WO2019119082A1 - Processo de obtenção do fungo phaeosphaeria sp. e seu caldo fermentado e seus usos - Google Patents

Processo de obtenção do fungo phaeosphaeria sp. e seu caldo fermentado e seus usos Download PDF

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WO2019119082A1
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fungus
phaeosphaeria
growth
biomass
fermentation
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PCT/BR2018/000076
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Juliana Dias MAIA
Ana Silvia PRATA
Michel Yudi Shinkai KANEMARU
Juliano Lemos BICAS
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Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention is in the field of application of agriculture, more specifically in the field of fungicidal activity of biocidal, repellent or pest attractive preparations or plant growth regulators, since it relates to a process of obtaining the microorganism Phaeosp aeria sp. derived from submerged fermentation for the application of the obtained biomass, the fermented broth or the aceto-ethylic extract as antifungal agent in the control of fungi responsible for the deterioration of food.
  • Fungicides used in agriculture can be grouped into two categories, depending on the stage of development of the target fungus: Contact Us and systemic.
  • the former are involved in prevention, preventing spore germination and mycelial growth, the main compounds of this group being copper and sulfur salts.
  • the latter such as benzimidazoles, are used to eliminate the fungus after the fungal mycelium has penetrated the plant tissue.
  • contact antifungals cause soil contamination and mutations in microbial communities, due to their broad spectrum of action.
  • cupric antifungal agents exhibit phytotoxic activity at temperatures above 34 ° C, and their uses are extremely limited in Europe.
  • Another major concern with the application of antifungal agents is the toxic effects on health, although at present most of the permitted compounds are considered of low to moderate toxicity: mammals.
  • inhibitory compounds are volatile (inhibition of fungal growth by volatiles is well known and reported), which makes the process complex and unfeasible, since it requires waiting for growth and volatiles production and they tend to dissipate in real situations of use (open environment).
  • fermented extract can be applied directly only by diluting it to a maximum of 10% (v / v) ?
  • more than one product can be obtained at the same time, for example 1 and 2 or 1 and 3.
  • the processes known and studied with the biocontrol agent are merely processes for accumulation of the compounds produced with subsequent mandatory extraction of the active compounds.
  • the applicability of the process proposed by the present invention is further enhanced because it reduces process steps due to the need for no extraction and purification processes using solvents, so it can be considered a natural and environmentally friendly form of fungus control.
  • the present invention relates to the process for obtaining the microorganism Phaeosphaeria sp. derived from submerged fermentation for application of the obtained biomass or its fermented broth as antifungal agent in the control of filamentous fungi responsible for the deterioration of food.
  • Said process comprises the steps of (a) culturing the strain Phaeosphaeria sp., Carried out at a temperature ranging from 15 to 27 ⁇ ° C, preferably 25 ⁇ ° C, at a relative humidity of 401 to 100%, (b) aseptically triturating 1: 100 ml of a culture fragment obtained was a liquid medium and (b) fermentation at a temperature ranging from 15 to 27 ⁇ ° C under stirring varies from 150 to 200 rpm in a suitable fermentation system between 24h to 120h, preferably 72h to 120h, rations preferably within 96h.
  • CFM minimal fungicide concentration tests of the acetoethyl extract obtained were carried out and for Colletotrichum nymphaea the CFM was 0.25 g.
  • Figure 1 depicts the antifungal activity (free growth area) around the colony of Phaeosphaeria sp. after the growth (7 days) of fungi, where (A) refers to Alternaria sp .; (B) A. niger ATCC394I; (C) A. niger ATCG4846; (D) Aspergillus sp .; (E) Canninghamel a binary; (F) Colletotrichum acutatum; (G) C. nyxnphaea; (H) F. oxysporum CCT7620 (D F. oxysporuin 152b; (J) M. perniciosa; and (K) Phyllosticta citricarpa.
  • A refers to Alternaria sp .
  • B A. niger ATCC394I
  • C A. niger ATCG4846
  • D Aspergillus sp .
  • E Canninghamel a
  • Figure 2 shows the radial growth of the fungus model C. acutatum after 7 days in different concentrations of broth supernatant fermented by Phaeosphaeria sp. (obtained after 96 hours fermentation) in the culture medium, i.e.
  • A n ICO; LL _! ;
  • B 25 mL.L " ⁇ ;
  • C 6.25 mL. L 1 ;
  • D 1.56 mL. L 1 ;
  • E 0.39 mL.Ir 1;
  • F 0.10 mL.L '; ;
  • G Control (without supernatant).
  • Figure 3 represents the results of the minimal fungicidal concentration (CFM) of the evaluation of the antifungal activity of the solvent extract of Phaeosphaeria sp., Where (A) refers to the concentrations;
  • Figure 4 depicts the effect of the treatment of strawberries with the fermented broth on inhibiting the growth of wild-type contaminating fungi, wherein A are supernatant treated fruits of the fermented broth diluted in water (10%, v / v), and B are the fruits treated with water
  • Figure 5 depicts the effect of the treatment of papaya with the fermented broth on the inhibition of growth of contaminated fungus of papaya inoculated thereto, and that A refers to the side treated with diluted fermented broth (10%), B refers to the interface of the treated (right) and control (left) sides, and C refers next to treated with water (control).
