WO2018207889A1 - α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物およびその使用 - Google Patents

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野田　秀夫
真司 ▲濱▼
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関西化学機械製作株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism and use thereof.
  • Soy molasses generated in the industrial processing process of soybeans is usually handled as waste.
  • Soybean molasses contains oligosaccharides such as raffinose and stachyose.
  • raffinose and stachyose are oligosaccharides containing ⁇ -1,6-linked galactose residues.
  • ⁇ -Galactosidase is known as an enzyme that hydrolyzes this bond (Non-patent Document 1).
  • many microorganisms cannot degrade these oligosaccharides.
  • yeast that presents proteins such as enzymes on the cell surface has been created.
  • proteins displayed on the surface-displaying yeast include lipases, amylases (glucoamylase, ⁇ -amylase, etc.), and cellulases (endoglucanase, cellobiohydrolase, ⁇ -glucosidase, etc.).
  • Such surface-displaying yeast is used for the production of biodiesel or bioethanol (Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of degrading oligosaccharides via ⁇ -1,6 bonds such as raffinose and stachyose which may be present in soybean molasses.
  • the present invention provides a transformed microorganism that displays ⁇ -galactosidase on the surface.
  • the ⁇ -galactosidase is C-type ⁇ -galactosidase (AglC).
  • the microorganism has an alcohol fermentation ability.
  • the microorganism is a yeast.
  • the yeast belongs to the genus Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, or Candida.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • the microorganism is a lactic acid bacterium.
  • the transformed microorganism is an inactivated microorganism.
  • the present invention provides an enzyme agent containing the transformed microorganism.
  • the present invention provides a method for producing alcohol, the method comprising: The method comprises culturing the transformed microorganism having an alcohol fermentation ability in a medium containing a material containing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose.
  • the alcohol is ethanol.
  • the present invention provides a method for saccharifying a material comprising an oligosaccharide comprising ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose, the method comprising: A step of allowing the transformed microorganism and / or the enzyme agent to coexist with a material containing an oligosaccharide containing the ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose.
  • the present invention provides a method for producing lactic acid, the method comprising: A step of obtaining a saccharified material by causing the transformed microorganism and / or enzyme agent to coexist with a material containing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose, and a medium containing the saccharified material The step of culturing lactic acid bacteria.
  • the present invention provides a method for producing lactic acid, the method comprising: A step of culturing the transformed microorganism which is the lactic acid bacterium in a material containing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose.
  • the oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose includes at least one sugar of raffinose, stachyose, melibiose, and verbusose.
  • a surface layer-presenting microorganism capable of hydrolyzing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose which may be present in soybean molasses.
  • soybean molasses can be utilized as a sugar raw material for microorganisms.
  • 2 is a graph showing ethanol fermentation by culturing ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast in a liquid medium containing raffinose.
  • 2 is a graph showing ethanol fermentation by culturing ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast in a liquid medium containing stachyose.
  • 2 is a graph showing ethanol fermentation by cultivating ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast in a liquid medium containing melibiose.
  • 2 is a graph showing ethanol fermentation by cultivating ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast in a liquid medium containing soybean molasses.
  • 3 is a graph showing the time-dependent variation of the activity of ⁇ -galactosidase displayed on the surface of yeast at 50 ° C. It is a graph which shows the total sugar concentration of the monosaccharide and sucrose before and behind the said incubation at the time of repeating incubation for 2 hours at 50 degreeC with galactosidase surface display yeast soybean molasses. It is a graph which shows the change of the quantity of a stachyose, raffinose, and deemed galactose when freeze-dried surface layer display yeast coexists at 50 degreeC in the liquid culture medium containing soybean molasses.
  • 2 is a graph showing lactic acid fermentation by culturing lactic acid bacteria displaying ⁇ -galactosidase surface layer in a liquid medium containing raffinose.
  • 2 is a graph showing lactic acid fermentation by culturing lactic acid bacteria displaying ⁇ -galactosidase surface layer in a liquid medium containing soybean molasses.
  • ⁇ -Galactosidase has an action of cleaving ⁇ -1,6 bonds between constituent sugars of galactose-containing oligosaccharides such as raffinose and stachyose (Non-patent Document 1).
  • ⁇ -Galactosidase also cleaves the ⁇ -1,6 bond between p-nitrophenyl and D-galactose in p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside.
  • the ⁇ -galactosidase to be presented is not particularly limited as long as it is an enzyme having an action of cleaving the ⁇ -1,6 bond as described above.
  • ⁇ -galactosidase has four types of A to D types, and any of them can be used. Preferably it is C type ("AglC").
  • the ⁇ -galactosidase can be derived from microorganisms such as, for example, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Phanerochaete, and examples of such microorganisms include Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae).
  • Non-Patent Document 1 Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus tamarii, Penicillium simplicissimum, Trichoderma reeree chrysosporium)
  • sequences of ⁇ -galactosidase and its encoding gene can be obtained by methods commonly used by those skilled in the art based on sequence information registered in institutions such as GenBank and NITE (DOGAN).
  • GenBank and NITE DOGAN
  • Aspergillus oryzae-derived C-type ⁇ -galactosidase also referred to as “AOAlgC”
  • AOAlgC Aspergillus oryzae-derived C-type ⁇ -galactosidase
  • a gene encoding ⁇ -galactosidase uses, for example, a primer pair (for example, SEQ ID NO: 3 and 4) designed based on its base sequence (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • a primer pair for example, SEQ ID NO: 3 and 4
  • SEQ ID NO: 3 and 4 designed based on its base sequence (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • a gene encoding ⁇ -galactosidase (eg, AOAlgC) is highly expressed against nucleic acids derived from the library using a probe designed based on its base sequence (eg, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1). By performing hybridization, it can be obtained as a nucleic acid fragment.
  • a gene encoding ⁇ -galactosidase (for example, AOAlgC) may be synthesized as a nucleic acid fragment by various nucleic acid sequence synthesis methods known in the art such as chemical synthesis methods.
  • the gene or polynucleotide used in the present specification consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the disclosed amino acid sequence, and the desired function or effect is substantially achieved in the present invention. It may encode a protein that it has. Any one type of amino acid mutation (for example, deletion, substitution or addition) relative to the disclosed amino acid sequence may be used, or two or more types may be combined. In addition, the total number of these mutations is not particularly limited, but is, for example, 1 or more and 10 or less, or 1 or more and 5 or less. Examples of amino acid substitution may be any substitution as long as each function or effect is substantially retained, and examples thereof include conservative substitutions.
  • conservative substitutions include the following: Substitution within the group (ie, between the amino acids shown in parentheses): (glycine, alanine), (valine, isoleucine, leucine), (aspartic acid, glutamic acid), (asparagine, glutamine), (serine, threonine) ), (Lysine, arginine), (phenylalanine, tyrosine).
  • the gene or polynucleotide has an amino acid sequence having, for example, 70% or more sequence identity to the disclosed amino acid sequence, and substantially exhibits the desired function or effect in the present invention. It may also encode a protein that it has. Sequence identity in the amino acid sequence can also be 74% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • sequence identity or similarity is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides determined by comparing sequences, as is known in the art. .
  • Sequence “identity” means between protein or polynucleotide sequences, as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. Means the degree of sequence invariance.
  • similarity refers to a protein or polynucleotide sequence as determined by alignment between protein or polynucleotide sequences, or in some cases by alignment between a series of partial sequences. It means the degree of correlation.
  • the method for determining identity and similarity is preferably a method designed to align the longest between the sequences to be compared. Methods for determining identity and similarity are provided as programs available to the public. For example, the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (Eg Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215: 403-410; Altschyl et al, Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3389-3402 ) Can be determined.
  • the conditions for using software such as BLAST are not particularly limited, but it is preferable to use default values.
  • the gene or polynucleotide may be one that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the disclosed base sequence.
  • the stringent condition refers to, for example, a condition where a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • a nucleic acid having high nucleotide sequence identity that is, a disclosed nucleotide sequence, for example, 70% or more, 75% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92% or more, 95%
  • a condition in which a complementary strand of a DNA comprising a base sequence having 98% or more identity or 99% or more identity is hybridized and a complementary strand of a nucleic acid having a lower homology is not hybridized.
  • the sodium salt concentration is, for example, 15 mM to 750 mM, 50 mM to 750 mM, or 300 mM to 750 mM
  • the temperature is, for example, 25 ° C. to 70 ° C., 50 ° C. to 70 ° C., or 55 ° C. to 65 ° C.
  • the concentration is 0% to 50%, 20% to 50%, or 35% to 45%.
  • the filter washing conditions after hybridization are such that the sodium salt concentration is, for example, 15 mM to 600 mM, 50 mM to 600 mM, or 300 mM to 600 mM, and the temperature is, for example, 50 ° C.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, after hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which the DNA is immobilized.
  • Examples thereof include DNA that can be obtained by washing the filter at 65 ° C. in an SSC solution having a concentration of 0.1 to 2 times (the composition of the SSC solution having a concentration of 1 is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate).
  • Hybridization can be performed, for example, by Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory (2001). The higher the temperature or the lower the salt concentration, the higher the stringency, and a polynucleotide with higher homology (sequence identity) can be isolated.
  • the gene or polynucleotide comprises a disclosed base sequence and, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 78% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 92 % Or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more of a nucleotide sequence having substantially the desired function or effect.
  • a base sequence encoding a predetermined amino acid sequence is substituted based on the degeneracy of the genetic code, and at least one base of the base sequence encoding the predetermined amino acid sequence is replaced with another base without changing the amino acid sequence of the protein.
  • the gene or polynucleotide used in the present invention also includes DNA having a base sequence altered by substitution based on the degeneracy of the genetic code.
  • the gene encoding ⁇ -galactosidase can be artificially synthesized, for example, by codon optimization depending on the host microorganism.
  • ⁇ -galactosidase surface display transformed microorganisms By transforming the host microorganism using a surface display cassette containing the ⁇ -galactosidase gene (described below), ⁇ -galactosidase surface display transformed microorganisms (simply “ ⁇ -galactosidase surface display microorganism”, “surface display microorganism”) Or “transformed microorganism”).
  • the host microorganism is not particularly limited, and examples thereof include yeast, lactic acid bacteria, filamentous fungi, corynebacterium, Escherichia coli, and Zymomonas. From the viewpoint of utilization in alcohol production, microorganisms having the ability to ferment alcohol (for example, ethanol) are preferred, and examples of such microorganisms include yeast and zymonas. From the viewpoint of utilization for lactic acid production, lactic acid bacteria are preferred.
  • yeast examples include the genus Saccharimyces, the genus Pichia, the genus Schizosaccharomyces, the genus Kluyveromyces, and the genus Candida. Yeast belonging to the genus Saccharomyces is preferred, and Saccharomyces cerevisiae is more preferred. Examples of Saccharomyces cerevisiae strains include, for example, Saccharomyces cerevisiae NBRC 1440 strain (available from the National Institute of Technology and Evaluation), Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain (Moukamnerd et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 88th).
  • yeast examples include the following strains: Pichia pastoris GS115 (manufactured by Invitrogen), Pichia anomala NBRC10213, Schizosaccharomyces pombe NBRC1628, Kluyveromyces lactis NBRC1267 and Kluyveromyces marxianus NBRC1777 (Yanase et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, Vol.
  • NBRC0988 strain (Tomita et al., PLoS One. 2012; 7 (5): e37226) (all NBRC strains are available from the National Institute of Technology and Evaluation Technology).
  • Lactic acid bacteria is a general term for bacteria that produce lactic acid from sugars by metabolism or fermentation. Lactic acid bacteria can be mainly classified into four types: bifidobacteria, enterococcus, lactobacilli, and streptococcus. Preferably, Lactobacillus bacteria can be used. Lactic acid bacteria include Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Pediococcus, or Leuconostoc The bacteria to which it belongs are listed.
  • lactic acid bacteria examples include Streptococcus thermophilus, Streptococcus cremoris, Streptococcus facilis, Streptococcus cilactus, Streptococcus cilactus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus binoseus, Lactobacillus obalacrubisca ), Lactobacillus Leishmanni, Lactobacillus mucicus (Lactobac illus musicus), Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium ⁇ Bongidobac terium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Pediococcus
  • Lactic acid bacteria also include sporic lactic acid bacteria.
  • the spore-forming lactic acid bacterium is a general term for the spore-forming lactic acid bacterium.
  • Examples of sporic lactic acid bacteria include bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • the spore-forming lactic acid bacteria belonging to the genus Bacillus can have heat resistance (for example, capable of growing under high heat such as 45 ° C.), a high fermentation rate, and a wide sugar utilization.
  • bacteria belonging to the genus Bacillus include Bacillus coagulans (also known as “Sporolactic acid bacterium”) and Bacillus lincheniformis.
  • Lactic acid bacteria may have been genetically modified.
  • a recombinant microorganism into which either L- or D-lactic acid synthase gene has been incorporated or destroyed can be mentioned.
  • genetically modified microorganisms include, for example, Lactobacillus plantarum ldhL1 :: amyA strain (Okano et al., Appl. Environ. Microbiol. 2009, Vol.75, 462-467), and Lactobacillus plantarum ⁇ ldhL1 :: PxylAB-xpk1: : tkt- ⁇ xpk2 :: PxylAB strain (Yoshida et al., “Appl.” Microbiol.
  • Lactobacillus plantarum ldhL1 amyA strain is a recombinant strain that secretes ⁇ -amylase and produces D-lactic acid from glucose.
  • Lactobacillus plantarum ⁇ ldhL1 PxylAB-xpk1 :: tkt- ⁇ xpk2 :: PxylAB strain Is a recombinant strain that produces D-lactic acid from both glucose and xylose.
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism is preferably a microorganism capable of fermenting alcohol or lactic acid using at least one of sucrose and galactose.
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism may use at least one of sucrose and galactose and glucose for fermentation.
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism may be further genetically modified so that, for example, galactose can be assimilated.
  • a surface layer display cassette for displaying ⁇ -galactosidase on the surface layer can be prepared.
