WO2019016976A1 - リステリア・モノサイトゲネス検出方法 - Google Patents

リステリア・モノサイトゲネス検出方法 Download PDF

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義孝 原田
泰裕 瀬戸
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株式会社ファスマック
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Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically detecting Listeria monocytogenes and a primer therefor.
  • Listeriosis is an infection caused by Listeria monocytogenes (hereinafter sometimes referred to as "monocytogenes"). About 10 species are known for Listeria, but only monocytogenes bacteria cause listeriosis in humans.
  • this bacterium is regarded as an important food poisoning bacterium, and also in Japan, monocytogenes bacteria are often detected from various foods such as meat products and dairy products. Since monocytogenes bacteria are killed by normal cooking, food poisoning rarely occurs in food requiring cooking. However, because monocytogenes bacteria grow even under low temperature conditions such as in a refrigerator, for foods such as cheese and other dairy products and foods eaten without cooking such as ham, salami and smoked salmon, they should be properly stored at low temperatures. However, there is a risk of food poisoning due to monocytogenes bacteria.
  • Patent Documents 1 and 2 Various primers for detecting monocytogenes bacteria by real time PCR and the like have been reported (for example, Patent Documents 1 and 2), and commercially available kits also exist. These prior art targets genes involved in the virulence of Monocytogenes bacteria. However, even with commercially available test kits, known methods can not sufficiently suppress the occurrence of false negatives and false positives, and can be sufficiently satisfactory as a test specifically detecting only monocytogenes bacteria. is not.
  • An object of the present invention is to provide a means which makes it possible to detect only monocytogenes with sufficient accuracy with distinction from other Listeria bacteria.
  • the inventors of the present invention analyze the genome of Monocytogenes bacillus thoroughly, and use two nucleic acid amplification methods as target regions which can be detected specifically by differentiating Monocytogenes bacillus from other Listeria bacteria. Identified. The nucleotide sequences of these two genes were examined in more detail, a large number of primers were designed, and various combinations of primers against genomic DNAs of Monocytogenes and other Listeria strains were intensively examined, resulting in monocytogenes. The inventors succeeded in identifying a primer setting region that specifically detects bacteria alone with high accuracy, and established preferred examples of PCR primer set and LAMP primer set, thus completing the present invention.
  • the present invention provides a primer set for detection of Listeria monocytogenes, which comprises any of the following primer sets for amplifying partial regions of lmo0084 gene or lmo2736 gene of Listeria monocytogenes.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 30 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 31 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 30 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 31 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 ′ side, and shown in SEQ ID NO: 30 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 ′ side, and shown in SEQ ID NO: 31 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 ′ side, and shown in SEQ ID NO: 30 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • a forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 31 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (B-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 58, or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 ′ side, and shown in SEQ ID NO: 59 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (C-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 37 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (D-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33 or a sequence in which 4 or less bases have been substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 38 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (E-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 38 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (F-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 39 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • G-1 A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 40 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (H-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 39 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (I-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 40 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (I-2) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 61 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (I-3) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 62 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 61 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • J-1 A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 41 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • K-1 A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 39 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (L-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 'side, and shown in SEQ ID NO: 40 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • (M-1) A forward primer comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 63 or a sequence in which 4 or less bases are substituted at the gene polymorphism site in the nucleotide sequence on its 3 ′ side, and shown in SEQ ID NO: 64 A set with a reverse sequence comprising a nucleotide sequence or a sequence in which 4 or less bases are substituted at a polymorphic site in the nucleotide sequence on its 3 'side.
  • the present invention also provides a primer set for detection of Listeria monocytogenes, which comprises any of the following sets: (A-9) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 67 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 69 on its 3' side. (A-10) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 68 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 69 on its 3' side.
  • (D-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 70 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 74 on its 3' side.
  • (E-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 71 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 74 on its 3' side.
  • (F-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 71 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 75 on its 3' side.
  • (G-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 71 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 76 on its 3' side.
  • (H-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 72 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 75 on its 3' side.
  • (I-4) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 72 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 76 on its 3' side.
  • J-2 A mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 72 on its 3 'side, and 4 or less bases substituted at the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 or a polymorphic site in the nucleotide sequence Set with a reverse primer that contains the identified sequence on its 3 'side.
  • K-3 A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 73 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 75 on its 3' side.
  • (L-2) A set of a mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 73 on its 3 'side, and a mixed reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 76 on its 3' side.
  • (N-1) A mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 71 on its 3 'side, and 4 or less bases substituted at the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 or a polymorphic site in the nucleotide sequence Set with a reverse primer that contains the identified sequence on its 3 'side.
  • (O-1) A mixed forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 73 on its 3 'side, and 4 or less bases substituted at the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 41 or a polymorphic site in the nucleotide sequence Set with a reverse primer that contains the identified sequence on its 3 'side.
  • the present invention provides a loop-mediated isothermal amplification primer set for detection of Listeria monocytogenes, comprising any of the following sets: (i) From the F3 primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42, the B3 primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43, the FIP primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 Set with the BIP primer. (ii) From the base sequence shown in SEQ ID NO: 49, the F3 primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47, the FIP primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 48, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 49 Set with the BIP primer.
  • the present invention provides a method for detecting L. monocytogenes, which comprises the step of amplifying a partial region of the lmo0084 gene or lmo2736 gene by a nucleic acid amplification method using the above-described primer set of the present invention.
  • the present invention comprises an oligonucleotide portion of the base sequence shown in SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 80 to 82, SEQ ID NO: 85 (ngaan is tgaaa or cgaac), or SEQ ID NO: 86 (ngcaan is ggcaag or cgcaac) Provided is a probe for detecting Listeria monocytogenes.
  • the present invention provides a primer and probe set for real-time PCR for detection of Listeria monocytogenes, which comprises any of the following primer and probe sets.
  • a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 67 on its 3 'side, a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 69 on its 3' side, and an oligo of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 77 or 80 A set of probes with nucleotide moieties.
  • a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 68 on its 3 'side, a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 69 on its 3' side, and an oligo of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 77 or 80 A set of probes with nucleotide moieties.
  • a primer which can distinguish various strains of monocytogenes bacteria from Listeria bacteria other than monocytogenes bacteria and specifically detect them. According to the method of the present invention, the occurrence of false negative and false positive is greatly reduced as compared with the conventional nucleic acid amplification test.
  • Listeria bacteria there are species other than Monocytogenes bacteria which form colonies with a milky white on a selective separation medium, but according to the present invention, amplification does not occur even with such a strain, It is possible to distinguish from the monocytogenes bacteria only by the result of the nucleic acid amplification method.
  • TaqMan (registered trademark) probe 0084TMP 535-558 (CC) in the following example a probe is designed with a polymorphism sequence that is characteristic to each serotype as a target, and a real-time PCR is performed to obtain a monocyte. Serotyping of Genes bacteria is also possible.
  • 1 to 10 are monocytogenes (from 1 to serotypes 1 / 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4d, 5), and 11 to 22 are monocytogenes Other than Listeria. It is an example of the result of PCR by the PCR primer for detection of Listeria monocytogenes designed in the example. PCR was performed using Prime set No. 1 targeting lmo02736 gene and detected by 2% agarose gel electrophoresis. The 168 bp PCR product indicated by the arrow is a specific amplification product of Monocytogenes. Arrows are specific amplification products. The numbers assigned to each lane are the same as in Figure 2-1.
  • any of the following two genes present in the genome of Monocytogenes is targeted for detection.
  • SEQ ID NOS: 1 to 12 in the sequence listing show the lmo 0084 gene of serotypes 1 / 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 3a, 3b, 3a, 4a, 4b, 4c, 4d, 7 of Monocytogenes bacteria.
  • the nucleotide sequences of The nucleotide sequences of lmo2736 gene of the above serotype of Monocytogenes are shown in SEQ ID NOs: 13 to 25 (4b are shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively).
  • the lmo0084 gene has the base sequence of serotype 1 / 2a shown in SEQ ID NO: 1 and the lmo2736 gene has the base sequence of serotype 1 / 2a shown in SEQ ID NO: 13 Use as a reference.
  • the region of positions 306 to 737 in lmo 0084 gene shown in SEQ ID NO: 1 the region of positions 306 to 737 in lmo 0084 gene of various serotypes is included.
  • the same is true for the lmo2736 gene.
  • the Accession numbers of the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 are as shown in Table 2 below.
  • Specific detection of monocytogenes can be performed by a nucleic acid amplification method using a primer for detection of Listeria monocytogenes that specifically hybridizes to the region of lmo0084 gene or lmo2736 gene.
  • a nucleic acid amplification method various known methods such as PCR method and isothermal amplification method can be used.
  • primer includes PCR primers and isothermal amplification primers.
  • the PCR method refers to a nucleic acid amplification method in which a target region is amplified by repeating temperature change.
  • the term “specifically hybridize” means that under normal hybridization conditions, it hybridizes only to the region of interest and does not substantially hybridize to other regions.
  • the “under normal hybridization conditions” refers to the conditions used for annealing of normal PCR, for example, in the case of PCR using Taq polymerase, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3). The reaction is performed at a suitable annealing temperature of about 54 ° C. to 60 ° C. using a general buffer solution such as ⁇ 9.0), 1.5 mM MgCl 2 .
  • the appropriate annealing temperature is not limited to the above-mentioned example, is determined based on the Tm value of the primer and the experimental rule of the experimenter, and can be easily determined by those skilled in the art. "Substantially non-hybridizing” means in the sense that it does not hybridize at all or at a much lower level than the amount that hybridizes to the region of interest, and that it hybridizes only relatively negligible amounts. is there.
  • the detection of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be applied to any known detection method.
  • electrophoresis, intercalation, quencher-mediated fluorescence detection, etc. may be used, and in the case of isothermal amplification, insolubilization or intercalation of pyrophosphate as a byproduct of amplification, It may be carried out by a char-mediated fluorescence detection method or the like, and the amplification product may be detected by nucleic acid chromatography.
  • PCR also includes real-time PCR.
  • detection and monitoring of amplification products are generally performed by an intercalation method or a quencher-mediated fluorescence detection method.
  • an intercalation method or a quencher-mediated fluorescence detection method.
  • TaqMan registered trademark
  • nucleic acid amplification is performed using the set of primers for detection of monocytogenes bacteria of the present invention, and the development is carried out on a strip on which a capture substance specifically binding to the amplification product is immobilized in a line It can detect by doing.
  • a labeled compound such as biotin or DIG or an arbitrary base sequence is added to the 5 'side of the forward or reverse primer, and a labeled compound specific binding such as avidin or anti-DIG antibody is added on the strip.
  • a substance or an oligonucleic acid probe having a base sequence complementary to an arbitrary base sequence can be immobilized as a capture substance.
  • a probe having a base sequence that specifically hybridizes to any partial sequence within the region amplified by the primer can be used as a capture probe on the strip.
  • Such a capture probe appropriately selects a partial region within the region amplified by the primer, and the lmo 0084 gene of each serotype shown in SEQ ID NO: 1-12 or the lmo2736 gene of each serotype shown in SEQ ID NO: 13-25
  • a probe capable of hybridizing to the amplification product of each serotype may be designed with reference to the nucleotide sequence of
  • the detection system may be constructed in the same manner as a known nucleic acid chromatography method, and examples thereof include a chromogenic detection method using an enzyme such as peroxidase and particles such as gold colloid and colored latex.
  • the isothermal amplification method is not particularly limited, and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, strand displacement amplification (SDA) method, chimeric primer isothermal nucleic acid amplification (Isthermal and Chimeric primer-initiated amplification of Various isothermal amplification methods such as the Nucleic acids (ICAN) method, the Helicase-Dependent Amplification (HDA) method, and the Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR) method can be used.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • SDA strand displacement amplification
  • Isthermal and Chimeric primer-initiated amplification of Various isothermal amplification methods such as the Nucleic acids (ICAN) method, the Helicase-Dependent Amplification (HDA) method, and the Nicking Enzyme Amplification Reaction (NEAR) method can be used.
  • isothermal amplification primers include LAMP primers designed in the following examples.
  • Typical samples to be tested in the present invention are samples collected from food (including raw materials and processed foods), but not limited thereto.
  • samples such as liquids, for which testing of monocytogenes bacteria is desired may be of interest.