  • Figure 6 depicts the corrected growth area (growth area minus well area where the spore suspension was added) from the microorganism Phaeosphaeria sp. relative to the relative air age.
  • the present invention relates to the application of the biomass of the microorganism Phaeosphaeria sp. or the supernatant and the broth fermented by the same, with or without extraction by organic solvent, in the biocontrol of filamentous fungi of importance in the agroindustrial production.
  • said process of obtaining the fungus Phaeosphaeria sp. comprises the steps of: a) Cultivating the strain Phaeosphae ia sp. in solid medium for fungus cultivation;
  • step “a” the cultivation is conducted at temperature ranges from 15 to 27 ° C, preferably 25 N C at a relative humidity 40-1001, preferably 1001; on a solid medium selected from the group consisting of. consists of dextrose potato agar, Sabouraud dextrose agar, YM agar (yeast extract medium, malt extract and glucose) or another solid fungus culture medium for at least 5 days.
  • a solid medium selected from the group consisting of. consists of dextrose potato agar, Sabouraud dextrose agar, YM agar (yeast extract medium, malt extract and glucose) or another solid fungus culture medium for at least 5 days.
  • step "b" after growth for at least 5 days in one of the solid media cited, a 1 cm 2 fragment of the culture obtained in step “a” is aseptically ground for each 100 L liquid medium, in order to reducing the particle sizes, preferably using high shear homogenizer at 6000 at 24000 rpm / min.
  • Said liquid medium is selected from the group consisting of yeast extract, malt extract and glucose (YM), dextrose potato broth, Sabouraud dextrose, malt extract broth or other liquid medium, preferably YM (yeast extract medium , malt extract and glucose).
  • step "c" the fermentation takes place in a suitable fermentation system selected from the group consisting of Erlen Eyer type conical flasks (50, 125, 250, 500 L or other) or even in a bioreactor; at a temperature ranging from 15 to 27 ° C, the cultivation being ideal at 25 ° C and with agitation ranging from 150 : to 200 rpm, preferably 175 rpm.
  • a suitable fermentation system selected from the group consisting of Erlen Eyer type conical flasks (50, 125, 250, 500 L or other) or even in a bioreactor; at a temperature ranging from 15 to 27 ° C, the cultivation being ideal at 25 ° C and with agitation ranging from 150 : to 200 rpm, preferably 175 rpm.
  • the fungus grows and is of pellets, and there is maximum production of the inhibitory agents due to the parameters (temperature and humidity ) settled down.
  • said process comprises an additional step "d" to reduce the size of the pellets obtained and thus increase the surface area.
  • the size of the fungus pallets is reduced after separation of the supernatant by filtration, for fragments smaller than 1 mm by homogenization of the bicarbonate in saline medium, preferably NaCl 8 , 5 g . , followed by aseptic grinding of the cells in high blender homogenizer between 6000 / min at 24000 / min for 5 minutes.
  • saline medium preferably NaCl 8 , 5 g .
  • the present invention relates to the use of the biomass obtained according to the present invention. described in the control of several filamentous fungi that cause losses in agroindustrial production, in specific Alternaria sp. , Aspergillias sp. , Canninghamei 1a sp. Colletotrichum sp. , Fusariu.m sp. , Moniliophtoza sp. and Phyllostica sp.
  • the biomass obtained with or without supernatant separation is applied to the biocontrol of filamentous fungi of importance in the agroindustrial production, requiring the application of a viable cell fragment of Phaeosphaeria sp. to every 1 cm 2 of surface to be treated.
  • step "d" the formation of larger pellets allows the easy separation of the fermentation supernatant using single filter filtration processes (eg, qualitative cellulose filter of 11 pM porosity) after fermentation.
  • the fermented broth of Phaeosphaeria sp- obtained after fermentation according to the process described above is also applied to the biocontrol of filamentous fungi of importance in agroindustrial production.
  • the same must be obtained initially by separating the fungal biomass from the fermented broth by decantation, centrifugation or, preferably, by simple filter filtration (eg, qualitative cellulose filter with IImM porosity). After this separation, the cell-free fermented broth can be applied in fungal control at a dilution of up to 10% (v / v).
  • CFM Colletotrichum acutatum, and in Table 3.
  • CFM ranged from ug / L to C. nymphaea to Ig / L to Alternaria sp. and the . niger, these values are similar to the values used commercially, for example Resende (2014) evaluated the commercial antifungal Cercobin® (of the benzimidazole class) against the fungi Alternaria alternata, Alternaria solani, Mucoz hymenis, Venturia pirine, Aspergillus flaxnis, Botzytis cinerea and C.
  • qloeosporioides (later reclassified as Colletotrichum nymphaea), obtaining MIC values (minimum inhibitory concentration) of 0.5, at 1.0 g.Il 1 .
  • MIC values minimum inhibitory concentration
  • GIJLLNO M.L .
  • GARIBALDI A .
