WO2019112391A1 - 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법 - Google Patents

3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법 Download PDF

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WO2019112391A1
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WO
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culture
cell
culture container
dimensional
dimensional cell
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PCT/KR2018/015569
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이동목
박현숙
이순례
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한국생산기술연구원
(주)세포바이오
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to an insertion type culture container for a three-dimensional cell culture, a kit and a three-dimensional cell co-culture method using the same, and more particularly, The present invention relates to an insertion type culture container, kit and a three-dimensional cell culture method for the three-dimensional cell culture structure, which can smoothly supply the air required for the three-dimensional cell culture structure, will be.
  • Cell culture is one of the most fundamental research methods in the field of biotechnology, and is widely used not only for the study of living organisms but also for the study of human diseases. Although more than 40 years have passed since the development and establishment of cell culture methods for eukaryotic cells, the most commonly used methods to date for adherent cell growth are polystyrene, poly Dimensional surface consisting of a substrate made of a synthetic polymer resin such as polypropylene, polyethylene, polycarbonate (PC) or glass.
  • a synthetic polymer resin such as polypropylene, polyethylene, polycarbonate (PC) or glass.
  • the two-dimensional cell culture method which is a method of culturing a single cell
  • the two-dimensional and three-dimensional cell cultures show general morphological differences, and the expression of the receptor, gene transcription, cell migration and apoptosis, which occur through conventional two-dimensional cell culture, Since the complex life phenomenon differs greatly from the phenomenon occurring in the actual tissue environment, the two-dimensional cell culture method has a problem that it can not accurately reflect the physiological environment of the living body in which the cells grow on the three-dimensional plane.
  • the present invention has been made keeping in mind the above problems occurring in the prior art, and it is an object of the present invention to provide a three-dimensional cell culturing structure in which cells are cultured at a position spaced apart from a bottom surface of a culture container, A kit, and a method for three-dimensional cell co-culture using the same.
  • a supporting structure for separately supporting a three-dimensional structure on a culture container, it is intended to facilitate insertion, acquisition and removal of the three-dimensional structure.
  • the culture container according to the present invention is of an insertion type, and is easy to insert, acquire and remove the three-dimensional structure, and can continue to use the existing culture plate as it is, .
  • the cell culture kit comprising the insertable culture container according to the present invention can optimally maintain two or more cells co-cultured by air circulation and smooth supply of nutrients in the culture medium due to the support structure optimized for the three-dimensional culture .
  • the three-dimensional cell culture method according to the present invention can rapidly and variously regulate the growth of cells, and the three-dimensional culture differentiated cells can be effectively applied to drug screening and toxicity test by applying to an animal replacement test.
  • the present invention also aims to provide a three-dimensional cell culture and differentiation or tissue culture container for restoring damaged human tissue function.
  • an insertion type culture container for three-dimensional cell culture comprising: a sidewall having a cylindrical shape with upper and lower openings; At least one hook portion protruding outward from the upper side of the side wall; And at least one support portion protruding inward from a lower side of the side wall.
  • the support may be located below the center of the sidewall.
  • the at least one support portion may be disposed at equal intervals.
  • the upper side of the side surface may be a cylindrical shape having a larger section than the lower side.
  • the diameter of the upper portion of the sidewall and the diameter of the lower portion of the sidewall may be 3: 1 to 1.2: 1.
  • the distance from the side wall to the end of the support portion may be 15 to 30% of the diameter of the upper portion.
  • an insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture according to the present invention.
  • the insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture comprises a sidewall having a cylindrical shape and open top and bottom; At least one hook portion protruding outward from the upper side of the side wall; And a plate into which the culture container is inserted, the kit comprising: at least one support for supporting at least one support portion protruding inward from a lower side of the side wall;
  • the plate comprising: at least one well recessed in one direction; And a connection portion connecting the wells,
  • the insertion type culture container is insertable into the well of the plate, and the hook portion of the culture container spans the connection portion of the plate, and the bottom surface of the well and the lower portion of the culture container are separated from each other.
  • the distance between the bottom surface of the well and the lower portion of the culture container may be 10 to 40% of the depth of the well.
  • the method for co-culturing three-dimensional cells includes: a side wall having upper and lower openings as a cylindrical shape; At least one hook portion protruding outward from the upper side of the side wall; And a plate into which the culture container is inserted, the kit comprising: at least one support for supporting at least one support portion protruding inward from a lower side of the side wall;
  • the plate comprising: at least one well recessed in one direction; And a connecting portion connecting between the wells, wherein the insertable culture container is insertable into the well of the plate, the hook portion of the culture container spans the connection portion of the plate, and the bottom surface of the well and the culture The bottom of the container being spaced apart;
  • An inoculation step of inoculating the first cells into the wells of the plate An inoculation step of inoculating the first cells into the wells of the plate
  • cells are cultured at a position apart from the bottom surface of the culture container, There is an advantage that the oxygen supply necessary for the fuel cell is smooth.