  • a primer set used for nucleic acid amplification methods such as PCR method and isothermal amplification method for specifically detecting Monocytogenes bacteria separately from other Listeria bacteria and other food poisoning pathogens is lmo0084 shown in SEQ ID NO: 1
  • a primer set can be used which specifically hybridizes within the region of the gene sequence or lmo2736 gene sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • In designing a primer set take into consideration the primer length, GC content, Tm value, base bias, continuous sequence, complementarity within and between primers, molecular weight of amplification product, gene polymorphism of target region, etc. do it.
  • the primer set used for the PCR method may be designed to have a length of about 15 to 30 bases, a GC content of about 40 to 60%, and a Tm value of about 50 to 70.degree.
  • a primer set can be designed according to the principle like the LAMP method shown below.
  • each primer constituting such a primer set it is desirable to design to a region with less sequence diversity among each serotype, but may be designed to a region containing a small number of genetic polymorphisms.
  • a primer is designed by adding base substitution reflecting the gene polymorphism to each gene sequence of serotype 1 / 2a shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13 can do. 20% or less is preferable with respect to 1 primer, and, as for the number of the base substitution in which the gene polymorphism was reflected, 15% or less is more preferable.
  • the primer in the case of a primer having a length of 20 bases that does not contain an additional sequence, is a sequence in which 4 or less, preferably 3 or less bases are substituted at the polymorphic site in the 20 base region. May be designed.
  • the primers designed as such may be identical to partial regions of gene sequences of other serotypes or their complementary strands.
  • a primer for each gene polymorphism may be used, or a mixed primer in which a primer for each gene polymorphism is mixed may be used.
  • a mixed primer synthesized so as to be a mixed base according to the gene polymorphism (for example, if the base of a certain site is G in some serotypes and C in other serotypes, the base of that site (S) (G or C) may be used as a mixed primer).
  • a primer for specifically detecting monocytogenes bacteria can be designed by designing a primer that specifically hybridizes in any region of the following (1) to (14) in consideration of the above. Good.
  • LMO0084-F286A SEQ ID NO: 26
  • LMO0084-F286B SEQ ID NO: 27
  • LMO0084-F281A SEQ ID NO: 28
  • LMO0084-F281B SEQ ID NO: 29
  • LMO0084-F286 / M (SEQ ID NO: 67) and LMO0084-F281 / M (SEQ ID NO: 68) are specific examples of the mixed forward primer that hybridizes in a region complementary to the region.
  • a primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 59 on its 3 'side, such as LMO 84 BIP (SEQ ID NO: 45) of the LAMP primer of the example is a reverse primer hybridizing within the region of positions 261-325. It is a specific example.
  • LMO0084-R757A SEQ ID NO: 30
  • LMO0084-R757B SEQ ID NO: 31
  • LMO0084-R757 / M SEQ ID NO: 69
  • a primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 58 at its 3 'end such as LMO 84 FIP (SEQ ID NO: 44) of the LAMP primer of the Example, hybridizes in a region complementary to the region at positions 108 to 166 It is a specific example of a forward primer.
  • LMO2736-F8 SEQ ID NO: 32
  • a forward primer that hybridizes to a region complementary to the region of the 1st to 47th positions.
  • LMO 2736-F222 (SEQ ID NO: 33) in the example is a specific example of a forward primer that hybridizes within the region complementary to the region at positions 202-261.
  • LMO 2736-F222 / M (SEQ ID NO: 70) is a specific example of a mixed forward primer that hybridizes in a region complementary to the region.
  • LMO 2736-F488 (SEQ ID NO: 34) in the example is a specific example of a forward primer that hybridizes in a region complementary to the region at positions 468-527.
  • LMO 2736-F488 / M (SEQ ID NO: 71) is a specific example of a mixed forward primer that hybridizes in a region complementary to the region.
  • LMO 2736-F572 (SEQ ID NO: 36) in the example is a specific example of a forward primer that hybridizes to a region complementary to the region at positions 552 to 611
  • LMO 2736-F572 / M (SEQ ID NO: 73) is
  • LMO 2736-R591 (SEQ ID NO: 38), which is a specific example of a mixed forward primer that hybridizes in a region complementary to the corresponding region, and a specific example of a reverse primer that hybridizes in the region of positions 552 to 611. It is.
  • LMO 2736-R176 SEQ ID NO: 37
  • SEQ ID NO: 37 a specific example of a reverse primer that hybridizes to the region of positions 137 to 196.
  • LMO 2736-R 685 (SEQ ID NO: 39) in the example is a specific example of a reverse primer that hybridizes to the region at positions 646-705.
  • LMO 2736-R685 / M (SEQ ID NO: 75) is a specific example of a mixed reverse primer that hybridizes into the region of interest.
  • Primers containing the LMO 2736-R771 (SEQ ID NO: 40) of the example and the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 on its 3 'side, such as LMO 2736-1 BIP (SEQ ID NO: 49) and LMO 2736-2 BIP (SEQ ID NO: 4) 53) is a specific example of a reverse primer that hybridizes in the region of positions 732-791.
  • LMO 2736-R771 / M (SEQ ID NO: 76) is a specific example of a mixed reverse primer that hybridizes to the region concerned.
  • LMO 2736-R992 SEQ ID NO: 41
  • a primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 64 at its 3 'side, such as LMO 2736-10 BIP (SEQ ID NO: 57) of the LAMP primer of the example, is a reverse primer hybridizing within the region of positions 721 to 775 It is a specific example.
  • the primer that specifically hybridizes to the lmo 0084 gene region of (1) to (3) above is, for example, the region of positions 261 to 325 and the region of positions 718 to 777 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Or a sequence consisting of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases in a region complementary to positions 108 to 166, or any of these, or 20% or less at a polymorphic site within the sequence It may be a primer containing the sequence in which the base is substituted on the 3 'side thereof.
  • the primer that specifically hybridizes to the region of lmo2736 gene of the above (4) to (14) is, for example, the region of positions 1 to 47, the region of positions 202 to 261 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 Region 468 to 527, region 510 to 569, region 552 to 611, region 137 to 196, region 646 to 705, region 732 to 791, region 953 A sequence consisting of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases in the region from position 1012 to the region from position 496 to 560, or the region from positions 721 to 775, or a region complementary to any of these; Alternatively, it may be a primer containing, on its 3 'side, a sequence in which no more than 20% of bases have been substituted at a polymorphic site in the sequence.
  • SEQ ID NOs: 26 to 31, 58 and 59 are 3 'partial sequences (sequences of F2 or B2 portions that hybridize to a target site in lmo0084 gene) of SEQ ID NOs: 44 and 45, which are LAMP primer sequences.
  • SEQ ID NOs: 26 to 29 and 58 are the sequences of the sense strand of lmo 0084 gene, and can be used as the sequences of forward primers that hybridize to the antisense strand of the gene.
  • SEQ ID NOs: 30, 31 and 59 are the sequences of the antisense strand of lmo0084 gene, and can be used as the sequences of reverse primers that hybridize to the sense strand of the gene.
  • SEQ ID NOs: 32 to 41 and 60 to 64 are 3 'partial sequences of the LAMP primer sequences
  • SEQ ID NOs: 48, 49, 52, 53, 56, 57 sequences of F2 or B2 portion hybridizing to a target site in lmo2736 gene
  • SEQ ID NOs: 32-36, 60, 62, 63 are sequences of the sense strand of lmo2736 gene, and can be used as a sequence of a forward primer that hybridizes to the antisense strand of the gene.
  • SEQ ID NOs: 37 to 41, 61 and 64 are sequences of the antisense strand of lmo2736 gene, and can be used as a sequence of a reverse primer that hybridizes to the sense strand of the gene.
  • SEQ ID NOs: 26 to 31 and SEQ ID NOs: 32 to 41 exemplified as preferred examples of preferred sequences that can be adopted as primers for amplifying and detecting partial regions of lmo 0084 gene and lmo 2736 gene are 5 It can be used as a LAMP primer by providing an additional sequence on the 'side.
  • the primer set may be a PCR primer or an isothermal amplification primer such as a LAMP primer.
  • A A set of a forward primer that hybridizes in the region of (1) and a reverse primer that hybridizes in the region of (2).
  • B A set of a forward primer that hybridizes in the region of (3) and a reverse primer that hybridizes in the region of (1).
  • (C) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (4) and a reverse primer that hybridizes in the region of (9).
  • (D) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (5) and a reverse primer that hybridizes in the region of (8).
  • (E) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (6) and a reverse primer that hybridizes in the region of (8).
  • F A set of a forward primer that hybridizes in the region of (6) and a reverse primer that hybridizes in the region of (10).
  • (G) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (6) and a reverse primer that hybridizes in the region of (11).
  • (H) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (7) and a reverse primer that hybridizes in the region of (10).
  • (I) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (7) and a reverse primer that hybridizes in the region of (11).
  • (J) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (7) and a reverse primer that hybridizes in the region of (12).
  • (K) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (8) and a reverse primer that hybridizes in the region of (10).
  • (L) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (8) and a reverse primer that hybridizes in the region of (11).
  • (M) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (13) and a reverse primer that hybridizes in the region of (14).
  • (N) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (6) and a reverse primer that hybridizes in the region of (12).
  • (O) A set of a forward primer that hybridizes in the region of (8) and a reverse primer that hybridizes in the region of (12).
  • the following set can be mentioned as a specific example of the set of (A) to (O).
  • the alphabet corresponds to each of the above (A) to (O), and for example, the following (A-1) to (A-10) are examples of the set of (A).
  • A-1) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 or a gene polymorphism site in the base sequence of SEQ ID NO: 26
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 3 and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 30
  • the set of LMO0084-F286A and LMO0084-R757A in the following example is a specific example of this set.
  • the set with the reverse primer which contains the sequence by which 4 or less bases were substituted in the gene polymorphism site
  • the set of LMO0084-F286A and LMO0084-R757B in the following example is a specific example of this set.
  • the set of LMO0084-F286B and LMO0084-R757A in the following example is a specific example of this set.
  • A-4) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 or a gene polymorphism site in the base sequence of SEQ ID NO: 27
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence in which the base of SEQ ID NO: 3 is substituted, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 31, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 31
  • the set of LMO0084-F286B and LMO0084-R757B in the following example is a specific example of this set.
  • A-5 At least 15 consecutive bases, preferably at least 18 bases, more preferably at full length in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, or 4 or less at a polymorphic site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 3 and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 30
  • the set of LMO0084-F281A and LMO0084-R757A in the following example is a specific example of this set.
  • A-6) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 28 or a gene polymorphism site in the base sequence of SEQ ID NO: 28
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence in which the base of SEQ ID NO: 3 is substituted, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 31, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 31
  • the set of LMO0084-F281A and LMO0084-R757B in the following example is a specific example of this set.
  • A-7) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29, or 4 or less at a polymorphic site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 3 and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 30
  • the set of LMO0084-F281B and LMO0084-R757A in the following example is a specific example of this set.
  • A-8) 15 or more consecutive bases in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29, preferably 18 or more, more preferably 4 or less at a gene polymorphism site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence in which the base of SEQ ID NO: 3 is substituted, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 31, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 31
  • the set of LMO0084-F281B and LMO0084-R757B of the following example is a specific example of this set.
  • a mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 67, and the base shown in SEQ ID NO: 69 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO0084-F286 / M and LMO0084-R757 / M in the following example is an example of this set.
  • a mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 68, and the base shown in SEQ ID NO: 69 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO0084-F281 / M and LMO0084-R757 / M in the following example is an example of this set.
  • (B-1) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 58, or 4 or less at a polymorphic site in the base sequence of SEQ ID NO: 58
  • the set of LAMP primers LMO 84 FIP and LMO 84 BIP in the following example is a specific example of this set.
  • the set of LMO 2736-F8 and LMO 2736-R 176 in the following example is a specific example of this set.
  • (D-1) At least 15 consecutive bases, preferably at least 18 bases, more preferably at full length in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 33, or 4 or less at a polymorphic site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33
  • the set of LMO 2736-F222 and LMO 2736-R 591 in the following example is a specific example of this set.
  • (D-2) A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 or more bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 70, and the base shown in SEQ ID NO: 74 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F222 / M and LMO 2736-R591 / M in the following example is an example of this set.
  • the set of LMO 2736-F488 and LMO 2736-R 591 in the following example is a specific example of this set.