  • ROMANO M. L

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Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção do micro-organismo Phaeosphaeria sp. oriundo de fermentação submersa para aplicação da biomassa obtida ou seu caldo fermentado como agente antifúngico no controle de fungos filamentosos responsáveis pela deterioração de alimentos.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DO FUNGO PHAEOSPHAERZA SP. E SEU CALDO
FERMENTADO E SEUS USOS
Campo da Invenção:
L 001 ] A presente invenção se insere no campo de aplicação da agricultura, mais especi ficamente na área de atividade fungicida de preparações biocidas, repelentes ou atrativos de pestes ou reguladores do crescimento de plantas, uma vez que se refere a um processo de obtenção do micro- organismo Phaeosp aeria sp. oriundo de fermentação submersa para aplicação da biomassa obtida, do caldo fermentado ou do extrato aceto-etílico como agente antifúngico no controle de fungos responsáveis pela deterioração de alimentos.
Estado da Técnica:
[002] A contaminação fúngica é um dos principais problemas na produção de alimentos. Responsável por diversas doenças fitopatogênicas , também implica na deterioração e perdas pós-colhei ta, gerando 2.5-50% de redução na produção.
[003] Entre os fungos contaminantes comumente encontrados em alimentos destacam-se aqueles dos gêneros Âspercjillus, Fusariu e. Penicíllium. A maior preocupação com esses gêneros se refere ao fato de que diversas de suas espécies serem capazes de produzir mícotoxinas, metabolitos tóxicos ao ser humano. Além destes, outros gêneros se destacam co o importantes fungos na produção de alimentos: Alternaria , Col letotrichum, Moniliophthora e Phyl lostícta .
[004] Para reduzir os prejuízos decorrentes da contaminação fúngica no campo, a principal medida é o uso de antifúngicos . Os fungicidas utilizados na agricultura podem ser agrupados em duas categorias, ba.seando-se no estágio de desenvolvimento do fungo alvo: são os ant. ifúngicos de contato e os sistémicos. Os primeiros estão envolvidos na prevenção, impedindo a germinação dos esporos e o crescimento do micélio, sendo os principais compostos desse grupo os sais de cobre e enxofre. Já os últimos, como os benzimidazóis , são utilizados para eliminar o fungo após o micélio fúngico ter penetrado no tecido da planta.
[005] Todavia, os antifúngicos de contato causam contaminação do solo e muàanças nas comunidades microbianas, devido a seu amplo espectro de ação. Adicionalmenfce , os antifúngicos cúpricos apresentam atividade fitotóxicas em temperaturas acima de 34°C, tendo seus usos extremamente limitados na Europa. Outra grande preocupação com a aplicação de antifúncjicos são os efeitos tóxicos á saúde, apesar de atualmente a maior parte dos compostos permitidos serem considerados de baixa a moderada toxicidade: aos mamíferos.
[006] Além disso, há u crescente número de casos de resistência aos compostos utilizados, além do fato de quevários destes se em classificados como possíveis carcinogênicos e humanos.
[007] Assim, estudos para a descoberta de novos compostos coxa novos mecanismos de ação e que sejam maio seguros são de grande importância para arapliat o número de substâncias disponíveis para o uso comercial.
[008] Ao contrário dos fungicidas quimicos comerciais, o uso de um agente biológico representa uma forma mais simples e menos agressiva ao meio ambiente, além de contornar os crescentes casos de resistência aos antifúngícos convencionais .
[009] No estado da técnica, há alguns documentos que descrevera a utilização de compostos isolados a partir de um agente biológico.
[010] O documento JP7069966 e o artigo "Isclation, Structure, and Bíological Activity of Phaeofungin, a Cyclic Lípodepsipeptide froni a Phaeosphaería sp, Using the Genome- Wíde Candida albícans Fitness Test" (2012) descrevem a aplicação dos compostos isolados a partir de processos de purificação para aumentar a quantidade e pureza dos compostos durante a aplicação. No proposto pela presente invenção, ao contrário, pode ser utilizado o extrato fermentado sem nenhum processo de extração e purificação, apenas realizando uma diluição do fermentado. Além disso, na presente invenção há a possibilidade da aplicação do micro-organismo diretamente, diferindo completamente das tecnologias propostas por tornar o processo de obtenção do fungo mais simples.
[011] Por outro lado, no artigo "Endophytic Fungi from Plunis (Prunus domestica) and Their Antifungai Activity agaínst Monilinia fructícola" apesar da aplicação direta do micro-organismo, não é demostrado a atividade, concentração e método de aplicação do extrato de fermentação do processo fer entatívo para o controle de fungos, sendo apenas o processo de aplicação do fungo para produção de compostos voláteis para redução do crescimento icelial dos fungos alvos, ao contrário do demonstrado e comprovado pela presente invenção que apresenta atividade de gerar zonas de inibição sem nenhum crescimento fúngico ao redor do fungo, apresentando portanto maior efetividade no controle. Além disso, no documento citado é revelado a inibição do crescimento radial dos fungos, enquanto que na presente invenção há inibição completa do crescimento ao redor da colôma produtora ( Phaeosphaería sp.j. Adicionalmente, uo artigo citado, os compostos inibitórios são voláteis (a inibição do crescimento fúngico por voláteis é bem conhecido e relatado), o que torna o processo complexo e inviável, pois requer aguardar crescimento e produção dos voláteis e os mesmos tendem a se dissipar em situações reais de uso (ambiente aberto) .