  • the surface display cassette contains, in addition to the gene encoding ⁇ -galactosidase, DNA encoding a secretion signal and an anchor domain.
  • the surface display cassette can be placed between the promoter and the terminator.
  • As the anchor domain a cell surface localized protein or a cell membrane binding region thereof can be used.
  • Cell surface localized protein refers to a protein that is immobilized on, attached to, or adhered to the cell surface and is localized there. Proteins modified with lipids are known as cell surface localized proteins, and these lipids are immobilized on cell membranes by covalent bonding with membrane components.
  • Patent Documents 1 to 4 and Non-Patent Document 2 Yeast
  • Non-Patent Documents 3 to 6 Lactic Acid Bacteria
  • Non-Patent Document 7 Finiliform Fungus
  • Non-Patent Document 8 Corynebacterium
  • Non-Patent Document 4 E. coli
  • Non-Patent Document 9 Zymomonas
  • Cell surface display technologies relating to yeast may be those known to those skilled in the art, such as GPI anchors (Patent Documents 1, 3 and 4 and Non-Patent Document 2) of cell surface localized proteins, or sugar chain binding domains ( Patent Documents 2 and 3) can be used.
  • GPI glycosyl phosphatidyl inositol: ethanolamine phosphate-6 mannose ⁇ -1,2 mannose ⁇ -1,6 mannose ⁇ -1,4 glucosamine ⁇ -1,6 inositol phospholipid A glycolipid having a basic structure
  • the GPI anchor protein has GPI which is a glycolipid at its C-terminal, and this GPI is bound to the cell membrane surface by covalently binding to PI (phosphatidyl tinositol) in the cell membrane.
  • Examples of cell surface display technology using GPI anchors include a method using a surface layer display cassette containing recombinant DNA comprising DNA encoding a secretory signal peptide-target gene-DNA encoding a GPI anchor adhesion recognition signal. . Binding of GPI to the C-terminus of the GPI anchor protein is performed as follows. The GPI anchor protein is secreted into the endoplasmic reticulum lumen by the action of a secretory signal present on the N-terminal side after transcription and translation. A region called a GPI anchor attachment signal that is recognized when the GPI anchor binds to the GPI anchor protein is present at the C-terminal of the GPI anchor protein or in the vicinity thereof. In the endoplasmic reticulum lumen and the Golgi apparatus, this GPI anchor attachment signal region is cleaved, and GPI binds to the newly generated C-terminus.
  • the protein to which GPI is bound is transported to the cell membrane by secretory vesicles, and is fixed to the cell membrane by GPI covalently binding to PI of the cell membrane. Further, the GPI anchor is cleaved by phosphatidylinositol-dependent phospholipase C (PI-PLC), and is incorporated into the cell wall so that it is fixed to the cell wall and presented on the cell surface.
  • PI-PLC phosphatidylinositol-dependent phospholipase C
  • a polynucleotide encoding the entire GPI anchor protein, which is a cell surface localized protein, or a region including a GPI anchor adhesion signal region, which is a cell membrane binding region thereof, can be used.
  • the cell membrane binding region (GPI anchor attachment signal region) is usually a region on the C-terminal side of the cell surface localized protein.
  • the cell membrane binding region only needs to contain a GPI anchor attachment signal region, and may contain any other part of the GPI anchor protein as long as the enzyme activity of the fusion protein is not inhibited.
  • the GPI anchor protein may be any protein that functions in yeast cells.
  • GPI anchor proteins include ⁇ - or a-agglutinin (AG ⁇ 1, AGA1), TIP1, FLO1, SED1, CWP1, and CWP2.
  • SED1 is a major cell surface localized protein in the stationary phase of the yeast Saccharomyces cerevisiae, and this gene is based on, for example, sequence information registered in GenBank and a method commonly used by those skilled in the art. (GenBank accession number NM_001180385; NCBI Gene ID: 851649).
  • a GPI anchor attachment recognition signal sequence present in a 320 amino acid sequence counted from the C-terminus of yeast ⁇ -agglutinin can also be used as the anchor domain.
  • a polynucleotide comprising a coding sequence of a secretory signal—a structural gene encoding a cell surface localized protein—a coding sequence of a GPI anchor attachment recognition signal
  • all or a part of the structural gene encodes ⁇ -galactosidase Can be replaced with a gene.
  • Cell surface display technology using a sugar chain binding domain includes, for example, binding an enzyme to the N-terminal side, C-terminal side, or both the N-terminal side and C-terminal side of a cell surface localized protein (aggregation functional domain)
  • aggregation functional domain The method of using the surface layer display cassette containing the made recombinant DNA is mentioned.
  • the enzyme expressed from this recombinant DNA and secreted outside the cell membrane can remain on the cell surface layer when a plurality of sugar chains of the sugar chain binding domain interact with sugar chains in the cell wall.
  • the aggregation functional domain include sugar chain binding sites such as a lectin and a lectin-like protein, and typically include an aggregation functional domain of a GPI anchor protein.
  • anchor proteins for surface display cassettes: for lactic acid bacteria, the CA domain of peptidoglycan binding protein AcmA and the poly- ⁇ -glutamate biosynthetic enzyme complex (PgsBCA) complex derived from Bacillus subtilis Subunit PgsA protein (Non-Patent Documents 3 to 6); As for filamentous fungi, Aspergillus oryzae-derived CWP anchor and MP1 anchor (membrane-bound protein) (Non-patent document 7); For Corynebacterium, Corynebacterium -Porin (cell wall binding protein) derived from Corynebacterium glutamicum (Non-patent Document 8); For Escherichia coli, PgsA protein described in the above lactic acid bacteria (Non-patent Document 4); and for Zymomonas, Pseudomonas Syringae (Pseudomonas syringae) anchoring area in the ice
  • the secretory signal is not particularly limited, and may be a secretory signal of the ⁇ -galactosidase to be displayed, a secretory signal sequence of a cell surface localized protein, or other enzyme capable of guiding the enzyme to the outside of the cell.
  • the secretion signal may be. If the enzyme activity is not affected, a part or all of the secretory signal sequence and pro-sequence may remain at the N-terminus after cell surface display.
  • any promoter and terminator can be used.
  • the promoter DNA may be that of the gene itself intended for expression or may be derived from another gene.
  • the promoter and terminator of the gene which codes the cell surface localization protein used as an anchor domain may be sufficient.
  • SED1 when SED1 is used for the anchor domain, the same SED1 promoter may be used.
  • SED1 when SED1 is used for the anchor domain, a terminator for ⁇ -agglutinin, which is another cell surface localized protein, may be used.
  • GAPDH glycosylcholine dehydrogenase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • PYK pyruvate kinase
  • TPI riose phosphate isomerase
  • the construction of the surface layer display cassette or the synthesis and binding of the recombinant DNA can be performed, for example, by a method commonly used by those skilled in the art.
  • a linker can be appropriately used as necessary.
  • the surface layer display cassette or the recombinant DNA may be incorporated into an expression vector.
  • the expression vector may appropriately contain factors such as a selection marker and an enhancer.
  • the expression vector is, for example, in the form of a plasmid.
  • a plasmid having an origin of replication (Ori) of 2 ⁇ m plasmid of yeast and an origin of replication of ColE1 is preferably used.
  • the plasmid preferably has a selection marker and a replication gene for Escherichia coli in terms of facilitating preparation of the plasmid and detection of the transformant. Examples of selectable markers include drug resistance genes and auxotrophic genes.
  • Examples of the drug resistance gene include, but are not limited to, an ampicillin resistance gene (Ampr) and a kanamycin resistance gene (Kanr).
  • Examples of auxotrophic genes include N- (5′-phosphoribosyl) anthranilate isomerase (TRP1) gene, tryptophan synthase (TRP5) gene, malate ⁇ -isopropyl dehydrogenase (LEU2) gene, imidazole glycerol phosphate dehydration
  • Specific examples include, but are not limited to, the elementary enzyme (HIS3) gene, the histidinol dehydrogenase (HIS4) gene, the dihydroorotic acid dehydrogenase (URA1) gene, and the orotidine-5-phosphate decarboxylase (URA3) gene.
  • a replication gene for yeast can be selected as necessary. In the case of other microorganisms, vectors, factors and the like well known to those skilled in the art can be used.
  • the method for introducing the surface display cassette or recombinant DNA into the host is not particularly limited. Examples thereof include a lithium acetate method, an electroporation method, and a protoplast method.
  • Transformed microorganisms can be selected using a selection marker.
  • the fact that ⁇ -galactosidase is displayed on the surface of microorganisms can be confirmed, for example, using an antibody against the enzyme. Alternatively, it can be confirmed by activity evaluation using a synthetic substrate p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside.
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism may be one in which the microorganism itself is inactivated (for example, metabolic function or fermentation ability is lost).
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying microorganism can be inactivated by, for example, heat treatment (for example, by heating, cryopreservation, freeze-drying, low-temperature drying, or the like). For example, even when the surface layer-presenting microorganism is inactivated in this way, the displayed ⁇ -galactosidase can still maintain the activity.
  • the surface layer-presenting microorganism thus inactivated can be used as an ⁇ -galactosidase enzyme agent.
  • the enzyme agent include ⁇ -galactosidase surface-presenting microorganism and a suspension containing a medium capable of maintaining the surface-presenting microorganism, and a heat-treated one of the surface-presenting microorganism (for example, heating, cryopreservation, lyophilization, And a method such as low temperature drying).
  • the surface layer-presenting microorganism may be fixed to a carrier.
  • the surface layer-presenting microorganism may be fixed to a carrier. This enables reuse in the method described below.
  • the carrier and method for immobilization those commonly used by those skilled in the art are used.
  • the fixing method include a carrier binding method, a comprehensive method, and a crosslinking method.
  • a porous body is preferably used as the carrier.
  • foams or resins such as polyvinyl alcohol, polyurethane foam, polystyrene foam, polyacrylamide, polyvinyl formal resin porous body, and silicon foam are preferable.
  • the size of the opening of the porous body can be determined in consideration of the microorganism to be used and its size, but in the case of a practical yeast, it is preferably within the range of 50 to 1000 ⁇ m.
  • the shape of the carrier does not matter. Considering the strength of the carrier, the culture efficiency, etc., a spherical shape or a columnar shape (for example, a cubic shape) is preferable.
  • the size may be determined according to the microorganism to be used. In general, the diameter is preferably 2 to 50 mm for a spherical shape, and 2 to 50 mm square for a columnar shape.
  • the manufacturing method of alcohol using surface layer display microorganisms is provided.
  • the surface layer-presenting microorganism has alcohol fermentation ability.
  • the alcohol production method includes a step of culturing a surface layer-presenting microorganism having alcohol fermentation ability in a medium containing a material containing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose.
  • the number of sugars of an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose is, for example, 2 to 5, preferably 2 to 4, more preferably 3 to 4. It is.
  • oligosaccharides containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose include raffinose, stachyose, melibiose, and Verbasse.
  • Raffinose is an oligosaccharide (trisaccharide) in which sucrose glucose and galactose are linked by ⁇ -1,6.
  • Stachyose is an oligosaccharide (tetrasaccharide) in which another galactose is ⁇ -1,6-linked to raffinose galactose.
  • Melibiose is an oligosaccharide (disaccharide) in which galactose is ⁇ -1,6-linked to glucose.
  • Verbasse is an oligosaccharide (pentasaccharide) in which another galactose is ⁇ 1,6-linked to stachyose galactose.
  • “Oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose” includes, for example, raffinose, stachyose, melibiose, or verbusose, or a mixture of two or more thereof.
  • the ⁇ -galactose-containing oligosaccharide comprises at least one sugar of raffinose, stachyose, melibiose and verbusose.
  • a process of culturing a microorganism and producing alcohol by the fermentation action of the microorganism is also referred to as an “alcohol fermentation process”.
  • a material used as a sugar raw material in the alcohol fermentation process is also referred to as a “fermentation substrate”.
  • the alcohol is ethanol.
  • the alcohol fermentation process includes a material containing an ⁇ -galactose-containing oligosaccharide as a “fermentation substrate”, but may further include a saccharide other than the oligosaccharide (eg, glucose, sucrose, etc.).
  • a saccharide other than the oligosaccharide eg, glucose, sucrose, etc.
  • ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing materials are oligosaccharides alone or oligosaccharides and other components. Includes both mixtures.
  • the “ ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material” includes at least one sugar of sugars corresponding to the ⁇ -galactose-containing oligosaccharide (for example, raffinose, stachyose, melibiose, and verbusose).
  • the material containing “at least one of raffinose, stachyose, melibiose and bellvas course” means a material containing any of raffinose, stachyose, melibiose or bellbass course, and combinations of two or more thereof Any of these are included. Since oligosaccharides containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose, such as raffinose, stachyose, melibiose and vervasose, are oligosaccharides contained in soybeans, they are also called “soy oligosaccharides”.
  • “Materials containing oligosaccharides comprising ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose” encompass both soy-derived materials and non-soy-derived materials.
  • the “material containing an oligosaccharide containing ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose” may contain a saccharide other than an ⁇ -galactose-containing oligosaccharide, and is the saccharide other than the oligosaccharide a monosaccharide? Regardless of whether it is a disaccharide or higher oligosaccharide, examples include sucrose and galactose.
  • soybean-derived material preferably soybean molasses can be used as the soybean-derived material.
  • Soy molasses is soy solubles and can be recovered from insolubles of soy, for example by washing with alcohol or acid.
  • the “soy molasses” may be a waste generated in a soybean processing process, and an oligosaccharide containing ⁇ -galactose having ⁇ -1,6-linked ⁇ -galactose from a soybean soluble product generated in the soybean processing process (for example, And raffinose, stachyose, melibiose or velvia course, or a mixture thereof).
  • the alcohol fermentation step can be performed under normal conditions for performing fermentation or microbial culture therefor.
  • Liquid culture is preferred.
  • Such fermentation can be performed, for example, in a suitable fermenter.
  • the alcohol fermentation medium may further contain components necessary or desirable for the growth of the microorganism used.
