of formula I, as described above, wherein said method comprises:
  • step (b) reducing the ketone group of the benzopyran-4-one obtained in step (a);
  • step (d) is subjected to:
  • Reagents and conditions (a) pyrrolidine, EtOH, 45 ° C, 24 h; (b) Zn, HCl-AcOH (2: 1, v / v), amb temp, 1 h; (c) R 1 X where X is a halogen, K2CO3, EtOH, reflux, 4 h; (d) 1 M DIBAL-H (diisobutylaluminum hydride) in THF, -78 ° C, 20 min; (e) 1) R 4 -MgBr, -78 ° C, 3 h; 2) MeC (OR6) 3 , isobutyric acid (2 drops), 140 ° C, 2 h; (f) (g) tBuOK or NaH, THF, 0 ° C at amb temp, 16h.
  • DIBAL-H diisobutylaluminum hydride
  • the formation of the chroman nucleus has therefore been carried out by (a) condensation of 2,5-dihydroxy acetophenone and alkyl keto ester, giving rise to benzopyran-4-one (Kabbe et al., 1982). Next, (b) the carbonyl group was reduced by Clemmensen reduction, and (c) the phenol group was protected. The elongation of the side chain was carried out (d) by reduction of the ethyl ester forming the corresponding aldehyde.
  • Compound 13 is obtained by subjecting said aldehyde obtained in step (d), to an olefinization by Wittig (f) or Horner-Wadsworth-Emmons (g) reaction (Bisceglia et al, 2012 and Toshima et al., 2001) .
  • step (e) the aldehyde obtained in step (d) was treated, first, with a Grignard reagent generating an allyl alcohol which was subjected to the Johnson-Claisen transposition conditions (Sen et al. al., 1990) to finally obtain the ester of compound 9.
  • Compounds 1-8 and 10-12 are obtained by a second elongation of the side chain again using the conditions of step (d) described above to perform the reduction of the group ester of compound 9 forming the corresponding aldehyde, wherein said aldehyde is subjected to an olefinization by reaction of Wittig (f) or Horner-Wadsworth-Emmons (g).
  • Figure 1 Effect on cell viability by the MTT test of policerasoidol (1), policerasoidin (2), compound 8, WY-14643 and rosiglitazone.
  • Fig. 1A human neutrophils
  • Fig. 1 B HUVEC
  • Figure 3 Effect of policerasoidol (1), policerasoidin (2), compound 8, WY-14643 and rosiglitazone, on cell viability by flow cytometry. Percentage of apoptotic neutrophils (Fig. 3A), survival (Fig. 3B), apoptosis (Fig. 3C) and survival in HUVEC (Fig. 3D) after 24 h incubation with compounds 1, 2, 8, WY-14643 and rosiglitazone.
  • Apoptotic cells were quantified as a percentage of the total population of late apoptotic and / or necrotic annexins V + / PL as annexin V + / PI + , and viable non-apoptotic cells such as annexin VVPI ⁇
  • FIG. 4A Percentage of neutrophil apoptosis (Fig. 4A), survival (Fig. 4B), apoptosis of HUVEC (Fig. 4C) and survival (Fig. 4D) after 24 h of incubation.
  • Apoptotic cells were quantified as a percentage of the total annexin V + / Pl ⁇ population, late apoptotic and / or necrotic as annexin V + / PI + , and viable non-apoptotic cells such as annexin V- / Pl ⁇
  • Representative flow cytometry panels (Fig. 4E) have been included showing the effects of the vehicle and compound 9 on apoptosis / neutrophil survival.
  • Policerasoidol (1) inhibits the adhesion of mononuclear cells to HUVEC induced by TNFa under conditions of physiological flow.
  • the cells were pretreated for 20 h with 1 mM of policerasoidol (1), policerasoidin (2), compound 8, WY-14643 or rosiglitazone, prior to stimulation with TNFa (20 ng / mL, 24 h).
  • Freshly isolated human neutrophils or mononuclear cells were perfused on endothelial monolayers for 5 min at 0.5 dynes / cm 2 and the adhesion of neutrophils (Fig. 5A) and mononuclear cells was quantified (Fig. 5B).
  • the dose-response curves were performed for policerasoidol (1) and rosiglitazone with HUVEC stimulated with TNFa (20 ng / mL, 24 h) and perfusion of freshly isolated human mononuclear cells (Fig. 5C). The results are the mean ⁇ SEM of 4-6 independent experiments. ** p ⁇ 0.01 relative to the vehicle group and ⁇ p ⁇ 0.01 relative to cells stimulated with TNFa.
  • Compound 9 inhibits the adhesion of mononuclear cells to HUVEC induced by TNFa under physiological flow conditions. Some cells were pretreated for 20 h with 3, 30 or 100 pM of compound 9, prior to stimulation with TNFa (20 ng / mL, 24 h). Freshly isolated human neutrophils or mononuclear cells were perfused on endothelial monolayers for 5 min at 0.5 dyne / cm 2 and the adhesion of neutrophils (Fig. 6A) and mononuclear cells was quantified (Fig. 6B).
  • the concentration-response curves (0.1-100 pM) were performed for compound 9 with HUVEC stimulated with TNFa (20 ng / mL, 24 h) and perfusion of freshly isolated human mononuclear cells (Fig. 6C). The results are the mean ⁇ SEM of 4-6 independent experiments. ** p ⁇ 0.01 relative to the vehicle group and ++ p ⁇ 0.01 relative to cells stimulated with TNFa.
  • FIG. 8 The silencing of PPARY O RXRa by siRNA stops the inhibitory effect of policerasoidol (1) on the interactions between endothelial cells-mononuclear leukocytes induced by TNFa.
  • HUVEC were transfected with the control, siRNA specific for RXRa, PPARa or PPARY. 48 h after transfection, the cells were pretreated with policerasoidol (10 mM) or rosiglitazone (1 pM) for 20 h and then stimulated with TNFa (20 ng / ml_, 4 h). Mononuclear cell adhesion was quantified. The results are the mean ⁇ SEM of 3-4 independent experiments.
  • ICAM-1, VCAM-1, and CX3CLI was also visualized in HUVEC non-permeabilized by immunofluorescence, using alexa-fluor 488 (green) (Fig. 10E).
  • the nuclei were contrasted with Hoechst dye (blue). * p ⁇ 0.05 or ** p ⁇ 0.01 relative to the vehicle group, ⁇ p ⁇ 0.05 or ttp ⁇ 0.01 relative to cells stimulated with TNFa.
  • FIG. 11 Compound 9 inhibits the expression in HUVEC of VCAM-1, CX3CLI and CXCL16 induced by TNFa, but not of ICAM-1.
  • Some cells were pretreated with compound 9 (3 pM) 20 h prior to stimulation with TNFa (20 ng / mL, 24 h).
  • the expression of ICAM-1 (Fig. 11 A), VCAM-1 (Fig. 11 B), CX3CLI (Fig. 11 C) and CXCL16 (Fig. 11 D) was determined by flow cytometry.
  • ICAM-1, VCAM-1, CX3CLI and CXCL16 were also visualized in HUVEC not permeabilized by immunofluorescence, using alexa-fluor 488 (green) (Fig. 11 E). The nuclei are contrasted with Hoechst dye (blue). ** p ⁇ 0.01 relative to the vehicle group, ⁇ p ⁇ 0.05 or ⁇ p ⁇ 0.01 relative to cells stimulated with TNFa.
  • FIG. 13 Compound 9 inhibits the activation of p38 MAPK and NF-kB (p65) induced by TNFa in HUVEC.
  • the cells were stimulated for 1 h with TNFa (20 ng / mL). Some cells were pretreated with compound 9 (3 mM) 20 h before stimulation with TNFa.
  • the activation of p38 MAPK (Fig. 13A) and NF-kB (Fig. 13B) was determined by flow cytometry.
  • the representative histograms are shown. ** p ⁇ 0.01 relative to the vehicle group and ⁇ p ⁇ 0.05 relative to cells stimulated with TNFa.
  • FIG. 14A Compound 9 does not produce significant differences in weight gain (g) and food efficiency in ob / ob mice after 4 days of treatment.
  • the histograms show the weight gain (Fig. 14A) which was expressed as the weight difference between day 5 and day 0 (ds-do), and the feed efficiency (Fig. 14B) which was calculated as the quotient between the weight gain and the food consumed. No significant differences in weight gain or feed efficiency were observed between the mice treated with compound 9 and the control groups.
  • FIG. 15 Compound 9 and rosiglitazone reduce plasma glucose values in ob / ob mice after 4 days of treatment.
  • the variation of glucose with respect to d 0 has been represented, which has been calculated using the following formula: ((d 5 -d o ) / d o ) x 100.
  • FIG. 18 Study of the anti-inflammatory effect in white adipose tissue (WAT) in ob / ob mice after 4 days of treatment.
  • Level of MCP-1 mRNA expression in WAT (Fig. 18A) and Quantification of F4 / 80 + macrophages in WAT by immunohistochemistry (Fig. 18B).
  • Compound 9 decreases MCP-1 mRNA expression and the number of infiltrated macrophages in white adipose tissue (WAT).
  • FIG. 19 Compound 9 and WY-14643 increase the levels of total cholesterol and HDL-c, and decrease the levels of triglycerides and free fatty acids in plasma.
  • Total cholesterol values Fig. 19A
  • HDL-c Fig. 19B
  • triglycerides Fig. 19C
  • free fatty acids Fig.19D.
  • Figure 21 Compound 9 reduced circulating levels of ALT and AST Levels of alanine amino transferase (ALT) and aspartic transaminase (AST) in ob / ob mice plasma after 4 days of treatment.
  • Hewlett-Packard HP-1 100 or TripleTOF5600 (ABSciex) was used for the LC-MS analysis, with the API source (atmospheric pressure ionization) configured as APCI (chemical ionization at atmospheric pressure) or API ES (electrospray ionization) ) in positive or negative mode.
  • the NMR spectra 1 H, 13 C, COZY 45, DEPT, HSQC and HMBC
  • the resonance multiplicities of 13 C NMR were assigned by DEPT experiments.
  • the NMR assignments were supported in COSY 45, DEPT, HSQC and HMBC experiments.
  • policerasoidol (1) and policerasoidin (2) were isolated from a methanolic extract of stem barks of Polyalthia cerasoides and P. sclerophylla and were identified based on their chromatographic and spectral characteristics (González et al., 1995 and 1996) .
  • reaction mixture was filtered, and the filtrate was diluted with CH2Cl2 (100 mL) and washed with 1 N HCl (3 x 50 mL), H2O (3 x 50 mL) and brine (3 x 50). mL), dried over anhydrous Na 2 SO 4 and evaporated in a rotary evaporator. The residue was purified by silica gel column chromatography (hexane-AcOEt, 70:30) to obtain benzopyran-4-one (729 mg, 2.62 mmol, 80%) as a yellow oil.
  • the residue obtained (250 mg) was used in the next reaction without purification.
  • the residue was treated with 10 mL of triethyl orthoacetate and catalytic amounts of isobutyric acid (3 drops) (Sen et al., 1990). 7
  • the mixture was stirred at 140 ° C for 2 h. After cooling, the mixture was concentrated in the rotary evaporator to remove excess triethylortoacetate.
  • the residue was diluted with CH 2 CI 2 (20 mL) and washed with H 2 O (3 x 15 mL), dehydrated with anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated in the rotary evaporator.
  • step (e) a reduction of the ester group, obtained by transposition of Johnson-Claisen, is again carried out to obtain an aldehyde again, according to the conditions described in step (d) of section 1.3. .
  • Compound 11 is obtained by hydrolysis of the ester group, by treatment with KOH at reflux of compound 10.
  • Steps (a), (b), (c) and (d) are carried out as described in section 1.3, where the O-protection of the benzopyran ester is carried out with benzyl chloride.
  • Cos-7 cells were obtained from the ATCC (CRL-1651). Cells were maintained under standard culture conditions (Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium, DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FCS) at 37 ° C in a 5% humidity atmosphere CO2 The medium was changed every 2 days.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium
  • Cos-7 cells were seeded on 60 mm discs at a density of 5.5 x 10 5 cells / disk in DMEM supplemented with 10% FCS and incubated at 37 ° C for 16 h before transfection.
  • the cells were transfected in DMEM, using jetPEI, with reporter (pG5-TK-pGL3) and expression plasmids (pGal4-h, hPPARa or hPPARy).
  • the expression plasmid pCMV- ⁇ -galactosidase was co-transfected as a control for the efficiency of transfection.
  • the transfection was stopped by adding DMEM supplemented with 10% FCS, and the cells they were trypsinized and seeded in 96-well plates and incubated for 6 h in DMEM containing 10% FCS. Subsequently, the cells were incubated for 24 h in DMEM containing 0.2% FCS and increasing concentrations of the compounds or vehicle were tested (DMSO, maximum concentration 0.1%). Finally, the cells were washed once with PBS chilled on ice, and the luciferase and b-galactosidase assays were used.
  • the assays were carried out on a chimera of a human PPAR / Gal4 luciferase reporter gene system to determine the maximum transactivation response of each compound.
  • the different compounds were tested in a concentration range of 0.001 to 10 mM.
  • the results obtained from all the compounds were compared with the data of the reference compounds WY-14643 and rosiglitazone in hPPARa and hPPARy, respectively.
  • the EC50 data showed that the natural compound 1, and its semisynthetic derivative 3, with the free phenolic group, exhibit total agonist activity on hPPARa and hPPARy, and high percentages of transactivation (107-100% and 95-86% for hPPARa and hPPARy, respectively).
  • Compound 4c the O-propylated derivative with a free carboxylic function at C-9 ', showed the highest percentage of transactivation (191% and 88% for hPPARa and hPPARy, respectively).
  • the other policerasoidol derivatives (4a, 4b and 5) showed lower transactivation percentages than compounds 1, 3 and 4c at the concentrations tested.
  • compound 1 naturally and 9 (synthetic) showed a potent dual agonist action of the PPARa and PPARy receptors.
  • Compound 2 exhibited a dual PPARa / and moderate activity and compound 8 displaced its selectivity towards activation of PPARy (Table 1).
  • Example 3 Cytotoxicity studies in human neutrophils and human umbilical cord vein endothelial cells (HUVEC)
  • compounds 1, 2 and 8 were evaluated at concentrations of 30 and 100 mM in human neutrophils (Fig. 1A) and primary cell cultures of human umbilical cord vein endothelial cells (HUVEC) (Fig. 1 B) by two different techniques: the MTT colorimetry assay and the flow cytometric analysis of cell apoptosis and survival.
  • the synthesized compound 9 was evaluated at 10, 30 and 100 pM (Fig. 2).
  • MTT test The viability of neutrophils and HUVEC was determined by the MTT colorimetry assay (3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide).
  • Neutrophils were obtained from the leukoplaque fraction (buffy coats) of healthy donors by centrifugation with Ficoll-Hypaque density gradient.
  • Human umbilical cord vein endothelial cells were isolated by collagenase treatment and maintained in human specific endothelial basal medium (EBM-2) supplemented with endothelial growth medium (EGM-2) and 10% FCS. Passage 1 cells were grown to confluence in 24-well plates. Before starting each experiment, the cells were incubated 24 h in medium containing 1% FBS.
  • the rate of apoptosis and survival in human neutrophils and HUVEC was determined by double staining with annexin V and propidium iodide (Pl) by flow cytometry.
  • Cytofluorometric analysis of apoptosis and survival The FITC Annexin V Apoptosis Detection kit (BD Bioscience, San Jose, CA) was used. The staining protocol and all reagents were supplied in the commercial kit. The HUVEC separated from the jars of Acutase culture (StemPro® Accutase® Cell dissociation reagent, Thermofischer Scientific Waltham, MA). Both cell types were incubated at 37 ° C for 24 h in the presence or absence of the compounds to be tested.
  • HUVEC confluents and freshly isolated neutrophils were washed, resuspended in 1x binding buffer (1 x 10 6 cells / ml_) and stained with annexin V conjugated with FITC and propidium iodide (Pl), as described in the manufacturer's instructions .
  • the cells were analyzed in a BD FACSVerse Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) flow cytometer and differentiated as early apoptosis cells (Annexin V + and Pl), late and / or necrotic apoptosis (Annexin V + and Pl + ), and living cells (annexin V- and PI-).
  • Example 4 Effect of Compounds 1. 2. 8 9 on the Leukocyte-Endothelium Interaction Induced by TNFa Under Flow Conditions
  • endothelial dysfunction is one of the first manifestations of the onset of atherosclerosis that leads to a phenotype proinflammatory and prothrombotic of the endothelium, causing the release and migration of leukocytes to the subendothelial space.
  • PPAR in particular PPARcr and PPARy, are expressed in most vascular cells, including endothelial and smooth muscle cells, where they participate in specific anti-inflammatory effects and lipid control (Rosenson et al., 2012).
  • 12 PPAR ⁇ agonists are able to inhibit the inflammatory process, decreasing the accumulation of neutrophils and mononuclear cells (Palee et al., 2011).
  • the parallel flow chamber technique was used to visualize cell adhesion under dynamic conditions of physiological flow.
  • neutrophils and mononuclear cells were perfused through monolayers of HUVEC previously stimulated or not with TNFa (20 ng / mL) for 24 h.
  • TNFa (20 ng / mL)
  • human mononuclear cells were obtained in suspension from healthy volunteers using the Ficoll-Hypaque method of centrifugation by density gradient.
  • Freshly isolated cells (1 x 10 6 / mL) were perfused through the monolayer of endothelial cells (HUVEC) stimulated or not, with TNFa for 24 h.
  • the interactions of leukocytes were determined after perfusing for 5 min at 0.5 dynes / cm 2 .
  • HUVEC plates were placed in the flow chamber (GlycoTech, Gaithersburg, MD) and a camera placed on an inverted phase contrast microscope (Axio Observer A1 Cari Zeiss microscope, Thornwood, NY) was attached to visualize cell adhesion ( 20x objective and 10x eyepiece). In addition, the images were recorded in video for later analysis.
  • the HUVEC were pretreated with policerasoidol (1), policerasoidin (2), compound (8), or compound 9 at doses of 1, 3, 10, 30 and 100 mM, as well as WY-14643 or rosiglitazone at 1 pM, 20 hours before stimulation with TNFa (Sanz et al, 2012).
  • TNFa caused a significant increase in adhesion to endothelial cells of mononuclear leukocytes and neutrophils ( Figures 5 and 6). None of the compounds significantly inhibited HUVEC-neutrophil interactions at the 1 pM concentration, however, it should be noted that pretreatment with policerasoidol (1), synthesized analogue 9 and rosiglitazone significantly decreased the adhesion of HUVEC-mononuclear cells ( Figures 5 and 6) in a concentration-dependent manner ( Figures 5C and 6B).
  • policerasoidol (1) was 5 times less potent than rosiglitazone, while compound 9 showed a potency of approximately 3.6 and 16 times greater than rosiglitazone and policerasoidol, respectively (IC50 values of 0.30 pM vs. 1 , 1 pM and 4.9 pM, respectively).
  • IC50 values 0.30 pM vs. 1 , 1 pM and 4.9 pM, respectively.
  • Example 5 policerasoidol (1) and compound 9 inhibited mononuclear cell adhesion to the endothelium, induced by TNFa via RXRa / PPARv interaction
  • Policerasoidol (1) and the compound synthesized 9 are dual PPARa / g agonist ligands and rosiglitazone is a PPARY selective agonist.
  • siRNA interfering RNA
  • Confluent HUVECs were transfected with specific RXRa, PPARa, PPARY siRNAs (Dharmacon, Lafayette, CO) using lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carslbad, CA) for 48 h (Sanz et al., 2012). 13 Next, the cells were treated for 20 h with policerasoidol (1) to 10 mM or 1 mM rosiglitazone and then stimulated for 4 h with TNFa (10 ng / ml_). In order to confirm the silencing of PPARa, PPARY and RXRa via siRNA, we performed the analysis by Western blot (Sanz etai, 2012).
