WO2019050101A9 - 3차원 세포배양 용기 - Google Patents

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WO2019050101A9
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김정아
김영혜
유영준
정석
양지훈
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한국기초과학지원연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional cell culture container. More specifically, as a container for facilitating three-dimensional cell culture, an experimenter can accurately inject a certain amount of a cell sample into a container at a predetermined height, and the cells injected into the container can appropriately perform medium and substance exchange And to facilitate the observation of the result of cell culture.
  • Living cell-based analytical techniques are used in a variety of basic studies, as well as in drug development and pharmacodynamic tests.
  • Cell-based analysis technology is superior to conventional biochemical analysis or analysis method using experimental animal model in terms of human biomolecule, and it is economical in terms of time and cost, and thus demand of related industry is increasing.
  • the cell-based analysis technique can investigate drug characteristics and efficacy reflecting the environment in the human body such as measurement of drug permeability through cellular cofactors, even though it is an in vitro analysis, and thus it is possible to study the whole molecular mechanism related to drug reaction .
  • 3-dimensional cell-based analysis technology is advancing day by day.
  • 3-dimensional cell-based analysis technology that more accurately simulates the environment or disease state is actively being developed.
  • the cell culture model of the three-dimensional cell culture is increasing.
  • the three-dimensional cell culture model mimics the in-vivo state and thus can realize the directional growth and complexity of cell-cell connection in an in vitro experiment.
  • the three-dimensional cell culture model has improved cell survival
  • the three-dimensional cell culture model is useful for capturing signal transduction and drug responses of various disease states to the two-dimensional cell culture model in studying molecular-based tissue function.
  • the present invention has been made to solve the conventional problems, and it is an object of the present invention to provide a method of inserting a certain amount of cells into a cell culture container safely,
  • the present invention also provides a cell culture container for supporting a cell sample so that the height of the cell sample can be kept constant so that the result of the cell culture can be easily observed with a microscope.
  • a cell culture container includes a lower plate 120; A barrier portion formed of two or more pillars (110) provided on the upper side of the lower plate; An upper plate 130 closing an open end of the barrier portion; And at least one cell sample injection guide unit 220 provided at one side of the upper plate.
  • the cell culture container may be formed as a horizontally arrayed array or a vertically arrayed array including a microplate type and a connection form of an incubator.
  • the cell sample injection guide part may be located on one side of at least one side of the cell culture container, and may have a hole structure that can be relied on by an experimental apparatus such as a pipette, which is a tool for injecting a cell sample.
  • the plurality of columns are composed of two or more columns, the diameter of the column is 20 ⁇ ⁇ or more and 2,000 ⁇ ⁇ or less, the spacing between the columns is preferably 10 ⁇ ⁇ or more and 2,000 ⁇ ⁇ or less, And may be arranged in a circular shape.
  • the diameter of the cell culture portion surrounded by the plurality of columns is suitably 0.1 mm or more and 10 mm or less.
  • the upper plate portion may be connected to the column portion at a right angle to be parallel to the lower plate, and the interval between the upper plate portion and the lower plate is preferably 0.05 mm or more and 5 mm or less.
  • the sample containing cells can be injected in a stable and precise position by resting on the guide part of the injection port.
  • the guide of the injection port is provided so that the flow of the sample is directed toward the culture container, It can act as a barrier.
  • the upper plate and the plurality of pillars facilitate the uniform and uniform injection of the sample, thereby facilitating the work of the experimenter, and also acting as a barrier to prevent the specimen in the form of a gel having a predetermined interval from escaping to the outside
  • the cell can be stably cultured by opening a space for exchanging the substance with the medium in the outer cell.
  • the top plate parallel to the bottom surface determines the height of the sample so that the height of the three-dimensional cell culture remains constant.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a structure of a three-dimensional cell culture container according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing that a configuration of a three-dimensional cell culture container according to an embodiment of the present invention can be manufactured in an array form or a plate form.