  • the temperature during the reaction in the alcohol fermentation process may depend on the microorganism used, but may be, for example, 30 ° C. to 37 ° C., preferably 30 ° C. to 35 ° C.
  • the fermentation pH is, for example, 4 to 8, preferably 5 to 7.
  • the fermentation culture can be performed anaerobically (the dissolved oxygen concentration can be, for example, 1 ppm or less, more preferably about 0.3 ppm or less, and even more preferably 0.1 ppm or less).
  • Examples of the alcohol fermentation process include a batch process, a fed batch process, a repeated batch process, a continuous process, and the like, and any of these may be used.
  • the amount of microorganism input (the concentration of microorganisms at the start of fermentation), the initial charge of the fermentation substrate and, if necessary, the additional charge and timing, and the fermentation time are the type and state of the substrate, the capacity of the fermentation culture, It can be appropriately determined depending on requirements such as the target production amount of fermented ethanol.
  • the yeast cell concentration at the start of fermentation is, for example, 2 g (wet weight) / L to 50 g (wet weight) / L (1 ⁇ 10 7 pieces / mL to 2.5 ⁇ 10 8 pieces / mL), preferably 4 g (wet weight) / L to 20 g (wet weight) / L (2 ⁇ 10 7 pieces / mL to 1 ⁇ 10 8 pieces / mL).
  • the initial charge amount is, for example, 5 (w / v)% to 50 (w / v)%, preferably 10 (w / v)% to 25 (with respect to the fermentation broth (total of medium and cells used for fermentation). w / v)%.
  • the additional input amount and timing of the fermentation substrate may be determined while monitoring the viscosity of the fermentation medium, the amount of alcohol produced, or the amount of carbon dioxide generated due to the progress of fermentation.
  • a medium containing alcohol for example, ethanol
  • ethanol is isolated by a separation process commonly used by those skilled in the art, such as a separation operation using a centrifuge and a distillation operation.
  • the surface layer-presenting microorganisms used for fermentation can also be recovered by, for example, solid-liquid separation (for example, centrifugation, filtration, etc.) and reused.
  • ⁇ -galactose-containing oligosaccharides eg, raffinose, stachyose, melibiose or verbose course
  • ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material eg, raffinose, stachyose, melibiose or verbose course
  • a saccharide having a smaller number of sugars such as sucrose (disaccharide) or galactose (monosaccharide) can be produced (also referred to as “saccharification” in the present specification).
  • the present invention provides a method for saccharification of a soybean oligosaccharide-containing material, and this method comprises a step of allowing an ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material to coexist with a transformed microorganism and / or an enzyme agent.
  • a “saccharified material” is obtained after this coexistence step. In this specification, this coexistence process is also referred to as a “saccharification process”.
  • the “saccharified material” can include at least one sugar such as, for example, galactose, sucrose, fructose, glucose and the like.
  • the coexistence conditions for example, temperature, pH, time, etc.
  • the coexistence conditions can be determined according to the amount of the ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material to be used, the amount of the transformed microorganism or enzyme agent, the property of the surface-presenting microorganism, and the like.
  • the transformed microorganism is preferably inactivated in advance (for example, the metabolic function or fermentation ability is lost).
  • the saccharified product of “ ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material” can be used, for example, in subsequent fermentation (eg, alcoholic fermentation, lactic acid fermentation, etc.) .
  • the saccharification product may be isolated or purified using means well known to those skilled in the art.
  • the surface layer-presenting microorganism used for saccharification can also be recovered by, for example, solid-liquid separation (for example, centrifugation, filtration, etc.) and reused.
  • This invention provides the manufacturing method of lactic acid, This method includes the said saccharification process and the culture
  • lactic acid bacteria can be cultured in a medium containing a product (saccharified material) produced by the saccharification process to produce lactic acid.
  • the present invention provides another method for producing lactic acid, wherein the method comprises ⁇ -galactosidase surface-displayed transformed lactic acid bacteria (“transformed lactic acid bacteria” or “surface-layer display” in a medium containing an ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material. A step of culturing lactic acid bacteria).
  • lactic acid fermentation process the process of culturing lactic acid bacteria or transformed lactic acid bacteria (surface-displaying lactic acid bacteria) and producing lactic acid by its fermentation action is also referred to as “lactic acid fermentation process”.
  • a material used as a sugar raw material in the lactic acid fermentation process is also referred to as a “lactic acid fermentation substrate”.
  • “Lactic acid fermentation substrate” includes “saccharified material” or “ ⁇ -galactose-containing oligosaccharide-containing material”, but further includes saccharides derived from other than these materials (eg, saccharides derived from a medium). It may be.
  • “Lactic acid bacteria” are as described above.
  • the lactic acid fermentation step can be performed under ordinary conditions for fermentation or lactic acid bacteria culture. Liquid culture is preferred. Such fermentation can be performed, for example, in a suitable fermenter.
  • the lactic acid fermentation medium can further contain components necessary or desirable for the growth of the microorganism to be used.
  • the lactic acid fermentation process is not particularly limited, and a normal lactic acid fermentation method can be used.
  • the pH for lactic acid fermentation varies depending on the type of microorganism to be used, the type of medium, and the culture conditions, and can be appropriately determined as necessary.
  • the fermentation pH is, for example, 4 to 8, preferably 5 to 7, and more preferably 5.5 to 6.8. It is preferred that the pH is adjusted over the duration of the fermentation process, as the pH can vary more acidic with the lactic acid produced. Fermentation culture can be performed anaerobically.
  • the culture of lactic acid bacteria or ⁇ -galactosidase surface-displayed transformed lactic acid bacteria may be any of batch culture, semi-batch culture, or continuous culture. Further, semi-batch culture or continuous culture in which only carbohydrates are added during culture may be used. The culture time varies depending on the strain used, the medium components, particularly the amount of carbohydrates, etc., but in the case of batch culture, for example, 0.5 days to 10 days, preferably 1 day to 7 days, more preferably 1 day. ⁇ 4 days. When continuous culture or semi-batch culture is performed, the culture period is not limited thereto. You may use a fermentation residue as a microbial bed. For example, after completion of one batch (batch) of fermentation, lactic acid-producing microorganisms contained in the fermentation residue may be used again for the next batch of fermentation.
  • the input amount of lactic acid bacteria or ⁇ -galactosidase surface-transformed lactic acid bacteria (“Bacterial concentration of lactic acid bacteria at the start of fermentation”), the initial amount of fermentation substrate and, if necessary, the additional amount and timing of the fermentation, and the fermentation time, It can be appropriately determined depending on the requirements such as the type and state of the substrate, the capacity of the fermentation culture, the target production amount of the fermented lactic acid.
  • the concentration of lactic acid bacteria at the start of fermentation is, for example, 0.01 g (wet weight) / L to 200 g (wet weight) / L (2 ⁇ 10 6 cells / mL to 4 ⁇ 10 10 cells / mL), preferably 5 g (wet weight) / L to 100 g (wet weight) / L (1 ⁇ 10 9 pieces / mL to 2 ⁇ 10 10 pieces / mL).
  • the initial charge amount is, for example, 1 (w / v)% to 99 (w / v)%, preferably 5 (w / v)% to 90% with respect to the fermentation broth (total of the medium and cells used for fermentation). (W / v)%.
  • the additional input amount and timing of the fermentation substrate may be determined while monitoring the viscosity of the fermentation medium, the amount of lactic acid produced or the amount of carbon dioxide generated due to the progress of fermentation.
  • the temperature of the fermentation culture can be set in consideration of the culture conditions such as the temperature at which the lactic acid-producing microorganism used grows and the action temperature of the added enzyme. For example, it can be set to 25 ° C. to 45 ° C., or 30 ° C. to 40 ° C., or 35 ° C. to 37 ° C., but may be higher or lower depending on the lactic acid-producing microorganism used.
  • the lactic acid-producing microorganism to be used is a heat-resistant microorganism such as a spore-forming lactic acid bacterium, it can be set to a higher temperature, for example, a temperature around 45 ° C.
  • Lactic acid can be recovered in the form of lactic acid or lactic acid alkali salt by removing the cells from the culture solution after culturing.
  • the method for recovering lactic acid from the culture solution is not particularly limited, and a known method can be used. For example, the method of international publication 2007/114017 is mentioned. In addition, it is adsorbed on an ion exchange resin, washed and then eluted; a method in which an ester is formed by reacting with an alcohol (for example, methanol, ethanol, etc.) under addition of sulfuric acid; and insoluble lactic acid such as magnesium salt; Examples thereof include a method of recovering and purifying as a salt.
  • the production of lactic acid includes the production of products containing lactic acid.
  • the fermentation liquid may be recovered as it is, or lactic acid may be recovered together with the bacterial cells and / or fermentation residue (for example, sugar).
  • a product for example, feed
  • lactic acid bacteria produced by fermentation of lactic acid bacteria, lactic acid bacteria and fermentation residue after culturing lactic acid bacteria or transformed lactic acid bacteria is used as a product containing lactic acid.
  • Alcohol for example, ethanol
  • lactic acid and the like produced by the method of the present invention can be used as a material for producing foods, pharmaceuticals and various industrial products.
  • AglC cDNA (“AOAglC”) encoding ⁇ -galactosidase of Aspergillus oryzae was obtained.
  • PCR was performed using the Aspergillus oryzae genomic DNA as a template and the primer pairs of SEQ ID NOS: 3 and 4.
  • PAUR101 (Takara Bio Inc.) was used as a vector to be introduced into yeast. Saccharomyces cerevisiae SED1 promoter (SEQ ID NO: 5), secretion signal (SEQ ID NO: 6; its amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 7), AOAglC (SEQ ID NO: 8; its amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 9), Saccharomyces.
  • a surface display cassette in which a gene sequence is arranged in the order of a cerevisiae SED1 anchor (SEQ ID NO: 10; its amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 11) and a terminator of Saccharomyces cerevisiae ⁇ -agglutinin (SEQ ID NO: 12) is represented by SmaI of pAUR101.
  • SmaI of pAUR101 was inserted into the cloning site by In-Fusion enzymatic reaction.
  • the resulting plasmid was named pAUR101-SED1p-AOAglC-SED1-SAG1t.
  • This pAUR101-SED1p-AOAglC-SED1-SAG1t was cleaved with StuI, and transformed into Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain using YAST MAKER yeast transformation system (Clontech® Laboratories, Palo® Alto, California, USA), and Aureobasidin A A (Aureobasidin A) resistant strain was obtained, and ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast was obtained.
  • Example 2 Performance evaluation of ⁇ -galactosidase surface display yeast
  • Example 2 Performance evaluation of ⁇ -galactosidase surface display yeast
  • 2-1 Evaluation of ⁇ -galactosidase activity using synthetic substrate p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast obtained in Example 1 was reacted for 10 minutes at 30 ° C. in the presence of 1 mM p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside. Thereafter, the absorbance was measured at 400 nm, and the ⁇ -galactosidase titer (U / g) was calculated from the measured value.
  • the vertical axis indicates the concentration of ethanol and raffinose (g / L), and the horizontal axis indicates the culture time (hours).
  • Each symbol in the figure represents the following: filled diamonds indicate the ethanol concentration (“EtOH-TJ”) of wild-type yeast (Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain), and filled squares indicate the ethanol concentration of the surface-displayed yeast (“EtOH-TJ”).
  • white diamonds indicate the raffinose concentration of wild-type yeast (" Raffinose-TJ ")
  • open squares indicate the raffinose concentration of surface-displayed yeast (“ Raffinose-TJ-AOAglC ").
  • raffinose did not decrease until the end of culture, whereas in surface-displayed yeast, raffinose decreased to almost zero after 7 hours of culture.
  • surface-displaying yeast was significantly increased over wild-type yeast.
  • ethanol production was also observed in wild-type yeast due to glucose, galactose, etc. in the liquid medium.
  • Example 1 was conducted under the same conditions as in Example 2-2 except that a YP liquid medium containing 50 g / L of stachyose (65% by weight of stachyose and 35% by weight of raffinose, sucrose, and galactose) was used.
  • the obtained ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast (20 g / L) was cultured, and the medium was collected at 2, 7, 22, 26, and 48 hours, and the concentration of the ethanol produced by fermentation and the remaining raffinose Concentration was measured.
  • FIG. The vertical axis shows the concentration of ethanol and stachyose (g / L), and the horizontal axis shows the culture time (hours).
  • Each symbol in the figure represents the following: filled diamonds indicate the ethanol concentration (“EtOH-TJ”) of wild-type yeast (Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain), and filled squares indicate the ethanol concentration of the surface-displayed yeast (“EtOH-TJ”).
  • white diamonds indicate the stachyose concentration of wild-type yeast (" Stakiose-TJ ")
  • white squares indicate the stachyose concentration of surface-displayed yeast (" Stakiose-TJ-AOAglC ").
  • stachyose did not decrease until the end of the culture, whereas in the surface-displayed yeast, the stachyose rapidly decreased by 7 hours after the culture.
  • surface-displaying yeast was significantly increased over wild-type yeast.
  • ethanol production was observed in the wild-type yeast due to glucose, fructose, sucrose, galactose or the like in the liquid medium.
  • FIG. The vertical axis shows the concentration of ethanol and melibiose (g / L), and the horizontal axis shows the culture time (hours).
  • Each symbol in the figure represents the following: filled diamonds indicate the ethanol concentration (“EtOH-TJ”) of wild-type yeast (Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain), and filled squares indicate the ethanol concentration of the surface-displayed yeast (“EtOH-TJ”).
  • -AOAglC ") white diamonds indicate the melibiose concentration of wild-type yeast (“ Melibiose-TJ ")
  • open squares indicate the melibiose concentration of the surface-displayed yeast (" Meribiose-TJ-AOAglC ").
  • melibiose did not decrease until the end of the culture, whereas in the surface-displayed yeast, the melibiose decreased to almost zero after 7 hours of culture.
  • surface-displaying yeast was significantly increased over wild-type yeast.