  • PPARs form heterodimers with RXR that in some cases respond synergistically to both agonists, RXR and the receptor. Since PPARY can interact with RXRa to produce its anti-inflammatory activity (Sanz et al., 2012), the targeted deletion of the expression of RXRa in HUVEC with RXRa-specific siRNA (> 72% protein reduction, Figure 7) also completely suppressed the inhibitory effect of policerasoidol (1) on the adhesion of mononuclear cells induced by TNFa ( Figure 8C).
  • the HUVEC were immunoprecipitated with an anti-PPARY antibody and subjected to electrophoresis and western blotting with an anti-RXRa antibody, and the increase of the RXRa / PPARY interaction was detected in those cells pretreated with policerasoidol (1) or rosiglitazone ( Figure 8D).
  • protein extracts were obtained in 50 mM Tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 and protease (1 mM PMSF, 40 pg / mL aprotinin and 40 pg / mL leupeptin) and phosphatase inhibitors. Then, the protein extracts ( ⁇ 200 pg) were incubated with 5 pg of antibody against PPARY. Immunocomplexes were precipitated using an anti-rabbit IgG beads (cat # 8800, eBioscience, San Diego, CA) and suspended in sample buffer with 50 mM dithiothreitol (DTT).
  • DTT dithiothreitol
  • the Western blot was carried out with an antibody against RXRa and the membranes were incubated with the secondary HRP-conjugate Rabbit TrueBlot (eBioscience, San Diego, CA) as a secondary antibody. Chemiluminescence signals were developed with ECL (GE Healthcare, Madrid, Spain).
  • Example 6 policerasoidol (1) and the synthesized compound 9 decrease the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and fractalkine (CX 3 CLI), induced by TNFa
  • ICM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • CX 3 CLI fractalkine
  • cytokines and chemokines that may reflect alterations in endothelial function.
  • Proinflammatory cytokines stimulate the endothelium to express cell adhesion molecules (CAM), such as the vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), increasing the adhesion of leukocytes to vascular endothelial cells, which is an important process of the initial stage of inflammatory and immunological responses (Zernecke et al., 2010).
  • CAM cell adhesion molecules
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • IAM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • PPARY is expressed in vascular tissues and leukocytes, and its activation can decrease the expression of CAMs such as ICAM-1 or VCAM-1, as well as the expression of CX 3 CLI (fractalquina).
  • CX 3 CLI is a chemokine that is expressed on the surface of endothelial cells, and can bind to its CX 3 CRI receptor, expressed in monocytes, T lymphocytes and NK cells, promoting cell adhesion.
  • CX 3 CLI can also be detached from the cell surface by the action of ADAM10 and ADAM17, releasing a soluble form capable of acting as a chemoattractant of the leukocytes that express their receptor.
  • CXCL16 transmembrane chemokine
  • ADAM10 transmembrane chemokine
  • chemokines and adhesion molecules regulate the adhesion and migration of leukocytes to the vascular wall, and there are indications that an increase in their endothelial expression is associated with an increase in atherosclerosis (Zernecke et al., 2008).
  • HUVEC was pretreated with policerasoidol (1) (10 mM) or compound 9 (3 pM) for 24 h, and stimulated with TNFa ( 20 ng / ml_) for an additional 24 h.
  • the cells were collected from the flasks using accutane (StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, ThermoFischer Scientific, Waltham, MA).
  • HUVEC HUVEC were incubated at 4 ° C overnight with a primary mouse monoclonal antibody against human VCAM-1 (1: 200 dilution, 1.G1 1 B1 clone, Serotec, Kidlington, UK), ICAM-1 (dilution 1 : 200; clone 6.5B5, Serotec, Kidlington, United Kingdom), CX3CLI (1: 200 dilution, clone 81506, R & D Systems, Minneapolis, MN) or CXCL16 (1: 200 dilution; Immunostep, Salamanca, Spain) in a 0 solution , 1% BSA / PBS, followed by incubation with a secondary antibody alexa-fluor 488-goat anti-rabbit conjugate (1: 1000 dilution; A11034, Life Technologies, Carlsbad, CA) at room temperature for 1 h.
  • a primary mouse monoclonal antibody against human VCAM-1 1: 200 dilution, 1.G1 1 B1 clone, Ser
  • Example 7 policerasoidol (1) and compound 9 inhibit the activation of p38 MAPK v NF-
  • HUVEC HUVEC were previously incubated for 24 h with compound 1 (10 mM) or 9 (3 mM) and stimulated for 1 h with TNFa (20 ng / mL).
  • the endothelial cells were fixed with BD Cytofix Fixation Buffer (BD Biosciences, San Jose, CA) and permeabilized with BD Sol Perm III solution (BD Biosciences, San Jose, CA) and stained sequentially with a 1: 10 dilution of an antibody.
  • PE-conjugated mAb against human p65 (pS529, clone K10-895.12.50; BD Biosciences, San Jose, CA) and a 1: 10 dilution of Alexa Fluor-conjugated mAb antibody against human p38 MAPK (pT80 / pY182, clone 36 / p38; BD Biosciences, San Jose, CA).
  • Cells were analyzed using a BD FACSVerse flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).
  • Example 8 Treatment of ob / ob mice with compound 9.
  • Ob / ob mice have a deficiency of leptin, and are associated with hyperphagia, and obesity, as well as hyperglycemia and hyperinsulinemia.
  • male ob / ob mice (C57BL / 6J) (Charles River laboratories, Chatillon-sur-Chalaronne, France) were used.
  • mice were housed in individual cages in a room where temperature, humidity and light were controlled. They were maintained and raised (to be stabled by the UCIM, Universitat de Valéncia). in pathogen-free conditions with free access to food and autoclaved water, at a humidity of 60-65% and at a constant temperature of 22 ⁇ 2 ° C with a dark / light cycle of 12 h (light of 06: 00-18: 00 h, darkness from 6:00 p.m. to 6:00 p.m.). The mice were allowed to acclimate for ten days before the study.
  • mice from 7 to 8 weeks of age were treated daily between 9:00 a.m. and 11:00 p.m. with compound 9 orally by an orogastric tube (10 mg / kg / d and 30 mg / kg). / d), rosiglitazone (10 mg / Kg / d) and / or WY-14643 (30 mg / Kg / d) for 4 days, and compared with the control group of ob / ob mice treated only with the vehicle (serum physiological with HEC 1%).
  • the compounds were prepared daily as suspensions in 1% HEC for oral administration. Randomization was performed on blood glucose values at day 0. During the duration of the experiment, weighed daily for each mouse: amount of food ingested and body weight. Daily, between 9:00 a.m. and 1:00 p.m. (pre-treatment) blood glucose was measured using (Contour next USB Blood glucose meter, BAYER, Basel, Switzerland).
  • mice On the fifth day of the experiment, the mice were anesthetized with isoflurane and the blood was extracted by cardiac puncture. The blood was collected in tubes containing EDTA or heparin. Once the samples were taken, the animals were sacrificed by cervical dislocation and later, various organs were extracted as white adipose tissue (WAT) and liver, for further study. The organs were weighed and frozen for subsequent RNA analysis and histological studies. Plasma samples were obtained by centrifugation and stored at -80 ° C.
  • WAT white adipose tissue
  • the samples were developed using a solution containing 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), subsequently counterstained with Harris haematoxylin (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain) and dehydrated.
  • DAB 3, 3'-diaminobenzidine
  • Harris haematoxylin Sigma-Aldrich, Madrid, Spain
  • Five fields of each WAT tissue section were photographed (Axio Observer A1, Cari Zeiss microscope, Thornwood, NY) digitized and analyzed (ImageJ software 1.48V, Bethesda, MA). The quantification was done double blind and by codes.
  • the relative quantification of the different transcripts was determined with the 2 _AACt method using GAPDH (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltha, MA) co or endogenous control and normalized for the control group.
  • the free fatty acids in plasma FAA
  • AST enzyme aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • plasma lipid levels of total cholesterol and triglycerides TG were determined by enzymatic methods (WAKO, Cape Charles, VA).
  • the concentration of HDL-cholesterol (HDL-c) was also determined with the same method as that used to measure total cholesterol, after the precipitation of apolipoprotein-B (apoB) with dextran sulfate / MgCh (Sigma-Aldrich, Madrid , Spain) as previously described (Zieske et al., 2005).
  • compound 9 and WY-14643 showed a decrease in plasma triglyceride levels, although not significantly and which could be due to the short treatment period (122 mg / dL or 101 mg / dL at a dose of 10 mg / dL). or 30 mg / Kg / d, respectively, vs. 137 mg / dL of control ob / ob) ( Figure 19C).
  • the compound 9 to 30 mg / Kg / d and WY-14643 were able to significantly lower the levels of fatty acids free blood (0.25 and 0.33 moles / pL, respectively, vs. 0.67 moles / pL of the ob / ob control)
  • Compound 9 decreased levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST)
  • Compound 9 decreased the levels of ALT and AST, the latter suffering a statistically significant reduction at the concentration of 30 mg / Kg / d (28%) compared to the ob / ob control group after 4 days of treatment ( Figure 21) . This suggests that compound 9 could reduce liver damage, showing a hepatoprotective effect.

Abstract

La presente invención describe compuestos de fórmula I que comprenden una estructura central de benzopirano prenilado. Formula (I) Dichos compuestos de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables, presentan actividad como agonistas de PPARα, PPARγ, o actividad dual agonista de PPARα y PPARγ. Se describen por tanto compuestos con dicha estructura benzopirano prenilado de fórmula I, sus composiciones farmacéuticas, su primer uso médico, así como el uso de compuestos de estructura benzopirano prenilado en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARα y/o PPARγ.

Description

BENZOPIRANOS PRENILADOS AGONISTAS DE PPAR
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con compuestos que comprenden una estructura central de benzopirano prenilado. Dichos compuestos presentan actividad como agonistas de PPARa, PPARY, O actividad dual agonista de PPARa y PPARY. La invención se refiere por tanto compuestos con dicha estructura benzopirano prenilado de fórmula I, sus composiciones farmacéuticas, primer uso médico, así como el uso de compuestos de estructura benzopirano prenilado en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARY. Dichas enfermedades son desórdenes tales como diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, desórdenes cardiovasculares, dislipidemias, tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia familiar (grave y moderada), quilomicronemia primaria, la disbetalipoproteinemia familiar o la hiperlipoproteinemia, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los receptores activadores de la proliferación de peroxisomas (PPAR) pertenecen a la familia de receptores hormonales nucleares. Existen tres tipos de PPAR: PPARa (NR1C1), PPARb/d (NUC1 ; NR1C2), y PPARY (NR1 C3). Todos actúan como heterodímeros con receptores del ácido 9-cis-retinoico (receptor X retinoide; RXR) y ejercen un papel fundamental en la regulación de diversas vías metabólicas, incluyendo la biosíntesis de lípidos y metabolismo de la glucosa, así como en la diferenciación y proliferación celular y apoptosis (Cheang et ai, 2015, Ahmadian et ai, 2013 y Tan et al., 2017).
Los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de diferentes patologías, tales como la diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, hiperlipidemia, desórdenes cardiovasculares, inflamación y enfermedades neurodegenerativas. Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular (Cheang et al., 2015, Ahmadian et al., 2013 y Tan et al., 2017).
Los PPARa se encuentran principalmente en hígado, riñones, corazón, músculo y tejido adiposo, y juegan un papel fundamental en la oxidación de ácidos grasos y el metabolismo de las lipoproteínas. PPARy predomina fundamentalmente en tejido adiposo, macrófagos, monocitos, células intestinales, músculo esquelético y endotelio. Están relacionados con el metabolismo lipídico, adipogénesis, homeostasis de la glucosa, y sensibilización a la insulina.
Los ligandos PPAR y en particular los agonistas PPARa y PPARy, inhiben la activación de la expresión de genes de la inflamación y pueden interferir negativamente con vías de señalización de factores de transcripción proinflamatorios en células vasculares e inflamatorias.
Los PPARa son activados por los compuestos de estructura fibrato: fenofibrato, clorfibrato, benzafibrato, y compuestos similares tales como WY-14643:
Figure imgf000004_0001
Fenofibrato (agonista PPARa) WY- 14643 (agonista PPARα)
Los agonistas de PPARa son capaces de disminuir los niveles de triglicéridos y aumentar HDL-c, siendo muy efectivos en el tratamiento de hipertrigliceridemia.1
Entre los ligandos de PPARy conocidos de estos receptores destacan los agonistas de tipo tiazolidinedionas (TZD), entre los que se encuentra rosiglitazona y pioglitazona, que se han utilizado en clínica para el tratamiento de DT2 debido a su capacidad de disminuir los niveles de glucosa en sangre y mejorar la sensibilidad a la insulina (Ahmadian et al., 2013).
Figure imgf000004_0002
Rosiglitazona (agonista PMRy)
El desarrollo de agonistas de PPARa o de PPARy, o de agonistas duales de PPARa/PPARy, ha llevado a la síntesis de una nueva clase de candidatos con potencial terapéutico (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). De hecho, los agonistas duales PPARa/g se consideran compuestos más potentes para corregir la homeostasis de lípidos y de glucosa en DT2 y síndrome metabólico, que los agonistas selectivos (Tan et al., 2017). A pesar de la eficacia clínica de los agonistas PPARa y PPARy en el tratamiento de las dislipemias y DT2, respectivamente, la aparición de numerosos efectos adversos ha limitado el uso de estos agonistas selectivos, obligando la retirada de numerosos fármacos. En particular, los agonistas PPARa pueden producir un aumento en los niveles de creatinina y transaminasas, y más raramente miopatía, mientras que los agonistas PPARy están relacionados con aumento de peso, edema e infarto de miocardio (Cheang et al., 2015). La posibilidad de encontrar un único compuesto capaz de activar los dos receptores PPARa y PPARy, agonista dual, se presenta como una alternativa potencial en el tratamiento de la DT2 y el síndrome metabólico, con menores efectos secundarios (Cheang et al., 2015 y Tan et al., 2017). Recientemente se ha aprobado el uso de dos agonistas duales PPARa/g pertenecientes al grupo de los glitazares, saroglitazar en la India (Lipaglyn™, por el centro de investigación Zydus Cadila) y lobeglitazona en Corea (Duvie™, por Chong Kun Dang), para el control lipídico y glucémico (Tan et al., 2017).
Figure imgf000005_0001
Saroglitazar (agosista dual PPARα/γ)
Sin embargo, otros agonistas duales como farglitazar y muraglitazar se han retirado del mercado debido a sus efectos secundarios de edema, infarto de miocardio, ictus y fallo cardiaco, así como aleglitazar (en fase clínica II), ragaglitazar y tesaglitazar ya que han mostrado carcinogeneicidad en modelos de roedores y un aumento de la creatinina en plasma (Tan et al., 2017).
El desarrollo de agonistas duales hPPARa y hPPARy permite combinar las propiedades de los agonistas del PPARa (fibratos) sobre la regulación del metabolismo lipídico incluyendo disminución de triglicéridos (TG), con el efecto adicional de mejorar la sensibilidad a la insulina que producen los agonistas del PPARy (TZD). Generalmente, estos ligandos duales hPPARa/g han mostrado en modelos animales mayor eficacia y menor toxicidad en el tratamiento de disfunciones del metabolismo, que la utilización de compuestos selectivos para cada uno de los receptores. De hecho, estudios clínicos muestran que agonistas duales PPARa/g disminuyen la resistencia a la insulina en diabetes tipo 2, los valores de glucemia y TG en plasma, y participan en el control de la inflamación vascular. Por lo tanto, la búsqueda de agonistas duales PPARa/g es importante para el tratamiento de diversas disfunciones metabólicas como es síndrome metabólico, DT2 y enfermedades cardiovasculares. Por todo ello, existe la necesidad de desarrollar agonistas de PPARa y/o g que muestren mayor eficacia que los actuales, y/o que además muestren menor toxicidad.
DESCRIPCIÓN
La presente invención describe compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy y composiciones farmacéuticas que los comprenden. Dichos compuestos, y las composiciones que los comprenden son útiles, en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy. Dichos compuestos son, por tanto, útiles en el tratamiento de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). La presente invención describe, asimismo, los usos de dichos compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy y de las composiciones farmacéuticas que los comprenden, en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
Una realización de los compuestos agonistas de PPARa y/o PPARy descritos se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000006_0001
donde
R1 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de un fenol;
R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000006_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000007_0001
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,
en donde
A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde R3 es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;
R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido.;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.
En una realización de la presente invención cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.
Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
A efectos de la presente invención se define el término“grupo protector de un fenol” como grupos que sustituyen al H del grupo fenol OH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de fenol, entre otros: C1-6 alquilo (p.ej. metilo, etilo, propilo, etc.); alilo; alquilamina (ej. metil- isoquinoleína); alquilamida (p.ej. acetamida); alquilarilo (p.ej. bencilo, p-fluorobencilo, p-metoxibencilo); alquil-éter (p.ej. 2-metoxietoximetil); halo-alquilo (p. ej. trifluorometilo, fluoroetilo, cloroetilo); sililo (p.ej. alquiltrimetilsilano, aliltrimetilsilano); carbamato C(0)NRmR , donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; un grupo acilo (p.ej. benzoílo), una alquilsulfona o una halo-alquilsulfona (p.ej. trifluorometilsulfona).
En una realización de la presente invención el grupo R1 es un grupo protector de un fenol que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona.
En una realización R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, alilo, alquilamida, alquilarilo, alquil-éter, alquilbenzoilo, halo-alquilo, sililo, halo- alquilsulfona o un grupo acilo -C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo.
En otra realización R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, alquilamida, alquilarilo, o un grupo acilo -C(O)Ra, donde Ra es un grupo arilo.
El término “grupo protector de un ácido carboxílico” se define, a efectos de la presente invención, como grupos que sustituyen al H del grupo ácido carboxílico -COOH para evitar que éste sea reactivo o bien grupos que favorecen la farmacodinamia y farmacocinética de la molécula. Son ejemplos no limitantes de grupos protectores de ácido carboxílico, entre otros: C1-6 alquilo, alilo, alquilamida, alquilamina, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, halo-alquilo, sililo, carbamato C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo, acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo, alquilsulfona o halo-alquilsulfona.
En una realización R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo- alquilsulfona.
En una realización R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, alquilarilo o alquil-éster.
En otra realización R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, C1-6 alquilo, arilo, alquilarilo, alquil-éter, alquil-éster, alquilsulfona, halo-alquilo, sililo, halo- alquilsulfona.
Una realización de la invención se refiere a un compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000009_0002
donde
- R1 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquila ida; alquila ina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmR , donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;
- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000009_0001
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000009_0003
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo, en donde
A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C alquilo; y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRp, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;
R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido.;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquila ina, alquila ida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carba ato, alquilsulfona o haloalquilsulfona.
En una realización de la presente invención cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.
A efectos de la presente invención, un compuesto de fórmula I incluye todos los estereoisómeros de dicha fórmula I.
El término“estereoisómero” se refiere, a efectos de la presente invención a moléculas que tienen la misma fórmula molecular y la misma secuencia de átomos unidos (misma constitución), con los mismos enlaces entre sus átomos, pero que difieren en la orientación tridimensional de sus átomos en el espacio. Enantiómeros y diasterómeros son dos tipos diferentes de estereoisómeros.
El término“enantiómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que son imágenes especulares y no superponibles entre sí.
En particular, una realización de la presente invención comprende los enantiómeros R y S de los compuestos de fórmula I, en los que dichos enantiómeros son los 2 enantiómeros posibles respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano, incluyendo, por tanto, la configuración R y S del radical R10.
