WO2018230628A1 - ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用 - Google Patents

ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2018230628A1
WO2018230628A1 PCT/JP2018/022679 JP2018022679W WO2018230628A1 WO 2018230628 A1 WO2018230628 A1 WO 2018230628A1 JP 2018022679 W JP2018022679 W JP 2018022679W WO 2018230628 A1 WO2018230628 A1 WO 2018230628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
protein
acid sequence
substituted
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/022679
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
考宏 月村
忠靖 兎川
均 櫻庭
Original Assignee
学校法人 明治薬科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人 明治薬科大学 filed Critical 学校法人 明治薬科大学
Priority to US16/622,706 priority Critical patent/US20200115698A1/en
Priority to EP18818453.5A priority patent/EP3639825A4/en
Publication of WO2018230628A1 publication Critical patent/WO2018230628A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/46—8-Azabicyclo [3.2.1] octane; Derivatives thereof, e.g. atropine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7008—Compounds having an amino group directly attached to a carbon atom of the saccharide radical, e.g. D-galactosamine, ranimustine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01049—Alpha-N-acetylgalactosaminidase (3.2.1.49)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical combination for treating Fabry disease and use thereof.
  • Fabry disease is caused by a marked decrease in the activity of ⁇ -galactosidase ( ⁇ -GAL), which is a lysosomal hydrolase, and the substrates globotriaosylceramide (Gb3) and globotriaosylsphingosine (Liso-Gb3).
  • ⁇ -GAL ⁇ -galactosidase
  • Gb3 globotriaosylceramide
  • Li-Gb3 globotriaosylsphingosine
  • Non-patent Document 2 it has been reported that enzyme replacement therapy administers a deficient recombinant ⁇ -GAL, so that an antibody against recombinant ⁇ -GAL is produced and the therapeutic effect is attenuated.
  • ⁇ -NAGA ⁇ -N-acetylgalactosaminidase
  • Patent Documents 4 and 5 and Non-Patent Document 3 The ⁇ -NAGA mutant is an enzyme that has acquired ⁇ -GAL activity by changing two amino acid residues at the NAGA substrate recognition site to ⁇ -GAL.
  • Patent Documents 4, 5 and non-patent documents Patent Document 3).
  • Japanese Patent Publication Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2012-107020 (Published June 7, 2012)” Japanese Patent Publication “Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-102128 (published May 31, 2012)” Japanese Patent Gazette “Special Table 2014-528901 Gazette (announced on October 30, 2010)” International Publication No. 2007/058381 (published May 24, 2007) (Patent No. 4368925) International Publication No. 2008/143354 (published Nov. 27, 2008) (Patent No. 5507242)
  • the administered enzyme preparation is gradually denatured in blood and cells.
  • repeated administration of recombinant ⁇ -GAL may produce antibodies against the enzyme, causing adverse side reactions or reducing the therapeutic effect of the enzyme. Accordingly, there is a need for enzyme preparations that are more stable and have a high therapeutic effect.
  • the inventors of the present application searched for compounds that enhance the stability of the ⁇ -NAGA mutant and the therapeutic effect on Fabry disease by co-administration with the ⁇ -NAGA mutant. Then, the present inventors have found that the stability of the ⁇ -NAGA mutant is enhanced by bringing the ⁇ -NAGA mutant into contact with a certain type of compound, thereby completing the present invention. That is, the present invention includes any one of the following aspects.
  • ⁇ 1> a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity;
  • a pharmaceutical combination for treating Fabry disease comprising:
  • the protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a); Protein having ⁇ -galactosidase activity (c) An amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Containing protein (d) A protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a pharmaceutical combination for treating Fabry disease which is a compound selected from the group consisting of 2 .
  • the protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid;
  • B a protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a);
  • C a protein comprising an amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
  • D a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or added, and having ⁇
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a stability improver comprising a compound selected from the group consisting of: ⁇ 3>
  • a drug for treating Fabry disease A protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that SEQ ID NO: 2 And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is replaced with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid;
  • B a protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a);
  • C a protein comprising an amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
  • D a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or added, and having ⁇
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • An agent for treating Fabry disease comprising a compound selected from the group consisting of: ⁇ 4> A method for increasing protein stability, Contacting the protein with an active site-specific chaperone;
  • the protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a); Protein having ⁇ -galactosidase activity (c) An amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Containing protein (d) A protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a method for enhancing the stability of a protein which is a compound selected from the group consisting of 2 .
  • the present invention provides an ⁇ -NAGA mutant pharmaceutical combination for treating Fabry disease and use thereof.
  • the present invention can be effectively used for the treatment of Fabry disease.
  • FIG. 6 (a) The enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant when the ⁇ -NAGA mutant and each concentration of DGJ were simultaneously added to a cultured fibroblast derived from a Fabry disease patient is shown in FIG. 6 (a).
  • the amount of enzyme taken in is shown in FIG. 6 (b).
  • FIG. 7 shows changes over time in the enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant and DGJ simultaneously added to cultured fibroblasts derived from Fabry disease patients. The change with time is shown in FIG.
  • Fabry disease is caused by a decrease or deficiency in the activity of an enzyme called “ ⁇ -galactosidase” among the enzymes present in lysosomes, one of the organelles of human cells, and its in vivo substrate, globotriaosylceramide ( It is a glycolipid metabolic disorder caused by accumulation of glycolipid called ceramide trihexoside in the body (for example, blood vessel, skin, cornea, nerve, kidney, heart, etc.) without being decomposed.
  • enzyme replacement therapy refers to introducing purified enzyme into an individual deficient in such an enzyme.
  • the enzyme to be administered can be obtained from natural sources or by recombinant expression.
  • the term also refers to the introduction of purified enzyme in individuals who need or benefit from administration of purified enzyme in other ways, for example, individuals who suffer from protein deficiencies.
  • the introduced enzyme may be a purified recombinant enzyme produced in vitro, or an enzyme purified from isolated tissue or fluid (eg, placenta or animal milk) or from a plant. Also good.
  • the term “active site-specific chaperone” or “pharmacological chaperone” refers to the specific reversible interaction with the active site of a protein to form a stable molecular conformation. Any molecule, including proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, etc., is intended to enhance.
  • the term is a non-specific chaperone for various proteins, such as an endogenous chaperone (eg BiP) or a non-specific chemical chaperone (eg glycerol, DMSO or deuterium-substituted water). It does not mean a drug that has been revealed.
  • the term “active site” refers to a region of a protein that has some specific biological activity. For example, it can be a site that binds to a substrate or other binding partner and contributes to amino acid residues that are directly involved in creating and breaking chemical bonds.
  • the active site in the present invention can include an enzyme catalytic site, an antibody antigen binding site, a receptor ligand binding domain, a regulator binding domain, or a receptor binding domain of a secreted protein. Active sites can also include transactivation, protein-protein interactions, or DNA binding domains of transcription factors and regulators.
  • treatment includes complete cure or alleviation of symptoms of the target disease, suppression of deterioration of the symptoms of the target disease, suppression of development of the target disease, or delay. That is, it includes “prevention” when the individual has not developed the target disease.
  • ⁇ -galactosidase and ⁇ -GAL both mean “human ⁇ -galactosidase A”.
  • ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and “ ⁇ -NAGA” both mean “human ⁇ -galactosidase B”, ie, “human ⁇ -N-acetylgalactosaminidase”.
  • Wt means wild type.
  • M6P means “mannose-6-phosphate”.
  • ⁇ -GAL activity means an activity capable of hydrolyzing a substrate of ⁇ -GAL described later (see reaction formula (1) described later), and activity possessed by ⁇ -GAL protein (wild type ⁇ -GAL) It is not limited to this meaning.
  • ⁇ -NAGA activity means an activity capable of hydrolyzing a substrate of ⁇ -NAGA described later (see reaction formula (2) described later), and activity possessed by ⁇ -NAGA protein (wild-type ⁇ -NAGA) It is not limited to this meaning.
  • “Acquired ⁇ -GAL activity” means that at the substrate binding site, the binding reactivity of ⁇ -GAL with the substrate was relatively higher than the binding reactivity of ⁇ -NAGA with the substrate. .
  • “Having ⁇ -GAL substrate specificity” means that the structure of the active site (especially the position and type of amino acid residues that play an important role in substrate binding reactivity) is the same as that of wild-type ⁇ -GAL. It means that there is.
  • “No. 188” and “No. 191” are positions viewed from the amino acid sequence of wild-type ⁇ -NAGA (SEQ ID NO: 2) (the amino acid residue at the N-terminal of the amino acid sequence is No. 1 in the C-terminal direction) Position when counting to).
  • ⁇ -NAGA mutant basically means all wild-type ⁇ -NAGA mutants, and is not limited to a specific mutant (amino acid mutant).
  • amino acid mutant in the amino acid sequence of wild-type ⁇ -NAGA (SEQ ID NO: 2), a mutant protein in which the 188th serine is replaced with glutamic acid and the 191st alanine is replaced with leucine (ie, “ ⁇ -NAGA (denoted as “S188E / A191L”) may be referred to (defined) as an ⁇ -NAGA variant in some cases.
  • ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA usually means a signal peptide part of wild-type ⁇ -NAGA (a peptide part consisting of the first to 17th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2).
  • the signal peptide portion is generally one that has already been removed when the protein is secreted outside the cell after being expressed in the cell. Even after being secreted into the liver, it may be referred to as “ ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA”.
  • ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA variant and “ ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA (S188E / A191L)” are usually a signal peptide portion of an ⁇ -NAGA variant (eg, SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence represented by the first to 17th amino acid sequence) is the signal peptide portion of wild-type ⁇ -GAL (the first to the 17th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10). It means a protein substituted with a peptide moiety consisting of the 31st amino acid.
  • the signal peptide portion is generally one that has already been removed when the protein is secreted outside the cell after being expressed in the cell.
  • the product after being secreted into the cell may also be referred to as “ ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA variant” or “ ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA (S188E / A191L)”.
  • Table A shows what kind of enzyme protein the nucleotide sequence and amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 described in this specification are.
  • “body” means a portion that becomes a mature protein excluding the signal peptide portion of the protein.
  • the notation “+” indicates that a predetermined signal peptide portion and a main body portion are combined.
  • the present invention is a method for increasing the stability of a protein, comprising the step of contacting the protein with an active site-specific chaperone, wherein the protein has a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase.
  • a protein having ⁇ -galactosidase activity which is any one of the following proteins (a) to (d) (provided that the 188th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is glutamic acid or asparagine) Except for a protein comprising an amino acid sequence substituted with an acid and the 191st amino acid substituted with leucine, valine or isoleucine.)
  • the 188th amino acid is replaced with glutamic acid or aspartic acid
  • the 191st amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a); Protein having ⁇ -galactosidase activity (c) An amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Containing protein (d) A protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or added, and the active site-specific chaperone is: Or a compound represented by the following general formula (I):
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a method for increasing the stability of a protein, which is a compound selected from the group consisting of 2 is provided.
  • the present inventors have succeeded in creating an ⁇ -NAGA mutant as a novel and excellent high-performance enzyme that can be used for the treatment of Fabry disease (Patent Documents 3 and 4).
  • the present invention has newly found a method for enhancing the stability of this ⁇ -NAGA mutant.
  • the protein in the present invention is specifically a mutant enzyme of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase ( ⁇ -NAGA).
  • ⁇ -GAL ⁇ -N-acetylgalactosaminidase
  • ⁇ -NAGA is different from ⁇ -GAL in the structure of a part of the substrate binding site in the active site, but the other part is ⁇ -GAL in both structural and property aspects including the catalytic site. It is an enzyme that has the characteristics of being very similar to. Therefore, the catalytic reaction mechanism of ⁇ -NAGA is very similar to the catalytic reaction mechanism of ⁇ -GAL in the types of reaction substrates and reaction products.
  • the present inventor paid attention to ⁇ -NAGA as described above, and genetically manipulated this ⁇ -NAGA to change the structure of the active site (particularly the substrate binding site), so that ⁇ -galactosidase activity was obtained. If the substrate specificity of NAGA is changed (for example, if a key amino acid residue related to ⁇ -NAGA substrate recognition is replaced from ⁇ -NAGA type to ⁇ -GAL type), Fabry disease It has been found that a novel and excellent high-functional enzyme that can be used for the treatment of cancer can be created (patent documents 4 and 5).
  • the protein of the present invention is the following protein (1a) or (1b), preferably the following protein (1c).
  • (1a) A protein that has acquired ⁇ -galactosidase ( ⁇ -GAL) activity by changing the structure of the active site (particularly the substrate binding site) of wild-type ⁇ -NAGA, preferably a protein having ⁇ -GAL substrate specificity .
  • (1b) The protein of (1a) above, which contains a signal peptide.
  • the type of the signal peptide is not particularly limited, and it may be a signal peptide derived from wild-type ⁇ -NAGA or may be derived from another protein.
  • (1c) The protein of (1b) above, wherein the signal peptide is a signal peptide derived from wild-type ⁇ -GAL.
  • ⁇ -GAL activity means, as described above, the binding reactivity with ⁇ -GAL substrate at the ⁇ -NAGA substrate binding site rather than the binding reactivity with ⁇ -NAGA substrate. Is relatively high. Therefore, the structural change described above is not limited to a structural change that completely disables the binding of ⁇ -NAGA to the substrate, and is essentially a substrate of ⁇ -NAGA rather than the binding reactivity with the substrate of ⁇ -GAL. It also includes a structural change that makes the binding reactivity of ⁇ -GAL with the substrate significantly higher than the binding reactivity with ⁇ .
  • ⁇ -GAL substrate specificity means that the structure of the active site (particularly, the position and type of amino acid residues that play an important role in the binding reactivity of the substrate) is different from that of ⁇ -GAL. Means the same.
  • the ⁇ -GAL substrate is a natural compound such as a glycolipid such as globotriaosylceramide (ceramide trihexoside (CTH)) having a galactose residue ⁇ -bonded to the non-reducing end; It means a synthetic compound such as methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactoside.
  • ⁇ -NAGA substrates include natural compounds such as oligosaccharides, glycoproteins and glycolipids having N-acetylgalactosamine residues ⁇ -bonded to the non-reducing end, and 4-methylumbelliferyl- ⁇ -N—. It means a synthetic compound such as acetyl-D-galactosaminide.
  • the catalytic reaction of wild type ⁇ -GAL is shown in the following reaction formula (1)
  • the catalytic reaction of wild type ⁇ -NAGA is shown in the following reaction formula (2).
  • R 1 represents a “group derived from a sugar complex” when the substrate is a natural compound, and represents a “4-methylumbelliferyl group” when the substrate is a synthetic compound.
  • R 2 represents a “group derived from a sugar complex” when the substrate is a natural compound, and represents a “4-methylumbelliferyl group” when the substrate is a synthetic compound.
  • Preferred examples of the protein of the present invention include proteins having the following amino acid sequences (2a) or (2b) and having ⁇ -GAL activity.
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the subunit of wild-type ⁇ -NAGA (homodimer) and the information of the base sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the sequence are described in, for example, “accession member: NM_000262” in GenBank. Swiss-Prot (obtainable from http://tw.expasy.org/uniprot/) is “entry name: NAGAB_HUMAN, accession”. number: P17050 ".
  • sequence (SEQ ID NO: 10) of the subunit of wild-type ⁇ -GAL (homodimer) and the base sequence encoding the sequence (SEQ ID NO: 9) are also included in GenBank, for example, “accession number: NP_000160 ”and is registered as“ entryname: AGAL_HUMAN, accession number: P06280 ”in Swiss-Prot (available from http://tw.expasy.org/uniprot/).
  • amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added is, for example, about 1 to 10, preferably about 1 to 5 amino acids deleted or substituted. Or, it is preferably an added amino acid sequence.
  • the above “protein consisting of a deleted, substituted or added amino acid sequence” is a protein that can stably exhibit ⁇ -GAL activity, for example, in a substrate of ⁇ -GAL 28th to 31st, 77th to 81st, 117th to 127th, which are considered to be important for ⁇ -galactose residue binding (substrate binding) and catalytic reactivity with the substrate 150th to 158th, 192nd, 209th to 220th, and 242nd to 254th amino acids (particularly the 156th and 217th aspartic acids (Asp: D)), the 45th aspartic acid (Asp: D) and the 350th arginine (Arg: R) considered to be important for the formation of homodimers, and the N-type sugar chain All or part (preferably all) of the 124th, 177th, 201st, 359th, and 385th amino acids (all of which are asparagine (
  • the other amino acid is not particularly limited as far as the 188th amino acid residue is other than serine (Ser: S).
  • glutamic acid (Glu: E), aspartic acid (Asp: D), etc. are preferable, and glutamic acid is more preferable.
  • the amino acid residue at position 191 is not particularly limited as long as it is other than alanine (Ala: A).
  • the 188th amino acid is glutamic acid and the 191st amino acid is leucine.
  • the amino acid after the substitution is preferably one that does not substantially affect the structure composed of other non-substituted amino acids.
  • the 188th amino acid residue is glutamic acid. It is a particularly preferable substitution mode that the 191st amino acid residue is leucine.
  • the 188th amino acid residue has no interaction with the N-acetyl group (especially oxygen atom) in the ⁇ -NAGA substrate, and has a binding action with the hydroxyl group in the ⁇ -GAL substrate.
  • the interaction with the N-acetyl group (especially methyl group) in the substrate of ⁇ -NAGA is eliminated, and the binding space (especially N-acetyl group) of the substrate is eliminated.
  • the space in which the group enters can be limited.
  • the recombinant enzyme (recombinant protein) after the amino acid substitution has a higher binding reactivity with the ⁇ -GAL substrate than the binding reactivity with the ⁇ -NAGA substrate. It can be an enzyme having ⁇ -GAL activity that is significantly higher than NAGA activity.
  • a recombinant enzyme having an amino acid sequence in which at least the 188th amino acid (serine) is substituted with glutamic acid and the 191st amino acid (alanine) is substituted with leucine is particularly preferable in that the above effect can be sufficiently obtained. .
  • the protein of the present invention is also preferably the following protein (3a) or (3b).
  • the protein of (3a) is a signal peptide of wild type ⁇ -NAGA among the amino acid sequences substituted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as described in (i) to (iii) above.
  • the 188th and 191st amino acid residues are both amino acids constituting the substrate binding site.
  • the amino acid sequence including the 18th to 411st amino acid sequences is preferably an amino acid sequence in which various signal peptides are bonded to the N-terminal of the 18th to 411st amino acid sequences, for example.
  • the signal peptide is not particularly limited as long as it can pass through the cell membrane of a damaged organ, and examples thereof include signal peptides of various lysosomal enzymes such as wild-type ⁇ -NAGA and wild-type ⁇ -GAL, and preprotrypsin.
  • the signal peptides of the secretory enzymes are preferably wild type ⁇ -NAGA and wild type ⁇ -GAL signal peptides, and more preferably wild type ⁇ -GAL signal peptides.
  • the wild-type ⁇ -NAGA signal peptide is a peptide consisting of the first to 17th amino acids of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -NAGA shown in SEQ ID NO: 2, as described above.
  • the -GAL signal peptide is a peptide consisting of the first to 31st amino acids of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -GAL shown in SEQ ID NO: 10.
  • the signal peptide of preprotrypsin is a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the protein (3a) is preferably a protein in the case where the “amino acid other than serine” in the descriptions (i) and (iii) is glutamic acid or aspartic acid.
  • the protein of (3a) above any one selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine, phenylalanine and methionine in which “amino acid other than alanine” in the descriptions of (ii) and (iii) above is used.
  • the protein of (3a) above is a protein in which “amino acids other than serine” in the descriptions of (i) to (iii) above are glutamic acid and “amino acid other than alanine” is leucine.
  • amino acids other than serine in the descriptions of (i) to (iii) above are glutamic acid and “amino acid other than alanine” is leucine.
  • the protein include a protein in which the 188th serine in the amino acid sequence of wild type ⁇ -NAGA (SEQ ID NO: 2) is substituted with glutamic acid and the 191st alanine is substituted with leucine ( ⁇ - NAGA (S188E / A191L)) is preferred (see SEQ ID NO: 4).
  • the alphabetical representation of amino acids is generally represented by three letters (for example, “Ser”) or one letter (for example, “S”), and is displayed before a number indicating the amino acid position from the N-terminus (for example, “188”).
  • the alphabet indicates the one-letter code of the amino acid before substitution, and the alphabet displayed after the number indicates the one-letter code of the amino acid after substitution. Therefore, for example, when the 188th Ser is replaced with Glu, “S188E” is displayed (the same applies hereinafter).
  • the protein of (3b) is one or several (for example, 1 to 3) excluding the amino acid at the substitution site in any one of the amino acid sequences (i) to (iii) contained in the protein of (3a).
  • the “substitution site” refers to the position of the 188th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 among the 394 amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • amino acid residue corresponding to the position of the 191st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (however, the amino acid residues corresponding to (i) and (iii) above) (Ii) and (iii) amino acid sequences). More specifically, the former amino acid residue means the 171st amino acid residue in the amino acid sequences of the above (i) and (iii), and the latter amino acid residue means the above (ii) and (iii) 174) amino acid residue in the amino acid sequence.
  • the protein (3b) is a protein that can stably exhibit ⁇ -GAL activity. Therefore, for example, the amino acid residues considered to be important for the binding property (substrate binding property) to the ⁇ -galactose residue in the ⁇ -GAL substrate and the catalytic reactivity with the substrate are the above (i) to (iii). ) Which is not mutated (deleted, substituted or added) from the amino acid sequence of The amino acid residues include the 28th to 31st and 77th to 81st amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 among the amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • Amino acid residues corresponding to the positions of amino acids Nos. 117 to 127, 150 to 158, 192, 209 to 220 and 242 to 254 include the 156th and 217th aspartic acids (Asp: D)) which are catalytic sites.
  • amino acid residues considered to be important for the formation of homodimers are preferably those that are not mutated (deleted, substituted or added) from the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • the amino acid residues correspond to the positions of the 45th and 350th amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 among the amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • Amino acid residues (specifically, the 45th aspartic acid (Asp: D) and the 350th arginine (Arg: R)) are preferably mentioned.
  • amino acid residues that are N-type sugar chain binding sites are preferably those that are not mutated (deleted, substituted or added) from the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • the amino acid residues are the 124th, 177th, 201st, 359th in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 among the amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • An amino acid residue (both asparagine (Asn: N)) corresponding to the position of the amino acid at position No. 385 and the position No. 385 is preferred.
  • the protein of the present invention is further preferably the following protein (4a) or (4b).
  • a protein comprising any one of the following amino acid sequences (i) to (iii): (I) An amino acid sequence in which the amino acid at position 202 is substituted with an amino acid other than serine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (ii) The amino acid at position 205 in amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is an amino acid other than alanine Amino acid sequence (iii) wherein the amino acid at position 202 is replaced with an amino acid other than serine and the amino acid at position 205 is replaced with an amino acid other than alanine (4b).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of any one of (i) to (iii) above are deleted, substituted or added, and having ⁇ -galactosidase activity
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is wild type ⁇ -NA.
  • the signal peptide portion of wild type ⁇ -GAL is a peptide portion consisting of the first to 31st amino acids of the amino acid sequence constituting wild type ⁇ -GAL shown in SEQ ID NO: 10, as described above. It is.
  • the 188th and 191st amino acid residues are both amino acids constituting the substrate binding site.
  • a protein containing the amino acid sequence (iii) is particularly preferable.
  • the protein (4a) is preferably a protein in the case where the “amino acid other than serine” in the description of (i) and (iii) is glutamic acid or aspartic acid.
  • the protein of (4a) above any one selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine, phenylalanine and methionine in which “amino acid other than alanine” in the descriptions of (ii) and (iii) above is used.
  • the protein of (4a) above is a protein in which “amino acids other than serine” in the description of (i) to (iii) above is glutamic acid and “amino acid other than alanine” is leucine.
  • amino acids other than serine in the description of (i) to (iii) above is glutamic acid and “amino acid other than alanine” is leucine.
  • the protein include a protein in which the 202nd serine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is substituted with glutamic acid and the 205th alanine is substituted with leucine ( ⁇ -GAL signal peptide fusion ⁇ -NAGA (S202E / A205L)) is preferred.
  • the protein of (4b) is one or several (for example, 1 to 4) excluding the amino acid at the substitution site in any one of the amino acid sequences (i) to (iii) contained in the protein of (4a).
  • substitution site means the 202nd amino acid residue (provided above (i) and (iii) above) among the 425 amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above. Amino acid sequence) and the 205th amino acid residue (limited to the amino acid sequences of (ii) and (iii) above).
  • the protein (4b) is a protein that can stably exhibit ⁇ -GAL activity. Therefore, for example, the amino acid residues considered to be important for the binding property (substrate binding property) to the ⁇ -galactose residue in the ⁇ -GAL substrate and the catalytic reactivity with the substrate are the above (i) to (iii).
  • amino acid residues considered to be important for the formation of homodimers are preferably those that are not mutated (deleted, substituted or added) from the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • amino acid residues among the 425 amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above, the 59th and 364th amino acid residues (specifically, the 59th asparagine) An acid (Asp: D) and a 364th arginine (Arg: R)) are preferred.
  • amino acid residues which are N-type sugar chain binding sites are preferably those that are not mutated (deleted, substituted or added) from the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • the amino acid residues include the 138th, 191st, 215th, 373rd and 399th amino acid residues of the 425 amino acid residues constituting the amino acid sequences (i) to (iii) above.
  • Preferred is a group (both asparagine (Asn: N)).
  • the ⁇ -GAL activity of the protein of the present invention described above is collected by expressing the target protein in cells derived from mammals such as CHO cells and human fibroblasts, and the protein (enzyme solution).
  • methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactoside a synthetic substrate obtained from ⁇ -D-galactose and 4-methylumbelliferone (fluorescent substrate)
  • methyl-umbelliferyl- ⁇ -D-galactoside a synthetic substrate obtained from ⁇ -D-galactose and 4-methylumbelliferone (fluorescent substrate)
  • It can be measured by detecting the amount of 4-methylumbelliferone that the unit amount of the enzyme solution can be released per unit time.
  • ⁇ -NAGA activity was also collected by expressing the target protein and the protein (enzyme solution) and 4-methylumbelliferyl- ⁇ -N-acetyl-D-galactosaminide.
  • a synthetic substrate obtained from ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine and 4-methylumbelliferone (fluorescent substrate) and reacted under acidic conditions, the unit amount of the enzyme solution is It can be measured by detecting the amount of 4-methylumbelliferone that can be released per unit time.
  • various known detection methods can be adopted for detection of the fluorescent substrate.
  • a detection method using a fluorometer or the like is preferable.
  • the target protein may be expressed by incorporating it into various known expression vectors and introducing it into cells.
  • the gene described in this item is a gene encoding the protein according to the present invention described above.
  • a gene encoding the protein according to the present invention for example, a gene containing the following DNA (1a) or (1b) is preferably exemplified.
  • the following DNAs (1a) and (1b) are preferably structural genes of the protein of the present invention, but the gene containing these DNAs may be composed only of these DNAs.
  • these DNAs may be included in part, and may also include known base sequences (transcription promoter, SD sequence, Kozak sequence, terminator, etc.) necessary for gene expression, and is not limited.
  • DNA comprising any one of the following base sequences (i) to (iii) (I) In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the 562nd to 564th bases “agc” are substituted with bases indicating codons of amino acids other than serine.
  • the base sequences in which the 571st to 573rd bases are substituted with bases indicating the codons of amino acids other than alanine are substituted with bases indicating the codons of amino acids other than alanine.
  • a base sequence consisting of the 36th base (1b) hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising any one of (i) to (iii) of (1a) above.
  • DNA encoding soybean wherein the base corresponding to the base at the substitution site is the same as the base at the substitution site, and encodes a protein having ⁇ -galactosidase activity
  • the term “codon” means not only a three-base chain (triplet) on the RNA sequence after transcription but also a three-base chain on the DNA sequence. Therefore, the notation of the codon on the DNA sequence is performed using thymine (T) instead of uracil (U).
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a base sequence consisting of 1,236 bases encoding wild type ⁇ -NAGA.
  • the DNA of the above (1a) is a wild-type ⁇ -NAGA among the base sequences in which the base substitution is performed as described in the above (i) to (iii) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • DNA comprising a base sequence including the 52nd to 1st and 236th base sequences excluding the 1st to 51st bases encoding the signal peptide.