  • FIG. 3 is a schematic view illustrating an example of a method of manufacturing a container for implementing an embodiment of the present invention and a three-dimensional cell culture process.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of an experiment for deriving an appropriate interval of a cell culture container column considering a surface tension when injecting a cell sample.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the diameter of the culture part and the spacing of the column on the loading success rate of the sample liquid according to the change of the surface property of the container.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of an experiment in which the degree of substance exchange with the medium was checked according to the diameter of the cell culture section through actual cell culture and differentiation experiments.
  • the cell culture container according to the present invention comprises a lower plate 120; A barrier portion formed of two or more pillars (110) provided on the upper side of the lower plate; An upper plate 130 closing an open end of the barrier portion; And a cell sample injection guide unit 220 provided on one side of the upper plate.
  • the cell culture container of the present invention can be used in a variety of fields such as transparent ceramics including glass, silicone rubbers containing at least one of polydimethylsiloxane (PDMS) and ecoflex, polystyrene, polymethylmethacrylate At least two of engineering plastics, transparent ceramics, silicone rubbers and engineering plastics including at least one of polymethylmethacrylate, polypropylene, polycarbonate and polyurethane At least one of a chemical modification of a transparent ceramic, a chemical modification of a transparent ceramic, a chemical modification of a silicone rubber, a chemical modification of an engineering plastic, or a chemical modification of a transparent ceramic, a chemical modification of a silicone rubber, And mixtures thereof. It may also include one or more materials that can be used as 3D printer materials, such as photocurable plastics, films, thermoplastic plastics, and metals, or may include both chemical modifications thereof.
  • 3D printer materials such as photocurable plastics, films, thermoplastic plastics, and metals, or may include both chemical modifications thereof
  • the cell sample injecting section of the cell culture container according to the present invention can be located at one side of the cell culture container configuration.
  • the cell sample injecting unit preferably has a circular hole structure so as to guide a discharge port such as a pipette or a needle for injecting a cell sample. And a barrier structure for guiding the flow of the liquid so that the sample does not escape from the column around the sample inlet and is filled toward the inside of the culture section.
  • the columnar part serving as a barrier tends to have a smaller spacing between columns as the diameter of the column becomes smaller.
  • a too narrow gap may increase the possibility of material exchange between the cell and the culture medium, or the formation of bubbles in the gap, and an excessively large gap may cause a balance between the surface energy and the tension between the column and the sample, There is a high possibility that the water will escape from the column.
  • the spacing between the columns is suitably between about 200 ⁇ ⁇ and 400 ⁇ ⁇ , and the cell sample is suitable for seating inside.
  • the number of columns is made up of a number suitable for forming a space in which the cell sample can be seated, and 1 to 100 cells are suitable.
  • the cross section of the column may exist in various forms such as a polygonal shape as well as a circular shape to control the interfacial tension.
  • the form of the cell culture container according to the present invention may preferably be other than circular or circular.
  • the width of the cultivation area should be such that oxygen and nutrients to be supplied to the cells inside the cell can be smoothly supplied, and the cell culture section can have a circular shape with a diameter of about 0.1 mm to about 10 mm. When the size is too small, it is difficult to supply a sufficient amount of cell sample. Too large diameter (diameter of the inscribed circle when the culture portion is polygonal) is not suitable as a cell incubator due to restriction of mass transfer to the side.
  • the top plate of the cell culture container according to the present invention may be in the form of being connected to the column portion at a right angle and being parallel to the bottom surface.
  • the height between the top plate and the bottom surface should be appropriately spaced so that the result of the cell culture can be observed with a microscope, preferably between 0.05 mm and 5 mm.
  • a microscope preferably between 0.05 mm and 5 mm.
  • the thickness is less than 0.05 mm, it is difficult to secure a sufficient number of cells to be observed within the observation range. If the thickness is more than 5 mm, it is inappropriate to observe the result of the cell culture under a microscope.
  • the cell spacing is set to 200 ⁇ m to obtain the proper spacing between the pillars.
  • Cell sample loading experiments were carried out at intervals of 100 ⁇ m up to 400 ⁇ m.