El término“diasterómero” se refiere, a efectos de la presente invención, a dos estereoisómeros que no son imágenes especulares. Los diasterómeros incluyen compuestos meso, isómeros E/Z e isómeros ópticos no enantioméricos.
Los isómeros E/Z se refieren a compuestos que comprenden enlaces doble C=C, es decir alquenos o cicloalquenos. Si en un enlace doble C=C los dos sustituyentes de mayor prioridad, de acuerdo con las reglas de la IUPAC (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada), están en el mismo lado, la disposición es Z. En cambio, si están en lados opuestos la disposición es E. Una realización se refiere a un compuesto de formula general I, descrito anteriormente, a sus enantiómeros, isómeros E,Z y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
Una realización comprende el enantiómero R respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero S respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero E respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero Z respecto al doble enlace de la posición C-‘3 de la cadena lateral prenilada.
El término sales farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, se refiere a cualquier sal que administrada a un paciente es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el compuesto en cuestión. Dichas sales son preferentemente sales de adición de ácidos orgánicos o inorgánicos, o de bases orgánicas o inorgánicas. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, o sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, trifluoroacetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato o tartrato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, calcio o amonio, o sales de adición de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquiletanolamina, trietanolamina y sales básicas de aminoácidos. Los procedimientos de formación de sales son procedimientos convencionales en el estado del arte.
El término “C1-6 alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada de 1 a 6 átomos de carbono, completamente saturada, que puede ser lineal o ramificada.
El término “halo-alquilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, en la que al menos un H se encuentra sustituido por un átomo de un halógeno.
El término“alilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, que comprende al menos un grupo -CH=CH-CH2-.
El término “alquilamida” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amida. El término “alquilamina” se refiere a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada, que puede ser lineal o ramificada, sustituida con un grupo amino.
El término“arilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a grupo derivado de un hidrocarburo aromático que se forma al extraer un átomo de hidrógeno de un anillo aromático en dicho hidrocarburo aromático. A efectos de la presente invención dichos grupos arilo pueden encontrarse opcionalmente sustituidos. Ejemplos de sustituciones no limitantes son OH, alcóxido, alquilo, halógeno, alquilo halogenado, ciano, tiol, amina o alquilamina.
El término “alquilarilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada sustituida con un grupo arilo, que a su vez se define tal como se describe anteriormente.
El término“alcóxido” se refiere, a efectos de la presente invención, a un átomo de oxígeno unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.
El término “alquil-éter” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo alcóxido, tal como se define anteriormente.
El término“acilo” se refiere, a efectos de la presente invención, a un grupo carbonilo unido a una cadena hidrocarbonada, donde dicha cadena hidrocarbonada puede comprender un grupo alquilo y/o un grupo arilo, tal como se definen anteriormente.
El término“éster”, a efectos de la presente invención, se refiere a un grupo derivado de un ácido carboxílico -COOH, en el que el grupo hidroxilo -OH se encuentra sustituido por un grupo alcóxido, tal como se define de acuerdo con la presente invención.
El término “alquil-éster” se refiere, a efectos de la presente invención, a una cadena hidrocarbonada saturada sustituida con un grupo éster, tal como se define anteriormente.
En una realización preferente A es un átomo de O.
En otra realización preferente A es un átomo de S.
En otra realización preferente A es un grupo un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, -ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo. Más preferentemente R7 es H, -OH o -OCH3.
En una realización preferente R es H.
En otra realización preferente R es un grupo C alquilo. Más preferentemente R es un grupo metilo o propilo.
En otra realización preferente R es un grupo alquilarilo. Más preferentemente R es un grupo bencilo o 4-fluorobencilo. En otra realización preferente Ri es un grupo alquilamida. Más preferentemente R1 es un grupo acetamida.
En otra realización preferente R1 es un grupo acilo -C(0)Ra. Más preferentemente R1 es un grupo acilo -C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo. Aún más preferentemente Ra es un grupo fenilo.
En una realización preferente R3 es H.
En otra realización preferente R3 es metilo.
En una realización preferente R4 es C1-6 alquilo o un grupo alcóxido. En una realización preferente el grupo alcóxido es un grupo alcóxido halogenado.
En una realización más preferente R4 es metilo.
En una realización más preferente R4 es -OCH2CF3.
En una realización preferente R5 es H.
En otra realización preferente R5 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R5 es metilo, etilo, propilo, butilo o tert-butilo. Aún más preferentemente R5 es metilo, etilo o propilo.
En otra realización preferente R5 es alquilarilo. Más preferentemente R5 es bencilo.
En otra realización preferente R5 es alquil éster. Más preferentemente R5 es -CH2COOCH3 o -CH(COOCH3)2.
En una realización preferente R6 es metilo.
En otra realización preferente R6 es OR9 donde R9 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R9 es etilo.
En una realización preferente R10 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R10 es metilo.
Una realización preferente de la invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 8, 9,10, 11 , 12 y 13:
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8,10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero E de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C- ‘3 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos 9 y 13, respecto a la posición C- ‘3 de la cadena lateral prenilada. Los compuestos de fórmula I, sus estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables, con actividad agonista PPAR comprenden una estructura común derivada de los benzopiranos prenilados naturales policerasoidol y policerasoidin (González et al., 1995 y 1996), isómeros naturales de los compuestos 1 y 2 aquí descritos: El isómero (3 E, 7Z) del compuesto 1 se corresponde al compuesto natural policerasoidol, mientras que el isómero (3 EJE) es el compuesto natural isopolicerasoidol, y el policerasoidin se corresponde al isómero (3E,7Z) del compuesto 2:
Figure imgf000017_0001
Dichos documentos de González et al (1995 y 1996) describen el aislamiento de los compuestos naturales policerasoidol y policerasoidin de la corteza de árboles del género Polyalthia, indicando que alguno de los compuestos de la familia de las hidroquinonas preniladas, a la que pertenecen, son conocidos por tener propiedades citotóxicas o antioxidantes, sin referirse o dar pistas sobre una posible actividad como agonistas de PPAR. En el mismo sentido, otros documentos divulgan dichos compuestos, o compuestos de estructura similar, si bien dichos compuestos tampoco presentan actividad como agonistas de PPAR. En particular, el documento Taha et al, 2015 y Karimian et al. (2015) describe el uso de policerasoidol, de su éster metílico, y de policerasoidin como inductores de apoptosis en células tumorales de cáncer de mama. Zhao et al. (2010) analiza diferentes metabolitos derivados de tocoferol y tocotrienoles detectados en orina, suero o hígado en muestras humanas y de ratones, entre los cuales se describe el policerasoidol. Zafra-Polo et al. (1996) describe el polyalthidin, relacionado con la estructura básica de los compuestos de la invención, pero que sin embargo se describe solamente con relación a su actividad como inhibidor de la cadena respiratoria mitocondrial. Finalmente, el documento EP0421419A describe compuestos de núcleo benzopirano con tres cadenas preniladas haciendo referencia a su uso para disminuir los niveles séricos del colesterol. Ninguno de estos documentos describe, o da pistas sobre la posible utilidad de compuestos similares, con un núcleo benzopirano prenilado, como agonistas de PPAR.
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos 1 y 2, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero ( Z,Z) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero ( Z,E) de los compuestos 1 y 2, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000018_0001
en el que R3, R10 y R4 son metilo y R2 es un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000018_0002
, donde A es un átomo de O, y R6 es metilo,
y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000019_0001
en donde R1 y R5 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.
Dichos compuestos de fórmula II incluyen, por tanto, los compuestos 1 , 2 y compuestos derivados con diferentes grupos R1 y R5.
En una realización preferente, cuando R1 es H, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es Me, R5 es distinto de H o metilo.
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula II, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos de fórmula II, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
En una realización preferente, R1 es H y R5 es H.
En otra realización preferente, R1 es C1-6 alquilo y R5 es H. Más preferentemente R1 es metilo y R5 es H.
En otra realización preferente, R1 es H y R5 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R1 es H y R5 es metilo o propilo.
En una realización preferente, R1 es H y R5 es alquilarilo. Más preferentemente R1 es H y R5 es bencilo. En otra realización preferente, R1 es alquilamida y R5 es alquilarilo. Más preferentemente R1 es acetamida, y R5 es bencilo.
En otra realización preferente, R1 y R5 son alquilarilo. Más preferentemente R1 y R5 son bencilo.
En otra realización preferente, R1 es C1-6 alquilo y R5 es H. Más preferentemente R1 es propilo es R5 es H.
En otra realización preferente, R1 es un grupo acilo -C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo, y R5 es un grupo alquil éster. Más preferentemente R1 es un grupo benzoilo y R5 es un grupo - CH2COOCH3.
En otra realización preferente, R1 es un grupo C1-6 alquilo y R5 es un grupo alquil éster. Más preferentemente R1 es un grupo metilo y R5 es un grupo -CH2COOCH3 o un grupo - CH(COOCH3)2.
Ambos compuestos 1 y 2 muestran una estructura similar y solo difieren en el grupo funcional de la posición C-6, un hidroxilo en el compuesto 1 y un metoxilo en el compuesto 2. A partir de los compuestos 1 y 2 se pueden sintetizar los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 u 8 de fórmula I, mediante sustitución de las posiciones C-9’ y C-6, tal como se describe en el Ejemplo 1 , más adelante.
Una realización del compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre compuesto 1 , 2, 3, 4, 4a, 4, b, 4c, 6, 7 u 8.
Una realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula II, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8. En una realización preferente los compuestos 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7 y 8 son isómeros ( E,Z ), en relación a los dobles enlaces de la cadena lateral prenilada en posiciones C-3’ y C-7’.
Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000020_0001
en el que R3 es H, R4 y R10 son metilo y R2 es un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000021_0002
, donde A es un átomo de O, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000021_0001
en donde Ri, R5, y R6 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.
Dichos compuestos de fórmula lll presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos 1 y 2, pero a diferencia de los compuestos de fórmula II, presentan H en lugar de metilo como grupo R3, y además de las modificaciones en las posiciones C-6 (-OR1) y C-9’ (- COOR5), también presentan modificaciones en la posición C-8’ (Re).
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula lll, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula lll, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero ( E,Z) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero ( E,E) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Una realización comprende el isómero (Z ,Z) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero (Z ,E) de los compuestos de fórmula lll, respecto a las posiciones C-‘3 y C-'7 de la cadena lateral prenilada. En una realización preferente, R1 es un grupo alquilarilo, R6 es un grupo -OR9, donde R9 es C1-6 alquilo, y R5 es H o un grupo C1-6 alquilo. Más preferentemente R1 es un grupo bencilo, R6 es un grupo -OCH2CH3, y R5 es H o etilo.
Mas preferentemente R1 es un grupo 4-fluorobencilo, R6 es un grupo -OCH2CH3, y R5 es etilo. Una realización del compuesto de fórmula III, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es un compuesto que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en compuesto 10, 11 y 12:
Figure imgf000022_0001
Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000023_0001
en el que R3 es H, R4y R10 son metilo y R2 es un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000023_0002
, donde A es un átomo de O, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000023_0003
en donde R1 y R5 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente.
Dichos compuestos de fórmula IV presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula I 1 y 2. Sin embargo, los compuestos de fórmula IV son compuestos de fórmula I donde el radical R3 es H, y no metilo tal como presentan los compuestos 1 y 2, y el radical R2 es un grupo alquil-éster que, a diferencia de los compuestos 1 y 2, no presenta un segundo grupo prenilo.
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula IV, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada. Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula IV, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.
En una realización preferente R1 es alquilarilo y R5 es C1-6 alquilo. Más preferentemente R1 es 4-fluorobencilo y R5 es etilo.
Una realización del compuesto de fórmula IV, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 9:
Figure imgf000024_0001
Otra realización preferente de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000024_0002
en el que R3 es H, R10 es metilo y R2 es -C(0)0Rb, y donde dicho compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000024_0003
en donde Rb es un grupo C1-6 alquilo y, R1 y R4 se definen de acuerdo a las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente. Dichos compuestos de fórmula V presentan igualmente una estructura derivada de los compuestos de fórmula 11 y 2, pero donde en dicha fórmula I el radical R2 es un grupo éster en lugar de un grupo alquil-éster prenilado que presentan los compuestos 1 y 2.
Una realización comprende el enantiómero R de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Otra realización comprende el enantiómero S de los compuestos de fórmula V, respecto a la posición C-2 del núcleo benzopirano.
Una realización comprende el isómero E de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.
Otra realización comprende el isómero Z de los compuestos de fórmula V, respecto al doble enlace de la cadena lateral prenilada.
En una realización preferente R1 es alquilarilo, Rb es C1-6 alquilo y R4 es un grupo alcóxido. Más preferentemente R1 es bencilo, Rb es etilo y R4 es -OCH2CF3.
Una realización del compuesto de fórmula V, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se describe anteriormente, es el compuesto 13:
Figure imgf000025_0001
Una realización de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, tal como se ha descrito anteriormente, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se define como cantidad efectiva, a efectos de la presente invención, aquella cantidad del compuesto que proporciona una mejora objetivamente identificable en el estado del paciente, reconocida por un observador cualificado, y donde dicho paciente es tratado con una composición farmacéutica que comprende dicha cantidad del compuesto.
Son excipientes farmacéuticamente aceptables, a efectos de la presente invención, ingredientes inertes tales como, pero no limitados a, codisolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizadores y antioxidantes. Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000026_0001
donde
R1 es H o un grupo protector de un fenol;
R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000026_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000026_0003
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo, en donde
- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
- R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;
- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
donde - R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y
donde cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.
Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000027_0001
donde
- R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;
- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000027_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000027_0003
o un grupo acilo -C(0)ORb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,
en donde
- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
- R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmR , donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;
- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquila ina, alquila ida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carba ato, alquilsulfona o haloalquilsulfona; y donde cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo; o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.
Una realización del compuesto de fórmula I, o de una composición que lo comprende, para uso como medicamento, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Una realización comprende el enantiómero R. Otra realización comprende el enantiómero S. Una realización comprende el isómero E. Otra realización comprende el isómero Z.
Otra realización preferente se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso como medicamento.
Los compuestos de fórmula I descritos, son agonistas de PPARa y/o PPARy. Por tanto, dichos compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, es decir, en enfermedades mediadas por agonistas de PPARa y/o PPARy, que equivale a enfermedades cuyo tratamiento se beneficia de la administración de agonistas de PPARa y PPARy. Tal como se ha indicado anteriormente, los PPAR se consideran potentes herramientas terapéuticas en el control de desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) (Ahmadian et al., 2013). Además, los PPAR tienen una importancia adicional ya que están implicados en el control de procesos inflamatorios, por lo que pueden regular la inflamación, función vascular, y el remodelado vascular.
Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000029_0001
donde
R1 es H o un grupo protector de un fenol;
R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000029_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000029_0003
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo, en donde - A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
- R5 es H o un grupo protector de un ácido carboxílico;
- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido; y
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;
o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
En una realización los desórdenes cardiovasculares se refieren a la aterosclerosis.
En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Una realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000030_0001
donde
- R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona; R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000031_0001
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000031_0002
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo,
en donde
- A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
- R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmR , donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona o halo-alquilsulfona;
- R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo; y
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido; y
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona;
o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy. En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
En una realización las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Una realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes tipo 2 (DT2).
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterosclerosis. Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la aterogénesis.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la inflamación y de enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipercolesterolemia.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hipertrigliceridemia.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento del síndrome metabólico.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de la obesidad.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de quilomicronemia primaria. Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de hiperlipoproteinemia.
Otra realización se refiere a un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica que lo comprende, tal como se describe anteriormente, para uso en el tratamiento de disbetalipoproteinemia.
En una realización de la presente invención cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.
Una realización del compuesto de fórmula I, o de una composición que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Una realización comprende el enantiómero R. Otra realización comprende el enantiómero S. Una realización comprende el isómero E. Otra realización comprende el isómero Z.
Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en II, III, IV o V:
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
donde R1, R4, R5, R6 y Rb se definen tal como se describe anteriormente, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
Una realización de los compuestos de fórmula II, III, IV o V, o de una composición que comprende uno de dichos compuestos, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, tal como se describe anteriormente, comprende cualquiera de sus enantiómeros o mezclas de estos, y cualquiera de sus isómeros E/Z y mezclas de ellos, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, que se selecciona independientemente entre un compuesto 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o 13, o una composición farmacéutica que lo comprende, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
El compuesto 5 se refiere al compuesto de fórmula I:
Figure imgf000034_0002
En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero R.
En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el enantiómero S.
En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 1 1 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( E,Z ). En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( E,E ).
En una realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( Z,Z ).
En otra realización los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero ( Z,E ).
En una realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero E.
En otra realización los compuestos 9 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy, descritos anteriormente, comprenden el isómero Z.
Otra realización se refiere al uso de los compuestos de fórmula I en el tratamiento de enfermedades que responden a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
Otra realización de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1 , 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPARy.
En una realización la enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa/g se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
En una realización más preferente las enfermedades neurodegenerativas se seleccionan independientemente entre Parkinson, Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica (ALS).
Otra realización se refiere a un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en 1 , 2, 3, 4c, 5, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13, o de una composición farmacéutica que lo comprende, a un paciente de una enfermedad que responde a la administración de agonistas duales de PPARa y PPARy.
Una realización de la invención se refiere al procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I, tal como se describen anteriormente, donde dicho procedimiento comprende:
(a) condensar una 2,5-dihidroxiacetofenona y un alquilcetoéster para obtener una benzopiran-4-ona de fórmula A;
Figure imgf000036_0001
(b) reducir el grupo cetónico de la benzopiran-4-ona obtenida en el paso (a);
(c) proteger el grupo fenol de la benzopiran-4-ona para obtener un éster benzopirano de fórmula (B);
Figure imgf000036_0002
(d) reducir el grupo éster con reactivos adecuados para obtener un aldehido;
Figure imgf000036_0003
(e) hacer reaccionar el grupo aldehido (C), obtenido en (d), con un reactivo de Grignard para obtener un alcohol alílico;
Figure imgf000036_0004
y someter dicho alcohol alílico a las condiciones de transposición de Johnson-Claisen obteniendo un éster benzopirano (D);
Figure imgf000037_0001
donde opcionalmente,
el aldehido (C) obtenido en el paso (d) se somete a:
(f) condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth-Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COORb)R4, o
(g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fósforo que comprende un radical -C(COORb)R4;
Figure imgf000037_0002
o donde una vez realizado el paso (e), el éster benzopirano (D) obtenido se somete al paso (d):
Figure imgf000037_0003
para obtener un nuevo aldehido (E); y donde se somete dicho nuevo aldehido (E) a (f)- condiciones de olefinación de Horner-Wadsworth- Emmons utilizando un fosfonato que comprende un radical -CH(COOR5)R6, o (g) condiciones de olefinación de Wittig utilizando un iluro de fosforo que comprende un radical -C(COOR5)R6;
y donde, opcionalmente, se desprotege posteriormente el grupo fenol, y/o el grupo carboxílico en el compuesto resultante del paso (f) o (g); y donde R1, R3, R4, R5, R6, R10 y Rb se definen tal como se describe anteriormente en las realizaciones descritas en esta invención.
Mediante dicho procedimiento de síntesis se obtienen los compuestos 1 , 2, 3, 4, 4a, 4b, 4c, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 y 13 descritos anteriormente. Dicho procedimiento de síntesis de los compuestos de fórmula I se puede esquematizar de la siguiente manera:
Figure imgf000038_0001
Reactivos y condiciones: (a) pirrolidina, EtOH, 45°C, 24 h; (b) Zn, HCI-AcOH (2: 1 , v/v), temp amb, 1 h; (c) R1X donde X es un halógeno, K2CO3, EtOH, reflujo, 4 h; (d) 1 M DIBAL-H (hidruro de diisobutilalumino) en THF, -78 °C, 20 min; (e) 1) R4-MgBr, - 78 °C, 3 h; 2) MeC(OR6)3, ácido isobutírico (2 gotas), 140°C, 2 h; (f) (g) tBuOK o NaH, THF, 0°C a temp amb, 16h.
