WO2019017811A1 - Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозгаишемического генеза - Google Patents

Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозгаишемического генеза Download PDF

Info

Publication number
WO2019017811A1
WO2019017811A1 PCT/RU2017/000956 RU2017000956W WO2019017811A1 WO 2019017811 A1 WO2019017811 A1 WO 2019017811A1 RU 2017000956 W RU2017000956 W RU 2017000956W WO 2019017811 A1 WO2019017811 A1 WO 2019017811A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
brain
chronic
mammal
biological fluid
autoantibodies
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000956
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Светлана Александровна ДАМБИНОВА
Галина Александровна ИЗЫКЕНОВА
Александр Анисимович СКОРОМЕЦ
Евгений Иванович ГУСЕВ
Михаил Юрьевич МАРТЫНОВ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ДРД"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ДРД" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ДРД"
Priority to JP2019572794A priority Critical patent/JP6989158B2/ja
Priority to CN201780083884.3A priority patent/CN110325862B/zh
Priority to EP17917909.8A priority patent/EP3657175A4/en
Priority to US16/307,491 priority patent/US10408829B2/en
Publication of WO2019017811A1 publication Critical patent/WO2019017811A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G01N33/541—Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Definitions

  • the invention relates to diagnostic tools, in particular to a method, device and a set of reagents for the rapid detection of chronic conditions of mammalian brain, in particular, chronic ischemia, endotoxic and cytotoxic edema (edema of the brain) developing in vascular and traumatic brain lesions, as well as risk of recurrent ischemic events.
  • the invention can be used for clinical examination or initial examination of patients who have previously suffered a traumatic brain injury, stroke or microstroke, and will allow for the most optimal therapeutic measures in neurology, traumatology, and sports medicine.
  • Stroke, as well as other acute and chronic pathologies of the brain of ischemic genesis represent a serious threat to the health and life of people.
  • the importance of early and highly specific diagnosis of these conditions is difficult to overestimate;
  • the speed, severity and other parameters of the patient’s recovery depend on the correct diagnosis. It is especially important to diagnose ischemic stroke in the first three to six hours from the onset of the disease for the possibility of thrombolytic therapy.
  • Diagnostics of such conditions is mainly based on neuroimaging methods, such as computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI), which are necessary to identify the affected brain areas and the extent of their damage.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • This invention has a number of properties necessary to solve the problem, and therefore can expand the arsenal of tools used to detect chronic brain lesions and the risk of repeated ischemic events.
  • NMDA receptors are a subclass of ionotropic glutamate receptors that selectively bind 1M-methyl-0-aspartate (NMDA).
  • the aim of the present invention is to create a method and device for the rapid and convenient detection of chronic conditions of mammalian brain of ischemic genesis, in particular, the risk of recurrent stroke or microstroke, delayed chronic ischemia associated with the formation of cerebral edema, with vascular or traumatic brain lesions leading to neuronal cell death.
  • a feature of this invention is that as a diagnostic marker, pathological antibodies are used that are produced on the hybrid fragments of NMDA neuroreceptors. Determining the level of antibodies on your own Protein fragments (autoantibodies) are preferable for chronic pathologies, since the effective formation of antibodies occurs in response to the repeated appearance of the antigen in the bloodstream. The level of specific autoantibodies to the NMDA neuroreceptors will correlate with the severity and extent of damage to the brain structures.
  • the hybrid peptide is formed from two different antigenic fragments and therefore allows the detection of antibodies to two different subunits of the NMDA of the receptor.
  • One of the variants of the invention includes a reagent kit (reagent kit) for diagnosing chronic pathology of the brain of a mammal of ischemic genesis, including a hybrid peptide having at least 90% identity along its entire length with the sequence SEQ ID NO: 1 (shown in the Sequence Listing), and immobilized on a solid carrier, as well as a reagent for determining the presence of autoantibodies to the above-mentioned hybrid peptide in a biological fluid of a mammal, having affinity for immunoglobulin mammals melting.
  • a reagent kit for diagnosing chronic pathology of the brain of a mammal of ischemic genesis, including a hybrid peptide having at least 90% identity along its entire length with the sequence SEQ ID NO: 1 (shown in the Sequence Listing), and immobilized on a solid carrier, as well as a reagent for determining the presence of autoantibodies to the above-mentioned hybrid peptide in a biological fluid of a mammal,
  • the hybrid peptide of the present invention includes both the sequence of SEQ ID NO: 1, and a sequence that is close enough to SEQ ID NO: 1, and contains insertions, substitutions or deletions of amino acids that do not violate, or hardly violate, functional properties of a hybrid polypeptide, such as affinity for autoantibodies that recognize the subunits of the NMDA receptor.
  • a biological fluid of a mammal blood, blood plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, vapors of respiration, or other body fluids containing antibodies can be used.
  • Examples of chronic brain pathologies of ischemic genesis are chronic ischemia, repeated and delayed strokes or micro strokes.
  • the reagent for determining the presence of autoantibodies is an agent that specifically binds a constant region of mammalian antibody molecules conjugated with an imaging agent.
  • an agent is protein A, isolated from the surface of the cell wall of Staphylococcus aureus, and having a high affinity for the constant region of the heavy chain (Fc domain) of IgG.
  • an agent can be a fragment of an antibody that recognizes the constant region of the heavy chain of IgG.
  • an agent is conjugated to an imaging agent.
  • Conjugation preferably occurs through the formation of a covalent bond between the two agents, but can be carried out in another way, provided that a stable functional complex is formed.
  • the imaging agent can be a gold nanoparticle, an organic dye, a magnetic nanoparticle, a carbon nanotube, or a fluorescent nanocrystal.
  • the solid carrier on which the hybrid peptide is immobilized is a cellulose nitrate membrane.
  • Some variants of the invention also include a diagnostic test strip for the accelerated detection of chronic brain pathology of ischemic genesis, having at least three zones arranged in series, namely, the sample application area, the reaction area and the detection area, the sample application area capable of absorbing biological liquid mammal and direct it to the zones of reaction and detection under the action of capillary forces;
  • the detection zone contains a test line on which the hybrid peptide is immobilized, having at least 90% identity along the entire length with the sequence of SEQ ID NO: 1;
  • the reaction zone located between the sample application and detection zones, contains a reagent for determining the presence of autoantibodies to the above-mentioned hybrid peptide in the biological fluid of a mammal, having affinity for the immunoglobulins of the mammal.
  • a reagent for determining the presence of autoantibodies is an agent that specifically binds a constant region of mammalian antibody molecules conjugated with an imaging agent, and a gold nanoparticle, an organic dye, a magnetic nanoparticle, a carbon nanotube or a fluorescent nanocrystal can act as an imaging agent.
  • Some embodiments of the invention also include a method for identifying patients with chronic brain pathologies of ischemic genesis, including sampling a mammalian biological fluid, applying the biological fluid sample to a diagnostic test strip of the present invention in the sample application area, and determining the presence of an imaging agent on the test line in the detection area of the diagnostic test strip.
  • the presence of an imaging agent on the test line is determined within 15 minutes or less after applying a sample of biological fluid on a diagnostic test strip.