  • the three-dimensional cell culture method according to the present invention is capable of rapid cell growth and various size control, and is more effective for drug screening, drug efficacy and toxicity test by a biomimetic model or an animal replacement test method.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an insertion type culture container for three-dimensional cell culture of the present invention
  • Fig. 2 is a cross-sectional view showing an insertion type culture container for three-dimensional cell culture of the present invention
  • FIG. 3 is a plan view showing an insertion type culture container for three-dimensional cell culture of the present invention
  • FIG. 4 is a perspective view showing a cell culture plate of an insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture of the present invention
  • FIG. 5 is a perspective view showing a state in which an insertion type culture container is inserted on a plate in an insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture of the present invention
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a state in which an insertion type culture container is inserted on a plate in an insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture of the present invention
  • Fig. 7 is a flow chart showing sequentially the three-dimensional cell co-culturing method of the present invention
  • FIG. 8 is a graph showing experimental results of three-dimensional cell culture with an insertable culture container kit for three-dimensional cell culture of the present invention
  • an insertion type culture container 100 for three-dimensional cell culture of the present invention may include an upper portion 10, a lower portion 11, a side wall 12, and a support portion 13 have.
  • the upper portion 10 refers to an upper portion that is opened for the insertion of the three-dimensional structure, and it can form a columnar basic structure opened upward / downward together with the lower portion 11 and the side walls 12.
  • the lower part 11 is formed in an open form so as to co-culture with a culture solution and xenogeneic cells.
  • the diameter of the upper portion 10 and the diameter of the lower portion 11 may be 3: 1 to 1.2: 1, preferably 2: 1 to 1.5: 1, more preferably 1.8: 1 to 1.6 : 1 is effective.
  • the inclination in this range facilitates the insertion and removal of the three-dimensional structure from above, while securing the structural bonding stability with the well, while maximizing the interaction between the culture solution from the bottom and the xenogeneic cells .
  • the ratio is more than 3: 1, the efficiency of air circulation and supply from the bottom and two or more kinds of cell co-cultivation may be remarkably decreased.
  • the ratio is less than 1.2: 1, The stability of the structural bonding with the lower well may be deteriorated.
  • the side wall 12 extends from the upper portion 10 to the lower portion 11 and protects the three-dimensional structure and forms a base surface on which the support portion 13 is formed.
  • the support portion 13 is formed protruding inward from the lower side of the side wall 12 and the number of the support portions 13 is preferably 2 to 5, more preferably 3 to 4, most preferably Three, it is effective. In the case of less than 2 cells, the three-dimensional cell structure is virtually impossible to support. If it exceeds 5 cells, the connection space with the actual lower well is excessively larger than the open space of the lower cell 12 due to the support part 13 There is a problem that the efficiency of air circulation and supply, two or more types of cell co-cultivation and the like are remarkably lowered.
  • the at least one support portion is arranged at equal intervals.
  • the support portion is located below the center portion of the side wall.
  • the support portion 13 is spaced from the upper portion 10 and is preferably located at a height of 0 to 40% of the side wall 12 from the lower opening portion 11, more preferably between 5 and 25% %, And most preferably at a height of 5 to 10%. Dimensional cell structure placed on the supporting part 13 and other cells contained in the well are difficult to co-cultivate.
  • the distance from the side wall 12 to the end of the support portion 13 is preferably 15 to 30%, more preferably 20 to 25%, and most preferably 22 to 23% % Is effective. If it is less than 15%, it is difficult to stably support the three-dimensional cell structure. If it exceeds 30%, the separation effect from the lower part 11 of the support part 13 is deteriorated. That is, And the like.
  • the support portion 13 may extend to the lower portion 11. Since the support portion 13 is formed along the side wall 12 from the lower portion 11, the injection portion can be easily integrally formed, which simplifies the manufacturing process and increases the economical efficiency. In addition, since the support portion 13 is formed in a columnar shape along the side wall 12, it has higher stability and durability.
  • the hooking portion 14 may protrude outward from the upper side of the side wall 12.
  • the upper portion 10, the lower portion 11, the side wall 12, the support portion 13 and the hook portion 14 may be formed of a material such as polystyrene (PS), polypropylene (PP), polyethylene (PE), polycarbonate Glass, or the like.
  • PS polystyrene
  • PP polypropylene
  • PE polyethylene
  • polycarbonate Glass or the like.
  • the side wall 12 and the support portion 13 are made of the same material, which is suitable for durability and easy-to-inject side walls.
  • the insertion type culture container kit for three-dimensional cell culture of the present invention comprises an insertion type culture container 100 for three-dimensional cell culture and a cell culture plate 200, A plate 200 and an insertion type culture container 100.
  • the plate 200 includes at least one well 20 recessed in one direction; And a connection part 21 connecting between the wells 20.
  • the insertable culture container 100 can be inserted into the well 20 of the plate 200.
  • the hooking part 14 is provided on the connection part 21 to support the insertion type culture container 100.
  • the bottom surface of the well 20 and the bottom open end 11 are spaced apart and the distance between the bottom surface of the well 20 and the bottom open end 11 is between 10 and 40% , More preferably 15 to 25%, and most preferably 15 to 20%. If it is less than 10%, it is difficult to smoothly circulate and supply air to cells in the lower part. If it exceeds 40%, the three-dimensional cell structure put on the support part 13 and other cells There is a problem that it is difficult to co-culture the cells.