  • the base sequence including the 52nd to 1236th base sequences for example, various signal peptides are encoded on the 5 ′ side of the 52nd to 1236th base sequences.
  • Preferred is a base sequence to which a base sequence (polynucleotide) is bound.
  • the signal peptide is not particularly limited as long as it can pass through the cell membrane of a damaged organ.
  • signal peptides of various lysosomal enzymes such as wild type ⁇ -NAGA and wild type ⁇ -GAL, and preprotrypsin
  • a signal peptide of a secretory enzyme such as (pre protopsin) is preferable
  • a signal peptide of wild type ⁇ -NAGA and wild type ⁇ -GAL is more preferable
  • a signal peptide of wild type ⁇ -GAL is more preferable.
  • the base sequence encoding the signal peptide of wild-type ⁇ -NAGA is a base sequence consisting of the first to 51st bases in the base sequence of wild-type ⁇ -NAGA shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence encoding the signal peptide of type ⁇ -GAL is a base sequence consisting of the first to 93rd bases in the base sequence of wild-type ⁇ -GAL shown in SEQ ID NO: 9.
  • the base sequence encoding the signal peptide of preprotrypsin is the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • DNA containing the base sequence of (iii) is particularly preferable among DNAs containing the base sequence of (i), (ii) or (iii).
  • the DNA of (1a) above is DNA in the case where the “base indicating the codon of amino acid other than serine” in the description of (i) and (iii) above is a base indicating the codon of glutamic acid or aspartic acid. Preferably mentioned.
  • the DNA of (1a) above is selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine, phenylalanine, and methionine as the “base indicating the codon of an amino acid other than alanine” in the descriptions of (ii) and (iii) above.
  • Preferred is also DNA in the case of a base showing any one of the above codons.
  • the bases indicating the codons of each of the above amino acids (the leftmost base is the 5′-side base)
  • the base indicating the glutamic acid codon is “gag” or “gaa” (preferably “gag”).
  • the base indicating the codon of aspartic acid is “gat” or “gac”.
  • the base indicating the codon of leucine is “ctc”, “ctt”, “cta” or “ctg” (preferably “ctc”)
  • the base indicating the codon of valine is “gtt”, “gtc”, “Gta” or “gtg”
  • the base indicating an isoleucine codon is “att”, “atc” or “ata”
  • the base indicating a phenylalanine codon is “ttt” or “ttc”
  • the base indicating the codon is “atg”.
  • the bases indicating serine codons include “agt” in addition to “agc”
  • the bases indicating alanine codons include “gct”, “gca”, and “gcg” in addition to “gcc”. is there.
  • the “base indicating the codon of amino acid other than serine” in the description of (i) to (iii) above is a base indicating the codon of glutamic acid
  • Particularly preferred is DNA in the case where the “base indicating an amino acid codon” is a base indicating a leucine codon.
  • the 562nd to 564th bases are substituted from a base indicating a serine codon to a base indicating a glutamic acid codon (“ agc ” ⁇ “ gag ”), and the bases of the 571st to 573rd bases are replaced by the bases indicating the codons of alanine (“ gcc ” ⁇ “ ctc ”).
  • DNA consisting of No. 3
  • the 562nd to 564th bases after substitution may be bases other than the above “gag” as long as they represent bases of glutamic acid, and similarly, the 571th base after substitution is the same.
  • the bases from the 573nd to the 573rd may be bases other than the above “ctc” as long as they indicate the leucine codons, and are not limited.
  • Such mutation-substituted DNA is described in, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. It can be prepared according to the site-specific displacement induction method. Specifically, it can be prepared using a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known method such as Kunkel method and Gapped duplex method, and examples of the kit include Quick Change TM Site.
  • DNA containing a base sequence encoding wild-type ⁇ -NAGA, etc. as a template can also be prepared by performing PCR under.
  • the DNA polymerase used for PCR is not limited, but is preferably a highly accurate DNA polymerase.
  • PwowDNA polymerase Roche Diagnostics
  • Pfu DNA polymerase Promega
  • platinum Pfx DNA polymerase Invitrogen
  • KOD DNA polymerase Toyobo
  • KOD-plus-polymerase Toyobo
  • the PCR reaction conditions may be appropriately set depending on the optimum temperature of the DNA polymerase to be used, the length and type of the DNA to be synthesized, etc.
  • cycle conditions “90-98 ° C. for 5-30 seconds (thermal denaturation) (Dissociation) ⁇ 50 to 65 ° C. for 5 to 30 seconds (annealing) ⁇ 65 to 80 ° C. for 30 to 1200 seconds (synthesis / elongation) ”is preferably performed under a total of 20 to 200 cycles.
  • the DNA of the above (1b) is a DNA comprising any one of the above base sequences (i) to (iii) (that is, the DNA of the above (1a)), a DNA comprising a complementary base sequence, or a fragment thereof.
  • the obtained product can be used as a probe and subjected to known hybridization methods such as colony hybridization, plaque hybridization, and Southern blot, and can be obtained from a cDNA library or a genomic library.
  • a library prepared by a known method may be used, or a commercially available cDNA library or genomic library may be used, and is not limited.
  • “Stringent conditions” in carrying out the hybridization method are conditions at the time of washing after hybridization, and the salt concentration of the buffer is 15 to 330 mM, the temperature is 25 to 65 ° C., preferably the salt concentration is 15 to It means the condition of 150 mM and temperature of 45-55 ° C. Specifically, for example, conditions such as 50 mM at 80 mM can be exemplified. Furthermore, in addition to such conditions as salt concentration and temperature, various conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. should be taken into account to appropriately set the conditions for obtaining the DNA of (1b) above. Can do.
  • the hybridizing DNA is preferably a base sequence having at least 40% homology to the DNA sequence of the above (1a), more preferably 60% or more, still more preferably 90% or more, Particularly preferred is 95% or more, and most preferred is 99% or more.
  • the base corresponding to the base at the substitution site is the same as the base at the substitution site.
  • substitution site here is a site of base substitution made in any one of the base sequences (i) to (iii) contained in the DNA of (1a) above. It means the site of the base (triplet) indicating the codon after the change has occurred. Specifically, the “substitution site” refers to the 562nd to 564th positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 among the 1,185 bases constituting the base sequences (i) to (iii) above.
  • the former base means the 511th to 513th bases in the base sequences (i) and (iii) above
  • the latter base means the bases in (ii) and (iii) above. This means the 520th to 522nd bases in the base sequence.
  • the “corresponding base” of the “base corresponding to the base at the substitution site” means that when the DNA of (1b) is hybridized with a complementary strand to the DNA of (1a), It means a base (triplet) that is in a position opposite to the base complementary to the base at the site (triplet).
  • the base sequence of the DNA of (1b) has no deletion and addition mutations compared to the DNA of (1a) (that is, the length (number of bases) of both DNAs is the same)
  • the 511th to 513th bases and / or the 520th to 522nd bases in the base sequence of the DNA of (1b) are the “corresponding bases”.
  • the DNA of (1b) above is a DNA encoding a protein having ⁇ -GAL activity. Therefore, for example, the bases indicating the codons of amino acid residues considered to be important for the binding property (substrate binding property) to ⁇ -galactose residues in the substrate of ⁇ -GAL and the catalytic reactivity with the substrate are the above ( Those not mutated (deleted, substituted or added) from the base sequences i) to (iii) are preferred.
  • Such bases in the base sequences (i) to (iii) above include the 82nd to 93rd (4 codons), 229th to 229th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 among the base sequences.
  • the base corresponding to the position of the 12 th (12 codon) and 724 th to 762 th (13 codon) bases is preferred, and in particular, the 466 th to 468 th positions indicating the codons of the amino acid residues at the catalytic site
  • the bases corresponding to the 649th to 651th bases are preferred.
  • the bases indicating the codons of amino acid residues considered to be important for the formation of homodimers are also mutated (deleted, substituted or replaced) from the base sequences of (i) to (iii) above. Those not added) are preferred.
  • Examples of such bases on the base sequences (i) to (iii) above include the 133rd to 135th positions and the 1,048th to 1st positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 among the base sequences. A base corresponding to the position of the 1,050th base is preferred.
  • the bases indicating the codons of amino acid residues that are N-type sugar chain binding sites are also mutated (deleted, substituted or added) from the base sequences of (i) to (iii) above. Those not present are preferred.
  • Such bases on the base sequences (i) to (iii) include the 370th to 372nd positions and the 529th to 531st positions in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 among the base sequences.
  • the DNA of (1b) is, for example, a base that is not completely identical in terms of base sequence but is completely identical in translated amino acid sequence as compared to the DNA of (1a) above.
  • a DNA comprising a sequence that is, a DNA obtained by subjecting the DNA of (1a) to a silent mutation is particularly preferred.
  • the gene containing DNA of the following (2a) or (2b) is also mentioned preferably.
  • the following DNAs (2a) and (2b) are preferably both structural genes of the protein of the present invention, but the gene containing these DNAs may be composed only of these DNAs, These DNAs may be included in part, and may also contain known base sequences (transcription promoter, SD sequence, Kozak sequence, terminator, etc.) necessary for gene expression, and are not limited.
  • DNA containing the base sequence of (i), (ii) or (iii) is particularly preferable.
  • DNA of (2a) above is DNA in the case where the “base indicating the codon of amino acid other than serine” in the description of (i) and (iii) above is a base indicating the codon of glutamic acid or aspartic acid. Preferably mentioned.
  • the DNA of (2a) above is selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine, phenylalanine, and methionine as the “base indicating the codon of an amino acid other than alanine” in the descriptions of (ii) and (iii) above.
  • Preferred is also DNA in the case of a base showing any one of the above codons.
  • the description regarding the DNA of (1a) can be similarly applied.
  • the “base indicating the codon of amino acid other than serine” in the description of (i) to (iii) above is a base indicating the codon of glutamic acid
  • Particularly preferred is DNA in the case where the “base indicating an amino acid codon” is a base indicating a leucine codon.
  • the 604th to 606th bases are substituted from the base showing the serine codon to the base showing the glutamic acid codon (“agc” ⁇ “ gag "), and the bases (SEQ ID NO: 7) in which the 613rd to 615th bases are replaced with bases indicating a codon of alanine to a base indicating a leucine codon (" gcc " ⁇ " ctc ").
  • the 604th to 606th bases after substitution may be bases other than the above “gag” as long as they represent bases of glutamic acid.
  • the th to 615th bases may be bases other than the above “ctc” as long as they indicate the leucine codons, and are not limited.
  • the DNA of the above (2b) is a DNA comprising any one of the above base sequences (i) to (iii) (that is, the DNA of the above (2a)), a DNA comprising a base sequence complementary thereto, or a fragment thereof.
  • the obtained product can be used as a probe and subjected to a known hybridization method to obtain a cDNA library or a genomic library.
  • the hybridizing DNA is preferably a base sequence having at least 40% homology to the DNA sequence of the above (2a), more preferably 60% or more, still more preferably 90% or more, Particularly preferred is 95% or more, and most preferred is 99% or more.
  • the base corresponding to the base at the substitution site is the same as the base at the substitution site.
  • substitution site is a site of base substitution made in any one of the base sequences (i) to (iii) contained in the DNA of (2a) above. It means the site of the base (triplet) indicating the codon after the change has occurred.
  • substitution site refers to the 604th to 606th bases of the 1,275 bases constituting the base sequences (i) to (iii) (provided that (i) above And (iii) base sequence) and 613th to 615th bases (however, limited to the base sequences (ii) and (iii) above).
  • the “corresponding base” of the “base corresponding to the base at the substitution site” means that when the DNA of (2b) is hybridized with a complementary strand to the DNA of (2a), It means a base (triplet) that is in a position opposite to the base complementary to the base at the site (triplet).
  • the base sequence of the above DNA (2b) has no deletion and addition mutations compared to the above DNA (2a) (that is, the length (base number) of both DNAs is the same)
  • the 604th to 606th bases and / or the 613th to 615th bases in the base sequence of the DNA of (2b) are the “corresponding bases”.
  • the DNA of (2b) above is a DNA encoding a protein having ⁇ -GAL activity. Therefore, for example, the bases indicating the codons of amino acid residues considered to be important for the binding property (substrate binding property) to ⁇ -galactose residues in the substrate of ⁇ -GAL and the catalytic reactivity with the substrate are the above ( Those not mutated (deleted, substituted or added) from the base sequences i) to (iii) are preferred.
  • bases on the base sequences (i) to (iii) include the 124th to 135th (4 codons), the 271st to 285th (5 codons), 391st to 423rd (11 codons), 490th to 516th (9 codons), 616th to 618th (1 codon), 667th to 702th (12 codons) and 766th
  • the 804th (13th codon) base is preferred, and the 508th to 510th and 691st to 693rd bases indicating the codon of the amino acid residue at the catalytic site are particularly preferred.
  • the bases indicating the codons of amino acid residues considered to be important for the formation of homodimers are also mutated (deleted, substituted or replaced) from the base sequences of (i) to (iii) above. Those not added) are preferred.
  • Preferred examples of such bases on the base sequences (i) to (iii) include the 175th to 177th bases and the 1,090th to 1,092th bases in the base sequence. .
  • the bases indicating the codons of amino acid residues that are N-type sugar chain binding sites are also mutated (deleted, substituted or added) from the base sequences of (i) to (iii) above. Those not present are preferred.
  • Such bases on the base sequences (i) to (iii) include the 412st to 414th, the 571st to 573th, the 643rd to 645th, Preferred are the 1,117th to 1,119th bases and the 1,195th to 1,197th bases.
  • the DNA of (2b) is, for example, a nucleotide sequence that is not completely identical to the DNA of (2a), but is completely identical in terms of the translated amino acid sequence.
  • a DNA comprising a sequence that is, a DNA obtained by subjecting the DNA of (2a) to a silent mutation is particularly preferred.
  • codons corresponding to individual amino acids after translation are not particularly limited. Therefore, after transcription, codons generally used in mammals such as humans ( Preferably, it may contain DNA showing frequently used codons, or it may be a codon generally used in microorganisms such as Escherichia coli and yeast, plants, etc. (preferably frequently used codons). ) May be included.
  • a recombinant vector in which the above-described gene of the present invention is incorporated into an expression vector is constructed.
  • a transcription promoter, an SD sequence (when the host is a prokaryotic cell), and a Kozak sequence (when the host is a eukaryotic cell) are ligated upstream in advance as necessary.
  • a terminator may be linked downstream, and an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, etc. may be linked.
  • Each element necessary for gene expression such as the above transcription promoter may be included in the gene from the beginning, or may be used when originally included in the expression vector. A use aspect is not specifically limited.
  • a method for incorporating the gene into an expression vector various methods using known gene recombination techniques such as a method using a restriction enzyme and a method using topoisomerase can be employed.
  • the expression vector is not limited as long as it can hold the gene encoding the protein of the present invention, such as plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, retroviral vector, artificial chromosome DNA, and the like.
  • a vector suitable for the host cell to be used can be appropriately selected and used.
  • the constructed recombinant vector is introduced into a host to obtain a transformant, and this is cultured, whereby the protein of the present invention can be expressed.
  • the “transformant” as used in the present invention means a gene into which a foreign gene has been introduced into the host, for example, a gene into which a foreign gene has been introduced by introducing plasmid DNA or the like into the host (transformation), Also included are those in which a foreign gene has been introduced by infecting a host with various viruses and phages (transduction).
  • the host is not limited as long as it can express the protein of the present invention after the introduction of the above recombinant vector, and can be selected as appropriate.
  • various animal cells such as humans and mice can be selected.
  • known hosts such as various plant cells, bacteria, and yeast.
  • animal cells for example, human fibroblasts, CHO cells, monkey cells COS-7, Vero, mouse L cells, rat GH3, human FL cells and the like are used. Insect cells such as Sf9 cells and Sf21 cells can also be used.
  • bacteria When bacteria are used as hosts, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis and the like are used.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, and the like are used.
  • plant cells are used as hosts, for example, tobacco BY-2 cells are used.
  • the method for obtaining the transformant is not limited and can be appropriately selected in consideration of the combination of the type of the host and the expression vector.
  • electroporation, lipofection, heat shock, PEG, Preferred examples include calcium phosphate method, DEAE dextran method, and methods of infecting various viruses such as DNA virus and RNA virus.
  • the codon type of the gene contained in the recombinant vector may be the same as or different from the codon type of the host actually used, and is not limited.
  • the protein of the present invention (protein having ⁇ -GAL activity) is produced, for example, by changing the structure of the active site (especially the substrate binding site) of wild-type ⁇ -NAGA so that the ⁇ -GAL substrate can be bound. can do. If an ⁇ -GAL substrate can be bound, the substrate can be hydrolyzed by catalysis by the catalytic site of wild-type ⁇ -NAGA.
  • Such a structural change is, for example, as described above, by genetic recombination technology, in which (i) the 188th serine is added to glutamic acid in the amino acid sequence constituting the active site (substrate binding site) of wild-type ⁇ -NAGA. Or (ii) the 191st alanine is replaced with another amino acid such as leucine, valine, isoleucine, phenylalanine or methionine, or (iii) the 188th serine and the Both the 191st alanine is substituted as in (i) and (ii) above.
  • the structural change is preferably performed by replacing the 188th serine with glutamic acid and the 191st alanine with leucine, thereby conferring ⁇ -NAGA substrate specificity of ⁇ -GAL. be able to.
  • the amino acid substitution that causes a remarkable three-dimensional structural change is to substitute the 191st alanine with leucine or the like.
  • the side chain of the 191st amino acid is changed from “—CH 3 ” which is a side chain of alanine to “—CH 2 —CH (CH 3 ) —CH 3 ” which is a side chain of leucine.
  • the above-described method for producing the protein of the present invention may be performed using wild-type ⁇ -NAGA containing a signal peptide derived from wild-type ⁇ -GAL as wild-type ⁇ -NAGA before the structural change, Alternatively, after obtaining mutant ⁇ -NAGA by structural change, adding (binding) a wild type ⁇ -GAL-derived signal peptide to this mutant ⁇ -NAGA, or mutant ⁇ -NAGA is wild type In the case of containing an ⁇ -NAGA signal peptide, a step of converting this signal peptide into a signal peptide derived from wild-type ⁇ -GAL may be carried out without any limitation.
  • the structure of the active site of wild-type human ⁇ -N-acetylgalactosaminidase containing a signal peptide derived from wild-type human ⁇ -galactosidase is used as the substrate for ⁇ -galactosidase.
  • a method for producing a protein having ⁇ -GAL activity characterized in that the protein is changed so that it can be bound.
  • a signal peptide derived from wild-type ⁇ -GAL is added to a protein whose structure of the active site of wild-type ⁇ -NAGA is changed so that an ⁇ -GAL substrate can be bound. (Binding) or converting a signal peptide portion of a protein whose wild-type ⁇ -NAGA active site structure is changed so that an ⁇ -GAL substrate can bind to a signal peptide derived from wild-type ⁇ -GAL.
  • a method for producing a protein having ⁇ -GAL activity characterized by
  • the above-mentioned conversion of the signal peptide portion can be performed by a conventional method of gene recombination technology using known base sequence information and amino acid sequence information for wild type ⁇ -NAGA and wild type ⁇ -GAL.
  • the production of the protein of the present invention can be carried out by a method comprising a step of culturing the above-described transformant and a step of collecting a protein having ⁇ -galactosidase activity from the obtained culture.
  • cultured product means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells.
  • the transformant can be cultured according to a usual method used for host culture.
  • the protein of interest is accumulated in the culture.
  • any known natural medium and any known medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the host, and can efficiently culture the transformant.
  • Any synthetic medium may be used.
  • the cells may be cultured under selective pressure in order to prevent the recombinant vector contained in the transformant from dropping and the gene encoding the target protein from dropping off. That is, when the selectable marker is a drug resistance gene, the corresponding drug can be added to the medium, and when the selectable marker is an auxotrophic complementary gene, the corresponding nutrient factor can be removed from the medium. it can. For example, when culturing human fibroblasts transduced with a vector containing a G418 resistance gene, G418 (G418 sulfate) may be added as needed during the culture.
  • G418 G418 sulfate
  • a suitable inducer eg, IPTG
  • IPTG IPTG
  • the culture conditions of the transformant are not particularly limited as long as the productivity of the target protein and the growth of the host are not hindered, and are usually 10 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C. and 5 to 100. Do time.
  • the pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. Examples of the culture method include solid culture, stationary culture, shaking culture, and aeration and agitation culture.
  • the target protein After culturing, when the target protein is produced in the microbial cells or cells, the target protein can be collected by disrupting the microbial cells or cells.
  • a method for disrupting cells or cells high-pressure treatment using a French press or homogenizer, ultrasonic treatment, grinding treatment using glass beads, enzyme treatment using lysozyme, cellulase, pectinase, etc., freeze-thawing treatment, hypotonic solution treatment, It is possible to use a lysis inducing treatment with a phage or the like.
  • the cells or cell crushing residues (including the cell extract insoluble fraction) can be removed as necessary. Examples of the method for removing the residue include centrifugation and filtration. If necessary, the residue removal efficiency can be increased by using a flocculant or a filter aid.
  • the supernatant obtained after removing the residue is a cell extract soluble fraction and can be a crudely purified protein solution.
  • the target protein when the target protein is produced in cells or cells, the cells or cells themselves can be recovered by centrifugation, membrane separation, etc., and used without being crushed.
  • the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or filtration. Then, if necessary, the target protein is collected from the culture by extraction with ammonium sulfate precipitation, and further, if necessary, using dialysis and various chromatography (gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.) It can also be isolated and purified.
  • the signal peptide portion when it is produced using cells or cells (inside or inside cells, or outside or outside cells), the signal peptide portion is usually When it moves from the intracellular endoplasmic reticulum to the cytoplasm, or when it is secreted outside the cell or extracellularly, it is finally recovered in the state of a mature protein having no signal peptide portion.
  • this embodiment is not limited. For example, two or more overlapping signal peptide portions necessary for the above-mentioned transfer from the endoplasmic reticulum to the cytoplasm and secretion outside the cell or the cell are duplicated.
  • the protein having (continuously) may be expressed once, and the protein having at least one signal peptide portion may be recovered even after the migration and secretion.
  • the signal peptide portion may be cleaved or decomposed using an enzyme or the like to obtain a mature protein.
  • the production yield of the protein obtained by culturing the transformant is, for example, SDS-PAGE (polyacrylamide gel) in units such as per culture medium, per microbial wet weight or dry weight, or per crude enzyme solution protein. For example, electrophoresis).
  • the target protein can also be produced using a cell-free protein synthesis system that does not use living cells at all.
  • the cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes a target protein in an artificial container such as a test tube using a cell extract.
  • Cell-free protein synthesis systems that can be used also include cell-free transcription systems that synthesize RNA using DNA as a template.
  • the cell extract to be used is preferably derived from the aforementioned host cell.
  • the cell extract include extracts derived from eukaryotic cells or prokaryotic cells. More specifically, CHO cells, rabbit reticulocytes, mouse L-cells, HeLa cells, wheat germ, budding yeast, Escherichia coli, and the like are extracted. Liquid can be used. These cell extracts may be used after being concentrated or diluted, or may be used as they are, and are not limited.
  • the cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation, or the like.
  • Such cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit.
  • reagent kits PROTEIOS TM Toyobo
  • TNT TM System Promega
  • synthesizer PG-Mate TM Toyobo
  • RTS Roche Diagnostics
  • the target protein produced by cell-free protein synthesis can be purified by appropriately selecting means such as chromatography as described above.
  • the form of the protein is not limited.
  • the form contained in the composition may be a dry form or an aqueous solution.
  • the protein of the present invention which is an active ingredient in the pharmaceutical composition described later, may be used in the form of various salts, hydrates, etc., if necessary, and also has storage stability (especially an enzyme) as a therapeutic agent. It may be used in a state where an appropriate chemical modification is made in consideration of (maintenance of activity), and is not particularly limited.
  • About the aspect in case protein is contained in a composition [3. Details of the pharmaceutical combination for the treatment of Fabry disease].
  • the active site-specific chaperone compound according to the present invention is a compound represented by the following general formula (I), or
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • description of the functional group in R 0 of the formula (I) is a functional group corresponding to the functional group that releases a hydrogen ion in water and has a negative charge (for example, —O ⁇ , —SO 3 ⁇ , — COO ⁇ ) is also included, and compounds having these functional groups are also within the category of the compounds represented by formula (I).
  • the active site-specific chaperone compound according to the present invention also includes its free base form and any pharmaceutically acceptable salt form.
  • alkyl group having 1 to 4 carbon atoms may be linear or branched. There may be.
  • alkyl group having 1 to 4 carbon atoms in R 0 specifically, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert- A butyl group is mentioned.
  • an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferable, an alkyl group having 1 or 2 carbon atoms is more preferable, and a carbon number of 1 is more preferable.
  • halogen atom in the haloalkyl group or the halogen group examples include F, Cl, and Br, and F or Cl is preferable.
  • the haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms in R 0 is a group in which the above-mentioned “halogen atom” is substituted in the above alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and examples thereof include trifluoromethyl, trichloromethyl, and the like.
  • Difluoromethyl Dichloromethyl, dibromomethyl, fluoromethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 2,2,2-trichloroethyl, 2-bromoethyl, 2-chloroethyl, 2-fluoroethyl, 2-iodoethyl, 3 -Chloropropyl, 2,2-dibromoethyl, 4-iodobutyl, 4-fluorobutyl, 4-chlorobutyl group and the like.
  • the alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms in R 0 is a group in which the above alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is bonded to an oxygen atom.
  • methoxy, ethoxy, n-propoxy, iso Examples include propoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy and the like.
  • the hydroxyalkyl group having 1 to 4 carbon atoms in R 0 is a group in which a hydroxyl group is substituted on the above-mentioned alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and examples thereof include hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, hydroxy A butyl group etc. are mentioned. In one example, a hydroxymethyl group is preferred.
  • the cycloalkyl group having 3 or 4 carbon atoms in R 0 is a 3-membered or 4-membered saturated or unsaturated cyclic hydrocarbon group, and examples thereof include a cyclopropyl group, a cyclopropylmethyl group, and a cyclobutyl group. It is done.
  • R 0 is preferably H, —OH, —SO 3 H or —SO 3 — , and may be H or —SO 3 H or —SO 3 —. More preferably, H is even more preferable.
  • the active site-specific chaperone compound of one embodiment is a competitive inhibitor of a protein according to the present invention.
  • “Competitive inhibitor” of an enzyme means a compound that is similar in chemical structure and molecular geometry and structure to an enzyme substrate and binds to the enzyme at approximately the same position as the substrate.
  • Active site-specific chaperone compounds as competitive inhibitors compete for the same active site as the substrate molecule and increase the Km.
  • Competitive inhibition can be reversible. Thus, the extent of enzyme inhibition depends on the concentration of the competitive inhibitor, the substrate concentration, and the relative affinity of the inhibitor and substrate for the active site.
  • ⁇ -NAGA mutants are more stable at acidic (lysosomal conditions) pH (5.2) than at neutral pH (7.4).
  • the stability of the enzyme can be improved as compared with the case where the active site-specific chaperone is not contacted under both neutral and acidic conditions.
  • the active site-specific chaperone further increases the denaturation temperature (Tm value) of the ⁇ -NAGA mutant.
  • the active site-specific chaperone is 1-deoxygalactonojirimycin (DGJ) in which R 0 is H, or R 0 is —SO 3 — in the structure of formula (I) above.
  • a galactostatin bisulfite galactostatin bisulfite (GBS)
  • GGS galactostatin bisulfite
  • 1-deoxygalactonojirimycin DGJ
  • 1-deoxygalactonojirimycin is (2R, 3S, 4R, 5S) -2- (hydroxymethyl) piperdine-3,4,5-triol
  • “1-deoxygalactonojirimycin” or “ Reference to “DGJ” includes both its free base form and any pharmaceutically acceptable salt form. It is known as Migarasutatto hydrochloride salt.
  • DGJ 1-deoxygalactonojirimycin
  • galactostatin bisulfite (galactostatin bisulfite (GBS)) has the following structure.
  • the active site-specific chaperone according to the present invention has at least one of the following functions.
  • a protein helps to take a stable three-dimensional structure, (2) Suppresses proteolysis, and promotes the movement of the protein from the ER to an appropriate place in the cell.
  • the active site-specific chaperone can be used as a stability improver for enhancing the stability of a protein. That is, the present invention is a stability improver for increasing the stability of a protein, wherein the protein is the ⁇ -NAGA mutant protein of the present invention, and the stability improver is an active site of the present invention. There is provided a stability improver comprising a specific chaperone compound.
  • the form of the active site-specific chaperone is not limited.
  • the form contained in the composition may be a dry form or an aqueous solution. Any form of these active site-specific chaperones can be used as a stability enhancer.
  • an active site-specific chaperone is contained in the composition, [3. Details of the pharmaceutical combination for the treatment of Fabry disease].
  • the method for increasing the stability of the protein of the present invention includes a step of contacting the protein with an active site-specific chaperone (contact step).