  • Example 3 Ethanol fermentation from soybean molasses
  • the ⁇ -galactosidase surface display yeast or wild type yeast (Saccharomyces cerevisiae TJ14 strain) 20 g (wet weight) / L obtained in Example 1 is placed in a Duran bottle in a YP liquid medium containing soybean molasses 800 g / L.
  • the culture was performed at 35 ° C. for 96 hours while stirring with a stirrer bar at 200 rpm.
  • the medium was collected at 2 hours, 7 hours, 22 hours, 26 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours, and the concentrations of ethanol produced by fermentation and the concentrations of remaining raffinose and stachyose were measured by HPLC.
  • FIG. The vertical axis shows the concentration (g / L) of ethanol, raffinose and stachyose, and the horizontal axis shows the culture time (hours).
  • Each symbol in the figure represents the following: filled diamonds are ethanol concentrations of wild-type yeast (“EtOH-WT”); filled squares are ethanol concentrations of surface-displayed yeast (“EtOH-AglC-present”); filled triangles are wild Raffinose concentration of type yeast (“Raffinose-WT”); cross-hatched raffinose concentration of surface-displayed yeast (“Raffinose-AglC-presentation”); rice symbol of stachyose concentration of wild-type yeast (“stachyose-WT”); The filled circle is the stachyose concentration of the surface-displayed yeast ("stachyose-AglC-presentation").
  • Example 4 Evaluation of thermal stability of ⁇ -galactosidase displayed on the surface of yeast
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast (about 0) obtained in Example 1 in the presence of 1 mM p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside. .77 ⁇ g / L (wet weight basis) was incubated at 50 ° C. for up to 168 hours, and the transition of ⁇ -galactosidase activity was examined.
  • FIG. 1 The vertical axis represents ⁇ -galactosidase activity (U / g wet cell weight), and the horizontal axis represents incubation time (hours). Solid diamonds show the results of ⁇ -galactosidase activity.
  • U ⁇ -galactosidase activity
  • incubation time hours.
  • Solid diamonds show the results of ⁇ -galactosidase activity.
  • yeast metabolism ie, ethanol fermentation production
  • Example 2 (4-2: Evaluation of sugar degradation in high-temperature batch culture using soybean molasses)
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast obtained in Example 1 was cultured in 100 mL of YPD medium (300 mL Erlenmeyer flask) at 30 ° C. and 150 rpm for 3 days. The yeast was then collected (5 minutes at 3500 rpm), washed once with water, adjusted to 200 g (wet weight) / L with water, and then incubated at 50 ° C. for 2 hours in a rotary thermostat.
  • YPD medium 300 mL Erlenmeyer flask
  • the yeast was then collected (5 minutes at 3500 rpm), washed once with water, adjusted to 200 g (wet weight) / L with water, and then incubated at 50 ° C. for 2 hours in a rotary thermostat.
  • soybean molasses, yeast (200 g (wet weight) / L) and water are mixed at a weight ratio of 500: 100: 400 (final concentration is soybean molasses 500 g / L, yeast 20 g (wet weight) / L).
  • Sampling was performed (“0 hour” of the “first time”), and further sampling was performed by incubation (heat treatment) at 50 ° C. for 2 hours in a rotary thermostat (“2 hours” of the “first time”).
  • the solution after heat treatment with soybean molasses was centrifuged at 3500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, and the yeast was recovered.
  • soybean molasses and water were added and sampled so that the concentration of soybean molasses was 500 g / L ("second time", "0 hour"), and further adjusted to 50 ° C in a rotary thermostat.
  • the sample was incubated for 2 hours (heat treatment) and sampled (“2 hours” of “second time”).
  • the total sugar concentration of monosaccharide and sucrose in each sample obtained by each sampling was quantified by HPLC.
  • FIG. 6 This result is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the total sugar concentration (g / L) of monosaccharide and sucrose
  • the horizontal axis represents the cycle ("first time” and "second time”).
  • first time first time
  • second time second time
  • results of post-sampling 2 hours
  • an increase in the total sugar concentration of monosaccharide and sucrose was observed after incubation at 50 ° C. for 2 hours.
  • oligosaccharides containing ⁇ -1,6-linked galactose such as raffinose and stachyose in soybean molasses are hydrolyzed by ⁇ -galactosidase displayed on the surface of yeast. It is suggested that sugars with a low number of sugars (for example, monosaccharides and sucrose) are produced, and the resulting sugars are not used by the yeast for fermentation.
  • the surface display yeast does not produce its metabolism (ie, ethanol fermentation production) at a high temperature such as 50 ° C., but the ⁇ -galactosidase displayed by the surface of the yeast is still active. It was found to maintain.
  • Example 5 Performance evaluation of lyophilized ⁇ -galactosidase surface layer display
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast obtained in Example 1 was lyophilized at 50 ° C. for 3 hours.
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast after lyophilization is hereinafter also referred to as “lyophilized surface-displaying yeast”.
  • FIG. 1 The result is shown in FIG.
  • the vertical axis shows the concentration of stachyose, raffinose and deemed galactose (g / L), and the horizontal axis shows the reaction time (hours) of incubation.
  • Each symbol in the figure is as follows: filled diamonds are stachyose concentrations (g / L); filled squares are raffinose concentrations (g / L); filled triangles are deemed galactose concentrations (g / L).
  • stachyose and raffinose decreased and an increase in galactose was observed.
  • the titer in soybean molasses is simply calculated from the decrease in stachyose and raffinose because galactose cannot be accurately quantified, stachyose contains two molecules of galactose, and stachyose can decompose into raffinose. Can not. Therefore, the minimum activity value of ⁇ -galactosidase was calculated from the reduction amount of stachyose alone, and was 432.8 U / g (reaction 10 minutes), and the maximum was 1018.3 U / g (reaction 2 minutes). .
  • Example 6 Lactic acid fermentation from soybean molasses
  • the ⁇ -galactosidase surface-displaying yeast obtained in Example 1 was incubated at 50 ° C. for 2 hours in a rotary thermostat and subjected to heat treatment.
  • 500 g of water containing 20 g (wet weight) of surface-displayed yeast after heat treatment and 500 g of soybean molasses were reacted at 50 ° C. for 2 hours with shaking at 500 rpm.
  • the soybean molasses obtained by this reaction was used for the subsequent cultivation of lactic acid bacteria.
  • the culture solution is collected at the start, 3 hours, 18 hours and 25 hours later.
  • concentration of lactic acid and saccharide in the medium was measured by HPLC.
  • concentration of lactic acid (produced lactic acid) produced by lactic acid bacteria during cultivation was determined from the lactic acid concentration measured at each sampling time point to the lactic acid concentration measured at the beginning (0 hours of culture) (the lactic acid originally present in soybean molasses). Subtracted).
  • the vertical axis indicates the concentration of lactic acid produced and monosaccharides and disaccharides (g / L), and the horizontal axis indicates the time (hours) for culturing lactic acid bacteria.
  • Each symbol in the figure is as follows: filled diamonds are lactic acid concentration under pH 6 adjustment (g / L); filled squares are lactic acid concentration without pH adjustment (g / L); open diamonds are under pH 6 adjustment Saccharide concentration (g / L) and white squares indicate saccharide concentration without pH adjustment (g / L).
  • the lactic acid concentration increased and the saccharide concentration decreased with time, and lactic acid fermentation by lactic acid bacteria was observed.
  • the pH was adjusted to 6 during the culture (fermentation reaction)
  • Example 7 Saccharification and lactic acid fermentation of soybean molasses
  • 500 g of water containing 20 g (wet weight) of ⁇ -galactosidase surface-displayed yeast that had been heat-treated and 500 g of soybean molasses were reacted at 50 ° C. for 2 hours with shaking at 500 rpm.
  • the sugar concentrations in soybean molasses before and after this reaction are shown in Table 2 below.
  • the reaction liquid total amount is 1 kg after reaction, what was converted as 500 g same as before reaction is also shown.
  • 500 g of a solution containing soybean molasses was collected after the above reaction, and used for subsequent cultivation of lactic acid bacteria. Therefore, 500 g of MRS medium containing 500 g of the solution and 5 g (wet weight) of lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum WCFS1 strain) is mixed, and the lactic acid bacteria are cultured under shaking at 200 rpm for 1 day at 37 ° C. for fermentation. I let you. The pH was adjusted to be maintained at 6 during this fermentation period. Table 2 below shows the concentrations of lactic acid and saccharides in the liquid before and after fermentation.
  • Example 8 Preparation of ⁇ -galactosidase surface-displaying lactic acid bacteria
  • Lactobacillus plantarum WCFS1 strain producing L-type and D-type lactic acid was used as a host.
  • ⁇ -galactosidase C derived from Aspergillus oryzae artificially synthesized by codon optimization for the host (“AOAglC for Lac” (SEQ ID NO: 13; its amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 14)) ) was used.
  • PgsA anchor (a poly- ⁇ -glutamate biosynthetic enzyme complex PgsBCA derived from Bacillus subtilis complex) between NdeI and BamHI of pCU plasmid (Okano et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 2007, Vol. 75, p.1007-1013)
  • a plasmid (pCUA) having a unit inserted therein was prepared, and a codon-optimized ⁇ -galactosidase gene artificially synthesized was inserted between BamHI and HindIII of this pCUA to prepare a plasmid pCUA-AOAglC for Lac.
  • the Lactobacillus plantarum WCFS1 strain was transformed by electroporation, and transformant colonies were obtained in MRS medium containing erythromycin 5 ⁇ g / mL. PCR was performed on a part of these colonies using a primer pair consisting of pgsA-Cter-Fw (SEQ ID NO: 15) and AOAglC for lac-Cter-Rv (SEQ ID NO: 16), and a band of 2159 bp was clearly seen. It was determined that the gene was introduced into the transformant.
  • Example 9 Performance evaluation of ⁇ -galactosidase surface-displaying lactic acid bacteria
  • 9-1 Evaluation of ⁇ -galactosidase activity using synthetic substrate p-nitrophenyl ⁇ -D-galactopyranoside
  • MRS medium containing erythromycin 5 ⁇ g / mL and 1% (w / v) calcium carbonate.
  • the sample was scraped with a platinum loop, weighed and added with 100 ⁇ L of water, and then vortexed to obtain a cell suspension.
  • the result is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the concentration (g / L) of each component in the culture solution
  • the horizontal axis represents the culture start time (“0 hour”) and the end time (“24 hours”).
  • the bar graphs at 0 and 24 hours are shown with the areas corresponding to the concentrations of raffinose, glucose, galactose and lactic acid stacked in order from the bottom. After 24 hours, the raffinose concentration decreased and the lactic acid concentration increased. Since Lactobacillus plantarum also assimilate galactose, accumulation of galactose in the medium was not observed.
  • Example 10 Lactic acid fermentation from soybean molasses
  • the medium was collected at 18, 24, 48 and 72 hours, and the concentration of lactic acid in the medium was measured by HPLC.
  • the concentration of lactic acid (produced lactic acid) produced by lactic acid bacteria during the cultivation was measured from the lactic acid concentration measured at each sampling time point at the start (0 hours of cultivation) (what was produced in the pre-culture and soybean) Subtracted (which may be due to lactic acid originally present in molasses).
  • the result is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the lactic acid concentration (g / L), and the horizontal axis represents the culture time (hours).
  • the filled circle indicates the result of lactic acid concentration. Even in a medium containing soybean molasses, lactic acid production over time by lactic acid bacteria displaying ⁇ -galactosidase surface layer was confirmed.
  • soybean molasses that has been conventionally discarded can be effectively used as a sugar raw material. Therefore, the present invention is useful for the production of foods, pharmaceuticals, and various industrial products using alcohol (for example, ethanol), lactic acid and the like as raw materials.