  • (E-2) A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 71, and the base shown in SEQ ID NO: 74 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F488 / M and LMO 2736-R591 / M in the following example is an example of this set.
  • the set of LMO 2736-F488 and LMO 2736-R 685 in the following example is a specific example of this set.
  • (F-2) A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 71, and the base shown in SEQ ID NO: 75 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F488 / M and LMO 2736-R 685 / M in the following example is an example of this set.
  • (G-1) At least 15 consecutive bases, preferably at least 18 bases, more preferably at full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 34, or 4 or less at a polymorphic site in the base sequence of SEQ ID NO: 34
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 40, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 40, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 40
  • the set of LMO 2736-F488 and LMO 2736-R 771 in the following example is a specific example of this set.
  • G-2 A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 71, and the base shown in SEQ ID NO: 76 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F488 / M and LMO 2736-R 771 / M in the following example is an example of this set.
  • (H-2) A mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 72, and the base shown in SEQ ID NO: 75
  • the set of LMO 2736-F530 / M and LMO 2736-R 685 / M in the following example is an example of this set.
  • (I-1) 4 or less consecutive 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full-length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 35, or 4 or less at a polymorphic site in the base sequence of SEQ ID NO: 35
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 40, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 40, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 40
  • the set of LMO 2736-F530 and LMO 2736-R 771 in the following example is a specific example of this set.
  • (I-3) At least 15 consecutive bases, preferably at least 18 bases, more preferably at full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 62, or 4 or less at a polymorphic site in the base sequence of SEQ ID NO: 62 And a forward primer containing the sequence at the 3 'end of the base sequence, and 15 or more consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 61, preferably a full-length sequence, or a gene within the base sequence of SEQ ID NO: 61 A set with a reverse primer containing a sequence substituted at the 4 or less bases at the type site on its 3 'side.
  • the set of LAMP primers LMO 2736-2 FIP and LMO 2736-2 BIP in the following example is a specific example of this set.
  • a mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 72, and the base shown in SEQ ID NO: 76 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F530 / M and LMO 2736-R771 / M in the following example is an example of this set.
  • the set of LMO 2736-F530 and LMO 2736-R 992 in the following example is a specific example of this set.
  • J-2 A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 72, and the base shown in SEQ ID NO: 41
  • the set of LMO 2736-F530 / M and LMO 2736-R 992 in the following example is an example of this set.
  • the set of LMO 2736-F572 and LMO 2736-R 685 in the following example is a specific example of this set.
  • (K-2) A mixed forward primer containing a continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence in the base sequence shown in SEQ ID NO: 73, and the base shown in SEQ ID NO: 75 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F572 / M and LMO 2736-R 685 / M in the following example is an example of this set.
  • L-1 At least 15 consecutive bases, preferably at least 18 bases, more preferably at full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 36, or 4 or less at a polymorphic site in the base sequence of SEQ ID NO: 36
  • a forward primer containing on the 3 'side thereof a sequence having a base of SEQ ID NO: 40, and 15 consecutive bases or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 40, preferably 18 bases or more, more preferably a full length sequence, or SEQ ID NO: 40
  • the set of LMO 2736-F572 and LMO 2736-R 771 in the following example is a specific example of this set.
  • L-2 A mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 73, and the base shown in SEQ ID NO: 76 A set with a mixed reverse primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more consecutive bases, more preferably a full length sequence on its 3 'side.
  • the set of LMO 2736-F572 / M and LMO 2736-R771 / M in the following example is an example of this set.
  • (M-1) A continuous sequence of 15 bases or more, preferably 18 bases or more, more preferably 20 bases or more in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 63, more preferably a full-length sequence, or a gene within the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63
  • a forward primer including on the 3 'side thereof a sequence having a substitution of 4 or less bases in the polymorphic site, and 4 or less in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 64, or a gene polymorphic site in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64 A set with a reverse primer containing the sequence substituted at the base of 3 at its 3 'side.
  • the set of LAMP primers LMO 2736-10 FIP and LMO 2736-10 BIP in the following example is a specific example of this set.
  • N-1) A mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 71, and the base shown in SEQ ID NO: 41
  • the set of LMO 2736-F488 / M and LMO 2736-R 992 in the following example is an example of this set.
  • (O-1) A mixed forward primer containing a sequence of 15 or more consecutive bases, preferably 18 or more bases, more preferably a full length in the base sequence shown in SEQ ID NO: 73, and the base shown in SEQ ID NO: 41
  • the set of LMO 2736-F572 / M and LMO 2736-R992 in the following example is an example of this set.
  • the primer containing a specific sequence at its 3 'side includes a primer having an arbitrary sequence added at the 5' side of the specific sequence, and a primer consisting of the specific sequence.
  • a primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 on its 3 'side a primer to which an arbitrary sequence was added on the 5' side of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 And primers are included.
  • Preferred specific examples of the polymorphic site in each of the nucleotide sequences described in (A-1) to (O-1) are as follows.
  • the primer containing a base substitution the primer which contains in the 3 'side the sequence by which at least 1 base selected from the specific example of the gene polymorphism site shown below, respectively is substituted can be mentioned.
  • These specific examples are identified from the alignment of 12 types of lmo0084 gene sequences of 12 serotypes shown in SEQ ID NO: 1 to 12 and the alignment of 13 types of lmo2736 gene sequences of 12 serotypes shown in SEQ ID NO: 13 to 25 Site of gene polymorphism.
  • gene polymorphism sites may be found in addition to the specific examples described below.
  • the polymorphic site in each sequence in the present invention is not limited to the following specific examples.
  • LAMP primers can be constructed by selecting an arbitrary partial region located inside the target region of the primer and adding the complementary strand of the partial region to the 5 'side of the primer.
  • Software for designing LAMP primers is known, and using such known software, based on the specific primer setting region of (1) to (14) described above, for monocytogenes specific detection. LAMP primers can be designed.
  • each region is required to be arranged in the order of F3, F2, F1, B1, B2 and B3 from the 5 'upstream side, and the complementary sequence of F1 sequence (antisense strand sequence) is the 5' end of F2.
  • the LAMP primer set is configured with the primer.
  • the specific primer setting region of the above (1) to (14) may be adopted for at least one, preferably both of F2 and B2.
  • the amplification size is a set of about 200 to 300 bp
  • select one that overlaps with the primer setting region for both F2 and B2 What is necessary is just to select one that overlaps with the primer setting region in one of F2 and B2 if the amplification size is out of the range, and the other may be appropriately selected from the sequences listed as candidates by the software. .
  • the following (i) to (iv) are an example of the primer set of (A-2), a set of LMO0084-F286A and LMO0084-R757B, and an example of the primer set of (I-1), LMO2736-F530 and It is a LAMP primer set designed based on the LMO 2736-R771 set.
  • these sets can be mentioned.
  • Isothermal amplification primers used other than the LAMP method can also be designed based on the specific primer setting regions of (1) to (14) described above using known software and the like.
  • a probe containing an oligonucleotide part of the sequence shown in SEQ ID NO: 85 means a probe containing an oligonucleotide part (SEQ ID NO: 78) where n --- n is T --- A, n --- n is C- It is a mixed probe with a probe comprising an oligonucleotide moiety which is --C (SEQ ID NO: 79).
  • a probe containing an oligonucleotide part of the sequence shown in SEQ ID NO: 86 means a probe containing an oligonucleotide part (SEQ ID NO: 83) in which n ---- n is G ---- G; --- a mixed probe with a probe comprising an oligonucleotide part (SEQ ID NO: 84) in which n is C ---- C.
  • the probe of SEQ ID NO: 85 and the probe of SEQ ID NO: 86 are a mixed probe of two types of oligonucleotide probes, but the mixing ratio of the two types of probes is about 1: 5 to 5: 1 in molar ratio, eg 1: 2 It may be about 2: 1 or about 1: 1.5 to 1.5: 1, and can be preferably used at about 1: 1.
  • each probe may be used in combination with a primer set for amplifying a region including the set region.
  • a probe containing an oligonucleotide moiety of these sequences can be preferably used as a capture probe for nucleic acid chromatography or as a probe for real-time PCR.
  • the 5 'end and 3' end of the oligonucleotide may be modified with a fluorescent substance and a quencher substance.
  • the 5 'end is modified with a fluorescent substance and the 3' end with a quencher substance.
  • Particularly preferred primer-probe combinations are described in Tables 23 and 25 of the following Examples.
  • candidate genes were finally narrowed down to six genes (LMO 0083, LMO 0084, LMO 0444, LMO 0833, LMO 2387, LMO 2736).
  • PCR primers For each of these six genes, multiple PCR primers are designed, and others including six monocytogenes strains (serotypes 1 / 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 4a, 4b, 4d) and L. innocua PCR was actually performed using three Listeria bacteria (L. innocua, L. grayi, L. ivanovii) to verify the specificity to monocytogenes bacteria.
  • the PCR primers at this time were designed by targeting the common region by comparing the sequences of monocytogenes serotypes (using the sequences of accession numbers in Table 2 above).
  • LMO 0083, LMO 0444, LMO 0833, or MLO 2387 can not detect any of the 6 strains, or other Listeria bacteria also amplify, making it difficult to design a highly specific primer set.
  • Met for example, in the case of the LMO0833 gene, the combination of primer F329 (ggaaagcaattgtccactcga, SEQ ID NO: 65) and primer R610 (tgttggtgagtagcgtggaa, SEQ ID NO: 66) resulted in no amplification of Listeria and no specificity was obtained. However, no amplification was seen in serotype 4a monocytogenes. Table 4 shows an example of the PCR result of each candidate gene.
  • ⁇ Method> 1 Strains used The various strains (Table 5-1 to Table 5-3) used for the PCR test are the National Research Institute for R & D RIKEN BioResource Center, Microorganism Material Development Division (JCM), and the National University Corporation Gifu University research promotion and social collaboration. It was obtained from the Organization for Microbial Germplasm Conservation (GTC), the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnologies (IFO), the JA All Agriculture Animal Health Institute (JA), and the University of Tokyo Applied Microbiology Institute (IMCB).
  • GTC Organization for Microbial Germplasm Conservation
  • IFO National Institute of Technology and Evaluation Biotechnologies
  • JA JA All Agriculture Animal Health Institute
  • IMCB University of Tokyo Applied Microbiology Institute
  • lmo0084 gene SEQ ID NOS: 1-12
  • lmo2736 gene SEQ ID NOS: 13-25
  • Table 6 shows a partial arrangement thereof.
  • the primers of SEQ ID NOs: 26, 28 and 30 reflect genetic polymorphisms of Monocytogenes serotype 1 / 2a type
  • the primers of SEQ ID NOs: 27, 29 and 31 reflect genetic polymorphism of serotype 4 a type Designed to be.
  • the primers of SEQ ID NOs: 32, 37, and 41 have a sequence common to each monocytogenes serotype, and the primers of SEQ ID NOs: 33, 34, 35, 36, 38, 39, and 40 have monocytogenes serum. It was designed to reflect the type 1/2 c type polymorphism.
  • the designed PCR primers were synthesized by outsourcing to Fasmac.
  • the template DNA was obtained by extracting genomic DNA from various strains using the mericon DNA Bacteria Plus Kit (QIAGEN).
  • PCR was performed using GeneAmp PCR System 9700.
  • the reaction cycle was: 94 ° C. 2 minutes ⁇ (94 ° C. 20 seconds ⁇ 60 ° C. 20 seconds ⁇ 72 ° C. 40 seconds) ⁇ 30 cycles ⁇ 72 ° C. 7 minutes ⁇ 4 ° C.
  • a culture medium for selective separation of monocytogenes Various Listeria bacteria were inoculated on ALOA agar medium (Sysmex Corporation) and Cromoagar agar medium (Kanto Chemical Co.) and cultured at 37 ° C. for about 24 hours to observe colonies. Monocytogenes bacteria form blue-green colonies with a milky white halo on ALOA agar, and blue colonies with a milky white halo on chromoagar agar.
  • L. ivanovii and L. seeligeri form a halo similarly to monocytogenes bacteria on ALOA agar medium or chromoagar agar medium that is generally used for selective isolation of monocytogenes bacteria, with monocytogenes bacteria.
  • amplifications did not occur with respect to various isolates of these Listeria bacteria, resulting in negative results.