  • the number of wells 20 formed on the plate 200 is not limited and may be configured to have various numbers of wells such as 16 wells, 96 wells.
  • the three-dimensional cell co-culturing method of the present invention comprises preparing (S20); Inoculation step S21; Exchange step S22; An inserting step S23 and a co-culturing step S24. This is a method by which the first cell and the second cell can be effectively co-cultured using the inserted culture container structure for the three-dimensional cell culture of the present invention.
  • the preparation step S20 is a step of preparing a three-dimensional cell culture kit composed of an insertable culture container according to the present invention and a plate into which the culture container is inserted.
  • Inoculation step S21 is a step of inoculating the first cells into the wells. That is, the first cells and the culture liquid can be inoculated into the wells.
  • the first cell may be any cell capable of co-culturing with the second cell, but may be an adherent cell, and may be a mesenchymal stem cell, a mesenchymal stem cell, a fat precursor cell, a smooth muscle cell (Smooth Muscle Cell, SMC) Or a macrophage.
  • a mesenchymal stem cell a mesenchymal stem cell
  • a mesenchymal stem cell a fat precursor cell
  • a smooth muscle cell Smooth Muscle Cell, SMC
  • macrophage a macrophage.
  • the exchange step S22 is a step of culturing the first cells, removing the supernatant, and at least partially exchanging the culture liquid.
  • the co-culture efficiency can be increased by removing the supernatant resulting from the first cell culture in the culture medium in the well and replacing part or all of the culture medium.
  • the inserting step S23 is a step of inserting the insertable culture container into the well of the plate.
  • the co-culturing step (S24) is a step of co-culturing the three-dimensional structure inoculated with the second cells on the supporter of the culture container.
  • the three-dimensional structure is preferably in the form of a bead or a support.
  • the second cell may be a culturable eukaryotic cell, and more particularly, an epithelial cell, a fibroblast, an osteoblast, a cartilage cell, a hepatocyte, a umbilical cord cell, a umbilical cord mesenchymal stem cell (UCMSC ), Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC), or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC).
  • an epithelial cell a fibroblast, an osteoblast, a cartilage cell, a hepatocyte, a umbilical cord cell, a umbilical cord mesenchymal stem cell (UCMSC ), Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC), or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC).
  • the replacing step S24 is a step of replacing the culture solution at intervals of 1 to 5 days after the co-culture step (S24). More preferably, it is effective to replace it every two to three days. This is to supply the necessary nutrients to the cell culture and to remove the cell-viability inhibitor that is generated during the cultivation, so that the cells or tissues are continuously grown.
  • a culture container is manufactured by using a 3D printing technique that forms a layer by stacking one layer by using a solid freeform fabrication (SFF) method using rapid prototyping (RP) equipment, Was performed using an electron beam accelerator.
  • SFF solid freeform fabrication
  • RP rapid prototyping
  • 3T3-L1 lipocal precursor cells (2.45x10 6 cells / 5mL / Tube), adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC)
  • the frozen first cells were thawed in a constant temperature water bath at 37 ° C and transferred to a 15 ml tube.
  • the cells were then added with a basic medium (DMEM + 1% antibiotics) to obtain 1,500
  • the supernatant was removed by centrifugation for 5 min at RPM and the supernatant was added again.
  • the above procedure was repeated to completely remove the frozen storage component.
  • the cells were then transferred to a 100 mm culture dish with DMEM + 1% antibiotics + 10%
  • the cells were inoculated and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. After 4 to 5 days, the cells were sufficiently proliferated.
  • 0.05% trypsin-EDTA was added thereto to inoculate cells per well in the culture vessel at a concentration of 1 ⁇ 10 3 .
  • the second cell was adipose-derived mesenchymal stem cell (ADMSC), and the 3-dimensional structure inoculated with the second cell was prepared in bead form.
  • ADMSC adipose-derived mesenchymal stem cell
  • the beads include a melting step in which a culture solution, alginate and gelatin are put into a tube and melted at 65 ⁇ ; The temperature of the tube was lowered to 37 DEG C, the second cell (2.45x10 < 6 > cells / 5mL / Tube) was added to the tube and stirred at 500RPM for 2 minutes; And a manufacturing step of making the mixture in the tube into a bead form and crosslinking it in a calcium chloride solution.
  • the bubbles are removed by centrifugation at 1500 RPM.
  • the concentration of the calcium chloride solution was 5%.
  • the crosslinked beads were washed with phosphate buffered saline (PBS), and cultured in a culture medium containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C in a 5% carbon dioxide incubator. As a result, Were prepared.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the support was made using polycaprolactone.
  • polycaprolactone was introduced into a tube and a pressure of 650 to 730 kPa was applied at 90 ° C.
  • a three-dimensional support was prepared using the suction function of the air controller, and the sterilization process was performed using electron beam acceleration.
  • Example 5 Three-dimensional cell culture using a support containing a second cell
  • the second cells were inoculated on 4 drop supports on a 4-drop support, cultured for 1 hour, and cultured in 1 ml medium at 37 ° C under 5% A three-dimensional structure of the support type in which the second cells were inoculated was prepared.
