WO2019106865A1

WO2019106865A1 - アシルステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドの製造方法、組成物、抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤

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Publication number: WO2019106865A1
Application number: PCT/JP2018/021018
Authority: WO
Inventors: 伊東　信; 昂渡邊; 涼植村; 鈴木　健吾; 杉本　良太; 雅弘林
Original assignee: 国立大学法人九州大学; 株式会社ユーグレナ
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-06-06
Also published as: JP7133306B2; JP2019099499A; KR20200091904A

Abstract

新奇アシルステリルグルコシド及びラビリンチュラを原料とするアシルステリルグルコシドの製造方法を提供する。　下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表されるアシルステリルグルコシド。

Description

アシルステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドの製造方法、組成物、抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤

　本発明は、アシルステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドの製造方法、組成物、抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤に関する。

　ラビリンチュラ類は、海洋に生息する真核性微生物であり、葉緑体を持たず、海洋の有機物を分解、吸収する従属性の単細胞生物である。ラビリンチュラ類は、分類学的には、原生生物に属し、卵菌類などとともにストラメノバイル類と呼ばれる一大系統群を構成している。ラビリンチュラ類は、狭義のラビリンチュラ科とヤブレツボカビ科から構成され、前者はラビリンチュラ属１属、後者はオーランチオキトリウム属、スラウストキトリウム属、パエリティキトリウム属等の１１属に分類されている。

　ラビリンチュラ類は、ＤＨＡ等の高度不飽和脂肪酸、パルミチン酸等の飽和脂肪酸、スクアレン等の炭化水素、スフィンゴ脂質等の脂質の生産力に優れ、それらを細胞内の油球（油滴）に大量に蓄積することができる。そのため、医薬品、機能性食品、バイオエネルギーの生産源として産業的にも深い関心が寄せられている（特許文献１）。

　例えば、ラビリンチュラ類の１種であるオーランチオキトリウムは、石油を作る藻として注目されており、青魚から工業的に生産されているｎ－３高度不飽和脂肪酸の代替生産源としても開発が進められている。

　ラビリンチュラ類に含まれる糖脂質として、ステロールにグルコースが結合したステリルグルコシド（ＳＧ）が同定されている。例えば、沖縄県波照間島の沿岸海水から分離したA.　limacinum　mh0186株において、ステリルグルコシドとして４つの物質が同定されている。具体的には、GL-A（3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasta-5,7,22-triene）とGL-B（3-O-b-D-glucopyranosyl-4-a-methyl-stigmasta-7,22-diene）という２種のステリルグルコシド（ＳＧ）が二次元ＮＭＲによって構造決定され、更に高速液体クロマトグラフィー－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）解析によってGL-C（3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasta-7,22-diene）とコレステリルグルコシド（CG）の存在が示されている（図１）。

　ステリルグルコシド（ステロール配糖体）やアシルステリルグルコシド（ステロール配糖体エステル）は、天然油脂成分として油脂中に含有されており、その用途として、例えば、発毛・育毛（特許文献２）、血中脂質の低下（特許文献３）、肥満予防（特許文献４）などの種々の用途が報告されている。

　ステリルグルコシドやアシルステリルグルコシドは、需要が高い有用成分であるが、自然界では希少であり、その供給源は限られている。また、従来、ラビリンチュラ類にアシルステリルグルコシドが含まれることは知られていなかった。

特開２０１０－２００６９０号公報特開平７－１０１８３５号公報特開平７－１１８１５９号公報特開平７－１０７９３９号公報

　本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ラビリンチュラ類を原料として用いる新奇アシルステリルグルコシドの製造方法を提供することにある。
　また、本発明の別の目的は、ラビリンチュラ類由来のアシルステリルグルコシドを含有する食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物などの組成物を提供することにある。
　また、本発明の更に別の目的は、ラビリンチュラ類由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラビリンチュラ類にステリルグルコシド以外に、構造未知の糖脂質が含まれることを見出し、本発明を完成するに至った。

　従って、前記課題は、本発明によれば、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表されるアシルステリルグルコシドにより解決される。

　また、前記課題は、本発明によれば、ラビリンチュラを用意するラビリンチュラ用意工程と、前記ラビリンチュラからアシルステリルグルコシドを含有するアシルステリルグルコシド画分を分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記アシルステリルグルコシド画分から前記アシルステリルグルコシドを精製する精製工程と、を行うことを特徴とするアシルステリルグルコシドの製造方法により解決される。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸又はパルミチン酸がエステル結合したものであるであるとよい。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸がエステル結合したものであるであるとよい。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表される１種以上であるであるとよい。

　また、前記課題は、本発明によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを含有し、食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物から選択される組成物により解決される。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸又はパルミチン酸がエステル結合したものであるとよい。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸がエステル結合したものであるとよい。
　このとき、前記アシルステリルグルコシドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表される１種以上であるとよい。

　このとき、前記組成物が、食品組成物であるとよい。
　このとき、前記組成物が、医薬組成物であるとよい。
　このとき、前記組成物が、化粧料組成物であるとよい。

　また、前記課題は、本発明の抗酸化剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。
　また、前記課題は、本発明の発毛又は育毛剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。
　また、前記課題は、本発明の血中脂質低下剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。
　また、前記課題は、本発明の抗肥満剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。
　また、前記課題は、本発明の抗腫瘍剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。
　また、前記課題は、本発明のアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有することにより解決される。

　本発明によれば、新奇なアシルステリルグルコシドを提供することができる。
　本発明のアシルステリルグルコシドの製造方法によれば、大量培養が可能な藻類バイオマスであるラビリンチュラ類を利用して、有用物質であるアシルステリルグルコシドを製造することが可能となる。
　また、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物などの組成物として利用することが可能である。
　また、本発明によれば、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤やアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤を提供することができる。