  • alcohol for example, ethanol
  • lactic acid for example, lactic acid

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Abstract

本発明は、α－ガラクトシダーゼを表層提示する形質転換微生物を提供する。アルコールを製造する方法が提供され、この方法は、この形質転換微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を含む培地において培養する工程を含む。α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料と共にこのような形質転換微生物を用いて、乳酸を製造する方法もまた提供される。本発明によれば、大豆モラセス中に存在し得るα－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を分解可能な微生物が提供され得る。

Description

α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物およびその使用
　本発明は、α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物およびその使用に関する。
　大豆の工業的な加工工程で発生する大豆モラセスは、通常は廃棄物として取り扱われている。大豆モラセス中には、ラフィノース、スタキオース等のオリゴ糖が含まれている。しかし、ラフィノースおよびスタキオースはα－１，６結合ガラクトース残基を含むオリゴ糖である。この結合を加水分解する酵素としてα－ガラクトシダーゼが知られている（非特許文献１）。しかし、多くの微生物は、これらのオリゴ糖を分解することができない。
　したがって、このように廃棄される大豆モラセスを糖原料として活用するための手段の開発が望まれている。
　ところで、細胞表面に酵素等のタンパク質を提示する酵母が作出されている。このような表層提示酵母上に提示されるタンパク質として、例えば、リパーゼ、アミラーゼ類（グルコアミラーゼ、α－アミラーゼ等）、セルラーゼ類（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ等）が挙げられる。このような表層提示酵母は、バイオディーゼルまたはバイオエタノールの生産に利用されている（特許文献１～４および非特許文献２）。
特開平１１－２９００７８号公報 国際公開第０２／０８５９３５号 国際公開第２０１５／０３３９４８号 国際公開第２０１６／０１７７３６号
Eur. J. Biochem., 268, 2982-2990 (2001) Biotechnology for Biofuels, 7(1):8 (2014) 生物工学会誌，第89巻，第4号，154-160 (2011) 化学工学会第70年会研究発表講演要旨集、セッションＩＤ　Ｆ１２３（http://doi.org/10.11491/scej.2005.0.255.0） Appl. Environ. Microbiol., 72(1), 269-275 (2006) Appl. Environ. Microbiol., 74(4), 1117-1123 (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol., 81, 711-719 (2008) Appl. Microbiol. Biotechnol., 84:733-739 (2009) 鳥取大学大学院工学研究科／工学部研究報告第４７巻, 12-27 (2016)
　本発明は、大豆モラセス中に存在し得るラフィノースおよびスタキオースなどのα－１，６結合を介したオリゴ糖を分解可能な微生物を提供することを目的とする。
　本発明は、α－ガラクトシダーゼを表層提示する形質転換微生物を提供する。
　１つの実施形態では、上記α－ガラクトシダーゼは、Ｃ型α－ガラクトシダーゼ（ＡｇｌＣ）である。
　１つの実施形態では、上記微生物はアルコール発酵能を有する。
　１つの実施形態では、上記微生物は酵母である。
　１つの実施形態では、上記酵母は、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、またはカンジダ属に属する。
　１つの実施形態では、上記酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。
　１つの実施形態では、上記微生物は乳酸菌である。
　１つの実施形態では、上記形質転換微生物は、不活化された微生物である。
　本発明は、上記形質転換微生物を含む酵素剤を提供する。
　本発明は、アルコールを製造する方法を提供し、この方法は、
　上記アルコール発酵能を有する形質転換微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を含む培地において培養する工程を含む。
　１つの実施形態では、上記アルコールはエタノールである。
　本発明は、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を糖化する方法を提供し、この方法は、
　上記形質転換微生物および／または酵素剤を、該α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料と共存させる工程を含む。
　本発明は、乳酸を製造する方法を提供し、この方法は、
　上記形質転換微生物および／または酵素剤を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料と共存させて、糖化された材料を得る工程、および
　上記糖化された材料を含む培地において乳酸菌を培養する工程を含む。
　本発明は、乳酸を製造する方法を提供し、この方法は、
　上記乳酸菌である形質転換微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料において培養する工程を含む。
　１つの実施形態では、上記α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖は、ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコースの少なくとも１つの糖を含む。
　本発明によれば、大豆モラセス中に存在し得るα－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を加水分解可能な表層提示微生物が提供される。これにより、大豆モラセスを微生物の糖原料として活用することができる。
ラフィノースを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を培養することによるエタノール発酵を示すグラフである。 スタキオースを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を培養することによるエタノール発酵を示すグラフである。 メリビオースを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を培養することによるエタノール発酵を示すグラフである。 大豆モラセスを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を培養することによるエタノール発酵を示すグラフである。 ５０℃においた酵母に表層提示されたα－ガラクトシダーゼの活性の経時変動を示すグラフである。 ガラクトシダーゼ表層提示酵母の大豆モラセスとの５０℃にて２時間のインキュベーションを反復して行った場合の当該インキュベーション前後の単糖およびスクロースの合計糖濃度を示すグラフである。 大豆モラセスを含む液体培地中に凍結乾燥表層提示酵母を５０℃にて共存した際のスタキオース、ラフィノースおよびみなしガラクトースの量の変化を示すグラフである。 熱処理した表層提示酵母との大豆モラセスの共存後に得られた材料と乳酸菌とを含む反応液で生じた乳酸発酵を示すグラフである。 ラフィノースを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌を培養することによる乳酸発酵を示すグラフである。 大豆モラセスを含む液体培地中でα－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌を培養することによる乳酸発酵を示すグラフである。
　（α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物）
　α－ガラクトシダーゼは、例えば、ラフィノースおよびスタキオースなどのガラクトース含有オリゴ糖の構成糖間のα－１，６結合を切断する作用を有する（非特許文献１）。α－ガラクトシダーゼはまた、ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド内のｐ－ニトロフェニルとＤ－ガラクトースとの間のα－１，６結合を切断する。
　提示されるα－ガラクトシダーゼは、上記のようなα－１，６結合を切断する作用を有する酵素である限り、特に限定されない。例えば、α－ガラクトシダーゼは、Ａ～Ｄ型の４種類があるが、いずれでも用いられ得る。好ましくはＣ型（「ＡｇｌＣ」）である。α－ガラクトシダーゼは、例えば、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、トリコデルマ（Trichoderma）、ファネロケーテ（Phanerochaete）などの微生物由来であり得、そのような微生物としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルシグル・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）などが挙げられる（非特許文献１）。
　α－ガラクトシダーゼおよびそのコード遺伝子の配列は、例えば、GenBank、NITE（DOGAN）などの機関に登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼ由来Ｃ型α－ガラクトシダーゼ（「ＡＯＡｌｇＣ」ともいう）は、その登録番号はXM_001827585であり、その塩基配列およびアミノ酸配列は、配列番号１および２に示す通りである。
　α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（例えば、ＡＯＡｌｇＣ）は、例えば、その塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）に基づいて設計したプライマー対（例えば、配列番号３および４）を用いて、その由来微生物（例えば、アスペルギルス・オリゼ）から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことによって、核酸断片として取得し得る。α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（例えば、ＡＯＡｌｇＣ）は、その塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、核酸断片として取得し得る。α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（例えば、ＡＯＡｌｇＣ）は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
　本明細書において用いられる遺伝子またはポリヌクレオチドは、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質をコードするものであってもよい。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、例えば、１個以上１０個以下、または１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよいが、例えば、保存的置換が挙げられ、保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
　他の実施形態としては、遺伝子またはポリヌクレオチドは、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質をコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上であり得る。
　本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
　さらに他の実施形態として、遺伝子またはポリヌクレオチドは、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ～７５０ｍＭ、５０ｍＭ～７５０ｍＭ、または３００ｍＭ～７５０ｍＭ、温度が例えば、２５℃～７０℃、５０℃～７０℃、または５５℃～６５℃、そしてホルムアミド濃度が例えば、０％～５０％、２０％～５０％、または３５％～４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ～６００ｍＭ、５０ｍＭ～６００ｍＭ、または３００ｍＭ～６００ｍＭ、そして温度が例えば５０℃～７０℃、５５℃～７０℃、または６０℃～６５℃である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）の中、６５℃でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，
A Laboratory Manual，3rd Ed,,  Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法などの周知の方法で行うことができる。温度が高いほど、または塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性（配列同一性）の高いポリヌクレオチドを単離できる。
　さらなる他の実施形態として、遺伝子またはポリヌクレオチドは、開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつその所望の機能または効果を実質的に有するものが挙げられる。
　所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することもできる。さらなる他の実施形態として、本発明において用いられる遺伝子またはポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変更された塩基配列を有するＤＮＡも包含する。α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、宿主微生物に依存してコドン最適化を行って人工的に合成され得る。
　α－ガラクトシダーゼ遺伝子を含む表層提示カセット（下述）を用いて宿主微生物の形質転換を行うことにより、α－ガラクトシダーゼ表層提示形質転換微生物（単に「α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物」、「表層提示微生物」または「形質転換微生物」ともいう）が作出される。
　宿主微生物は、特に限定されないが、例えば、酵母、乳酸菌、糸状菌、コリネ菌、大腸菌、ザイモナス菌などが挙げられる。アルコール製造への利用の観点からは、アルコール（例えば、エタノール）の発酵能を有する微生物が好ましく、このような微生物としては酵母、ザイモナス菌が挙げられる。乳酸製造への利用の観点からは、乳酸菌が好ましい。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス属（Saccharimyces）、ピキア属（Pichia）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）などが挙げられる。サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがさらに好ましい。サッカロマイセス・セレビシエの菌株としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手可能）、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株（Moukamnerdら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2010年、第88巻、p.87-94）、およびサッカロマイセス・セレビシエＫＦ－７株（Tingら、Process Biochem.、2006年、第41巻、p.909-914）が挙げられる。さらに、酵母としては、以下の菌株も挙げられる：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＧＳ１１５（Invitrogen社製）およびピキア・アノマラ（Pichia anomala）ＮＢＲＣ１０２１３株、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＢＲＣ１６２８株、クルイベロマイセス・ラクテイス（Kluyveromyces lactis）ＮＢＲＣ１２６７株およびクルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）ＮＢＲＣ１７７７株（Yanaseら、Appl Microbiol Biotechnol、2010年、第88巻、p.381-388）、カンジダ・ユチリス（Candida utilis）ＮＢＲＣ０９８８株（Tomitaら、PLoS One. 2012; 7(5): e37226）（ＮＢＲＣ株はいずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手可能）。
　「乳酸菌」とは、代謝または発酵によって糖類から乳酸を産生する細菌の総称である。乳酸菌は、主として、ビフィズス菌、エンテロコッカス菌、ラクトバチルス菌、ストレプトコッカス菌の４種に分類され得る。好ましくは、ラクトバチルス菌が用いられ得る。乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、またはリューコノストック属（Leuconostoc）に属する菌が挙げられる。乳酸菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）、ストレプトコッカス・フェカーリス（Streptococcus faecalis）、ストレプトコッカス・ラクテイス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・ブルカリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブルツキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アラビノースス（Lactobacillus arabinosus）、ラクトバチルス・カウカシクス（Lactobacillus caucasicus）、ラクトバチルス・ラクテイス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ライシュマニ（Lactobacillus Leishmanni）、ラクトバチルス・ムシカス（Lactobacillus musicus）、ラクトバチルス・サーモフィルス（Lactobacillus thermophilus）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobac terium longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ラクトコッカス・ラクテイス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、およびロイコノストック・メゼンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）などが挙げられる。乳酸菌には、有胞子性乳酸菌もまた包含される。有胞子性乳酸菌は、有胞子性の乳酸菌の総称である。有胞子性乳酸菌としては、例えば、バチルス属（Bacillus）に属する菌が挙げられる。バチルス属に属する有胞子性乳酸菌は、耐熱性（例えば４５℃のような高熱下にて生育可能）、高い発酵速度、および広い糖資化性を有するものであり得る。バチルス属（Bacillus）に属する菌としては、例えば、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans、「スポロ乳酸菌」としても知られる）およびバチルス・リンチェニフォルマイス（Bacillus lincheniformis）が挙げられる。