  • the technical result of the present invention lies in the fact that this invention helps to solve the problem of a quick and objective assessment of the condition of a patient with chronic brain damage of ischemic origin and suspected of having another stroke.
  • a new hybrid peptide formed by merging two fragments of the NMDA neuro-receptor subunits with antigenic potentials has been isolated, analyzed and tested.
  • a device has been described that allows for rapid and convenient testing of autoantibodies present in a patient’s blood and recognizing a hybrid peptide. The presence of such antibodies indicates the presence of certain structural brain lesions and serves as an indicator of massive neuronal cell death.
  • the described approach extends the available tools used in the clinical examination or initial examination of patients who have previously suffered a traumatic brain injury, stroke or microstroke, and will allow for the most optimal therapeutic measures.
  • antibody is equivalent to the term "immunoglobulin” and means a glycoprotein formed in response to the introduction into the body of a mammal bacteria, viruses or other antigens, consisting of two heavy (H) chains and two light (L) chains connected by disulfide bonds.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region.
  • the constant region of the heavy chain consists of three domains - CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region.
  • the constant region of the light chain consists of one CL domain.
  • VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions, called complementarity determining regions (H-CDR and L-CDR), separated by more conservative regions.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen (i.e., the antigen-binding portion of the antibody).
  • the heavy-chain constant regions have fairly conservative amino acid sequences that have a high degree of homology for all antibody molecules of the same class.
  • the constant regions of an immunoglobulin molecule may contain different combinations of domains from the constant regions of heavy and / or light chains; in some embodiments, the constant region should be understood as the Fc region of an immunoglobulin molecule, which consists of a dimer formed by the CH2 and CH3 domains of two heavy chains.
  • the Fc region mediates the antibody's effector functions, that is, the interaction of an immunoglobulin molecule with tissues or host factors, including various cells of the immune system (for example, effector cells).
  • autoantibodies in the present description refers to antibody molecules that have been developed in the body of a mammal in response to antigens formed from proteins of its own body (autoantigens). Autoantibodies can be produced in response to autoantigens that are not normally present in the bloodstream, for example, hybrid fragments of neuroreceptors, or in response to hybrid proteins or peptides formed by the fusion of two or more protein fragments.
  • a reagent that has an affinity for immunoglobulins can be any chemical substance that can specifically bind to immunoglobulins and form a new complex object. At the same time, this reagent should not inhibit the binding of immunoglobulins to their specific antigens (antibody-antigen reaction).
  • percent identity of two sequences is determined by the number of positions of identical amino acids in these two sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space, which must be entered for optimal matching of two sequences by alignment. The percent identity is equal to the number of identical amino acids in these positions, taking into account sequence alignment, divided by the total number of positions, and multiplied by 100. The percent identity of two amino acid sequences can be determined using the free NCBI Protein BLAST program (https: //blast.ncbi.nlm .nih.gov /).
  • Fig. 1 Simplified structure of a diagnostic test strip in a plastic case.
  • 1 filter plate for applying a sample of a biological fluid
  • 2 - a plate containing a detection reagent and forming a reaction zone
  • 3 - a nitrocellulose membrane forming a detection zone
  • 4 - adsorbent pad
  • 5 sample well
  • 6 test line formed an immobilized hybrid peptide
  • 7 is a control line formed by immobilized antibodies that recognize constant regions of antibody molecules
  • 8 is a body of a plastic cassette, covering a diagnostic test strip.
  • Fig. 2 The results of the rapid diagnosis of chronic pathology of the brain after mild TBI. Patients_1 ° 1 - the left part of the figure (A), Patients_2 ° 2 - the right part of the figure (B). The level of autoantibodies in chronic cerebral ischemia was determined using a diagnostic test strip (upper part of the figure). Both patients confirmed the formation of cytotoxic edema using MRI (lower part of the figure). Legend: 11 control strip, 12 test strip.
  • ischemic stroke The key point in the pathogenesis of ischemic stroke is neurotoxicity and immunoexitotoxicity - a cascade of pathobiochemical changes that can lead to irreversible damage to the nervous tissue by the mechanism of apoptosis.
  • the characteristic for ischemia lack of oxygen and glucose intake can cause disruption of cellular ion pumps (which are ionotropic glutamate receptors) and excessive entry of Na + ions into the cell, which causes an increase in intracellular osmotic pressure and, accordingly, an excessive influx of water into the cell. This is the cause of the formation of cytotoxic swelling of the brain.
  • CNS central nervous system
  • peptide fragments of neuroreceptors peptide fragments of neuroreceptors
  • Applicants have found that significant quantities of fragments of neuroreceptors H YES appear during ischemic attacks, which are specific to the lesion of endogenous or cytotoxic edema. Neurotoxicity activates serine proteases that break down NMDA receptors into short peptides, some of which have immune activity.
  • both fragments of the NMDA neuroreceptors, and autoantibodies on them, can serve as markers of neuronal cell death (apoptosis).
  • Effective autoantibody formation requires a constant influx of immunoactive hybrid fragments of NMDA receptors into the bloodstream and can occur asymptomatically in individuals with previous factors (atherosclerosis, hypertension, diabetes) (Gonzalez-Garcia et al. J Neurol Sci. 2017; 375: 324-330).
  • the determination of the presence of autoantibodies to the neuroreceptors of NMDA in the blood can be used for the rapid examination of patients with suspected stroke or TIA, as well as for the assessment of symptomatic TIA.
  • the most effective production of autoantibodies occurs when cytotoxic edema is formed, when irreversible neuronal cell death occurs through apoptosis. In this case, there is a high probability of recurring ischemic attacks, as well as the development of chronic ischemia.
  • diagnosis of cytotoxic edema is carried out only with the help of diffusion spectral tomography, which requires time, significant instrumental resources and financial costs.
  • This invention describes the creation of a device (diagnostic test strips) to predict significant damage to the nervous tissue by detecting autoantibodies to NMDA neuroreceptors in the blood of patients using lateral flow immunochromatography.
  • a key aspect of creating such a device is the choice of antigen for the efficient and specific detection of autoantibodies.
  • the inventors analyzed various fragments of neuroreceptors NMDA circulating in the blood of patients with significant damage to the nervous tissue, and also analyzed the ability of these fragments to induce an autoimmune response. This ability is determined by the degree of similarity of peptide epitopes of NMDA fragments with other protein epitopes that are recognized by the immune system of the mammal and are not perceived as foreign. Also, the immunogenicity of a peptide is determined by its affinity for the receptors of the major histocompatibility complex; this affinity allows you to induce a T-cell immune response and the formation of IgG antibodies to peptides.
  • peptide fragments of the two subunits of the NMDA neuroreceptors namely the NR2A subunits (GRIN2A gene product) and NR2B (GRIN2B gene product) in different concentrations can be present in the blood of patients with significant damage to the nervous tissue.
  • NR2A subunits GRIN2A gene product
  • NR2B GRIN2B gene product
  • Such hybrid peptides are often more immunogenic than peptides derived from only one of the subunits, since the fusion of two peptides from different subunits can lead to the formation of neoantigens.