[012] Desse modo, nenhum documento do estado da técnica descreve um processo de obtenção da biomassa do fungo Phaeospha&ría sp, oriunda de fermentação submersa sem a necessidade da adoção de métodos de extração, separação e purificação para a aplicação no controle dos fungos de importância agrcalimentar . Além disso, são obtidas no próprio processo da presente invenção:
- (1) células viáveis do fungo para aplicação direta do micro-organis o ;
(2) extrato fermentado podendo esse ser aplicado diretamente realizando apenas a diluição deste a um máximo de 10% (v/v) ? e
- (3) extrato concentrado pela extração com solvente orgânico .
[013] Ainda, pode ser obtido mais que um produto ao mesmo tempo, co o por exemplo 1 e 2 ou 1 e 3.
[014] Alé disso,, é importante ressaltar que a fermentação submersa é uma técnica amplamente empregada em laboratórios de roicrobiologia aplicada e de fermentações. Porém, o fungo Phaeosphaerxa sp. tem particularidades que impedem que um técnico da área possa reproduzir os resultados propostos. Por exemplo: normalmente uma fermentação submersa é efetuada partindo-se de uma suspensão de esporas. Mas o Phaeosphaeria sp . não esporula, portanto, a estratégia de utilizar células fragmentadas (fragmento de cultura em meio sólido, na concretização da presente invenção, sem, no entanto, restringir a esta configuração, realizada em placa de Petri, homogeneizado no meio de fermentação) proposta pela presente invenção, torna-se uma saída não óbvia para o problema. Adicionalmente, caso esta homogeneização não for feita adequadamente, podem haver a formação de grandes aglomerados de hifas, o que impede uma adequada fermentação e consequente produção dos compostos de interesse.
[015] Outra dificuldade técnica encontrada refere- se ao crescimento do Phaeosphaetía sp. em meio sólido, na concretização da presente invenção, sem, no entanto, restringir a esta configuração, realizada em Placa de Petri, (procedimento necessário para efetuar a fermentação submersa) . Foi notado que o crescimento não acontece se não· houver condições muito específicas ( ex . : umidade e temperatura controladas), tal como estabelecidas pela presente invenção. Tal fato impossibilita que um técnico da área reproduza os resultados sem todos os estudos desenvolvidos para chegar a presente invenção.
[016] Portanto, diferentemente, os processos conhecidos e estudados co o agente de biocontrole são meramente processos para acumulação dos compostos produzidos com posterior extração obrigatória dos compostos ativos. Além disso, comparatívamente , a aplicabilidade do processo proposto pela presente invenção é maior, pois reduz etapas de processos devido a não necessidade de processos de extração e purificação utilizando solventes, podendo assim, ser considerado uma forma natural e ambientalmente amigável de controle de fungos. Breve descrição dã invenção:
[017j A presente invenção refere-se a x processo cie obtenção do micro-organismo Phaeosphaeria sp. oriundo de fermentação submersa para aplicação da biomassa obtida ou seu caldo fermentado como agente antifúngico no controle de fungos filamentosos responsáveis pela deterioração de alimentos. 0 referido processo compree.nde as etapas de (a; realizar o cultivo da cepa Phaeosphaeria sp . , realizado 1 temperatura que varia de 15 a 27 °C, preferencialmente 25°C, em uma umidade relativa do ar de 401 a 100%, preferencialmente IOO%, em meio sólido para cultivo de fungos; (b) triturar assepticamente 1:100 cirv mL de um fragmento da cultura obtida era meio liquido; e (c aguardar fermentação em temperatura que varia entre 15 a 27 °c sob agitação que varia de 150 a 200 rpm em sistema de fermentação adequado entre 24h a 120h, preferencialmente 72b a 120h, raais preferencial ente 96 horas.
[018] Foram realizados testes de concentração fungicida mínima (CFM) do extrato aceto-etílí ca obtido e para o Colletotrichum nymphaea a CFM foi dé 0,25 g . L~ sendo o fungo raais sensível, enquanto os fungos Colletotrichum acutatum, Cunnínghamella bínaríeae e Fusariúm oxysporum obtiveram uma CFM de 0,50 g.L“^-. Portanto, os resultados aqui apresentados são muito promissores para o desenvolvimento da produção de um novo composto com atividades antifúngicas .
Breve d&scrição das figuras:
[019] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue. [020] A Figura 1 representa a atividade anti fúngica (área livre de crescimento) ao redor da colónia de Phaeosphaeria sp. após o crescimento (7 dias) dos fungos, em que (A) refere-se à Alternaria sp.; (B) A. niger ATCC394I; (C) A. niger ATCG4846; (D) Aspergillus sp.; (E) Canninghamel a binarias; (F) Colletotrichum acutatum; (G) C. nyxnphaea; (H) F. oxysporum CCT7620 (D F. oxysporuín 152b; (J) M. perniciosa ; e (K) Phyllosticta cítricarpa.
[021] A Figura 2 apresenta o crescimento radiai do fungo modelo C. acutatum após 7 dias em diferentes concentrações de sobrenadante do caldo fermentado por Phaeosphaeria sp. (obtido após 96h de fermentação) no meio de cultura, isto é: (A) ICO n;L.L_!; (B) 25 mL.L“{; (C) 6,25· mL . L 1 ; (D) 1,56 mL . L 1 ; (E) 0,39 mL.Ir1; (F) 0,10 mL.L‘;; (G) Controle (sem sobrenadante) .