La formación del núcleo cromano se ha realizado, por tanto, mediante (a) condensación de 2,5-dihidroxi acetofenona y alquilcetoéster, dando lugar a benzopyran-4-ona (Kabbe et al., 1982). A continuación, (b) se redujo el grupo carbonilo mediante reducción de Clemmensen, y (c) se protegió el grupo fenol. La elongación de la cadena lateral se realizó (d) mediante reducción del éster etílico formando el correspondiente aldehido. El compuesto 13 se obtiene sometiendo dicho aldehido obtenido en el paso (d), a una olefinacion mediante reacción de Wittig (f) o de Horner-Wadsworth-Emmons (g) (Bisceglia et ai, 2012 y Toshima et al., 2001).
Para la obtención del compuesto 9, (e) se trató el aldehido obtenido en el paso (d), en primer lugar, con un reactivo de Grignard generando un alcohol alílico que se sometió a las condiciones de transposición de Johnson-Claisen (Sen et al., 1990) para finalmente obtener el éster del compuesto 9. Los compuestos 1-8 y 10-12 se obtienen mediante una segunda elongación de la cadena lateral utilizando nuevamente las condiciones del paso (d) anteriormente descrito para realizar la reducción del grupo éster del compuesto 9 formando el correspondiente aldehido, donde dicho aldehido se somete a una olefinacion mediante reacción de Wittig (f) o de Horner-Wadsworth-Emmons (g).
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto en la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 y rosiglitazona. En neutrófilos humanos (Fig. 1A) y HUVEC (Fig. 1 B). Datos representados como media ± SEM de n=5 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.
Figura 2. Efecto en la viabilidad celular mediante ensayo de MTT del análogo sintetizado 9. En neutrófilos humanos (A) y HUVEC (B). Datos representados como media ± SEM de n=5 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.
Figura 3. Efecto de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 y rosiglitazona, en la viabilidad celular mediante citometría de flujo. Porcentaje de neutrófilos apoptóticos (Fig. 3A), supervivencia (Fig. 3B), apoptosis (Fig. 3C) y supervivencia en HUVEC (Fig. 3D) después de 24 h de incubación con los compuestos 1 , 2, 8, WY-14643 y rosiglitazona. Las células apoptóticas se cuantificaron como porcentaje de la población total de anexinas V+/PL apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V+/PI+, y células no apoptóticas viables como anexina VVPI\ Las columnas son la media ± SEM de n= 3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 3E) que muestran los efectos del vehículo y compuestos 1 , 2, 8, WY-14643 y rosiglitazona sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.
Figura 4. Efecto en la viabilidad celular del compuesto 9 mediante citometría de flujo. Porcentaje de apoptosis de neutrófilos (Fig. 4A), supervivencia (Fig. 4B), apoptosis de HUVEC (Fig. 4C) y supervivencia (Fig. 4D) después de 24 h de incubación. Las células apoptóticas se cuantificaron como porcentaje de la población total anexina V+/Pl·, apoptóticas tardías y/o necróticas como anexina V+/PI+, y células no apoptóticas viables como anexina V- /Pl\ Las columnas son la media ± SEM de n=3 experimentos independientes. Se han incluido los paneles representativos de citometría de flujo (Fig. 4E) que muestran los efectos del vehículo y del compuesto 9 sobre la apoptosis/supervivencia de neutrófilos. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo.
Figura 5. Policerasoidol (1) inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Las células se pretrataron durante 20 h con 1 mM de policerasoidol (1), policerasoidin (2), compuesto 8, WY-14643 o rosiglitazona, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm2 y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 5A) y células mononucleares (Fig. 5B). Las curvas dosis-respuesta se realizaron para policerasoidol (1) y rosiglitazona con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig. 5C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y††p < 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 6. El compuesto 9 inhibe la adhesión de células mononucleares a HUVEC inducida por TNFa en condiciones de flujo fisiológico. Algunas células se pretrataron durante 20 h con 3, 30 o 100 pM de compuesto 9, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Neutrófilos humanos recién aislados o células mononucleares se perfundieron sobre monocapas endoteliales durante 5 min a 0,5 dinas/cm2 y se cuantificó la adhesión de neutrófilos (Fig. 6A) y células mononucleares (Fig. 6B). Las curvas concentración-respuesta (0, 1-100 pM) se realizaron para compuesto 9 con HUVEC estimuladas con TNFa (20 ng/mL, 24 h) y perfusión de células mononucleares humanas recién aisladas (Fig. 6C). Los resultados son la media ± SEM de 4-6 experimentos independientes. **p< 0,01 relativo al grupo vehículo y ++p< 0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 7. Las células endoteliales se transfectaron con siRNA de control o siRNA específico de RXRa, PPARa o PPAR. 48 h después de la transfección, la expresión proteica de RXRa (Fig. 7A), PPARa (Fig. 7B) o PPARy (Fig. 7C) se determinó por Western blot. Los resultados (media ± SEM de n=4 experimentos independientes) se expresan en relación con b-actina. También se muestran las imágenes de los geles representativos. **p <0, 01 con respecto a los valores en el respectivo grupo de control de siRNA.
Figura 8. El silenciamiento de PPARY O RXRa por siRNA detiene el efecto inhibitorio de policerasoidol (1) en las interacciones entre células endoteliales-leucocitos mononucleares inducidas por TNFa. HUVEC se transfectaron con el control, siRNA específico de RXRa, PPARa o PPARY. 48h después de la transfección, las células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) o rosiglitazona (1 pM) durante 20h y entonces se estimularon con TNFa (20 ng/ml_, 4h). Se cuantificó la adhesión celular mononuclear. Los resultados son la media ± SEM de 3- 4 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo a grupo vehículo respectivo, †p <0,05 o ttp <0,01 relativo a las células estimuladas con TNFa respectivas (Fig. 8A, 8B, 8C). La interacción RXRa/PPARY se midió por immunoprecipitación de PPARY seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes (Fig. 8D).
Figura 9. La interacción RXRa/PPARY del compuesto 9 se midió por inmunoprecipitación de PPARY seguido de Western blot para RXRa. Las películas de quimioluminiscencia se cuantificaron por análisis de imagen. El blot representa un n=3 de experimentos independientes.
Figura 10. Policerasoidol (1) inhibe la expresión en HUVEC de ICAM-1 , VCAM-1 y CX3CLI inducida por TNFa. Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) 20 h, antes de la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h para ICAM-1 , VCAM-1 y CX3CLI). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1 (Fig. 10A), VCAM-1 (Fig. 10B) y CX3CLI (Fig. 10C). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1 , VCAM-1 , y CX3CLI también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 10E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo vehículo, †p <0,05 o ttp <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 11. Compuesto 9 inhibe la expresión en HUVEC de VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16 inducida por TNFa, pero no de ICAM-1. Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 pM) 20 h, previamente a la estimulación con TNFa (20 ng/mL, 24 h). Mediante citometría de flujo se determinó la expresión de ICAM-1 (Fig. 11 A), VCAM-1 (Fig. 11 B), CX3CLI (Fig. 11 C) y CXCL16 (Fig. 11 D). Los resultados (media ± SEM) se expresaron como una media de la intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes. La expresión de ICAM-1 , VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16 también se visualizó en HUVEC no permeabilizadas mediante inmunofluorescencia, utilizando alexa-fluor 488 (verde) (Fig. 11 E). Los núcleos se contrastaron con colorante Hoechst (azul). **p <0,01 relativo al grupo vehículo,†p <0,05 o††p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 12. Policerasoidol (1) inhibe la activación de p38 MAPK y NF-kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con policerasoidol (10 mM) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 12A) y NF-kB (Fig. 12B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 12C y 12D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo†p <0,05 y††p <0,01 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 13. El compuesto 9 inhibe la activación de p38 MAPK y NF-kB (p65) inducida por TNFa en HUVEC. Las células se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Algunas células se pretrataron con el compuesto 9 (3 mM) 20 h antes de la estimulación con TNFa. La activación de p38 MAPK (Fig. 13A) y NF-kB (Fig. 13B) se determinó mediante citometría de flujo. Los resultados (media ± SEM) se expresaron como la media de intensidad de fluorescencia de n=3-6 experimentos independientes (Fig. 13C y 13D). Se muestran los histogramas representativos. **p <0,01 relativo al grupo vehículo y†p <0,05 relativo a células estimuladas con TNFa.
Figura 14. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en ganancia de peso (g) y eficiencia alimenticia en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Los histogramas muestran la ganancia de peso (Fig. 14A) que se expresó como la diferencia de peso entre el día 5 y el día 0 (ds-do), y la eficiencia alimenticia (Fig. 14B) que se calculó como el cociente entre el aumento de peso y el alimento consumido. No se observaron diferencias significativas de aumento de peso ni eficiencia en la alimentación entre los ratones tratados con el compuesto 9 y los grupos control. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes.
Figura 15. El compuesto 9 y rosiglitazona reducen los valores de glucosa en plasma en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Se ha representado la variación de glucosa respecto al d0, que se ha calculado utilizando la siguiente fórmula: ((d5-do)/do) x 100. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratado con vehículo.
Figura 16. El compuesto 9 no produce diferencias significativas en la ganancia de peso de tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas muestran la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes Figura 17. El compuesto 9 reduce significativamente el área media de los adipocitos de WAT de forma dosis-dependiente en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Área media de los adipocitos, en pm2 (Fig. 17A), y sus respectivas imágenes representativas (Fig. 17B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.
Figura 18. Estudio del efecto antiinflamatorio en tejido adiposo blanco (WAT) en ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Nivel de expresión de ARNm de MCP-1 en WAT (Fig. 18A) y Cuantificación de macrófagos F4/80+ en WAT mediante inmunohistoquímica (Fig. 18B). El compuesto 9 disminuye la expresión de ARNm de MCP-1 y el número de macrófagos infiltrados en el tejido adiposo blanco (WAT). Las columnas son la media ± SEM de n=5-6 experimentos independientes. *p < 0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.
Figura 19. El compuesto 9 y WY-14643 aumentan los niveles de colesterol total y HDL-c, y disminuyen los niveles de triglicéridos y ácidos grasos libres en plasma. Valores de colesterol total (Fig. 19A), HDL-c (Fig. 19B), triglicéridos (Fig. 19C) y ácidos grasos libres (Fig.19D). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 o **p <0,01 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.
Figura 20. El compuesto 9 no afectó de forma significativa al peso del hígado ni a los triglicéridos acumulados, en comparación con el grupo control (vehículo). Ganancia de peso del hígado (Fig. 20A) y niveles de triglicéridos en hígado (Fig. 20B). Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.
Figura 21. El compuesto 9 redujo los niveles circulantes de ALT y AST Niveles de alanina amino transferasa (ALT) y aspártico transaminasa (AST) en plasma de ratones ob/ob tras 4 días de tratamiento. Las columnas representan la media ± SEM de n=5-6 experimentos independiente. *p <0,05 relativo al grupo de ratones ob/ob tratados con vehículo.
EJEMPLOS
Los ejemplos descritos a continuación tienen carácter ilustrativo y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención. Toda la investigación con muestras humanas de este estudio se ha llevado a cabo cumpliendo los principios de la Declaración de Helsinki y con la aprobación del Comité ético institucional del Hospital Clínico de Valencia (Valencia, España). 1 : Obtención de compuestos de fórmula I
Todos los reactivos y disolventes se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron directamente. Todas las reacciones sensibles a la humedad se llevaron a cabo en matraces secados en horno, bajo atmósfera de nitrógeno y con disolventes secos. Todas las reacciones se controlaron por CCF analítica con gel de sílice 60 F254 (Merck 5554) con detección UV a 254 nm. Los residuos se purificaron a través de una columna de gel de sílice 60H (5-40 pm, Merck 7736) y por cromatografía ultrarrápida (230-400 pm, Merck 9385). La CCF preparativa se realizó usando placas de gel de sílice de 0,5 mm (Merck). Hewlett-Packard (HP-1 100) o TripleTOF5600 (ABSciex) se utilizó para el análisis LC-MS, con la fuente API (ionización de presión atmosférica) configurada como APCI (ionización química a presión atmosférica) o API ES (ionización por electrospray) en modo positivo o negativo. Los espectros de RMN (1H, 13C, COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC) se referenciaron para la señal de disolvente CDCI3 en un Bruker AC 300 o AC-500. Las multiplicidades de resonancias de 13C RMN fueron asignadas por experimentos DEPT. Las asignaciones de RMN se apoyaron en experimentos COSY 45, DEPT, HSQC y HMBC.
1.1. Obtención de los compuestos 1 (policerasoidol) y 2 (policerasoidin)
Se aislaron el policerasoidol (1) y policerasoidin (2) a partir de un extracto metanólico de cortezas de tallos de Polyalthia cerasoides y P. sclerophylla y se identificaron en base a sus características cromatográficas y espectrales (González et al., 1995 y 1996).
1.2. Obtención de los compuestos 3 a 8
Compuesto 3: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K2CO3 (80 mg) en acetona (2 mL), se añadió 1-bromopropano CH3CH2CH2Br (20 μL 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró a sequedad y se volvió a disolver en 10 mL de CH2CI2. La fase orgánica se lavó con salmuera (3 x 10 mL) y H2O (3 x 10 mL), se deshidrató con Na2S04 anhidro y se evaporó a sequedad en el rotavapor. El crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 3 (50 mg, 63 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d 6.49 (d, J= 2.6 Hz, H-7), 6.39 (d, J= 2.6 Hz, H-5), 5.91 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7', 5.15 (td, J= 0.9, 7.1 Hz, H-3'), 4.1 1 (t, J= 6.6 Hz, 2H, COOCH2CH2CH3-9'), 2.68 (t, J= 6.6 Hz, 2H, CH2-4), 2.57 (ddd, J= 1.2, 7.5, 15.1 Hz, 2H, CH2-6'), 2.12 (s, 3H, CH3-13'), 2.10-2.03 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 1.89 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH3-10'), 1.75 (sex, J= 7.3 Hz, 2H, COOCH2CH2CH3-9'), 1.86-1.60 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.59 (s, 3H, CH3- 1 1), 1.25 (s, 3H, CH3-12'), 0.97 (t, J= 7.3 Hz, 3H, COOCH2CH2CH3-9'); RMN 13C (125 MHz, CDCb) d 168.4 (COOCH2CH2CH3-9'), 147.9 (C-6), 145.8 (C-8a), 142.8 (CH-7'), 134.3 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.0 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121.1 (C- 4a), 1 15.6 (CH-7), 1 12.6 (CH-5), 75.2 (C-2), 65.8 (COOCH2CH2CH3-9'), 39.6 (CH2-T), 39.0 (CH2-5'), 31.3 (CH2-3), 27.9 (CH2-6'), 23.9 (CH3-12'), 22.4 (CH2-4), 22.1 (COOCH2CH2CH3-9'), 22.0 (CH2-2'), 20.6 (CH3-10'), 16.0 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 1,') 10.5 (COOCH2CH2CH3-9'); LC- MS (APCI modo positivo) m/z 401.1 (100) [MH]+; HREIMS m/z 400.263746 [M]+ (400.261360 caled para C25H36C>4).
Compuesto 4: A una suspensión de policerasoidol (1) (80 mg, 0.2 mmol) y K2C03 (80 mg) en acetona (2 ml_), se añadió cloruro de bencilo CICH2Ph (25 mI_ 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 4 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4 (60 mg, 67 %). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 7.39-7.29 (m, 5H, COOCH2P/7-9'), 6.50 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-7), 6.40 (dd, J= 0.4, 2.7 Hz, H-5), 5.95 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.20 (s, 2H, COOCH2Ph-9'), 5.12 (td, J= 1.1 , 7.1 Hz, H-3'), 2.70 (td, J= 2.5, 6.7 Hz, 2H, CH2-4), 2.57 (ddd, J= 1.3, 7.4, 15.2 Hz, 2H, CH2-6'), 2.14 (s, 3H, CH3-13'), 2.12-1.90 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH3-10'), 1.82-1.60 (m, 4H, CH2-3 y CH2-T), 1.56 (s, 3H, CH3-1 , 11').26 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (125 MHz, CDCI3) d 167.9 (COOCH2Ph-9'), 147.8 (C-6), 145.8 (C- 8a), 143.6 (CH-7'), 134.1 (C-1" de COOCH2P/7-9'), 134.3 (C-4'), 128.5 (2CH de COOCH2P/7- 9'), 128.0 (3CH de COOCH2P/7-9'), 127.3 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.8 (CH-3'), 121.2 (C-4a),
1 15.6 (CH-7), 112.6 (CH-5), 76.0 (C-2), 66.0 (COOCH2Ph-9'), 39.6 (CH2-1 '), 39.0 (CH2-5'), 31.3 (CH2-3), 28.0 (CH2-6'), 24.0 (CH3-12'), 22.4 (CH2-4), 22.1 (CH2-2'), 20.6 (CH3-10'), 16.0 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 1'); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 472.2 (100) [MH + Na]+; EIMS m/z 357 [M-CH2Ph]+.
Compuesto 4a: A una suspensión de compuesto 4 (45 mg, 0.1 mmol) y K2C03 (45 mg) en acetonitrilo (5 ml_), se añadió 2-cloroacetamida CICH2CONH2 (0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 9 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4a (25 mg, 50 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d 7.38-7.29 (m, 5H, COOCH2P/7-9'), 6.60 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.46 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.93 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.18 (s, 2H, COOCH2Ph-9'), 5.11 (td, J= 1.2, 7.3 Hz, H-3'), 4.41 (s, 2H, OCH2CONH2-6), 2.72 (td, J= 2.5, 6.5 Hz, 2H, CH2- 4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.3, 14.8 Hz, 2H, CH2-6'), 2.16 (s, 3H, CH3-13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH2- 2' y CH2-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH3-10'), 1.81-1.58 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.55 (s, 3H, CH3-1 1'), 1.26 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 171.8 (OCH2CONH2-6), 167.7 (COOCH2Ph-9'), 149.8 (C-6), 147.0 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 136.2 (C-1" de COOCH2P/7-9'), 134.4 (C-4'), 128.4 (2CH de COOCH2P/7-9'), 128.0 (3CH de COOCH2P/7-9'), 126.7 (C-8'),
126.7 (C-8), 124.7 (CH-3'), 121.2 (C-4a), 1 15.6 (CH-7), 1 12.0 (CH-5), 75.5 (C-2), 67.9 (OCH2CONH2-6), 65.9 (COOCH2Ph-9'), 39.6 (CH2-1 '), 39.0 (CH2-5'), 31.2 (CH2-3), 28.0 (CH2- 6'), 24.0 (CH3-12'), 22.6 (CH2-4), 22.1 (CH2-2'), 20.6 (CH3-10'), 16.2 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 ; 1') HREIMS m/z 505.290785 [M]+ (505.282824 caled para C3iH39N05). Compuesto 4b. A una suspensión de compuesto 4 (35 mg, 0.1 mmol) y K2CO3 (35 mg) en acetona (5 ml_), se añadió cloruro de bencilo CICH2Ph (10 mI_, 0.1 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, se purificó el crudo de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 4b (20 mg, 40 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) d 7.44-7.29 (m, 10H, OCH2P/7-6, COOCH2P/7-9'), 6.66 (d, J= 3.0 Hz, H-7), 6.54 (dd, J= 3.0 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.19 (s, 2H, COOCH2Ph-9'), 5.12 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-3'), 4.98 (s, 2H, OCH2Ph-6), 2.73 (td, J= 2.8, 6.7 Hz, 2H, CH2-4), 2.56 (ddd, J= 1.2, 7.2, 15.2 Hz, 2H, CH2-6'), 2.16 (s, 3H, CH3-13'), 2.11-2.04 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 1.92 (d, 3H, J= 1.2 Hz, CH3-10'), 1.81-1.60 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.56 (s, 3H, CH3-H'), 1.27 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 167.0 (COOCH2Ph- 9'), 151.4 (C-6), 146.2 (C-8a), 143.5 (CH-7'), 137.6 y 136.2 (2C, C-1" de OCH2P/7-6, C-T" de COOCH2P/7-9'), 134.3 (C-41), 128.5-127.5 (10CH, OCH2P/7-6, COOCH2P/7-9'), 127.2 (C-8'), 126.7 (C-8), 124.9 (CH-3'), 120.9 (C-4a), 1 15.7 (CH-7), 1 12.2 (CH-5), 75.3 (C-2), 70.5 (OCH2Ph-6), 65.9 (COOCH2Ph-9'), 39.7 (CH2-T), 39.0 (CH2-5'), 31.4 (CH2-3), 28.0 (CH2-6'), 24.0 (CH3-12'), 22.6 (CH2-4), 22.1 (CH2-2'), 20.6 (CH3-10'), 16.2 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 1'); EIMS m/z 538 [M]+ (70), 447 [M-CH2Ph]+, 356 (10) [M-2 x CH2Ph]+, 91 (100).