  • the applicants have isolated, purified and analyzed various hybrid peptides present in the blood of patients with chronic brain pathologies.
  • a hybrid peptide designed by combining the two subunits of the NR2A and NR2B subunits, as having significant antigenic potential.
  • the resulting peptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (shown in the Sequence Listing).
  • SEQ ID NO: 1 shown in the Sequence Listing.
  • NMDA autoantibodies The key parameters of the test system for NMDA autoantibodies will be specificity, the minimum level of autoantibody detection, ease of use and interpretation of the result, cost, and reliability.
  • the optimal level of these parameters can be obtained when implementing a test system based on lateral flow-through immunochromatography.
  • a diagnostic test strip is used, which has at least three zones arranged in series, namely, the sample application zone, the reaction zone and the detection zone, and the sample application zone, initially dry, is able to absorb the mammalian biological fluid and direct it to the reaction zones and detection under the action of capillary forces.
  • Various embodiments of such a construction are known in the art and may be used in the present invention.
  • a few drops of patient's freshly collected blood (20–80 ⁇ l) can be used.
  • the sample is placed in the zone of application of the sample, while the liquid migrates through a special filter plate to the reaction zone.
  • the material of the special lining can be selected to filter the blood and optimize the background signal by methods known to those skilled in the art, for example, using fiberglass materials.
  • the reaction zone contains an agent that can specifically bind a constant region of immunoglobulin antibody molecules, while this agent is conjugated with an imaging agent and is able to migrate under the action of capillary forces to the detection zone after binding to the immunoglobulin molecule.
  • an imaging agent In chronic brain lesions, there is a constant production of NMDA neuroreceptor fragments and their subsequent entry into the bloodstream.
  • an agent capable of specifically binding a constant region of IgG antibody molecules is used in the reaction zone.
  • an agent for example, can be protein A, isolated from the surface of the cell wall of Staphylococcus aureus, and having a high affinity for the constant region of the heavy chain of IgG.
  • protein A was conjugated to an imaging agent by methods known to those skilled in the art.
  • a substance capable of emitting detectable radiation can be used, or in which emission of detectable radiation can be caused (for example, by radioactive decay, chemical reaction, fluorescence excitation, spin resonance excitation, etc.).
  • an agent can be a gold nanoparticle, an enzyme (for example, horseradish peroxidase), an organic dye or a fluorescent nanocrystal (quantum dot), as well as other similar agents known to those skilled in the art.
  • the signal visualization in the detection zone can occur under wide spectrum daylight illumination or through the use of narrow-spectrum sources.
  • protein A was conjugated to a streptavidin molecule using a maleimide functional group;
  • biotinylated gold nanoparticles were used.
  • the final conjugation "protein A - gold nanoparticle” was carried out using the high-affinity biotin-streptavidin interaction.
  • the detection zone is a cellulose nitrate membrane with pores sufficient to pass through this complex.
  • membranes from the following manufacturers have been used: Sartorius (CN95, CN 140), Millipore (HF 90, HF 120, HF 180) or MDI (mdi70, mdi10p).
  • the membrane contains at least two bands, test and control, preferably located perpendicular to the fluid flow.
  • the test band is formed by immobilizing a selected hybrid peptide with the sequence of SEQ ID NO: 1 on the membrane, or at least 90% identical to it.
  • immobilization of the peptide on the membrane can be used various methods known in the art.
  • immobilization on the membrane was carried out by conjugating the peptide with bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the hybrid peptide may be conjugated to BSA using a maleimide functional group using a commercially available maleimide-BSA combination. Further, the peptide-BSA complex was directly deposited on the membrane in the area of the test strip and bound to the membrane during the drying process.
  • the control band is located farther from the test line along the fluid flow and is formed by immobilizing polyclonal anti-IgG antibodies on the membrane by methods known to those skilled in the art.
  • the complex “IgG autoantibody - protein A - gold nanoparticle” migrating from the reaction zone can first interact with the immobilized hybrid peptide, provided that autoantibody has an affinity for this peptide. Unbound complexes migrate further to the control band, where the binding of immobilized anti-IgG antibodies to these complexes occurs. Accordingly, when only the control band is developed, the test result is considered negative.
  • the visualization of the binding will be carried out using the imaging agent used, while the nature of the imaging agent will determine the way in which the detection will occur.
  • the gold nanoparticles used have good optical properties; when bonding on the strip and illuminated by daylight, they paint the strip in a dark golden color and allow for detection visually, without the aid of additional equipment.
  • the intensity of the signal will be proportional to the concentration of specific antibodies to the peptide present in the sample.
  • an adsorbent pad which maintains the flow of fluid along the membrane from the zone where the sample is applied to the detection zone and prevents backflow.
  • the described embodiment of the invention allows semi-quantitative analysis of the content of autoantibodies specific to the immobilized peptide.
  • the intensity and speed of the test strip will be determined by the concentrations of antibodies in the sample and can be compared with the color of the bands on the reference card, specially designed for a specific set of reagents.
  • the construction of the reference card can be performed by titrating a sample of specially prepared polyclonal antibodies to the hybrid peptide.
  • Example 1 The result of the determination of antibodies to the hybrid peptide using rapid diagnosis in chronic cerebral ischemia (with confirmed cytotoxic edema).
  • Example 2 The result of the determination of antibodies to the hybrid peptide using rapid diagnosis in chronic cerebral ischemia (with confirmed cytotoxic edema).
  • a diagnostic rapid test was made using the test strips of the present invention, as well as brain MRI in T2 FLAIR mode (Fig. 2B). In the MRI images, cytotoxic edema was detected (manifested as bright areas and points). Diagnostic rapid test showed the presence of two bands (Fig. 2B).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • T1, T2, T2 modes FLAIR, DWI, GRE magnetic resonance imaging
  • Other examination methods aimed at finding potential risk factors for cerebral circulation disorders.
  • atherosclerosis of the brachiocephalic and cerebral arteries was detected in 7 patients, hypertension in 5 patients, diabetes mellitus in 2 patients, arrhythmias in 2 patients.
  • Two patients were diagnosed with a combination of three risk factors.
  • the control group consisted of 12 relatively healthy volunteers, selected according to the average age, identical to the average age of the test group of patients. Upon admission to the hospital, capillary blood was taken from the patients, 80 ⁇ l of the sample was placed in a special rapid test window, 10 ⁇ l of phosphate buffer was added.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к диагностике, а именно к набору реагентов, экспресс-методу и устройству для выявления факта поражения головного мозга ишемического генеза. Особенностью изобретения является использование иммуноактивного гибридного пептида, образованного как продукт двух фрагментов субъединиц нейрорецепторов НМДА. Описано устройство, позволяющее быстро и удобно тестировать аутоантитела, присутствующие в крови пациента и распознающие гибридный пептид. Метод детекции аутоантител основан на принципе латеральной проточной иммунохроматографии. Изобретение может быть использовано при диспансеризации (скрининг хронических поражений мозга ишемического генеза), для выявления декомпенсированной хронической ишемии головного мозга на догоспитальном этапе терапевтами или неврологами поликлиник, а также в нейрохирургии и спортивной медицине на предмет диагностики отсроченной ишемизации мозга у лиц с ЧМТ.