[022] A Figura 3 representa os resultados de concentração fungicida minima ( CFM ) da avaliação da atividade antifúngica do extrato em solvente do Phaeosphaeria sp., em que (A) refere-se às concentrações;
( B ) A, niger; (C) Cu ninghamela hinariae; (D) F. oxysporum CCT7620; (E) Alternaria sp . ; ( F) Colletotrichu nympbaea iG) Colletotrichum acutatum.
[023] A Figura 4 representa o efeito do tratamento de morangos com o caldo fermentado na inibição do crescimento de fungos contaminantes selvagens, em que A são as frutas tratadas com sobrenadaste do caldo fermentado diluído em água (10%, v/v), e B são as frutas tratadas com água
(controle) .
[024] A Figura 5 representa o efeito do tratamento de mamões com o caldo fermentado na inibição do crescimento de fungo contaminante de mamão inoculado ao mesmo, e que A refere-se ao lado tratado com caldo fermentado diluído í 10% ) , B refere-se à interface dos lados tratados (direita) e controle (esquerda), e C refere-se ao lado tratado com água ( controle) .
[025] A Figura 6 representa a área de crescimento corrigida (área de crescimento menos área do poço onde a suspensão de esporos foi adicionada) do micro-organismo Phaeosphaeria sp. em relação a u idade relativa do ar.
Figure imgf000010_0001
[026] A presente invenção refere-se à aplicação da biomassa do micro-organismo Phaeosphaeria sp. ou o sobrenadam e do caldo fermentado pelo mesmo, com ou sem extração por solvente orgânico, no biocontrole de fungos filamentosos de importância na produção agroindustrial .
[027] Para tal, primeiramente , é necessário a realização de um processo de obtenção do fungo Phaeosphaeria s . empregando a fermentação submersa, processo este considerado essencial para se atingir as caracteristí cas diferenciadas apresentadas pela presente invenção.
[028] Nesse sentido, o referido processo de obtenção do fungo Phaeosphaeria sp. compreende as etapas de: a) Realizar cultivo da cepa Phaeosphae ia sp . em meio sólido para cultivo de fungos;
b) Triturar assepcicamente 1:100 cmA/mL de um fragmento da cultura obtida em meio líquido; e
c) Aguardar fermentação em temperatura que vária entre 15 a 27 °c sob agitação que varia de 150 a 200 rpm em sistema de fermentação adequado entre 24h a 120b, preferencialmente 72 a 120 horas, mais preferencialmente 96 horas .
[029] Na etapa "a" o cultivo é realizado à temperatura que varia de 15 a 27 °c, preferencialmente 25 nC, em uma umidade relativa do ar de 40 a 1001, preferencialmente 1001; em meio sólido selecionado do grupo que. consiste em ágar batata dextrose, ágar Sabouraud dextrose, ágar YM (meio extrato de levedura, extrato de malte e glicose) ou outro meio sólido para cultivo de fungos, por peio menos 5 dias.
[030] Na etapa "b", após crescimento por pelo menos 5 dias em um dos meios sólidos citados, um fragmento de 1 cm2 da cultura obtida na etapa "a" é triturado assepticamente para cada 100 L meio líquido, de forma a reduzir os tamanhos das partículas, preferencialmente utilizando homogeneizador de alto cisaiharaentc a 6000 a 24000 rpm/min. O referido meio liquido é selecionado de grupo que consiste em, mero extrato de levedura, extrato de malte e glicose (YM) , caldo batata dextrose, Sabouraud dextrose, caldo extrato de malte ou outro meio líquido, preferencialmente o YM (meio extrato de levedura, extrato de malte e glicose) .
[03.1] Na etapa "c", a fermentação ocorre em sistema de fermentação adequado selecionado do grupo que consiste em frascos cónicos tipo Erlen eyer (50, 125, 250, 500 .L ou outro) ou mesmo em biorreator; em temperatura variando entre 15 a 27 °C, sendo ideal o cultivo a 25 °C e com agitação que varia de 150: a 200 rpm, preferencialmente 175 rpm.
[032] Assim, ao decorrer da fermentação, ocorre contínuo crescimento do fungo e aumento da produção de compostos antífúngicos até que, entre 72 e 120 horas, preferencíalmente por 96 horas, quando tanto a quantidade de bioraassa quanto atividade antifúngica atingem valores máximos (8 g/L de bíomassa seca e 98-100% de inibição quando testado em diluição 1/10 de sobrenadante em meio sólido) .
[033] Portanto, entre 24 a 120 horas de cultivo ern fermentação submersa, preferencialmente de 72 a 120h, maia preferencíalmente 96h, o fungo cresce e for a de pellets, e há a máxima produção dos agentes inibitórios devido aos parâmetros (temperatura e umidade) estabelecidos.
[034] Alternativameftte , o referido processo compreende uma etapa "d" adicional para reduzir o tamanho dos pellets obtidos e assim aumentar a área superficial.
[035] Desse modo, na etapa adicional "d" realiza- se a redução do tamanho dos pallets do fungo, após a separação do sobrenadante por filtração, para fragmentos menores que 1 mm através da homogeneização da bíomassa em meio salino, preferencialmente NaCl 8,5g.lr;, seguido de trituração asséptica das células em homogenei zador de alto císalha ento entre 6000/min a 24000/mín por 5 minutos.