  • Protein stability can be judged by whether or not a protein has an appropriate three-dimensional structure and has normal functionality.
  • the three-dimensional structure and functionality of a protein change depending on the presence or absence of interacting substances or the environmental conditions in which the protein exists, such as pH and temperature. Therefore, it can be said that the stability of the protein is higher as the three-dimensional structure change is less likely to occur and the functionality is less likely to decrease.
  • the high stability of the protein can be determined, for example, by examining the high activity of the protein itself, the change of the protein activity or the amount of protein over time, the maintenance of an appropriate three-dimensional structure, and the like.
  • the method for increasing the stability of a protein can be rephrased as a method for suppressing a decrease in enzyme activity, maintaining enzyme activity, or improving enzyme activity.
  • the contact between the protein and the active site-specific chaperone in the contacting step may be performed in vivo or in vitro.
  • the amount of the active site-specific chaperone to be brought into contact with the protein is an amount necessary for enhancing the stability of the protein, and is determined according to, for example, the amount of the protein to be contacted.
  • the concentration of the active site specific chaperone can be determined, for example, by calculating the IC 50 value of the specific chaperone for the enzyme.
  • the method for increasing the stability of a protein according to the present invention comprises 1) contacting the protein according to the present invention with an active site-specific chaperone according to the present invention (contacting step), and 2) contacting.
  • the measurement step is performed after the contact step and measures the protein stability after the contact step.
  • protein stability As a method for measuring protein stability, protein activity measurement, thermal shift assay, inspection scanning calorimeter, measurement of protein three-dimensional structure maintenance by circular dichroism, etc., and ELISA method, Western blotting, etc. Examples include measurement of the amount of protein.
  • whether the stability of the protein is enhanced is confirmed by comparing the activity or expression level of the protein before the contact step and the activity or expression level of the protein after the contact step. can do.
  • the analysis result of the active site-specific chaperone / protein interaction can be evaluated using techniques well known in the art, such as plasmon resonance, differential scanning calorimetry, circular dichroism, and the like.
  • the method of the present invention can be applied to a protein for administration to an individual in need thereof. That is, the method of the present invention can be used for an ⁇ -NAGA mutant as a replacement enzyme for enzyme replacement therapy, and can also improve the stability of the ⁇ -NAGA mutant in a living body.
  • the present invention provides a method for treating Fabry disease.
  • One embodiment of the method for treating Fabry disease of the present invention comprises administering to an individual an effective amount of a protein according to the present invention and an effective amount of an active site-specific chaperone according to the present invention against said protein. It is a method to do.
  • one aspect of the treatment method of the present invention is a method for simultaneously increasing the stability of ⁇ -NAGA mutant protein in enzyme replacement therapy using ⁇ -NAGA mutant protein.
  • the stability and activity of an ⁇ -NAGA mutant protein administered to an individual is enhanced by the active site-specific chaperone administered to the individual.
  • the treatment method of this embodiment is a combination therapy by a combination of enzyme replacement therapy and pharmacological chaperone therapy.
  • the active site-specific chaperone may be administered as a role as an adjunct to the ⁇ -NAGA mutant protein which is a supplementary enzyme.
  • Proteins and active site-specific chaperones are described in [1. The method described above in the section “Method for enhancing protein stability” is applied. The form of the composition is the following [3. Those described in the item of “Combination of pharmaceuticals for treating Fabry disease” can be applied.
  • the protein and the active site specific chaperone may be administered simultaneously or separately.
  • the protein and the active site-specific chaperone may be contained in separate compositions (hereinafter, the composition includes a preparation as a pharmaceutical composition for treating Fabry disease). May be contained in a single composition.
  • a plurality of types of proteins and / or active site-specific chaperones having different structures may be administered for both or one of the protein and the active site-specific chaperone.
  • the administration period is not particularly limited, and may be given continuously or intermittently. For example, in a period of 1 to several months, 1 to several years, or several years to several tens of years (for example, until death). Can be administered continuously or intermittently (eg, every 1-7 days or every 1-14 days).
  • the protein and active site specific chaperone may be administered simultaneously, and the active site specific chaperone is administered before or after protein administration. May be.
  • the active site-specific chaperone may be administered, for example, within 0 to 2 hours, 0 to 2 hours or 0 to 2 hours after protein administration. Good.
  • a plurality of proteins and / or active site-specific chaperones when administered, a plurality of types of proteins and / or active site-specific chaperones may be administered simultaneously or in combination.
  • the active site specific chaperone may be administered at different times.
  • the order of administration may be changed by changing the composition components to be administered, for example, a certain protein is administered for a certain period of time, and then a different protein having another structure is administered for a further period of time.
  • the composition of the active ingredient administered over a period of time may be varied in the desired cycle and order.
  • administration route The route of administration is intravenous, subcutaneous, intraarterial, intraperitoneal, eye drop, intramuscular, oral cavity, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradermal, intracranial, intrathecal, intraventricular, arachnoid membrane Lower, intracisternal, intraarticular, intrapulmonary, intranasal, transmucosal, percutaneous and via inhalation, or oral and parenteral.
  • parenteral administration such as intravenous, subcutaneous and intraperitoneal is preferable.
  • the chaperone and the protein may be administered by the same route, for example, intravenous injection, or may be administered by different routes.
  • the protein can be administered by intravenous infusion and the active site specific chaperone can be administered by different routes, such as oral administration.
  • parenteral methods such as intravenous infusion are usually employed.
  • the preparations that can be used for various methods such as parenteral methods include excipients, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, and buffering agents that are commonly used in pharmaceutical production.
  • Preservatives, solubilizers, preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, tonicity agents and the like can be appropriately selected and used, and can be prepared by conventional methods.
  • the form of the pharmaceutical composition is not limited, but in the case of a replenishing enzyme drug, an intravenous injection (including infusion) is usually adopted, for example, a unit dose ampoule or a multi-dose container state Etc. may be provided.
  • Administration methods include subcutaneous, intracutaneous, intravenous, intramuscular or intraperitoneal direct injection, intranasal, buccal, pulmonary, intravaginal or rectal mucosal spray, oral administration and blood vessels It is performed based on a known method such as internal administration. For example, bolus injection of the formulation.
  • parenteral delivery systems used for administration include ethylene-vinyl acetate copolymer particles, osmotic pumps, implantable infusion systems, pump delivery, encapsulated cell delivery, liposome delivery, needle delivery injection, needleless injection, Nebulizers, aerosol nebulizers, electroporation and transdermal patches.
  • the dose of the protein of the present invention and the active site-specific chaperone is determined in consideration of the compounding ratio of the active ingredient in the preparation, and the administration route (patient) age, weight, type of disease, medical condition, administration route In consideration of the number of administrations, the administration period, etc., it can be appropriately set over a wide range.
  • the administration frequency is preferably about once every 2 to 4 weeks, and the dose (/ once) is, for example,
  • the amount of the active ingredient, such as the protein of the present invention (recombinant enzyme) preferably about 0.1 to 10 mg / kg, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg, relative to the body weight of the patient. More preferably, it is about 0.2 to 1 mg / kg.
  • the individual to be administered includes all animals, but vertebrates are preferable, and mammals are more preferable.
  • mammalian subjects include domestic animals (chicken, pigs, horses, goats, sheep, cows, etc.), pet animals (cats, dogs, hamsters, rabbits, guinea pigs, etc.) and laboratory animals (mouse).
  • Rodents such as rats, monkeys, etc.
  • humans are particularly preferable.
  • An exemplary individual is a patient with Fabry disease or is at risk of developing Fabry disease. Having the risk of developing Fabry disease is intended to have a high probability of onset compared to healthy individuals, although it has not yet occurred, for example, it does not develop clinical symptoms but ⁇ -galactosidase It includes having a genetic expression type such as having a gene defect.
  • the individual to be administered may be of any age, and the sex is not limited.
  • the individual has at least one clinical symptom of Fabry disease described above.
  • Another embodiment of the method for treating Fabry disease of the present invention comprises, in an individual, an effective amount of a gene encoding the protein according to the present invention, and an effective amount of the active site-specific chaperone according to the present invention against the protein. Administering.
  • a further aspect of the treatment method of the present invention is a method for enhancing the stability of an ⁇ -NAGA mutant protein expressed in vivo simultaneously with gene therapy using an ⁇ -NAGA mutant gene.
  • the Fabry disease treatment method of the present embodiment provides a combination therapy by a combination of the above-described gene therapy using the gene encoding the protein of the present invention and chaperone therapy with a chaperone compound.
  • Proteins and active site-specific chaperones are described in [1. The method described above in the section “Method for enhancing protein stability” is applied.
  • the form of a gene encoding a protein to be administered to an individual may be, for example, the form of a composition containing the gene itself, or the form of a vector in which the gene is incorporated so that it can be expressed, or the composition containing the vector It may be a form.
  • Suitable vectors for administration include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, retrovirus vectors and lentivirus vectors. It can administer efficiently by using these viral vectors.
  • a commercially available gene transfer kit (for example, product name: Adeno Express, manufactured by Clontech) can also be used.
  • a pharmaceutical composition containing a gene When a pharmaceutical composition containing a gene is used for administration, it is also possible to introduce the composition into a phospholipid vesicle such as a liposome and administer the vesicle.
  • the endoplasmic reticulum holding the gene of the present invention is introduced into a predetermined cell by the lipofection method. Then, the obtained cells are administered, for example, intravenously or intraarterially. It can also be administered locally to an organ affected by Fabry disease.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition is administered to an adult, it is preferably about 0.1 ⁇ g / kg to 1000 mg / kg per day, more preferably about 1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg relative to the weight of the patient. It is.
  • the administration route, administration method, administration mode, etc. of gene administration and active site-specific chaperone are the same as those described above [by enzyme replacement therapy using ⁇ -NAGA mutant protein as a supplementary enzyme and active site-specific chaperone.
  • the protein as the administration component can be replaced with a gene and applied as it is.
  • the present invention includes a protein according to the present invention having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, and an active site-specific chaperone according to the present invention.
  • a pharmaceutical combination for the treatment of Fabry disease is provided.
  • Proteins and active site-specific chaperones are described in [1. The method described above in the section “Method for enhancing protein stability” is applied.
  • the protein and the active site-specific chaperone compound may be in the form of a combination as separate substances for using these substances as a combination, and a single composition as a component in the same composition
  • the form contained in a thing may be sufficient.
  • the protein and the active site-specific chaperone compound may be in the form of separate compositions.
  • any form of the form contained in a single composition, and the form contained in a separate composition, the other component, dosage form, etc. which are contained in a composition are mentioned later [pharmaceutical composition for Fabry disease treatment. The thing of a thing] is applicable.
  • Active site-specific chaperone compounds as stability improvers to increase protein stability may be applied in the form of combinations as separate substances.
  • the combination can be suitably used in a method for enhancing the stability of the protein of the present invention and a method for treating Fabry disease.
  • a protein and an active site-specific chaperone compound are prepared as pharmaceuticals for treating Fabry disease to which respective pharmaceutical labels are attached, and a combination for using these pharmaceuticals in combination. The thing which was done is mentioned.
  • each drug label of the drug is used as a combination with each other's drug as a combination.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating Fabry disease comprising one or both of the protein of the present invention and an active site-specific chaperone.
  • the composition of the present invention is applied to the method for enhancing the stability of the protein of the present invention and the method for treating Fabry disease, as described above, the protein and the active site-specific chaperone are contained in a single composition. Or may be included in a separate composition.
  • composition containing both the protein and the active site-specific chaperone can be effectively used for the simultaneous administration of the protein and the active site-specific chaperone, for example, in the above-described treatment method.
  • each composition may contain the same component as other components, or may contain different components.
  • composition comprising the active site-specific chaperone compound of the present invention is a drug for treating Fabry disease. That is, in the invention, a drug for treating Fabry disease, which is used in combination with the protein of the present invention, and the drug for treating Fabry disease comprises the active site-specific chaperone compound of the present invention. Also provide.
  • the protein of the present invention and the active site-specific chaperone can exert various excellent effects on the treatment of Fabry disease, and these are used as pharmaceutical compositions for treating Fabry disease (Fabry disease therapeutic agent).
  • this invention provides the pharmaceutical composition for Fabry disease treatment containing the protein of this invention mentioned above.
  • the pharmaceutical composition is preferably in the form of a replenishment enzyme that can be used for enzyme replacement therapy.
  • the proportion of the protein of the present invention and the types and proportions of other components are determined according to known replenishment enzyme agents (particularly, replenishment enzymes for the treatment of Fabry disease). It can be appropriately set according to the preparation method of the drug.
  • the protein of the present invention (recombinant enzyme) as an active ingredient is excellent in blood stability and has a high uptake efficiency into cells of damaged organs. Enzyme supplementation effect similar to or higher than conventional ones can be obtained, and allergic side effects are extremely small, so that the physical, mental and economic burden on the patient can be greatly reduced.
  • the pharmaceutical composition for treating Fabry disease comprising the protein of the present invention and an active site-specific chaperone has a higher therapeutic effect than a conventional composition that does not contain an active site-specific chaperone. is there. Therefore, in the present invention, the pharmaceutical composition for treating Fabry disease suppresses the production of antibodies to the enzyme by repeated administration of recombinant ⁇ -GAL, which is a problem in conventional enzyme replacement therapy, and reduces adverse side reactions. And has the effect of maintaining the therapeutic effect and maintaining the in vivo stability after administration to an individual.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a gene encoding the protein of the present invention that can exert various excellent effects on the treatment of Fabry disease.
  • the form of the gene contained in the composition may be, for example, a form of the composition containing the gene itself, or a form in which the gene is incorporated into a vector so that the gene can be expressed.
  • the pharmaceutical composition is preferably in the form of a gene therapy drug that can be used for gene therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention enhances protein stability during storage and administration in vivo or during in vitro testing. Thereby, when applying this composition to the treatment for Fabry disease, the treatment effectiveness can be enhanced.
  • the pharmaceutical composition can contain other components besides the protein or gene of the present invention and the active site-specific chaperone.
  • the other components include various pharmaceutically acceptable components (such as various pharmaceutically acceptable carriers) required depending on the usage (form of use) of the pharmaceutical composition.
  • Other components can be appropriately contained as long as the effects exhibited by the protein of the present invention are not impaired.
  • the pharmaceutical composition may further contain substances such as a suitable solvent, carrier, excipient, adjuvant and the like.
  • a pharmaceutical preparation suitable for injection use it is preferably a sterile preparation and has fluidity to such an extent that it can be easily injected.
  • Carrier for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol and the like), and a suitable mixture thereof, and a solvent and dispersion medium containing vegetable oil may be used.
  • the proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size (in the case of dispersion) and by the use of surfactants.
  • the action of microorganisms can be prevented by various antibacterial and antifungal agents such as paraben, chlorobutanol, phenol, benzyl alcohol, sorbic acid and the like.
  • the pharmaceutical composition for treating Fabry disease may contain a pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients include citrate buffer, phosphate buffer, acetate buffer, bicarbonate buffer, etc .; amino acids, urea, alcohol, ascorbic acid, phospholipids; serum albumin, collagen, gelatin Proteins such as EDTA or EGTA, and salts such as sodium chloride; liposomes; polyvinylpyrrolidone; saccharides such as dextran, mannitol, sorbitol, glycerol; propylene glycol and polyethylene glycol (eg, PEG-4000, PEG-6000); glycerol; Glycine or other amino acids; and lipids.
  • Preferred nonionic surfactants include polysorbate 20, polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, octyl ⁇ -glucoside, octyl ⁇ -glucoside, Brij 35, Pluronic. ) And Tween 20.
  • filler examples include glycine, mannitol, albumin, dextran, lactose, microcrystalline cellulose, or calcium hydrogen phosphate.
  • solvent examples of the solvent of the pharmaceutical composition of the present invention include water and a buffer solution, and examples of the buffer solution include physiological saline, phosphate buffer solution, Ringer's solution and the like. Further, the solvent used in the composition may be a mixture of two or more of the above-mentioned solvents.
  • lubricants eg magnesium stearate, talc or silica
  • disintegrants eg corn starch, potato starch or sodium starch glycolate
  • binders eg pregelatinized starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropylmethylcellulose
  • a wetting agent for example, sodium lauryl sulfate
  • the concentration of the protein in the pharmaceutical composition for treating Fabry disease can be changed according to the purpose and application of use, and is not particularly limited, and can be, for example, 0.1 to 10 mg / mL.
  • the concentration of the active site-specific chaperone in the pharmaceutical composition for treating Fabry disease is changed according to the protein concentration and is not particularly limited, but can be, for example, 2 mg / mL or less.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be liquid, solid, semi-solid or semi-liquid. Further, it may be a lyophilized preparation. These dosage forms can be easily produced based on methods known to those skilled in the art. Examples include tablets, pills, powders, liquids, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, and injections, preferably oral dosage forms such as injections or tablets. . For example, a preparation for inhalation administration, a preparation for intranasal administration, and a preparation in the form of nasal drops may be used.
  • the method for enhancing the stability of the protein of the present invention has the excellent effect that the ⁇ -NAGA mutant protein that is effectively used for the treatment of Fabry disease can further enhance the stability and enhance the therapeutic effect.
  • the method for treating Fabry disease and the pharmaceutical composition for treating Fabry disease of the present invention can be effectively used for the treatment of Fabry disease.
  • the present invention includes any of the following aspects.
  • a pharmaceutical combination for treating Fabry disease comprising:
  • the protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a); Protein having ⁇ -galactosidase activity (c) An amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Containing protein (d) A protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a pharmaceutical combination for treating Fabry disease which is a compound selected from the group consisting of 2 .
  • the protein of (a) is a protein in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine.
  • the protein of (c) is a pharmaceutical combination for treating Fabry disease according to ⁇ 1>, wherein the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid and the 205th amino acid is substituted with leucine.
  • the pharmaceutical combination for treating Fabry disease according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the active site-specific chaperone is 1-deoxygalactonojirimycin (DGJ).
  • DGJ 1-deoxygalactonojirimycin
  • a stability improver for increasing protein stability The protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid;
  • B a protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a);
  • C a protein comprising an amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
  • D a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or added, and having ⁇
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a stability improver comprising a compound selected from the group consisting of: ⁇ 6>
  • a drug for treating Fabry disease A protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that SEQ ID NO: 2 And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is replaced with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid;
  • B a protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a);
  • C a protein comprising an amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
  • D a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or added, and having ⁇
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • An agent for treating Fabry disease comprising a compound selected from the group consisting of: ⁇ 7> A method for increasing protein stability, Contacting the protein with an active site-specific chaperone;
  • the protein is a protein having a mutation in the amino acid sequence of ⁇ -N-acetylgalactosaminidase and having ⁇ -galactosidase activity, which is one of the following proteins (a) to (d) (provided that And a protein containing an amino acid sequence in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence consisting of the 411st amino acid (b) comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a); Protein having ⁇ -galactosidase activity (c) An amino acid sequence in which the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid or aspartic acid and the 205th amino acid is replaced with leucine, valine or isoleucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 Containing protein (d) A protein having an ⁇ -galactosidase activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids except the amino acid at the substitution site in the amino acid sequence of (c) are deleted, substituted or
  • R 0 represents H, —OH, —SO 3 H, —SO 3 ⁇ , —COOH, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom.
  • a method for enhancing the stability of a protein which is a compound selected from the group consisting of 2 .
  • the protein of (a) is a protein in which the 188th amino acid is substituted with glutamic acid and the 191st amino acid is substituted with leucine.
  • the method according to ⁇ 7>, wherein the protein of (c) is such that the 202nd amino acid is substituted with glutamic acid and the 205th amino acid is substituted with leucine.
  • the active site-specific chaperone is a reversible competitive inhibitor of the protein.
  • DGJ 1-deoxygalactonojirimycin
  • the inhibitor candidate compound dissolved in nozide or purified water or DMSO was added to 0.8, 1, 400 ⁇ M and reacted at 37 ° C. for 30 minutes (total 50 ⁇ l). After completion of the reaction, 950 ⁇ l of 0.2 M glycine buffer (pH 10.7) was added to stop the reaction. The liberated 4-methylumbelliferone was measured using a Wallac 1420 ARVOMX Multilabel Counter at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm. The residual enzyme activity was calculated assuming that the enzyme activity value when purified water or DMSO was added instead of the inhibitor candidate compound was 100%.
  • DGJ dissolved in purified water or DMSO in 25 ng ⁇ -NAGA mutant and 4 mM 4-methylumbelliferyl ⁇ -D-galactopyranozide dissolved in 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 4.6) , GBS, N-C-DGJ, N-DGJ or N-HE-DGJ was added to a concentration of 0.1, 1, 10 ⁇ M and reacted at 37 ° C. for 30 minutes (total 50 ⁇ l). After completion of the reaction, 950 ⁇ l of 0.2M glycine buffer (pH 10.7) was added to stop the reaction.
  • FIG. 1 is a diagram showing inhibition of enzyme activity of ⁇ -NAGA mutant by DGJ.
  • DGJ and GBS had an effect of inhibiting the activity of ⁇ -NAGA mutant.
  • the liberated 4-methylumbelliferone was measured using a Wallac 1420 ARVOMX Multilabel Counter at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm. From this value, a Lineweaver-Burk plot was prepared, and the inhibition constant Ki was calculated from the slope of the plot corresponding to the inhibitor concentration.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of calculating the Lineweaver-Burk plot of the enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant by DGJ or GBS and the inhibition constant Ki from this plot.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of a thermal stability test of ⁇ -NAGA mutant inhibitory activity for DGJ.
  • the thermal stability of the ⁇ -NAGA mutant was improved by the addition of DGJ in both acidic conditions at pH 5.2 and neutral conditions at pH 7.5. In particular, a higher thermal stability improvement was observed under acidic conditions.
  • Tm value was 2 ⁇ g of ⁇ -NAGA mutant, DGJ or GBS at various concentrations (1, 10, 50, 100 ⁇ M), 25 mM sodium phosphate buffer solution added with 5 mM SYPRO® Orange (Invitrogen) and 150 mM NaCl. (PH 7.4) or 25 mM ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium acetate buffer solution (pH 5.2) added with 150 mM NaCl was added (total 20 ⁇ L). The sample was raised from 25 ° C. to 95 ° C. at 0.5 ° C./10 seconds using qRT-PCR (Bio Rad), and the fluorescence intensity was measured over time. And Tm value was computed using CFR Manager software. The results are shown in FIG. FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of Tm values under acidic and neutral conditions for DGJ and GBS.
  • the medium was replaced with F-10 medium containing 10% fetal bovine serum and antibiotics supplemented with 1 ⁇ g / mL ⁇ -NAGA mutant and various concentrations (0, 1, 10, 100, 500 ⁇ M) of DGJ. Incubate for hours. The cells were washed with PBS three times, and then treated with trypsin to collect the cells. 20 mM MES (pH 6.0) to which Complete Mini (Roche) was added was added to the collected cells and sonicated. The homogenate was centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm, and the supernatant was used as a sample for enzyme activity measurement, protein quantification, and Western blot.
  • F-10 medium 10% fetal bovine serum and antibiotics supplemented with 1 ⁇ g / mL ⁇ -NAGA mutant and various concentrations (0, 1, 10, 100, 500 ⁇ M) of DGJ. Incubate for hours. The cells were washed with PBS three times, and then treated with tryps
  • the cultured fibroblasts derived from a Fabry disease patient were cultured at 37 ° C. in an environment of 5% carbon dioxide using F-10 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotics.
  • F-10 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotics.
  • concentration dependence of DGJ on the uptake efficiency of ⁇ -NAGA mutant was analyzed. Cells were seeded in 12 well plates at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. Then, the medium was replaced with a medium supplemented with 1 ⁇ g / mL ⁇ -NAGA mutant and various concentrations (0, 1, 10, 100 ⁇ M) of DGJ, and cultured for 24 hours.
  • the cells were washed with PBS three times, and then treated with trypsin to collect the cells. 20 mM MES (pH 6.0) to which Complete Mini (Roche) was added was added to the collected cells and sonicated. The homogenate was centrifuged at 4 ° C. and 12,000 rpm, and the supernatant was used as a sample for enzyme activity measurement, protein quantification, and Western blot.
  • the liberated 4-methylumbelliferone was then measured using a Wallac 1420 ARVO MX Multilabel Counter (Perkin Elmer, Waltham, MA) at an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 460 nm.
  • the PVDF membrane is blocked with a blocking buffer (Tris-HCl buffered saline containing 5% skim milk and 0.1% Tween 20 (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)), 100 mM sodium chloride) for 60 minutes.
  • a blocking buffer Tris-HCl buffered saline containing 5% skim milk and 0.1% Tween 20 (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)
  • an anti-human NAGA rabbit polyclonal antibody primary antibody
  • the PVDF membrane was washed three times for 5 minutes with Tris-HCl buffered saline containing 0.1% Tween 20, and then diluted with a blocking buffer 5000 times as anti-rabbit IgG.
  • HRP-labeled secondary antibody A goat Peroxidase-labeled antibody (HRP-labeled secondary antibody) (GE Healthcare) was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the PVDF membrane after the reaction with the secondary antibody was washed three times for 5 minutes with Tris-HCl buffered saline containing 0.1% Tween 20, and then added with EzWestLumi plus coloring reagent (ATTO). For 1 minute. Thereafter, luminescence was detected using ImageQuant (GE Healthcare).
  • FIG. 5 shows the enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant when the ⁇ -NAGA mutant and each concentration of DGJ were added simultaneously to cultured fibroblasts derived from Fabry disease model mice.
  • FIG. 6 is a diagram showing the enzyme activity and the amount of enzyme uptake of the ⁇ -NAGA mutant when the ⁇ -NAGA mutant and each concentration of DGJ were simultaneously added to cultured fibroblasts derived from a Fabry disease patient.
  • m. NAGA represents an ⁇ -NAGA mutant
  • Wild represents a cultured fibroblast derived from a healthy subject
  • Fabry represents a cultured fibroblast derived from a Fabry disease patient.
  • the enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant when the ⁇ -NAGA mutant and each concentration of DGJ were simultaneously added to a cultured fibroblast derived from a Fabry disease patient is shown in FIG. 6 (a).
  • the amount of enzyme taken in is shown in FIG. 6 (b).
  • FIG. 7 is a view showing temporal changes in enzyme activity and enzyme uptake amount of ⁇ -NAGA mutant when ⁇ -NAGA mutant and DGJ were added simultaneously to cultured fibroblasts derived from a Fabry disease patient.
  • m. NAGA represents an ⁇ -NAGA mutant
  • FIG. 7 (a) shows changes over time in the enzyme activity of the ⁇ -NAGA mutant and DGJ simultaneously added to cultured fibroblasts derived from Fabry disease patients. The change with time is shown in FIG.
  • the present invention can be used for the treatment of Fabry disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用を提供する。本発明は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質と、活性部位特異的シャペロンと、を含む、ファブリー病治療用医薬の組合せ物に関する。