Compuesto 4c. A una suspensión de compuesto 4 (70 mg, 0.2 mmol) y K2C03 (70 mg) en acetona (5 ml_), se añadió 1-bromopropano CH3CH2CH2Br (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 10 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción con el grupo fenol protegido, se disolvió en 10 ml_ de una mezcla EtOH-KOH al 20% (v/v) y se mantuvo a reflujo durante 10 h. Posteriormente, la mezcla de reacción se acidificó con HCI 1 N, se concentró a sequedad y se redisolvió en 10 ml_ de CH2CI2. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener 4c (34 mg, 43 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 6.58 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.45 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 6.06 (td, J= 1.3, 7.3 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 0.9, 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (t, J= 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2CH3-6), 2.72 (t, J= 6.8 Hz, 2H, CH2-4), 2.62 (dd, J= 7.5, 14.4 Hz, 2H, CH2-6'), 2.15 (s, 3H, CHs-13'), 2.11-2.05 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 1.90 (d, 3H, J= 1.5 Hz, CH3-10'), 1.79-1.72 (m, 6H, OCH2CH2CH3-6, CH2-3 y CH2-T), 1.60 (s, 3H, CH3-1 ,1' 1) .26 (s, 3H, CH3- 12'), 1.01 (t, J= 6.6 Hz, 3H, OCH2CH2CH3-6); RMN 13C (75 MHz, CDCI3) d 173.0 (COOH-9'), 151.6 (C-6), 146.3 (C-8a), 145.9 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.1 (C-8'), 126.1 (C-8), 125.1 (CH- 3'), 120.9 (C-4a), 115.4 (CH-7), 11 1.8 (CH-5), 75.2 (C-2), 70.0 (OCH2CH2CH3-6), 39.7 (CH2-1') , 39.0 (CH2-5'), 31.4 (CH2-3), 28.1 (CH2-6'), 24.0 (CH3-12'), 22.7 (CH2-4), 22.6 (OCH2CH2CH3-6), 22.1 (CH2-2'), 20.5 (CH3-10'), 16.2 (CH3-13'), 15.7 (CH3-11 '), 22.6 (OCH2CH2CH3-6); LC-MS (APCI modo positivo) m/z 424.2 (100) [MH + Na]+.
Compuesto 5. A una disolución de policerasoidol (1) (10 mg, 0.03 mmol) en metanol (5 ml_) se le añadió gota a gota HCI conc (1.5 ml_) a 0°C. La mezcla se agitó a reflujo 7 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener 5 (6 mg, 54 %). RMN 1H (300 MHz, CDCIs) d 6.48 (d, J= 2.9 Hz, H-7), 6.38 (d, J= 2.9 Hz, H-5), 5.94 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-7'), 5.16 (td, J= 1.2, 7.4 Hz, H-3'), 3.73 (s, 3H, COOCP3-9'), 2.80-2.57 (m, 4H, CH2-4, CH2-6'), 2.35-2.00 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 2.12 (s, 3H, CH3-13'), 1.90-1.82 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.90 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH3- 10'), 1.58 (s, 3H, CH3-11 '), 1.25 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (75 MHz, CDCIs) d 169.1 (COOCH3- 9'), 147.3 (C-6), 146.0 (C-8a), 144.8 (CH-7'), 134.2 (C-4'), 127.2 (C-8'), 127.1 (C-8), 124.9 (CH- 3'), 121.1 (C-4a), 1 15.5 (CH-7), 1 12.5 (CH-5), 75.1 (C-2), 51.1 (COOCP3-9'), 39.5 (CH2-T), 39.0 (CH2-5'), 31.3 (CH2-3), 27.9 (CH2-6'), 23.9 (CH3-12'), 22.3 (CH2-4), 22.0 (CH2-2'), 20.5 (CH3-10'), 16.0 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 1';) HREIMS m/z 372.236641 [M]+ (372.230060 caled para C23H32C>4).
Compuesto 6. A una suspensión de policerasoidol (1) (100 mg, 0.3 mmol) y K2C03 (100 mg) en acetona (5 ml_), se añadió cloruro de benzoilo PhCOCI (25 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 2 h. Transcurrido este tiempo se añadió metil bromoacetato BrCH2COOCH3 (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el compuesto 6 (55 mg, 35 %). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d 8.18 (dd, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-2" y H-6" de OCOP/7-6), 7.62 (td, J= 1.5, 7.7 Hz, H-4" de OCOP/7-6), 7.50 (td, 2H, J= 1.5, 7.7 Hz, H-3" y H-5" de OCOP/7-6), 6.80 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-7), 6.75 (dd, J= 0.8, 2.8 Hz, H-5), 6.02 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H-7'), 5.17 (td, J= 1.2, 7.2 Hz, H- 3'), 4.69 (s, 2H, COOCH2COOCH3-9'), 3.77 (s, 3H, COOCH2COOCH3-9'), 2.77 (m, 2H, CH2- 4), 2.61 (m, 2H, CH2-6'), 2.18 (s, 3H, CH3-13'), 2.15-2.06 (m, 4H, CH2-2', CH2-5'), 1.94 (d, 3H, J= 1.6 Hz, CH3-10'), 1.80-1.62 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.57 (s, 3H, CH3-11 '), 1.30 (s, 3H, CH3- 12'); RMN 13C (100 MHz, CDCI3) d 170.0-165.0 (3C, OCOPh-6 y COOCH2COOCH3-9'), 149.5 (C-6), 145.0 (CH-7'), 142.7 (C-8a), 134.4 (C-1 " de OCOP/7-6), 134.2 (C-4'), 130.1-128.5 (5CH, de OCOP/7-6), 127.4 (C-8'), 125.9 (C-8), 124.9 (CH-3'), 121. 2 (CH-7), 120.9 (C-4a), 119.2 (CH-5), 75.9 (C-2), 60.4 (COOCP2COOCH3-9'), 52.2 (COOCH2COOCP3-9'), 39.8 (CH2-T), 39.0 (CH2-5'), 31.0 (CH2-3), 28.0 (CH2-6'), 24.1 (CH3-12'), 22.4 (CH2-4), 22.1 (CH2-2'), 20.5 (CH3-10'), 16.1 (CH3-13'), 15.7 (CH3-1 1';) HREIMS m/z 534.267390 [M]+ (534.261754 caled para C32H3807).
Compuesto 7. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K2C03 (20 mg) en acetona (5 ml_), se añadió dimetil bromomalonato BrCH(COOCH3)2 (5 mI_, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Transcurrido este tiempo, se añadió metil bromoacetato BrCH2COOCH3 (20 mI_, 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 15 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF preparative (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 7 (17 mg, 67 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 6.56 (d, J= 2.8 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.8 Hz, H-5), 6.08 (td, J= 1.3, 7.2 Hz, H-7'), 5.62 (s, COOCP(COOCH3)2-9'), 5.16 (t, J= 6.6 Hz, H-3'), 3.83 (s, 6H, COOCH(COOCP3)2-9'), 3.73 (s, 3H, COOCP3-6), 2.75- 2.71 (m, 2H, CH2-4), 2.66-2.59 (m, 2H, CH2-6'), 2.18-2.05 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 2.15 (s, 3H, CHs-13'), 1.96 (d, 3H, J= 1.3 Hz, CH3-10'), 1.90-1.73 (m, 4H, CH2-3, CH2- 1'), 1.59 (s, 3H, CH3- 1 1), 1.26 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (75 MHz, CDCl3) d 169.0-167.2 (3C,
COOCH(COOCH3)2-9'), 151.5 (C-6), 145.4 (C-8a), 144.4 (CH-7'), 133.7 (C-4'), 126.6 (C-8'), 126.1 (COOCH(COOCH3)2-9'), 125.3 (C-8), 124.4 (CH-3'), 121.0 (C-4a), 115.0 (CH-7), 1 11.0 (CH-5), 75.4 (C-2), 56.1 (OCH3-6), 52.1 (2C, COOCH(COOCH3)2-9'), 40.0 (CH2-1 '), 39.0 (CH2- 5'), 31.3 (CH2-3), 28.3 (CH2-6'), 24.1 (CH3-12'), 23.3 (CH2-4), 22.2 (CH2-2'), 20.3 (CH3-10'), 16.3 (CH3-13'), 16.0 (CH3-11 '); HREIMS m/z 502.263390 [M]+ (502.256669 caled para C28H3808).
Compuesto 8. A una suspensión de policerasoidin (2) (20 mg, 0.05 mmol) y K2C03 (20 mg) en acetona (5 mL), se añadió metil bromoacetato BrCH2COOCH3 (5 mI_, 0.05 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 6 h. Tras extracción habitual, el crudo de reacción se purificó mediante CCF de sílica gel preparativa (hexano-AcOEt, 80:20) para obtener el compuesto 8 (15 mg, 67 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 6.56 (d, J= 2.7 Hz, H-7), 6.44 (d, J= 2.7 Hz, H-5), 6.00 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-7'), 5.15 (td, J= 1.5, 7.2 Hz, H-3'), 4.68 (s, 2H, COOCH2COOCH3- 9'), 3.76 (s, 3H, COOCH2COOCH3-9'), 3.73 (s, 3H, COOCH3-6), 2.73 (t, 2H, J= 7.0 Hz, CH2- 4), 2.59 (dd, 2H, J= 7.2, 14.8 Hz, CH2-6'), 2.15 (s, 3H, CH3-13'), 2.10-2.04 (m, 4H, CH2-2' y CH2-5'), 1.93 (d, 3H, J= 1.4 Hz, CH3-10'), 1.79-1.56 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.59 (s, 3H, CH3- 11') , 1.26 (s, 3H, CH3-12'); RMN 13C (75 MHz, CDCI3) d 168.8 y 167.4 (2C, COOCH2COOCH3- 9'), 152.5 (C-6), 146.4 (C-8a), 145.4 (CH-7'), 134.7 (C-4'), 127.6 (C-8'), 126.3 (C-8), 125.4 (CH- 3'), 121.3 (C-4a), 1 15.2 (CH-7), 11 1.4 (CH-5), 75.7 (C-2), 60.8 (COOCH2COOCH3-9'), 56.0 (OCH3-6), 52.6 (COOCH2COOCH3-9'), 40.1 (CH2-T), 39.4 (CH2-5'), 31.8 (CH2-3), 28.4 (CH2- 6'), 24.4 (CH3-12'), 23.1 (CH2-4), 22.6 (CH2-2'), 20.9 (CH3-10'), 16.6 (CH3-13'), 16.1 (CH3-1 ; 1') HREIMS m/z 444.252007 [M]+ (444.251189 caled para C26H3606).
1.3. Síntesis del compuesto 9:
Figure imgf000049_0001
(a) Síntesis de benzopiran-4-ona: 2,5-dihidroxiacetofenona (0.5 g, 3.28 mmol), etil levulinato (0.46 mL, 3.28 mmol) y pirrolidina (0.87 ml_, 9.86 mmol), se disolvieron en EtOH absoluto (10 ml_) con tamiz molecular de 3-Á (100 mg).6 La mezcla se agitó a 45°C durante 24 h bajo atmósfera de N2. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se diluyó con CH2CI2 (100 mL) y se lavó con HCI 1 N (3 x 50 mL), H2O (3 x 50 mL) y sal muera (3 x 50 mL), se secó sobre Na2S04 anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 70:30) para obtener la benzopiran-4-ona (729 mg, 2.62 mmol, 80%) como un aceite amarillo. RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d 7.34 (d, J= 3.0 Hz, H-5), 7.07 (dd, J= 8.9, 3.0 Hz, H-7), 6.80 (d, J= 8.9 Hz, H-8), 4.14 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH2CH3), 2.78 (d, J= 16.7 Hz, 1 H, CH2a-3), 2.63 (d, J= 16.7 Hz, 1 H, CH2b-3), 2.53-2.46 (m, 2H, CH2-2'), 2.1 (m, 2H, CH2-1 '), 1.38 (s, 3H, CH3-4'), 1.25 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH2CH3); 13C NMR (100 MHz, CDCI3) d 193.0 (C-4), 173.3 (COOCH2CH3-3'), 153.7 (C-8a), 150.2 (C-6), 125.2 (CH-7), 120.1 (C-4a), 119.5 (CH-8), 1 10.6 (CH-5), 79.8 (C- 2), 60.8 (COOCH2CH3), 47.2 (CH2-3), 34.1 (CH2-1 '), 28.7 (CH2-2'), 23.3 (CH3-4'), 14.1 (COOCH2 CH3y, EIMS m/z 278 [M: CI5HI805]+ (35), 233 (25), 177 (100), 137 (75); HREIMS (%) m/z 278.1 1408 [M]+ (278.1 1542 caled para CI5HI805).
(b) Reducción del grupo cetona: Se disolvió el benzopiran-4-ona (0.4 g, 1.44 mmol) en una mezcla de AcOH-H20 (2: 1 , v/v) (14 mL). Entonces, se añadió poco a poco Zn en polvo (1.69 g, 25.92 mmol) y HCIconc (9 mL) durante 30 min y la mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió H2O (15 ml_) a la mezcla de reacción y se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 ml_). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2S04 anhidro y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano-AcOEt, 85: 15) para obtener el éster de benzopirano (220.3 mg, 0.834 mmol, 58%) como un aceite incoloro. RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 6.55 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.12 (q, J= 7.1 Hz, 2H, COOCH2CH3), 2.70 (m, 2H, CH2-4), 2.44 (t, J= 7.7 Hz, 2H, H-2'), 2.05-1.70 (m, 4H, CH2-3, CH2-I'), 1.23 (s, 3H, CH3-2), 1.24 (t, J= 7.1 Hz, 3H, COOCH2CH3); 13C NMR (75 MHz, CDCb) d 174.1 (COOCH2CH3-3'), 148.8 (C-6), 147.4 (C-8a), 121.6 (CH-7), 117.8 (CH- 8), 1 15.4 (C-4a), 114.6 (CH-5), 74.6 (C-2), 60.5 (COOCH2CH3), 34.3 (CH2-3), 31.1 (CH2-T), 28.8 (CH2-2'), 34.3 (CH2-3), 23.7 (CH3-2), 22.1 (CH2-4), 14.1 (COOCH2 CH3). EIMS m/z 264 [M: CI5H2O04]+ (100), 218 (50), 163 (35), 123 (55). HREIMS (%) m/z 264.13562 [M]+ (264.13616 caled para C15H20O4) (100).
(c) O-protección del éster de benzopirano: Una suspensión de éster de benzopirano (0.5 g, 1.89 mmol), cloruro de p-flurobencilo pF(Ph)CH2CI (0.3 mL, 2.46 mmol), K2CO3 anhidro (0.4 g, 2.83 mmol) en EtOH absoluto (20 mL) se agitó a 65°C bajo atmósfera de N2 durante 4 h. La mezcla de reacción se evaporó en el rotavapor, se añadió H20 (3 x 20 mL) y se extrajo con CH2CI2 (3 x 15 mL). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con HCI 1 M (2 x 15 mL) y salmuera (2 x 15 mL), deshidrataron con Na2SC>4 anhidro y se evaporaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano- AcOEt, 90:10) para obtener el éster de benzopirano O-protegido (556 mg, 1.49 mmol, 79%) como un aceite incoloro. RMN 1H (300 MHz, CDCI3) d 7.39 (m, 2H, H-2", H-6"), 7.05 (m, 2H, H-3", H-5"), 6.70 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, p-F-PhCHgO), 4.13 (q, J= 7.1 Hz, 2H, CO2CH2CH3), 2.76 (t, 2H, J= 6.7 Hz, CH2-4), 2.48 (t, J= 7.7 Hz, 2H, CH2-2'), 1.91 (m, 4H, CH2- 3, CH2-T), 1.24 (t, J= 7.2 Hz, 3H, C02CH2CH3-3'); RMN 13C (75 MHz, CDCI3) d 173.6 (COOCH2CH3-3'), 162.3 (d, CF=243.7 HZ, C-4"), 152.0 (C-6), 147.9 (C-8a), 133.1 (d, Jc F= 3 Hz, C-1"), 129.1 (d, 2C, CF= 8.3 Hz, C-2", C-6"), 121.4 (C-4a), 1 17.7 (CH-5), 1 15.2 (d, 2C, CF= 24.8 Hz, CH-3", CH-5"), 1 15.1 y 114.4 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (p-F-PhCH2O), 60.3 (C02CH2CH3), 34.3 (CH2-T), 31.0 (CH2-3), 28.7 (CH2-2'), 23.6 (CH3-2), 22.2 (CH2-4), 14.1 (C02CH 2CH3)·, HREIMS m/z (%) 372.1730 [M]+ (372.173688 caled para C22H2504F) (83).
(d) Reducción del éster de benzopirano O-protegido Una disolución de éster de benzopirano O-protegido (0.2 g, 0.54 mmol) en CH2CI2 anhidro (6 mL) a -78°C bajo atmósfera de N2 se agitó durante 15 min. A esta disolución se le añadió gota a gota una disolución de hidruro de diisobutilaluminio (DIBAL-H) 1 M en THF (2.47 mL, 2.47 mmol). Transcurridos 20 min, se detuvo la reacción mediante adición de MeOH (1 mL) y se agitó durante 15 min, y entonces se añadió una disolución acuosa saturada de NH4CI (1 mL). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente, se filtró y el filtrado se extrajo con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas, se secaron sobre Na2S04 anhidro y se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexano-AcOEt, 90: 10) para obtener el aldehido (128 mg, 0.34 mmol, 63%) como un aceite incoloro. RMN 1 H (300 MHz, CDCIs) d 9.78 (t, J= 1.6 Hz, 1 H, CHO), 7.39 (m, 2H, H-2" y H-6"), 7.06 (m, 2H, H-3" y H-5"), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 4.94 (s, 2H, OCH2Ph-p-F), 2.75 (m, 2H, CH2-4), 2.60 (m, 2H, CH2- 2'), 1.90 (m, 4H, CH2-3, CH2-T), 1.30 (s, 3H, CH3-2); RMN 13C (75 MHz, CDCIs) d 202 (CHO), 162.4 (d, CF=244.4 HZ, C-4"), 152.1 (C-6), 147.7 (C-8a), 133.1 (d, Jc F= 3.3 Hz, C-1"), 129.3 and 129.2 (d, 2C, JCF= 8.3 Hz, C-2", C-6"), 121.4 (C-4a), 117.7 (CH-5), 1 15.2 (d, 2C, JCF= 24.8 Hz, CH-3", CH-5"), 115.2 y 114.5 (CH-7 y CH-8), 74.6 (C-2), 69.9 (OCH2Ph-p-F), 38.4 (CH2- 2'), 31.8 (CH2-1 '), 31.2 (CH2-3), 23.7 (CH3-2), 22.3(CH2-4); HREIMS m/z (%) 329.1552 [M]+ (329.1547 caled para C20H2I O3F), 343.1710 (343.1704 caled para C2iH2303F).