Description

ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ
ПАТОЛОГИЙ МОЗГА ИШЕМИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА Область техники
Изобретение относится к средствам диагностики, а именно к методу, устройству и набору реагентов для скоростного выявления хронических состояний головного мозга млекопитающих, в частности, хронической ишемии, эндотоксической и цитотоксической эдемы (отека мозга), развивающихся при сосудистых и травматических поражениях головного мозга, а также риска повторных ишемических событий. Изобретение может применяться при диспансеризации или первичном осмотре пациентов, ранее перенесших черепно-мозговую травму, инсульт или микроинсульт, и позволит проводить наиболее оптимальные лечебные мероприятия в неврологии, травматологии, и спортивной медицине.
Уровень техники
Инсульт, а также другие острые и хронические патологии головного мозга ишемического генеза представляют собой серьёзную угрозу здоровью и жизни людей. Важность ранней и высокоспецифичной диагностики этих состояний трудно переоценить; от правильного диагноза зависит скорость, тяжесть и другие параметры восстановления пациента. Особенно важно диагностировать ишемический инсульт в первые три-шесть часов с начала заболевания для возможности проведения тромболитической терапии. Несмотря на достигнутые успехи, до сих пор существует необходимость в новых, объективных средствах диагностики риска повторения острой фазы ишемии на фоне хронической патологии, а также возникновения связанных с ними эндотоксической и цитотоксической эдемы (отека мозга) и последующих заболеваний малых сосудов. Диагностика подобных состояний в основном основана на методах нейровизуализации, таких как компьютерная томография и магнитно-резонансная томография (МРТ), необходимых для выявления пораженных участков мозга и степени их повреждения. По некоторым оценкам, до 40% пациентов с инсультом в Великобритании не могут быть вовремя продиагностированы радиологическими методами из-за противопоказаний, нестабильности состояния или недоступности оборудования (Hand PJ et al. (2005) J Neurol Neurosurg Psychiatry 76: 1525-1527). Во многих других странах проблема с доступностью оборудования стоит гораздо более остро, и, соответственно, процент таких пациентов выше. Отдельной проблемой является диагностика и предсказание последствий для транзиторных ишемических атак (ТИА) или микроинсультов, с симптомами, длящимися от часа до 24 часов. Во многих случаях у пациентов, перенесших инсульт или ТИА, регистрируется по крайней мере один повторный инсульт в течение короткого промежутка времени. Игнорирование симптомов ТИА пациентом может привести к развитию хронических патологий головного мозга. Несмотря на понимание роли некоторых факторов, определяющих развитие повторных или хронических инсультов, таких как наличие атеросклероза, повышенного артериального давления или сахарного диабета, в настоящее время пока отсутствует возможность мониторинга состояния больного с такими предшествующими факторами, особенно на фоне хронического инсульта, при помощи недорогих биохимических тестов для быстрой и эффективной оценки рисков повторных инсультов.
Из уровня техники известно несколько иммуноактивных биомаркеров, предполагаемых для диагностики инсульта или ТИА в дополнение к имеющимся средствам нейровизуализации (Bazarian J J, et al. PLoS One 2014, 9, e94734; Wang KK, et al. J Neurotrauma 2016, 33,1270-1277; Сорокина ЕГ, и др., Ж. Неврологии Психиатр 2010,110, 30-35; Guaraldi F, et al. J Clin Med 2015, 4, 1025-1035), однако ни один из них пока не нашел применения в клинической практике, в основном по причине недостаточной специфичности. Аналогично, на сегодняшний день на рынке не существует эффективных средств для прогнозирования развития хронических инсультов или микроинсультов. Поэтому крайне актуальной остается проблема создания специфического недорогого экспресс-теста для выявления хронической ишемии, особенно в ассоциации с отеком головного мозга (эндотоксической или цитотоксической эдемой). Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения поставленной задачи, и поэтому может расширить арсенал средств, применяемых для выявления хронических поражений головного мозга и риска повторных ишемических событий.
Сущность изобретения
Известно, что уровни циркулирующих в крови фрагментов нейрорецепторов НМДА могут быть использованы как диагностический инструмент для клинической оценки пациентов, перенесших инсульт или ТИА. НМДА-рецепторы являются подклассом ионотропных рецепторов глутамата, селективно связывающих 1М-метил-0-аспартат (НМДА). Целью настоящего изобретения является создание метода и устройства для быстрого и удобного выявления хронических состояний головного мозга млекопитающих ишемического генеза, в частности, риска повторного инсульта или микроинсульта, отсроченной хронической ишемии, связанной с формированием отека мозга, при сосудистых или травматических поражениях головного мозга, приводящих к гибели клеток нервной ткани. Для решения указанной задачи был получен и экспериментально протестирован гибридный пептид, образующийся при патологических условиях в виде единого фрагмента двух фрагментов субъединиц нейрорецепторов НМДА (возможность образования таких гибридов была описана в заявке WO/2002/012892).
Особенностью данного изобретения является то, что в качестве диагностического маркера используются патологические антитела, вырабатывающиеся на гибридные фрагменты нейрорецепторов НМДА. Определение уровня антител на собственные белковые фрагменты (аутоантител) предпочтительно для хронических патологий, поскольку эффективное образование антител происходит в ответ на повторяющееся появление антигена в кровотоке. Уровень специфических аутоантител на нейрорецепторы НМДА будет коррелировать со степенью тяжести и размером повреждения структур головного мозга. В данном изобретении гибридный пептид образован из двух разных антигенных фрагментов и поэтому позволяет детектировать антитела к двум разным субъединицам НМДА рецептора.
Один из вариантов изобретения включает в себя набор реагентов (комплект реагентов) для диагностики хронической патологии мозга млекопитающего ишемического генеза, включающий гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность по всей длине с последовательностью SEQ ID NO:1 (приведенной в Перечне последовательностей), и иммобилизованный на твердом носителе, а также реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего. Таким образом, гибридный пептид по настоящему изобретению включает в себя как последовательность SEQ ID NO:1 , так и последовательности, достаточно близкие к SEQ ID NO:1 , и содержащие вставки, замены или делеции аминокислот, не нарушающие, или почти не нарушающие, функциональные свойства гибридного полипептида, такие как аффинность к аутоантителам, распознающим субъединицы НМДА рецептора. В качестве биологической жидкости млекопитающего может быть использована кровь, плазма крови, сыворотка крови, спинномозговая жидкость, слюна, пот, пары дыхания или другие жидкости организма, содержащие антитела. Примерами хронических патологий мозга ишемического генеза являются хроническая ишемия, повторные и отсроченные инсульты или микроинсульты.
В предпочтительном варианте изобретения реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации. Примером такого агента выступает белок А, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, и имеющий высокую аффинность к константному участку тяжелой цепи (Fc-домену) IgG. Также, таким агентом может выступать фрагмент антитела, распознающего константный участок тяжелой цепи IgG. Для облегчения последующей детекции на тест-полоске в предпочтительном варианте изобретения такой агент конъюгируют с агентом визуализации. Конъюгация предпочтительно происходит через образование ковалентной связи между двумя агентами, но может осуществляться другим способом при условии образования стабильного функционального комплекса. Агентом визуализации может выступать наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл. В предпочтительном варианте изобретения твердый носитель, на котором иммобилизован гибридный пептид, представляет собой мембрану из нитрата целлюлозы.
Некоторые варианты изобретения также включают в себя диагностическую тест- полоску для ускоренного выявления хронической патологии мозга ишемического генеза, имеющую по меньшей мере три зоны, расположенных последовательно, а именно, зону нанесения образца, зону реакции и зону детекции, причем зона нанесения образца способна впитывать биологическую жидкость млекопитающего и направлять ее к зонам реакции и детекции под действием капиллярных сил; зона детекции содержит тестовую линию, на которой иммобилизован гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичности по всей длине с последовательностью SEQ ID NO:1 ; а зона реакции, расположенная между зонами нанесения образца и детекции, содержит реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего. В предпочтительном варианте изобретения реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации, а в качестве агента визуализации может выступать наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл.