  • Collagen 2mg / ml was used as the injection sample, and the diameter of the column was 300 ⁇ m.
  • the thickness of the top and bottom surfaces was fixed at 250 ⁇ m.
  • the interface of the gel sample tends to protrude to the outside of the column as the distance between the columns increases from 200 ⁇ m to 400 ⁇ m. That is, at larger intervals, the sample may leak out of the column, so an optimal spacing is required depending on the diameter of the column and the diameter of the culture.
  • the column diameter is fixed at 300 ⁇ m, the gel-like cell sample is not eluted outside the column at the interval of the column between 200 ⁇ m and 400 ⁇ m, and it is appropriately located inside the bar made of the column due to its tension I could confirm.
  • the success rate of the sample to be injected into the vessel was investigated after hydrophilic treatment (plasma treatment) of the cell incubator and column surface.
  • the surface energy of the vessel is high and the hydrophobicity is gradually recovered as time passes.
  • the wettability of the sample is improved when the column surface is hydrophilic, so that the sample easily flows out from the column, the sample loading failure rate is increased, As the hydrophobicity is restored, the surface tension of the liquid increases the success rate of sample loading.
  • Figure 5 (a) shows the probability of successful loading of the sample with time on the hydrophilic surface.
  • the loading success rate of the sample gradually increases and it is close to 100% after 8 hours. This shows that the column structure can be successful in sample loading.
  • Fig. 5 (b) the effect of the diameter of the cell culture part on the loading success rate was examined. It was observed that the larger the diameter of the culture area on the highly hydrophilic surface (1 h, time after plasma treatment), the higher the probability of the solution leaking out of the surrounding column before the sample was finally filled in the culture. It gradually decreased with time to restore the hydrophobicity, and after 8 hours, the loading success rate reached 100% regardless of the diameter.
  • the sample loading probability was measured according to the interval between the columnar portions around the culture portion of Fig. 5 (c).
  • the larger the distance between the columns the higher the probability that the sample leaks out of the column. This is because after 8 h the hydrophobicity is restored There was little failure rate without.
  • the results showed that the distance between the columnar part and the diameter of the culture part had an effect on the cell loading success rate, and the probability of cell loading on the surface with low surface energy reached almost 100% .
  • the diameter of the cell loading section is set to 1 mm from 2 mm to 5 mm, Respectively.
  • the thickness of the top and bottom surfaces was fixed at 250 ⁇ m.
  • ReN-VM Neurovascular stem cell
  • ReN-VM Neuro stem cell
  • the diameter of the cell culture range from 2 mm to 4 mm is well differentiated by the gel environment and the culture medium in which the neural stem cells are injected in the whole cell culture part. This confirms that the medium and the substance exchange smoothly throughout the whole sample range. However, when observed for a limited time period of 50 minutes, the degree of spread of the staining solution seems to be the most uneven in the 5 mm cell culture section. This means that the diameter of the cell culture section may be restricted to an infinite size.

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Abstract

본 발명은 3차원 세포배양 용기에 관한 것이다. 본 발명의 세포배양 용기는 하판(120); 상기 하판의 상측에 구비되는 둘 이상의 기둥(110)으로 이루어진 배리어부; 상기 배리어부의 개방된 단부를 마감하는 상판(130); 상기 상판의 일측에 구비된 하나 이상의 세포시료 주입 가이드부(220);를 포함하여 구성될 수 있다. 이러한 구성에 의한 본 발명은 세포를 포함하는 시료를 가이드부에 의지하여 안정적으로 정확한 위치에 주입할 수 있으며, 상판과 다수개의 기둥이 적정량의 시료를 손쉽고 균일하게 주입할 수 있도록 돕는 역할을 함으로써 실험자의 작업을 용이하게 하는 한편, 일정 간격의 기둥부가 젤 형태의 시료가 외부로 빠져나가지 못하도록 하는 배리어 역할을 하고 외부 셀에 있는 배지와 물질교환을 할 수 있도록 공간을 개방하는 역할을 함으로써 안정적인 세포배양을 할 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 04.04.2018]　3차원 세포배양 용기
본 발명은 3차원 세포배양 용기에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 3차원 세포배양을 용이하게 하기 위한 용기로서, 실험자가 일정량의 세포 시료를 일정한 높이로 정확하게 용기에 주입할 수 있으며, 용기에 주입된 세포가 배지와 물질교환을 적절하게 할 수 있고, 세포 배양 결과물의 관찰을 용이하게 할 수 있도록 하는 구조의 기기에 관한 것이다.