  • the three-dimensional cell culture performed using the insertable culture container according to the present invention shows that, unlike the two-dimensional cell culture using a general culture container, the cell number does not decrease but increases with the passage of time have. That is, it has been confirmed in actual experiments that the three-dimensional cell culture can be more continuously performed with the culture container of the present invention.
  • the present invention relates to an implantable culture container, a kit and a three-dimensional cell co-culture method using the same, and is industrially applicable.

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Abstract

본 발명은 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 관한 것으로서, 원통형으로서 상부 및 하부가 개방되는 측벽; 상기 측벽의 상측로부터 외측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 걸이부; 및 상기 측벽의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 지지부를 포함하는 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기를 제공한다. 본 발명에 따르면, 배양용기의 바닥면과 이격된 위치에서 세포가 배양됨으로써, 3차원 세포배양 구조물에 필요한 공기의 공급이 원활한 장점을 제공하면서, 배양용기가 삽입형으로 구성되어 기존의 배양플레이트를 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법
본 발명은 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종래와 달리, 배양용기의 바닥면과 이격된 위치에서 세포가 배양됨으로써, 3차원 세포배양 구조물에 필요한 공기의 공급이 원활하면서도 삽입형으로 구성되면서, 동시에 기존의 배양플레이트를 그대로 사용할 수 있는 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 관한 것이다.
세포의 배양은 바이오 분야 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는 데에도 매우 광범위하게 이용되고 있다. 일반적인 진핵세포(eukaryotic cell)의 세포배양 방법이 개발 및 확립된지도 40 여년이 경과되었지만, 부착성 세포(adherent cell)의 성장을 지지하기 위해 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리카보네이트(PC)과 같은 합성 폴리머 수지 혹은 유리(glass)로 된 기질로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다.
그러나, 단층 세포배양 방법인 2차원적 세포배양법에 의해 성장하는 세포는 세포가 잘 부착될 수 있도록 처리된 배양용기 표면에 부착되어 자라므로 3차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2차원적 및 3차원적 세포배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2차원적 세포배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직환경에서 일어나는 현상과 크게 다르기 때문에, 2차원적 세포배양 방법은 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 가지고 있다.
실제로, 비만, 당뇨, 동맥경화 등과 같은 대사성 질환(metabolic disease)의 치료제 개발 시에, 초기 시험관 내(in vitro) 실험에서는 우수한 약효를 보였던 약물들이 생체 내(in vivo) 동물 실험에서는 약효가 현저히 떨어지는 등 신약 개발에 많은 어려움이 따르고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는, 치료제 개발의 초기 단계에서부터 약물의 정확한 효능 및 독성을 예측할 수 있는 생체 내 모델과 유사한 시험관 내 모델이 필요하다.
종래의 세포배양 용기는 3차원 세포배양시 공간적 한계로 공기의 공급과 순환이 원활하지 않아 3차원 세포의 성장과 조직형성이 충분히 이루어지기 어려워, 약물 스크리닝이나 독성 시험에 적용하기에 어려움이 있었다.
따라서, 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 3차원 세포의 빠른 성장에 적합하면서도, 2차원과 3차원 공배양도 가능한 세포배양 용기에 대한 기술개발이 요구되고 있다.
또한, 기존에 범용적으로 사용되는 세포배양 플레이트에 호환될 수 있는 3차원 세포배양용기가 요구되고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 종래와 달리, 배양용기의 바닥면과 이격된 위치에서 세포가 배양됨으로써, 3차원 세포배양 구조물에 필요한 공기 순환과 공급이 원활한 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법을 제공하는 것으로 목적으로 한다.
또한, 종래 멤브레인을 바닥면에 사용하는 경우에 기공 크기의 한계로 인하여 단백질 등 일부 성분만 공급이 가능했던 문제와 세포나 지지체가 멤브레인과 물리적으로 접촉할 수 밖에 없었던 문제를 본 발명의 특수한 지지부 구조로 인하여 물리적 접촉이 없으면서도 모든 성분의 공급이 가능하도록 개선하는 것을 목적으로 한다.
또한, 배양용기 상에 3차원 구조체를 별도로 지지하는 지지부 구조를 구현함으로써, 3차원 구조체의 삽입과 획득 및 제거가 용이한 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 배양용기는 삽입형으로 구성되어, 3차원 구조체의 삽입과 획득 및 제거가 더욱 용이할 뿐만 아니라, 기존의 배양플레이트를 그대로 계속 사용할 수 있어서 편리하고 교체가 용이한 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 삽입형 배양용기를 포함하는 세포 배양 키트는 3차원 배양에 최적화된 지지부 구조로 인하여, 공기 순환과 배양액 내 영양 성분의 원활한 공급으로 2가지 이상의 세포를 공배양하는 경우 이를 효율적으로 유지할 수 있는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 3차원 세포 배양방법은 세포의 성장이 빠르고 다양한 크기 조절이 가능하며, 3차원 배양 분화된 세포는 동물대체시험에 적용하여 약물 스크리닝이나 독성 시험 등에 효과적으로 이용할 수 있다.
또한, 손상된 인체조직 기능을 복원하기 위한 3차원 세포배양 및 분화 혹은 조직배양 용기로 활용 가능한 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기는, 원통형으로서 상부 및 하부가 개방되는 측벽; 상기 측벽의 상측로부터 외측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 걸이부; 및 상기 측벽의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 지지부를 포함한다.