Description

ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用
　本発明はファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用に関する。
　ファブリー病は、リソソーム性加水分解酵素であるα－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）の活性が顕著に低下することで基質であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ－Ｇｂ３）が蓄積するＸ染色体性の遺伝病である。現在、ファブリー病の治療法として、組換えα－ＧＬＡ（アガルシダーゼ・アルファとアガルシダーゼ・ベータ）を投与する酵素補充療法が導入されている。
　また、欧州ではα－ＧＡＬの基質アナログである１－デオキシガラクトノジリマイシン（１－ｄｅｏｘｙ ｇａｌａｃｔｏｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ、別名Ｍｉｇａｌｓｔａｔ）を用いたシャペロン療法が承認されている。また近年、臨床研究で、組換えα－ＧＡＬと１－デオキシガラクトノジリマイシンとをファブリー病患者に同時に投与することが行われ、投与された組換えα－ＧＡＬが１－デオキシガラクトノジリマイシンにより血中で安定化されることで、組換えα－ＧＡＬの治療効果が増強されたことが報告されている（特許文献１～３及び非特許文献１）。
　一方、酵素補充療法は、欠損した組換えα－ＧＡＬを投与するため、組換えα－ＧＡＬに対する抗体が産生され、治療効果を減弱することが報告されている（非特許文献２）。
　本願発明者らは、これまでに、ファブリー病患者に投与しても抗体が産生されにくいことが期待される酵素製剤としてα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（α－ＮＡＧＡ）変異体を開発している（特許文献４、５及び非特許文献３）。α－ＮＡＧＡ変異体は、ＮＡＧＡの基質認識部位の２アミノ酸残基をα－ＧＡＬ様に換えることで、α－ＧＡＬ活性を獲得した酵素である。今までに、α－ＮＡＧＡ変異体をファブリー病モデルマウスに投与することで、各臓器に蓄積していたＧｂ３及びＬｙｓｏ－Ｇｂ３が分解されることを確認している（特許文献４、５及び非特許文献３）。
日本国公開特許公報「特開２０１２－１０７０２０号公報（２０１２年６月７日公開）」 日本国公開特許公報「特開２０１２－１０２１２８号公報（２０１２年５月３１日公開）」 日本国公表特許公報「特表２０１４－５２８９０１号公報（２０１０年１０月３０日公表）」 国際公開第２００７／０５８３８１号公報（２００７年５月２４日公開）（特許第４３６８９２５号） 国際公開第２００８／１４３３５４号公報（２００８年１１月２７日公開）（特許第５５０７２４２号）
Warnock D et al., PLoS One. 2015,10:e0134341. Lenders M et al., J Am Soc Nephrol. 2016，27:256-64. Tajima Y et al., Am J Hum Genet. 2009, 85:569-80.
　組換え酵素は不安定なため、投与された酵素製剤は血液中や細胞中で徐々に変性してしまう。また、組換えα－ＧＡＬの繰り返し投与により、酵素に対する抗体が作られ、有害な副反応が生じたり、酵素の治療効果が減弱することがある。したがって、より安定かつ治療効果の高い酵素製剤が求められる。
　本願発明者らは、α－ＮＡＧＡ変異体と同時投与することでα－ＮＡＧＡ変異体の安定性及びファブリー病治療効果を増強する化合物を探索した。そして、α－ＮＡＧＡ変異体とある種類の化合物とを接触させることでα－ＮＡＧＡ変異体の安定性が増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質と、
　活性部位特異的シャペロンと、
を含む、ファブリー病治療用医薬の組合せ物であって、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、ファブリー病治療用医薬の組合せ物。
＜２＞　タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤であって、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　前記安定性向上剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
からなる群から選択される化合物を含む、安定性向上剤。
＜３＞　ファブリー病治療用薬剤であって、
　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）と併用されるものであり、
　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　前記ファブリー病治療用薬剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
からなる群から選択される化合物を含む、ファブリー病治療用薬剤。
＜４＞　タンパク質の安定性を高める方法であって、
　前記タンパク質を活性部位特異的シャペロンと接触させる工程を包含し、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、タンパク質の安定性を高める方法。
　本発明は、α－ＮＡＧＡ変異体ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用を提供する。本発明は、ファブリー病の治療に有効に用いることができる。
ＤＧＪ又はＧＢＳによるα－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の阻害を示す図である。 ＤＧＪ又はＧＢＳによるα－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔ、及びこのプロットからの阻害定数Ｋｉの算出結果を示す図である。 ＤＧＪについてα－ＮＡＧＡ変異体阻害活性の熱安定性試験の結果を示す図である。 ＤＧＪ及びＧＢＳについての、酸性及び中性条件下でのＴｍ値の測定結果を示した図である。 ファブリー病モデルマウス由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性を示す図である。 ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性及び酵素の取り込み量を示す図である。ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性を図６の（ａ）に示し、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素の取り込み量を図６の（ｂ）に示す。 ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪの同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性及び酵素の取り込み量の経時的変化を示す図である。ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪの同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の経時的変化を図７の（ａ）に示し、酵素の取り込み量の経時的変化を図７の（ｂ）に示す。
　〔用語の説明〕
　ファブリー病とは、ヒト細胞内小器官のひとつであるリソソームに存在する酵素のうち、「α－ガラクトシダーゼ」という酵素の活性低下もしくは欠損が原因となり、その生体内基質であるグロボトリアオシルセラミド（セラミドトリヘキソシドとも言う）という糖脂質が分解されずに体内（例えば、血管、皮膚、角膜、神経、腎臓、心臓等）に蓄積することによって生じる、糖脂質代謝異常性疾患である。
　α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子はＸ染色体上にあるため、この疾患はＸ染色体性の遺伝型式をとる。そのため、本症では、主にヘミ接合体の男性において明確な臨床像がみられる。典型的な臨床経過をとる「古典型ファブリー病」は、約４万人の男児に１人の割合で発生すると考えられており、少年期や青年期に、手足の痛み（四肢疼痛）、低汗症、被角血管腫、角膜混濁等の症状がみられ、それが進行して、中年期以後に腎不全、心不全、脳血管障害等の全身の臓器障害を生じ、これが死因となる。また、「古典型ファブリー病」のような典型的な臨床経過をとらず、発症が遅く比較的緩やかな経過を示すものとして、「遅発型ファブリー病」も存在し、このタイプの患者においては、僅かながらα－ガラクトシダーゼの残存活性が認められる。遅発型ファブリー病としては、例えば「心ファブリー病」が知られており、前記糖脂質の蓄積が主に心臓で生じ、それにより心臓肥大が発症して心不全や不整脈等の障害を生じる。一方、ヘテロ接合体のファブリー病女性患者では、Ｘ染色体の特性により、その臨床像としては様々な形がみられ、ヘミ接合体の男性と変わらない重症のものからほとんど無症状のものまで存在し得る。しかし、最近の調査により、ヘテロ接合体のファブリー病女性患者は、高年齢になると、そのほとんどが何らかの症状を示すことが明らかになり、これらを「保因者」としてではなく「患者」として扱うべきであるとの見方もある。
　「酵素補充療法」という用語は、精製酵素を、このような酵素が欠乏している個体に導入することを指す。投与される酵素は、天然源から、又は組換え発現によって得ることができる。またこの用語は、他の方法で精製酵素の投与を必要としているかその利益を受けている個体、例えば、タンパク質の不足に苦しんでいる個体における精製酵素の導入も指す。導入される酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素であっても、あるいは単離された組織もしくは流体（例えば、胎盤又は動物の乳など）から、又は植物から精製された酵素であってもよい。
　本明細書で使用される場合、「活性部位特異的シャペロン」又は「薬理学的シャペロン」という用語は、タンパク質の活性部位と特異的に可逆的相互作用を起こして安定な分子立体配座の形成を高める、任意の分子を指し、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などを含むあらゆる分子を意図している。この用語は、内因性のシャペロン（例えばＢｉＰ）、又は非-特異的な化学的シャペロン（例えばグリセロール、ＤＭＳＯ又は重水素置換水）などの、様々なタンパク質に対して非-特異的なシャペロンであることが明らかにされている薬剤を意味しない。
　本明細書で使用される場合、「活性部位」という用語は、いくらかの特異的な生物活性を有するタンパク質の領域を指す。例えば、基質又は他の結合パートナーと結合して、化学結合の作製及び破壊に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。本発明における活性部位は、酵素の触媒部位、抗体の抗原結合部位、受容体のリガンド結合ドメイン、制御因子の結合ドメイン、又は分泌タンパク質の受容体結合ドメインを包含することができる。また活性部位は、トランス活性化、タンパク質－タンパク質相互作用、又は転写因子及び制御因子のＤＮＡ結合ドメインも包含することができる。
　本発明において「治療」とは、対象疾患の症状を完治又は軽減させること、対象疾患の症状の悪化を抑制すること、対象疾患の発症を抑制すること、又は遅延させることを含む。すなわち、個体が対象疾患を発症していない場合の「予防」を含む。
　（α－ＮＡＧＡ変異体に関する用語の説明）
　本明細書においては、特に言及した場合を除き、以下のように用語の定義をするものとする。
　「α－ガラクトシダーゼ」及び「α－ＧＡＬ」とは、いずれも、「ヒトα－ガラクトシダーゼＡ」を意味する。「α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ」及び「α－ＮＡＧＡ」は、いずれも、「ヒトα－ガラクトシダーゼＢ」、すなわち「ヒトα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ」を意味する。「ｗｔ」とは、野生型（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）を意味する。「Ｍ６Ｐ」とは、「マンノース－６－リン酸」を意味する。「α－ＧＡＬ活性」とは、後述するα－ＧＡＬの基質を加水分解し得る活性（後述の反応式（１）参照）を意味し、α－ＧＡＬタンパク質（野生型α－ＧＡＬ）が有する活性という意味に限定されるものではない。「α－ＮＡＧＡ活性」とは、後述するα－ＮＡＧＡの基質を加水分解し得る活性（後述の反応式（２）参照）を意味し、α－ＮＡＧＡタンパク質（野生型α－ＮＡＧＡ）が有する活性という意味に限定されるものではない。「α－ＧＡＬ活性を獲得した」とは、基質結合部位において、α－ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα－ＧＡＬの基質との結合反応性が相対的に高くなったことを意味する。「α－ＧＡＬの基質特異性を有する」とは、活性部位の構造（特に、基質の結合反応性に重要な役割を果たすアミノ酸残基の位置及び種類）が野生型α－ＧＡＬのそれと同じであることを意味する。
　「第１８８番」及び「第１９１番」とは、野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）からみた位置（当該アミノ酸配列のＮ末端のアミノ酸残基を第１番としてＣ末端側方向へ数えたときの位置）を示す。
　「α－ＮＡＧＡ変異体」とは、基本的には、野生型α－ＮＡＧＡの変異体を全て含む意味であり、特定の変異体（アミノ酸変異体）に限定はされるものではないが、本明細書においては、野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）のうち第１８８番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第１９１番目のアラニンがロイシンに置換された変異型タンパク質（すなわち「α－ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」と表記される）を、α－ＮＡＧＡ変異体と称して（定義づけて）、説明している場合がある。
　「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ」とは、通常、野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチド部分（配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目～第１７番目のアミノ酸からなるペプチド部分）が、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分（配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目～第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分）に置換されたタンパク質を意味する。ここで、当該シグナルペプチド部分とは、一般に、タンパク質が細胞内で発現した後、細胞外に分泌された際には、既に除かれているものであるが、本発明においては、便宜上、細胞外に分泌された後のものに対しても、「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ」と称することがある。
　「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ変異体」及び「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」とは、通常、α－ＮＡＧＡ変異体のシグナルペプチド部分（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目～第１７番目のアミノ酸からなるペプチド部分）が、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分（配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうちの第１番目～第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分）に置換されたタンパク質を意味する。ここで、当該シグナルペプチド部分とは、一般に、タンパク質が細胞内で発現した後、細胞外に分泌された際には、既に除かれているものであるが、本発明においては、便宜上、細胞外に分泌された後のものに対しても、「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ変異体」又は「α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ）」と称することがある。
　（配列表の説明）
　本明細書に記載の配列番号１～１０に示される塩基配列及びアミノ酸配列が、どのような酵素タンパク質に関する配列であるかについて、下記表Ａに示す。なお、表Ａ中、「本体」とは、タンパク質のシグナルペプチド部分を除いた成熟タンパク質となる部分を意味する。また、「＋」の表記は、所定のシグナルペプチド部分と本体部分とが結合したものであることを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　〔１．タンパク質の安定性を高める方法〕
　本発明は、タンパク質の安定性を高める方法であって、前記タンパク質を活性部位特異的シャペロンと接触させる工程を包含し、前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、タンパク質の安定性を高める方法を提供する。
　以下、まず、本発明の方法に適用されるタンパク質と活性部位特異的シャペロンとについて詳細に説明する。
　本願発明者らは、これまでに、ファブリー病の治療に用い得る新規かつ優れた高機能酵素としてα－ＮＡＧＡ変異体を創出することに成功した（特許文献３及び４）。
　本願発明は、このα－ＮＡＧＡ変異体の安定性を高めるための方法を新規に見出したものである。
　［タンパク質］
　本発明におけるタンパク質は、具体的には、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（α－ＮＡＧＡ）の変異体酵素である。
　これまでに、本願発明者らは、α－ＧＡＬ以外の酵素をファブリー病治療用の補充用酵素として利用することができないか検討し、α－ＧＡＬと同様にリソソーム酵素であり（すなわち細胞内での局在性が同じであり）、かつα－ＧＡＬと全体の立体構造は酷似しているが基質特異性の点では異なる、「α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（α－ＮＡＧＡ）」に着目した。
　α－ＮＡＧＡは、活性部位のうち基質結合部位の一部の構造においてα－ＧＡＬと異なっているが、その他の部分については、触媒部位も含め、構造面及び性質面のいずれにおいてもα－ＧＡＬと非常によく似ているという特性を有する酵素である。そのため、α－ＮＡＧＡの触媒反応機構は、反応基質及び反応生成物の種類等において、α－ＧＡＬの触媒反応機構と非常に類似している。
　そこで本発明者は、前述の通りα－ＮＡＧＡに着目し、このα－ＮＡＧＡに遺伝子操作を加えて活性部位（特に基質結合部位）の構造を変化させ、α－ガラクトシダーゼ活性を有するようにα－ＮＡＧＡの基質特異性を転換すれば（例えばα－ＮＡＧＡの基質認識に関係するアミノ酸残基のうち、鍵となるものをα－ＮＡＧＡタイプからα－ＧＡＬタイプのものに置換すれば）、ファブリー病の治療に用い得る新規かつ優れた高機能酵素を創出できることを見出した（特許文献４及び５）。
　詳しくは、本発明のタンパク質は、以下の（１ａ）のタンパク質、又は（１ｂ）のタンパク質であり、好ましくは以下の（１ｃ）のタンパク質である。
（１ａ）野生型α－ＮＡＧＡの活性部位（特に基質結合部位）の構造を変化させることによりα－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）活性を獲得したタンパク質、好ましくはα－ＧＡＬの基質特異性を有するタンパク質。
（１ｂ）シグナルペプチドを含むものである上記（１ａ）のタンパク質。ここで、シグナルペプチドの種類は特に限定はされず、野生型α－ＮＡＧＡ由来のシグナルペプチドであってもよいし、他のタンパク質由来のものであってもよい。
（１ｃ）シグナルペプチドが野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドである上記（１ｂ）のタンパク質。
　ここで、「α－ＧＡＬ活性を獲得した」とは、前述の通り、α－ＮＡＧＡの基質結合部位において、α－ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα－ＧＡＬの基質との結合反応性が相対的に高くなったことを意味する。従って、上述した構造変化としては、α－ＮＡＧＡの基質との結合を完全に不可能にする構造変化には限定されず、本来α－ＧＡＬの基質との結合反応性よりもα－ＮＡＧＡの基質との結合反応性が相対的に有意に高かったのを、逆にα－ＧＡＬの基質との結合反応性が有意に高くなるようにする構造変化も含む。また「α－ＧＡＬの基質特異性を有する」とは、前述の通り、活性部位の構造（特に、基質の結合反応性に重要な役割を果たすアミノ酸残基の位置及び種類）がα－ＧＡＬと同じであることを意味する。
　本発明において、α－ＧＡＬの基質とは、非還元末端にα結合したガラクトース残基を持つグロボトリアオシルセラミド（セラミドトリヘキソシド（ＣＴＨ））等の糖脂質などの天然化合物や、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトシドなどの合成化合物を意味する。また、α－ＮＡＧＡの基質とは、非還元末端にα結合したＮ－アセチルガラクトサミン残基を持つオリゴ糖、糖タンパク質及び糖脂質などの天然化合物や、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミニドなどの合成化合物を意味する。）
　ここで、野生型α－ＧＡＬの触媒反応を下記反応式（１）に示し、野生型α－ＮＡＧＡの触媒反応を下記反応式（２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（反応式（１）中、Ｒ１は、基質が天然化合物の場合は「糖複合体由来の基」を表し、基質が合成化合物の場合は「４－メチルウンベリフェリル基」を表す。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（反応式（２）中、Ｒ２は、基質が天然化合物の場合は「糖複合体由来の基」を表し、基質が合成化合物の場合は「４－メチルウンベリフェリル基」を表す。）
　本発明のタンパク質としては、例えば、以下の（２ａ）又は（２ｂ）のアミノ酸配列からなり、かつα－ＧＡＬ活性を有するタンパク質が好ましく挙げられる。
（２ａ）野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列における第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸のうちの少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、好ましくは第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸がいずれも他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列。
（２ｂ）上記（２ａ）のアミノ酸配列のうち第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
　なお、野生型α－ＮＡＧＡ（ホモ二量体）のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２）及び当該配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋには「ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｍｂｅｒ：ＮＭ＿０００２６２」として公表されており、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／から取得可能）には「ｅｎｔｒｙ　ｎａｍｅ：ＮＡＧＡＢ＿ＨＵＭＡＮ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１７０５０」として登録されている。また野生型α－ＧＡＬ（ホモ二量体）のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号１０）及び当該配列をコードする塩基配列（配列番号９）の情報も同様に、例えばＧｅｎＢａｎｋには「ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿０００１６０」として公表されており、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／から取得可能）には「ｅｎｔｒｙｎａｍｅ：ＡＧＡＬ＿ＨＵＭＡＮ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０６２８０」として登録されている。
　ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個～１０個程度、好ましくは１個～５個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましい。
　また、上記「欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質」は、α－ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要であるため、例えば、α－ＧＡＬの基質中のα－ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられる第２８番目～第３１番目、第７７番目～第８１番目、第１１７番目～第１２７番目、第１５０番目～第１５８番目、第１９２番目、第２０９番目～第２２０番目及び第２４２番目～第２５４番目のアミノ酸（特に、触媒部位である第１５６番目及び第２１７番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））、ホモ二量体の形成に重要と考えられる第４５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３５０番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、並びに、Ｎ型糖鎖結合部位である第１２４番目、第１７７番目、第２０１番目、第３５９番目及び第３８５番目のアミノ酸（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））などの全部又は一部（好ましくは全部）は、野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。
　上記他のアミノ酸としては、第１８８番目のアミノ酸残基に関しては、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）以外であれば特に限定はされないが、例えば、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）等を好ましく挙げることができ、グルタミン酸がより好ましい。同様に、第１９１番目のアミノ酸残基に関しては、アラニン（Ａｌａ：Ａ）以外であれば特に限定はされないが、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅ：Ｍ）等を好ましく挙げることができ、ロイシンがより好ましい。中でも、上記他のアミノ酸として、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、かつ、第１９１番目のアミノ酸がロイシンであることが特に好ましい。なお、上記置換後のアミノ酸は、他の置換されていないアミノ酸からなる構造に実質的に影響を及ぼさないものであることが好ましく、この点でも、第１８８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸とすること、第１９１番目のアミノ酸残基をロイシンとすることが、特に好ましい置換態様である。
　基質結合部位に存在する第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸を、それぞれ上記のように置換することにより、次のような効果が得られる。すなわち、第１８８番目のアミノ酸残基に関しては、α－ＮＡＧＡの基質中のＮ－アセチル基（特に酸素原子）との相互作用を無くし、かつα－ＧＡＬの基質中のヒドロキシル基との結合作用を生じさせることができ、第１９１番目のアミノ酸残基に関しては、α－ＮＡＧＡの基質中のＮ－アセチル基（特にメチル基）との相互作用を無くし、かつ当該基質の結合空間（特にＮ－アセチル基の入り込む空間）を制限することができる。以上の結果、上記アミノ酸置換後の組換え酵素（組換えタンパク質）は、α－ＮＡＧＡの基質との結合反応性よりもα－ＧＡＬの基質との結合反応性の方が高いものとなり、α－ＮＡＧＡ活性と比較して有意に高いα－ＧＡＬ活性を有する酵素となり得る。少なくとも、第１８８番目のアミノ酸（セリン）がグルタミン酸に置換され且つ第１９１番目のアミノ酸（アラニン）がロイシンに置換されたアミノ酸配列を有する組換え酵素は、上記効果が十分に得られる点で特に好ましい。
　本発明のタンパク質はまた、以下の（３ａ）又は（３ｂ）のタンパク質であることが好ましい。
（３ａ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列
（３ｂ）上記（３ａ）の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、野生型α－ＮＡＧＡを構成する４１１個のアミノ酸からなるアミノ酸配列である。
　上記（３ａ）のタンパク質は、詳しくは、この配列番号２に示されるアミノ酸配列において上記（ｉ）～（ｉｉｉ）に記載のように置換されたアミノ酸配列のうち、野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチドを構成する第１番目～第１７番目のアミノ酸を除いた、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質である。前述したように、第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸残基はいずれも基質結合部位を構成するアミノ酸の一つである。
　ここで、上記第１８番目～第４１１番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列としては、例えば、当該第１８番目～第４１１番目のアミノ酸配列のＮ末端に、各種シグナルペプチドが結合したアミノ酸配列などが好ましく挙げられる。当該シグナルペプチドとしては、障害臓器の細胞膜を通過させ得るものであればよく、限定はされないが、例えば、野生型α－ＮＡＧＡ及び野生型α－ＧＡＬ等の各種リソソーム酵素のシグナルペプチド並びにプレプロトリプシン等の分泌酵素のシグナルペプチドが好ましく、より好ましくは野生型α－ＮＡＧＡ及び野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドであり、さらに好ましくは野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドである。なお、野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチドは、上述の通り、配列番号２に示される野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列のうち第１番目～第１７番目のアミノ酸からなるペプチドであり、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドは、配列番号１０に示される野生型α－ＧＡＬのアミノ酸配列のうち第１番目～第３１番目のアミノ酸からなるペプチドである。また、プレプロトリプシンのシグナルペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好ましい。
　また、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸又はアスパラギン酸である場合のタンパク質が好ましく挙げられる。同様に、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである場合のタンパク質も好ましく挙げられる。
　さらに、上記（３ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸」がロイシンである場合のタンパク質が、特に好ましく挙げられる。当該タンパク質としては、例えば、野生型α－ＮＡＧＡのアミノ酸配列（配列番号２）のうち第１８８番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第１９１番目のアラニンがロイシンに置換されたタンパク質（α－ＮＡＧＡ（Ｓ１８８Ｅ／Ａ１９１Ｌ））が好ましく挙げられる（配列番号４参照）。なお、アミノ酸のアルファベット表記は、一般に、３文字（例えば「Ｓｅｒ」）又は１文字（例えば「Ｓ」）で表し、Ｎ末端からのアミノ酸位置を示す数字（例えば「１８８」）の前に表示したアルファベットは置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。従って、例えば第１８８番目のＳｅｒをＧｌｕに置換した場合は「Ｓ１８８Ｅ」と表示する（以下同様）。