살아있는 세포를 기반으로 하는 분석기술은 다양한 기초연구를 비롯해 신약 개발 및 약동력학 시험에서 주요하게 활용되고 있다. 세포 기반 분석 기술은 기존의 생화학적 분석이나 실험동물 모델을 이용한 분석방법과 대비하여 인간 생체모사 측면에서 뛰어나며, 기간과 비용 면에서 경제적이어서 관련 업계의 수요가 증대되는 추세이다. 또한 세포 기반 분석기술은 생체 외 분석임에도 불구하고 세포성 보조인자를 통한 약물 투과성 측정 등 인체 내 환경을 반영한 약물 특성 및 효능을 연구할 수 있어 약물반응과 관련한 전체적 분자 메커니즘의 연구가 가능한 장점이 있다.
이러한 장점 때문에 세포 기반 분석기술은 날로 발전하고 있으며, 2차원 세포 기반 분석기술의 한계 극복을 위해 콜라겐, 세포외기질, 하이드로젤 등을 포함한 스캐폴드 구조를 사용해 배양한 3차원 세포를 기반으로 생체 내 환경 또는 질병 상태를 보다 정확히 모사하는 3차원 세포기반 분석기술의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히, 생체 내에서3차원접촉을 하고 있는 뉴런(neuron) 및 신경줄기세포(neural stem cell)를 가지는 뇌조직세포의 경우 상기 2차원세포배양모델의 한계로 인해서, 살아있는 조직의 공간적 구조와 생화학적 복잡성을 잘 모사하는3차원세포배양모델에 대한 관심이 높아지고 있다. 3차원세포배양모델은 생체 내 상태를 잘 모방하므로 생체 외실험에서 방향적 성장과세포-세포연결의 복잡성을 구현할 수 있고, 더불어3차원세포배양모델은 2차원세포배양모델에 비하여 개선된세포생존과 향상된 신경줄기세포분화를 보여준다.따라서,3차원세포배양모델은 분자 기반의 조직 기능을 연구하는데 있어서 2차원세포배양모델 대비 다양한 질병 상태의 신호기전과 약물 반응을 잘 포착하는데 유용하다.
3차원 세포배양과 이를 기반으로 하는 분석에서 신뢰성 높은 결과물을 얻기 위해서는 다양한 변수로부터 실험 대상 세포를 정확하게 제어하는 것이 필요하다. 특히 배양하고자 하는 세포시료를 배양장치 내 주입하는 과정에서 실험자의 능숙도에 따라 그 주입량 및 주입 형태 조절이 어려워 실험 결과물의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 겔 제형의 세포 시료를 배양용기의 내에 주입할 때 용기와 시료, 주변 기체와의 계면 에너지에 의해 세포가 평탄하게 주입되지 못하거나 주입된 세포 시료의 높이 차이로 인하여 배양 결과물의 현미경 관찰 및 정량적인 결과분석에 어려움이 있을 수 있다. 일정한 높이로 주입을 하는 장치가 있다 하더라도, 배양환경, 배지량의 제약, 주입방법의 복잡성과 같은 문제가 존재한다. 따라서 이러한 실험상의 곤란성을 해결할 수 있는 장치의 개발이 필요하다.