A.　limacinum　mh0186株に含まれるステリルグルコシドを示す図である。本実施形態のアシルステリルグルコシドの製造方法を示すフロー図である。試験１における薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の結果を示す写真である。未知糖脂質を矢印で示す。標品にはシトステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドを使用し、１レーンに２ｍｇの乾燥細胞から抽出した脂質を供試した。展開溶媒にはクロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４を用い、オルシノール硫酸でバンドを検出した。試験２における高速液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）の結果である。試験２において特定されたアシルステリルグルコシドの構造を示す図である（ＤＨＡ－ＧＬ－Ａ、構造式（Ｉ））。試験２における高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果である。試験２において特定されたアシルステリルグルコシドの構造を示す図である（ＤＨＡ－ＣＧ、構造式（ＩＩ））。試験３においてアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）に結合している脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で解析した結果を示すグラフである。試験４においてアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）におけるステリルグルコシド（ＳＧ）と脂肪酸の組み合わせを高速液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）で解析した結果を示すグラフである。試験５で行った結合解析（弱アルアリ分解とβグルコシダーゼ（ＥＧＣｒＰ２）処理）の流れを示す説明図である。試験５におけるＡＳＧの脂肪酸と糖の結合解析の結果を示す薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の写真である。試験６におけるＡ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６の細胞の増殖曲線を示すグラフである。試験６における培養液に含まれるグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。試験６において検討を行ったＡ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６の細胞に含まれるステリルグルコシド（ＳＧ）量の経時変化を示すグラフである。試験６において検討を行ったＡ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６の細胞に含まれるアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）量の経時変化を示すグラフである。推定されるＡＳＧ合成過程を示す説明図である。（ａ）仮説１：ＴＧリパーゼが脂肪酸をＳＧに転移する。（ｂ）仮説２：ホスホリパーゼが脂肪酸をＳＧに転移する。オレイン酸添加によるＳＧとＡＳＧ量の変化。（ａ）ＥＧ（エルゴステリルグルコシド）の量、（ｂ）ＡＥＧ（アシルエルゴステリルグルコシド）の量、（ｃ）総ＡＥＧ量。Ｍｅａｎ±ＳＥ（ｎ＝３）、ｎ．ｄはｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄを意味する。試験１乃至６から同定されたラビリンチュラに含まれる新奇なアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）の構造の説明図である。ラビリンチュラにおいてアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）、中性脂質、リン脂質がＤＨＡ蓄積のリザーバーとして働いていることを示す図である。試験８で測定を行った薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の結果を示す写真である。試験８で測定を行った高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の結果を示すグラフであるである。試験９で検討を行ったＤＨＡ－ＳＧとＤＨＡの酸化測定の結果を示すグラフである。

　以下、本発明の実施形態（本実施形態）について、図１乃至２０を参照しながら説明する。
　本実施形態は、アシルステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドの製造方法、組成物、抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤に関するものである。

　本明細書において用いる略語は、以下のとおりである。
　ＡＳＧ：アシルステリルグルコシド（acyl　steryl　gluoside）
　ＤＣＷ：乾燥細胞重量（dry　cell　weight）
　ＤＨＡ：ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic　acid）
　ＥＧ：エルゴステリルグルコシド（ergosteryl　glucoside）
　ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析（liquid　chromatography　mass　spectrometry）
　ＬＰＣ：リゾフォスファチジルコリン（lysophosphatidyl　choline）
　ＬＰＥ：リゾフォスファチジルエタノールアミン（lysophosphatidyl　ethanolamine）
　ＰＣ：フォスファチジルコリン（phosphatidyl　choline）
　ＰＥ：フォスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl　ethanolamine）
　ＳＥ：ステロールエステル（sterol　ester）
　ＳＧ：ステリルグルコシド（steryl　glucoside）
　ＴＧ：トリアシルグリセロール（triacylglycerol）
　ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー（thin　layer　chromatography）

＜ラビリンチュラ＞
　本実施形態のアシルステリルグルコシドは、海洋性真核微生物であるラビリンチュラ類を培養し分離、精製することにより得ることができる。
　本実施形態において、「ラビリンチュラ」とは、動物学や植物学の分類でラビリンチュラ類に分類される微生物、その変種、その変異種のすべてを含む。

　ラビリンチュラ類としては、ラビリンチュラ属（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）、アルトルニア属（Ａｌｔｈｏｒｎｉａ）、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、イァポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ラビリンチュロイデス属　　　（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギチトリウム属　　　（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、パリエチキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔ－ｒｉｕｍ）、又はウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）、オーランチオキトリウム属（Ａｕｒａ－ｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）が挙げられ、好ましくはオーランチオキトリウム属に属する微生物であり、特に好ましくはオーランチオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃ－ｈｙｔｒｉｕｍ　ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）が挙げられる。これらは保存機関から分譲された菌株、あるいはその継代培養菌株であってもよく、例えば、Ａ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６株が例示される。

　ラビリンチュラ類Ａ．ｌｉｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１９７５５）、は、沖縄県波照間島沿岸で単離され、培養温度が１０～３５℃と幅広い温度で生育可能であるため、本実施形態のアシルステリルグルコシドの製造方法に好適に用いることができる。

　ラビリンチュラ類は、海洋、特に沿岸域の海水域や、河口などの汽水域に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のラビリンチュラ類を使用してもよい。
　ラビリンチュラ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。