Некоторые варианты изобретения также включают в себя способ идентификации пациентов с хроническими патологиями мозга ишемического генеза, включающий отбор образца биологической жидкости млекопитающего, нанесение этого образца биологической жидкости на диагностическую тест-полоску по настоящему изобретению в зону нанесения образца, и определение наличия агента визуализации на тестовой линии в зоне детекции диагностической тест-полоски. В предпочтительном варианте изобретения наличие агента визуализации на тестовой линии определяется в течение 15 или менее минут после нанесения образца биологической жидкости на диагностическую тест-полоску.
Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что данное изобретение помогает решить проблему быстрой и объективной оценки состояния пациента с хроническим поражением мозга ишемического генеза и подозрением на повторный инсульт. Выделен, проанализирован и протестирован новый гибридный пептид, образованный с помощью слияния двух фрагментов субъединиц нейрорецепторов НМДА, обладающих антигенными потенциалами. Описано устройство, позволяющее быстро и удобно тестировать аутоантитела, присутствующие в крови пациента и распознающие гибридный пептид. Наличие таких антител указывает на наличие определенных структурных поражений мозга и служит индикатором массированной гибели клеток нервной ткани. Описанный подход расширяет доступный инструментарий, используемый при диспансеризации или первичном осмотре пациентов, ранее перенесших черепно-мозговую травму, инсульт или микроинсульт, и позволит проводить наиболее оптимальные лечебные мероприятия.
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «антитело» эквивалентен термину «иммуноглобулин» и означает гликопротеин, образующийся в ответ на введение в организм млекопитающего бактерий, вирусов или других антигенов, состоящий из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепи, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1 , СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH и VL- области могут быть далее подразделены на гипервариабельные участки, именуемые областями, определяющими комплементарность (H-CDR и L-CDR), разделенные более консервативными областями. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном (то есть, антигенсвязывающую часть антитела). Константные области тяжелых цепей имеют достаточно консервативные аминокислотные последовательности, обладающие высокой степенью гомологии для всех молекул антител одного класса. Константные участки молекулы иммуноглобулина могут содержать разные комбинации доменов из константных областей тяжелых и/или легких цепей; в некоторых вариантах изобретения под константным участком следует понимать Fc-регион молекулы иммуноглобулина, который состоит из димера, образованного СН2 и СНЗ доменами двух тяжелых цепей. Fc-регион опосредует эффекторные функции антитела, то есть взаимодействие молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки). Термин «аутоантитела» в настоящем описании обозначает молекулы антител, которые выработались в организме млекопитающего в ответ на антигены, образованные из белков собственного организма (аутоантигены). Аутоантитела могут вырабатываться в ответ на аутоантигены, которые в норме не присутствуют в кровотоке, например, на гибридные фрагменты нейрорецепторов, или в ответ на гибридные белки или пептиды, образованные слиянием двух или более белковых фрагментов. Реагентом, который имеет сродство к иммуноглобулинам, может являться любое химическое вещество, способное специфически связываться с иммуноглобулинами и образовывать новый комплексный объект. При этом, данный реагент не должен ингибировать связывание иммуноглобулинов с их специфическими антигенами (реакцию антитело-антиген).
Используемый здесь термин «процент идентичности двух последовательностей» определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений, и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью бесплатной программы NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Краткое описание рисунков
Рис. 1. Упрощенная структура диагностической тест-полоски в пластиковом корпусе. 1 - накладка-фильтр для нанесения образца биологической жидкости, 2 - накладка, содержащая детектирующий реагент и образующая зону реакции, 3 - нитроцеллюлозная мембрана, образующая зону детекции, 4- адсорбентная накладка, 5- лунка для нанесения образца, 6- тестовая линия, образованная иммобилизованным гибридным пептидом, 7- контрольная линия, образованная иммобилизованными антителами, распознающими константные участки молекул антител, 8- корпус пластиковой кассеты, покрывающий диагностическую тест-полоску.
Рис. 2. Результаты экспресс-диагностики хронической патологии мозга после легкой ЧМТ. Пациент_Ы° 1 - левая часть рисунка (А), Пациент_Ы° 2 - правая часть рисунка (Б). Уровень аутоантител при хронической ишемии мозга был определен с помощью диагностической тест-полоски (верхняя часть рисунка). У обоих пациентов подтверждено образование цитотоксической эдемы при помощи МРТ (нижняя часть рисунка). Обозначения: 11- контрольная полоса, 12- тестовая полоса.
Подробное раскрытие изобретения
Ключевым моментом патогенеза ишемического инсульта является нейротоксичность и иммуноэксайтотоксичность - каскад патобиохимических изменений, которые могут привести к необратимому повреждению нервной ткани по механизму апоптоза. Например, характерный для ишемии недостаток поступления кислорода и глюкозы может вызывать нарушение работы клеточных ионных насосов (которыми являются ионотропные глутаматные рецепторы) и избыточное поступление в клетку ионов Na+, что вызывает повышение внутриклеточного осмотического давления и соответственно чрезмерное поступление воды в клетку. Это является причиной образования цитотоксического отёка головного мозга. Вместе с этим, гибель клеток головного мозга приводит к высвобождению в биологические жидкости пациента специфических для центральной нервной системы (ЦНС) молекул, например, пептидных фрагментов нейрорецепторов. Эти фрагменты проникают через гематоэнцефалический барьер и попадают в кровь пациента, где могут быть зарегистрированы. Заявителями было обнаружено, что значительные количества фрагментов нейрорецепторов Н ДА появляются при ишемических атаках, которые специфичны для области поражения эндогенной или цитотоксической эдемой. Нейротоксичность активирует сериновые протеазы, которые расщепляют НМДА рецепторы на короткие пептиды, некоторые из которых обладают иммунной активностью. При тяжелых или хронических поражениях нервной ткани концентрация таких иммуноактивных пептидов становится достаточно большой, для того чтобы после попадания в кровоток инициировать аутоиммунный ответ - выработку аутоантител на эти пептиды. Таким образом, как фрагменты нейрорецепторов НМДА, так и аутоантитела на них, могут служить маркерами гибели клеток нервной ткани (апоптоза). Эффективное образование аутоантител требует постоянного притока иммуноактивных гибридных фрагментов НМДА рецепторов в кровоток и может происходить бессимптомно у лиц с предшествующими факторами (атеросклероз, гипертензия, диабет) (Gonzalez-Garcia et al. J Neurol Sci. 2017; 375:324- 330). Было установлено, что обнаруживаемые концентрации НМДА аутоантител появляются в крови на третьи- седьмые сутки после попадания пептидных фрагментов в кровь (Dambinova S et al., Clin Chem, 2003 Oct;49(10): 1752-62). Вместе с этим, аутоантитела персистируют в кровотоке в течение длительного времени (от нескольких недель до месяцев), и поэтому они потенциально являются более надежным и удобным индикатором наличия патологии.
Определение наличия в крови аутоантител к нейрорецепторам НМДА может быть использовано для оперативного обследования пациентов с подозрением на инсульт или ТИА, а также для оценки симптоматического ТИА. Наиболее эффективная выработка аутоантител происходит в случае образования цитотоксической эдемы, когда происходит необратимая гибель клеток нервной ткани посредством апоптоза. В этом случае велика вероятность возникновения повторных ишемических атак, а также развития хронической ишемии. В настоящее время диагностика цитотоксической эдемы осуществляется только при помощи диффузионной спектральной томографии, что требует времени, значительных инструментальных ресурсов и финансовых затрат. В данном изобретении описано создание устройства (диагностической тест-полоски) для предсказания значительных поражений нервной ткани при помощи обнаружения аутоантител к нейрорецепторам НМДА в крови пациентов с использованием латеральной проточной иммунохроматографии.