[036] Vale ressaltar que a trituração da bíomassa não pode ser efetuada em qualquer meio: o uso de água, por exemplo, romperia as células (estresse os ótico) . Por este motivo, a etapa de ',vd" é efetuada com a biomassa adicionada em volume de solução salina.
[037] Portanto, através do processo aqui descrito obtém-se células viáveis (biomassa) do fungo Pha eo.spha er. a sp. juntamente com seu caldo fermentado para aplicação na inibição do crescimento fúngico durante a produção de alimentos .
[038] Desse mo o, adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso da biomassa obtida conforme aqui descrito no controle de diversos fungos filamentosos que causam prejuízos na produção agroindustrial, em especifico Alternaria sp. , Aspergilias sp. , Canninghamei 1a sp. Colletotrichum sp. , Fusariu.m sp. , Moniliophtoza sp. e Phyllostica sp.
[039] Para tal, aplica-se a biomassa obtida com ou sem separação do sobrenadante, no biocontrole de fungos filamentosos de importância na produção agroindustrial, sendo necessária a aplicação de um fragmento celular viável de Phaeosphaeria sp. a cada 1 cm2 de superfície a ser tratada .
[040] Por outro lado, caso a intenção seja utilizar o sobrenadante da fermentação díretamente na Inibição de fungos ou para extração por solvente orgânico, seu crescimento pode dispensar a homogeneização (etapa "d"), dado que a formação de pellets maiores permite a fácil separação do sobrenadante de fermentação utilizando processos de filtração em filtros simples (ex: filtro de celulose qualitativo de porosidade 11 pM) após a fermentação.
[041] Para extração por solvente orgânico, primeiramente, a biomassa fúngica obtida por fermen ação submersa é separada por filtração simples. O sobrenadante resultante é então submetido à extração usando solventes orgânicos, preferencial ente acetato de etila.
[042] Adícional ente, o caldo fermentado de Phaeosphaeria sp-, obtido após fermentação conforme processo anterior ente descrito é também aplicado no biocontrole de fungos filamentosos de importância na produção agroindustrial. Para tal, o mesmo deve ser ínicialmente obtido separando-se a biomassa fúngica do caldo fermentado por decantação, centrifugação ou, preferencialmente, por filtração com filtro simples (ex. : filtro qualitativo cie celulose com porosidade de IImM) . Após esta separação, o caldo fermentado livre de células poderá ser aplicado no controle dos fungos em uma diluição de até 10% (v/v) .
[043] Para avaliar o potencial da biomassa e seu caldo fermentado da presente invenção no biocontrole cie fungos filamentosos, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.
Testes Realizados
[044] A aplicação do Phaeosphaería sp. diretamente contra os fungos de relevância agroalimentar foi confirmada a partir da aplicação de um fragmento circular (5 mm) adicionado em um furo de igual tamanho no centro de uma placa de Pet.ti contendo ágar YM, previa ente inoculada na superfície com uma suspensão de esporos dos fungos a serem controlados. Após o crescimento (7 dias) dos fungos foi realizada a medição da área livre de crescimento ao redor da colónia de Phaeosphaería sp. utilizando-se as fotografias das placas no software Imag J conforme apresentado em Figura 1, em que (A) refere-se a Alternaria sp.; (B) Aspergillus niger ATCC3941; (C) A. nlger ATCC4846; (D) Aspergillus sp.; (E) Cunninghamela binariae; (F) Colletotrichum acutatum; (G) C, nymphaea ; ( H ) Fusarium oxysporum CCT7620; (I) F. oxysporum 152b; (J) ftf. perniciosa; (K.) Phyllosticta citricarpa . Os diâmetros de inibição do controle sobre os fungos alvos estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 - Zona de inibição do Phaeosphaería sp. contra diferentes fungos avaliados.
Figure imgf000015_0001
(ND) Atividade não detectada; * Média de 9 placas com 4 medições por placa.
[045] Para avaliação da atividade antifúngica do sobrenadante de fermentação do Phaeosphaeria sp . utilizando o sobrenadante de 96 horas de fermentação foi realizada a incorporação de diferentes concentrações (10Q raL/L a 0,10 mL/L) de sobrenadante em meio ágar batata dextrose que, após solidificado, foi inoculado com o fungo Colletrotrichum acutatum TQQ58A por picada no centro da placa. Após o crescimento do C. acutatum ((7 dias) ffoi realizada a medida cie crescimento radial de cada placa utilizando-se as fotografias das placas no software ImageJ conforme Figura 2, em que (A) refere-se 100 mL.Ir!; (B) 25 mL.L !; (C) 6,25 mL . L (D) 1,56 mL.Lr;; (E; 0,39 mL.L“!; ( F) 0,10 ml. Ir1; (G5 Controle (sem sobrenadante } . As porcentagens de redução de crescimento radial estão apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Redução do crescimento radial do
Figure imgf000016_0001
média de 3 repetições independente realizadas em triplicat
[046] Para avaliação da atividade anti fúngica do extrato em solvente do Phaeosphaeria sp. utilizou-se o extrato obtido por extração do caldo fermentado coro acetato de etila seguida da remoção do solvente orgânico . O extrato foi avaliado em diferentes concentrações (2 mg.mlr; a 0,00195 mg.mL 1}, foi colocado em contato com 0,4.10'= a 5.10 esporos/mL dos fungos alvos, isto é Alternaria s , , A. niger, C, acutatvm, C. bínarieae, C. numphaaa e F. oxysporum. Após cultivo a 30 °C durante 3 dias, frações deste meio foram transferidas para placas de Petri contendo ágar batata dextrose, que foram então mantidas a 25°C durante 2 dias para avaliar qual seria1 a CFM (concentração fungicida mínima) . Os resultados de CFM podem ser obser ados na Figura 3, em que (A) refere-se às concentrações; (B; A. níger;
Cunnin.çhamaia L·J n rx o; (D) F. cx s orum CCTlòiO.