본 발명은 종래 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 실험자의 실험 능숙도를 보완하여 세포배양 용기에 일정량의 세포를 안전하게 주입하고, 세포시료가 주변 배지와 물질 교환을 용이하고 적절하게 할 수 있도록 세포시료를 지지하며, 세포배양 결과물의 현미경 관찰이 용이하도록 세포시료의 높이를 일정하게 유지하도록 하는 세포배양 용기를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 세포배양 용기는 하판(120); 상기 하판의 상측에 구비되는 둘 이상의 기둥(110)으로 이루어진 배리어부; 상기 배리어부의 개방된 단부를 마감하는 상판(130); 상기 상판의 일측에 구비된 하나 이상의 세포시료 주입 가이드부(220);를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 세포배양용기는 마이크로플레이트형태, 배양기의 연결형태를 포함하여 복수 개의 용기가 수평으로 어레이된 형태나 수직으로 배열된 형태로 제작될 수 있다.
상기 세포시료 주입 가이드부는 적어도 한 개 이상 상기 세포배양용기 일 측면에 위치할 수 있으며, 세포시료를 주입하는 도구인 파이펫 등의 실험기구가 의지할 수 있도록 도출된 홀 구조를 가질 수 있다.
상기 다수개의 기둥은 바람직하게는 둘 이상의 기둥으로 구성되며, 기둥의 지름은 20㎛ 이상 2,000㎛ 이하이고, 기둥간의 간격은 바람직하게는 10㎛ 이상 2,000㎛ 이하이고, 세포시료와 배지의 원활한 물질교환을 위하여 바람직하게는 원형으로 배치될 수 있다.
상기 다수개의 기둥으로 둘러싸인 세포배양부의 지름은 0.1㎜ 이상 10㎜ 이하인 것이 적절하다.
상기 상판부는 기둥부와 직각으로 연결되어 하판과 평행하게 위치할 수 있으며, 하판과의 간격은 0.05㎜ 이상 5㎜ 이하인 것이 적절하다.
이러한 구성에 의한 본 발명은 세포를 포함하는 시료를 주입구의 가이드부에 의지하여 안정적으로 정확한 위치에 주입할 수 있으며, 또한 주입구의 가이드는 시료의 흐름이 배양 용기 쪽을 향하고, 외부로 빠져 나가지 못하도록 배리어 역할을 할 수 있다. 상판과 다수개의 기둥이 적정량의 시료를 손쉽고 균일하게 주입할 수 있도록 돕는 역할을 함으로써 실험자의 작업을 용이하게 하는 한편, 일정 간격의 기둥부가 젤 형태의 시료가 외부로 빠져나가지 못하도록 하는 배리어 역할을 하고 외부 셀에 있는 배지와 물질교환을 할 수 있도록 공간을 개방하는 역할을 함으로써 안정적인 세포배양을 할 수 있다. 바닥면과 평행한 상판은 시료의 높이를 결정함으로써 3차원 세포배양물이 높이를 일정하게 유지하도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포배양 용기의 구조를 보여주는 사시도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포배양용기의 구성이 어레이 형태 혹은 플레이트 형태로 제작될 수 있음을 보여주는 사시도이다.
도 3는 본 발명의 실시 예를 구현하기 위한 용기의 제작 방법의 예시와 3차원 세포배양 과정을 묘사하는 모식도이다.
도 4은 세포시료를 주입 시 표면장력을 고려하여 세포배양 용기 기둥부의 적절한 간격을 도출하기 위한 실험의 결과를 보여주는 도이다.
도 5는 세포 배양부내에 세포시료액의 주입 형태를 확인한 실험으로, 용기의 표면성질의 변화에 따라 배양부의 지름, 기둥의 간격이 시료액의 로딩 성공률에 미치는 영향에 관한 결과를 보여주는 도이다.
도 6는 실제 세포배양 및 분화실험을 통하여 세포 배양부의 지름에 따라 배지와의 물질교환이 이루어지는 정도를 확인한 실험의 결과를 보여주는 도이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시 예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭하며, 길이 및 면적, 두께 등과 그 형태는 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다.