Ключевым аспектом создания подобного устройства является выбор антигена для эффективной и специфической детекции аутоантител. Авторами изобретения были проанализированы различные фрагменты нейрорецепторов НМДА, циркулирующих в крови пациентов, имеющих значительные поражения нервной ткани, а также проанализирована способность этих фрагментов вызывать аутоиммунный ответ. Такая способность определяется степенью схожести пептидных эпитопов фрагментов НМДА с другими белковыми эпитопами, которые распознаются иммунной системой организма млекопитающего и не воспринимаются как чужеродные. Также, иммуногенность пептида определяется его сродством к рецепторам главного комплекса гистосовместимости; такое сродство позволяет индуцировать Т-клеточный иммунный ответ и образование IgG антител на пептиды. Процедура поиска и анализа пептидных фрагментов нейрорецепторов в крови пациентов была описана в Dambinova S et al., Biomarkers for Traumatic Brain Injury, 2012, Royal Society of Chemistry (SN - 978-1-84973-389-2), p. 66-86. Кратко, белковые фрагменты, изолированные из синаптических мембран коры головного мозга, использовались для продукции поликлональных антител. Далее эти антитела использовались для скрининга плазмы или сыворотки пациентов с хроническими патологиями головного мозга. Аффинно-очищенные из плазмы пациентов пептиды идентифицировались с помощью методов масс спектрометрии. Далее идентифицированные пептиды, относящиеся к фрагментам глутаматных рецепторов, синтезировались и верифицировались на предмет эффективного связывания с IgG антителами, изолированными из крови пациентов. Таким образом были селектированы наиболее иммуногенные пептиды.
Было обнаружено, что в крови пациентов, имеющих значительные поражения нервной ткани, могут присутствовать пептидные фрагменты двух субъединиц нейрорецепторов НМДА, а именно, субъединиц NR2A (продукт гена GRIN2A) и NR2B (продукт гена GRIN2B) в разных концентрациях. Более того, неожиданно было обнаружено присутствие в крови пациентов определенных гибридных пептидов, возникающих посредством слияния более мелких пептидов, образованных из NR2A и NR2B. Такие гибридные пептиды часто являются более иммуногенными по сравнению с пептидами, образованными из только одной из субъединиц, поскольку слияние двух пептидов из разных субъединиц может приводить к образованию неоантигенов. Для создания простой, эффективной и специфической тест-системы для детекции аутоантител заявителями были выделены, очищены и проанализированы различные гибридные пептиды, присутствующие в крови пациентов с хроническими патологиями головного мозга. В частности, был селектирован гибридный пептид, сконструированный путем объединения двух участков субъединиц NR2A и NR2B, как обладающий значительным антигенным потенциалом. Получившийся пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 (приведена в Перечне последовательностей). Таким образом, данный пептид может служить для определения наличия аутоантител как на фрагменты NR2A, так и NR2B.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Ключевыми параметрами тест-системы на НМДА аутоантитела будут являться специфичность, минимальный уровень детекции аутоантител, простота использования и интерпретации результата, стоимость, надежность. Оптимальный уровень этих параметров можно получить при реализации тест-системы на основе латеральной проточной иммунохроматографии. В этом случае для определения аутоантител используется диагностическая тест-полоска, имеющая по меньшей мере три зоны, расположенные последовательно, а именно, зону нанесения образца, зону реакции и зону детекции, причем зона нанесения образца, изначально сухая, способна впитывать биологическую жидкость млекопитающего и направлять ее к зонам реакции и детекции под действием капиллярных сил. Различные варианты реализации такой конструкции известны специалистам и могут быть использованы в настоящем изобретении. В качестве образца, например, могут быть использованы несколько капель свежеотобранной крови пациента (20-80 мкл). Образец помещают в зону нанесения образца, при этом жидкость мигрирует через специальную накладку-фильтр к зоне реакции. Материал специальной накладки может быть подобран для осуществления фильтрации крови и оптимизации фонового сигнала способами, известными специалистам, например, с помощью материалов из стекловолокна. Зона реакции содержит агент, способный специфически связывать константный участок молекул антител иммуноглобулина, при этом данный агент конъюгирован с агентом визуализации и способен мигрировать под действием капиллярных сил к зоне детекции после связывания с молекулой иммуноглобулина. При хронических поражениях головного мозга происходит постоянная выработка фрагментов нейрорецепторов НМДА и их последующее поступление в кровоток. Это приводит к развитию зрелого иммунного ответа на иммуногенные пептиды с образованием иммуноглобулинов класса G (IgG) в крови пациента. Поэтому, в предпочтительном варианте изобретения, в зоне реакции используется агент, способный специфически связывать константный участок молекул антител IgG. Таким агентом, например, может служить белок А, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка, и имеющий высокую аффинность к константному участку тяжелой цепи IgG. Для удобства детекции, в предпочтительном варианте изобретения, белок А был конъюгирован с агентом визуализации методами, известными специалистам. В качестве агента визуализации может быть использовано вещество, способное испускать обнаруживаемое излучение, либо у которого можно вызвать испускание обнаруживаемого излучения (например, посредством радиоактивного распада, химической реакции, возбуждения флуоресценции, возбуждения спинового резонанса и так далее). В разных вариантах изобретения таким агентом может служить наночастица золота, фермент (например, пероксидаза хрена), органический краситель или флуоресцентный нанокристалл (квантовая точка), а также другие подобные агенты, известные специалистам. Визуализация сигнала в зоне детекции может происходить при освещении дневным светом широкого спектра или посредством использования узкоспектральных источников. В предпочтительном варианте изобретения белок А был конъюгирован с молекулой стрептавидина при помощи малеимидной функциональной группы; кроме того, были использованы коммерчески доступные биотинилированные наночастицы золота. В результате, финальная конъюгация «белок А - наночастица золота» осуществлялась с помощью высокоаффинного взаимодействия биотин-стрептавидин.
Образованные в зоне реакции комплексы «аутоантитело IgG - белок А - наночастица золота» далее мигрируют в зону детекции под действием капиллярных сил. В предпочтительном варианте изобретения зона детекции представляет собой мембрану из нитрата целлюлозы с порами, достаточными для прохождения данного комплекса. Примеры таких мембран известны специалистам. В некоторых вариантах изобретения использовались мембраны от следующих производителей: Sartorius (CN95, CN 140), Millipore (HF 90, HF 120, HF 180) или MDI (mdi70, mdi10p). В предпочтительном варианте изобретения мембрана содержит по меньшей мере две полосы, тестовую и контрольную, предпочтительно расположенных перпендикулярно потоку жидкости. Тестовая полоса образована при помощи иммобилизации на мембране выбранного гибридного пептида с последовательностью SEQ ID NO:1 , или идентичной ей по меньшей мере на 90%. Для иммобилизации пептида на мембране могут быть использованы различные методы, известные специалистам. В предпочтительном варианте изобретения иммобилизация на мембране осуществлялась при помощи конъюгации пептида с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Гибридный пептид может быть конъюгирован с БСА при помощи малеимидной функциональной группы, с использованием коммерчески доступной комбинации малеимид-БСА. Далее, комплекс пептид-БСА непосредственно наносился на мембрану в районе тестовой полосы и связывался с мембраной в процессе высушивания.
Контрольная полоса расположена дальше от тестовой линии по потоку жидкости и образована при помощи иммобилизации на мембране поликлональных анти-lgG антител методами, известными специалистам. Мигрирующий из зоны реакции комплекс «аутоантитело IgG - белок А - наночастица золота» сначала может провзаимодействовать с иммобилизованным гибридным пептидом, при условии, если аутоантитело имеет сродство к этому пептиду. Несвязавшиеся комплексы мигрируют далее до контрольной полосы, где происходит связывание иммобилизованных анти-lgG антител с данными комплексами. Соответственно, при проявлении только контрольной полосы результат теста считается отрицательным. Визуализация связывания будет осуществляться при помощи используемого агента визуализации, при этом, природа агента визуализации будет определять способ, по которому будет происходить детекция. В предпочтительном варианте изобретения используемые наночастицы золота имеют хорошие оптические свойства; при связывании на полосе и освещении дневным светом они окрашивают полосу в темно-золотистый цвет и позволяют производить детекцию визуально, без помощи дополнительного оборудования. Интенсивность сигнала будет пропорциональна концентрации специфических антител к пептиду, присутствующих в образце. Наконец, в конце зоны детекции находится адсорбентная накладка, которая поддерживает ток жидкости вдоль мембраны по направлению от зоны нанесения образца к зоне детекции и предотвращает противоток. Упрощенная структура диагностической тест-полоски в одном из вариантов изобретения показана на Рис. 1.