　乳酸菌は、遺伝子組換えがされたものであってもよい。例えば、Ｌ－またはＤ－乳酸合成酵素遺伝子のいずれかを組み込むあるいは破壊した組換え微生物が挙げられる。遺伝子組換え微生物として、例えば、ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株（Okanoら, Appl. Environ. Microbiol. 2009, Vol.75, 462-467）、およびラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株（Yoshidaら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, Vol.92, 67-76）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルムldhL1::amyA株は、α－アミラーゼを分泌しグルコースからＤ－乳酸を生成する組換え株であり、ラクトバチルス・プランタルムΔldhL1::PxylAB-xpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB株は、グルコースとキシロースの両方からＤ－乳酸を生成する組換え株である。
　例えば、ラフィノース、スタキオース、メリビオースまたはベルバスコースが加水分解されると、ガラクトースおよび／またはスクロースが生じ得る。α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物は、スクロースおよびガラクトースの少なくとも一方を用いて、アルコールまたは乳酸を発酵可能な微生物が好ましい。１つの実施形態では、α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物は、発酵のために、スクロースおよびガラクトースの少なくとも一方と、グルコースとを用い得る。α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物は、例えば、ガラクトースを資化可能なようにさらに遺伝子組換えが施されてもよい。
　以下に詳述するように、α－ガラクトシダーゼを表層提示させるための表層提示カセットを作製することができる。表層提示カセットは、α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子に加えて、分泌シグナルおよびアンカードメインをコードするＤＮＡを含む。表層提示カセットは、プロモーターとターミネーターとの間に配置され得る。アンカードメインとしては、細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域が用いられ得る。「細胞表層局在タンパク質」は、細胞表層に固定化または付着もしくは接着し、そこに局在するタンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。例えば、各種宿主微生物に関する表層提示技術としては、特許文献１～４および非特許文献２（酵母）、非特許文献３～６（乳酸菌）、非特許文献７（糸状菌）、非特許文献８（コリネ菌）、非特許文献４（大腸菌）、非特許文献９（ザイモナス菌）などに記載の技術を用いることができる。
　酵母に関する細胞表層提示技術は、当業者に公知のものが採用され得、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカー（特許文献１、３および４ならびに非特許文献２）、または糖鎖結合ドメイン（特許文献２および３）を利用することができる。
　細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol：エタノールアミンリン酸－６マンノースα－１，２マンノースα－１，６マンノースα－１，４グルコサミンα－１，６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカータンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカータンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（phosphatidyl inositol）と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
　ＧＰＩアンカーを用いた細胞表層提示技術としては、例えば、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ－目的遺伝子－ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡからなる組換えＤＮＡを含む表層提示カセットを用いる方法が挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は、以下のようにして行われる。ＧＰＩアンカータンパク質は、転写および翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端またはその近傍の領域に、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカータンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔およびゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
　ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ－ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
　表層提示微生物の作製には、細胞表層局在タンパク質であるＧＰＩアンカータンパク質の全体、またはその細胞膜結合領域であるＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用いることができる。細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端側の領域である。細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、融合タンパク質の酵素活性を阻害しない限り、ＧＰＩアンカータンパク質のその他の任意の部分を含んでいてもよい。
　ＧＰＩアンカータンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよい。このようなＧＰＩアンカータンパク質としては、例えば、α－またはａ－アグルチニン（ＡＧα１、ＡＧＡ１）、ＴＩＰ１、ＦＬＯ１、ＳＥＤ１、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２が挙げられる。例えば、ＳＥＤ１は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の定常期における主要な細胞表層局在タンパク質であり、この遺伝子は、例えば、GenBankに登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手することができる（GenBank accession number NM_001180385；ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８５１６４９）。例えば、酵母のα－アグルチニンのＣ末端から数えて３２０アミノ酸の配列中に存在するＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列もまた、アンカードメインとして利用され得る。
　例えば、分泌シグナルのコード配列－細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子－ＧＰＩアンカー付着認識シグナルのコード配列を含むポリヌクレオチドにおいて、この当該構造遺伝子の全部または一部を、α－ガラクトシダーゼをコードする遺伝子に置換することができる。
　糖鎖結合ドメインを用いた細胞表層提示技術としては、例えば、酵素を細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）のＮ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側との両方に結合させた組換えＤＮＡを含む表層提示カセットを用いる方法が挙げられる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌された酵素は糖鎖結合ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって、細胞表層に留まり得る。凝集機能ドメインとしては、例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位が挙げられ、代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。
　表層提示カセットのアンカータンパク質として、以下もまた用いられ得る：乳酸菌については、ペプチドグリカン結合タンパク質ＡｃｍＡのＣＡドメインおよびバシルス・ズブチリス（Baccilus subtilis）由来のポリ－γ－グルタミン酸生合成酵素複合体（ＰｇｓＢＣＡ）のサブユニットであるＰｇｓＡタンパク質（非特許文献３～６）；糸状菌については、アスペルギルス・オリゼ由来のＣＷＰアンカーおよびＭＰ１アンカー（膜結合タンパク質）（非特許文献７）；コリネ菌については、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のポリン（細胞壁結合タンパク質）（非特許文献８）；大腸菌については、上記乳酸菌で説明したＰｇｓＡタンパク質（非特許文献４）；およびザイモナス菌については、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）由来の氷核蛋白質遺伝子N末領域にあるアンカーリング領域（INPN）（非特許文献９）。
　分泌シグナルは、特に限定されず、提示するα－ガラクトシダーゼの分泌シグナルであってもよいし、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列であってもよいし、酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナルであってもよい。酵素活性に影響を及ぼさなければ、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残っていてもよい。
　本発明においては、任意のプロモーターおよびターミネーターが用いられ得る。プロモーターＤＮＡは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものを利用してもよい。また、アンカードメインとして用いられる細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターおよびターミネーターであってもよい。例えば、ＳＥＤ１をアンカードメインに用いる場合、同じＳＥＤ１のプロモーターを用いてもよい。例えば、ＳＥＤ１をアンカードメインに用いる場合、別の細胞表層局在タンパク質であるα－アグルチニンのターミネーターを用いてもよい。プロモーターおよびターミネーターとして、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’－リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターもまた用いることができる。
　表層提示カセットの構築、または組換えＤＮＡの合成および結合は、例えば、当業者が通常用いる方法により行うことができる。ＤＮＡの結合には、必要に応じて、適宜リンカーを用い得る。
　表層提示カセットまたは組換えＤＮＡは、発現ベクターに組み込まれてもよい。発現ベクターは、選択マーカー、エンハンサー等の因子を適宜含み得る。発現ベクターは、例えば、プラスミドの形態である。酵母の場合、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製起点とを有するプラスミドが好適に用いられる。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にする点で、選択マーカーと大腸菌用の複製遺伝子とを有することが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性遺伝子、および栄養要求性遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、およびカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられるが、特に限定されない。栄養要求性遺伝子としては、例えば、Ｎ－（５'－ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β－イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、およびオロチジン－５－リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられるが、特に限定されない。酵母用の複製遺伝子は必要に応じて選択され得る。他の微生物の場合も、当業者に周知のベクター、因子等が用いられ得る。
　宿主に表層提示カセットまたは組換えＤＮＡを導入する方法は特に限定されない。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、およびプロトプラスト法が挙げられる。
　形質転換微生物は、選択マーカーを用いて選択され得る。微生物にα－ガラクトシダーゼが表層提示されていることは、例えば、当該酵素に対する抗体を用いて確認することができる。あるいは、合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを用いた活性評価によって確認することができる。
　α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物は、当該微生物自体が不活化（例えば、代謝機能または発酵能が喪失）されたものであってもよい。α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物は、例えば、熱処理（例えば、加熱、凍結保存、凍結乾燥、低温乾燥等の手法による）することにより、不活化され得る。例えば、このように表層提示微生物が不活化された場合であっても、提示されているα－ガラクトシダーゼはなお活性を維持し得る。
　このように不活化された表層提示微生物は、α－ガラクトシダーゼ酵素剤として使用され得る。酵素剤としては、例えば、α－ガラクトシダーゼ表層提示微生物および当該表層提示微生物を維持し得る培地を含む懸濁液、および当該表層提示微生物が熱処理されたもの（例えば、加熱、凍結保存、凍結乾燥、低温乾燥等の手法による）が挙げられる。下述するように、表層提示微生物が担体に固定された形態であってもよい。
　表層提示微生物は、担体に固定されてもよい。そのことにより、下述する方法において再使用が可能となる。
　固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられる。固定方法としては、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
　担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、５０～１０００μｍの範囲内が好ましい。
　また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは柱状（例えば、立方体状）が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が２～５０ｍｍ、柱状の場合、２～５０ｍｍ角が好ましい。
　（アルコールの製造方法）
　本発明によれば、表層提示微生物を用いたアルコールの製造方法が提供される。表層提示微生物は、アルコール発酵能を有するものである。アルコール製造方法は、アルコール発酵能を有する表層提示微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を含む培地で培養する工程を含む。
　α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖（以下、「α－ガラクトース含有オリゴ糖」ともいう）の糖数は、例えば２～５、好ましくは２～４、より好ましくは３～４である。α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖としては、ラフィノース、スタキオース、メリビオース、ベルバスコースなどが挙げられる。ラフィノースは、スクロースのグルコースとガラクトースがα－１，６結合したオリゴ糖（三糖）である。スタキオースは、ラフィノースのガラクトースにさらに別のガラクトースがα－１，６結合したオリゴ糖（四糖）である。メリビオースは、グルコースにガラクトースがα－１，６結合したオリゴ糖（二糖）である。ベルバスコースは、スタキオースのガラクトースにさらに別のガラクトースがα１，６－結合したオリゴ糖（五糖）である。「α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖」とは、例えば、ラフィノース、スタキオース、メリビオースもしくはベルバスコース、またはこれらのうち２つ以上の混合物を包含する。１つの実施形態では、α－ガラクトース含有オリゴ糖は、ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコースの少なくとも１つの糖を含む。
　本明細書において、微生物を培養し、当該微生物の発酵作用によりアルコールを生産する工程を「アルコール発酵工程」ともいう。アルコール発酵工程で糖原料として用いられる材料を「発酵基質」ともいう。１つの実施形態では、アルコールはエタノールである。
　アルコール発酵工程には、「発酵基質」として、α－ガラクトース含有オリゴ糖を含む材料が含まれるが、当該オリゴ糖以外の糖類（例えば、グルコース、スクロース等）がさらに含まれていてもよい。