(e) Reacción de Grignard y transposición de Johnson-Claisen: Una disolución del intermedio aldehido (0.2 g, 0.61 mmol) en THF anhidro (5 ml_) se agitó a -78°C bajo atmósfera de N2 durante 15 min, y entonces se trató con una solución de bromuro de isopropenilmagnesio 0.5 M (7.32 ml_, 3.66 mmol) (Sen et al., 1990).7 La mezcla se agitó a - 78°C durante 3 h. La mezcla de reacción se trató con una solución de NH4CI saturada y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. Se añadió H20 y se extrajo con con AcOEt (3 x 15 mL). Se combinaron las fases orgánicas y la fase orgánica resultante se lavó con H20 (3 x 15 mL) y sal muera (3 x 15 mL), se deshidrató con Na2S04 anhidro y se concentró en el rotavapor.
El residuo obtenido (250 mg) se utilizó en la siguiente reacción sin purificar. El residuo se trató con 10 mL de trietil ortoacetato y cantidades catalíticas de ácido isobutírico (3 gotas) (Sen et al., 1990).7 La mezcla se agitó a 140°C durante 2 h. Después de enfriar, la mezcla se concentró en el rotavapor para eliminar el exceso de trietilortoacetato. El residuo se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y se lavó con H20 (3 x 15 mL), se deshidrató con Na2S04 anhidro y se concentró en el rotavapor. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (hexano/ AcOEt, 98:2) para obtener 126 mg de compuesto 9 (0.29 mmol, 47 %). RMN 1H (500 MHz, CDCI3) d 7.39 (m, 2H, H-2" y H-6"), 7.06 (m, 2H, H-3" y H-5"), 6.73 (m, 3H, H-5, H-7, H-8), 5.14 (t, J= 7.0 Hz, 1 H, CH-3'), 4.94 (s, 2H, OCHgPh-p-F), 4.11 (q, J= 7.4 Hz, 2H, COOCH2CHs), 2.72 (t, J= 6.8, 2H, CH2-4), 2.39 (m, 2H, CH2-6'), 2.28 (m, 2H, CH2-5'), 2.08 (m, 2H, CH2-2'), 1.82 (m, 2H, CH2-3), 1.67 (m, 6H, CH2-T), 1.60 (s, 3H, CH3-4'), 1.27 (s, 3H, CH3-2), 1.23 (t, J=
7.3 Hz, 3H, COOCH 2CH3); RMN 13C (125 MHz, CDCIs) d 173.4 (CO), 162.4 (d, CF=245 HZ, C-4"), 151.9 (C-6), 148.2 (C-8a), 133.5 (C-4'), 133.3 (d, JCF= 3 Hz, C-1"), 129.2 (d, 2C, JCF=
8.3 Hz, C-2", C-6"), 124.9 (C-3'), 121.7 (C-4a), 117.8 (CH-5), 115.3 (d, 2C, JCF= 24.8 Hz, CH- 3", CH-5"), 115.2 y 1 14.4 (CH-7 y CH-8), 75.6 (C-2), 70.1 (OCH2Ph-p-F), 60.2 (COOCH2CH3), 39.2 (CH2-1 '), 34.6 (CH2-6'), 33.2 (CH2-5'), 30.9 (CH2-3), 24.1 (CH3-2), 22.4 (CH2-4), 22.2 (CH2- 2'), 15.8 (CHs-4'), 14.2 (COOCH 2CH3); HREIMS m/z (%) 441.2441 [M]+ (441.2436 caled para C27H33F04). 1.4. Síntesis de los compuestos 10 a 12:
Se procede a realizar los pasos (a), (b), (c), (d) y (e) tal como se describen en la sección 1.3 para el compuesto 9, si bien, la O-protección del éster de benzopirano se realiza en el caso de los compuestos 10 y 11 con cloruro de bencilo (Ri= bencilo) y en el caso del compuesto 12 con cloruro de p-flurobencilo (Ri= p-FluoroBn).
Una vez realizado el paso (e), se vuelve a realizar una reducción del grupo éster, obtenido mediante transposición de Johnson-Claisen, para volver a obtener un aldehido, de acuerdo con las condiciones descritas en el paso (d) de la sección 1.3.
Los compuestos 10 y 12 se obtienen mediante olefinación del aldehido obtenido llevando a cabo la reacción de Wittig con un iluro de fósforo (Ph)3P=C(CH2CH3)(COOCH2CH3) o la reacción de Horner-Wadsworth-Emmons con un fosfonato (EtO)2P(0)- CH(CH2CH3)(COOCH2CH3). El compuesto 11 se obtiene por hidrólisis del grupo éster, mediante tratamiento con KOH a reflujo del compuesto 10.
Figure imgf000053_0001
1.5. Síntesis del compuesto 13:
Se procede a realizar los pasos (a), (b), (c) y (d) tal como se describen en la sección 1.3, en donde la O-protección del éster de benzopirano se realiza con cloruro de bencilo. El aldehido obtenido tras el paso (d) se somete a olefinación llevando a cabo la reacción de Wittig con un iluro de fósforo (Ph)3P=C(CH2CF3)(COOCH2CH3) o la reacción de Horner-Wadsworth- Emmons con un fosfonato (Et0)2P(0)-CH(CH2CF3)(C00CH2CH3).
Figure imgf000054_0001
Estudios in vitro
Ejemplo 2: Evaluación de la transactivación hPPARa v hPPARy
Los compuestos naturales 1 y 2, los compuestos 3-8 y el compuesto (9), se estudiaron in vitro mediante ensayos de transactivación PPARa/g. Se utilizó un ensayo de transcripción en células Cos-7 transitoriamente transfectadas con un plásmido reportero de luciferasa en presencia de vectores de expresión pGAL4hPPARa y pGAL4hPPARy (Carmona et al., 2007). Las células Cos-7 se obtuvieron de la ATCC (CRL-1651). Las células se mantuvieron bajo condiciones de cultivo estándar (medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS) a 37°C en una atmósfera de humedad al 5% CO2. El medio se cambiaba cada 2 días. Las células Cos-7 se sembraron en discos de 60 mm a una densidad de 5,5 x 105 células/disco en DMEM supiementado con 10% de FCS e incubado a 37°C durante 16 h antes de la transfección. Las células fueron transfectadas en DMEM, usando jetPEI, con reportador (pG5-TK-pGL3) y plásmidos de expresión (pGal4-h, hPPARa o hPPARy). El plásmido de expresión pCMV-b- galactosidasa se co-transfectó como control para la eficiencia de la transfección. Después de 16 h se detuvo la transfección adicionando DMEM supiementado con 10% FCS, y las células se tripsinizaron y sembraron en placas de 96-pocillos e incubaron durante 6 h en DMEM conteniendo 10% FCS. Posteriormente, las células se incubaron durante 24 h en DMEM conteniendo 0,2% FCS y se ensayaron concentraciones crecientes de los compuestos o del vehículo (DMSO, concentración máxima 0,1%). Finalmente, las células se lavaron una vez con PBS enfriado sobre hielo, se Usaron y se realizaron los ensayos de luciferasa y b- galactosidasa.
Para evaluar los compuestos sobre la actividad transcripcional PPAR, los ensayos se llevaron a cabo en una quimera de un sistema de gen reportero de luciferasa PPAR/Gal4 humano para determinar la respuesta de transactivación máxima de cada compuesto. Los distintos compuestos se ensayaron en un rango de concentraciones de 0,001 a 10 mM. Los resultados obtenidos de todos los compuestos se compararon con los datos de los compuestos de referencia WY-14643 y rosiglitazona en hPPARa y hPPARy, respectivamente.
Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Figure imgf000055_0001
(a) Máxima actividad obtenida con cada compuesto expresada como porcentaje de actividad máxima de WY-14643 para PPARa (CE50 12 pM) y rosiglitazona para PPARy (CE50 4 nM) respectivamente. (NA: no activo sobre el hPPAR ensayado). De entre todos los compuestos ensayados, el producto natural policerasoidol (1) mostró la mayor actividad agonista dual PPARa/g y su respuesta máxima resultó comparable a la obtenida por los compuestos de referencia (WY-14643 y rosiglitazona). Los datos de CE50 mostraron que el compuesto natural 1 , y su derivado semisintético 3, con el grupo fenólico libre, presentan actividad agonista total sobre hPPARa y hPPARy, y elevados porcentajes de transactivación (107-100% y 95-86% para hPPARa y hPPARy, respectivamente). El compuesto 4c, el derivado O-propilado con una función carboxílica libre en C-9’, mostraba el máximo porcentaje de transactivación (191 % y 88% para hPPARa y hPPARy, respectivamente). Los otros derivados de policerasoidol (4a, 4b y 5) mostraron porcentajes de transactivación más bajos que los compuestos 1 , 3 y 4c a las concentraciones ensayadas. Las modificaciones sobre el grupo carboxílico en C-9’ de la cadena lateral en posición 2, introduciendo el grupo COOCH(COOCH3)2 daba lugar al compuesto 7 con selectividad sobre la activación PPARa (76% para hPPARa y 37% para hPPARy). Sin embargo, el derivado 8, con un grupo COOCH2COOCH3 en C-9’, mostró una menor activación PPARa (39% para hPPARa y 24% para hPPARy). El compuesto 9 también mostró una actividad agonista dual y un porcentaje de transactivación elevado (251 % para hPPARa y 57% para hPPARy, respectivamente).
Los compuestos 10, 11 , 12 y 13 también mostraron actividad agonista dual PPARa y PPARy, destacando la potencia del compuesto 11 , con porcentajes de transactivación del 96% y 62% para hPPARa y hPPARy respectivamente.
Cabe destacar que el compuesto 1 (natural) y 9 (sintético) mostraron una potente acción agonista dual de los receptores PPARa y PPARy. El compuesto 2 presentó una actividad dual PPARa/y moderada y el compuesto 8 desplazaba su selectividad hacia la activación de PPARy (Tabla 1).
Ejemplo 3: Estudios de citotoxicidad en neutrófilos humanos v células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC)
Anteriormente se ha mencionado que existen importantes limitaciones en la utilización de agonistas PPAR para su uso en humanos, debido a sus efectos adversos como hepatotoxicidad, cáncer, cardiotoxicidad u otros efectos cardiovasculares. Los glitazares son los compuestos más estudiados con actividad agonista PPARy, sin embargo, como hemos mencionado en la introducción, únicamente está aprobado el uso de los agonistas duales saroglitazar (Lipaglyn™) en la India desde 2013 y lobeglitazona en Corea (Duvie™) con efectos antidiabéticos e hipolipemiantes. En la actualidad, existe un mayor interés en desarrollar agonistas duales PPARa y PPARy que muestren menos efectos adversos que los ligandos selectivos a o y (Tan et al., 2017). Con la finalidad de evaluar los posibles efectos adversos (citotoxicidad) de los compuestos de la invención, los compuestos 1 , 2 y 8 así como los compuestos de referencia, se evaluaron a concentraciones de 30 y 100 mM en neutrófilos humanos (Fig. 1A) y cultivos celulares primarios de células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC) (Fig. 1 B) mediante dos técnicas distintas: el ensayo de colorimetría de MTT y el análisis de citometría de flujo de apoptosis celular y supervivencia. Además, el compuesto sintetizado 9 se evaluó a 10, 30 y 100 pM (Fig. 2).
Ensayo de MTT. La viabilidad de neutrófilos y HUVEC se determinó mediante el ensayo de colorimetría de MTT (bromuro de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio).
Se obtuvieron neutrófilos a partir de la fracción leucoplaquetaria ( buffy coats) de donantes sanos mediante centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque.
Las células endoteliales de venas de cordón umbilical humano (HUVEC) se aislaron mediante el tratamiento de colagenasa y mantenidas en medio basal endotelial específico humano (EBM-2) suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) y 10% FCS. Se cultivaron células de pase 1 hasta confluencia en placas de 24-pocillos. Antes de iniciar cada experimento, las células se incubaron 24 h en medio conteniendo 1 % FBS.
Se añadieron 100 pL de neutrófilos y la suspensión de HUVEC en medio RPMI suplementado (2 x 105 células/mL) a cada pocilio de una placa de 96-pocillos. Las células se incubaron en ausencia y/o presencia de los compuestos a 37°C durante 24h. Se preparó una disolución de MTT (2 mg/mL en PBS). Se añadieron 100 pL de la disolución de MTT a cada pocilio y se incubó a 37°C durante otras 3 h. Los sobrenadantes se descartaron y se añadieron 200 pL de DMSO a cada pocilio para disolver el precipitado de formazán. Se midieron las densidades ópticas a dos longitudes de onda (560 y 630 nm) en un espectrofotómetro (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suiza).
Todos los compuestos mostraron una citotoxicidad significativa a 100 pM sobre ambos tipos de células (Figuras 1 y 2). Policerasoidin (2) y el derivado 8 también presentaron toxicidad a 30 pM en neutrófilos y HUVEC, y WY-14643 produjo citotoxicidad a 30 pM (9%) pero solo en neutrófilos humanos (Fig. 1). El compuesto sintetizado 9, mostró únicamente citotoxicidad en HUVEC a 30 pM (Fig. 2) pero del 12% respecto al vehículo.
Además, la tasa de apoptosis y supervivencia en neutrófilos humanos y HUVEC se determinó mediante doble tinción con anexina V y yoduro de propidio (Pl) mediante citometría de flujo.
Análisis de citofluorometría de apoptosis y supervivencia. Se utilizó el kit FITC Annexin V Apoptosis Detección (BD Bioscience, San José, CA). El protocolo de tinción y todos los reactivos se suministraron en el kit comercial. Las HUVEC se separaron de los frascos de cultivo mediante acutasa (StemPro® Accutase® Cell dissociation reagent, Thermofischer Scientific Waltham, MA). Ambos tipos celulares se incubaron a 37°C durante 24h en presencia o ausencia de los compuestos a ensayar. HUVEC confluentes y neutrófilos recién aislados se lavaron, resuspendieron en binding buffer 1x (1 x 106 cells/ml_) y se tiñeron con anexina V conjugada con FITC y yoduro de propidio (Pl), tal y como se describe en las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSVerse Flow Cytometer (BD Biosciences, San José, CA) y se diferenciaron como células de apoptosis temprana (anexina V+ y Pl ), apoptosis tardía y/o necrótica (anexina V+ y Pl+), y células vivas (anexina V- y PI-).
En neutrófilos, solo el compuesto 8 y rosiglitazona a la dosis de 100 mM causó un efecto mínimo en la supervivencia celular (5,3% y 8,5% respectivamente) (Figura 3B). El compuesto de síntesis 9 también provocó un efecto mínimo en la supervivencia de neutrófilos a las dosis de 30 y 100 mM (1 ,07% y 1 ,55%, respectivamente), en comparación con el vehículo (Figura 4B). Por el contrario, todos los compuestos aumentaron la apoptosis de forma significativa y disminuyeron la supervivencia a partir de 30 pM en células HUVEC, con excepción de policerasoidol (1) (Figura 3C y D) y el compuesto 9 (Figura 4C y D). En HUVEC, los compuestos más tóxicos fueron policerasoidin (2), su análogo 8 y rosiglitazona, que disminuyeron la supervivencia celular un 38,9, 61 ,3 y 79,2%, respectivamente, a 100 pM y ejercieron algunos efectos significativos a 30 pM (Figura 3C y D). Cabe destacar la ausencia de toxicidad del compuesto 9 en HUVEC a las dosis ensayadas, incluida a 100 pM, en comparación con el vehículo (Figura 4 C y D).
En la introducción hemos mencionado el uso limitado en humanos de numerosos agonistas PPARa y PPARy debido a problemas de toxicidad que conlleva a importantes efectos adversos. De hecho, a pesar de que rosiglitazona ejerce numerosos efectos beneficiosos en pacientes con diabetes tipo 2, las evidencias de sus efectos adversos cardiovasculares que incluyen aumento del riesgo de infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca, ha obligado la retirada del fármaco en numerosos países de la Comunidad Europea (Palee et al., 2011). Así pues, los estudios de toxicidad son importantes en este tipo de compuestos y mediante los ensayos de MTT y citometría de flujo hemos demostrado que los compuestos 1 y 9 son menos citotóxicos que los agonistas específicos de referencia para PPARa y PPARy.
Ejemplo 4: Efecto de los compuestos 1. 2. 8 9 sobre la interacción leucocito-endotelio inducida por TNFa bajo condiciones de flujo
El endotelio que recubre internamente los vasos sanguíneos presenta diversas funciones, cuyas alteraciones (“disfunción endotelial”) se han visto relacionadas con enfermedades cardiovasculares, tromboembolismo y aterosclerosis. De hecho, la disfunción endotelial es una de las primeras manifestaciones del inicio de aterosclerosis que conlleva a un fenotipo proinflamatorio y protrombótico del endotelio, provocando la liberación y migración de leucocitos al espacio subendotelial. Los PPAR, en particular PPARcr y PPARy, se expresan en la mayoría de las células vasculares, incluyendo endoteliales y células del músculo liso, donde participan en efectos antiinflamatorios específicos y el control lípidico (Rosenson et ai, 2012).12 Los agonistas PPARy (rosiglitazona) son capaces de inhibir el proceso inflamatorio, disminuyendo la acumulación de neutrófilos y células mononucleares (Palee et al., 2011).
Se utilizó la técnica de cámara de flujo paralelo que permite visualizar la adhesión celular bajo condiciones dinámicas de flujo fisiológico.
En la realización de este estudio, los neutrófilos y las células mononucleares se perfundieron a través de monocapas de HUVEC previamente estimuladas o no con TNFa (20 ng/mL) durante 24 h. Para ello, los neutrófilos y células mononucleares humanas se obtuvieron en suspensión de voluntarios sanos mediante el método Ficoll-Hypaque de centrifugación por gradiente de densidad. Las células recién aisladas (1 x 106/mL) se perfundieron a través de la monocapa de células endoteliales (HUVEC) estimuladas o no, con TNFa durante 24 h. En todos los experimentos, se determinaron las interacciones de los leucocitos después de perfundir durante 5 min a 0,5 dinas/cm2. Las placas de HUVEC se colocaron en la cámara de flujo (GlycoTech, Gaithersburg, MD) y se acopló una cámara colocada sobre un microscopio invertido de contraste de fases (Axio Observer A1 Cari Zeiss microscope, Thornwood, NY) para visualizar la adhesión celular (objetivo 20x y un ocular 10x). Además, las imágenes se grabaron en vídeo para su posterior análisis.
Las HUVEC se pretrataron con policerasoidol (1), policerasoidin (2), el compuesto (8), o el compuesto 9 a dosis de 1 , 3, 10, 30 y 100 mM, así como WY-14643 o rosiglitazona a 1 pM, 20 horas antes de la estimulación con TNFa (Sanz et ai, 2012).