상기 지지부는 상기 측벽의 중앙부 아래에 위치할 수 있다.
상기 적어도 하나 이상의 지지부는 등간격으로 배치될 수 있다.
상기 측면의 상측이 하측보다 단면이 더 큰 원통형일 수 있다.
상기 측벽의 상부의 지름과 상기 측벽의 하부의 지름 비율은 3:1 내지 1.2:1일 수 있다.
상기 측벽으로부터 상기 지지부 끝단까지의 거리는 상기 상부의 지름 대비 15 내지 30%일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명에 따른 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트를 제공한다.
구체적으로, 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트는 원통형으로서 상부 및 하부가 개방되는 측벽; 상기 측벽의 상측로부터 외측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 걸이부; 및 상기 측벽의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 지지부를 포함하는 삽입형 배양용기 및 상기 배양용기가 삽입되는 플레이트를 포함하는 3차원 세포배양용 키트로서,
상기 플레이트는 일 방향으로 오목한 적어도 하나 이상의 웰; 및 상기 웰 사이를 연결하는 연결부로 구성되고,
상기 삽입형 배양용기는, 상기 플레이트의 상기 웰에 삽입가능하며, 상기 배양용기의 걸이부는 상기 플레이트의 상기 연결부에 걸쳐지며, 상기 웰의 바닥면와 상기 배양용기의 하부가 이격되는 것을 특징으로 한다.
상기 웰의 바닥면과 상기 배양용기의 하부의 이격거리는, 상기 웰의 깊이의 10 내지 40%일 수 있다.
본 발명의 또다른 양태로서, 3차원 세포배양 키트를 사용하여 3차원적으로 세포를 공배양하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 3차원 세포를 공배양 하는 방법은, 원통형으로서 상부 및 하부가 개방되는 측벽; 상기 측벽의 상측로부터 외측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 걸이부; 및 상기 측벽의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 지지부를 포함하는 삽입형 배양용기 및 상기 배양용기가 삽입되는 플레이트를 포함하는 3차원 세포배양용 키트로서,
상기 플레이트는 일 방향으로 오목한 적어도 하나 이상의 웰; 및 상기 웰 사이를 연결하는 연결부로 구성되고, 상기 삽입형 배양용기는, 상기 플레이트의 상기 웰에 삽입가능하며, 상기 배양용기의 걸이부는 상기 플레이트의 상기 연결부에 걸쳐지며, 상기 웰의 바닥면와 상기 배양용기의 하부가 이격되는 것을 특징으로 하는 키르를 준비하는 단계;
제 1세포를 상기 플레이트의 웰 내부에 접종하는 접종단계;
상기 제 1세포를 배양한 후 상층액을 제거하고 배양액을 적어도 일부 교환하는 교환단계;
상기 플레이트의 웰에 상기 삽입형 배양용기를 삽입하는 삽입단계; 및
제 2세포가 접종된 3차원 구조체를 상기 지지부 상에 위치시켜 공배양하는 공배양단계;를 포함한다.
본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 따르면, 종래와 달리, 배양용기의 바닥면과 이격된 위치에서 세포가 배양됨으로써, 3차원 세포배양 구조물에 필요한 산소 공급이 원활한 장점이 있다.
또한, 종래 멤브레인을 바닥면에 사용하는 경우에 기공 크기의 한계로 인하여 단백질 등 일부 성분만 공급이 가능했던 문제와 세포나 지지체가 멤브레인과 물리적으로 접촉할 수 밖에 없었던 문제를 본 발명의 특수한 지지부 구조로 인하여 물리적 접촉이 없으면서도 모든 성분의 공급이 가능하도록 개선한 장점이 있다.
배양용기 상에 3차원 구조체를 별도로 지지하는 지지부 구조를 구현함으로써, 3차원 구조체의 삽입과 획득 및 제거가 용이한 장점이 있다.
또한, 삽입형으로 구성되어, 3차원 구조체의 삽입과 획득 및 제거가 더욱 용이할 뿐만 아니라, 기존의 배양플레이트를 그대로 계속 사용할 수 있어서 편리하고 교체가 용이한 장점이 있다.
3차원 배양에 최적화된 지지부 구조로 인하여, 3차원 세포배양뿐만 아니라, 2종류 이상의 세포 공배양을 효율적으로 진행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 3차원 세포 배양방법은 세포의 성장이 빠르고 다양한 크기 조절이 가능하며, 생체 모사 모델 혹은 동물대체시험법으로 약물 스크리닝이나 약효 확인, 독성 시험 등에 보다 효과적인 장점이 있다.
또한, 손상된 인체조직 기능을 복원하기 위한 3차원 세포배양 및 조직배양 용기로 활용 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기를 나타낸 사시도
도 2는 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기를 나타낸 단면도
도 3은 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기를 나타낸 평면도
도 4는 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트의 세포배양 플레이트를 나타낸 사시도
도 5는 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트에서, 플레이트 상에 삽입형 배양용기를 삽입한 상태를 나타낸 사시도
도 6은 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트에서, 플레이트 상에 삽입형 배양용기를 삽입한 상태를 나타낸 단면도
도 7은 본 발명의 3차원 세포 공배양 방법을 순차적으로 나타낸 순서도
도 8는 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트로 3차원 세포배양을 실시한 실험결과를 나타낸 그래프
이하, 본 발명에 의한 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 대하여 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기(100)는, 상부(10), 하부(11), 측벽(12) 및 지지부(13)를 포함할 수 있다.