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시 예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 따르는 세포배양용기는 하판(120); 상기 하판의 상측에 구비되는 둘 이상의 기둥(110)으로 이루어진 배리어부; 상기 배리어부의 개방된 단부를 마감하는 상판(130); 상기 상판의 일측에 구비된 세포시료 주입 가이드부(220);를 포함한다.
본 발명의 세포배양용기는 유리(glass)를 포함하는 투명 세라믹류, 폴리디메틸실록세인(PolyDiMethylSiloxane; PDMS)과 에코플렉스(ecoflex) 중 적어도 하나를 포함하는 실리콘고무류, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리카보네이트(polycarbonate)와 폴리우레탄(polyurethane), 중 적어도 하나를 포함하는 엔지니어링 플라스틱류, 투명 세라믹류, 실리콘고무류와 엔지니어링 플라스틱류 중 적어도 두 개를 포함하는 혼합물, 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체, 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체, 또는 투명 세라믹류의 화학적 변형체, 실리콘고무류의 화학적 변형체와 엔지니어링 플라스틱류의 화학적 변형체 중 하나 또는 적어도 두 개를 포함하는 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 광경화형 플라스틱류, 필름, 열가소성 플라스틱 및 금속 등 3D 프린터 소재로 이용될 수 있는 소재를 하나 이상 포함하거나 이의 화학적 변형체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 세포배양용기의 세포 시료 주입부는 세포배양용기 구성의 일 측면에 위치할 수 있다. 세포 시료 주입부는 세포 시료를 주입하는 파이펫, 주사기 니들 등의 토출구를 가이드 할 수 있도록 바람직하게는 원형의 홀 구조를 갖는다. 또한 시료 주입구 주위로 시료가 기둥 밖으로 빠져 나가지 않고, 배양부 내부로 향하여 채워지도록 액체의 흐름을 가이드 하는 배리어 구조체가 포함될 수 있다.
본 발명에 따르는 세포배양용기의 다수개의 기둥부는 젤 형태의 세포시료가 그 표면장력에 의하여 기둥부 내부에 안착하는데 적절할 정도의 간격을 갖으며, 기둥의 간격은 10㎛ 에서 2,000㎛, 기둥의 지름은 20㎛ 에서 2,000㎛ 정도로 가능하다. 배리어 역할을 하는 기둥부는 기둥의 지름이 작을수록 기둥간의 간격도 작아지는 경향이 있다. 하지만 너무 좁은 간격은 세포와 배양액 사이의 물질 교환을 하는데 제약이 생기거나, 기포가 틈 사이에 형성될 가능성이 높아 질 수 있고, 너무 큰 간격은 기둥과 시료 간 표면에너지와 장력 간 균형이 깨지면서 시료가 기둥 밖으로 빠져 나갈 가능성이 높아진다. 실시 예에서처럼, 기둥의 지름이 300 ㎛일 때, 각 기둥간의 간격이 약 200㎛에서 400㎛ 사이가 적절하며, 세포시료가 내부에 안착하는데 적절하다. 또한 기둥의 개수는 세포시료를 내부에 안착시킬 수 있는 공간을 구성하기에 적절한 숫자로 구성되며 1개 이상 100개 이하가 적절하다. 기둥의 단면은 원형 외에 다각형 등 계면 장력을 조절할 수 있는 다양한 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따르는 세포배양용기의 형태는 바람직하게는 원형 혹은 원형외에 다른 형태도 무방하다. 배양부의 폭은 물질교환이 충분히 일어나 내부의 세포에 전달하는 산소와 영양분이 공급이 원활하게 일어날 수 있는 크기여야 하며, 세포 배양부가 원형일 때 그 지름을 기준으로 0.1mm에서 10mm 정도로 가능하다. 크기가 너무 작으면 충분한 양의 세포시료를 공급하기 어려우며, 너무 큰 지름(배양부가 다각형일 때 내접원의 지름)은 측면으로의 물질전달에 제약이 있어 세포배양기로서 적합하지 않다.
본 발명에 따르는 세포배양용기의 상판은 기둥부에 직각으로 연결되어 바닥면과 평행을 이루는 형태일 수 있다. 상판과 바닥면과의 높이는 세포 배양 결과물을 현미경으로 관찰하기에 적절한 간격을 갖도록 하며, 0.05㎜에서 5㎜ 사이가 적절하다. 0.05㎜ 이하일 경우 관찰범위 내에 관찰 대상 세포 수의 충분한 확보가 어려우며, 5㎜ 이상일 경우 관찰 대상이 되는 세포의 중첩 등의 문제로 현미경으로 세포 배양 결과를 관찰하기에 부적절하다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 바람직한 기둥부 간격 도출
일반적으로 사용되는 젤 형상의 세포시료와 용기 표면과의 표면에너지를 고려하여 세포시료가 용출되지 않고 다수개의 기둥으로 일루어진 배리어 내에 고정되기에 적절한 기둥 간 간격 도출을 위하여 기둥간의 간격을 200㎛에서 400㎛까지 100㎛ 간격으로 두고 세포시료 로딩 실험을 수행하였다. 주입 시료는 콜라겐 2mg/ml를 이용하였고, 이때 기둥의 지름은 300㎛로 하였다. 상판과 바닥면의 두께 (시료의 두께)는 250 ㎛으로 고정되었다.
실험결과, 도4에서 확인할 수 있는 바와 같이 200㎛에서 400㎛로 기둥 간의 간격이 커질수록 젤 시료의 계면이 기둥 바깥쪽으로 돌출되는 경향이 보인다. 즉 더 큰 간격에서는 시료가 기둥 밖으로 샐 수 있으므로 기둥의 지름 및 배양부의 지름에 따라 최적의 간격이 필요하다. 본 실험에서는 기둥지름을 300㎛으로 고정하였을 때 200㎛에서 400㎛ 사이의 기둥 간 간격에서는 젤 형태의 세포시료가 기둥 밖으로 용출되지 않고, 그 장력에 의하여 기둥으로 이루어진 배리어 내부에 적절하게 위치하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 용기 표면의 친수성 정도에 따른 시료주입의 성공률
본 실험에서는 세포배양기와 기둥 표면을 친수성으로 처리 (플라즈마 처리)한 후, 용기내로 주입되는 시료가 내부로 잘 안착되는 지 성공률을 조사하였다. 플라즈마 처리한 직후는 용기의 표면에너지가 높은 친수성이며, 시간이 지날수록 점차 소수성을 회복한다, 기둥 표면이 친수성일 때 시료의 젖음성이 좋아져서 시료가 기둥 밖으로 흘러나오기 쉽고, 시료 로딩 실패율이 높아지며, 소수성을 회복할수록 액체의 표면장력에 의해 시료 로딩의 성공률이 높아지게 된다. 본 실험에서는 기둥의 간격, 주입부 지름이 로딩에 미치는 효과를 극대화하기 위하여, 기둥 표면을 친수성으로 처리한 지 8시간 이내에 로딩에 얼마나 성공하는지를 확인하였다. 이 실험에서, 시료가 하나 이상의 기둥 밖으로 빠져나가면 실패, 기둥 안으로 성공적으로 안착하면 성공으로 정의하였다. 도 5(a)는 친수성 표면에서 시간의 변화에 따라 시료의 로딩에 성공하는 확률을 나타낸다. 그림에서와 같이 시간이 지남에 따라 친수성에서 소수성으로 변해가면서 시료의 로딩 성공률은 점차 높아져 8시간 이후에는 100%에 가까움을 보여준다. 이는 기둥 구조가 시료 로딩의 성공이 가능함을 보여준다. 도 5(b)에서는 세포배양부의 지름의 크기가 로딩성공률에 미치는 영향을 알아보았다. 매우 친수성인 표면 (1h, time after plasma treatment)에서 배양부의 지름이 클수록 시료가 배양부 내에 최종 채워지기 전에 주변 기둥 밖으로 용액이 새는 확률이 높아짐을 관찰하였다. 이는 소수성을 회복하는 시간에 따라 점차 줄어들어, 8시간 이후에는 지름크기에 상관없이 로딩 성공률이 100%에 달했다. 또한 도 5(c) 배양부 주변 기둥부의 간격에 따른 시료 로딩확률을 측정하였다. 마찬가지로, 매우 친수성인 표면에서 (1h, time after plasma treatment)에서 기둥 간 간격이 클수록 시료가 기둥 밖으로 새는 확률이 높음을 확인할 수 있었으며, 이는 시간이 지날수록 줄어들어 소수성이 회복되는 8h 이후에서는 간격에 상관없이 실패율이 거의 없었다. 이를 통해, 기둥부의 간격과 배양부의 지름이 세포 로딩 성공률에 미치는 효과를 확인할 수 있었으며, 표면에너지가 높지 않은 표면에서 세포 로딩의 확률이 거의 100%에 달해 매우 효과적으로 세포 시료를 채울 수 있음을 증명하였다.