　上記（３ｂ）のタンパク質は、上記（３ａ）のタンパク質に含まれる上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個～１０個程度、好ましくは１個～５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ＧＡＬ活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、「前記置換部位」とは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する３９４個のアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１８８番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）、並びに、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１９１番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）を意味する。より具体的には、前者のアミノ酸残基は、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列における第１７１番目のアミノ酸残基を意味し、後者のアミノ酸残基は、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列における第１７４番目のアミノ酸残基を意味する。
　なお、上記（３ｂ）のタンパク質は、α－ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要である。そのため、例えば、α－ＧＡＬの基質中のα－ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基は、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第２８番目～第３１番目、第７７番目～第８１番目、第１１７番目～第１２７番目、第１５０番目～第１５８番目、第１９２番目、第２０９番目～第２２０番目及び第２４２番目～第２５４番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（特に、触媒部位である第１５６番目及び第２１７番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））が好ましく挙げられる。
　同様に、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第４５番目及び第３５０番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（具体的には、第４５番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３５０番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ））が好ましく挙げられる。
　さらに、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列における第１２４番目、第１７７番目、第２０１番目、第３５９番目及び第３８５番目のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸残基（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））が好ましく挙げられる。本発明のタンパク質はさらに、以下の（４ａ）又は（４ｂ）のタンパク質であることが好ましい。
（４ａ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がアラニン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
（４ｂ）上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　配列番号６に示されるアミノ酸配列は、野生型α－ＮＡＧＡを構成する４１１個のアミノ酸において、シグナルペプチド部分である第１番目～第１７番目のアミノ酸が野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分に変換されたアミノ酸配列（計４２５アミノ酸）であり、いわゆる融合タンパク質である。ここで、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分は、前述した通り、配列番号１０に示される野生型α－ＧＡＬを構成するアミノ酸配列のうちの第１番目～第３１番目のアミノ酸からなるペプチド部分である。
　上記（４ａ）のタンパク質を構成するアミノ酸配列において、第１８８番目及び第１９１番目のアミノ酸残基はいずれも基質結合部位を構成するアミノ酸の一つである。上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質のうち、上記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を含むタンパク質が特に好ましい。
　また、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸又はアスパラギン酸である場合のタンパク質が好ましく挙げられる。同様に、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つである場合のタンパク質も好ましく挙げられる。
　さらに、上記（４ａ）のタンパク質としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸」がグルタミン酸であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸」がロイシンである場合のタンパク質が、特に好ましく挙げられる。当該タンパク質としては、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列のうち第２０２番目のセリンがグルタミン酸に置換され、かつ、第２０５番目のアラニンがロイシンに置換されたタンパク質（α－ＧＡＬシグナルペプチド融合α－ＮＡＧＡ（Ｓ２０２Ｅ／Ａ２０５Ｌ））が好ましく挙げられる。
　上記（４ｂ）のタンパク質は、上記（４ａ）のタンパク質に含まれる上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く、１個又は数個（例えば１個～１０個程度、好ましくは１個～５個程度）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ＧＡＬ活性を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、「前記置換部位」とは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第２０２番目のアミノ酸残基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）並びに第２０５番目のアミノ酸残基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のアミノ酸配列に限る）を意味する。
　なお、上記（４ｂ）のタンパク質は、α－ＧＡＬ活性を安定して発揮し得るタンパク質であることが重要である。そのため、例えば、α－ＧＡＬの基質中のα－ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基は、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第４２番目～第４５番目、第９１番目～第９５番目、第１３１番目～第１４１番目、第１６４番目～第１７２番目、第２０６番目、第２２３番目～第２３４番目及び第２５６番目～第２６８番目のアミノ酸残基（特に、触媒部位である第１７０番目及び第２３１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ））が好ましく挙げられる。
　同様に、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第５９番目及び第３６４番目のアミノ酸残基（具体的には、第５９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）及び第３６４番目のアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ））が好ましく挙げられる。
　さらに、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。当該アミノ酸残基としては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のアミノ酸配列を構成する４２５アミノ酸残基のうち、第１３８番目、第１９１番目、第２１５番目、第３７３番目及び第３９９番目のアミノ酸残基（いずれもアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ））が好ましく挙げられる。
　以上に述べた本発明のタンパク質について、α－ＧＡＬ活性は、例えば、ＣＨＯ細胞やヒト線維芽細胞等の哺乳類由来の細胞に目的タンパク質を発現させて採取し、当該タンパク質（酵素溶液）と、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトシド（α－Ｄ－ガラクトース及び４－メチルウンベリフェロン（蛍光基質）から得られる合成基質）とを混合して、酸性条件下で反応させた場合に、当該酵素溶液の単位量が単位時間当たりに遊離させ得る４－メチルウンベリフェロンの量を検出することにより測定することができる。
　なお、α－ＮＡＧＡ活性も、上記α－ＧＡＬ活性と同様に、目的タンパク質を発現させて採取し、当該タンパク質（酵素溶液）と、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミニド（α－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン及び４－メチルウンベリフェロン（蛍光基質）から得られる合成基質）とを混合して、酸性条件下で反応させた場合に、当該酵素溶液の単位量が単位時間当たりに遊離させ得る４－メチルウンベリフェロンの量を検出することにより測定することができる。
　上記α－ＧＡＬ活性及びα－ＮＡＧＡ活性の測定方法において、蛍光基質の検出には、公知の各種検出方法を採用できるが、例えば、蛍光光度計等により検出する方法が好ましい。また、目的タンパク質の発現は、公知の各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し発現させればよい。
　（組換え遺伝子）
　上述した本発明に係るタンパク質は、組換え遺伝子によってコードされる。
　本項目に記載の遺伝子は、上述した本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子である。本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、以下の（１ａ）又は（１ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子が好ましく挙げられる。なお、以下の（１ａ）及び（１ｂ）のＤＮＡは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であることが好ましいが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
（１ａ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５６２番目～第５６４番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目～第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５７１番目～第５７３番目の塩基「ｇｃｃ」がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目～第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号１に示される塩基配列において第５６２番目～第５６４番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第５７１番目～第５７３番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列のうち、第５２番目～第１，２３６番目の塩基からなる塩基配列
（１ｂ）上記（１ａ）の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
　本発明において「コドン」とは、転写後のＲＮＡ配列上の３塩基連鎖（トリプレット）に限らず、ＤＮＡ配列上の３塩基連鎖をも意味する。よって、ＤＮＡ配列上のコドンの表記は、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）を用いて行う。
　配列番号１に示される塩基配列は、野生型α－ＮＡＧＡをコードする１，２３６個の塩基からなる塩基配列である。
　上記（１ａ）のＤＮＡは、詳しくは、この配列番号１に示される塩基配列において上記（ｉ）～（ｉｉｉ）に記載のように塩基置換がなされた塩基配列のうち、野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチドをコードする第１番目～第５１番目の塩基を除いた、第５２番目～第１，２３６番目の塩基配列を含む塩基配列からなるＤＮＡである。
　ここで、上記第５２番目～第１，２３６番目の塩基配列を含む塩基配列としては、例えば、当該第５２番目～第１，２３６番目の塩基配列の５’側に、各種シグナルペプチドをコードする塩基配列（ポリヌクレオチド）が結合した塩基配列が好ましく挙げられる。当該シグナルペプチドとしては、障害臓器の細胞膜を通過させ得るものであればよく、限定はされないが、例えば、野生型α－ＮＡＧＡ及び野生型α－ＧＡＬ等の各種リソソーム酵素のシグナルペプチド、並びにプレプロトリプシン（ｐｒｅ ｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）等の分泌酵素のシグナルペプチドが好ましく、より好ましくは野生型α－ＮＡＧＡ及び野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドであり、さらに好ましくは野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドである。なお、野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１に示される野生型α－ＮＡＧＡの塩基配列のうち第１番目～第５１番目の塩基からなる塩基配列であり、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号９に示される野生型α－ＧＡＬの塩基配列のうち第１番目～第９３番目の塩基からなる塩基配列である。また、プレプロトリプシンのシグナルペプチドをコードする塩基配列は、配列番号１１に示される塩基配列である。
　上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡのうち、上記（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡが特に好ましい。また、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸又はアスパラギン酸のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。同様に、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡも好ましく挙げられる。ここで、上記の各アミノ酸のコドンを示す塩基（左端の塩基を５’側の塩基とする）については、グルタミン酸のコドンを示す塩基は「ｇａｇ」又は「ｇａａ」（好ましくは「ｇａｇ」）であり、アスパラギン酸のコドンを示す塩基は「ｇａｔ」又は「ｇａｃ」である。同様に、ロイシンのコドンを示す塩基は「ｃｔｃ」、「ｃｔｔ」、「ｃｔａ」又は「ｃｔｇ」（好ましくは「ｃｔｃ」）であり、バリンのコドンを示す塩基は「ｇｔｔ」、「ｇｔｃ」、「ｇｔａ」又は「ｇｔｇ」であり、イソロイシンのコドンを示す塩基は「ａｔｔ」、「ａｔｃ」又は「ａｔａ」であり、フェニルアラニンのコドンを示す塩基は「ｔｔｔ」又は「ｔｔｃ」であり、メチオニンのコドンを示す塩基は「ａｔｇ」である。なお、セリンのコドンを示す塩基としては、前記「ａｇｃ」以外に「ａｇｔ」があり、アラニンのコドンを示す塩基としては、前記「ｇｃｃ」以外に「ｇｃｔ」、「ｇｃａ」及び「ｇｃｇ」がある。
　さらに、上記（１ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸のコドンを示す塩基であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシンのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが、特に好ましく挙げられる。当該ＤＮＡとしては、例えば、野生型α－ＮＡＧＡの塩基配列（配列番号１）のうち第５６２番目～第５６４番目の塩基がセリンのコドンを示す塩基からグルタミン酸のコドンを示す塩基に置換され（「ａｇｃ」→「ｇａｇ」）、かつ、第５７１番目～第５７３番目の塩基がアラニンのコドンを示す塩基からロイシンのコドンを示す塩基に置換された（「ｇｃｃ」→「ｃｔｃ」）塩基配列（配列番号３）からなるＤＮＡが好ましく挙げられる。この例示においては、置換後の第５６２番目～第５６４番目の塩基は、グルタミン酸のコドンを示す塩基であれば上記「ｇａｇ」以外の塩基であってもよいし、同様に、置換後の第５７１番目～第５７３番目の塩基は、ロイシンのコドンを示す塩基であれば上記「ｃｔｃ」以外の塩基であってもよく、限定はされない。
　以上のような変異置換型のＤＮＡは、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調製することができる。具体的には、Ｋｕｎｋｅｌ法及びＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて調製することができ、当該キットとしては、例えば、Ｑｕｉｃｋ ＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ、Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓＫｍ等：タカラバイオ社製）等が好ましく挙げられる。
　また、所望のアミノ酸のコドンを示す塩基となるようにミスセンス変異が導入されるように設計したＰＣＲプライマーを用い、野生型α－ＮＡＧＡをコードする塩基配列を含むＤＮＡ等をテンプレートとして、適当な条件下でＰＣＲを行うことにより調製することもできる。ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、例えば、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－ポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼの最適温度、合成するＤＮＡの長さ及び種類等により適宜設定すればよいが、例えば、サイクル条件であれば「９０～９８℃で５～３０秒（熱変性・解離）→５０～６５℃で５～３０秒（アニーリング）→６５～８０℃で３０～１２００秒（合成・伸長）」を１サイクルとして合計２０～２００サイクル行う条件が好ましい。
　上記（１ｂ）のＤＮＡは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ（すなわち上記（１ａ）のＤＮＡ）若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照することができる。
　ハイブリダイゼーション法を実施における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が１５～３３０ｍＭ、温度が２５～６５℃、好ましくは塩濃度が１５～１５０ｍＭ、温度が４５～５５℃の条件を意味する。具体的には、例えば８０ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記（１ｂ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（１ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　また、上記（１ｂ）のＤＮＡは、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。
　ここでいう「置換部位」とは、上記（１ａ）のＤＮＡに含まれる上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列においてなされた塩基置換の部位であり、詳しくは、当該塩基置換により生じた変更後のコドンを示す塩基（トリプレット）の部位を意味する。具体的には、「置換部位」とは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列を構成する１，１８５個の塩基のうち、配列番号１に示される塩基配列における第５６２番目～第５６４番目の塩基の位置に対応する塩基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）、並びに、配列番号１に示される塩基配列における第５７１番目～第５７３番目の塩基の位置に対応する塩基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）を意味する。さらに具体的には、前者の塩基は、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列における第５１１番目～第５１３番目の塩基を意味し、後者の塩基は、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列における第５２０番目～第５２２番目の塩基を意味する。
　また「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（１ｂ）のＤＮＡが上記（１ａ）のＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。例えば、上記（１ｂ）のＤＮＡの塩基配列が、上記（１ａ）のＤＮＡと比較して欠失及び付加の変異が無い場合（つまり両ＤＮＡの長さ（塩基数）が同じ）であれば、上記（１ｂ）のＤＮＡの塩基配列における第５１１番目～第５１３番目の塩基及び／又は第５２０番目～第５２２番目の塩基が、上記「対応する塩基」となる。
　なお、上記（１ｂ）のＤＮＡは、α－ＧＡＬ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが重要である。そのため、例えば、α－ＧＡＬの基質中のα－ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基は、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち配列番号１に示される塩基配列における第８２番目～第９３番目（４コドン）、第２２９番目～第２４３番目（５コドン）、第３４９番目～第３８１番目（１１コドン）、第４４８番目～第４７４番目（９コドン）、第５７４番目～第５７６番目（１コドン）、第６２５番目～第６６０番目（１２コドン）及び第７２４番目～第７６２番目（１３コドン）の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられ、中でも特に、触媒部位のアミノ酸残基のコドンを示す第４６６番目～第４６８番目及び第６４９番目～第６５１番目の塩基に対応する塩基が好ましい。
　また、上記（１ｂ）のＤＮＡは、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち、配列番号１に示される塩基配列における第１３３番目～第１３５番目及び第１，０４８番目～第１，０５０番目の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられる。
　さらに、上記（１ｂ）のＤＮＡは、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち、配列番号１に示される塩基配列における第３７０番目～第３７２番目、第５２９番目～第５３１番目、第６０１番目～第６０３番目、第１，０７５番目～第１，０７７番目及び第１，１５３番目～第１，１５５番目の塩基の位置に対応する塩基が好ましく挙げられる。
　上記（１ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（１ａ）のＤＮＡと比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（１ａ）のＤＮＡにサイレント変異が施されたＤＮＡ）が、特に好ましい。
　また、本発明の遺伝子としては、以下の（２ａ）又は（２ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子も好ましく挙げられる。以下の（２ａ）及び（２ｂ）のＤＮＡは、いずれも本発明のタンパク質の構造遺伝子であることが好ましいが、これらＤＮＡを含む遺伝子としては、これらＤＮＡのみからなるものであってもよいし、これらＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）をも含むものであってもよく、限定はされない。
（２ａ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目～第６０６番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６１３番目～第６１５番目の塩基「ｇｃｃ」がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（ｉｉｉ）配列番号５に示される塩基配列において第６０４番目～第６０６番目の塩基「ａｇｃ」がセリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換され第６１３番目～第６１５番目の塩基がアラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基に置換された塩基配列
（２ｂ）上記（２ａ）の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一であり、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
　配列番号５に示される塩基配列は、野生型α－ＮＡＧＡをコードする１，２３６個の塩基配列において、シグナルペプチド部分をコードする第１番目～第５１番目の塩基からなる配列が野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分をコードする塩基配列に変換された塩基配列であり、いわゆる融合タンパク質をコードする塩基配列である。ここで、野生型α－ＧＡＬのシグナルペプチド部分をコードする塩基配列は、前述した通り、配列番号９に示される野生型α－ＧＡＬをコードする塩基配列のうち、第１番目～第９３番目の塩基からなる配列である。
　上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡのうち、上記（ｉｉｉ）の塩基配列を含むＤＮＡが特に好ましい。また、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸又はアスパラギン酸のコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが好ましく挙げられる。同様に、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の記載中の「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群より選ばれるいずれか１つのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡも好ましく挙げられる。ここで、上記の各アミノ酸のコドンを示す塩基については、前記（１ａ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
　さらに、上記（２ａ）のＤＮＡとしては、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の記載中の「セリン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がグルタミン酸のコドンを示す塩基であり、かつ、「アラニン以外のアミノ酸のコドンを示す塩基」がロイシンのコドンを示す塩基である場合のＤＮＡが、特に好ましく挙げられる。当該ＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列のうち、第６０４番目～第６０６番目の塩基がセリンのコドンを示す塩基からグルタミン酸のコドンを示す塩基に置換され（「ａｇｃ」→「ｇａｇ」）、かつ、第６１３番目～第６１５番目の塩基がアラニンのコドンを示す塩基からロイシンのコドンを示す塩基に置換された（「ｇｃｃ」→「ｃｔｃ」）塩基配列（配列番号７）からなるＤＮＡが好ましく挙げられる。この例示においては、置換後の第６０４番目～第６０６番目の塩基は、グルタミン酸のコドンを示す塩基であれば上記「ｇａｇ」以外の塩基であってもよいし、同様に、置換後の第６１３番目～第６１５番目の塩基は、ロイシンのコドンを示す塩基であれば上記「ｃｔｃ」以外の塩基であってもよく、限定はされない。
　以上のような変異置換型のＤＮＡの調製法などについては、前記（１ａ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
　上記（２ｂ）のＤＮＡは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ（すなわち上記（２ａ）のＤＮＡ）若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ハイブリダイゼーション法の種類、手順及び条件、並びに各ライブラリーについては、前記（１ｂ）のＤＮＡに関する説明が同様に適用できる。
ハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記（２ａ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも４０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　また、上記（２ｂ）のＤＮＡは、前記置換部位の塩基に対応する塩基が当該置換部位の塩基と同一である。
　ここでいう「置換部位」とは、上記（２ａ）のＤＮＡに含まれる上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列においてなされた塩基置換の部位であり、詳しくは、当該塩基置換により生じた変更後のコドンを示す塩基（トリプレット）の部位を意味する。具体的には、「置換部位」とは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列を構成する１，２７５個の塩基のうち、第６０４番目～第６０６番目の塩基（但し上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）並びに第６１３番目～第６１５番目の塩基（但し上記（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の塩基配列に限る）を意味する。
　また「前記置換部位の塩基に対応する塩基」の「対応する塩基」とは、上記（２ｂ）のＤＮＡが上記（２ａ）のＤＮＡに対する相補鎖とハイブリダイズした場合に、このハイブリッドにおいて、前記置換部位の塩基に対する相補塩基（トリプレット）と、位置的に対向する関係にある塩基（トリプレット）を意味する。例えば、上記（２ｂ）のＤＮＡの塩基配列が、上記（２ａ）のＤＮＡと比較して欠失及び付加の変異が無い場合（つまり両ＤＮＡの長さ（塩基数）が同じ）であれば、上記（２ｂ）のＤＮＡの塩基配列における第６０４番目～第６０６番目の塩基及び／又は第６１３番目～第６１５番目の塩基が、上記「対応する塩基」となる。
　なお、上記（２ｂ）のＤＮＡは、α－ＧＡＬ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが重要である。そのため、例えば、α－ＧＡＬの基質中のα－ガラクトース残基との結合性（基質結合性）及び当該基質との触媒反応性に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基は、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第１２４番目～第１３５番目（４コドン）、第２７１番目～第２８５番目（５コドン）、第３９１番目～第４２３番目（１１コドン）、第４９０番目～第５１６番目（９コドン）、第６１６番目～第６１８番目（１コドン）、第６６７番目～第７０２番目（１２コドン）及び第７６６番目～第８０４番目（１３コドン）の塩基が好ましく挙げられ、中でも特に、触媒部位のアミノ酸残基のコドンを示す第５０８番目～第５１０番目及び第６９１番目～第６９３番目の塩基が好ましい。
　また、上記（２ｂ）のＤＮＡは、ホモ二量体の形成に重要と考えられるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第１７５番目～第１７７番目及び第１，０９０番目～第１，０９２番目の塩基が好ましく挙げられる。
　さらに、上記（２ｂ）のＤＮＡは、Ｎ型糖鎖結合部位であるアミノ酸残基のコドンを示す塩基も、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列から変異（欠失、置換又は付加）されていないものが好ましい。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の塩基配列上のそのような塩基としては、当該塩基配列のうち第４１２番目～第４１４番目、第５７１番目～第５７３番目、第６４３番目～第６４５番目、第１，１１７番目～第１，１１９番目及び第１，１９５番目～第１，１９７番目の塩基が好ましく挙げられる。
　上記（２ｂ）のＤＮＡとしては、例えば、上記（２ａ）のＤＮＡと比較して、塩基配列については完全に同一ではないが、翻訳された後のアミノ酸配列については完全に同一となるような塩基配列からなるＤＮＡ（すなわち上記（２ａ）のＤＮＡにサイレント変異が施されたＤＮＡ）が、特に好ましい。
　以上に述べた本発明のタンパク質をコードする遺伝子としては、翻訳後の個々のアミノ酸に対応するコドンは、特に限定はされないため、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよいし、また、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に用いられているコドン（好ましくは使用頻度の高いコドン）を示すＤＮＡを含むものであってもよい。
　＜組換えベクター及び形質転換体＞
　本発明のタンパク質を発現させる場合、通常は、まず上述の本発明の遺伝子を発現ベクターに組込んだ組換えベクターの構築が行われる。この際、発現ベクターに組込む遺伝子には、必要に応じて、予め、上流に転写プロモーター、ＳＤ配列（宿主が原核細胞の場合）及びＫｏｚａｋ配列（宿主が真核細胞の場合）を連結しておいてもよいし、下流にターミネーターを連結しておいてもよく、その他、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を連結しておくこともできる。なお、上記転写プロモーター等の遺伝子発現に必要な各要素は、初めから当該遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、各要素の使用態様は特に限定されない。
　発現ベクターに当該遺伝子を組込む方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法など、公知の遺伝子組換え技術を利用した各種方法が採用できる。また、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、レトロウイルスベクター、人工染色体ＤＮＡなど、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を保持し得るものであれば、限定はされず、使用する宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
　次いで、構築した上記組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、これを培養することにより、本発明のタンパク質を発現させることができる。なお、本発明で言う「形質転換体」とは宿主に外来遺伝子が導入されたものを意味し、例えば、宿主にプラスミドＤＮＡ等を導入すること（形質転換）で外来遺伝子が導入されたもの、並びに、宿主に各種ウイルス及びファージを感染させること（形質導入）で外来遺伝子が導入されたものが含まれる。
　宿主としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明のタンパク質を発現し得るものであれば、限定はされず、適宜選択することができるが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、細菌、酵母等の公知の宿主が挙げられる。
　動物細胞を宿主とする場合は、例えば、ヒト繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、サル細胞ＣＯＳ－７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。また、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞を用いることもできる。
　細菌を宿主とする場合、例えば、大腸菌、枯草菌等が用いられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が用いられる。
　植物細胞を宿主とする場合は、例えば、タバコＢＹ－２細胞等が用いられる。
　形質転換体を得る方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターとの種類の組合せを考慮し、適宜選択することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、ＰＥＧ法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、並びに、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等の各種ウイルスを感染させる方法などが好ましく挙げられる。
　得られる形質転換体においては、組換えベクターに含まれる遺伝子のコドン型は、実際に用いた宿主のコドン型と一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。
　（タンパク質の製法）
　本発明のタンパク質（α－ＧＡＬ活性を有するタンパク質）は、例えば、野生型α－ＮＡＧＡの活性部位（特に基質結合部位）の構造を、α－ＧＡＬの基質が結合できるように変化させることにより製造することができる。α－ＧＡＬの基質を結合させることができれば、野生型α－ＮＡＧＡの触媒部位による触媒作用により当該基質は加水分解され得る。
　このような構造変化は、例えば、前述したように、遺伝子組換え技術により、野生型α－ＮＡＧＡの活性部位（基質結合部位）を構成するアミノ酸配列中、（ｉ）第１８８番目のセリンをグルタミン酸又はアスパラギン酸等の他のアミノ酸に置換し、（ｉｉ）第１９１番目のアラニンをロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン又はメチオニン等の他のアミノ酸に置換し、あるいは（ｉｉｉ）第１８８番目のセリン及び第１９１番目のアラニンを共に上記（ｉ），（ｉｉ）のように置換する。このようにして、置換前と置換後のアミノ酸側鎖の立体構造を変化させることで行うことができ、野生型α－ＮＡＧＡの基質特異性を変化させることができる。特に、上記構造変化は、第１８８番目のセリンをグルタミン酸に置換し且つ第１９１番目のアラニンをロイシンに置換して行うことが好ましく、これによりα－ＮＡＧＡにα－ＧＡＬの基質特異性を付与することができる。なお、以上の構造変化において、顕著な立体構造変化をもたらすアミノ酸置換は、第１９１番目のアラニンをロイシン等に置換することである。詳しくは、第１９１番目のアミノ酸の側鎖が、アラニンの側鎖である「－ＣＨ３」から、ロイシンの側鎖である「－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ３」等のように占有空間の大きな側鎖に変わることで、α－ＮＡＧＡの基質中のＮ－アセチル基が活性部位に入り込む空間が制限され、当該基質との結合性が低減し、その分α－ＧＡＬの基質との結合性が高まることとなる。
　ここで、上述した本発明のタンパク質の製造方法は、構造変化前の野生型α－ＮＡＧＡとして、野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを含む野生型α－ＮＡＧＡを用いて行ってもよいし、あるいは、構造変化により変異型α－ＮＡＧＡを得た後、この変異型α－ＮＡＧＡに野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを付加する（結合させる）工程、若しくは、変異型α－ＮＡＧＡが野生型α－ＮＡＧＡのシグナルペプチドを含むものである場合はこのシグナルペプチドを野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドに変換する工程を行ってもよく、限定はされない。
　そのため、本発明のタンパク質の製造方法としては、例えば、野生型ヒトα－ガラクトシダーゼ由来のシグナルペプチドを含む野生型ヒトα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼの活性部位の構造を、α－ガラクトシダーゼの基質が結合できるように変化させることを特徴とする、α－ＧＡＬ活性を有するタンパク質の製造方法が好ましく挙げられる。
　また、本発明のタンパク質の製造方法としては、野生型α－ＮＡＧＡの活性部位の構造をα－ＧＡＬの基質が結合できるように変化させたタンパク質に野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドを付加する（結合させる）、又は、野生型α－ＮＡＧＡの活性部位の構造をα－ＧＡＬの基質が結合できるように変化させたタンパク質のシグナルペプチド部分を野生型α－ＧＡＬ由来のシグナルペプチドに変換することを特徴とする、α－ＧＡＬ活性を有するタンパク質の製造方法も好ましく挙げられる。
　なお、上述したシグナルペプチド部分の変換は、野生型α－ＮＡＧＡ及び野生型α－ＧＡＬについての公知の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報を用いて、遺伝子組換え技術の常法により行うことができる。
　本発明のタンパク質の製造は、具体的には、前述した形質転換体を培養する工程と、得られる培養物からα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を採取する工程とを含む方法により実施することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。上記形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的のタンパク質は、上記培養物中に蓄積される。
　上記培養に用いる培地としては、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、公知の各種天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
　培養中は、形質転換体に含まれる組換えベクターの脱落及び目的タンパク質をコードする遺伝子の脱落を防ぐために、選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加することができ、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合には、相当する栄養因子を培地から除くことができる。例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むベクターで形質導入したヒト線維芽細胞を培養する場合、培養中、必要に応じてＧ４１８（Ｇ４１８硫酸塩）を添加してもよい。
　　　
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体等を培養する場合は、必要に応じて、好適なインデューサー（例えば、ＩＰＴＧ等）を培地に添加してもよい。
　形質転換体の培養条件は、目的タンパク質の生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定はされず、通常、１０℃～４０℃、好ましくは２０℃～３７℃で５～１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。
　培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより目的タンパク質を採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製したタンパク質溶液とすることができる。
　また、目的のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合は、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
　一方、目的のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により、培養物中から目的タンパク質を採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
　なお、前述のように、目的タンパク質が菌体又は細胞を用いて（菌体内又は細胞内に、あるいは菌体外又は細胞外に）生産される場合は、通常、シグナルペプチド部分が、菌体内又は細胞内の小胞体から細胞質に移動する際や、菌体外又は細胞外への分泌の際に除去され、最終的に、シグナルペプチド部分を有しない成熟タンパク質の状態で回収されることになる。しかしながら、本発明においては、この態様には限定はされず、例えば、上述した小胞体から細胞質への移動や菌体外又は細胞外への分泌の際に必要なシグナルペプチド部分を２つ以上重複して（連続して）有するタンパク質を一旦発現させ、当該移動及び分泌後においてもシグナルペプチド部分を少なくとも１つは有する状態のものを回収するようにしてもよい。この場合、得られた目的タンパク質を医薬組成物等の有効成分として利用する場合は、例えば、シグナルペプチド部分を酵素等を用いて切断又は分解し、成熟タンパク質の状態にしてから利用すればよい。
　形質転換体等を培養して得られたタンパク質の生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）等により確認することができる。
　また、目的タンパク質の製造は、上述したような形質転換体を用いたタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を用いて行うこともできる。
　無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内で目的タンパク質を合成する系である。また、使用し得る無細胞タンパク質合成系としては、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
　この場合、使用する細胞抽出液の由来は、前述の宿主細胞であることが好ましい。細胞抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、ＣＨＯ細胞、ウサギ網状赤血球、マウスＬ－細胞、ＨｅＬａ細胞、小麦胚芽、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮又は希釈して用いてもよいし、そのままでもよく、限定はされない。
　細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。
　このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭＳｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ－ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
　無細胞タンパク質合成によって産生された目的のタンパク質は、前述したようにクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
　本発明のタンパク質の安定性を高める方法において、タンパク質の形態は限定されない。例えば、組成物に含有される形態であっても、乾燥形態又は水溶液の形態であってもよい。後述する医薬組成物において有効成分となる、本発明のタンパク質は、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよいし、また、治療剤としての保存安定性（特に酵素活性の維持）を考慮した適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよく、特に限定はされない。タンパク質が組成物に含有される場合の態様については、〔３．ファブリー病治療用医薬の組合せ物〕の項目に詳述する。
　［活性部位特異的シャペロン化合物］
　本発明に係る活性部位特異的シャペロン化合物は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である。
　ここで、式（Ｉ）のＲ０における官能基の記載は、その官能基に対応する、水中で水素イオンを放出して負電荷を有する官能基（例えば－Ｏ-、－ＳＯ３ -、－ＣＯＯ-）も包含され、これらの官能基を有する化合物も式（Ｉ）で表される化合物の範疇である。本発明に係る活性部位特異的シャペロン化合物には、その遊離塩基形態及び任意の薬学的に許容可能な塩形態もその範疇に包含される。
　また、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれであってもよい。
　式（Ｉ）中、Ｒ０における炭素数１～４のアルキル基として、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が挙げられる。このうち、炭素数１～３のアルキル基が好ましく、炭素数１又は２のアルキル基がより好ましく、炭素数１であることがさらに好ましい。
　ハロアルキル基又はハロゲン基におけるハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒが挙げられ、Ｆ又はＣｌであることが好ましい。
　式（Ｉ）中、Ｒ０における炭素数１～４のハロアルキル基は、上述の炭素数１～４のアルキル基において前記「ハロゲン原子」が置換した基であり、例えば、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ジフルオロメチル、ジクロロメチル、ジブロモメチル、フルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、２－ブロモエチル、２－クロロエチル、２－フルオロエチル、２－ヨードエチル、３－クロロプロピル、２，２－ジブロモエチル、４－ヨードブチル、４－フルオロブチル、４－クロロブチル基等が挙げられる。
　式（Ｉ）中、Ｒ０における炭素数１～４のアルコキシ基は、上述の炭素数１～４のアルキル基が酸素原子に結合した基であり、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられる。
　式（Ｉ）中、Ｒ０における炭素数１～４のヒドロキシアルキル基は上述の炭素数１～４のアルキル基において水酸基が置換した基であり、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル基等が挙げられる。一例ではヒドロキシメチル基が好適である。
　式（Ｉ）中、Ｒ０における炭素数３若しくは４のシクロアルキル基は、３員又は４員の飽和又は不飽和環状炭化水素基であり、例えばシクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロブチル基等が挙げられる。
　ある実施形態では、式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ又は－ＳＯ３ －であることが好ましく、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ３ －であることがより好ましく、Ｈであることがさらにより好ましい。
　一実施形態の活性部位特異的シャペロン化合物は、本発明に係るタンパク質の競合的阻害剤である。
　酵素の「競合的阻害剤」とは、酵素基質に化学的構造及び分子的幾何学的及び構造的に類似して、基質とほぼ同一の位置における酵素に結合する化合物を意味している。競合的阻害剤としての活性部位特異的シャペロン化合物は、基質分子と同一の活性部位について競合し、Ｋｍを増大させる。競合阻害は可逆的であり得る。従って、酵素阻害の程度は競合阻害剤の濃度、基質濃度、及び活性部位に対する阻害剤及び基質の相対的親和性に依存する。
　通常、α－ＮＡＧＡ変異体は、中性ｐＨ（７．４）よりも酸性（リソソーム条件）ｐＨ（５．２）において安定である。本発明に係る活性部位特異的シャペロンを接触させることによって、中性及び酸性のいずれの条件においても接触させない場合と比較して、酵素の安定性を向上させるものであり得る。
　一例では、活性部位特異的シャペロンはα－ＮＡＧＡ変異体の変性温度（Ｔｍ値）をより上昇させるものが好ましい。
　特定の実施形態において、活性部位特異的シャペロンは、上記式（Ｉ）の構造のうち、Ｒ０がＨである１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）であるか、Ｒ０が－ＳＯ３ －であるガラクトスタチン重亜硫酸塩（ガラクトスタチンバイスルファイト、galactostatin bisulfite（ＧＢＳ）であり、別の実施形態では、１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）である。１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）は、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）ピペルジン（ｐｉｐｅｒｄｉｎｅ）－３，４，５－トリオールを指す。本明細書で使用されるとき、「１－デオキシガラクトノジリマイシン」又は「ＤＧＪ」という場合、その遊離塩基形態及び任意の薬学的に許容可能な塩形態の双方を含む。ＤＧＪの塩酸塩はミガラスタット塩酸塩として知られる。
　なお、１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）は下記の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
また、ガラクトスタチン重亜硫酸塩（ガラクトスタチンバイスルファイト、galactostatin bisulfite（ＧＢＳ）は下記の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本発明に係る活性部位特異的シャペロンは、以下のうちの少なくとも１つの機能を有するものである。
（１）タンパク質が安定な立体構造をとることを助ける、（２）タンパク質分解を抑制して、タンパク質のＥＲから細胞内の適切な場所への移動を促進する、（３）ミスフォールディングを有する（不安定な立体構造を有する）タンパク質の凝集を抑制する。（４）タンパク質の活性の増強、活性の持続期間の延長、又は活性の回復。
　［タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤］
　上述した通り、活性部位特異的シャペロンはタンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤として用いることができる。すなわち、本発明は、タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤であって、前記タンパク質は、本発明のα－ＮＡＧＡ変異体タンパク質であり、前記安定性向上剤は、本発明の活性部位特異的シャペロン化合物を含む、安定性向上剤を提供する。
　本発明のタンパク質の安定性を高める方法において、活性部位特異的シャペロンの形態は限定されない。例えば、組成物に含有される形態であっても、乾燥形態又は水溶液の形態であってもよい。これらの任意の形態の活性部位特異的シャペロンは安定性向上剤としての用いることができる。活性部位特異的シャペロンが組成物に含有される場合の態様については、〔３．ファブリー病治療用医薬の組合せ物〕の項目に詳述する。
　［本発明の方法における各工程］
　続いて、以下は本発明の方法の各工程について詳細に説明する。
　（接触工程）
　本発明のタンパク質の安定性を高める方法は、前記タンパク質を活性部位特異的シャペロンと接触させる工程（接触工程）を包含する。
　「タンパク質の安定性」は、タンパク質が、適切な立体構造を保ち、正常な機能性を有しているかどうかで判断することができる。タンパク質の立体構造及び機能性は、相互作用する物質の有無又はｐＨ及び温度などの該タンパク質の存在する環境条件等に影響されて変化する。よってタンパク質はこのような立体構造変化が生じにくく、機能性の低下がしにくいほど、安定性が高いといえる。
　タンパク質の安定性の高さは、例えば、該タンパク質自体の活性の高さ、タンパク質の活性又はタンパク質の量の経時的な変化、適切な立体構造の維持等を調べることで判定することができる。
　つまり、タンパク質の安定性を高める方法とは、酵素活性の低下を抑制する、酵素活性を維持する、又は、酵素活性を向上させる方法と言い換えることもできる。
　接触工程におけるタンパク質と活性部位特異的シャペロンとの接触は、in vivoで行っても、in vitroで行ってもよい。
　タンパク質に接触させる活性部位特異的シャペロンの量は、該タンパク質の安定性を高めるために必要な量であり、例えば接触させる対象のタンパク質の量等に応じて決定される。活性部位特異的シャペロンの濃度は、例えば、該酵素についての特異的シャペロンのＩＣ５０値を計算することによって決定することができる。
　さらなる実施形態において、本発明に係るタンパク質の安定性を高める方法は、１）本発明に係るタンパク質を、本発明に係る活性部位特異的シャペロンと接触させる工程（接触工程）、及び、２）接触工程後に前記タンパク質の安定性を測定する工程（測定工程）、を含む方法である。
　（測定工程）
　測定工程は、上記接触工程後に行われ、接触工程後に前記タンパク質の安定性を測定する工程である。
　タンパク質の安定性の測定方法としては、タンパク質の活性測定、サーマルシフトアッセイ、示査走査熱量計、円偏向二色法等によるタンパク質の立体構造維持の測定、及び、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティングなどによる、タンパク質の量の測定等が挙げられる。
　一実施形態において、タンパク質の安定性が高められているか否かは、前記接触工程を行う前のタンパク質の活性又は発現量と、接触工程後のタンパク質の活性又は発現量とを比較することによって確認することができる。また、活性部位特異的シャペロン／タンパク質相互作用の分析結果は、例えば、プラズモン共鳴法、示差走査熱量計、円偏向二色性等、当分野で周知の技術を用いて評価することができる。
　本発明の方法は、それを必要とする個体へ投与するためのタンパク質に適用することができる。つまり、本発明の方法は、酵素補充療法のための補充酵素としてのα－ＮＡＧＡ変異体に対して用いることができ、生体中のα－ＮＡＧＡ変異体の安定性を高めることも可能である。
　〔２．ファブリー病の治療方法〕
　本発明は、ファブリー病の治療方法を提供する。
　［α－ＮＡＧＡ変異体タンパク質を補充酵素とする酵素補充療法と、活性部位特異的シャペロンによるシャペロン療法との組合せによる併用療法］
　本発明のファブリー病の治療方法の一実施形態は、個体に、有効量の本発明に係るタンパク質と、有効量の、前記タンパク質に対する本発明に係る活性部位特異的シャペロンとを投与することを包含する方法である。
　つまり、本発明の治療方法の一態様は、α－ＮＡＧＡ変異体タンパク質を用いた酵素補充療法において、同時に、α－ＮＡＧＡ変異体タンパク質の安定性を高める方法である。個体に投与されたα－ＮＡＧＡ変異体タンパク質は、同個体に投与された活性部位特異的シャペロンによって、その安定性及び活性が増強される。すなわち、本実施形態の治療方法は、酵素補充療法と、薬理学的シャペロン療法との組合せによる併用療法である。
　このとき、活性部位特異的シャペロンは、補充酵素であるα－ＮＡＧＡ変異体タンパク質の補助剤としての役割を果たすものとして投与されるものであってもよい。
　タンパク質及び活性部位特異的シャペロンは、〔１．タンパク質の安定性を高める方法〕の項目にて上述した通りのものが適用される。また、組成物の形態は、以下の〔３．ファブリー病治療用医薬の組合せ物〕の項目にて記載するものを適用することができる。
　以下、投与工程について説明する。
　（投与工程）
　タンパク質と活性部位特異的シャペロンとは、同時に投与されてもよく、別々に投与されてもよい。同時投与される場合は、タンパク質と活性部位特異的シャペロンとは、別々の組成物（以下、組成物というときは、ファブリー病治療用医薬組成物としての製剤も含む）に含まれていてもよく、単一の組成物中に含まれていてもよい。また、タンパク質と活性部位特異的シャペロンとの両方又は一方について、異なる構造を有する複数種類のタンパク質及び／又は活性部位特異的シャペロンを投与してもよい。
　（投与期間）
　投与期間も特に制限されず、連続で与えても間欠的に投与してもよいが、例えば１～数か月間、１～数年又は数年～数十年（例えば死亡するまで）という期間に、連続で、又は間欠的に（例えば１～７日おき又は１～１４日おきに）投与することができる。
　（投与のタイミング）
　タンパク質及び活性部位特異的シャペロンが個別の組成物中に含まれる場合、タンパク質及び活性部位特異的シャペロンを同時に投与してもよく、活性部位特異的シャペロンをタンパク質投与の前に、又は後に、投与してもよい。例えば、タンパク質が静脈内投与される場合に、活性部位特異的シャペロンは、一例として、該タンパク質投与の０～２時間以内、タンパク質投与の０～２時間前又は０～２時間後に投与してもよい。
　投与工程において、複数のタンパク質及び／又は活性部位特異的シャペロンを投与する場合は、複数種類のタンパク質及び／又は活性部位特異的シャペロンを同時に又は混合して投与してもよく、複数種類のタンパク質及び／又は活性部位特異的シャペロンを異なる時期に投与してもよい。その場合、投与の順は、例えば、ある特定のタンパク質を一定の投与期間投与した後、別の構造を有する異なるタンパク質をさらなる一定期間投与する、というように、投与する組成物成分を変更してもよく、一定期間中の投与有効成分の組成は所望のサイクル及び順序で変更してもよい。
　（投与経路）
　投与経路は、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、点眼、筋肉内、経口腔、経直腸、経膣、眼窩内、大脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、クモ膜下、槽内、関節内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮及び吸入経由のいずれであってもよく、また、経口及び非経口のいずれであってもよい。なお、静脈内、皮下及び腹腔内等の非経口投与が好ましい。
　タンパク質及び活性部位特異的シャペロンが別個の組成物で調製される場合、シャペロン及びタンパク質を、例えば、静脈内注入等の同一経路によって投与してもよく、別の経路で投与してもよい。例えば、タンパク質は静脈内注入で、活性部位特異的シャペロンは経口投与等の異なる経路で投与することができる。
　タンパク質を含む組成物を補充用酵素薬として投与する場合は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用される。非経口用法等の各種用法に用い得る製剤は、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。
　当該医薬組成物の形態は、限定はされないが、補充用酵素薬である場合は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供され得る。
　（投与方法）
　投与方法としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内又は腹腔内等への直接注射、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内又は直腸内等の粘膜への噴霧、ならびに経口投与及び血管内投与などの、公知の方法に基づいて行われる。例えば、製剤のボーラス注射が挙げられる。
　投与に用いられる他の有用な非経口送達システムとしては、エチレン－酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋込み型注入システム、ポンプ送達、封入細胞送達、リポソーム送達、ニードル送達式注射、ニードルレス注射、ネブライザー、エアロゾル噴霧器、エレクトロポレーション及び経皮パッチが挙げられる。
　（投与量）
　本発明のタンパク質と活性部位特的シャペロンとの投与量は、製剤中の有効成分の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類、病状のほか、投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜、広範囲に設定することができる。特に、タンパク質を補充用酵素薬としての医薬組成物の形態で投与する場合は、その投与回数は、２～４週間に１回程度が好ましく、またその投与量（／１回）は、例えば、有効成分である本発明のタンパク質等（組換え酵素）を、患者の体重に対して０．１～１０ｍｇ／ｋｇ程度投与できる量であることが好ましく、より好ましくは０．１～５ｍｇ／ｋｇ程度、さらに好ましくは０．２～１ｍｇ／ｋｇ程度である。
　（投与の対象）
　投与対象となる個体としては、あらゆる動物が挙げられるが、脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の被験体としては、ヒトの他に、家畜類（ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等）、ペット動物（ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、モルモット等）及び実験動物（マウス、ラット等のげっ歯類、サル等）が挙げられるが、特にヒトが好ましい。
　例示的な個体は、ファブリー病を有する患者であるか、ファブリー病を発症するリスクを有する。ファブリー病を発症するリスクを有するとは、発症には至っていないが、発症の可能性が健常者と比べて高いことを意図しており、例えば、臨床症状を発症していないが、α－ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損を有するなどの遺伝学的な発現型を有することが含まれる。
　さらに投与対象の個体は、いかなる年齢であってもよく、性別も限定されない。一実施形態の個体は、上述したファブリー病の少なくとも１つの臨床的症状を呈している。
　［α－ＮＡＧＡ変異体タンパク質による遺伝子治療と、シャペロン化合物によるシャペロン療法との組合せによる併用療法］
　本発明のファブリー病の治療方法の別の実施形態は、個体に、有効量の、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子と、有効量の、前記タンパク質に対する本発明に係る活性部位特異的シャペロンとを投与することを包含する、方法である。
　つまり、本発明の治療方法のさらなる態様は、α－ＮＡＧＡ変異体遺伝子を用いた遺伝子治療において、同時に、生体内に発現するα－ＮＡＧＡ変異体タンパク質の安定性を高める方法である。すなわち、本実施形態のファブリー病の治療方法は、前述した本発明のタンパク質をコードする遺伝子を用いた遺伝子治療と、シャペロン化合物によるシャペロン療法との組合せによる併用療法を提供するものである。
　タンパク質及び活性部位特異的シャペロンは、〔１．タンパク質の安定性を高める方法〕の項目にて上述した通りのものが適用される。
　個体に投与されるタンパク質をコードする遺伝子の形態は、例えば、その遺伝子自体を含む組成物の形態であってもよいし、該遺伝子を発現可能に組み込んだベクターの形態又はそのベクターを含む組成物の形態であってもよい。投与に好適なベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等が挙げられる。これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。なお、市販の遺伝子導入キット（例えば、製品名：アデノエクスプレス、クローンテック社製）を用いることもできる。
　遺伝子を含む医薬組成物を投与に用いる場合、当該組成物をリポソーム等のリン脂質小胞体に導入し、この小胞体を投与することも可能である。本発明の遺伝子を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内又は動脈内等に投与する。ファブリー病の障害臓器に局所投与することもできる。例えば、成人に当該医薬組成物を投与する場合は、患者の体重に対し、一日あたり０．１μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ程度であることが好ましく、より好ましくは１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ程度である。
　遺伝子の投与と、活性部位特異的シャペロンの投与との投与経路、投与方法、投与形態等は、上述の［α－ＮＡＧＡ変異体タンパク質を補充酵素とする酵素補充療法と、活性部位特異的シャペロンによるシャペロン療法との組合せによる併用療法］における、投与成分としてのタンパク質を遺伝子に置き換えてそのまま適用可能である。
　〔３．ファブリー病治療用医薬の組合せ物〕
　本発明では、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、本発明に係るタンパク質と、本発明に係る活性部位特異的シャペロンと、を含む、ファブリー病治療用医薬の組合せ物を提供する。
　　　
　タンパク質及び活性部位特異的シャペロンは、〔１．タンパク質の安定性を高める方法〕の項目にて上述した通りのものが適用される。
　組合せ物において、タンパク質と活性部位特異的シャペロン化合物とは、これらの物質を組合せとして使用するための別個の物質としての組合せの形態であってもよく、同一組成物中の成分として単一の組成物に含まれる形態であってもよい。組合せ物が別個の物質としての組合せの形態であるときは、例えば、タンパク質と活性部位特異的シャペロン化合物とはそれぞれ別個の組成物の形態となっていてもよい。なお、単一組成物中に含まれる形態及び別個の組成物に含まれる形態のいずれの形態についても、組成物に含まれる他の成分や剤型等は、後述の［ファブリー病治療用医薬組成物］に記載のものが適用可能である。タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤としての活性部位特異的シャペロン化合物を、別個の物質としての組合せ物の形態の場合に適用してもよい。
　組合せ物は本発明のタンパク質の安定性を高める方法及びファブリー病の治療方法に好適に使用することができる。組合せ物の具体的な一例としては、タンパク質と活性部位特異的シャペロン化合物とをそれぞれの医薬ラベルが貼付されたファブリー病治療用医薬として準備し、これらの医薬を組合せて使用するための組合せ物としたものが挙げられる。なお、医薬の互いの医薬ラベルには組合せ物としての互いの医薬との組合せとして使用されることが記載されていてもよい。
　［ファブリー病治療用医薬組成物］
　本発明はまた、本発明のタンパク質と活性部位特異的シャペロンとの一方又は両方を含むファブリー病治療用医薬組成物を提供する。
　本発明のタンパク質の安定性を高める方法及びファブリー病の治療方法に本発明の組成物が適用される場合、上述の通り、タンパク質と活性部位特異的シャペロンとは単一の組成物中に含まれていてもよく、別個の組成物中に含まれていてもよい。
　タンパク質と活性部位特異的シャペロンとの両方を含む組成物は、例えば、上述の治療方法において、タンパク質と活性部位特異的シャペロンとの同時投与するために有効に用いることができる。
　また、タンパク質と活性部位特異的シャペロンとを別個の組成物の形態とする場合、それぞれの組成物は、その他の成分として同一の成分を含んでいてもよく、異なる成分を含んでいてもよい。
　［ファブリー病治療用薬剤］
　よって本発明の活性部位特的シャペロン化合物を含む組成物の一実施形態は、ファブリー病治療用薬剤である。つまり発明では、ファブリー病治療用薬剤であって、本発明のタンパク質と併用されるものであり、前記ファブリー病治療用薬剤は、本発明の活性部位特的シャペロン化合物を含む、ファブリー病治療用薬剤も提供する。
　［補充用酵素薬等としての医薬組成物］
　本発明のタンパク質と活性部位特的シャペロンとは、前述したように、ファブリー病の治療に関して種々の優れた効果を発揮し得るものであり、これらをファブリー病治療用医薬組成物（ファブリー病治療剤）の有効成分として好適に用いることができる。すなわち、本発明は、前述した本発明のタンパク質を含有するファブリー病治療用医薬組成物を提供するものである。当該医薬組成物としては、具体的には、酵素補充療法に用い得る補充用酵素薬の形態であることが好ましい。
　当該医薬組成物を補充用酵素薬として用いる場合は、本発明のタンパク質の配合割合や、他の成分の種類及び配合割合は、公知の補充用酵素薬（特に、ファブリー病治療用の補充用酵素薬）の調製法に準じて適宜設定することができる。
　本発明においては、有効成分となる本発明のタンパク質（組換え酵素）は、血中安定性に優れ、障害臓器の細胞への取り込み効率も高いため、従来に比べて少量の使用であっても従来と同様又はそれ以上の酵素補充効果を得ることができ、またアレルギー性副作用も極めて少ないので、患者への体力的、精神的及び経済的な負担を大いに低減することができる。
　さらに、本発明のタンパク質と活性部位特異的シャペロンとを含むファブリー病治療用医薬組成物は、活性部位特異的シャペロンを含まない従来の組成物よりも治療効果が高いので、より少量にて有効である。よって、本発明では、ファブリー病治療用医薬組成物は、従来の酵素補充療法における課題であった、組換えα－ＧＡＬの繰り返し投与による、酵素に対する抗体の産生を抑制し、有害副反応を低減させ、治療効果を持続させる効果、及び、個体へ投与後の生体内での安定性を維持する効果を有する。
　［遺伝子治療剤としての医薬組成物］
　本発明の医薬組成物は、前述したように、ファブリー病の治療に関して種々の優れた効果を発揮し得る本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含むものであってもよい。
　組成物中に含まれる遺伝子の形態は、例えば、その遺伝子自体を含む組成物の形態であってもよいし、ベクターに該遺伝子を発現可能に組み込まれた形態であってもよい。
　当該医薬組成物としては、具体的には、遺伝子治療に用い得る遺伝子治療薬の形態であることが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、保管中及びin vivoへの投与中又はin vitroでの試験中のタンパク質の安定性を高める。これにより本組成物をファブリー病への治療へ適用する場合、治療有効性を高めることができる。
　当該医薬組成物は、本発明のタンパク質又は遺伝子と、活性部位特異的シャペロンと以外にも他の成分を含むことができる。他の成分としては、当該医薬組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる、製薬上許容され得る各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。他の成分は、本発明のタンパク質等により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。例えば医薬組成物は、好適な溶媒、担体、賦形剤、補助剤等の物質をさらに含んでいてもよい。注射使用に適した医薬製剤とする場合は、無菌的な製剤であって、容易に注射することが可能な程度に流動性を有していることが好ましい。
　（担体）
　担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適当な混合物、並びに植物油を含有する溶媒及び分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、必要な粒径の維持によって（分散液の場合）、また、界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸等、種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって防止することができる。
　（賦形剤）
　ファブリー病治療用医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤の具体例としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液等の緩衝液；アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質；血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ＥＤＴＡ若しくはＥＧＴＡ、及び塩化ナトリウム等の塩類；リポソーム；ポリビニルピロリドン；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール等の糖類；プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００、ＰＥＧ－６０００）；グリセロール；グリシン若しくはその他のアミノ酸；及び脂質等が挙げられる。
　（界面活性剤）
好ましい非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（Polysorbate）２０、ポリソルベート８０、TritonＸ－１００、TritonＸ－１１４、NonidetＰ－４０、オクチルα－グルコシド、オクチルβ－グルコシド、ブリジ（Brij）３５、プルロニック（Pluronic）及びTween 20が挙げられる。
　（充填剤）
　充填剤としては、グリシン、マンニトール、アルブミン、デキストラン、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム等が挙げられる。
　（溶媒）
　本発明の医薬組成物の溶媒の例としては、水及び緩衝液等が挙げられ、緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝液及びリンゲル液などが挙げられる。また、組成物に用いられる溶媒は上述の溶媒の２種類以上の混合物であってもよい。
　その他、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）、結合剤（例えば、アルファ化デンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などを含んでいてもよい。
　（タンパク質濃度及び活性部位特異的シャペロン濃度（有効成分の濃度））
　ファブリー病治療用医薬組成物中のタンパク質の濃度は、使用する目的や用途に応じて変更可能であり、特に限定されないが、例えば、０．１～１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。また、ファブリー病治療用医薬組成物中の活性部位特異的シャペロンの濃度は、タンパク質濃度に応じて変更され、特に限定されないが、例えば、２ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
　（剤型）
　本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されず、液体、固体又は半固体若しくは半液体とすることができる。さらに凍結乾燥製剤としてもよい。これらの剤形は、当業者に公知の方法に基づき、容易に製造することができる。例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、及び注射剤等が挙げられ、好ましくは注射剤又は錠剤等の経口投与用の剤型である。例えば、吸入投与用製剤、鼻腔内投与用製剤、点鼻剤の形状の製剤としてもよい。
　以上の通り、本発明のタンパク質の安定性を高める方法は、ファブリー病の治療に有効に用いられるα－ＮＡＧＡ変異体タンパク質をさらに安定性を高め、治療効果を増強することができるという優れた効果を有する。また、本発明ファブリー病の治療方法及びファブリー病治療用医薬組成物はファブリー病の治療に有効に用いることができる。
　〔４．本発明に係る具体的な態様の例示〕
　本発明は以下の何れかの態様を包含する。
＜１＞　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質と、
　活性部位特異的シャペロンと、
を含む、ファブリー病治療用医薬の組合せ物であって、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、ファブリー病治療用医薬の組合せ物。
＜２＞　前記（ａ）のタンパク質は、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシンに置換されたものであり、
　前記（ｃ）のタンパク質は、前記第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、前記第２０５番目のアミノ酸がロイシンに置換されている、＜１＞に記載のファブリー病治療用医薬の組合せ物。
＜３＞　前記活性部位特異的シャペロンは、前記タンパク質の可逆的競合阻害剤である、＜1＞又は＜２＞に記載のファブリー病治療用医薬の組合せ物。
＜４＞　前記活性部位特異的シャペロンは、１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）である、＜１＞～＜３＞の何れかに記載の、ファブリー病治療用医薬の組合せ物。
＜５＞　タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤であって、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　前記安定性向上剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
からなる群から選択される化合物を含む、安定性向上剤。
＜６＞　ファブリー病治療用薬剤であって、
　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）と併用されるものであり、
　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
　前記ファブリー病治療用薬剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
からなる群から選択される化合物を含む、ファブリー病治療用薬剤。
＜７＞　タンパク質の安定性を高める方法であって、
　前記タンパク質を活性部位特異的シャペロンと接触させる工程を包含し、
　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、タンパク質の安定性を高める方法。
＜８＞　前記（ａ）のタンパク質は、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシンに置換されたものであり、
　前記（ｃ）のタンパク質は、前記第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、前記第２０５番目のアミノ酸がロイシンに置換されている、＜７＞に記載のタンパク質の安定性を高める方法。
＜９＞　前記活性部位特異的シャペロンは、前記タンパク質の可逆的競合阻害剤である、＜７＞又は＜８＞に記載のタンパク質の安定性を高める方法。
＜１０＞　前記活性部位特異的シャペロンは、１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）である、＜７＞～＜９＞の何れかに記載の、タンパク質の安定性を高める方法。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　〔１．α－ＮＡＧＡ変異体阻害剤のスクリーニングと阻害効果の検討〕
　化合物
　３０種類の化合物について、α－ＮＡＧＡ変異体阻害効果を有する化合物のスクリーニングを行った。１－デオキシガラクトノジリマイシン(DGJ)、ガラクトスタチン重亜硫酸塩（galactostatin bisulfite (GBS)）はToronto Research Chemicalsより購入した。その他の化合物も市販の化合物を購入又は受託合成した。
（阻害剤のスクリーニング（１））
　阻害剤のスクリーニングは、２０ｎｇのα－ＮＡＧＡ変異体（配列番号８）と０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ４．６）に溶解した４ｍＭ ４－メチルウンベリフェリル
α－Ｄ－ガラクトピラノジドに精製水又はＤＭＳＯに溶解した阻害剤候補化合物を０．８、１、４００μＭになるように加え、３７℃で３０分間反応させることで行った（計５０μｌ）。反応終了後に、０．２Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．７）を９５０μｌ添加し、反応を停止させた。そして、遊離した４－メチルウンベリフェロンをWallac 1420 ARVOMX Multilabel Counterを用いて励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。残存酵素活性は、阻害剤候補化合物の代わりに精製水又はＤＭＳＯを添加した場合の酵素活性値を１００％として算出した。その結果、３０種類の化合物のうち、４００μＭの高濃度のＤＧＪ及びＧＢＳの化合物添加で特に阻害効果が見られた。
（阻害剤のスクリーニング（２））
　続いて、一回目のスクリーニングの結果から選択されたＤＧＪ、ＧＢＳについてα－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の阻害の測定を行った。Ｎ－Ｃ－ＤＧＪ、Ｎ－ＤＧＪ及びＮ－ＨＥ－ＤＧＪについても同様に活性測定を行い、コントロールとした。
　２５ｎｇのα－ＮＡＧＡ変異体と０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ４．６）に溶解した４ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－ガラクトピラノジドに精製水又はＤＭＳＯに溶解したＤＧＪ、ＧＢＳ、Ｎ－Ｃ－ＤＧＪ、Ｎ－ＤＧＪ又はＮ－ＨＥ－ＤＧＪを０．１、１、１０μＭになるように加え、３７℃で３０分間反応させることで行った（計５０μｌ）。反応終了後に、０．２Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．７）を９５０μｌ添加し、反応を停止させた。そして、遊離した４－メチルウンベリフェロンをWallac 1420 ARVO MX Multilabel Counterを用いて励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。残存酵素活性は、阻害剤候補化合物の代わりに精製水又はＤＭＳＯを添加した場合の酵素活性値を１００％として算出した。結果を図１に示す。図１は、ＤＧＪによるα－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の阻害を示す図である。ＤＧＪ、ＧＢＳはα－ＮＡＧＡ変異体の活性を阻害する効果を有していた。
　（阻害定数Ｋｉの算出）
　続いて、ＤＧＪ、ＧＢＳについて、阻害定数Ｋｉを算出し、阻害様式について検討を行った。
　酵素学的解析は、５０ｎｇのα－ＮＡＧＡ変異体と０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ４．６）に溶解した様々な濃度（１、２、４、６及び８ｍＭ）の基質４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－ガラクトピラノジドを反応液として用いて行った（計５０μｌ）。また、阻害活性測定では上記反応液にＤＧＪの場合は１００、２００及び４００ｎＭ、ＧＢＳの場合は２００、４００、８００ｎＭの濃度で添加して反応を行った。３７℃で１０分間反応させた後に、０．２Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．７）を９５０μｌ添加し、反応を停止させた。そして、遊離した４－メチルウンベリフェロンをWallac 1420 ARVOMX Multilabel Counterを用いて励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。この値より、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを作製し、阻害定数Ｋｉを阻害
剤の濃度に対応するプロットの傾きから算出した。
　図２は、ＤＧＪ又はＧＢＳによるα－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔ、及びこのプロットからの阻害定数Ｋｉの算出結果を示す図である。
　Ｋｉの値から、ＤＧＪ、ＧＢＳはいずれも競合阻害による阻害活性を有することが分かった。
　〔２．α－ＮＡＧＡ変異体阻害剤の酵素安定化効果の検討〕
　（酵素活性測定による熱安定性試験）
　ＤＧＪについて、α－ＮＡＧＡ変異体阻害活性の熱安定性試験を行った。
　１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）又は２５ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ５．２）に、α－ＮＡＧＡ変異体を溶解して作製した１０μｇ／ｍｌα－ＮＡＧＡ変異体溶液に、ＤＧＪ １μＭ又は１０μＭをそれぞれ添加した（計１００μｌ）。そして、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）を用いた溶液では４２℃、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ５．２）を用いた溶液では５５℃でインキュベートした。そして、インキュベート開始０分及び６０分後に１０μｌをサンプリングして、即座に０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ４．６）に溶解した５ｍＭの基質４０μｌに添加し、酵素活性を測定した。残存活性は、０分後の酵素活性の値を１００％として表した。結果を図３に示す。図３は、ＤＧＪについてα－ＮＡＧＡ変異体阻害活性の熱安定性試験の結果を示す図である。
　ｐＨ ５．２の酸性条件、ｐＨ ７．５の中性条件のいずれも、ＤＧＪ添加によってα－ＮＡＧＡ変異体の熱安定性が向上した。特に酸性条件下でより高い熱安定性の向上が見られた。
　（サーマルシフトアッセイ）
　ＤＧＪとＧＢＳについて、酸性及び中性条件下でのＴｍ値の測定を行った。
　Ｔｍ値の解析は、２μｇのα－ＮＡＧＡ変異体、様々な濃度（１、１０、５０、１００μＭ）のＤＧＪ又はＧＢＳ、×５ SYPRO Orange（Invitrogen）を１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ７．４）又は１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えた２５ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ５．２）に添加し、行った（計２０μＬ）。試料をｑＲＴ－ＰＣＲ（Bio Rad）を用いて２５℃から９５℃まで０．５℃／１０秒で上昇させ、経時的に蛍光強度を測定した。そして、ＣＦＲ　Ｍａｎａｇｅｒソフトを用いて、Ｔｍ値を算出した。結果を図４に示す。図４は、ＤＧＪ及びＧＢＳについての、酸性及び中性条件下でのＴｍ値の測定結果を示した図である。
　〔３．α－ＮＡＧＡ変異体とα－ＮＡＧＡ変異体阻害剤との同時添加によるα－ＮＡＧＡ変異体酵素活性の向上効果〕
　（ファブリー病モデルマウス由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪとの同時添加）
　ファブリー病モデルマウス由来培養線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清と抗生物質を加えたＤＭＥＭ培地を用いて、５％二酸化炭素の環境下において、３７℃で培養した。初めに、α－ＮＡＧＡ変異体の取り込み効率に対するＤＧＪの濃度依存性を解析した。細胞を１２ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。そして、１μｇ／ｍＬのα－ＮＡＧＡ変異体と様々な濃度（０、１、１０、１００、５００μＭ）のＤＧＪを添加した１０％ウシ胎児血清と抗生物質を含むＦ－１０培地に交換し、２４時間培養した。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄した後、トリプシンを用いて細胞を処理し回収した。回収した細胞にComplete Mini（Roche）を添加した２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６．０）を加え、超音波処理した。そのホモジネートを４℃、１２，０００ｒｐｍの条件で遠心分離し、上清液を酵素活性測定、タンパク質定量、ウェスタンブロットの試料とした。
　（ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪとの同時添加）
　ファブリー病患者由来培養線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清と抗生物質を加えたＦ－１０培地を用いて、５％二酸化炭素の環境下において、３７℃で培養した。初めに、α－ＮＡＧＡ変異体の取り込み効率に対するＤＧＪの濃度依存性を解析した。細胞を１２ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。そして、１μｇ／ｍＬα－ＮＡＧＡ変異体と様々な濃度（０、１、１０、１００μＭ）のＤＧＪを添加した培地に交換し、２４時間培養した。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄した後、トリプシンを用いて細胞を処理し回収した。回収した細胞にComplete Mini（Roche）を添加した２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ６．０）を加え、超音波処理した。そのホモジネートを４℃、１２，０００　ｒｐｍの条件で遠心分離し、上清液を酵素活性測定、タンパク質定量、ウェスタンブロットの試料とした。
　続いて、時間依存性を確認するために、細胞に１μｇ／ｍＬ α－ＮＡＧＡ変異体と１０μＭ　ＤＧＪを添加し、２４、４８、及び７２時間培養した。そして、酵素活性測定、タンパク質定量及びウェスタンブロットを行った。
　（酵素活性測定）
　５ｍＭ 基質、１１７ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を０．１Ｍ クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ ４．６）に溶解した溶液を、基質溶液とした。４０μｌ基質溶液に１０μｌホモジネートを添加し、３７℃で３０分間反応させた。酵素反応後、９４０μｌの０．２Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ １０．７）を添加し、反応を停止させた。そして、遊離した４－メチルウンベリフェロンをWallac 1420 ARVO MX Multilabel Counter（Perkin Elmer, Waltham, MA）を用いて、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定した。
　（タンパク質定量）
　牛血清アルブミン（Alubumin standard: Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）の濃度を基準として、Micro BCA法（Micro BCA (商標) Protein Assay Reagent Kit: Pierce）で行った。測定においては、試料をＭｉｌｌｉＱ水で希釈した後に、等量のＭｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標）試薬を添加し、６０℃で１時間反応させた。そして室温まで冷まし、ＯＤ５６０を測定した。
　（ウェスタンブロット）
　タンパク質を含む分析試料に、サンプル緩衝液（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、２％ ＳＤＳ、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１．５％ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を加え、９８℃で５分間熱処理した。この試料を、５－２０％ビス－トリスポリアクリルアミドゲル（ｅ－ＰＡＧＥＬ（登録商標）５～２０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ；ＡＴＴＯ）にアプライし、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳランニング緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ）を用いて、定電流で８３分間電気泳動を行った。その後、ＴＥ７７ＰＷＲ（ＧＥ Healthcare）を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写にした。転写終了後、ＰＶＤＦ膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水（５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４））、１００ｍＭ 塩化ナトリウム）で６０分間ブロッキングした後に、ブロッキング緩衝液で５００倍に希釈した抗ヒトＮＡＧＡウサギポリクローナル抗体（一次抗体）を加え、４℃で一晩反応させた。一次抗体との反応後のＰＶＤＦ膜は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水を用いて５分間の洗浄を３回行った後に、ブロッキング緩衝液で５０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧヤギＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗体（ＨＲＰ標識二次抗体）（GE Healthcare）を加え、室温で１時間反応させた。二次抗体との反応後のＰＶＤＦ膜は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水を用いて５分間の洗浄を３回行った後に、EzWestLumi plus発色試薬（ＡＴＴＯ）を加え、室温で１分間反応させた。その後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（GE Healthcare）を用いて、発光を検出した。
　ＧＡＰＤＨの検出では、一次抗体にブロッキング緩衝液で５０００倍に希釈した抗ＧＡＰＤＨマウスモノクローナル抗体（ＭＢＬ）を、二次抗体にブロッキング緩衝液で５０００倍に希釈した抗マウスＩｇＧヤギＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗体（GE Healthcare）を使用した。結果を図５に示す。図５は、ファブリー病モデルマウス由来培養線維芽細胞へα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性を示す図である。図６は、ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性及び酵素の取り込み量を示す図である（図中、m. NAGAはα－ＮＡＧＡ変異体を、Wildはコントロールとして健常者由来培養線維芽細胞を、Fabryはファブリー病患者由来培養線維芽細胞をそれぞれ示す）。ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へα－ＮＡＧＡ変異体と各濃度のＤＧＪとを同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性を図６の（ａ）に示し、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素の取り込み量を図６の（ｂ）に示す。
図７は、ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪの同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性及び酵素の取り込み量の経時的変化を示す図である（図中、m. NAGAはα－ＮＡＧＡ変異体を示す）。ファブリー病患者由来培養線維芽細胞へのα－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪの同時添加したときの、α－ＮＡＧＡ変異体の酵素活性の経時的変化を図７の（ａ）に示し、酵素の取り込み量の経時的変化を図７の（ｂ）に示す。
　このように、α－ＮＡＧＡ変異体とＤＧＪとの同時添加によって、α－ＮＡＧＡ変異体酵素活性が向上した。また、細胞に取り込まれたα－ＮＡＧＡ変異体のタンパク質量はＤＧＪを同時添加することで添加なしの場合よりも増加していることが確認された。
　本発明は、ファブリー病の治療に利用することができる。

Claims (10)

  1. 　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質と、
    　活性部位特異的シャペロンと、
    を含む、ファブリー病治療用医薬の組合せ物であって、
    　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
    （ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
    　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
    　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、ファブリー病治療用医薬の組合せ物。
  2. 　前記（ａ）のタンパク質は、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシンに置換されたものであり、
    　前記（ｃ）のタンパク質は、前記第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、前記第２０５番目のアミノ酸がロイシンに置換されている、請求項１に記載のファブリー病治療用医薬の組合せ物。
  3. 　前記活性部位特異的シャペロンは、前記タンパク質の可逆的競合阻害剤である、請求項１又は２に記載のファブリー病治療用医薬の組合せ物。
  4. 　前記活性部位特異的シャペロンは、１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）である、請求項１～３の何れか一項に記載の、ファブリー病治療用医薬の組合せ物。
  5. 　タンパク質の安定性を高めるための安定性向上剤であって、
    　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
    　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
    　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
    　前記安定性向上剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
    からなる群から選択される化合物を含む、安定性向上剤。
  6. 　ファブリー病治療用薬剤であって、
    　α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）と併用されるものであり、
    　（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
    　（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質；
    　前記ファブリー病治療用薬剤は、α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
    からなる群から選択される化合物を含む、ファブリー病治療用薬剤。
  7. 　タンパク質の安定性を高める方法であって、
    　前記タンパク質を活性部位特異的シャペロンと接触させる工程を包含し、
    　前記タンパク質は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼのアミノ酸配列において変異を有し、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有する、タンパク質であって、以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのタンパク質（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を除く。）であり、
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第１９１番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列のうち、第１８番目～第４１１番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸に置換され第２０５番目のアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンに置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質
    （ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において前記置換部位のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつα－ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
    　前記活性部位特異的シャペロンは、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である、又は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（Ｉ）中、Ｒ０は、Ｈ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ３ －、－ＣＯＯＨ、炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のハロアルキル基、炭素数１～４のアルコキシ基、炭素数１～４のヒドロキシアルキル基、炭素数３若しくは４のシクロアルキル基、又はハロゲン基を表す）
    　α－アロ－ホモノジリマイシン、α－ガラクト－ホモノジリマイシン、α－１－Ｃ－ブチル－デオキシノジリマイシン、カリステジンＡ３、カリステジンＢ２、Ｎ－メチル－カリステジンＡ３及びＮ－メチル－カリステジンＢ２からなる群から選択される化合物である、タンパク質の安定性を高める方法。
  8. 　前記（ａ）のタンパク質は、第１８８番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第１９１番目のアミノ酸がロイシンに置換されたものであり、
    　前記（ｃ）のタンパク質は、前記第２０２番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換され、前記第２０５番目のアミノ酸がロイシンに置換されている、請求項７に記載のタンパク質の安定性を高める方法。
  9. 　前記活性部位特異的シャペロンは、前記タンパク質の可逆的競合阻害剤である、請求項７又は８に記載のタンパク質の安定性を高める方法。
  10. 　前記活性部位特異的シャペロンは、
    　１－デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）である、請求項７～９の何れか一項に記載の、タンパク質の安定性を高める方法。
PCT/JP2018/022679 2017-06-14 2018-06-14 ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用 WO2018230628A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/622,706 US20200115698A1 (en) 2017-06-14 2018-06-14 Pharmaceutical combination for treatment of fabry disease and use thereof
EP18818453.5A EP3639825A4 (en) 2017-06-14 2018-06-14 PHARMACEUTICAL ASSOCIATION FOR THE TREATMENT OF FABRY'S DISEASE AND ITS USE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-117266 2017-06-14
JP2017117266A JP7066157B2 (ja) 2017-06-14 2017-06-14 ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018230628A1 true WO2018230628A1 (ja) 2018-12-20

Family

ID=64660287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/022679 WO2018230628A1 (ja) 2017-06-14 2018-06-14 ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200115698A1 (ja)
EP (1) EP3639825A4 (ja)
JP (1) JP7066157B2 (ja)
WO (1) WO2018230628A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5507242A (en) 1995-03-10 1996-04-16 Leblanc; Brad J. Hand operated trolling motor control station
JP2003528799A (ja) * 1998-06-01 2003-09-30 マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー リソソームα−ガラクトシダーゼＡの増強方法
WO2007058381A1 (ja) 2005-11-18 2007-05-24 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research 基質特異性を変換した新規高機能酵素
WO2008143354A1 (ja) 2007-05-18 2008-11-27 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research 酵素補充療法用医薬組成物
JP2012102128A (ja) 2003-01-31 2012-05-31 Mount Sinai School Of Medicine Of New York Univ タンパク質欠損性障害の治療のための併用療法
JP2014528901A (ja) 2011-03-11 2014-10-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ファブリー病の治療用投薬レジメン

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5507242A (en) 1995-03-10 1996-04-16 Leblanc; Brad J. Hand operated trolling motor control station
JP2003528799A (ja) * 1998-06-01 2003-09-30 マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー リソソームα−ガラクトシダーゼＡの増強方法
JP2012102128A (ja) 2003-01-31 2012-05-31 Mount Sinai School Of Medicine Of New York Univ タンパク質欠損性障害の治療のための併用療法
JP2012107020A (ja) 2003-01-31 2012-06-07 Mount Sinai School Of Medicine Of New York Univ タンパク質欠損性障害の治療のための併用療法
WO2007058381A1 (ja) 2005-11-18 2007-05-24 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research 基質特異性を変換した新規高機能酵素
WO2008143354A1 (ja) 2007-05-18 2008-11-27 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research 酵素補充療法用医薬組成物
JP2014528901A (ja) 2011-03-11 2014-10-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド ファブリー病の治療用投薬レジメン

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
CLARK, NE. ET AL.: "Pharmacological chaperones for human alpha-N-acetylgalactosaminidase", PNAS, vol. 109, no. 43, 2012, pages 17400 - 17405, XP055564877 *
ISHII, S.: "Pharmacological chaperone therapy for Fabry disease", PROC. JPN. ACAD., vol. 88, no. 1, 2012, pages 18 - 30, XP055171870 *
LENDERS M ET AL., J AM SOC NEPHROL., vol. 27, 2016, pages 256 - 64
See also references of EP3639825A4
TAJIMA Y ET AL., AM J HUM GENET., vol. 85, 2009, pages 569 - 80
WARNOCK D ET AL., PLOS ONE, vol. 10, 2015, pages e0134341

Also Published As

Publication number Publication date
EP3639825A1 (en) 2020-04-22
EP3639825A4 (en) 2021-03-03
JP2019001744A (ja) 2019-01-10
US20200115698A1 (en) 2020-04-16
JP7066157B2 (ja) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5507242B2 (ja) 酵素補充療法用医薬組成物
JP4368925B2 (ja) 基質特異性を変換した新規高機能酵素
TWI430805B (zh) 使用ｆｇｆ２３融合多肽之方法及組合物
JP6709733B2 (ja) 内在化部分
KR20100118126A (ko) Ｋｌｏｔｈｏ-ｆｇｆ 융합 폴리펩티드를 사용하는 방법 및 조성물
JP2018516566A (ja) 病的石灰化状態を治療するための組成物およびそれを使用する方法
ES2339683T3 (es) Diagnostico y tratamiento de canceres de celulas mieloides y linfoides.
KR101535791B1 (ko) 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도
JP5678664B2 (ja) ヒトβ−ヘキソサミニダーゼＢの基質特異性を変換した新規高機能酵素
WO2018230628A1 (ja) ファブリー病治療用医薬の組合せ物及びその利用
JP5959114B2 (ja) リン酸化糖鎖を含有する組換えヒトサポシンｂタンパク質及びその用途
WO2024115767A1 (en) Nomacopan-pas fusion proteins
JP2023515827A (ja) 房水流出を高め、眼圧を減少させる方法
JPWO2002064770A1 (ja) 新規スカベンジャー受容体クラスａ蛋白質
JP2003169683A (ja) 新規脱共役蛋白質ｍｔ００２９

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18818453

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018818453

Country of ref document: EP

Effective date: 20200114