  • monocytogenes strain JMC7673 strain No. 4 in the table
  • such a strain was also detectable as a monocytogenes bacterium.
  • the primer sets shown in Tables 8-1 to 8-4 had extremely excellent specificity to monocytogenes bacteria.
  • LAMP primers were designed based on primer set F286A / R757B targeting lmo0084 gene and primer set F530 / R771 targeting lmo2736 gene.
  • the known LAMP method primer design support software LAMP Designer 1.14 (manufactured by OptiGene) was used for primer design.
  • the LAMP primer set for specifically detecting monocytogenes bacteria obtained as described above is shown below.
  • the lmo 0084 LAMP primer set was designed to reflect the monocytogenes serotype 1 / 2a type polymorphism.
  • the lmo2736 LAMP primer set was designed to reflect the monocytogenes serotype 1 / 2c type polymorphism except for SEQ ID NO: 64.
  • a mixed primer was designed using a mixed base at the lmo2736 primer design site shown in Table 6.
  • the column of “SEQ ID NO:” shows the SEQ ID NO of lmo2736 gene of each serotype referenced or the SEQ ID NO describing the sequence of the primer.
  • TaqMan (registered trademark) probe was designed to construct a real-time PCR detection system.
  • LMO 0084 Gene The following conditions are general for the design of TaqMan (registered trademark) probe. Design TaqMan® probes from 20 mer to 30 mer (cited by Thermo Fisher). -The length of the amplification target is ideally 70 bp to 200 bp and should not exceed 300 bp (QIAGEN reference).
  • the length of the amplification target is approximately It was 470 bp.
  • TaqMan® probes were designed within this range, as shorter lengths did not yield PCR specificity. Sequences having a common sequence of 2 bases or less in Monocytogenes with 20 mer or more were present in three places in the amplification target (Table 20).
  • probe sequences The 5 'end of the oligonucleotide consisting of each sequence was modified with the fluorescent substance FAM (6-Carboxyfluorescein) and the 3' end with the quencher substance TAMRA to prepare a TaqMan (registered trademark) probe.
  • FAM fluorescent substance
  • TAMRA quencher substance
  • 0084TMP 366-389 TATTACATTCATAGAATTGACC (SEQ ID NO: 77)
  • 0084TMP535-558 TA: ATCTGGTGGCGAGAAGC T GAA A
  • 0084TMP 535-558 CC
  • ATCTGGTGGCGAGAAGC C GAA C
  • SEQ ID NO: 79 0084TMP 686-711: TACCAAGATTCCAAAAGAAGCCATG (SEQ ID NO: 80)
  • agarose electrophoresis of the PCR product was also performed to confirm the presence or absence of the band and the band size.
  • the results of the real time PCR test are shown in Tables 22-1 to 22-3.
  • the 0084 TMP366-389 and 0084TMP686-711 were able to specifically detect monocytogenes bacteria when combined with either primer set. It has been found that, by using mixed probes, TMP535-558 (TA) and 0084TMP 535-558 (CC) can specifically detect monocytogenes bacteria similarly.
  • the composition of the reaction solution may be 0.25 ⁇ L of 100 ⁇ M 0084TMP 535 (558) and 0.25 ⁇ L of 100 ⁇ M 0084 TMP 535 (558) (CC).
  • probe sequences The following four types of sequences were adopted as probe sequences.
  • the 5 'end of the oligonucleotide consisting of each sequence was modified with the fluorescent substance FAM (6-Carboxyfluorescein) and the 3' end with the quencher substance TAMRA to prepare a TaqMan (registered trademark) probe.
  • FAM fluorescent substance
  • TAMRA quencher substance
  • 2736TMP 70-89 AAAAAAGGCTGGACTAAAGC (SEQ ID NO: 81)
  • 2736TMP 372-393 ACGTAAAAAATCATTATC (SEQ ID NO: 82)
  • 2736TMP 619-647 (GG): GTTTTCGGTGCTCAAAAAGG G GCAA G TCC (SEQ ID NO: 83)
  • 2736TMP 619-647 (CC): GTTTTCGGTGCTCAAAAAGG C GCAA C TCC (SEQ ID NO: 84)
  • the real time PCR test was performed using the combination of primers and probes shown in Table 24 below.
  • 2736TMP 619-647 (GG) and 2736TMP 619-647 (CC) were used alone or in combination as a probe.
  • the numbers in [] are the sequence numbers in the sequence listing.
  • the test strain used, the composition of the real-time PCR reaction solution and the reaction conditions were the same as in the above-described LMO0084 gene detection test.
  • the reaction liquid composition in the case of using 2736TMP 619-647 (SS) was 0.25 ⁇ L of 100 ⁇ M 2736TMP 619-647 (GG) and 0.25 ⁇ L of 100 ⁇ M 2736TMP 619-647 (CC).
  • 0084TMP 535-558 is a probe that can specifically detect serotype 4a.
  • CC 0084TMP 535-558

Abstract

他のリステリア属菌と区別してモノサイトゲネス菌のみを十分に高い精度で検出することを可能にする新規な手段が開示されている。本願発明者らは、モノサイトゲネス菌のゲノムを鋭意に解析し、核酸増幅法を利用してモノサイトゲネス菌を他のリステリア属菌と区別して特異的に検出できる標的領域として２つの遺伝子（lmo0084遺伝子、lmo2736遺伝子）を同定した。これら２つの遺伝子の塩基配列についてさらに鋭意検討し、モノサイトゲネス菌のみを高い精度で特異的に検出するプライマー設定領域を同定し、好ましいPCRプライマーセット、LAMPプライマーセット、及びリアルタイムPCR用プライマー・プローブセットの具体例を確立した。

Description

リステリア・モノサイトゲネス検出方法
　本発明は、リステリア・モノサイトゲネスを特異的に検出する方法及びそのためのプライマーに関する。
　リステリア症とは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes、以下「モノサイトゲネス菌」ということがある）によって引き起こされる感染症である。リステリア属には10菌種程度が知られているが、ヒトにリステリア症を引き起こすのはモノサイトゲネス菌のみである。
　欧米諸国では本菌は重要な食中毒菌として捉えられており、我が国においても、肉製品や乳製品等の種々の食品からモノサイトゲネス菌がしばしば検出されている。モノサイトゲネス菌は通常の加熱調理で死滅するため、加熱調理を要する食品で食中毒が起こることはまれである。しかしながら、モノサイトゲネス菌は冷蔵庫内等の低温条件下でも増殖するため、チーズをはじめとする乳製品やハム、サラミ、スモークサーモンなどの加熱調理なしで喫食する食品では、低温で適正に保存していてもモノサイトゲネス菌による食中毒の危険が伴うことになる。
　モノサイトゲネス菌の公定の定性試験法では、ALOA寒天培地やクロモアガー寒天培地などの選択分離培地上で乳白色のハローを伴うコロニーが形成された場合にはモノサイトゲネス菌と判定される（非特許文献１）。しかしながら、リステリア属菌にはモノサイトゲネス菌以外にもハローを形成する種があり、そのようなリステリア属菌が混入していた場合にはモノサイトゲネス菌陽性の判定となってしまう。その他、選択分離培地を用いる公定法には、数日間の確認培養が必要で判定までに日数がかかる、当該確認培養には熟練を要する等の問題点もある。
　リアルタイムPCRなどによりモノサイトゲネス菌を検出するためのプライマーが種々報告されており（例えば特許文献１、２）、市販のキットも存在する。これらの先行技術では、モノサイトゲネス菌の病原性に関与する遺伝子をターゲットとしている。しかしながら、市販の検査キットも含め、公知の手法では偽陰性や偽陽性の発生を十分に抑えることができておらず、モノサイトゲネス菌のみを特異的に検出する検査法として十分に満足できるものではない。
特開2010-263873号公報 特開2007-61061号公報
食安発1128第2号「リステリア・モノサイトゲネスの検査について」、平成26年11月28日
　本発明の目的は、他のリステリア属菌と区別してモノサイトゲネス菌のみを十分に高い精度で検出することを可能にする手段を提供することにある。
　本願発明者らは、モノサイトゲネス菌のゲノムを鋭意に解析し、核酸増幅法を利用してモノサイトゲネス菌を他のリステリア属菌と区別して特異的に検出できる標的領域として２つの遺伝子を同定した。これら２つの遺伝子の塩基配列をさらに詳細に検討し、多数のプライマーを設計し、モノサイトゲネス菌株及びその他のリステリア属菌株のゲノムDNAに対してプライマーを種々組み合わせて鋭意検討した結果、モノサイトゲネス菌のみを高い精度で特異的に検出するプライマー設定領域の同定に成功し、好ましいPCRプライマーセット及びLAMPプライマーセットの具体例をも確立するに至り、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、リステリア・モノサイトゲネスのlmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の部分領域を増幅する下記のいずれかのプライマーセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマーセットを提供する。
(A-1)　配列番号２６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-2)　配列番号２６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-3)　配列番号２７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-4)　配列番号２７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-5)　配列番号２８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-6)　配列番号２８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-7)　配列番号２９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(A-8)　配列番号２９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(B-1)　配列番号５８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号５９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(C-1)　配列番号３２に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(D-1)　配列番号３３に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(E-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(F-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(G-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(H-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(I-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(I-2)　配列番号６０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(I-3)　配列番号６２に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(J-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(K-1)　配列番号３６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(L-1)　配列番号３６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(M-1)　配列番号６３に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
　また、本発明は、下記のいずれかのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマーセットを提供する。
(A-9)　配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(A-10)　配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(D-2)　配列番号７０に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(E-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(F-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(G-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(H-2)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(I-4)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(J-2)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(K-3)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(L-2)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
(N-1)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
(O-1)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
　さらに、本発明は、下記のいずれかのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用ループ媒介等温増幅プライマーセットを提供する。
(i)　配列番号４２に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４３に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４４に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４５に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(ii)　配列番号４６に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４７に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４８に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４９に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(iii)　配列番号５０に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５１に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５２に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５３に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(iv)　配列番号５４に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５５に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５６に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５７に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
　さらに、本発明は、上記本発明のプライマーセットを使用した核酸増幅法により、lmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の部分領域を増幅する工程を含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法を提供する。
　さらにまた、本発明は、配列番号７７、配列番号８０～８２、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）、又は配列番号８６（ngcaanはggcaag又はcgcaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プローブを提供する。
　さらにまた、本発明は、以下のいずれかのプライマー及びプローブのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出のためのリアルタイムPCR用プライマー及びプローブセットを提供する。
[1] 配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号７７又は８０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
[2] 配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
[3] 配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号７７又は８０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
[4] 配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
[5] 配列番号３２に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３７に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
[6] 配列番号７０に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
[7] 配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８６（ngcaanはggcaag又はcgcaac）に示す配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
　本発明によれば、モノサイトゲネス菌の各種菌株をモノサイトゲネス菌以外のリステリア属菌と区別して特異的に検出できるプライマーが提供される。本発明の手法によれば、従来の核酸増幅法による検査法と比べて、偽陰性や偽陽性の発生が大きく低減される。リステリア属菌の中には、モノサイトゲネス菌以外にも選択分離培地上で乳白色のハローを伴うコロニーを形成する種が存在するが、本発明によればそのような菌株でも増幅が起こらず、核酸増幅法の結果のみでもモノサイトゲネス菌と区別することが可能である。また、下記実施例のTaqMan(登録商標)プローブ0084TMP535-558(CC)のように、個々の血清型に特徴的な多型配列をターゲットとしてプローブを設計し、リアルタイムPCRを行なうことで、モノサイトゲネス菌の血清型判別も可能となる。
モノサイトゲネス菌をALOA寒天培地及びクロモアガー寒天培地で培養したコロニーの画像である（ハローを形成した陽性コロニー、及びハローを形成しない偽陰性のコロニーの画像の一例）。 モノサイトゲネス菌以外のリステリア属菌をALOA寒天培地及びクロモアガー寒天培地で培養したコロニーの画像である（ハローを形成した偽陽性のコロニーの画像の一例）。 モノサイトゲネス菌以外のリステリア属菌をALOA寒天培地及びクロモアガー寒天培地で培養したコロニーの画像である（ハローを形成しない陰性のコロニーの画像の一例）。 実施例で設計したリステリア・モノサイトゲネス検出用PCRプライマーによるPCRの結果の一例である。lmo00084遺伝子を対象としたPrime set No. 4を使用してＰＣＲし、2％のアガロースゲル電気泳動により検出した。矢印で示した476 bpのＰＣＲ産物がモノサイトゲネス菌の特異的増幅産物である。各レーンに付した番号は表５－１及び表５－２に示した菌株番号に対応する。１～１０がモノサイトゲネス（１から順番に血清型1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4d、5）であり、１１～２２がモノサイトゲネス以外のリステリア属菌である。 実施例で設計したリステリア・モノサイトゲネス検出用PCRプライマーによるPCRの結果の一例である。lmo02736遺伝子を対象としたPrime set No. 1を使用してＰＣＲし、2％のアガロースゲル電気泳動により検出した。矢印で示した168 bpのＰＣＲ産物がモノサイトゲネス菌の特異的増幅産物である。矢印が特異的増幅産物。各レーンに付した番号は図２－１と同じ。
　本発明では、モノサイトゲネス菌のゲノム中に存在する下記２つの遺伝子のいずれかを検出対象とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列表の配列番号１～１２には、モノサイトゲネス菌の血清型1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 7のlmo0084遺伝子の塩基配列をそれぞれ示す。配列番号１３～２５には、モノサイトゲネス菌の上記血清型のlmo2736遺伝子の塩基配列をそれぞれ示す（4bは配列番号２０、２１に２種類示した）。本明細書では、各遺伝子の部分領域を特定するに当たり、lmo0084遺伝子は配列番号１に示す血清型1/2aの塩基配列を、lmo2736遺伝子は配列番号１３に示す血清型1/2aの塩基配列を基準として用いる。例えば、「配列番号１に示すlmo0084遺伝子における306位～737位の領域」といった場合には、各種血清型のlmo0084遺伝子における306位～737位の領域が包含される。lmo2736遺伝子についても同様である。配列番号１～２５の配列のAccession番号は下記表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　モノサイトゲネス菌の特異的検出は、lmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の領域内に特異的にハイブリダイズするリステリア・モノサイトゲネス検出用プライマーを用いた核酸増幅法により行なうことができる。核酸増幅法としては、PCR法や等温増幅法など種々の公知の手法を用いることができる。本発明において、プライマーという語には、PCRプライマー及び等温増幅プライマーが包含される。なお、本発明において、PCR法とは、温度変化を繰り返して目的領域を増幅させる核酸増幅法をいう。
　「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象とする領域にのみハイブリダイズし、その他の領域には実質的にハイブリダイズしないという意味である。「通常のハイブリダイズの条件下」とは、通常のＰＣＲのアニーリングに用いられる条件下のことをいい、例えば、Taqポリメラーゼを用いたPCRの場合には、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3～9.0)、1.5mM MgCl2といった一般的な緩衝液を用いて、54℃～60℃程度の適当なアニーリング温度で反応を行なうことをいう。ただし、適当なアニーリング温度は、上記例示に限定されず、プライマーのTm値及び実験者の経験則に基づいて定められ、当業者であれば容易に定めることができる。「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないか、するとしても対象とする領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少なく、相対的に無視できる程度の微量しかハイブリダイズしないという意味である。
　前記核酸増幅法により得られた増幅産物の検出は、公知の検出法であれば何れも適用することができる。PCR法であれば電気泳動法やインターカレーション法、クエンチャー媒介蛍光検出法等により行ってもよいし、等温増幅法であれば増幅副産物であるピロリン酸の不溶化法やインターカレーション法、クエンチャー媒介蛍光検出法等により行ってもよく、また、増幅産物を核酸クロマトグラフィーにより検出してもよい。
　PCR法という語にはリアルタイムPCR法も包含される。リアルタイムPCRでは、一般にインターカレーション法又はクエンチャー媒介蛍光検出法により増幅産物の検出・モニタリングが行われる。下記実施例には、クエンチャー媒介蛍光検出法の一例であるTaqMan(登録商標)プローブ法を用いたリアルタイムPCR検出系の具体例が記載されているが、これに限定されず、各種の手法を採用することができる。
　核酸クロマトグラフィーであれば、まず本発明のモノサイトゲネス菌検出用プライマーのセットを用いて核酸増幅を行ない、その増幅産物と特異的に結合する捕捉物質をライン状等に固定したストリップ上を展開することにより検出することができる。増幅産物を捕捉するために、例えば、フォワード又はリバースプライマーの５’側にビオチンやＤＩＧ等の標識化合物や任意の塩基配列を付加し、ストリップ上にアビジンや抗ＤＩＧ抗体等の標識化合物特異的結合物質や任意の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴ核酸プローブを捕捉物質として固定化することができる。検出の特異性をより高めるために、ストリップ上の捕捉プローブとして、プライマーによる増幅領域内のいずれかの部分配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブを用いることができる。このような捕捉プローブは、プライマーによる増幅領域内の部分領域を適宜選択し、配列番号１～１２に示した各血清型のlmo0084遺伝子、又は配列番号１３～２５に示した各血清型のlmo2736遺伝子の塩基配列を参考に、各血清型の増幅産物にハイブリダイズできるプローブを設計すればよい。検出系は、公知の核酸クロマトグラフィー法と同様に構築すればよく、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素、金コロイドや着色ラテックス等の粒子を用いた発色検出法が挙げられる。
　等温増幅法は特に限定されず、ループ媒介等温増幅（Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP）法、鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification; SDA）法、キメラプライマー等温核酸増幅（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids; ICAN）法、ヘリカーゼ依存増幅（Helicase-Dependent Amplification; HDA）法、ニッキング酵素増幅反応（Nicking Enzyme Amplification Reaction; NEAR）法等の各種の等温増幅法を用いることができる。等温増幅プライマーの一例として、下記実施例で設計されたLAMPプライマーを挙げることができる。
　本発明において検査対象となる典型的なサンプルは、食品（原材料、加工食品を包含する）から採取したサンプルであるが、これに限定されず、食品工場の製造ラインや従業者の手指などのぬぐい液など、モノサイトゲネス菌の検査が望まれる種々のサンプルが対象となり得る。
　モノサイトゲネス菌を他のリステリア属菌及び他の食中毒病原菌と区別して特異的に検出するための、PCR法及び等温増幅法等の核酸増幅法に使用するプライマーセットは、配列番号１に示すlmo0084遺伝子配列又は配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列の領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーセットを使用することができる。プライマーセットの設計においては、プライマーの長さ、ＧＣ含量、Ｔｍ値、塩基の偏り、連続配列、プライマー内及びプライマー間の相補性、増幅産物の分子量、更には標的領域の遺伝子多型等を考慮すればよい。ＰＣＲ法に使用するプライマーセットであれば、その長さは１５～３０塩基程度、ＧＣ含量は４０～６０％程度、Ｔｍ値は５０～７０℃程度になるように設計すればよい。ＰＣＲ法以外の核酸増幅法では、例えば下記に示すＬＡＭＰ法のようにその原理に応じてプライマーセットを設計することができる。
　このようなプライマーセットを構成する各プライマーは、一般には、各血清型間で配列の多様性が少ない領域に設計することが望ましいが、少数の遺伝子多型を含む領域に設計してもよい。遺伝子多型を含む領域にプライマーを設計する場合、配列番号１又は配列番号１３に示す血清型1/2aの各遺伝子配列に対して、遺伝子多型を反映させた塩基置換を加えてプライマーを設計することができる。遺伝子多型を反映させた塩基置換の個数は、１のプライマーに対して２０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。より具体的には、付加配列を含まない鎖長２０塩基のプライマーの場合、その２０塩基の領域内の遺伝子多型部位において４個以下、好ましくは３個以下の塩基が置換された配列でプライマーを設計してもよい。そのようにして設計されたプライマーは、他の血清型の遺伝子配列の部分領域又はその相補鎖と同一の配列となる場合もあり得る。遺伝子多型部位における置換を含むプライマーを使用する場合、遺伝子多型毎のプライマーを使用してもよく、遺伝子多型毎のプライマーを混合した混合プライマーを使用してもよく、遺伝子多型部位を遺伝子多型に応じた混合塩基になる様に合成したミックスプライマー（例えば、ある部位の塩基が一部の血清型でGであり、他の血清型でCである場合には、その部位の塩基をS（G or C）としたミックスプライマー）を使用してもよい。
　本発明では、モノサイトゲネス菌を特異的に検出するプライマーは、以上のことを勘案して下記(1)～(14)のいずれかの領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーを設計すればよい。
(1)　配列番号１に示すlmo0084遺伝子配列における261位～325位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO0084-F286A（配列番号２６）、LMO0084-F286B（配列番号２７）、LMO0084-F281A（配列番号２８）、LMO0084-F281B（配列番号２９）は、当該261位～325位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。また、LMO0084-F286/M（配列番号６７）、LMO0084-F281/M（配列番号６８）は、当該領域と相補的な領域内にハイブリダイズする混合フォワードプライマーの具体例である。また、配列番号５９に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLAMPプライマーのLMO84 BIP（配列番号４５）は、当該261位～325位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。
(2)　配列番号１に示すlmo0084遺伝子配列における718位～777位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO0084-R757A（配列番号３０）、LMO0084-R757B（配列番号３１）は、当該718位～777位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。また、LMO0084-R757/M（配列番号６９）は、当該領域内にハイブリダイズする混合リバースプライマーの具体例である。
(3)　配列番号１に示すlmo0084遺伝子配列における108位～166位の領域又は該領域と相補的な領域。
　配列番号５８に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLAMPプライマーのLMO84 FIP（配列番号４４）は、当該108位～166位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。
(4)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における1位～47位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-F8（配列番号３２）は、当該1位～47位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。
(5)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における202位～261位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-F222（配列番号３３）は、当該202位～261位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。また、LMO2736-F222/M（配列番号７０）は、当該領域と相補的な領域内にハイブリダイズする混合フォワードプライマーの具体例である。
(6)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における468位～527位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-F488（配列番号３４）は、当該468位～527位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。また、LMO2736-F488/M（配列番号７１）は、当該領域と相補的な領域内にハイブリダイズする混合フォワードプライマーの具体例である。
(7)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における510位～569位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-F530（配列番号３５）や、配列番号６０又は６２に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLMO2736-1 FIP（配列番号４８）及びLMO2736-2 FIP（配列番号５２）は、当該510位～569位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。また、LMO2736-F530/M（配列番号７２）は、当該領域と相補的な領域内にハイブリダイズする混合フォワードプライマーの具体例である。
(8)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における552位～611位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-F572（配列番号３６）は、当該552位～611位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例であり、LMO2736-F572/M（配列番号７３）は、当該領域と相補的な領域内にハイブリダイズする混合フォワードプライマーの具体例であり、LMO2736-R591（配列番号３８）は、当該552位～611位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。
(9)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における137位～196位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-R176（配列番号３７）は、当該137位～196位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。
(10)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における646位～705位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-R685（配列番号３９）は、当該646位～705位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。LMO2736-R685/M（配列番号７５）は、当該領域内にハイブリダイズする混合リバースプライマーの具体例である。
(11)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における732位～791位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-R771（配列番号４０）や、配列番号６１に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLMO2736-1 BIP（配列番号４９）及びLMO2736-2 BIP（配列番号５３）は、当該732位～791位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。また、LMO2736-R771/M（配列番号７６）は、当該領域内にハイブリダイズする混合リバースプライマーの具体例である。
(12)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における953位～1012位の領域又は該領域と相補的な領域。
　実施例のLMO2736-R992（配列番号４１）は、当該953位～1012位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。
(13)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における496位～560位の領域又は該領域と相補的な領域。
　配列番号63に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLAMPプライマーのLMO2736-10 FIP（配列番号５６）は、当該496位～560位の領域と相補的な領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーの具体例である。
(14)　配列番号１３に示すlmo2736遺伝子配列における721位～775位の領域又は該領域と相補的な領域。
　配列番号64に示す塩基配列をその3'側に含むプライマー、例えば実施例のLAMPプライマーのLMO2736-10 BIP（配列番号５７）は、当該721位～775位の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーの具体例である。
　上記(1)～(3)のlmo0084遺伝子の領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーは、例えば、配列番号１に示す塩基配列中の261位～325位の領域、718位～777位の領域、若しくは108位～166位の領域、若しくはこれらのいずれかと相補的な領域中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上からなる配列、又は該配列内の遺伝子多型部位において２０％以下の塩基が置換された配列を、その3'側に含むプライマーであり得る。
　上記(4)～(14)のlmo2736遺伝子の領域内に特異的にハイブリダイズするプライマーは、例えば、配列番号１３に示す塩基配列中の1位～47位の領域、202位～261位の領域、468位～527位の領域、510位～569位の領域、552位～611位の領域、137位～196位の領域、646位～705位の領域、732位～791位の領域、953位～1012位の領域、496位～560位の領域、若しくは721位～775位の領域、若しくはこれらのいずれかと相補的な領域中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上からなる配列、又は該配列内の遺伝子多型部位において２０％以下の塩基が置換された配列を、その3'側に含むプライマーであり得る。
　lmo0084遺伝子の部分領域を増幅・検出するためのプライマーに採用できる好ましい配列の具体例としては、配列番号２６～３１、５８及び５９を挙げることができる。配列番号５８及び５９は、LAMPプライマー配列である配列番号４４及び４５の3'側部分配列（lmo0084遺伝子中の標的部位にハイブリダイズするF2又はB2部分の配列）である。配列番号２６～２９、５８はlmo0084遺伝子のセンス鎖の配列であり、該遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイズするフォワードプライマーの配列として利用できる。配列番号３０、３１、５９はlmo0084遺伝子のアンチセンス鎖の配列であり、該遺伝子のセンス鎖にハイブリダイズするリバースプライマーの配列として利用できる。
　lmo2736遺伝子の部分領域を増幅・検出するためのプライマーに採用できる好ましい配列の具体例としては、配列番号３２～４１、６０～６４を挙げることができる。配列番号６０～６４は、LAMPプライマー配列である配列番号４８、４９、５２、５３、５６、５７の3'側部分配列（lmo2736遺伝子中の標的部位にハイブリダイズするF2又はB2部分の配列）である。配列番号３２～３６、６０、６２、６３はlmo2736遺伝子のセンス鎖の配列であり、該遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイズするフォワードプライマーの配列として利用できる。配列番号３７～４１、６１、６４はlmo2736遺伝子のアンチセンス鎖の配列であり、該遺伝子のセンス鎖にハイブリダイズするリバースプライマーの配列として利用できる。
　なお、lmo0084遺伝子及びlmo2736遺伝子の部分領域を増幅・検出するためのプライマーに採用できる好ましい配列の具体例として例示した配列番号２６～３１及び配列番号３２～４１は、下記に示すように、その５’側に付加配列を設けることによりＬＡＭＰプライマーとして使用することができる。
　上記(1)～(14)の領域に設定した、モノサイトゲネス菌のlmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の部分領域を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットとしては、以下のいずれかを含むプライマーセットが挙げられる。当該プライマーセットは、PCRプライマー、又はLAMPプライマー等の等温増幅プライマーであり得る。
(A)　前記(1)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(2)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(B)　前記(3)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(1)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(C)　前記(4)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(9)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(D)　前記(5)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(8)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(E)　前記(6)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(8)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(F)　前記(6)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(10)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(G)　前記(6)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(11)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(H)　前記(7)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(10)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(I)　前記(7)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(11)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(J)　前記(7)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(12)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(K)　前記(8)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(10)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(L)　前記(8)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(11)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(M)　前記(13)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(14)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(N)　前記(6)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(12)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
(O)　前記(8)の領域内にハイブリダイズするフォワードプライマーと、前記(12)の領域内にハイブリダイズするリバースプライマーとのセット。
　上記(A)～(O)のセットの具体例として、下記のセットを挙げることができる。アルファベットは上記(A)～(O)のそれぞれに対応しており、例えば下記の(A-1)～(A-10)は上記(A)のセットの例である。
(A-1)　配列番号２６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２６の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F286AとLMO0084-R757Aのセットはこのセットの具体例である。
(A-2)　配列番号２６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上の配列、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２６の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F286AとLMO0084-R757Bのセットはこのセットの具体例である。
(A-3)　配列番号２７に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２７の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F286BとLMO0084-R757Aのセットはこのセットの具体例である。
(A-4)　配列番号２７に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２７の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F286BとLMO0084-R757Bのセットはこのセットの具体例である。
(A-5)　配列番号２８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２８の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F281AとLMO0084-R757Aのセットはこのセットの具体例である。
(A-6)　配列番号２８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２８の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F281AとLMO0084-R757Bのセットはこのセットの具体例である。
(A-7)　配列番号２９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F281BとLMO0084-R757Aのセットはこのセットの具体例である。
(A-8)　配列番号２９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号２９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F281BとLMO0084-R757Bのセットはこのセットの具体例である。
(A-9)　配列番号６７に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F286/MとLMO0084-R757/Mのセットはこのセットの一例である。
(A-10)　配列番号６８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO0084-F281/MとLMO0084-R757/Mのセットはこのセットの一例である。
(B-1)　配列番号５８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号５８の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号５９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは全長の配列、又は配列番号５９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLAMPプライマーLMO84 FIPとLMO84 BIPのセットはこのセットの具体例である。
(C-1)　配列番号３２に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３２の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３７に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３７の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F8とLMO2736-R176のセットはこのセットの具体例である。
(D-1)　配列番号３３に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３３の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３８の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F222とLMO2736-R591のセットはこのセットの具体例である。
(D-2)　配列番号７０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F222/MとLMO2736-R591/Mのセットはこのセットの一例である。
(E-1)　配列番号３４に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３４の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３８の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488とLMO2736-R591のセットはこのセットの具体例である。
(E-2)　配列番号７１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488/MとLMO2736-R591/Mのセットはこのセットの一例である。
(F-1)　配列番号３４に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３４の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488とLMO2736-R685のセットはこのセットの具体例である。
(F-2)　配列番号７１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488/MとLMO2736-R685/Mのセットはこのセットの一例である。
(G-1)　配列番号３４に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３４の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488とLMO2736-R771のセットはこのセットの具体例である。
(G-2)　配列番号７１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488/MとLMO2736-R771/Mのセットはこのセットの一例である。
(H-1)　配列番号３５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３５の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530とLMO2736-R685のセットはこのセットの具体例である。
(H-2)　配列番号７２に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530/MとLMO2736-R685/Mのセットはこのセットの一例である。
(I-1)　配列番号３５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３５の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530とLMO2736-R771のセットはこのセットの具体例である。
(I-2)　配列番号６０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号６０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは全長の配列、又は配列番号６１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLAMPプライマーLMO2736-1 FIPとLMO2736-1 BIPのセットはこのセットの具体例である。
(I-3)　配列番号６２に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号６２の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは全長の配列、又は配列番号６１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLAMPプライマーLMO2736-2 FIPとLMO2736-2 BIPのセットはこのセットの具体例である。
(I-4)　配列番号７２に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530/MとLMO2736-R771/Mのセットはこのセットの一例である。
(J-1)　配列番号３５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３５の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530とLMO2736-R992のセットはこのセットの具体例である。
(J-2)　配列番号７２に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F530/MとLMO2736-R992のセットはこのセットの一例である。
(K-1)　配列番号３６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３６の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３９の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F572とLMO2736-R685のセットはこのセットの具体例である。
(K-2)　配列番号７３に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F572/MとLMO2736-R685/Mのセットはこのセットの一例である。
(L-1)　配列番号３６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号３６の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４０の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F572とLMO2736-R771のセットはこのセットの具体例である。
(L-2)　配列番号７３に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F572/MとLMO2736-R771/Mのセットはこのセットの一例である。
(M-1)　配列番号６３に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全長の配列、又は配列番号６３の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６４に示す塩基配列、又は配列番号６４の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLAMPプライマーLMO2736-10 FIPとLMO2736-10 BIPのセットはこのセットの具体例である。
(N-1)　配列番号７１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F488/MとLMO2736-R992のセットはこのセットの一例である。
(O-1)　配列番号７３に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列中の連続する15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは全長の配列、又は配列番号４１の塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。下記実施例のLMO2736-F572/MとLMO2736-R992のセットはこのセットの一例である。
　特定の配列をその3'側に含むプライマーには、当該特定の配列の5'側に任意の配列が付加されたプライマー、及び当該特定の配列からなるプライマーが包含される。例えば、配列番号２６に示す塩基配列をその3'側に含むプライマーには、配列番号２６に示す塩基配列の5'側に任意の配列が付加されたプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーとが包含される。
　(A-1)～(O-1)に記載した各塩基配列内の遺伝子多型部位の好ましい具体例は以下の通りである。塩基置換を含むプライマーの好ましい具体例として、それぞれ、下記に示した遺伝子多型部位の具体例から選択される少なくとも１つの塩基が置換された配列を3'側に含むプライマーを挙げることができる。これらの具体例は、配列番号１～１２に示した１２の血清型のlmo0084遺伝子配列１２種類のアライメント、及び配列番号１３～２５に示した１２の血清型のlmo2736遺伝子配列１３種類のアライメントから特定される遺伝子多型部位である。もっとも、他の血清型のモノサイトゲネス菌株や同じ血清型の他のモノサイトゲネス菌株の遺伝子配列をさらに考慮した場合には、下記具体例以外にも遺伝子多型部位が見出される可能性があり、本発明ではそのような部位における塩基置換も許容されるので、本発明における各配列内の遺伝子多型部位は下記具体例に限定されるものではない。
配列番号２６：第6位、第15位及び第16位
配列番号２７：第6位、第15位及び第16位
配列番号２８：第2位、第11位及び第20位
配列番号２９：第2位、第11位及び第20位
配列番号３０：第8位及び第11位
配列番号３１：第8位及び第11位
配列番号３３：第5位、第18位及び第20位
配列番号３４：第5位及び第8位
配列番号３５：第5位及び第11位
配列番号３６：第5位及び第11位
配列番号３８：第10位及び第16位
配列番号３９：第14位、第15位及び第16位
配列番号４０：第7位
配列番号５８：第5位、第9位、第11位及び第14位
配列番号５９：第1位及び第10位
配列番号６０：第7位及び第13位
配列番号６１：第5位
配列番号６２：第7位及び第13位
配列番号６３：第1位、第4位、第19位及び第25位
配列番号６４：第6位及び第15位
　プライマーの5'側に存在していてもよい任意の付加配列の好ましい具体例として、ＬＡＭＰプライマーを構築するための付加配列を挙げることができる。プライマーの標的領域よりも内側に位置する任意の一部領域を選択し、その一部領域の相補鎖をプライマーの5'側に付加することで、LAMPプライマーを構築することができる。LAMPプライマーを設計するためのソフトウェアは公知であり、そのような公知のソフトウェアを用いて、上記した(1)～(14)の特異的プライマー設定領域をベースにしてモノサイトゲネス菌特異的検出用のLAMPプライマーを設計することができる。
　LAMPプライマーの設計では、5'上流側からF3、F2、F1、B1、B2、B3の順に並ぶ各領域が必要であり、F1配列の相補配列（アンチセンス鎖の配列）がF2の5'末に付加したFIPプライマーと、B1配列の相補配列（センス鎖の配列）がB2の5'末の付加したBIPプライマーと、F3の領域にハイブリダイズするフォワードプライマーと、B3の領域にハイブリダイズするリバースプライマーとのセットでLAMPプライマーセットが構成される。このうちのF2及びB2の少なくともいずれか、好ましくは両方に、上記(1)～(14)の特異的プライマー設定領域を採用すればよい。上記(a)～(v)のプライマーセットをベースにして設計する場合には、増幅サイズが約200～300bp程度のセットであれば、F2及びB2の両方にプライマー設定領域と重複するものを選択すればよく、増幅サイズがこの範囲から外れるセットであれば、F2及びB2のいずれか一方にプライマー設定領域と重複するものを選択し、他方はソフトウェアが候補として挙げた配列から適宜選択すればよい。
　下記の(i)～(iv)は、(A-2)のプライマーセットの一例であるLMO0084-F286AとLMO0084-R757Bのセット、及び(I-1)のプライマーセットの一例であるLMO2736-F530とLMO2736-R771のセットをベースにしてそれぞれ設計したLAMPプライマーセットである。モノサイトゲネス菌検出用LAMPプライマーセットの好ましい具体例として、これらのセットを挙げることができる。
(i)　配列番号４２に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４３に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４４に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４５に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(ii)　配列番号４６に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４７に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４８に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４９に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(iii)　配列番号５０に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５１に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５２に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５３に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
(iv)　配列番号５４に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５５に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５６に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５７に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
　LAMP法以外に用いられる等温増幅プライマーも、上記した(1)～(14)の特異的プライマー設定領域をベースとし、公知のソフトウェア等を用いて設計することができる。
　PCR増幅産物の検出に用いるプローブの好ましい具体例として、以下の配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブを挙げることができる。配列番号８５に示す配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとは、n---nがT---Aであるオリゴヌクレオチド部分（配列番号78）を含むプローブと、n---nがC---Cであるオリゴヌクレオチド部分（配列番号79）を含むプローブとの混合プローブである。同様に、配列番号８６に示す配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとは、n----nがG----Gであるオリゴヌクレオチド部分（配列番号83）を含むプローブと、n----nがC----Cであるオリゴヌクレオチド部分（配列番号84）を含むプローブとの混合プローブである。
＜LMO0084遺伝子用プローブ＞
TATTACATTCATAGAATTGACCC（配列番号77）(366位～389位に設定)
ATCTGGTGGCGAGAAGCnGAAnA（配列番号85）(535位～558位に設定、nGAAnはTGAAA又はCGAAC)
TACCAAGATTCCAAAAAGAAGCCATG（配列番号80）(686位～711位に設定)
＜LMO2736遺伝子用プローブ＞
AAAAAAGGCTGGACTAAAGC（配列番号81）(70位～89位に設定)
ACGTCAAAAAAATCATTATC（配列番号82）(372位～393位に設定)
GTTTTCGGTGCTCAAAAAGGnGCAAnTCC（配列番号86）(619位～647位に設定、nGCAAnはGGCAAG又はCGCAAC)
　配列番号８５のプローブ、配列番号８６のプローブは、２種類のオリゴヌクレオチドプローブの混合プローブであるが、２種類のプローブの混合比はモル比で1:5～5:1程度、例えば1:2～2:1程度、又は1:1.5～1.5:1程度であればよく、1:1程度で好ましく用いることができる。
　各プローブの設定位置は上記の通りであるので、この設定領域を含む領域を増幅するプライマーセットと組み合わせて用いればよい。これらの配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブは、核酸クロマトグラフィーの捕捉プローブや、リアルタイムPCR用プローブとして好ましく用いることができる。リアルタイムPCR用プローブとして用いる場合、オリゴヌクレオチドの5'末端及び3'末端を蛍光物質とクエンチャー物質で修飾すればよい。5'末端を蛍光物質で、3'末端をクエンチャー物質で修飾するのが一般的である。特に好ましいプライマー・プローブの組み合わせは、下記実施例の表２３、表２５に記載されている。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
I. 標的遺伝子の検索
　モノサイトゲネス菌遺伝子検査の従来品は、モノサイトゲネス菌が有するhlyA遺伝子、clpC遺伝子、inlA遺伝子、plcA遺伝子等の病原性遺伝子をターゲットとしているが、モノサイトゲネス菌とそれ以外のリステリア属菌を十分に識別できるものではない。高い精度でモノサイトゲネス菌を他のリステリア属菌と識別できるプライマーセットの確立をめざし、前記の病原性遺伝子以外をターゲットとして検討を行なった。
　まず始めに、http://genolist.pasteur.fr/ListiList/のサイトを利用した。このサイト上にあるAccession No.NC_003210.1のモノサイトゲネスと、Accession No.NC_003212.1のイノクアの情報を活用した。リステリア属のリステリア・イノクア（遺伝子数：3,068）とリステリア・モノサイトゲネス（遺伝子数：2,941）の比較ゲノム解析を行ない、モノサイトゲネス特異的遺伝子を296遺伝子に絞り込んだ。
　次に、選択した296遺伝子のそれぞれについて、データベースに対してBLAST検索を行い、登録されているモノサイトゲネス各血清型の全ての分離株のゲノム配列中に遺伝子の存在が確認できるかどうかを調べた。いずれかの分離株で存在が確認できなかった遺伝子は候補から除外した。この検索結果の一例を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上により、候補遺伝子を最終的に6遺伝子（LMO 0083、LMO 0084、LMO 0444、LMO 0833、LMO 2387、LMO 2736）に絞り込んだ。
　この6遺伝子のそれぞれについて、複数のPCRプライマーを設計し、モノサイトゲネス菌６株（血清型1/2a、1/2b、1/2c、4a、4b、4d）及びL. innocuaを含む他のリステリア属菌３株（L. innocua, L. grayi, L. ivanovii）を用いて実際にPCRを行ない、モノサイトゲネス菌への特異性を検証した。この際のPCRプライマーは、モノサイトゲネスの各血清型の配列（上掲表２のアクセッション番号の配列を使用）を比較し、共通領域をターゲットとして設計した。その結果、LMO 0083、LMO 0444、LMO 0833、MLO 2387では、６株のうちのいずれかを検出できないか、あるいは他のリステリア属菌も増幅してしまい、特異性の高いプライマーセットの設計が困難であった。例えば、LMO0833遺伝子の場合、プライマーF329（ggaaagcaattgtccactcga、配列番号６５）とプライマーR610（tgttggtgagtagcgtggaa、配列番号６６）の組合せで行った結果、リステリア属菌の増幅が見られず特異性が得られた。しかし、血清型4aのモノサイトゲネスも増幅が見られなかった。表４には、各候補遺伝子のPCR結果の一例を示す。LMO 0084及びLMO 2736では、６株のモノサイトゲネス菌のみで特異的増幅産物が得られた。比較のため、市販のモノサイトゲネス菌遺伝子検査キット２点にて、同じ菌株を用いて検出を実施してみたところ、いずれもここで用いたモノサイトゲネス菌を特異的に検出することができなかった（表４）。以上の結果より、候補遺伝子をLMO 0084及びLMO 2736に絞り込んでモノサイトゲネス菌特異的プライマーの構築を試みた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
II. モノサイトゲネス菌特異的プライマーセットの構築
　上記で絞り込んだ２遺伝子LMO 0084及びLMO 2736の各種血清型の塩基配列をさらに詳細に検討し、プライマーを多数設計した。使用する菌株を増やしてPCRによる検証を行ない、モノサイトゲネス菌を高い精度で特異的に検出するプライマーの構築を試みた。
＜方法＞
１．使用菌株
　PCR試験に供した各種菌株（表５－１～表５－３）は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）、及び国立大学法人岐阜大学研究推進・社会連携機構微生物遺伝資源保存センター（ＧＴＣ）、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー（ＩＦＯ）、ＪＡ全農家畜衛生研究所（ＪＡ）、東京大学応用微生物研究所（ＩＭＣＢ）から入手した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
２．プライマー及びPCR反応条件
　リステリア・モノサイトゲネスの各種血清型のlmo0084遺伝子（配列番号１～１２）及びlmo2736遺伝子（配列番号１３～２５）の配列情報をもとに種々のプライマーを設計した。表６にその一部の配列を示す。lmo0084遺伝子において、配列番号２６、２８、３０のプライマーはモノサイトゲネス菌血清型１／２ａタイプの遺伝子多型を、配列番号２７、２９、３１のプライマーは血清型４ａタイプの遺伝子多型を反映するように設計した。lmo2736遺伝子において、配列番号３２、３７、４１のプライマーはモノサイトゲネス菌各血清型に共通する配列を、配列番号３３、３４、３５、３６、３８、３９、４０のプライマーはモノサイトゲネス菌血清型１／２ｃタイプの遺伝子多型を反映するように設計した。設計したPCRプライマーは、株式会社ファスマックに委託して合成した。鋳型DNAは、各種菌株からそれぞれmericon DNA Bacteria Plus Kit（QIAGEN社）を用いてゲノムDNAを抽出して得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　PCR反応液の組成を下記表７に示す。GeneAmp PCR System 9700を用いてPCRを行なった。反応サイクルは、94℃2分→(94℃20秒→60℃20秒→72℃40秒)×30サイクル→72℃7分→4℃とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
３．モノサイトゲネス選択分離用培地
　各種リステリア属菌をALOA寒天培地（シスメックス社）及びクロモアガー寒天培地（関東化学社）に播種して37℃で24時間程度培養し、コロニーを観察した。モノサイトゲネス菌は、ALOA寒天培地では乳白色のハローを伴う青緑色のコロニーを、クロモアガー寒天培地では乳白色のハローを伴う青色のコロニーを形成する。
＜結果＞
　ハロー形成試験では、モノサイトゲネス菌は、菌株番号４の様に一部ハローを形成しないコロニーが出現する株があるものの、何れもハローを形成して陽性となった。それに対して、L. ivanovii（菌株番号１１、１２、１３、１４）及びL. seeligeri（菌株番号１８）で偽陽性を示した。リステリア属以外の食中毒菌26菌株（菌株番号２３～４８）ではコロニーの形成が確認できなかった。ハロー試験の結果の一例を図２－１～図２－３に示す。
　設計したプライマーを種々組み合わせて検討した結果、遺伝子多型に影響されることなく、表８－１～表８－４に示す組み合わせでモノサイトゲネス菌を特異的に検出することができた。いずれもモノサイトゲネス菌以外のリステリア属菌（菌株番号１１～２２）、及びその他の食中毒菌26菌株（菌株番号２３～４８）に対しては所定サイズのＰＣＲ産物が得られなかった（表９－１～表９－６）。ＰＣＲの結果の一例を図２－１及び図２－２に示す。
　特に、L. ivanovii及びL. seeligeriは、モノサイトゲネス菌選択分離用として一般に使用されているALOA寒天培地やクロモアガー寒天培地上でモノサイトゲネス菌と同様にハローを形成し、モノサイトゲネス菌との識別が困難であるが、表８－１～表８－４に示すプライマーセットによれば、これらのリステリア属菌の各種分離菌株に対しても増幅が起こらず陰性となった。一方、モノサイトゲネス菌株JMC7673（表中の菌株No. 4）はハローを形成しないコロニーも出現するが、このような菌株でもモノサイトゲネス菌として検出可能であった。これにより、表８－１～表８－４に示すプライマーセットはモノサイトゲネス菌に対する特異性が非常に優れていることが確認された。更に、表３に示した従来のモノサイトゲネス菌検出ＰＣＲキットよりも優れていることも確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
＜LAMPプライマーの設計＞
　lmo0084遺伝子を標的とするプライマーセットF286A／R757B、及びlmo2736遺伝子を標的とするプライマーセットF530／R771をベースにLAMPプライマーを設計した。プライマー設計には、公知のLAMP法プライマー設計支援ソフトLAMP Designer 1.14 (OptiGene社製)を用いた。
[lmo0084を標的とするLAMP法プライマーの設計]
1. 検索領域を1から984で入力した。
2. F2からB2の範囲を150から300で入力した。
3. ソフトからF3/B3、F2/B2、F1/B1のセットで配列が予測された。
4. F2、B2のどちらかが、PCRプライマーF286A、R757Bに重複するセットを選択した。
5. 最適化を行ない、F2、B2の両配列がプライマーF286A、R757Bに重複するセットを選択した。
[lmo2736を標的とするLAMP法プライマーの設計]
1. 検索領域を491から811で入力した。
2. F2からB2の範囲を150から300で入力した。
3. F1からB1の範囲を100から200で入力した。
4. ソフトからF3/B3、F2/B2、F1/B1のセットで配列が予測された。
5. F2/B2が、PCRプライマーF530、R771に重複するセットを選択した。
6. 設計したプライマーで実際にLAMP法を行ない、選択したF2/B2を中心に最適化を行なった。
　上記の通りにして得られた、モノサイトゲネス菌を特異的に検出するためのLAMPプライマーセットを下記に示す。lmo0084ＬＡＭＰプライマーセットは、モノサイトゲネス菌血清型１／２ａタイプの遺伝子多型を反映するように設計した。lmo2736ＬＡＭＰプライマーセットは、配列番号６４を除き、モノサイトゲネス菌血清型１／２ｃタイプの遺伝子多型を反映するように設計した。上記の各種菌株を用いた検出試験の結果、下記表１４－１～表１４－３に示す通り、遺伝子多型に影響されることなく、いずれもモノサイトゲネス菌に対する特異性を確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
＜ミックスプライマーの設計＞
　上記表６に示したLMO0084プライマー設計部位において、さらに多くの血清型の多型配列を網羅すべく、混合塩基を使用したミックスプライマーを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　F286/MとR757/M、F281/MとR757/Mとの組み合わせで通常のPCRを実施し、モノサイトゲネス特異的な増幅が見られるかどうかを確認した。検出試験には表５－１に示した菌株番号１～１０のモノサイトゲネス菌株、表５－２に示した菌株番号１１～２２のリステリア属菌株、菌株番号２３～４８の食中毒菌（ただし菌株番号４２に代えてCitrobacter freundii N-326株を使用）を用いた。
　その結果、全てのモノサイトゲネス菌で増幅が確認され、かつ、モノサイトゲネス菌以外の菌株では全て増幅が見られなかった（表１６－１～１６－６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　LMO2736についても同様に、表６に示したlmo2736プライマー設計部位において、混合塩基を使用したミックスプライマーを設計した。「配列番号」の欄には、参照した各血清型のlmo2736遺伝子の配列番号、またはプライマーの配列を記載した配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　下記表１８に示すFプライマー及びRプライマーの組み合わせで通常のPCRを実施し、モノサイトゲネス特異的な増幅が見られるかどうかを確認した。検出試験には表５－１に示した菌株番号１～１０のモノサイトゲネス菌株、表５－２に示した菌株番号１１～２２のリステリア属菌株、菌株番号２３～４８の食中毒菌（ただし菌株番号４２に代えてCitrobacter freundii N-326株を使用）を用いた。
　その結果、全てのモノサイトゲネス菌で増幅が確認され、かつ、モノサイトゲネス菌以外の菌株では全て増幅が見られなかった（表１９－１～１９－６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
＜TaqMan(登録商標)プローブの設計＞
　リアルタイムPCR検出系の構築を目指し、TaqMan(登録商標)プローブを設計した。
〔１〕LMO0084遺伝子
　TaqMan(登録商標)プローブの設計は、以下の条件が一般的である。
・TaqMan(登録商標)プローブは20mer～30merで設計する（Thermo Fisher引用）。
・増幅ターゲットの長さは、70bp～200bpが理想であり、300bp以上にならないようにする（QIAGEN引用）。
　しかしながら、LMO0084遺伝子をターゲットに上記で設計したミックスプライマーのセット（LMO0084-F286/MとLMO0084-R757/M、LMO0084-F281/MとLMO0084-R757/M）によると、増幅ターゲットの長さは約470bpであった。これより短い長さではPCRの特異性が得られなかったので、この範囲内でTaqMan(登録商標)プローブを設計した。20mer以上で、モノサイトゲネス菌に2塩基以内の共通配列を持つ配列は、増幅ターゲット内で3箇所存在した（表２０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　そこで、プローブ配列として以下の４種類の配列を採用した。各配列からなるオリゴヌクレオチドの5'末端を蛍光物質FAM（6-Carboxyfluorescein）で、3'末端をクエンチャー物質TAMRAで修飾してTaqMan(登録商標)プローブを調製した。
0084TMP366-389: TATTACATTCATAGAATTGACCC（配列番号77）
0084TMP535-558(TA): ATCTGGTGGCGAGAAGCTGAAAA（配列番号78）
0084TMP535-558(CC): ATCTGGTGGCGAGAAGCCGAACA（配列番号79）
0084TMP686-711: TACCAAGATTCCAAAAAGAAGCCATG（配列番号80）
　表１５に示したミックスプライマーのセット（LMO0084-F286MとLMO0084-R757M、LMO0084-F281MとLMO0084-R757M）とこれらのTaqMan(登録商標)プローブを組み合わせ、試験菌株のゲノムを鋳型としてリアルタイムPCRによる検出実験を行なった。試験菌株として、表５－１に示した菌株番号１～１０のモノサイトゲネス菌株、表５－２に示した菌株番号１１～２２のリステリア属菌株、菌株番号２３～４８の食中毒菌（ただし菌株番号４２に代えてCitrobacter freundii N-326株を使用）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
[反応条件]
使用機器：Corbett Research：Roter-Gene6000
50℃・2分・hold→95℃・2分・hold→(95℃・3秒－64℃・15秒)×40サイクル
　増幅曲線の有無で評価したほか、PCR産物のアガロース電気泳動も行ない、バンドの有無及びバンドサイズの確認を行なった。
　リアルタイムPCR試験の結果を表２２－１～２２－３に示す。0084TMP366-389と0084TMP686-711は、どちらのプライマーセットと組み合わせてもモノサイトゲネス菌を特異的に検出できた。0084TMP535-558(TA)と0084TMP535-558(CC)は混合プローブとすることで同様にモノサイトゲネス菌を特異的に検出できることがわかった。これらを混合して用いる場合、反応液組成は100μM 0084TMP535-558(TA)を0.25μL、100μM 0084TMP535-558(CC)を0.25μLとすればよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　以上の結果から、リアルタイムPCRによるLMO0084遺伝子検出に好ましく使用できるプライマー・プローブの組み合わせは下記の通りである。[]内の番号は配列表中の配列番号である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
〔２〕LMO2736遺伝子
　表１８に示したプライマーセットのうち、No.1 及びNo.2については、PCR増幅領域内にそれぞれ1個のTaqMan(登録商標)プローブを設計した（表２４）。
　No.3からNo.12のPCR増幅内に共通配列はほとんど存在せず、No.4からNo.12のPCR増幅領域内（488位～992位）の共通配列でTaqMan(登録商標)プローブを1箇所設定した（表２４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　プローブ配列としては以下の４種類の配列を採用した。各配列からなるオリゴヌクレオチドの5'末端を蛍光物質FAM（6-Carboxyfluorescein）で、3'末端をクエンチャー物質TAMRAで修飾してTaqMan(登録商標)プローブを調製した。
2736TMP70-89: AAAAAAGGCTGGACTAAAGC（配列番号81）
2736TMP372-393: ACGTCAAAAAAATCATTATC（配列番号82）
2736TMP619-647(GG): GTTTTCGGTGCTCAAAAAGGGGCAAGTCC（配列番号83）
2736TMP619-647(CC): GTTTTCGGTGCTCAAAAAGGCGCAACTCC（配列番号84）
　リアルタイムPCR試験は、下記表２４に示したプライマー、プローブの組み合わせで行なった。2736TMP619-647(GG)と2736TMP619-647(CC)はそれぞれ単独で、又は混合してプローブとして用いた。表中、[]の数字は配列表中の配列番号である。使用した試験菌株、リアルタイムPCR反応液組成及び反応条件は、上記のLMO0084遺伝子の検出試験と同様とした。2736TMP619-647(SS)を用いる場合の反応液組成は、100μM 2736TMP619-647(GG)を0.25μL、100μM 2736TMP619-647(CC)を0.25μLとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
　結果を表２６－１～２６－３に示す。表２５中のプライマー・プローブセット1および2は、モノサイトゲネス菌を特異的に検出できた。2736TMP619-647(GG)と2736TMP619-647(CC)は混合プローブとすることでモノサイトゲネス菌を特異的に検出できた。以上の結果から、リアルタイムPCRによるLMO2736遺伝子検出に特に好ましく使用できるプライマー・プローブの組み合わせは、表２５中の１、２、５である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
　本リアルタイムPCR検出系を用いて食品のモノサイトゲネス菌検査を行なう場合のDNAサンプル調製手順の一例を以下に記載する。
(１)　食品25gに対し、選択増菌培地225mLを加え、30℃24時間±3時間培養する。その0.1mLをBHI（Brain-Heart Infusion）培地10mLに添加する。あるいは、選択寒天培地のシングルコロニーを拾い、BHI培地10mLに釣菌し、37℃24時間±3時間培養する。
(２)　この培養液1mLを遠心（13,000xg、10分、20℃）で集菌する。
(３)　mericon DNA Bacteria Plus Kit（QIAGEN：69534）等のDNA抽出キットでDNAを抽出する。
(４)　DNA濃度を測定する。
　以上により、LMO0084遺伝子及びLMO2736遺伝子内で設計したTaqMan(登録商標)プローブを用いることで、モノサイトゲネスを特異的に検出できることが示された。これらの遺伝子の多型配列を考慮し、複数のTaqMan(登録商標)プローブを混合して用いることで、各種血清型のモノサイトゲネス菌を網羅的にかつ特異的に検出することができる。また、表２２－１、表２６－１の結果は、ある血清型に特徴的な多型をターゲットとしてプローブを設計することで、血清型別にモノサイトゲネス菌を検出できること、すなわち血清型判別も可能であることを示している。例えば、0084TMP535-558(CC)は血清型4aを特異的に検出できるプローブである。モノサイトゲネス菌を特異的に検出するための標的領域として本願発明者らが特定したこれら2遺伝子内の領域、あるいは別の領域から新たなプライマー・プローブを設計し、それらを適宜組み合わせることで、モノサイトゲネス菌の血清型判定が可能となる。

Claims (10)

  1. 　リステリア・モノサイトゲネスのlmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の部分領域を増幅する下記のいずれかのプライマーセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマーセット。
    (A-1)　配列番号２６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-2)　配列番号２６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-3)　配列番号２７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-4)　配列番号２７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-5)　配列番号２８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-6)　配列番号２８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-7)　配列番号２９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (A-8)　配列番号２９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (B-1)　配列番号５８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号５９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (C-1)　配列番号３２に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３７に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (D-1)　配列番号３３に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (E-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３８に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (F-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (G-1)　配列番号３４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (H-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (I-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (I-2)　配列番号６０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (I-3)　配列番号６２に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (J-1)　配列番号３５に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (K-1)　配列番号３６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３９に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (L-1)　配列番号３６に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４０に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (M-1)　配列番号６３に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６４に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
  2. 　下記のいずれかのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プライマーセット。
    (A-9)　配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (A-10)　配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (D-2)　配列番号７０に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (E-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (F-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (G-2)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (H-2)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (I-4)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (J-2)　配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (K-3)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７５に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (L-2)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含む混合リバースプライマーとのセット。
    (N-1)　配列番号７１に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
    (O-1)　配列番号７３に示す塩基配列をその3'側に含む混合フォワードプライマーと、配列番号４１に示す塩基配列、又は該塩基配列内の遺伝子多型部位において４個以下の塩基が置換された配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット。
  3. 　下記のいずれかのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用ループ媒介等温増幅プライマーセット。
    (i)　配列番号４２に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４３に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４４に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４５に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
    (ii)　配列番号４６に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号４７に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号４８に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号４９に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
    (iii)　配列番号５０に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５１に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５２に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５３に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
    (iv)　配列番号５４に示す塩基配列からなるF3プライマーと、配列番号５５に示す塩基配列からなるB3プライマーと、配列番号５６に示す塩基配列からなるFIPプライマーと、配列番号５７に示す塩基配列からなるBIPプライマーとのセット。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のプライマーセットを使用した核酸増幅法により、lmo0084遺伝子又はlmo2736遺伝子の部分領域を増幅する工程を含む、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法。
  5. 　部分領域の増幅がPCR法又は等温増幅法により行われる、請求項４記載の方法。
  6. 　等温増幅法がループ媒介等温増幅法である、請求項５記載の方法。
  7. 　PCR法がリアルタイムPCR法である、請求項５記載の方法。
  8. 　配列番号７７、配列番号８０～８２、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）、又は配列番号８６（ngcaanはggcaag又はcgcaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む、リステリア・モノサイトゲネス検出用プローブ。
  9. 　前記オリゴヌクレオチド部分の末端が蛍光物質及びクエンチャー物質でそれぞれ修飾されたリアルタイムPCRによる検出用のプローブである、請求項８記載のプローブ。
  10. 　以下のいずれかのプライマー及びプローブのセットを含む、リステリア・モノサイトゲネス検出のためのリアルタイムPCR用プライマー及びプローブセット。
    [1] 配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号７７又は８０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
    [2] 配列番号６７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
    [3] 配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号７７又は８０に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
    [4] 配列番号６８に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６９に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８５（ngaanはtgaaa又はcgaac）に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
    [5] 配列番号３２に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号３７に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８１に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
    [6] 配列番号７０に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号７４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８２に示す塩基配列のオリゴヌクレオチド部分を含むプローブとのセット。
    [7] 配列番号７２に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号７６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーと、配列番号８６（ngcaanはggcaag又はcgcaac）に示す配列のオリゴヌクレオチド部分を含む混合プローブとのセット。
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