　ラビリンチュラ類の培養は、通常用いられる固体培地あるいは液体培地等で、常法により培養する。この時、用いられる培地としては、例えば炭素源としてグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン等、また窒素源として酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等、また無機塩としてリン酸カリウム等、その他必要な成分を適宜組み合わせた培地であり、ラビリンチュラ類を培養するために通常用いられるものであれば特に限定されないが、特に好ましくは酵母エキス・グルコース培地（ＧＹ培地）が用いられる。培地は調製後、ｐＨを３．０～８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により殺菌して用いる。培養は、１０～４０℃、好ましくは１５～３５℃にて、１～１４日間、通気撹拌培養、振とう培養、あるいは静置培養で行えば良い。

　ラビリンチュラ類の培養は、光を照射することなく行うことができるが、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行っても良い。
　また、ラビリンチュラ類の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行っても良い。
　ラビリンチュラ類の分離は、例えば培養液の遠心分離，濾過又は単純な沈降によって行われる。

＜ステリルグルコシド及びアシルステリルグルコシド＞
（ステリルグルコシド）
　ステリルグルコシド（ＳＧ）は、糖脂質の１種であり、ステロール骨格にグルコースがα－又はβ－グルコシド結合した構造をとる。ステリルグルコシドは細胞分化やストレス応答における脂質性メディエーターとして機能する可能性が示唆されている。また、ステリルグルコシドは、例えば、ウイルス感染及び細菌感染の治療剤、発毛剤、育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗ストレス剤、栄養成分吸収促進剤などの有効成分として知られている。

（アシルステリルグルコシド）
　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）とは、ステリルグルコシド（ＳＧ）に脂肪酸がエステル結合した物質の総称である。
　ここで、本実施形態のアシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシド（ＳＧ）にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やパルミチン酸がエステル結合している。

　本実施形態のアシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシド（ＳＧ）にＤＨＡがエステル結合した下記構造式（Ｉ）（ＤＨＡ－ＧＬ－Ａ）、構造式（ＩＩ）（ＤＨＡ－ＣＧ）又は構造式（ＩＩＩ）（ＤＨＡ－ＧＬ－Ｃ）で表されるものである。

　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）の機能性として、ヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）をステリルグルコシド（ＳＧ）よりも良く殺すこと（Wimmerova　et　al,　Improved　enzyme-mediated　synthesis　and　supramolecular　self-assembly　of　naturally　occurring　conjugates　of　β-sitosterol,　Steroids　117　(2017)　38-43）、上昇したＬＤＬコレステロールを減少させること（Ito　et　al,　Rice　bran　extract　containing　acylated　steryl　glucoside　fraction　decreases　elevated　blood　LDL　cholesterol　level　in　obese　Japanese　men,　The　Journal　of　Medical　Investigation,　62　(2015)　80-84）、アテローム性動脈硬化症リスクを低減させること（Nhung　et　al,　Rice　Bran　Extract　Reduces　the　Risk　of　Atherosclerosis　in　Post-Menopausal　Vietnamese　Women.,　Journal　of　Nutritional　Science　and　Vitaminology,　62　(2016)　295-302）などが報告されている。

＜アシルステリルグルコシドの製造方法＞
　本実施形態のアシルステリルグルコシドの製造方法は、ラビリンチュラを用意するラビリンチュラ用意工程と、前記ラビリンチュラからアシルステリルグルコシドを含有するアシルステリルグルコシド画分を分離する分離工程と、前記分離工程で分離した前記アシルステリルグルコシド画分から前記アシルステリルグルコシドを精製する精製工程と、を行うことを特徴とする。
　以下、各工程について、図２を参照して詳細に説明する。

（ラビリンチュラ用意工程）
　ラビリンチュラ用意工程では、アシルステリルグルコシドの原料となるラビリンチュラ類を用意する（ステップＳ１）。
　原料となるラビリンチュラとしては、アシルステリルグルコシドの分離・精製の観点からラビリンチュラ細胞の乾燥品を用いることが好ましいが、これに限定されるものではない。本実施形態において、ラビリンチュラ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得たラビリンチュラの乾燥体を原料として用いると好適である。

　また、培養後に、遠心分離，濾過又は沈降等によって回収したラビリンチュラ生細胞を原料とすることもできる。ラビリンチュラ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、ラビリンチュラ藻体が培養液や水などの液体に分散した分散液の状態で用いてもよい。
　更に、ラビリンチュラ細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物を原料としてもよい。また、機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物を原料としてもよい。

（分離工程）
　分離工程では、ラビリンチュラ用意工程で用意したラビリンチュラからアシルステリルグルコシドを含有するアシルステリルグルコシド画分を分離する（ステップＳ２）。
　アシルステリルグルコシド画分を分離することができれば、分離（分画）の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマト法、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）によりアシルステリルグルコシド含有量の高い画分を分画して得る方法や、粉砕されたラビリンチュラ及びアシルステリルグルコシドを含む抽出物の抽出混合物をろ過し、抽出液と残渣に分離し、抽出液を濃縮して液体クロマトググラフィーにより分画する方法が挙げられる。

　ラビリンチュラ用意工程で、培養したラビリンチュラを含む培養液を用意した場合、培養液の遠心分離または単純な沈降、膜濾過等の公知の方法によってラビリンチュラ藻体を回収して、ラビリンチュラ藻体を洗浄後、公知の乾燥方法（真空凍結乾燥、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等）で乾燥することによりラビリンチュラの藻体乾燥物を分離工程で用いてもよい。

　また、ラビリンチュラ用意工程で用意したラビリンチュラを、超音波破砕機等の公知の粉砕方法で粉砕してもよい。

　分離工程で用いる抽出溶媒は、アシルステリルグルコシドを抽出することができ、その後の精製が容易に行える溶媒であれば特に限定はされないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン等を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
　特に、クロロホルム／メタノール混合溶媒を用いてアシルステリルグルコシドを抽出することが好ましい。この時、溶媒の混合比は任意に設定すれば良いが、クロロホルム：メタノール＝５０ｖｏｌ％：５０ｖｏｌ％～９０ｖｏｌ％：１０ｖｏｌ％の溶媒を用いることが好ましく、クロロホルム：メタノール＝６０ｖｏｌ％：４０ｖｏｌ％～７０ｖｏｌ％：３０　　ｖｏｌ％の溶媒を用いることがより好ましく、Ｆｏｌｃｈ分配、即ちクロロホルム：メタノール＝２：１（体積比）の溶媒を用いることが特に好ましい。