　「α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料」（以下、「α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料」ともいう）とは、オリゴ糖単独およびオリゴ糖と他の成分との混合物の両方を包含する。「α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料」は、α－ガラクトース含有オリゴ糖に該当する糖（例えば、ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコース）の少なくとも１つの糖を含む。「ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコースの少なくとも１つ」を含む材料とは、ラフィノース、スタキオース、メリビオースまたはベルバスコースのいずれかを含む材料、ならびにこれらのうちの２つ以上の組合せを含む材料のいずれも包含する。ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコースなどのα－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖は大豆に含まれるオリゴ糖であるため、これらは「大豆オリゴ糖」とも呼ばれる。「α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料」は、大豆由来材料および非大豆由来材料の両方を包含する。「α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料」は、α－ガラクトース含有オリゴ糖以外の糖を含むものであってもよく、オリゴ糖以外の糖は単糖であるか二糖以上のオリゴ糖であるかを問わず、例えば、スクロースおよびガラクトースが挙げられる。大豆由来材料として、好ましくは、大豆モラセスが用いられ得る。「大豆モラセス」は、大豆可溶物であり、例えば、アルコールまたは酸を用いた洗浄により大豆の不溶物から回収され得る。「大豆モラセス」は、大豆の加工工程で発生した廃棄物であってもよく、大豆加工工程から発生した大豆可溶物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース、メリビオースもしくはベルバスコース、またはこれらの混合物）が富むように濃縮処理したものであってもよい。
　本発明のアルコール製造方法においては、アルコール発酵工程は、発酵またはそのための微生物培養を行う通常の条件下で行われ得る。好ましくは液体培養である。このような発酵は、例えば、適当な発酵槽内で行われ得る。
　アルコール発酵培地には、上記α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料に加えて、用いる微生物の生育に必要または望ましい成分がさらに含められ得る。アルコール発酵工程の反応時の温度は、用いる微生物に依存し得るが、例えば３０℃～３７℃、好ましくは３０℃～３５℃であり得る。発酵ｐＨは、例えば４～８、好ましくは５～７である。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、１ppm以下、より好ましくは約０．３ppm以下、よりさらに好ましくは０．１ppm以下であり得る）。
　アルコール発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分（フェドバッチ）工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。
　微生物の投入量（発酵開始時の微生物の菌体濃度）、発酵基質の初期仕込み量および必要に応じて追加の仕込み量および時期、ならびに発酵時間は、基質の種類および状態、発酵培養の容量、発酵エタノールの目的生産量などの要件に依存して適宜決定され得る。発酵開始時の酵母の菌体濃度は、例えば、２ｇ（湿重量）／Ｌ～５０ｇ（湿重量）／Ｌ（１×１０７個／ｍＬ～２．５×１０８個／ｍＬ）、好ましくは、４ｇ（湿重量）／Ｌ～２０ｇ（湿重量）／Ｌ（２×１０７個／ｍＬ～１×１０８個／ｍＬ）である。初期仕込み量は、発酵液（発酵に用いる培地および菌体の合計）に対し例えば、５（w/v）％～５０（w/v）％、好ましくは１０（w/v）％～２５（w/v）％である。発酵基質の追加の投入量および時期は、発酵の進行による発酵培地の粘度、アルコール生産量または炭酸ガス発生量などをモニタリングしながら決定してもよい。
　発酵の進行とともにアルコールの発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
　発酵工程終了後、アルコール（例えば、エタノール）を含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。発酵に用いた表層提示微生物もまた、例えば、固液分離（例えば、遠心分離、濾過等）によって回収し、再利用に供することができる。
　（糖化方法）
　α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料を形質転換微生物（表層提示微生物）および／または酵素剤と共存させることにより、α－ガラクトース含有オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース、メリビオースまたはベルバスコース）が加水分解されて、スクロース（二糖）またはガラクトース（単糖）のようなより少ない糖数の糖類を生成（本明細書中では、「糖化」ともいう）することができる。本発明は、大豆オリゴ糖含有材料の糖化方法を提供し、この方法は、α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料を形質転換微生物および／または酵素剤と共存させる工程を含む。この共存工程後に「糖化された材料」が得られる。本明細書中では、この共存工程を「糖化工程」ともいう。「糖化された材料」は、例えば、ガラクトース、スクロース、フルクトース、グルコースなどの少なくとも１つの糖を含み得る。
　共存の条件（例えば、温度、ｐＨ、時間など）は、用いるα－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料の量、形質転換微生物または酵素剤の量、表層提示微生物の性質などに応じて決定され得る。形質転換微生物は、好ましくは、予め不活化（例えば、代謝機能または発酵能を喪失）しておく。
　「α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料」の糖化物（例えば、スクロース（二糖）またはガラクトース（単糖）を含む）は、例えば、続く発酵（例えば、アルコール発酵、乳酸発酵など）に用いられ得る。糖化物を当業者に周知の手段を用いて単離または精製してもよい。糖化に用いた表層提示微生物もまた、例えば、固液分離（例えば、遠心分離、濾過等）によって回収し、再利用に供することができる。
　（乳酸の製造方法）
　本発明は、乳酸の製造方法を提供し、この方法は、上記糖化工程と、乳酸菌の培養工程とを含む。本発明によれば、糖化工程により生じた産物（糖化された材料）を含む培地において乳酸菌を培養して、乳酸を製造することができる。あるいは、本発明は、乳酸の別の製造方法を提供し、この方法は、α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料を含む培地においてα－ガラクトシダーゼ表層提示形質転換乳酸菌（「形質転換乳酸菌」または「表層提示乳酸菌」ともいう）を培養する工程を含む。
　本明細書中では、乳酸菌または形質転換乳酸菌（表層提示乳酸菌）を培養し、その発酵作用により乳酸を生産する工程を「乳酸発酵工程」ともいう。乳酸発酵工程で糖原料として用いられる材料を「乳酸発酵基質」ともいう。「乳酸発酵基質」には、「糖化された材料」または「α－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料」が含まれるが、これらの材料以外に由来する糖類（例えば、培地由来の糖類）がさらに含まれていてもよい。「乳酸菌」については上で説明したとおりである。
　本発明の乳酸製造方法においては、乳酸発酵工程は、発酵またはそのための乳酸菌培養を行う通常の条件下で行われ得る。好ましくは液体培養である。このような発酵は、例えば、適当な発酵槽内で行われ得る。
　乳酸発酵培地には、上記のようなα－ガラクトース含有オリゴ糖含有材料またはその糖化物に加えて、用いる微生物の生育に必要または望ましい成分がさらに含められ得る。
　乳酸発酵工程は、特に制限されることなく、通常の乳酸発酵法を用いることができる。乳酸発酵のためのｐＨは、用いる微生物の種類、培地の種類、培養条件によって異なるため、必要に応じて適宜決定され得る。発酵ｐＨは、例えば、４～８、好ましくは、５～７、より好ましくは、５．５～６．８である。生成された乳酸によりｐＨがより酸性に変動し得るため、ｐＨは、発酵工程期間にわたって調整されることが好ましい。発酵培養は嫌気的に行われ得る。
　乳酸菌またはα－ガラクトシダーゼ表層提示形質転換乳酸菌の培養は、回分培養、半回分培養、または連続培養のいずれであってもよい。また、糖質のみ培養中に追加する半回分培養または連続培養であってもよい。培養時間は、使用菌株、培地成分、特に糖質の量などにより異なるが、回分培養の場合、例えば、０．５日間～１０日間、好ましくは、１日間～７日間、より好ましくは、１日間～４日間である。連続培養、半回分培養を行う場合は、培養期間はこれに限定されない。発酵残渣を菌床として用いてもよい。例えば、１バッチ（回分）の発酵終了後、その発酵残渣に含まれる乳酸生産微生物を次バッチの発酵に再度利用してもよい。
　乳酸菌またはα－ガラクトシダーゼ表層提示形質転換乳酸菌の投入量（「発酵開始時の乳酸菌の菌体濃度」）、発酵基質の初期仕込み量および必要に応じて追加の仕込み量および時期、ならびに発酵時間は、基質の種類および状態、発酵培養の容量、発酵乳酸の目的生産量などの要件に依存して適宜決定され得る。発酵開始時の乳酸菌の菌体濃度は、例えば、０．０１ｇ（湿重量）／Ｌ～２００ｇ（湿重量）／Ｌ（２×１０６個／ｍＬ～４×１０１０個／ｍＬ）、好ましくは、５ｇ（湿重量）／Ｌ～１００ｇ（湿重量）／Ｌ（１×１０９個／ｍＬ～２×１０１０個／ｍＬ）である。初期仕込み量は、発酵液（発酵に用いる培地および菌体の合計）に対し例えば、１（w/v）％～９９（w/v）％、好ましくは、５（w/v）％～９０（w/v）％である。発酵基質の追加の投入量および時期は、発酵の進行による発酵培地の粘度、乳酸生産量または炭酸ガス発生量などをモニタリングしながら決定してもよい。
　発酵培養の温度は、用いる乳酸生産微生物が生育する温度および添加される酵素の作用温度などの培養条件を考慮して設定され得る。例えば、２５℃～４５℃、または３０℃～４０℃、または３５℃～３７℃に設定し得るが、特に用いる乳酸生産微生物によっては、より高いまたは低い温度でもあり得る。用いる乳酸生産微生物が有胞子性乳酸菌などの耐熱性微生物の場合は、より高い温度、例えば、４５℃付近の温度に設定し得る。
　培養後の培養液から菌体を除去することにより、乳酸を、乳酸または乳酸アルカリ塩の形態で回収し得る。培養液からの乳酸の回収方法は特に制限されず、公知の方法が使用され得る。例えば、国際公開第２００７／１１４０１７号に記載の方法が挙げられる。また、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法；硫酸添加下でアルコール（例えば、メタノール、エタノールなど）と反応させてエステルを形成させ、蒸留する方法；およびマグネシウム塩などの不溶性の乳酸塩として回収および精製する方法などが挙げられる。
　また、乳酸の製造には、乳酸を含む製品の製造も包含される。例えば、乳酸菌または形質転換乳酸菌による乳酸生産後、発酵液をそのまま回収してもよく、あるいは菌体および／または発酵残渣（例えば、糖）ともに乳酸を回収してもよい。例えば、大豆モラセスから乳酸を製造する場合、乳酸菌または形質転換乳酸菌の培養後、生産された乳酸、乳酸菌体および発酵残渣の大豆モラセス糖化物を含む製品（例えば、飼料）を、乳酸を含む製品として得ることができる。
　本発明の方法によって製造されたアルコール（例えば、エタノール）、乳酸等は、食品、医薬品および各種工業製品の製造のための材料として用いられ得る。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：α－ガラクトシダーゼ表層提示酵母の調製）
　アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のα－ガラクトシダーゼをコードするＡｇｌＣのｃＤＮＡ（「ＡＯＡｇｌＣ」）を取得した。この取得のために、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡを鋳型にして配列番号３および４のプライマー対を用いたＰＣＲを行った。
　酵母に導入するベクターとして、ｐＡＵＲ１０１（タカラバイオ株式会社製）を用いた。サッカロマイセス・セレビシエＳＥＤ１プロモーター（配列番号５）、分泌シグナル（配列番号６；そのアミノ酸配列を配列番号７にも示す）、ＡＯＡｇｌＣ（配列番号８；そのアミノ酸配列を配列番号９にも示す）、サッカロマイセス・セレビシエＳＥＤ１アンカー（配列番号１０；そのアミノ酸配列を配列番号１１にも示す）、およびサッカロマイセス・セレビシエα－アグルチニンのターミネーター（配列番号１２）の順番で遺伝子配列を配置した表層提示カセットを、ｐＡＵＲ１０１のＳｍａＩのクローニングサイトにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素反応によって挿入した。得られたプラスミドをｐＡＵＲ１０１－ＳＥＤ１ｐ－ＡＯＡｇｌＣ－ＳＥＤ１－ＳＡＧ１ｔと名付けた。
　このｐＡＵＲ１０１－ＳＥＤ１ｐ－ＡＯＡｇｌＣ－ＳＥＤ１－ＳＡＧ１ｔをＳｔｕＩで切断後、ＹＥＡＳＴ　ＭＡＫＥＲ酵母形質転換システム（Clontech Laboratories、Palo Alto、California、USA）を用い、サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株に形質転換し、オーレオバシジンＡ（Aureobasidin A）耐性株を取得し、α－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を得た。
　（実施例２：α－ガラクトシダーゼ表層提示酵母の性能評価）
　（２－１：合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを用いたα－ガラクトシダーゼ活性の評価）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母（約０．７７μｇ／Ｌ（湿重量ベース））をｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド１ｍＭ存在下、３０℃にて１０分間反応させた後、４００ｎｍにて吸光度を測定し、当該測定値からα－ガラクトシダーゼ力価（Ｕ／ｇ）を算出した。その結果、力価３００～８００Ｕ／ｇ（湿潤細胞重量）のα－ガラクトシダーゼ活性が検出された。よって、本酵母がα－ガラクトシダーゼを表層提示できていることが確認された。
　（２－２：ラフィノースを用いたエタノール発酵）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母２０ｇ（湿重量）／Ｌをラフィノース５０ｇ／Ｌ（ラフィノース７０重量％およびガラクトース３０重量％）を含有するＹＰ液体培地中で、デュラン瓶内で２００ｒｐｍにてスターラーバーを用いて撹拌しながら３０℃にて４８時間培養した。２時間、７時間、２２時間、２６時間、および４８時間で培地を採取し、発酵生産されたエタノールの濃度および残存するラフィノースの濃度を測定した。
　この結果を図１に示す。縦軸は、エタノールおよびラフィノースの濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は培養の時間（時間）を示す。図中の各記号は以下を表す：塗りつぶし菱形は野生型酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）のエタノール濃度（「EtOH-TJ」）であり、塗りつぶし四角が表層提示酵母のエタノール濃度（「EtOH-TJ-AOAglC」）、白抜き菱形が野生型酵母のラフィノース濃度（「ラフィノース-TJ」）、白抜き四角が表層提示酵母のラフィノース濃度（「ラフィノース-TJ-AOAglC」）である。野生型酵母では、培養終了までラフィノースの減少が見られなかったのに対し、表層提示酵母では、培養７時間後にはラフィノースがほぼゼロ近くまで減少した。エタノール生産については、表層提示酵母は野生型酵母よりも顕著に増加された。なお野生型酵母でもエタノール生産が見られたのは、液体培地中のグルコースやガラクトースなどに起因すると思われた。
　（２－３：スタキオースを用いたエタノール発酵）
　スタキオース５０ｇ／Ｌ（スタキオース６５重量％およびその他の糖（ラフィノース、スクロースおよびガラクトース３５重量％）を含有するＹＰ液体培地を用いたこと以外は、上記２－２と同じ条件下で、実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母（２０ｇ／Ｌ）を培養した。２時間、７時間、２２時間、２６時間、および４８時間で培地を採取し、発酵生産されたエタノールの濃度および残存するラフィノースの濃度を測定した。
　この結果を図２に示す。縦軸は、エタノールおよびスタキオースの濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は培養の時間（時間）を示す。図中の各記号は以下を表す：塗りつぶし菱形は野生型酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）のエタノール濃度（「EtOH-TJ」）であり、塗りつぶし四角が表層提示酵母のエタノール濃度（「EtOH-TJ-AOAglC」）、白抜き菱形が野生型酵母のスタキオース濃度（「スタキオース-TJ」）、白抜き四角が表層提示酵母のスタキオース濃度（「スタキオース-TJ-AOAglC」）である。野生型酵母では、培養終了までスタキオースの減少が見られなかったのに対し、表層提示酵母では、培養７時間後までにスタキオースが急激に減少した。エタノール生産については、表層提示酵母は野生型酵母よりも顕著に増加された。なお野生型酵母でエタノール生産が見られたのは、液体培地中のグルコース、フルクトース、スクロース、またはガラクトースなどに起因すると思われた。
　（２－４：メリビオースを用いたエタノール発酵）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母２０ｇ（湿重量）／Ｌをメリビオース５０ｇ／Ｌを含有するＹＰ液体培地中で、デュラン瓶内で２００ｒｐｍにてスターラーバーを用いて撹拌しながら３０℃にて４８時間培養した。２時間、７時間、２２時間、２６時間、および４８時間で培地を採取し、発酵生産されたエタノールの濃度および残存するメリビオースの濃度を測定した。
　この結果を図３に示す。縦軸は、エタノールおよびメリビオースの濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は培養の時間（時間）を示す。図中の各記号は以下を表す：塗りつぶし菱形は野生型酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）のエタノール濃度（「EtOH-TJ」）であり、塗りつぶし四角が表層提示酵母のエタノール濃度（「EtOH-TJ-AOAglC」）、白抜き菱形が野生型酵母のメリビオース濃度（「メリビオース-TJ」）、白抜き四角が表層提示酵母のメリビオース濃度（「メリビオース-TJ-AOAglC」）である。野生型酵母では、培養終了までメリビオースの減少が見られなかったのに対し、表層提示酵母では、培養７時間後にはメリビオースがほぼゼロ近くまで減少した。エタノール生産については、表層提示酵母は野生型酵母よりも顕著に増加された。
　（実施例３：大豆モラセスからのエタノール発酵）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母または野生型酵母（サッカロマイセス・セレビシエＴＪ１４株）２０ｇ（湿重量）／Ｌを大豆モラセス８００ｇ／Ｌを含有するＹＰ液体培地中で、デュラン瓶に入れ、２００ｒｐｍでスターラーバーを用いて撹拌しながら３５℃にて９６時間培養した。２時間、７時間、２２時間、２６時間、４８時間、７２時間および９６時間で培地を採取し、発酵生産されたエタノールの濃度ならびに残存するラフィノースおよびスタキオースの各濃度をＨＰＬＣにて測定した。