먼저, 상부(10)는 3차원 구조체가 삽입되기 위해 개방된 상부를 의미하며, 하부(11)와 측벽(12)과 함께 상/하로 개방된 기둥 형상의 기본 구조를 형성할 수 있다.
하부(11)는 배양액, 이종 세포와의 공배양이 가능하도록 개방된 형태로 구성된다.
상기 상부(10)의 지름과 상기 하부(11)의 지름 비율은 3:1 내지 1.2:1일 수 있으며, 바람직하게는, 2:1 내지 1.5:1, 더 바람직하게는, 1.8:1 내지 1.6:1인 것이 효과적이다. 이 정도 범위에서 기울기를 형성하도록 구성하는 것이 상부로부터의 3차원 구조체의 삽입과 제거를 용이하게 하면서도, 하부로부터의 배양액과 이종 세포와의 상호작용을 극대화하면서도, 웰과의 구조적 결합안정성을 확보하기 위해 최적이다.
3:1의 비율을 초과하는 경우에는 하부로부터의 공기 순환 및 공급, 2종 이상의 세포 공배양 등의 효율이 현저히 저하될 수 있으며, 1.2:1 미만인 경우에는 상부로부터의 3차원 구조체의 삽입과 제거의 용이성이 떨어지거나 하부 웰과의 구조적 결합 안정성이 저하될 수 있다.
측벽(12)은 상기 상부(10)로부터 상기 하부(11)까지 연장되어 구성되며, 3차원 구조체를 보호하고 상기 지지부(13)가 형성되기 위한 기초면을 형성한다.
또한, 지지부(13)는 상기 측벽(12)의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되며, 지지부(13)의 개수는 바람직하게는, 2 내지 5개, 더 바람직하게는, 3 내지 4개, 가장 바람직하게는, 3개인 것이 효과적이다. 2개 미만인 경우에는 사실상 3차원 세포 구조체의 지지가 불가능하며, 5개를 초과하는 경우에는 지지부(13)로 인하여 하부 (12)의 개방 공간 대비 실제 하부 웰(well)과의 연결 공간이 과도하게 좁아 공기 순환 및 공급, 2종 이상의 세포 공배양 등의 효율이 현저히 저하되는 문제가 있다.
상기 적어도 하나 이상의 지지부는 등간격으로 배치되는 것을 특징으로 한다.
상기 지지부는 상기 측벽의 중앙부 아래에 위치하는 것을 특징으로 한다.
상기 지지부(13)는 상기 상부(10)로부터 이격되며, 상기 하부 개방단구(11)로부터 상기 측벽(12)의 0 내지 40%의 높이에 위치하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는, 5 내지 25%의 높이에 위치하고, 가장 바람직하게는, 5 내지 10%의 높이에 위치하는 것이 효과적이다. 40%를 초과하는 높이에 위치하는 경우에는 지지부(13) 상에 올려지는 3차원 세포 구조체와 웰(well)에 담긴 타 세포간의 공배양이 이루어지기 어려운 문제가 있다.
상기 측벽(12)으로부터 상기 지지부(13) 끝단까지의 거리는 상기 상부(10)의 지름 대비 15 내지 30%인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는, 20 내지 25%, 가장 바람직하게는, 22 내지 23%인 것이 효과적이다. 15% 미만인 경우에는 3차원 세포 구조체를 안정적으로 지지하기 어려우며, 30%를 초과하는 경우에는 지지부(13)의 하부(11)로부터의 이격 효과가 떨어지며, 즉, 원활한 공기 순환 및 공급이 어려워 세포 성장에 악영향을 주는 문제가 있다.
상기 지지부(13)는 상기 하부(11)까지 연장될 수 있다. 하부(11)로부터 측벽(12)을 따라 지지부(13)가 형성되므로, 일체로 사출이 용이하여 제조공정이 단순해지고 경제성이 높아지는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 지지부(13)가 측벽(12)을 따라 기둥형태로 형성되므로, 보다 높은 안정성과 내구성을 갖는다.
또한, 상기 걸이부(14)는 상기 측벽(12)의 상측으로부터 외측으로 돌출되어 형성될 수 있다.
상기 상부(10), 하부(11), 측벽(12), 지지부(13) 및 걸이부(14)는, 폴리스티렌(PS), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리카보네이트(PC), 유리 등 세포배양에 적용되는 어떠한 소재로 구성되어도 무방하나, 상기 측벽(12)과 지지부(13)는 동일한 소재로 구성되는 것이 내구성 및 일체로의 사출용이성 측벽에서 적합하다.
다음으로, 도 4 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트는, 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기(100) 및 세포배양 플레이트(200), 즉, 플레이트(200) 및 삽입형 배양용기(100)를 포함할 수 있다.