실시예 3. 세포의 배지와의 물질교환 확인을 통한 세포 주입부 크기 도출
다수개의 기둥으로 이루어진 배리어 내부에 있는 세포시료와 배지의 물질교환이 적절하게 이루어질 수 있는 수준의 세포 주입부 크기 도출을 위하여 세포 로딩부의 지름을 2㎜에서 5㎜까지 1㎜ 간격으로 두고 물질교환 실험을 수행하였다. 상판과 바닥면의 두께 (시료의 두께)는 250 ㎛으로 고정되었다.
세포는 ReN-VM(Neural stem cell)을 이용하였으며, 세포 배양조건 및 관찰 기준은 아래와 같다.
Nameof cell: ReN-VM (Neural stem cell)
Matrigel concentration. : 5.7 mg/ml
Cell concentration. : 1.0 x 107 cells/ml
Culture period : 1 week
Staining method : FITC-phalloidin, 50 min
실험결과, 도6에서 확인할 수 있는 바와 같이 세포배양부의 지름이 2㎜에서 4㎜까지는 세포 배양부 전체에서 신경줄기세포가 주입된 젤 환경과 배양액에 의해서 분화가 잘 일어나고 있음을 확인할 수 있었다. 이는 곧 시료 전체 범위에서 배지와 물질교환이 원활하게 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 50분간 염색한 제한된 시간에서 살펴보면, 염색액이 퍼지는 정도는 5mm 세포배양부에서 가장 불균일하게 보인다. 이는 곧 세포배양부의 지름이 무한정 커지는 데 제약이 있을 수 있음을 의미한다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (8)

  1. 하판(120);
    상기 하판의 상측에 구비되는 둘 이상의 기둥(110)으로 이루어진 배리어부;
    상기 배리어부의 개방된 단부를 마감하는 상판(130);
    상기 상판의 일측에 구비된 하나 이상의 세포시료 주입 가이드부(220);를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양용기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기둥은 상판과 하판 사이에 방사상으로 배열되어 상기 배리어부는 원형으로 형성된 것을 특징으로 하는 세포 배양용기.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배리어부의 기둥 사이의 간격은 10㎛ 이상 2,000㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양용기.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 기둥의 내측 지름은 20㎛ 이상 2,000㎛ 이하 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양용기.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배리어부의 내측 지름은 0.1mm 이상 10mm 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양용기.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 상판과 하판의 간격은 0.05㎜ 이상 5㎜ 이하인 것을 특징으로 하는 세포배양용기.
  7. 제1항의 세포배양용기 구조를 복수개 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양 어레이.
  8. 제1항의 세포배양용기를 이용한 세포 배양 방법으로서,
    상기 세포배양용기의 세포시료 주입 가이드부에 따라 세포시료를 주입하는 단계; 상기 세포배양용기의 바닥면과 상판 및 배리어 내부에 세포시료를 채우는 단계; 및 상기 배리어 외부에 세포배양에 필요한 배지를 배치하는 단계를 포함하는 세포배양방법.
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