　この結果を図４に示す。縦軸は、エタノール、ラフィノースおよびスタキオースの濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は培養の時間（時間）を示す。図中の各記号は以下を表す：塗りつぶし菱形が野生型酵母のエタノール濃度（「EtOH-WT」）；塗りつぶし四角が表層提示酵母のエタノール濃度（「EtOH-AglC-提示」）；塗りつぶし三角が野生型酵母のラフィノース濃度（「ラフィノース-WT」）；バツ印が表層提示酵母のラフィノース濃度（「ラフィノース-AglC-提示」）；米印が野生型酵母のスタキオース濃度（「スタキオース-WT」）；および塗りつぶし丸が表層提示酵母のスタキオース濃度（「スタキオース-AglC-提示」）。野生型酵母では、培養終了までラフィノースおよびスタキオースともに減少が見られなかったのに対し、表層提示酵母では、培養７時間後までにラフィノースおよびスタキオースともに急激に減少した。野生型酵母でもエタノールが生産された（大豆モラセス中のラフィノースおよびスタキオース以外の糖（スクロース等）に起因し得る）が、表層提示酵母のエタノール生産量は野生型酵母よりも顕著に増加された。
　（実施例４：酵母が表層提示するα－ガラクトシダーゼの熱安定性評価）
　（４－１：合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを用いたα－ガラクトシダーゼ活性の熱安定性評価）
　上記の実施例２の「２－１」の合成基質との反応について、ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド１ｍＭ存在下、実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母（約０．７７μｇ／Ｌ（湿重量ベース））を５０℃にて１６８時間までインキュベートし、α－ガラクトシダーゼ活性の推移を調べた。
　この結果を図５に示す。縦軸は、α－ガラクトシダーゼ活性（Ｕ／ｇ湿潤細胞重量）を示し、そして横軸はインキュベーションの時間（時間）を示す。塗りつぶし菱形が、α－ガラクトシダーゼ活性の結果を示す。この結果、一時的に活性が増加した処理時間があったが、その後緩やかに活性が低下したが、１２０時間後まで活性が維持された。したがって、５０℃のような高温下では、酵母の代謝（すなわちエタノール発酵生産）は生じなくなるが、酵母が表層提示するα－ガラクトシダーゼはなお活性を維持した。
　（４－２：大豆モラセスを用いた高温バッチ培養における糖分解評価）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を３０℃、１５０ｒｐｍ、３日間、１００ｍＬのＹＰＤ培地（３００ｍＬ三角フラスコ）中で培養した。次いで酵母を集菌し（３５００ｒｐｍにて５分）、水で１回洗浄後、水で２００ｇ（湿重量）／Ｌに調整し、次いで回転式恒温槽中で５０℃にて２時間インキュベートした。この後、大豆モラセス、酵母（２００ｇ（湿重量）／Ｌ）、水を５００：１００：４００の重量比（最終濃度は大豆モラセス５００ｇ／Ｌ、酵母２０ｇ（湿重量）／Ｌ）で混合してサンプリングし（「１回目」の「０時間」）、さらに回転式恒温槽中で５０℃にて２時間インキュベート（熱処理）してサンプリングした（「１回目」の「２時間」）。大豆モラセスとの熱処理後の溶液を３５００ｒｐｍにて５分間遠心分離して上清を除去し、酵母を回収した。この酵母に対し新たな大豆モラセスおよび水を大豆モラセスの濃度が５００ｇ／Ｌとなるように添加してサンプリングし（「２回目」の「０時間」）、さらに回転式恒温槽中で５０℃にて２時間インキュベート（熱処理）してサンプリングした（「２回目」の「２時間」）。それぞれのサンプリングで得た各試料中の単糖およびスクロースの合計糖濃度をＨＰＬＣで定量した。
　この結果を図６に示す。縦軸は、単糖およびスクロースの合計糖濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸はサイクル（「１回目」および「２回目」）を示す。図６では、１回目（「１回目」）および２回目（「２回目」）とも、左側に酵母の大豆モラセスとの添加混合直後サンプリング（「０時間」）および右側に５０℃で２時間インキュベート後サンプリング（「２時間」）の結果を示す。１回目および２回目とも、５０℃で２時間インキュベート後に単糖およびスクロースの合計糖濃度の増大が見られた。これにより、５０℃のような高温下では、大豆モラセス中のラフィノース、スタキオース等のα－１，６結合したガラクトースを含有するオリゴ糖が、酵母が表層提示するα－ガラクトシダーゼにより加水分解されてより少ない糖数の糖（例えば、単糖およびスクロース）を生じ、かつこのように生じた糖を当該酵母が発酵に用いていないことが示唆される。
　上記４－１および４－２の結果から、５０℃のような高温下で、表層提示酵母は、その代謝（すなわちエタノール発酵生産）を生じなくなるが、酵母が表層提示するα－ガラクトシダーゼはなお活性を維持することが分かった。
　（実施例５：凍結乾燥したα－ガラクトシダーゼ表層提示の性能評価）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を５０℃にて３時間凍結乾燥した。凍結乾燥後のα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を以下、「凍結乾燥表層提示酵母」ともいう。
　（５－１：合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを用いたα－ガラクトシダーゼ活性の評価）
　合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド１ｍＭ存在下、凍結乾燥表層提示酵母を３０℃または５０℃にて１０分間反応させた後、４００ｎｍにて吸光度を測定し、当該測定値からα－ガラクトシダーゼ力価（Ｕ／ｇ）を算出した。この結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（５－２：大豆モラセスを用いた高温下での糖分解評価）
　凍結乾燥表層提示酵母４ｇ（乾燥量）／Ｌを、大豆モラセス（９０重量％にて水中に懸濁）と、５０℃にて２時間、５００ｒｐｍ振盪下にて反応させた。適宜反応液を採取し、スタキオース、ラフィノースおよびガラクトースの各濃度をＨＰＬＣにて測定した。なおガラクトースは、本測定条件下ではフルクトース等も含まれるため、みなしガラクトース量として算出した。
　この結果を図７に示す。縦軸は、スタキオース、ラフィノースおよびみなしガラクトースの濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸はインキュベーションの反応時間（時間）を示す。図中の各記号は以下のとおりである：塗りつぶし菱形はスタキオース濃度（ｇ／Ｌ）；塗りつぶし四角はラフィノース濃度（ｇ／Ｌ）および；塗りつぶし三角はみなしガラクトース濃度（ｇ／Ｌ）。反応時間の経過とともに、スタキオースおよびラフィノースが減少し、ガラクトースの増大が見られた。大豆モラセスでの力価は、ガラクトースが正確に定量できないこと、スタキオースが２分子のガラクトースを含むこと、スタキオースが分解してラフィノースにもなり得ること等から、単純にスタキオースとラフィノースの減少量より算出できない。このため、α－ガラクトシダーゼの最低限の活性値としてスタキオースのみの減少量より算出したところ、４３２．８Ｕ／ｇ（反応１０分）で、最大は１０１８．３Ｕ／ｇ（反応２分）となった。参考までにガラクトース量から算出した場合３７２０．６Ｕ／ｇ（反応１０分）となり、フルクトース分を考慮すると、合成基質での活性値と近い値であるため、原料に対しても十分に働くことが示唆された。
　（実施例６：大豆モラセスからの乳酸発酵）
　実施例１で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母を回転式恒温槽中で５０℃にて２時間インキュベートし、熱処理を施した。熱処理後の表層提示酵母２０ｇ（湿重量）を含有する水５００ｇと大豆モラセス５００ｇとを５０℃にて２時間、５００ｒｐｍ振盪下にて反応させた。この反応により得られた大豆モラセスを続く乳酸菌の培養に用いた。よって、２５０ｇ／Ｌの反応後の大豆モラセスおよび４０ｇ（湿重量）／Ｌの乳酸菌（ラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１株（Kleerebezemら, PNAS、2003年、第100巻、p.1990-1995）：ＮＣＩＭＢ８８２６（Okanoら, Appl. Environ. Microbiol.、2009年、第75巻、p.462-467）と同株）をＭＲＳ培地とフラスコ内で混合し、スターラーバーで２００ｒｐｍにて撹拌しながら３７℃にて２５時間乳酸菌を培養した。培養開始時にのみｐＨを６に調整した場合と、培養期間中ｐＨを６に維持するよう調整した場合とで、開始時、３時間後、１８時間後および２５時間後に培養液を採取し、液中の乳酸および糖類（単糖および二糖：フルクトース、ガラクトース、グルコースおよびスクロースを含む）との各濃度をＨＰＬＣにより測定した。培養の際に乳酸菌が生産した乳酸（生成乳酸）の濃度を、各採取時点で測定した乳酸濃度から、開始時（培養０時間）に測定された乳酸濃度（大豆モラセス中にもともと存在する乳酸に起因し得る）を差し引いて求めた。
　この結果を図８に示す。縦軸は、生成乳酸ならびに単糖および二糖の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は乳酸菌の培養の時間（時間）を示す。図中の各記号は以下のとおりである：塗りつぶし菱形はｐＨ６調節下の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）；塗りつぶし四角はｐＨ調節なしの乳酸濃度（ｇ／Ｌ）；白抜き菱形はｐＨ６調節下の糖類濃度（ｇ／Ｌ）および；白抜き四角はｐＨ調節なしの糖類濃度（ｇ／Ｌ）。ｐＨ調節の有無にかかわらず、時間経過と共に乳酸濃度は増大し、糖類濃度は低下しており、乳酸菌による乳酸発酵が見られた。特に培養（発酵反応）の間中ｐＨを６に調整した場合は、高い発酵乳酸量が得られ、発酵収率が１００％に到達したことが観察された。
　（実施例７：大豆モラセスの糖化および乳酸発酵）
　実施例６と同様に熱処理したα－ガラクトシダーゼ表層提示酵母２０ｇ（湿重量）を含有する水５００ｇと大豆モラセス５００ｇとを５０℃にて２時間、５００ｒｐｍ振盪下にて反応させた。この反応の前後の大豆モラセス中の糖類の濃度を以下の表２に示す。なお反応後では反応液総量が１ｋｇであるため、反応前と同じ５００ｇとして換算したものを併せて示す。
　さらに、上記反応後に大豆モラセスを含む溶液５００ｇを回収し、続く乳酸菌の培養に用いた。よって、５００ｇの溶液と５ｇ（湿重量）の乳酸菌（ラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１株）を含む５００ｇのＭＲＳ培地とを混合し、３７℃にて１日間、２００ｒｐｍの振盪下で乳酸菌を培養して発酵させた。この発酵期間中ｐＨを６に維持するよう調整した。発酵前および発酵後の液中の乳酸および糖類の濃度を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に見られるように、表層提示酵母との反応により、大豆モラセス中のラフィノースおよびスタキオースが減少し、スクロースおよびガラクトースが増加したことが観察された。これにより、表層提示酵母によりラフィノースおよびスタキオースが加水分解されて、スクロースおよびガラクトースに糖化されたことが示唆される。さらに、乳酸菌によって、この糖化された大豆モラセスを用いて乳酸発酵がなされたことが観察された。
　（実施例８：α－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌の調製）
　Ｌ型およびＤ型の乳酸を生産するラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１株を宿主として用いた。導入する遺伝子として、宿主に対してコドン最適化を行って人工的に合成したアスペルギルス・オリゼ由来α－ガラクトシダーゼＣ（「ＡＯＡｇｌＣ　ｆｏｒ　Ｌａｃ」（配列番号１３；そのアミノ酸配列を配列番号１４にも示す））を用いた。
　ｐＣＵプラスミド（Okanoら, Appl Microbiol Biotechnol、2007年、第75巻、p.1007-1013）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ間にＰｇｓＡアンカー（バシルス・ズブチリス由来のポリ－γ－グルタミン酸生合成酵素複合体ＰｇｓＢＣＡのサブユニット）を挿入したプラスミド（ｐＣＵＡ）を用意し、このｐＣＵＡのＢａｍＨＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に人工合成したコドン最適化α－ガラクトシダーゼ遺伝子を挿入し、プラスミドｐＣＵＡ－ＡＯＡｇｌＣ　ｆｏｒ　Ｌａｃを調製した。
　このプラスミドｐＣＵＡ－ＡＯＡｇｌＣ　ｆｏｒ　Ｌａｃを用いて、エレクトロポレーション法によりラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１株を形質転換し、エリスロマイシン５μｇ／ｍＬを含むＭＲＳ培地で形質転換体のコロニーを取得した。これらコロニーの一部を、ｐｇｓＡ－Ｃｔｅｒ－Ｆｗ（配列番号１５）およびＡＯＡｇｌＣ　ｆｏｒ　ｌａｃ－Ｃｔｅｒ－Ｒｖ（配列番号１６）からなるプライマーペアでＰＣＲを行い、２１５９ｂｐのバンドが明確にみられたことから、形質転換体に遺伝子が導入されていると判断した。
　（実施例９：α－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌の性能評価）
　（９－１：合成基質ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシドを用いたα－ガラクトシダーゼ活性の評価）
　実施例８で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌を、ＭＲＳ培地（エリスロマイシン５μｇ／ｍＬおよび１％（w/v）炭酸カルシウムを添加した）のプレートで３７℃にて２日間培養後、菌体を白金耳でかきとり、計量して水１００μＬを加えてボルテックスミキサーに供し、菌体懸濁液を得た。３０μＬの菌体懸濁液を、ｐ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド１ｍＭ存在下、３０℃にて２０分間反応させた後、４００ｎｍにて吸光度を測定し、当該測定値からα－ガラクトシダーゼ活性（Ｕ／ｇ）を算出した。その結果、コロニーごとのばらつきはあるが、０．２９～０．６９Ｕ／ｇ（湿潤細胞重量）のα－ガラクトシダーゼ活性が検出された。よって、本乳酸菌がα－ガラクトシダーゼを表層提示していることが確認された。
　（９－２：ラフィノースを用いた乳酸発酵）
　実施例８で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌の１株（＃１１）について、２（w/v）％ラフィノース、１（w/v）％炭酸カルシウムおよび５（w/v）％前培養菌液（０．５（w/v）％グルコースを含有するＹＰ液体培地にて１日培養したもの）を含むＹＰ液体培地５ｍＬを試験管に入れ、３７℃にて２４時間静置することで培養した。
　この結果を図９に示す。縦軸は、培養液中の各成分の濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は、培養開始時（「０時間」）および終了時（「２４時間」）を示す。０時間および２４時間の棒グラフは、ラフィノース、グルコース、ガラクトースおよび乳酸の濃度に対応する面積を下から順に積み重ねて示される。２４時間後には、ラフィノース濃度が減少して乳酸濃度が増加した。ラクトバチルス・プランタルムはガラクトースも資化するため、培地中におけるガラクトースの蓄積はみられなかった。
　（実施例１０：大豆モラセスからの乳酸発酵）
　実施例８で得たα－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌の１株（ＷＣＳＦ１＃１１２１－１）について、２０（w/v）％大豆モラセス、２（w/v）％炭酸カルシウムおよび５（w/v）％前培養菌液（０．５（w/v）％グルコースを含有するＹＰ液体培地にて１日培養したもの）を含む培養液５０ｍＬをデュラン瓶に入れ、２００ｒｐｍでスターラーバーを用いて撹拌しながら３７℃にて７２時間培養した。１８時間、２４時間、４８時間および７２時間で培地を採取し、培地中の乳酸の濃度をＨＰＬＣにて測定した。培養の際に乳酸菌が生産した乳酸（生成乳酸）の濃度を、各採取時点で測定した乳酸濃度から、開始時（培養０時間）に測定された乳酸濃度（前培養において生産されたものおよび大豆モラセス中にもともと存在する乳酸に起因し得る）を差し引いて求めた。
　この結果を図１０に示す。縦軸は、乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を示し、そして横軸は培養の時間（時間）を示す。塗りつぶし丸は、乳酸濃度の結果を示す。大豆モラセスを含む培地においても、α－ガラクトシダーゼ表層提示乳酸菌による経時的な乳酸生産が確認された。
　本発明によれば、従来廃棄されていた大豆モラセスを糖原料として有効に活用することができる。したがって、本発明は、アルコール（例えば、エタノール）、乳酸等を原材料とする食品、医薬品および各種工業製品の製造に有用である。

Claims (15)

  1. 　α－ガラクトシダーゼを表層提示する形質転換微生物。
  2. 　前記α－ガラクトシダーゼが、Ｃ型α－ガラクトシダーゼ（ＡｇｌＣ）である、請求項１に記載の形質転換微生物。
  3. 　前記微生物がアルコール発酵能を有する、請求項１または２に記載の形質転換微生物。
  4. 　前記微生物が酵母である、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換微生物。
  5. 　前記酵母がサッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、またはカンジダ属に属する、請求項４に記載の形質転換微生物。
  6. 　前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項５に記載の形質転換微生物。
  7. 　前記微生物が乳酸菌である、請求項１または２に記載の形質転換微生物。
  8. 　不活化された微生物である、請求項１から７のいずれかに記載の形質転換微生物。
  9. 　請求項１から８のいずれかに記載の形質転換微生物を含む酵素剤。
  10. 　アルコールを製造する方法であって、
    　請求項３から６のいずれかに記載の形質転換微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を含む培地において培養する工程を含む、方法。
  11. 　前記アルコールがエタノールである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を糖化する方法であって、
    　請求項１から８のいずれかに記載の形質転換微生物および／または請求項９に記載の酵素剤を該α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料と共存させる工程を含む、方法。
  13. 　乳酸を製造する方法であって、
    　請求項１から６および８のいずれかに記載の形質転換微生物および／または請求項９に記載の酵素剤を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料と共存させて、糖化された材料を得る工程、および
    　該糖化された材料を含む培地において乳酸菌を培養する工程
    を含む、方法。
  14. 　乳酸を製造する方法であって、
    　請求項７に記載の形質転換微生物を、α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖を含む材料を含む培地において培養する工程を含む、方法。
  15. 　前記α－１，６結合したα－ガラクトースを含むオリゴ糖が、ラフィノース、スタキオース、メリビオースおよびベルバスコースの少なくとも１つの糖を含む、請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。
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