Описанный вариант реализации изобретения позволяет проводить полуколичественный анализ содержания аутоантител, специфичных к иммобилизованному пептиду. Интенсивность и скорость проявления тестовой полосы будет определяться концентрациями антител в образце и может сравниваться с окраской полос на референс-карте, специально разработанной для определенного набора реагентов. Построение референс-карты можно производить при помощи титрования образца специально полученных поликлональных антител к гибридному пептиду.
Примеры использования изобретения
Пример 1. Результат определения антител к гибридному пептиду с помощью экспресс-диагностики при хронической ишемии мозга (с подтвержденной цитотоксической эдемой).
Женщина, 77 лет, поступила в неврологическое отделение Na1 Первого Санкт- Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова (ПСПбГМУ) с жалобами после легкой ЧМТ. Были определены факторы риска в виде гипертонической болезни, сахарного диабета второго типа, распространенного атеросклероза. Неврологический статус: 1) Умеренное нарушение когнитивных функций; 2) Двусторонняя пирамидная недостаточность; 3) Корешковый синдром L4-L5 справа; 4) Полиневропатический синдром с укорочением вибрационной чувствительности и выпадением ахилловых рефлексов.
Был сделан диагностический экспресс-тест при помощи тест-полоски по настоящему изобретению, а также МРТ головного мозга в режиме Т2 FLAIR (Рис. 2А). На снимках MPT была обнаружена цитотоксическая эдема (проявляется в виде светлых областей). Диагностический экспресс-тест показал наличие двух полос (Рис. 2А).
Пример 2. Результат определения антител к гибридному пептиду с помощью экспресс-диагностики при хронической ишемии мозга (с подтвержденной цитотоксической эдемой).
Женщина, 83 лет, поступила в неврологическое отделение Ns1 ПСПбГМУ с жалобами на шаткость при ходьбе, скованность при движениях в конечностях, периодические ощущения потемнения в глазах, головокружения, дрожь во всем теле, отеки стоп. Ранее госпитализировалась в ПСПбГМУ с диагнозом Дисциркуляторная энцефалопатия III ст., синдром сосудистого паркинсонизма. Были определены факторы риска в виде гипертонической болезни и распространенного атеросклероза. Неврологический статус: 1) умеренное нарушение когнитивных функций; 2) псевдобульбарный синдром; 3) синдром паркинсонизма; 4) двусторонняя пирамидная недостаточность; 5) нарушение статики и динамики в поясничном отделе позвоночника.
Был сделан диагностический экспресс-тест при помощи тест-полоски по настоящему изобретению, а также МРТ головного мозга в режиме Т2 FLAIR (Рис. 2Б). На снимках МРТ была обнаружена цитотоксическая эдема (проявляется в виде светлых областей и точек). Диагностический экспресс-тест показал наличие двух полос (Рис. 2Б).
Пример 3. Пилотное исследование пациентов ПСПбГМУ с помощью диагностических тест-полосок по настоящему изобретению.
В исследовании приняло участие 10 человек с установленным рабочим диагнозом «Дисциркуляторная энцефалопатия/Хроническое нарушение мозгового кровообращения (ХНМК)», что согласно Международной Классификации Болезней соответствует шифру I67 (I67.2 Церебральный атеросклероз, I67.4 Гипертензивная энцефалопатия, I67.8 Другие уточненные поражения сосудов мозга). Диагноз подтверждался клиническими (неврологический осмотр), нейро-психологическими (шкалы MMSE, FAB) и инструментальными методами исследования (нейровизуализация, дуплексное сканирование), принимали участие 3 мужчин и 7 женщин, средний возраст 68,3 лет. Всем участникам исследования проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) в режимах Т1 , Т2, Т2 FLAIR, DWI, GRE, а также другие методы обследования, направленные на поиск потенциальных факторов риска нарушений мозгового кровообращения. Таким образом, атеросклероз брахиоцефальных и церебральных артерий был выявлен у 7 пациентов, гипертоническая болезнь - у 5 пациентов, сахарный диабет - у 2 пациентов, аритмии - у 2 пациентов. У двух пациентов диагностировано сочетание трех факторов риска. Контрольную группу составили 12 относительно здоровых добровольцев, подобранных с учетом среднего возраста, идентичного среднему возрасту тестовой группы пациентов. При поступлении в стационар у пациентов бралась капиллярная кровь, 80 мкл образца помещались в специальное окошко экспресс-теста, добавлялось 10 мкл фосфатного буфера. В течение 30 минут (в среднем 15 минут) наблюдали развитие иммунохроматографической реакции в виде появления на экране экспресс-теста контрольной С-полоски и тестовой Т-полоски. У восьми из десяти пациентов с диагнозом «Хроническое нарушение мозгового кровообращения/Дисциркуляторная энцефалопатия» экспресс-тест показал положительный результат. В контрольной группе из 12 пациентов тестовая полоса проявилась только в одном случае. Таким образом, предварительные испытания диагностических тест-полосок по настоящему изобретению показали чувствительность около 80% и специфичность около 93%.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Набор реагентов для диагностики хронической патологии мозга млекопитающего ишемического генеза, включающий:
а) гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность по всей длине с последовательностью SEQ ID NO:1 , и иммобилизованный на твердом носителе;
б) реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего.
2. Набор реагентов по п. 1 , отличающийся тем, что биологическая жидкость млекопитающего представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови, спинномозговую жидкость, слюну, пары дыхания или пот.
3. Набор реагентов по п. 2, в котором реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации.
4. Набор реагентов по п. 3, в котором агентом визуализации является наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл.
5. Набор реагентов по п. 1 , в котором хронической патологией мозга ишемического генеза является заболевание, выбранное из следующего списка: хроническая ишемия, хронические транзиторные ишемические атаки, повторные инсульты или микроинсульты, отек мозга.
6. Набор реагентов по п. 5, в котором твердый носитель представляет собой мембрану из нитрата целлюлозы.
7. Диагностическая тест-полоска для ускоренного выявления хронической патологии мозга ишемического генеза, имеющая по меньшей мере три зоны, расположенных последовательно, а именно, зону нанесения образца, зону реакции и зону детекции, причем
зона нанесения образца способна впитывать биологическую жидкость млекопитающего и направлять ее к зонам реакции и детекции под действием капиллярных сил;
зона детекции содержит тестовую линию, на которой иммобилизован гибридный пептид, имеющий по меньшей мере 90% идентичность по всей длине с последовательностью SEQ ID NO:1 ;
зона реакции, расположенная между зонами нанесения образца и детекции, содержит реагент для определения присутствия аутоантител к вышеупомянутому гибридному пептиду в биологической жидкости млекопитающего, имеющий сродство к иммуноглобулинам млекопитающего.
8. Диагностическая тест-полоска по п. 7, отличающаяся тем, что биологическая жидкость млекопитающего представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови, спинномозговую жидкость, слюну, пары дыхания или пот.
9. Диагностическая тест-полоска по п. 8, в которой реагентом для определения присутствия аутоантител является агент, специфически связывающий константный участок молекул антител антител млекопитающего, конъюгированный с агентом визуализации.
10. Диагностическая тест-полоска по п. 9, в которой агентом визуализации является наночастица золота, органический краситель, магнитная наночастица, углеродная нанотрубка или флуоресцентный нанокристалл.
11. Способ идентификации пациентов с хроническими патологиями мозга ишемического генеза, включающий:
(а) отбор образца биологической жидкости млекопитающего;
(б) нанесение этого образца биологической жидкости на диагностическую тест- полоску по любому из пп. 7, 8, 9 или 10 в зону нанесения образца;
(в) определение наличия агента визуализации на тестовой линии в зоне детекции диагностической тест-полоски.
12. Способ по п. 11 , отличающийся тем, что наличие агента визуализации на тестовой линии определяется в течение 15 или менее минут после нанесения образца биологической жидкости на диагностическую тест-полоску.
PCT/RU2017/000956 2017-07-18 2017-12-20 Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозгаишемического генеза WO2019017811A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019572794A JP6989158B2 (ja) 2017-07-18 2017-12-20 脳虚血由来の慢性病態を検出するための試薬の診断セット
CN201780083884.3A CN110325862B (zh) 2017-07-18 2017-12-20 用于检测缺血性发生的慢性脑病理学的诊断试剂盒
EP17917909.8A EP3657175A4 (en) 2017-07-18 2017-12-20 DIAGNOSTIC REAGENT SET FOR DETECTION OF CHRONIC PATHOLOGIES OF CEREBRAL ISCHEMIC ORIGIN
US16/307,491 US10408829B2 (en) 2017-07-18 2017-12-20 Diagnostic reagent kit for detecting chronic brain pathologies of ischemic genesis