El TNFa provocó un aumento significativo en la adhesión a las células endoteliales de leucocitos mononucleares y neutrófilos (Figuras 5 y 6). Ninguno de los compuestos inhibió significativamente las interacciones HUVEC-neutrófilos a la concentración de 1 pM, sin embargo, cabe destacar que el pretratamiento con policerasoidol (1), el análogo sintetizado 9 y rosiglitazona disminuyeron significativamente la adhesión HUVEC-células mononucleares (Figuras 5 y 6) de forma concentración-dependiente (Figuras 5C y 6B). En este ensayo, policerasoidol (1) fue 5 veces menos potente que rosiglitazona, mientras que el compuesto 9 mostró una potencia de aproximadamente 3,6 y 16 veces mayor que rosiglitazona y policerasoidol, respectivamente (valores CI50 de 0,30 pM vs. 1 , 1 pM y 4,9 pM, respectivamente). Teniendo en cuenta estos resultados y los estudios de citotoxicidad sobre apoptosis y supervivencia en neutrófilos, podemos decir que policerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9, podrían actuar inhibiendo el reclutamiento de células mononucleares sin comprometer la respuesta inmunitaria de neutrófilos, necesaria para la defensa del huésped. Por lo tanto, parece que ambos compuestos son candidatos interesantes para una evaluación inmuno-farmacológica adicional, debido a la capacidad de estos compuestos para reducir el reclutamiento de células mononucleares, la potencia como agonistas duales de PPARa/g y la baja citotoxicidad.
Ejemplo 5: Policerasoidol (1 ) v el compuesto 9 inhibieron la adhesión celular mononuclear al endotelio, inducida por TNFa vía interacción RXRa/PPARv
Policerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9 son ligandos agonistas duales PPARa/g y rosiglitazona es un agonista selectivo PPARY. Para suprimir la expresión PPARa o PPARY en células endoteliales, hemos aplicado una aproximación de silenciamiento de genes mediante ARN de interferencia (siRNA).
Se transfectaron HUVEC confluentes con ARNsi de RXRa, PPARa, PPARY específicos (Dharmacon, Lafayette, CO) utilizando RNAiMAX de lipofectamina (Invitrogen, Carslbad, CA) durante 48 h (Sanz et al., 2012).13 A continuación, las células se trataron durante 20 h con policerasoidol (1) a 10 mM o rosiglitazona a 1 mM y luego se estimularon durante 4 h con TNFa (10 ng/ml_). Con el fin de confirmar el silenciamiento PPARa, PPARY y RXRa vía ARNsi, se realizó el análisis mediante Western blot (Sanz etai, 2012).13 Después de silenciar, se lavaron las células, se rasparon, se recogieron y se centrifugaron a 15.000 g a 4°C durante 30 min para obtener el extracto total de proteína. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford. Las muestras se desnaturalizaron, se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con BSA-PBS al 5% con Tween 20 al 0,05% y se incubaron con el anticuerpo correspondiente. Los anticuerpos policlonales de conejo frente a RXRa y PPARY (H-100) y el anticuerpo monoclonal de ratón frente a PPARa fueron adquiridos a Santa Cruz Biotechnology (dilución: 1 :400, Santa Cruz, CA). Los anticuerpos secundarios IgG anti-conejo o anti-ratón ligados a la peroxidasa de rábano fueron suministrados por DakoCytomation (dilución 1 :2000, Dinamarca).
Transcurridas las 48 horas de la transfección con siRNA específico de PPARa o PPARy, las HUVEC mostraron > 68% y 66% de reducción de proteína, respectivamente, en comparación con los niveles detectados en las células control tratadas con siRNA (Figura 7). En el control de células transfectadas-siRNA, la estimulación con TNFa inducía aumentos significativos en la adhesión de las células mononucleares que eran inhibidas cuando las células endoteliales se pretrataban con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8A y B). Cabe destacar que, mientras estas respuestas no se veían afectadas por el silenciamiento PPARa (Figura 8A), las respuestas inducidas por policerasoidol (1) eran anuladas en HUVEC deficiente de PPARy (Figura 8B). Los PPAR forman heterodímeros con RXR que en algunos casos responden sinérgicamente a ambos agonistas, RXR y el receptor. Dado que PPARY puede interactuar con RXRa para producir su actividad antiinflamatoria (Sanz et al., 2012), la delección dirigida de la expresión de RXRa en HUVEC con siRNA específico de RXRa (>72% de reducción de proteína, Figura 7) también suprimió completamente el efecto inhibidor de policerasoidol (1) sobre la adhesión de células mononucleares inducida por TNFa (Figura 8C).
Además, para confirmar la interacción entre PPARY y RXRa, las HUVEC se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-PPARY y se sometieron a electroforesis y western- blot con un anticuerpo anti-RXRa, y se detectó el aumento de la interacción RXRa/PPARY en aquellas células pretratadas con policerasoidol (1) o rosiglitazona (Figura 8D).
Para inmunoprecipitación, los extractos de proteína se obtuvieron en 50 mM Tris-HCI (pH 8), 150 mM NaCI, 1 % Nonidet P-40 y proteasa (1 mM PMSF, 40 pg/mL aprotinina y 40 pg/mL leupeptina) e inhibidores de fosfatasa. Entonces, los extractos de proteína (~200 pg) se incubaron con 5 pg de anticuerpo frente a PPARY. Se precipitaron inmunocomplejos utilizando un anti-conejo IgG beads (cat# 8800, eBioscience, San Diego, CA) y se suspendieron en tampón de muestra con 50 mM ditiotreitol (DTT). El Western blot se llevó a cabo con un anticuerpo frente a RXRa y las membranas se incubaron con el secundario HRP-conjugado Conejo TrueBlot (eBioscience, San Diego, CA) como anticuerpo secundario. Se desarrollaron señales de quimioluminiscencia con ECL (GE Healthcare, Madrid, España).
Este mismo experimento de inmunoprecipitación se llevó a cabo con el compuesto de síntesis 9 (Figura 9). Teniendo en cuenta los resultados, podemos concluir que policerasoidol (1) y el compuesto 9, no requieren la activación de PPARa para inhibir el reclutamiento de células mononucleares, pero necesitan la activación de RXRa y PPARY para ejercer su efecto antiinflamatorio, como ocurre con otros agonistas selectivos PPARY O RXRa (Sanz et al., 2012) .
Ejemplo 6: Policerasoidol (1 ) v el compuesto sintetizado 9 disminuyen la expresión de la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1), la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) v fractalquina (CX3CLI), inducidas por TNFa
En enfermedades cardiovasculares y cardiometabólicas (hipertensión, obesidad, diabetes, síndrome metabólico) se han detectado niveles elevados de mediadores circulantes, entre otros, citoquinas y quimiocinas que pueden reflejar alteraciones en la función endotelial. Las citoquinas proinflamatorias estimulan el endotelio para expresar moléculas de adhesión celular (CAM), tales como la molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula- 1 de adhesión intercelular (ICAM-1), aumentando la adhesión de leucocitos a las células del endotelio vascular, que constituye un proceso importante de la etapa inicial de las respuestas inflamatorias e inmunológicas (Zernecke et al., 2010). PPARY se expresa en tejidos vasculares y leucocitos, y su activación puede disminuir la expresión de CAMs como ICAM-1 o VCAM-1 , así como la expresión de CX3CLI (fractalquina). CX3CLI es una quimiocina que se expresa en la superficie de células endoteliales, y puede unirse a su receptor CX3CRI , expresado en monocitos, linfocitos T y células NK, promoviendo la adhesión celular. CX3CLI también se puede desprender de la superficie celular por acción de ADAM10 y ADAM17, liberándose una forma soluble capaz de actuar como quimioatrayente de los leucocitos que expresan su receptor. Además de CX3CLI , existe otra quimiocina transmembrana, CXCL16, que al igual que CX3CLI , también se expresa en células endoteliales y puede desprenderse por la acción de ADAM10. Ejerce su acción interaccionando con su receptor CXCR6, presente en determinados subtipos leucocitarios, promoviendo la adhesión de los mismos a la superficie endotelial. Así, estas quimiocinas y moléculas de adhesión regulan la adhesión y migración de los leucocitos a la pared vascular, y existen indicios de que un incremento de su expresión endotelial está asociado a un incremento de la aterosclerosis (Zernecke et al., 2008).
Para investigar la expresión de VCAM-1 , ICAM-1 , fractalquina (CX3CLI) y CXCL16, se pretrataron HUVEC con policerasoidol (1) (10 mM) o el compuesto 9 (3 pM) durante 24 h, y se estimularon con TNFa (20 ng/ml_) durante 24 h adicionales. Las células se recogieron de los frascos utilizando accutasa (StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent, ThermoFischer Scientific, Waltham, MA). Entonces, se lavaron e incubaron durante 1 h con un anticuerpo APC-conjugado mAb frente a VCAM-1 humano (100 pg/mL; clon STA, BioLegend, San Diego, CA), FITC-conjugado mAb frente a ICAM-1 humano (400 pg/mL; clon HA58, BioLegend, San Diego, CA), PE-conjugado mAb frente a CX3CLI humano (1 ,25 pg/mL; clon 51637, R&D Systems, Minneapolis, MN) o con un anticuerpo monoclonal APC-conjugado frente a CXCL16 humano (clon 256213, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), todos ellos a una dilución 1 :25 en 3% BSA/PBS. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo paralelo (FACSVerse, BD Biosciences, San José, CA).
En este estudio hemos demostrado que el pretratamiento de HUVEC con policerasoidol (1) durante 20 h a 10 pM disminuía significativamente la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 , inducida por TNFa (Fig. 10), siendo el efecto más acusado en VCAM-1 (87,8% de inhibición) que ICAM- 1 (23,8% de inhibición). Para investigar el efecto de policerasoidol (1) sobre la expresión de fractalquina (CX3CLI ), las células se estimularon con TNFa y las respuestas se evaluaron por citometría de flujo e inmunofluorescescia después de 24 h.
Los resultados mostraron que policerasoidol (1) a 10 pM reducía la expresión de esta quimiocina en un 77,6% (Figura 10C). La expresión de moléculas de adhesión como VCAM- 1 , ICAM-1 o quimiocinas como CX3CLI o CXCL16, también se determinó para el compuesto 9 a 3 pM, que mostró un descenso significativo de la expresión de VCAM-1 , CX3CLI y CXCL16
(Figura 11). Para realizar los ensayos de inmunofluorescencia HUVEC confluentes se cultivaron sobre cristales y algunas células se incubaron 24 h con policerasoidol (1) (10 mM) o el compuesto 9 (3 mM), antes de ser tratadas con TNFa (20 ng/ml_) durante 24 h adicionales. Entonces, las células se lavaron dos veces con PBS (1x), se fijaron con 4% de paraformaldehído y se bloquearon en solución de PBS (1x) conteniendo 1 % BSA. HUVEC se incubaron a 4°C toda la noche con un anticuerpo monoclonal primario de ratón frente a VCAM-1 humano (dilución 1 :200; clon 1.G1 1 B1 , Serotec, Kidlington, Reino Unido), ICAM-1 (dilución 1 :200; clon 6.5B5, Serotec, Kidlington, Reino Unido), CX3CLI (dilución 1 :200; clon 81506, R&D Systems, Minneapolis, MN) o CXCL16 (1 :200 dilución; Immunostep, Salamanca, España) en una solución 0, 1 % BSA/PBS, seguido de incubación con un anticuerpo secundario alexa-fluor 488-conjugado de cabra anti-conejo (dilución 1 : 1000; A11034, Life Technologies, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente durante 1 h. Los núcleos celulares se contrastaron con Hoechst (diluido 1 :4000 en PBS, Sigma-Aldrich, Madrid, España). Se capturaron imágenes con microscopio de fluorescencia (Axio Observer A1 , Cari Zeiss, Thornwood, NY) equipado con un objetivo de lente 40x y un ocular 10x.
Ejemplo 7: Policerasoidol (1 ) v el compuesto 9 inhiben la activación de p38 MAPK v NF-
KB inducida por TNFa en HUVEC
Numerosas evidencias han revelado que los ligandos PPAR son capaces de modular las vías de señalización MAPK (Park et al., 2011). Por lo que hemos investigado las vías de señalización intracelular que subyacen a las respuestas inhibidoras mostradas por polycerasoidol (1) y el compuesto sintetizado 9.
El efecto de policerasoidol (1) o el compuesto 9 sobre la fosforilación de p38 MAPK y p65 (NF- KB) inducida por TNFa se determinó en HUVEC mediante citometría de flujo. HUVEC se incubaron previamente durante 24 h con el compuesto 1 (10 mM) o 9 (3 mM) y se estimularon durante 1 h con TNFa (20 ng/mL). Las células endoteliales se fijaron con BD Cytofix Fixation Buffer (BD Biosciences, San José, CA) y se permeabilizaron con BD Sol Perm III solución (BD Biosciences, San José, CA) y se tiñeron secuencialmente con una dilución 1 : 10 de un anticuerpo PE-conjugado mAb frente a p65 humano (pS529, clon K10-895.12.50; BD Biosciences, San José, CA) y una dilución 1 : 10 de anticuerpo Alexa Fluor-conjugado mAb frente a p38 MAPK humano (pT80/pY182, clon 36/p38; BD Biosciences, San José, CA). Las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD FACSVerse (BD Biosciences, San José, CA).
Los resultados mostraron que policerasoidol (1) fue capaz de descender de forma considerable (63,4%) la activación de p38 MAPK, así como el compuesto 9 (71 ,9%) (Figuras 12A y 13A). Además, la activación de distintos compuestos de la familia MAPK se asocia con la transactivación de NF-kB (p65), y la movilización de NF-kB al núcleo activa la transcripción de genes que codifican la expresión de numerosos mediadores inflamatorios como las moléculas de adhesión endoteliales o la síntesis de citocinas y quimiocinas (Monaco et al., 2004). Pudimos determinar que policerasoidol (1) y el compuesto 9 fueron capaces de bloquear significativamente la activación de NF-kB inducida por TNFa (Figura 12B y 13B).
Estudios in vivo
Ejemplo 8: Tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9.
Los protocolos conformes a las directrices de la Unión Europea para el cuidado y la protección de los animales fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Valencia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados, así como su sufrimiento.
Los ratones ob/ob presentan una deficiencia de leptina, y están asociados con hiperfagia, y obesidad, además de hiperglicemia e hiperinsulinemia. En este estudio se utilizaron ratones machos ob/ob (C57BL/6J) (Charles River laboratories, Chatillon-sur-Chalaronne, Francia).
Los ratones fueron alojaron en jaulas individuales en una habitación donde se controlaba la temperatura, humedad y luz. Se mantuvieron y criaron (estabularlo de la UCIM, Universitat de Valéncia). en condiciones libres de patógenos con acceso libre a alimento y agua autoclavada, a una humedad del 60-65% y a una temperatura constante de 22±2°C con un ciclo oscuro/luminoso de 12 h (luz de 06:00-18:00 h, oscuridad de 18:00-06:00 h). A los ratones se les permitió aclimatarse durante diez días antes del estudio.
Los ratones machos ob/ob de 7 a 8 semanas de edad se trataron diariamente entre las 9:00 a.m. y las 11 :00 horas con el compuesto 9 por vía oral mediante una sonda orogástrica (10 mg/Kg/d y 30 mg/Kg/d), rosiglitazona (10 mg/ Kg / d) y/ o WY-14643 (30 mg/Kg/d) durante 4 días, y se compararon con el grupo de ratones ob/ob control tratados únicamente con el vehículo (suero fisiológico con HEC 1 %). Las dosis se eligieron en base a resultados previos, obtenidos de un experimento con ratones ob/ob (n=3) en el que el compuesto 9 y los compuestos de referencia, rosiglitazona y WY-14643, se administraron intraperitonealmente (datos no mostrados). Se utilizaron 6 animales por grupo, en experimentos independientes (n=6). Los compuestos se prepararon diariamente como suspensiones en HEC al 1 % para su administración oral. La aleatorización se realizó sobre los valores de glucemia a día 0. Durante la duración del experimento se pesó diariamente para cada ratón: cantidad de alimento ingerido y el peso corporal. Diariamente, entre las 9:00 a.m. y las 1 1 :00 horas (previo al tratamiento) se midió la glucosa en sangre utilizando (Contour next USB Blood glucose meter, BAYER, Basel, Suiza). El quinto día del experimento, los ratones se anestesiaron con isofluorano y se extrajo la sangre por punción cardiaca. La sangre se recogió en tubos conteniendo EDTA o heparina. Una vez tomadas las muestras, los animales se sacrificaron por dislocación cervical y posteriormente, se extrajeron diversos órganos como tejido adiposo blanco (WAT) e hígado, para su estudio posterior. Los órganos se pesaron y se congelaron para un posterior análisis de ARN y poder llevar a cabo estudios histológicos. Las muestras de plasma se obtuvieron por centrifugación y se almacenaron a -80°C.
Análisis histológico
Las muestras de tejido adiposo blanco perigonal (WAT) y de hígado fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, embebidas en parafina, seccionadas utilizando un microtomo (Leica RM2245, Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) y montadas en portaobjetos de microscopio Superfrost® plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se obtuvieron secciones transversales de tejido de WAT y de hígado. Se examinaron al menos 10 portaobjetos, que contenían≈ 4 secciones transversales de tejido (5 pm de espesor) de cada animal. Se llevó a cabo una tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de WAT e hígado. La infiltración inflamatoria en WAT se midió como se describió previamente (Toyoda et al., 2008). Tras la inactivación de la peroxidasa (H2O2 3%) y del bloqueo con suero de cabra (Abcam, Cambridge, Reino Unido), se incubaron secciones transversales de WAT durante la noche (4°C) con el siguiente anticuerpo monoclonal (mAb) primario: mAb de conejo anti-ratón F4/80 (dilución 1 : 100, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se detectó un mareaje específico con un anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con HRP (dilución 1 :500, Dako, Copenhague, Dinamarca). Con el fin de confirmar la especificidad de los anticuerpos, se usaron anticuerpos control de igual isotipo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o anticuerpo secundario sólo como controles negativos. Las muestras se revelaron usando una solución que contenía 3, 3'- diaminobenzidina (DAB, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA), posteriormente se contratiñeron con hematoxilina de Harris (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y se deshidrataron. Cinco campos de cada sección de tejido WAT fueron fotografiados (Axio Observer A1 , microscopio Cari Zeiss, Thornwood, NY) digitalizados y analizados (ImageJ software 1.48V, Bethesda, MA). La cuantificación se realizó a doble ciego y mediante códigos.
Extracción de ARNm, PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo de la grasa WAT de ratones mediante homogenización. La transcripción reversa se realizó con 1000 ng de ARN total usando el kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y se convirtió a cDNA por métodos estándar. El cDNA se amplificó con cebadores específicos para la proteína quimioatrayente monocítica de ratón 1 (MCP-1 o CCL2, Mm00441242_m1) en un aparato de PCR en Tiempo Real 7900HT (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) usando el Mix Universal Master (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) Todos los cebadores fueron prediseñados por Applied Biosystems. La cuantificación relativa de las diferentes transcripciones se determinó con el método 2_AACt usando GAPDH (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltha , MA) co o control endógeno y normalizado para el grupo control.
Mediciones de metabolitos
Se determinaron los ácidos grasos libres en plasma (FFA), el enzima aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) por medio de un kit de ensayo colorimétrico (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Además, se determinaron los niveles de lípidos en plasma de colesterol total y triglicéridos (TG) mediante procedimientos enzimáticos (WAKO, Cape Charles, VA). También se determinó la concentración de HDL-colesterol (HDL- c) con el mismo método que el usado para medir colesterol total, después de la precipitación de la apolipoproteína-B (apoB) con sulfato de dextrano/MgCh (Sigma-Aldrich, Madrid, España) como se describió previamente (Zieske et al., 2005).
8.1 El compuesto 9 no provoca variaciones en el peso corporal y en la eficiencia alimenticia.
Un efecto adverso durante el tratamiento con TZD en los individuos con DT2 es la ganancia de peso (Ahmadian et al., 2013). Para determinar los efectos del tratamiento con el compuesto 9, los ratones y la comida ingerida se pesaron diariamente. Se calculó la ganancia de peso al final del tratamiento (d5-d0) (Figura 14A). El tratamiento con el compuesto 9 a las dosis de 10 y 30 mg/Kg/d no provocó diferencias significativas en la ganancia de peso en relación al grupo control. El aumento de ganancia fue de 1 ,70 ±0,25, 2,5±0,32 y 1 ,88±0,52 g, para los ratones control, tratados con rosiglitazona y compuesto 9 (30 mg/Kg/d), respectivamente. La eficiencia alimenticia siguió esta misma tendencia, y en los ratones tratados con el compuesto 9 no se observaron diferencias significativas (Figura 14B).