（精製工程）
　精製工程では、前記分離工程で分離した前記アシルステリルグルコシド画分から前記アシルステリルグルコシドを精製する（ステップＳ３）。
　目的とするアシルステリルグルコシドを精製することができれば、精製の方法は特に限定されるものではないが、例えば、適切な分離カラムや再結晶によってアシルステリルグルコシドを精製する方法が挙げられる。

＜用途＞
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、他のステリルグルコシド（ＳＧ）やアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）と同様に、その機能性を利用して、各種用途に用いることが可能である。

（抗酸化剤）
　ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の多価不飽和脂肪酸は、抗酸化作用を有しており、ステリルグルコシド（ＳＧ）にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）がエステル結合したラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、抗酸化剤として用いることが可能である。

（発毛剤、育毛剤）
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、発毛剤や育毛剤として用いることが可能である（特開平７－１０１８３５号公報）。

（血中脂質低下剤）
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、血中におけるコレステロール、中性脂質、リン脂質などの脂質を低下させるために用いられる血中脂質低下剤として用いることが可能である（特開平７－１１８１５９号公報、Ito　et　al,　The　Journal　of　Medical　Investigation,　62　(2015)　80-84）。

（抗肥満剤）
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、肥満の治療や予防のために用いられる抗肥満剤として用いることが可能である（特開平７－１０７９３９号公報）。

（抗腫瘍剤）
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、癌細胞を殺す作用を有しており、腫瘍の増殖を抑制して癌を治療するための抗腫瘍剤（抗乳癌剤））として用いることが可能である（Wimmerova　et　al,　Steroids　117　(2017)　38-43）。

（アテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤）
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、アテローム性動脈硬化症リスクを低減させる作用を有しており、アテローム性動脈硬化症を予防又は治療するためのアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤として用いることが可能である（Nhung　et　al,　Journal　of　Nutritional　Science　and　Vitaminology,　62　(2016)　295-302）。

＜組成物＞
　本実施形態に係るラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗酸化剤、発毛又は育毛剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤は、健康食品等の食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物として構成されて生体に投与される。

（食品組成物）
　本実施形態のラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、食品にも用いることが可能である。
　本実施形態の食品組成物は、食品の分野では、各種作用を有効に発揮できる有効な量のラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
　また、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等と組み合わせて食品組成物を提供することも可能である。
　当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。

　ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。

　また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
　また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。

　本実施形態に係る食品組成物には、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドに加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。

　本実施形態に係る食品組成物には、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドに、各種作用があることが知られているその他の物質を１種以上添加することも可能である。

（医薬組成物）
　本実施形態のラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、医薬組成物として利用することができる。
　本実施形態の医薬組成物は、各種作用を有効に発揮できる量のラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドと共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
　当該医薬組成物は、外用的に適用されても、また内用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、皮下注射、静脈注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
　当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤が挙げられる。

　本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
　例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。

　本実施形態に係る医薬組成物には、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシド以外に、各種作用があることが知られているその他の物質を１種以上添加することも可能である。

（化粧料組成物）
　本実施形態のラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドは、各種作用を利用して、化粧料組成物に好適に用いることができる。
　該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、ローション、乳液、クリーム、美容液などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。

　本実施形態に係る化粧料組成物には、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドに加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。
　例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。

　本実施形態に係る化粧料組成物において、ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドの含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。

　以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下の実施例ではラビリンチュラ類であるＡｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ　ｌｉ－ｍａｃｉｎｕｍ　ｍｈ０１８６株の総脂質画分から、Ｓｅｐ－ｐａｋ　ｐｌｕｓ　ｓｉｌ－ｉｃａカラムを用いて未知糖脂質を単離し、質量分析計、弱アルカリ分解、βグルコシダーゼ処理により構造を解析した。また、糖脂質は液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）で定量した。

＜材料＞
　SGとASGはMatreya　LCCから購入した。TG(12:0/12:0/12:0)、PC(11:0/11:0)、LPC(13:0)、PE(12:0/12:0)、LPE(13:0)、SE(16:0-d7　cholesterol)、d7　cholesterolはAvanti　Polar　Lipidsから購入した。人工海水（SEALIFE）は日本海水から購入した。LC-MS解析に用いた有機溶媒は和光純薬から購入した。

＜試験１　未知糖脂質の単離・精製＞
（A.　limacinum　mh0186　の培養）
　ラビリンチュラとして、A.　limacinum　mh0186株を用いた。3mlの0.1%　vitamin　mixture、0.2%　element　solution含有GY培地（3.1%(w/v)D-glucose、1.0%(w/v)Yeast　Extract、1.75%(w/v)　SEALIFE）で前培養した細胞のうち100μlを、100mlのGY培地(300ml容三角フラスコ、0.1%　vitamin　mixture、0.2%　element　solution含有)に加えて３日間振とう培養した（150　rpm、25℃）。ここで、vitamin　mixtureの組成は、0.2%　(w/v)　vitamin　B₁、0.001%　(w/v)　vitamin　B₂、0.001%　(w/v)　vitamin　B₁₂である。element　solutionの組成は、3%　(w/v)　EDTA　do-sodium、0.145%　(w/v)　FeCl₃・6H₂O、3.42%　(w/v)　H₃BO₃、0.43%　(w/v)　MnCl₂・4H₂O、0.1355%　(w/v)　ZnSO₄・7H₂O、0.013%　(w/v)　CoCl₂・6H₂O、0.01%　(w/v)　CuSO₄・5H₂Oである。