여기서, 플레이트(200)는 일방향으로 오목한 적어도 하나의 웰(20); 및 상기 웰(20) 사이를 연결하는 연결부(21)를 포함할 수 있다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 플레이트(200)의 웰(20) 내부로 삽입형 배양용기(100)가 삽입될 수 있다. 삽입된 경우에 상기 걸이부(14)는 상기 연결부(21)에 걸쳐져 상기 삽입형 배양용기(100)를 지지하는 역할을 한다.
상기 웰(20)의 바닥면와 상기 하부 개방단부(11)는 이격되며, 상기 웰(20)의 바닥면과 상기 하부 개방단부(11)간의 이격거리는, 상기 웰의 깊이의 10 내지 40%인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는, 15 내지 25%, 가장 바람직하게는, 15 내지 20%인 것이 효과적이다. 10% 미만에 위치하는 경우에는 하부에서의 세포에의 원활한 공기 순환 및 공급이 어려우며, 40%를 초과하는 경우에는 지지부(13) 상에 올려지는 3차원 세포 구조체와 웰(well)에 담긴 타 세포간의 공배양이 이루어지기 어려운 문제가 있다.
플레이트(200) 상에 형성된 웰(20)의 개수에는 제한이 없으며, 16웰, 96웰처럼 다양한 숫자의 웰을 갖도록 구성될 수 있다.
본 발명의 3차원 세포 공배양 방법은, 준비단계(S20); 접종단계(S21); 교환단계(S22); 삽입단계(S23) 및 공배양단계(S24)를 포함할 수 있다. 이는 제 1세포와 제 2세포를 본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 구조를 이용하여 효과적으로 공배양할 수 있는 방법이다.
먼저, 준비단계(S20)는 본 발명에 따른 삽입형 배양용기와 상기 배양용기가 삽입되는 플레이트로 구성된 3차원 세포배양용 키트를 준비하는 단계이다.
접종단계(S21)는 제 1세포를 상기 웰 내부에 접종하는 단계이다. 즉, 제 1세포와 배양액을 웰 내부에 접종할 수 있다.
여기서, 제 1세포는 제 2세포와 공배양이 가능한 어떠한 세포이든 무방하나, 정확히는 부착세포일 수 있으며, 간엽세포 혹은 간엽줄기세포, 지방전구세포, 지방세포, 평활근 세포(Smooth Muscle Cell, SMC) 또는 마크로파지(macrophage) 중 적어도 하나일 수 있다.
교환단계(S22)는 상기 제 1세포를 배양한 후 상층액을 제거하고 배양액을 적어도 일부 교환하는 단계이다. 웰 내의 배양액에서 제 1세포 배양으로 인해 발생한 상층액을 제거하고 배양액의 일부 또는 전부를 교환함으로써, 공배양 효율을 높일 수 있다.
삽입단계(S23)는 상기 플레이트의 웰에 상기 삽입형 배양용기를 삽입하는 단계이다.
공배양단계(S24)는 제 2세포가 접종된 3차원 구조체를 상기 배양용기의 지지부 상에 위치시켜 공배양하는 단계이다. 여기서, 3차원 구조체는 비드 또는 지지체 형태인 것이 바람직하다.
여기서, 상기 제 2세포는, 배양 가능한 진핵세포일 수 있으며, 더 상세하게는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 간세포, 제대혈세포, 탯줄 유래 간엽줄기세포(Umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC), 지방 유래 간엽줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cell, ADMSC) 또는 골수 유래 간엽줄기세포(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BMMSC) 중 적어도 하나일 수 있다.
마지막으로, 교체단계(S24)는 상기 공배양단계(S24) 이후, 1 내지 5일 간격으로 상기 배양액을 교체하는 단계이다. 더 바람직하게는, 2 내지 3일 간격으로 교체하는 것이 효과적이다. 이는 세포배양에 필요한 영양성분의 공급과 배양 중 생성되는 세포 생존 저해 물질을 제거함으로써 세포 또는 조직이 지속적으로 성장하도록 하기 위함이다.
실시예 1) 배양용기 제작 및 멸균
본 개발의 실시예로 쾌속 조형(RP;rapid prototyping) 장비를 이용한 임의형상제작 (SFF;solid freeform fabrication) 방식으로 한층, 한층 적층하여 형상을 제작하는 3D 프린팅 기술을 이용하여 배양용기를 제작하고 멸균은 전자빔 가속기를 사용하여 수행하였다.
실시예 2) 제 1세포 배양
본 발명의 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기 키트를 이용한 3차원 세포배양의 효과를 측정하기 위한 실험으로 다음과 같은 조건으로 실험을 실시하였다.
- 세포: 3T3-L1(지방전구세포)(2.45x106cells/5mL/Tube), 지방 유래 간엽줄기세포(ADMSC)
- 배양기간: 7일간 배양
- 세포계수: 0, 3, 7일째 세포계수
- 알지네이트 혼합: 1.3% 농도
제 1세포는 3T3-L1(지방전구세포)로, 구체적으로, 냉동 보관된 제 1세포를 37℃ 항온수조에서 해동하여 15ml tube로 옮기 뒤, 기본배지(DMEM + 1% antibiotics)를 추가하여 1,500RPM에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 다시 한번 기본배지를 추가하여 앞의 방법을 반복함으로써 동결보존액 성분을 완전히 제거한 후 100mm 배양접시에 DMEM + 1% antibiotics + 10% FBS 포함한 배지와 함께 세포를 접종하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하고, 4 내지 5일 후 충분히 세포가 증식되면 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 배양용기의 웰당 세포를 1x103 농도로 접종하였다.