8.2 El compuesto 9 disminuye los valores de glucemia
El tratamiento durante 4 días nos permitió observar un aumento del 47% en el porcentaje de glucosa en sangre (248 vs. 300 mg/dL) en los ratones ob/ob del grupo control tratados con vehículo, mientras que la administración del compuesto 9 provocó un descenso del 20% en los niveles de glucosa (261 vs. 194 mg/dL) a la dosis de 30 mg/Kg/d respecto al día 0 (do), por último, el tratamiento con rosiglitazona disminuyó la glucosa un 32% (217 vs. 135 mg/dL) (Figura 15).
8.3 Efecto del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)
El tratamiento de ratones ob/ob con el compuesto 9 no aumentó de forma significativa el peso del tejido adiposo blanco (WAT) perigonadal en comparación con el grupo de ratones control
(Figura 16). Por otra parte, el examen histológico de WAT reveló cambios en la morfología de las células, con un descenso significativo del área media de los adipocitos en ratones tratados con el compuesto 9 de forma dosis-dependiente, similar al efecto producido por WY- 14643 (Figura 17), sugiriendo la capacidad del compuesto 9 para prevenir la hipertrofia de adipocitos. Por el contrario, el tratamiento con rosiglitazona aumentó el número de adipocitos de pequeño tamaño en los depósitos de WAT, disminuyendo el valor medio del área de los adipocitos y confirmando su efecto adipogénico.
8.4 Efecto antiinflamatorio del compuesto 9 sobre el tejido adiposo blanco (WAT)
Existen evidencias de que en individuos obesos con DT2 se desarrolla un proceso de inflamatorio crónico iniciado en el tejido adiposo. En WAT de ratones obesos se encuentran aumentados los niveles de expresión de los genes en las vías inflamatorias, esto se refleja en un aumento de quimiocinas inflamatorias en el tejido adiposo de individuos obesos, tales como la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1), que participa en el reclutamiento de monocitos en la zona de la inflamación (Yoshimura et al., 1989), así como un aumento de la infiltración de macrófagos en tejido adiposo (MacKnight et al., 1996).
Se realizaron estudios sobre el proceso inflamatorio de WAT y pudimos observar que en ratones ob/ob tratados con el compuesto 9 a 30 mg/Kg/d, disminuyó de forma significativa la expresión de MCP-1 (Figura 18A). Además, la cuantificación de macrófagos en WAT mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo frente a F4/80, nos mostró que el compuesto 9 fue capaz de disminuir significativamente el número de macrófagos a la dosis de 30 mg/Kg/d, indicando la capacidad del compuesto 9 para reducir la infiltración de macrófagos en WAT, similar al efecto producido por rosiglitazona (Figura 18B).
8.5 El compuesto 9 mejora los parámetros lipidíeos en sangre
Se ha estudiado los efectos en la dislipidemia de ratones ob/ob determinando diversos parámetros en plasma como son el colesterol total, HDL-c, triglicéridos y ácidos grasos libres. El tratamiento con el compuesto 9 a la dosis de 30 mg/Kg/d y WY-14643 aumentó de forma significativa los niveles de colesterol total respecto al grupo de ratones control ob/ob (50% y 64%, respectivamente) (Figura 19A). El compuesto 9 a las dosis de 10 y 30 mg/Kg/d y WY- 14643 también aumentaron significativamente el HDL-c, respecto al grupo de ratones control ob/ob (Figura 19B). Además, el compuesto 9 y WY-14643 mostraron un descenso de los niveles de triglicéridos en plasma, aunque no de forma significativa y que podría ser debido al corto periodo de tratamiento (122 mg/dL o 101 mg/dL a la dosis de 10 o 30 mg/Kg/d, respectivamente, vs. 137 mg/dL del control ob/ob) (Figura 19C). El compuesto 9 a 30 mg/Kg/d y WY-14643 fueron capaces de descender significativamente los niveles de ácidos grasos libres en sangre (0,25 y 0,33 moles/pL, respectivamente, vs. 0,67 moles/pL del control ob/ob)
(Figura 19D).
8.6 Efecto del compuesto 9 en el hígado
Se ha estudiado el efecto del compuesto 9 sobre un órgano primordial como es el hígado, observándose un aumento de peso no significativo respecto al grupo control ob/ob (Figura 20A). La cuantificación del contenido de triglicéridos mostró que en el corto periodo de tratamiento con el compuesto 9 a 30 mg/Kg/d, los triglicéridos no se acumularon de forma significativa en hígado en comparación al grupo control ob/ob (Figura 20B).
8.7. El compuesto 9 disminuyó los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)
El compuesto 9 disminuyó los niveles de ALT y AST, sufriendo esta última una reducción estadísticamente significativa a la concentración de 30 mg/Kg/d (28%) en comparación con el grupo control ob/ob tras 4 días de tratamiento (Figura 21). Esto sugiere que el compuesto 9 podría reducir el daño hepático, mostrando un efecto hepatoprotector.
REFERENCIAS
1. Cheang, W. S. et al. The peroxisome proliferator-activated receptors in cardiovascular diseases: experimental benefits and clinical challenges. Br. J. Pharmacol. 2015, 172, 5512-5522.
2. Ah adian, M. et al. PPARY signaling and metabolism: the good, the bad and the future.
Nat. Med. 2013, 19, 557-566.
3. Tan, C. K. et al. Synthetic and natural Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) agonists as candidates for the therapy of the metabolic síndrome. Expert Opin. Ther. Targets 2017, 21 , 333-348.
4. González, M. C. et al. Polycerasoidin and polycerasoidol, two new prenylated benzopyran derivatives from Polyalthia cerasoides. J. Nat. Prod. 1995, 58, 1278-1284.
5. González, M. C. et al. Prenylated benzopyran derivatives from two Polyalthia species.
Phytochem. 1996, 43, 1361-1364.
6. Kabbe, H.-J., Widdig, A. Synthesis and reactions of 4-chromanones. Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 1982, 21 , 247-256.
7. Sen, S. E. et al. Inhibition of vertébrate squalene epoxidase by extended and truncated analogues of trisnorsqualene alcohol. J. Med. Chem. 1990, 33, 1698-1701. 8. Bisceglia, J. A.; Orelli, L. R. Recent Applications of the Horner-Wadsworth-Emmons Reaction to the Synthesis of Natural Products. Curr. Org. Chem. 2012, 16, 2206-2230.
9. Toshima, K. et al. The First Total Synthesis of Concanamycin F (Concanolide A). J.
Org. Chem. 2001 , 66, 1708-1715.
10. Carmona, M. C. et al. S 26948: a new specific peroxisome proliferator-activated receptor-modulator with potent antidiabetes and antiatherogenic effects. Diabetes
2007, 56, 2797-2808.
11. Palee, S. et al. PPARgamma activator, rosiglitazone: Is it beneficial or harmful to the cardiovascular Syste ? World J. Cardiol. 2011 , 3, 144-152.
12. Rosenson, R. S. et al. Modulating peroxisome proliferator-activated receptors for therapeutic benefit? Biology, clinical experience, and future prospects. Am. Heart J. 2012, 164, 672-680.
13. Sanz, M. J. et al. Retinoid X receptor agonists impair arterial mononuclear cell recruitment through peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activation. J. Immunol. 2012, 189, 411-424.
14. Zernecke, A.; Weber, C., Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosis. Cardiovasc. Res. 2010, 86, 192-201.
15. Zernecke, A. et al. Chemokines in atherosclerosis an update. Artherioscler. Thromb.
Vaso. Biol. 2008, 28, 1897-1908.
16. Park, J. B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists suppress tissue factor overexpression in rat balloon injury model with paclitaxel infusión. PLoS One 2011 , 6, e2832.
17. Monaco, C.; Paleolog, E., Nuclear factor kappaB: a potential therapeutic target in atherosclerosis and thrombosis. Cardiovasc. Res. 2004, 61 , 671-678.
18. Toyoda, T. et al. Effect of peroxisoma proliferator-activated receptor-a ligands in the interaction between adipocytes and macrophages in obese adipose tissue. Obesity
2008, 16, 1199-1207.
19. Zieske A. W. et al. Elevated serum c-reactive protein levels and advanced atherosclerosis in youth. Arterioscler. Thromb. Vaso. Biol. 2005, 25, 1237-1243.
20. Yoshimura, T. et al. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Full-length cDNA cloning, expression in mitogen-stimulated blood mononuclear leukocytes, and sequence similarity to mouse competence gene JE. FEBS Lett. 1989, 244, 487-49321. 21. McKnight, A. J. et al. Molecular cloning of F4/80, a murine macrophage-restricted cell surface glycoprotein with homology to the G-protein-linked transmembrane 7 hormone receptor family. J. Biol. Chem. 1996, 271 , 486-489.
22. Taha H et al., (2015) PLoS ONE 10(5) e0126126.doi: 10.1371 /journal.pone.0126126. 23. Zhao Yang et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry (2010), 58(8), 4844-4852.
24. Karimian et al., (2015) PLoS ONE 10(5) e0127434.doi:10.1371/journal.pone.0127434.
25. Zafra-Polo et. Al., J. Nat. Prod., 1996, 59(10), 913-916.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000071_0001
donde
R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo C(0)Ra, donde Ra es un grupo arilo; alquilsulfona y halo-alquilsulfona;
R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil éster de estructura:
Figure imgf000071_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000071_0003
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C1-6 alquilo, en donde cuando Rb es etilo, R1 es bencilo y R4 es -OCH2CF3;
en donde A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
R5 se selecciona independientemente entre H; C1-6 alquilo; alilo; alquilamida; alquilamina; alquilarilo; alquil-éter; halo-alquilo; sililo; C(0)NRmRP, donde Rm y/o Rp son cada uno e independientemente H, C1-6 alquilo o arilo; acilo; alquilsulfona y halo-alquilsulfona;
R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona
y en donde, además, cuando R1 es H y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo, y
cuando R1 es metilo y R3 es metilo, R5 es distinto de H o metilo.
2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , seleccionado entre el grupo que consiste en 3, 4, 4a, 4b, 4c, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 o 13:
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
3. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para uso como medicamento.
4. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
5. Compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicha enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiometabólicos, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar y enfermedades neurodegenerativas.
6. Composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de fórmula I, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
7. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, para uso como medicamento.
8. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 6, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
9. Composición farmacéutica para uso, de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiometabólicos, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar y enfermedades neurodegenerativas.
10. Compuesto de formula general I, estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
Figure imgf000076_0001
donde
- R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H o un grupo protector de fenol;
- R2 se selecciona independientemente entre un grupo alquil-éster de estructura:
Figure imgf000076_0002
un derivado de un grupo prenilo de estructura:
Figure imgf000076_0003
o un grupo acilo -C(0)0Rb, donde Rb es un grupo C alquilo,
en donde A se selecciona independientemente entre un átomo de O, un átomo de S o un grupo NR7, donde R7 se selecciona independientemente entre H, ORs o un grupo C1-6 alquilo, y donde Rs es un grupo H o un grupo C1-6 alquilo;
R5 se selecciona independientemente entre H o un grupo protector de ácido carboxílico;
R6 es C1-6 alquilo o OR9 donde R9 es C1-6 alquilo;
y donde
- R3 es H o un grupo C1-6 alquilo;
- R4 es un grupo C1-6 alquilo o un alcóxido;
- R10 se selecciona independientemente entre un grupo C1-6 alquilo, alilo, alquilamina, alquilamida, alquilarilo, alquiléter, haloalquilo, sililo, carbamato, alquilsulfona o haloalquilsulfona
para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy,
11. Compuesto para uso, de acuerdo con la reivindicación 10, donde la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente entre desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
12. Composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto según la reivindicación 10 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento de una enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy.
13. Composición farmacéutica para uso, de acuerdo con la reivindicación 12, donde la enfermedad que responde a la administración de agonistas de PPARa y/o PPARy se selecciona independientemente desórdenes cardiovasculares, diabetes tipo 2 (DT2), obesidad, síndrome metabólico, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, quilomicronemia primaria, hiperlipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0421419A2 (en) 1989-10-04 1991-04-10 Bristol-Myers Squibb Company Tocotrienols in the treatment of hypercholesterolemia, hyperlipidemia and thromboembolic disorders
WO2002026729A2 (en) * 2000-09-27 2002-04-04 Merck & Co., Inc. Benzopyrancarboxylic acid derivatives for the treatment of diabetes and lipid disorders

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2874583C (en) * 2012-05-22 2018-10-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods for making tocoflexols and analogues thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0421419A2 (en) 1989-10-04 1991-04-10 Bristol-Myers Squibb Company Tocotrienols in the treatment of hypercholesterolemia, hyperlipidemia and thromboembolic disorders
WO2002026729A2 (en) * 2000-09-27 2002-04-04 Merck & Co., Inc. Benzopyrancarboxylic acid derivatives for the treatment of diabetes and lipid disorders

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHMADIAN, M. ET AL.: "PPARy signaling and metabolism: the good, the bad and the future", NAT. MED., vol. 19, 2013, pages 557 - 566
BISCEGLIA, J. A.ORELLI, L. R.: "Recent Applications of the Horner-Wadsworth-Emmons Reaction to the Synthesis of Natural Products", CURR. ORG. CHEM., vol. 16, 2012, pages 2206 - 2230
CARMONA, M. C. ET AL.: "S 26948: a new specific peroxisome proliferator-activated receptor-modulator with potent antidiabetes and antiatherogenic effects", DIABETES, vol. 56, 2007, pages 2797 - 2808
CHEANG, W. S. ET AL.: "The peroxisome proliferator-activated receptors in cardiovascular diseases: experimental benefits and clinical challenges", BR. J. PHARMACOL., vol. 172, 2015, pages 5512 - 5522
GONZALEZ M CARMEN ET AL.: "Polycerasoidin and polycerasoidol, two new prenylated benzopyran derivatives from Polyalthia cerasoides", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS (LLOYDIA) 1995, vol. 58, no. 8, 30 November 1994 (1994-11-30), pages 1278 - 1284, XP055622434, ISSN: 0163-3864, DOI: 10.1021/np50122a022 *
GONZALEZ M CARMEN ET AL.: "Prenylated benzopyran derivatives from two Polyalthia species", PHYTOCHEMISTRY ( OXFORD ) 1996, vol. 43, no. 6, 30 November 1995 (1995-11-30), pages 1361 - 1364, XP055622438, ISSN: 0031-9422, DOI: 10.1016/S0031-9422(96)00450-5 *
GONZALEZ, M. C. ET AL.: "Prenylated benzopyran derivatives from two Polyalthia species", PHYTOCHEM., vol. 43, 1996, pages 1361 - 1364, XP055622438, DOI: 10.1016/S0031-9422(96)00450-5
GONZALEZ, M. C.: "Polycerasoidin and polycerasoidol, two new prenylated benzopyran derivatives from Polyalthia cerasoides", J. NAT. PROD., vol. 58, 1995, pages 1278 - 1284, XP055622434, DOI: 10.1021/np50122a022
KABBE, H.-J.WIDDIG, A.: "Synthesis and reactions of 4-chromanones", ANGEW. CHEM. INT. ED. ENGL., vol. 21, 1982, pages 247 - 256
KARIMIAN ET AL., PLOS ONE, vol. 10, no. 5, 2015, pages e0127434
MCKNIGHT, A. J. ET AL.: "Molecular cloning of F4/80, a murine macrophage-restricted cell surface glycoprotein with homology to the G-protein-linked transmembrane 7 hormone receptor family", J. BIOL. CHEM., vol. 271, 1996, pages 486 - 489, XP000877442, DOI: 10.1074/jbc.271.50.31869
MONACO, C.PALEOLOG, E.: "Nuclear factor kappaB: a potential therapeutic target in atherosclerosis and thrombosis", CARDIOVASC. RES., vol. 61, 2004, pages 671 - 678
PALEE, S. ET AL.: "PPARgamma activator, rosiglitazone: Is it beneficial or harmful to the cardiovascular system?", WORLD J. CARDIOL., vol. 3, 2011, pages 144 - 152
PARK, J. B. ET AL.: "Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists suppress tissue factor overexpression in rat balloon injury model with paclitaxel infusion", PLOS ONE, vol. 6, 2011, pages e2832
PEARCE B C ET AL.: "HYPOCHOLESTEROLEMIC ACTIVITY OF SYNTHETIC AND NATURAL TOCOTRIENOLS", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 1992, vol. 35, no. 20, 30 November 1991 (1991-11-30), pages 3595 - 3606, XP002393508, ISSN: 0022-2623, doi:10.1021/jm00098a002 *
ROSENSON, R. S. ET AL.: "Modulating peroxisome proliferator-activated receptors for therapeutic benefit? Biology, clinical experience, and future prospects", AM. HEART J., vol. 164, 2012, pages 672 - 680
SANZ M -J ET AL.: "A novel dual PPARa and PPARy agonist inhibit TNFa - induced mononuclear cell recruitment", BASIC AND CLINICAL PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY, vol. 123, no. 2, 1 August 2018 (2018-08-01), pages 44, ISSN: 1742-7843 *
SANZ, M. J. ET AL.: "Retinoid X receptor agonists impair arterial mononuclear cell recruitment through peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activation", J. IMMUNOL., vol. 189, 2012, pages 411 - 424
See also references of EP3733658A4
SEN, S. E.: "Inhibition of vertebrate squalene epoxidase by extended and truncated analogues of trisnorsqualene alcohol", J. MED. CHEM., vol. 33, 1990, pages 1698 - 1701
TAN CHEK KUN ET AL.: "Synthetic and natural Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) agonists as candidates for the therapy of the metabolic syndrome", EXPERT OPINION ON THERAPEUTIC TARGETS MAR 2017, vol. 21, no. 3, 28 February 2017 (2017-02-28), pages 333 - 348, XP055622430, ISSN: 1472-8222, DOI: 10.1080/14728222.2017.1280467 *
TAN, C. K.: "Synthetic and natural Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) agonists as candidates for the therapy of the metabolic syndrome", EXPERT OPIN. THER. TARGETS, vol. 21, 2017, pages 333 - 348, XP055622430, DOI: 10.1080/14728222.2017.1280467
TOSHIMA, K. ET AL.: "The First Total Synthesis of Concanamycin F (Concanolide A", J. ORG. CHEM., vol. 66, 2001, pages 1708 - 1715
TOYODA, T. ET AL.: "Effect of peroxisoma proliferator-activated receptor-a ligands in the interaction between adipocytes and macrophages in obese adipose tissue", OBESITY, vol. 16, 2008, pages 1199 - 1207
YOSHIMURA, T. ET AL.: "Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Full-length cDNA cloning, expression in mitogen-stimulated blood mononuclear leukocytes, and sequence similarity to mouse competence gene JE", FEBS LETT., vol. 244, 1989, pages 487 - 49321
ZAFRA-POLO, J. NAT. PROD., vol. 59, no. 10, 1996, pages 913 - 916
ZERNECKE, A.: "Chemokines in atherosclerosis an update", ARTHERIOSCLER. THROMB. VASE. BIOL., vol. 28, 2008, pages 1897 - 1908
ZERNECKE, A.WEBER, C.: "Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosis", CARDIOVASC. RES., vol. 86, 2010, pages 192 - 201
ZHAO YANG ET AL., JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 58, no. 8, 2010, pages 4844 - 4852
ZIESKE A. W. ET AL.: "Elevated serum c-reactive protein levels and advanced atherosclerosis in youth", ARTERIOSCLER. THROMB. VASE. BIOL., vol. 25, 2005, pages 1237 - 1243

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