（脂質抽出）
　３日間培養した100mlの培養液を遠心分離（4℃、3,000×g,5min）して上清を除去した。1.75%　SEA　LIFEで洗浄後再度遠心分離して細胞を回収し、凍結乾燥により乾燥細胞を得た。得た乾燥細胞の重量を測定し、等量の水と200倍量のchloroform(C)/methanol(M)=2/1を加えて超音波で脂質を抽出した。濃縮乾固し、C/M/water(W)=8/4/3を加えて遠心分離（600×g,5min）し、下層を回収、乾固したものを総脂質とした。

（未知糖脂質の単離・精製）
　Sep-Pak　plus　silica　cartridge（Waters社製）にメタノール、アセトン、クロロホルムを順に流してコンディショニングした。回収した総脂質を3mlのクロロホルムに溶解し、全量をSep-Pak　plus　silicaカラムへ供試した。10mlのクロロホルムによって中性脂質を溶出した後、C/acetone(A)=80:20(vol%)で溶出した。

（薄層クロマトグラフィー(TLC)解析）
　Sep-Pak　plus　silicaカラムで分取した溶出液を乾固した後、C/M=2/1に溶解して、2mg　DCW分の脂質をTLCプレート（TLC　Silica　Gel　60,　Merck）に負荷した。
　C/M/W=65/25/4(v/v/v)を展開溶媒とし、オルシノール硫酸(0.2%オルシノール、11.4%硫酸)で発色した。

（試験１の結果）
　A.　limacinum　mh0186の総脂質をTLCで検出すると、未知糖脂質のバンドは中性脂質のバンドと非常に移動度が近く、中性脂質が多すぎるために、バンドが見えなくなった。そのためSep-Pak　plus　silicaカラムを用いて、A.　limacinum　mh0186の総脂質から中性脂質、糖脂質、リン脂質を分離した。その結果、SGと共にアセトン画分で検出された。次にSep-Pak　plus　silicaカラムを用いてSGを含まない未知糖脂質の単離方法を検討した結果、クロロホルム／アセトン=80／20で溶出すると未知糖脂質が単離できた（図３）。また、このバンドは標品のASGのRf値と一致していた。

＜試験２　未知糖脂質のＬＣ－ＭＳ解析＞
（未知糖脂質のシリカからの掻き取り）
　未知糖脂質をTLCプレートにアプライ（2mg　DCW分×7レーン）し、試験１と同様の条件で展開、バンドを検出した。検出したバンドをスパチュラーで掻き取った。

（スピンカラムを用いたシリカの除去）
　掻き取ったシリカに　C/M/W=65/25/4(v/v/v)を加えて超音波処理によって脂質を抽出した。遠心分離（600×g、5min）した後、上清を回収して乾固した。400μlのC/M=1/2と800μlのM/0.45%　NaCl=1/1を加えて懸濁し、MonoSpin　C18　FF（GL　Sciences社製）に供試した。遠心分離（1,000×g、1min）して廃液を除去し、この操作を３回行った。カラムに200μlの超純水を添加して遠心分離（1,000×g、1min）し、廃液を除去した。カラムに100μlのメタノールを添加して遠心分離（1,000×g、1min）し、溶出液を得た。

（LC-MS解析）
　未知糖脂質はLC-MS（3200　Q　TRAP、AB　SCIEX社製）によって構造を解析した。流速200μl/minで流し、カラムにInertSustain　C18（2.1×150mm、5μl、GL　Science社製）を用いてリン脂質、中性脂質と糖脂質を分離した。溶離液はA　(Acetonitrile/Methanol/H₂O=19/19/2(v/v/v)、0.1%　Formic　acid、0.028%　Ammonia)とbuffer　B（IPA、0.1%　Formic　acid、0.028%　Ammonia）を使用した。クラジエント条件は、3分間3%Bの後、21分間かけて40%B、1分間で70%Bにして、70%Bを7分間維持し、最後に3%Bに戻して7分間維持した。A:100%、B:0%(3min)→A:60%、B:40%(21min)→A:30%、B:70%(1min)→A:30%、B:70%(7min)に設定した。

（試験２の結果）
　結果を図４Ａ及び図５Ａに示す。未知糖脂質は、どちらもステロール骨格部分の質量数と一致する値が検出された。更にMS/MS/MS解析した結果、それぞれのステロール骨格に特徴的な部分の質量数と一致する値が検出された。これらの結果から、A.　limacinum　mh0186にはGL-A（3-O-b-D-glucopyranosyl-stigmasta-5,7,22-triene）やCG（コレステリルグルコシド）にDHAが付加したアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）が存在することが明らかになった（図４Ｂ、図５Ｂ）。具体的には、ＧＬ－ＡにＤＨＡが付加したＤＨＡ－ＧＬ－Ａ（図４Ｂ、構造式（Ｉ））と、ＣＧにＤＨＡが付加したＤＨＡ－ＣＧ（図５Ｂ、構造式（ＩＩ））が存在することがわかった。

＜試験３　ＡＳＧの脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）解析＞
　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）に結合している脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で解析した。

（試験３の結果）
　結果を図６に示す。未知糖脂質には、ＤＨＡ（Ｃ２２：６）やパルミチン酸（Ｃ１６：０）が多く存在することがわかった。

＜試験４　ＡＳＧの分子種解析＞
　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）におけるステリルグルコシド（ＳＧ）と脂肪酸の組み合わせをＬＣ－ＭＳで解析した。