실시예 3) 제 2세포가 포함된 비드 제작
제 2세포는 지방 유래 간엽줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cell, ADMSC)로, 제 2세포가 접종된 3차원 구조체를 비드 형태로 제작하였다.
비드는, 배양액, 알지네이트 및 젤라틴을 튜브에 투입하여 65℃ 하에서 녹이는 멜팅단계; 상기 튜브의 온도를 37℃로 낮추고, 상기 튜브에 상기 제 2세포(2.45x106cells/5mL/Tube)를 투입하여 500RPM으로 2분간 교반하는 교반단계; 및 상기 튜브 내의 혼합물을 비드 형태로 만들고, 염화칼슘용액에 넣어 가교시켜 제조하는 제조단계;를 포함하여 제조되었다.
교반 이후에는, 원심분리를 통하여 1500RPM으로 버블을 제거한다. 상기 제조단계에서, 염화칼슘용액의 농도는 5%로 하였다.
상기 가교된 비드는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척하고, 10% 우태아 혈청이 함유된 배양액에 넣어 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양함으로써, 상기 제 2세포가 접종된 비드 형태의 3차원 구조체를 제조하였다.
실시예 4) 지지체 제작과 멸균공정
지지체는, 폴리카프롤락톤을 이용하여 제작하였다. 우선 폴리카프롤락톤을 튜브에 투입하여 90℃ 하에서 650 내지 730kPa의 압력을 가한 이후에는 에어컨트롤러의 흡입기능을 이용하여 3차원 지지체를 제작하고 전자빔 가속도를 이용하여 멸균공정을 처리하였다.
실시예 5) 제2세포가 포함된 지지체를 이용한 3차원 세포 배양
제2세포가 포함된 지지체를 이용한 3차원 세포배양은, 제 2세포를 25㎕씩 4개의 drop 지지체 위에 접종한 후 1시간 동안 배양하고 1ml 배지 첨가하고 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양함으로써, 상기 제 2세포가 접종된 지지체 형태의 3차원 구조체를 제조하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 삽입형 배양용기를 사용하여 실시한 3차원 세포배양은 일반적인 배양용기를 이용한 2차원 세포배양과 달리, 배양시간이 지날수록 세포수가 감소하지 않고 증가하는 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 배양용기로 3차원 세포배양이 보다 지속적으로 이루어질 수 있음을 실제 실험에서 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
[부호의 설명]
100: 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기
10: 상부
11: 하부
12: 측벽
13: 지지부
14: 걸이부
200: 세포배양 플레이트
20: 웰(well)
21: 연결부
본 발명은 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법에 관한 것으로 산업상 이용가능합니다.

Claims (7)

  1. 원통형으로서 상부 및 하부가 개방되는 측벽;
    상기 측벽의 상측로부터 외측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 걸이부; 및
    상기 측벽의 하측으로부터 내측으로 돌출되어 형성되는 적어도 하나 이상의 지지부;
    를 포함하는 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 지지부는 상기 측벽의 중앙부 아래에 위치하는 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 적어도 하나 이상의 지지부는 등간격으로 배치되는 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 측면의 상측이 하측보다 단면이 더 큰 원통형인 3차원원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기.
  5. 제1항의 삽입형 배양용기 및 상기 배양용기가 삽입되는 플레이트를 포함하는 3차원 세포배양용 키트로서,
    상기 플레이트는 일 방향으로 오목한 적어도 하나 이상의 웰; 및 상기 웰 사이를 연결하는 연결부로 구성되고,
    상기 삽입형 배양용기는, 상기 플레이트의 상기 웰에 삽입가능하며, 상기 배양용기의 걸이부는 상기 플레이트의 상기 연결부에 걸쳐지며, 상기 웰의 바닥면와 상기 배양용기의 하부가 이격되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포배양용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 웰의 바닥면과 상기 배양용기의 하부의 이격거리는, 상기 웰의 깊이의 10 내지 40%인 3차원 세포배양용 키트.
  7. 제5항의 키트를 준비하는 단계;
    제 1세포를 상기 플레이트의 웰 내부에 접종하는 접종단계;
    상기 제 1세포를 배양한 후 상층액을 제거하고 배양액을 적어도 일부 교환하는 교환단계;
    상기 플레이트의 웰에 상기 삽입형 배양용기를 삽입하는 삽입단계; 및
    제 2세포가 접종된 3차원 구조체를 상기 배양용기의 지지부 상에 위치시켜 공배양하는 공배양단계;를 포함하는 3차원 세포 공배양 방법.
PCT/KR2018/015569 2017-12-08 2018-12-07 3차원 세포배양을 위한 삽입형 배양용기, 키트 및 이를 이용한 3차원 세포 공배양방법 WO2019112391A1 (ko)

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