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017122628 2017-07-18
RU2017122628A RU2668534C1 (ru) 2017-07-18 2017-07-18 Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозга ишемического генеза

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019017811A1 true WO2019017811A1 (ru) 2019-01-24

Family

ID=63798114

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000956 WO2019017811A1 (ru) 2017-07-18 2017-12-20 Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозгаишемического генеза

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10408829B2 (ru)
EP (1) EP3657175A4 (ru)
JP (1) JP6989158B2 (ru)
CN (1) CN110325862B (ru)
RU (1) RU2668534C1 (ru)
WO (1) WO2019017811A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220161465A (ko) * 2020-03-31 2022-12-06 업카라 인코포레이티드 생물학적 시료에서 표적 분석물의 신속 검출을 위한 장치 및 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2112243C1 (ru) * 1995-11-29 1998-05-27 Светлана Александровна Дамбинова Набор "па-тест" для диагностики неврологических заболеваний
RU2123704C1 (ru) * 1995-03-21 1998-12-20 Евгений Иванович Гусев Способ диагностики острой церебральной ишемии
WO2002012892A2 (en) 2000-08-04 2002-02-14 Cis Biotech, Inc. Rapid multiple panel of biomarkers in laboratory blood tests for tia/stroke

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596476B1 (en) * 1989-12-22 2003-07-22 Abbott Laboratories Hepatitis C assay
JPH08509607A (ja) * 1993-04-20 1996-10-15 ザ ソールク インスチチュート バイオテクノロジー／インダストリアル アソシエイツ，インコーポレイテッド ヒトｎ−メチル−ｄ−アスパラギン酸受容体サブユニット、これをコードする核酸およびその用途
US6896872B2 (en) 2001-06-27 2005-05-24 Svetlana A. Dambinova Rapid multiple panel of biomarkers in laboratory blood tests for TIA/stroke
AU2005245785B2 (en) * 2004-04-15 2011-04-07 Banyan Biomarkers Inc. Proteolytic markers as diagnostic biomarkers for cancer, organ injury and muscle rehabilitation/exercise overtraining
US20060257943A1 (en) 2005-01-25 2006-11-16 Cis Biotech, Inc. Ischemic biomarkers and their use to predict adverse neurological events from surgery
RU2297634C2 (ru) * 2005-03-02 2007-04-20 Светлана Александровна Дамбинова Диагностический набор реагентов "нарко-ифа-пептидный тест" для выявления наркоманий
RU2008101419A (ru) * 2005-06-13 2009-07-20 СиАйЭс БАЙОТЕК, ИНК. (US) Способы диагностики и лечения цереброваскулярных явлений на основе пептидов nr2
EP2057466B1 (en) * 2006-08-15 2013-10-23 The Trustees of the University of Pennsylvania Methods and compositions for treatment and diagnosis of autoimmune encephalitis or epilepsy
US20100210816A1 (en) 2006-12-12 2010-08-19 Svetlana Dambinova NMDAR Biomarkers for Diagnosing and Treating Cerebral Ischemia
US20090275736A1 (en) * 2006-12-12 2009-11-05 Svetlana Dambinova NMDAR Biomarkers for Diagnosis and Treatment of Traumatic Brain Injury and Other Disorders
CN104411826A (zh) * 2012-03-13 2015-03-11 萨克生物研究学院 使用腺病毒和化学二聚体的选择性细胞寻靶

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2123704C1 (ru) * 1995-03-21 1998-12-20 Евгений Иванович Гусев Способ диагностики острой церебральной ишемии
RU2112243C1 (ru) * 1995-11-29 1998-05-27 Светлана Александровна Дамбинова Набор "па-тест" для диагностики неврологических заболеваний
WO2002012892A2 (en) 2000-08-04 2002-02-14 Cis Biotech, Inc. Rapid multiple panel of biomarkers in laboratory blood tests for tia/stroke

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAZARIAN JJ ET AL., PLOS ONE, vol. 9, 2014, pages e94734
DAMBINOVA S ET AL., CLIN CHEM, vol. 49, no. 10, October 2003 (2003-10-01), pages 1752 - 62
DAMBINOVA S ET AL.: "Biomarkers for Traumatic Brain Injury", 2012, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, pages: 66 - 86
E.G. SOROKINA ET AL., JOURNAL OF NEUROLOGY AND PSYCHIATRY, vol. 110, 2010, pages 30 - 35
GONZALEZ-GARCIA ET AL., J NEUROL SCI., vol. 375, 2017, pages 324 - 330
GUARALDI F ET AL., J CLIN MED, vol. 4, 2015, pages 1025 - 1035
HAND PJ ET AL., J NEUROL NEUROSURG PSYCHIATRY, vol. 76, 2005, pages 1525 - 1527
See also references of EP3657175A4
WANG KK ET AL., J NEUROTRAUMA, vol. 33, 2016, pages 1270 - 1277

Also Published As

Publication number Publication date
RU2668534C1 (ru) 2018-10-01
EP3657175A4 (en) 2021-05-05
US20190187133A1 (en) 2019-06-20
CN110325862A (zh) 2019-10-11
JP6989158B2 (ja) 2022-01-05
US10408829B2 (en) 2019-09-10
EP3657175A1 (en) 2020-05-27
JP2020527699A (ja) 2020-09-10
CN110325862B (zh) 2020-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dambinova et al. Blood test detecting autoantibodies to N-methyl-D-aspartate neuroreceptors for evaluation of patients with transient ischemic attack and stroke
US9952214B2 (en) SNTF is a blood biomarker for the diagnosis and prognosis of sports-related concussion
JP2013501919A (ja) 脳脊髄液の免疫的識別のための装置および方法
US20170307640A1 (en) Methods, kits and devices for detecting bii-spectrin, and breakdown products thereof, as biomarkers for the diagnosis of neural injury
US8084225B2 (en) Methods for diagnosing cerebrovascular events based on NR2 peptides
RU2668534C1 (ru) Диагностический набор реагентов для выявления хронических патологий мозга ишемического генеза
WO2018030252A1 (ja) 尿バイオマーカーを用いたアルツハイマー病の診断補助方法
CN114573692A (zh) 用于检测嗜铬粒蛋白a的免疫测定与抗体
JP2021534381A (ja) パーキンソン病の判定
JP2021012094A (ja) アルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の診断用マーカー及び診断用キット、脳内へのアミロイドβタンパク質の蓄積量の評価方法、並びに被験者におけるアルツハイマー病又は発症前アルツハイマー病の検出を補助するためのインビトロの方法
US20130323754A1 (en) Diagnostic Kit as Well as a Metho dfor the Examination of a Human Patient Sample for the Presence of Neuromyelitis Optica-Specific Antibodies
JP2016040540A (ja) ドレブリンａ及びドレブリンｅの特異的定量法
US20140186293A1 (en) Immunoglobulin-bound extracellular vesicles and uses thereof
US20160137741A1 (en) Muscle Specific Tyrosine Kinase-Fluorophore Conjugate Compositions, Kits and Methods of Using
US20220244274A1 (en) Quantitative biomarkers for assessing mild traumatic brain injury and methods of use thereof
US11300576B2 (en) DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples
JP7078265B2 (ja) 血液検査を用いる無意識の昏睡及び昏睡後状態（植物状態を含む）の経過及び転帰の予測
JP6908810B2 (ja) ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法
US20130078653A1 (en) Antibodies, compositions, and assays for detection of cardiac disease
CA3241311A1 (en) Serological assays for parkinson's disease
JP6226334B2 (ja) 炎症及び脱髄の少なくとも一方を伴う神経疾患の検出方法
EP4278188A1 (en) Devices and methods for diagnosising thyroid medical conditions

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17917909

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019572794

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017917909

Country of ref document: EP

Effective date: 20200218