（試験４の結果）
　結果を図７に示す。ＤＨＡが付加したＡＳＧが最も多く特に、ＤＨＡ－ＣＧ（図５Ｂ）、ＤＨＡ－ＧＬ－Ａ（図４Ｂ）が多く存在していた。また、ＤＨＡ－ＧＬ－Ｃ（構造式（ＩＩＩ））も存在していた。なお、SGはGL-A、GL-B、GL-C、CGの順に多く存在していた。
　ＤＨＡが付加したアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）は、これまでに報告のない新奇な構造であった。

＜試験５　ＡＳＧの脂肪酸と糖の結合解析＞
　LC-MSの解析結果より、未知糖脂質はSGに脂肪酸が結合したアシルステリルグルコシド（ASG）であると考えられた。植物ではASGはグルコース6位の炭素に脂肪酸がエステル結合した構造が報告されている。そこで、A.　limacinum　mh0186のASGも同様にSGに脂肪酸がエステル結合した構造であるかどうかを明らかにするために弱アルカリ分解とβグルコシダーゼ（ＥＧＣｒＰ２）で処理をした（図８）。

（弱アルカリ分解）
　精製した未知糖脂質（4mg凍結乾燥細胞重量）に90μlのC/M=1/2と10μlのNaOHを加え、37℃でインキュベートした。2時間後、常温に戻して6μlのメタノールで10倍希釈した酢酸を加えて中和した後窒素乾固した。

（未知糖脂質の精製）
　乾固した反応後の未知糖脂質を、200μlのC/M=1/2に溶解し、試験２と同様の方法で脱塩した。抽出液を窒素乾固した。

（βグルコシダーゼ処理）
　弱アルカリ分解した未知糖脂質に、全量20μlになるように50mMのAcetate　buffer（pH5.0）、0.025%　Sodium　Cholateと500ngのリコンビナントEGCrP2を加えて、37℃で24時間反応させた。ネガティブコントロールとして、煮沸したEGCrP2を加えたものも用意し、同様の条件で反応させた。反応終了後、蒸発乾固した。

（TLC解析）
　乾固した脂質を、5μlのC/M=2/1に溶解して、全量をTLCプレートにアプライした。C/M/W=65/25/4を展開溶媒として展開し、オルシノール硫酸で発色した。

（試験５の結果）
　弱アルカリ分解とβグルコシダーゼ処理の結果、未知糖脂質はEGCrP2に耐性であるが、弱アルカリ分解することで、EGCrP2によって分解された（図９）。本試験の結果から、未知糖脂質がステリルグルコシド（ＳＧ）に脂肪酸がエステル結合したアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）であることが分かった。

＜試験６　培養時期におけるＳＧ・ＡＳＧ量の比較＞
　試験６では、A.　limacinum　mh0186の培養時期におけるSGとASG量の変化をLC-MSで解析した。

（A.　limacinum　mh0186　の培養と増殖曲線の作製）
　3mlのGY培地（0.1%　vitamin　mixture、0.2%　element　solution）で前培養した細胞を、初期濃度がOD₆₀₀=0.02となるように100mlのGY培地（300ml容三角フラスコ、0.1%　vitamin　mixture、0.2%　element　solution含有）に加えて振とう培養した（150rpm、25℃）。24時間毎にOD₆₀₀を測定した。

（グルコース濃度の測定）
　1mlの培養液を24時間毎に回収し、遠心分離（4℃、3,000×　g、5　min）して上清を回収した。超純水で、培養1日目の上清を100倍、2日目、3日目の上清を50倍、4日目の上清を10倍、5～9日目の上清を5　倍に希釈した。また、検量線作成のためにグルコース標準液（200　mg/dL）の2倍希釈系列を作製し、10μlずつ分注した。
　96穴プレートの各ウェルに、10μlの希釈済み培養液と発色試薬（グルコースCIIテスト、Wako）を加え、室温で15分間インキュベートした後、MULTISKAN　FC（Thermo　SCIENTIFIC社製）でOD₄₉₂を測定した。

（細胞の回収と脂質抽出）
　1mlの培養培地を24時間毎に回収し、遠心分離（4℃、3,000×g、5min）して上清を除去した。1.75%　SEALIFEで洗浄後、凍結乾燥細胞を得た。4mgの乾燥細胞を測り取り、300μlのインターナルスタンダード（20　μM　EG,　10μM　ASG(18:0-sitosteryl　glucoside)、TG（12:0/12:0/12:0）、PC（11:0/11:0）、LPC（13:0）、PE（12:0/12:0）、LPE（13:0）、SE（16:0-d7　cholesterol）、d7　cholesterol）含有C/M=2/1を加え、10分間超音波で脂質を抽出した。遠心分離（4℃、15,000rpm、5　min）し、上清を回収した後、75μlの超純水を加えて遠心分離（4℃、15,000rpm、5　min）し、下層を回収した。

（LC-MS解析）
　回収した下層のうち100μlを、900μlの2-プロパノールを入れたオートサンプラーバイアルに加え、5μlをLC-MSに供試した。LC-MS条件は試験２と同様である。

（試験６の結果）
　結果を図１０乃至１３に示す。図１０は細胞の増殖曲線であり、図１１は培養液に含まれるグルコース濃度の経時変化、図１２はステリルグルコシド（ＳＧ）量の経時変化、図１３はアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）量の経時変化を示す。

　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）は対数増殖期に増加し、定常期以降で減少したが、ステリルグルコシド（ＳＧ）は定常期以降に増加傾向にあった。
　これらの結果から、炭素源が十分にある時にはDHAはSGに結合して体内に蓄積されるが、グルコースが枯渇して栄養がなくなると、SGに結合していたDHAが遊離し、エネルギー源となることが考えられた。したがって、アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）がステリルグルコシド（ＳＧ）のリザーバーとして働いている可能性が示唆された。