Alternaria sp. ; (F) Colletotrichum nymphaaa e l· c ΐ
Colletotrichum acutatum, e na Tabela 3. A CFM variou de u g/L para C. nymphaea até Ig/L para Alternaria sp. e A . niger, esses valores são similares aos valores utilizados comercialmente , a exemplo de Resende {2014} avaliou o antifúngico comercial Cercobin© (da classe dos benzimidazóis ) contra os fungos Alternaria alternata, Alternaria solani , Mucoz híemalis, Venturia pirína, Aspergíl lus flaxnis, Botzytis cinerea e C. qloeosporíoides (pósteriormente reclassifiçado como Colletotrichum nymphaea) , obtendo valores de CIM (concentração inibitória mínima) de 0,5, a 1,0 g.Il1. Em outro estudo com diferentes fungicidas para controlar C. gloeosporioides em morango, Gulliano, Garibaldi e Romano {1985} testaram diversos 13 fungicidas, cinco apresentavam CIM maior que 1 g.L~;!, seis entre 0,1 a 1 g.L-1, e apenas 2 com CIM menores que 10 mg. Lr
Tabela 3 - Concentração fungicida mínima (CFM) do extrato aceto etílico de Phaeosphaería sp. contra fungos alvo .
Figure imgf000017_0001
[04/] Tendo em vista que os valores obtidos de CIM são menores que os valores de CFM observa-se que os valores obtidos são comparáveis ao fungicida comercial.
Aplicação do caldo f rmentado na inibição do crescimento fúngico em frutas:
[048] O caldo fermentado de Phaeosphaería sp. diluido (10% em água), obtido após fermentação por 96h a 25°C e 175 rpm, quando aplicado em mamão e morango, demonstrou uma redução ric crescimento fúngico (Figuras 4 e
[049] No caso dos morangos, o procedimento foi efetuado imergindo cinco frutas em caldo fermentado diluído (10%) por 3 minutos e, após a secagem do liquido em temperatura ambiente, os morangos foram mantidos em estufa bacteriológica a 25°C durante 4 dias em frascos assépticos para observação do crescimento de contaminação selvagem (Figura 4A} . Um experimento controle foi efetuado da mesma forma, apenas substituindo-se o caldo fermentado diluído por água destilada (Figura 4B) .
[050] Como pode se observar na Figura 4 há uma redução visível no crescimento de fungos contaminantes selvagens nos morangos tratados com a solução, quando comparados aos morangos controle. É importante destacar que a contaminação foi acelerada ao manter as frutas a 25 C. Caso estas estivessem sido mantidos sob refrigeração, o tempo para o aparecimento dos contaminantes seria maior.
[051] No caso do mamão, a avaliação do potencial de inibição da contaminação envolveu inícialmente a inoculação de um fungo contamírtante de mamão (I mL de uma solução de esporos padronizados na escala de. McFarland 0,5) em um único fruto. Parte deste fruto foi então tratado com IGmL de caldo fermentado de Phaeosphaeria sp diluído (10%) ou com lOmL água (controle) . Ma sequência, os frutos foram mantidos em estufa bacteriológica a 25 °C por 7 dias. A Figura 5 evidencia uma redução significativa no crescimento/aparecimento de lesões fúngicas na metade tratada com caldo fermentado (A) , quando comparado ao lado controle (C) , onde é visível o crescimento fúngico sobre uma porção considerável da fruta.
Umídade mínima
[052] Visando determinar a umidade ínima para o micro-organismo Phaeosphaeria sp, este foi colocado para crescer em cubas contendo diferentes soluções saturadas (KOH, NaCl, (N¾ ) ÇSOÍ , KN0; e água destilada), de forma a se obter ambientes com diferentes umidades relativas do ar, aferida com termo-higrômetro. Após 96h de crescimento a 25°C, mediu-se a área de crescimento do micro-organismo e calculou- se a área corrigida (área de crescimento menos área do poço onde a suspensão de esporos foi adicionada) . Os resultados mostrados na Figura 6 demonstram que a umídade relativa do ar mínima para um crescimento satisfatório é de 40%, pois para este micro-organismo, considera-se que uma área abaixo de 30mm é um crescimento insatisfatório. Assim, quão maior for esta umidade, melhor será o crescimento. Portanto, a umidade do ar considerada ideai seria o mais próximo possível de 100%.
[053] Portanto, diante dos expostos, os resultados aqui apresentados são muito promissores para o desenvolvimento da produção de um novo composto com anti fúngicas, algo potencialmente interessante para a indústria agroalimentar . [0541 Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.
Figure imgf000020_0001
PAULA SIMIQUELI. PRODUÇÃO
CONTÍNUA DE SURFACT.XNA UTILIZANDO MANXPUEIRA COMO SUBSTRATO E ESTUDO DE SUA APLICAÇÃO EM CONJUNTO COM ÓLEOS ESSENCIAIS. 2014. 124 p. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos)
Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, 2G14.
[056] GIJLL1NO, M. L.; GARIBALDI, A.; ROMANO, M. L,
Identification and Response to Eungicides of Colletotrichum gloeosporioides , Incitant of Stra berry Black Rot in Italy. Plant Disease, v. 69, n. 7, p. 603-609, 1985.

Claims

BEIVINDXCAÇOES
1. Processo de obtenção do fungo Phaeosphaeria sp . e seu caldo fermentado caracterizado pelo fato de empregar fermentação submersa e compreender as etapas de:
a) Realizar cultivo da cepa Phaeosphaeria sp. em meio sólido para cultivo de fungos;
b) Triturar assepticamente 1:100 cirn/mL de uni fragmento da cultura obtida em meio liquido; e
c) Aguardar fermentação em temperatura que varia entre 15 a 27 °C sob agitação que varia de 150 a 200 rpm em sistema de fermentação adequado por pelo menos 24 horas.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, pelo fato de, na etapa "a", o cultivo ser
Figure imgf000021_0001
realizado à temperatura que varia de 15: a 27 °C, preferencialmente 25°C, uma umidade relativa do ar de 40% a 100%, preferencialmente 100%, em eio sólido selecionado do grupo que consiste em ágar batata dextrose, ágar Sabouraud dextrose, ágar YM ou outro meio sólido para cultivo de fungos, por pelo menos 5 dias.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, pelo fato de, na etapa "b", o trituramento se:
Figure imgf000021_0002
preferencialmente utilizando um homogeneizador de alto cisalhamento a 6000 a 24000 rpm/ in, em que o referido meio liquido é selecionado do grupo que consiste em extrato do levedura, extrato de malte e glicose (YM) , caldo batata dextrose, Sabouraud dextrose, caldo extrato de malte ou outro meio liquido, preferencia.lm.ente o YM.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caraeterizado pelo fato de, na etapa "c", a fermentação ocorrer em sistema de fermentação adequado selecionado do grupo que consiste: era frascos cónicos tipo Srlenmeyer de 50,· 125, 2.50, 500 mL ou outro; ou era biorreator; em que a temperatura varia entre 15 a 27 °C, preferencialraente 25 ÔC, com agitação que varia de 150 a 200 rpm, preferencialraente 175 rpm.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de·, na etapa "c", a fermentação ocorrer de forma contínua entre 24b a 12Õh, preferencialmente 96 horas até a quando a quantidade de biomassa na forma de pellets e a atividade antifúngiea atingir valores máximos (8 g/L de biomassa seca e 98-100% de inibição) .
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, alternativamente, compreender uma etapa "d" adicional, era que se realiza a redução do tamanho dos pallets do fungo para fragmentos menores que 1 mm através da homogeneização dst biomassa era meio salino, preferencialmente NaCl 8,5g.Ir:i, seguido de trituração asséptica das células em homogeneizador de alto eisalhamento por pelo menos 5 minutos, entre a 6000 a 24000 rpm/min.
7. Uso da biomassa do fungo Phaeosphaería sp. caracterizado pelo fato de a. biomassa ser obtida conforme processo definido em qualquer uma. das reivindicações 1 a 6; e ser no preparo de uma composição para inibir o crescimento de fungos filamentosos.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a inibição do crescimento fúngico ser preferencialmente em alimentos.
9. Uso, de acordo corri a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de os referidos fungos serem preferencialraente selecionados do grupo que consistem era AI ternaria SP · r Aspergi!lus sp. , Cunn inghamei 1a sr .
Colletotríchum sp . , Fusarium sp., Monilicphtora sp. e Phyl 1oã tíca sp .
10. Uso, de acordo eora a reivindicação 7 , caracterizado pelo fato de ser cora. oti sem extração por solvente orgânico.
11. Uso, de acordo com a reivindicação
Figure imgf000023_0001
caractariaado pelo fato de a Moinassa fúngica ser filtrada em filtro simples, preferencialmente filtro de celulose qualitativo de porosidade 11 pM, em que a concentração de aplicação é de 1 fragmento celular viável de phaeosphaeria sp. a cada 1 cm2 de superfície a ser tratada.
12, Uso do caldo fermentado de Phaeosphaeria sp. caracterizado pelo fato de o caldo fermentado ser obtido conforme processo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e ser no preparo de uma composição para inibir o crescimento de fungos filamentosos.
13, Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a inibição do crescimento fúngico ser pxeferencialmente em alimentos.
14, Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de os referidos fungos serem preferencialmente selecionados do grupo que consistem em Alternaria sp., Aspergillus sp., Cunninghamella sp. Colletotríchum sp,, Fusaríum sp. , Moniliophtora sp. e Phyl los tica sp.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser livre de células da biomassa fúngica por decantação, centrifugação ou, preferencialmente , filtração com filtro 0,30 mih.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado elo fato de ser aplicado no controle dos fungos eit uma diluição de até 101 (v/v) .
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