＜試験７　出芽酵母におけるＡＳＧ合成酵素の探索＞
　ASG合成酵素に関して、TGリパーゼが脂肪酸をSGに転移する（仮説１、図１４（ａ））、またはホスホリパーゼが脂肪酸をSGに転移する（仮説２、図１４（ｂ））、という２つの仮説を考えた。２つの仮説のうち仮説１を、出芽酵母を用いて検証した。

（出芽酵母におけるオレイン酸添加によるSGとASG量の比較）
　出芽酵母は、培地にオレイン酸を添加することで大きな油滴を作る。そこで、培地にオレイン酸を添加し、大きな油滴を作らせることによって出芽酵母の持つTG量を増加させ、SGとASG量の変化をLC-MSで解析した。また、出芽酵母野生株はSGをほとんど持っていないため、本試験では、出芽酵母の主要ステロールであるエルゴステロールにUDP-GlcからGlcを転移し、エルゴステリルグルコシド(EG)を合成するUgt51を過剰発現させたEG過剰蓄積株を用いた。
（出芽酵母UGT51OE/egh1KO株の培養）
　UGT51OE/egh1KO株を用い、3mlのYPD培地（2.0%　(w/v)　D-glucose、1.0%　(w/v)　Polypeptone、1.0%(w/v)　Yeast　Extract）で前培養した細胞を、初期濃度OD₆₀₀=0.2となるように3mlのYPD培地に加えた。YPD培地に、エタノールに溶解した3μlの1μg/μlオレイン酸を添加し、24時間振とう培養した（150　rpm、30℃）。ネガティブコントロールとして3μlのエタノールのみを添加したものも用意し、同様の条件で培養した。

（細胞の回収と脂質抽出）
　24時間培養した3mlの培養培地を遠心分離（4℃、3,000×g、5　min）して上清を除去した。PBS溶液で洗浄後、再度遠心して細胞を回収し、凍結乾燥により乾燥細胞を得た。4mgの乾燥細胞を測り取り、300μlのインターナルスタンダード（20μM　CG、10μM　ASG(18:0-sitosteryl　glucoside)、TG(12:0/12:0/12:0)、PC(11:0/11:0)、LPC(13:0)、PE(12:0/12:0)、LPE(13:0)、SE(16:0-d7　cholesterol)、d7　cholesterol）含有C/M=2/1を加え、10分間超音波で破砕した。遠心分離（4℃、15,000rpm、5　min）して上清を回収した。75μlの超純水を加えて遠心分離（4℃、15,000rpm、5min）し、下層を回収した。

（LC-MS解析によるSG・ASG量の測定）
　回収した全量の下層をオートサンプラーバイアルに入れ、5μlをLC-MSに供試した。LC-MS条件は試験２と同様である。

（TGリパーゼ(tgl3,　4,　5)欠損株のSG・ASG量の測定）
　TGリパーゼ（tgl3、tgl4、tgl5）欠損株を用いた。3mlのYPD培地で前培養した細胞を、初期濃度OD₆₀₀=0.02となるように3mlのYPD培地に加え、24時間振とう培養した（150rpm、30℃）。前述の方法で脂質抽出をしてLC-MSによってSG・ASGの含有量を解析した。

（TGリパーゼ欠損株におけるAEG量解析）
　TGリパーゼがAEG合成酵素であれば、TGリパーゼを欠損することでAEG量が減少すると考えた。そこで、出芽酵母は主要なTGリパーゼとして　Tgl3,　Tgl4,Tgl5を持つので、tgl3、tgl4、tgl5欠損株における　ASG　量を測定した。

（試験７の結果）
　結果を図１５に示す。LC-MS解析の結果、EGと、EGに脂肪酸が付加したアシルEG（AEG）は野生株では検出されなかったが、EG過剰蓄積株ではEGとAEGが共に検出された（図１５（ａ））。AEGの脂肪酸の種類は、16:0、16:1、18:0、18:1であった（図１５（ｂ））。また、EG過剰蓄積株では、オレイン酸の有無によってEGはほとんど変化しなかったが（図１５（ａ））、AEGはオレイン酸添加によって増加傾向にあった（図１５（ｂ））。これらの結果より、出芽酵母においてTGの量が増えることがAEG量の増加と関係していること、また、出芽酵母がAEG合成酵素を持っていることが示唆された。

　また、LC-MS解析の結果、tgl3、tgl4、tgl5を欠損するとAEG量は減少傾向にあった（図１５（ｃ））。この結果はTGリパーゼが脂肪酸をSGに転移するという仮説１を支持していた。

＜試験１～７のまとめ＞
（１．未知糖脂質の構造決定）
　未知糖脂質は、クロロホルム：アセトン＝８０：２０で溶出した。
　未知糖脂質をＬＣ－ＭＳ、弱アルカリ分解、βグルコシダーゼ処理で解析した結果、未知糖脂質はステリルグルコシド（ＳＧ）のグルコースにＤＨＡかパルミチン酸などの脂肪酸がエステル結合したアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）であった。
　ＤＨＡがステリルグルコシド（ＳＧ）に付加したアシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）は新奇な構造であった（図１６）。

（２．培養時期におけるＳＧ・ＡＳＧ量の比較）
　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）は対数増殖期に増加し定常期以降で減少した。一方、ステリルグルコシド（ＳＧ）はグルコース枯渇後、増加傾向にあった。
　アシルステリルグルコシド（ＡＳＧ）が中性脂質やリン脂質と同様に、ＤＨＡ蓄積のリザーバーとして働いている可能性が示唆された（図１７）。

＜試験の考察＞
　ラビリンチュラ類の糖脂質に関して、SGについては構造決定と生物機能の解明が進んでいる。しかし、ラビリンチュラ類にはSGとは別に、構造の不明な未知糖脂質が存在しており、本研究ではこの未知糖脂質の構造決定と合成酵素の解明を目的とした。

　未知糖脂質の構造決定の結果、未知糖脂質はDHAやパルミチン酸がSGに付加したASGであった（図４Ｂ、図５Ｂ、図６、図７）。ASGはこれまでラビリンチュラ類において報告はなく、またDHAの付加した構造はこれまでに他生物においても報告のない新奇な構造であった。

　ラビリンチュラ類はDHAなどの高度不飽和脂肪酸をTGやSEとして油滴に蓄積する特徴がある。本試験において培養時期におけるSGとASG量を測定した結果、SG量は培養時期による変化がほとんど見られなかったのに対し、ASGは対数増殖期に増加し、定常期に入った後に減少していた（図１２、図１３）。このことから、ASGがTGやSEと同様にDHAのリザーバーとして働いている可能性がある。

　DHAには抗炎症効果などがあることが知られているが、米ぬか抽出油に含まれるASGには、上昇した血中LDL-コレステロールを低下させる役割があることが報告されていることから、DHAが結合したASGはDHAの機能性だけでなくASGとしての機能性の両方を生かして、健康食品やサプリメントとしてヒトに応用可能である。

　ラビリンチュラ類のSGは少なくとも４種類存在する（図１）。これまで、真菌類やヒト線維芽細胞でSGは、熱ストレスで増加することが報告されている。ラビリンチュラ類においてもSGが熱ストレスによって増加することから、ラビリンチュラ類の持つ環境適応機構の発達にSGが重要な役割を持つことが示唆されており、ASGも同様に環境適応機構に関連した機能を持つ可能性が考えられる。

＜試験８　A.　limacinum由来DHA-GL-Cのリパーゼによる分解＞
（試験８の方法）
　DHA-GL-Cと25Uの豚膵臓リパーゼを混合し、サーモミキサーで37℃、750rpmで反応させ、C/M=2:1を加えて反応を停止させた。
　(A)28時間リパーゼと反応させた分解物をTLCに載せ、C/M/W=65/16/2で展開し、硫酸銅試薬（3%硫酸銅を15%リン酸溶液に溶解）で発色させた（図１８において四角で囲ったレーン）。比較対照としてトリアシルグリセロール（TG）を同量のリパーゼで分解した（右２つのレーン）。
　(B)反応の時間経過後、反応物をLC-MSで定量した。

（試験８の結果）
　結果を図１８及び１９に示す。
　(A)DHA-GL-Cはリパーゼによって分解を受け、DHAとSG（GL-C）が遊離した（図１８、＋はリパーゼ添加、－は無添加）。
　(B)DHA-GL-Cのリパーゼによる分解は反応時間に依存し、反応時間の経過とともにDHA-GL-Cが減少し、遊離SG（GL-C）が増加した（図１９）。

＜試験９　A.　limacinum由来DHA-GL-CとDHAの酸化測定＞
（試験９の方法）
　1mg乾燥細胞重量から精製したDHA-GL-CまたはDHA(5nmol)に100μlの50mMリン酸バッファーpH7.3を加え、容器のフタを開けた状態でUV照射（254nm、51μW/cm²、ランプからサンプルまで35cm、23℃）。
　照射終了後、200μlのC/M=2/1を加えて脂質を抽出、LC-MSでDHA-GL-CとDHAを定量した。

（試験９の結果）
　結果を図２０に示す。DHAはUV照射１時間で約５０％が酸化されたが、DHA-GL-Cは照射３時間でも全く酸化されなかった。したがって、DHA-GL-Cの方がDHAよりも酸化されにくいことが示された。

　UV照射による酸化試験の結果、DHAがエステル結合しているASGは体内で安定な形で存在し、リパーゼで分解されると遊離DHAと同様にレゾルビン、プロテクチン等の機能性代謝物に変換される可能性があることがわかった。

Claims

　下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表されるアシルステリルグルコシド。
　ラビリンチュラを用意するラビリンチュラ用意工程と、
　前記ラビリンチュラからアシルステリルグルコシドを含有するアシルステリルグルコシド画分を分離する分離工程と、
　前記分離工程で分離した前記アシルステリルグルコシド画分から前記アシルステリルグルコシドを精製する精製工程と、
　を行うことを特徴とするアシルステリルグルコシドの製造方法。
　前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸又はパルミチン酸がエステル結合したものであることを特徴とする請求項２に記載のアシルステリルグルコシドの製造方法。
　前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸がエステル結合したものであることを特徴とする請求項３に記載のアシルステリルグルコシドの製造方法。
　前記アシルステリルグルコシドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表される１種以上であることを特徴とする請求項４に記載のアシルステリルグルコシドの製造方法。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを含有し、
　食品組成物、医薬組成物、化粧料組成物から選択される組成物であることを特徴とする組成物。
　前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸又はパルミチン酸がエステル結合したものであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
　前記アシルステリルグルコシドは、ステリルグルコシドにドコサヘキサエン酸がエステル結合したものであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
　前記アシルステリルグルコシドは、下記構造式（Ｉ）、構造式（ＩＩ）又は構造式（ＩＩＩ）で表される１種以上であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
　前記組成物が、食品組成物であることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか一項に記載の組成物。
　前記組成物が、医薬組成物であることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか一項に記載の組成物。
　前記組成物が、化粧料組成物であることを特徴とする請求項６乃至９のいずれか一項に記載の組成物。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗酸化剤。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する発毛又は育毛剤。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する血中脂質低下剤。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗肥満剤。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
　ラビリンチュラ由来のアシルステリルグルコシドを有効成分として含有するアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤。