WO2018193566A1 - 被験物質又は物品が皮膚に与える影響を評価する方法 - Google Patents

被験物質又は物品が皮膚に与える影響を評価する方法 Download PDF

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WO2018193566A1
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skin
article
stratum corneum
test substance
area
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PCT/JP2017/015797
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千絵 布施
尚子 森崎
慶一 菅田
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花王株式会社
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61B5/103—Detecting, measuring or recording devices for testing the shape, pattern, colour, size or movement of the body or parts thereof, for diagnostic purposes
    • A61B5/107—Measuring physical dimensions, e.g. size of the entire body or parts thereof
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the influence of a test substance or article on skin.
  • Skin has the function of preventing the loss of moisture and biological components from the inside of the body and the entry of foreign substances from the outside. Such a function is generally called a “skin barrier function”.
  • the barrier function of the skin is mainly borne by the stratum corneum present in the outermost layer of the skin.
  • the water content of the stratum corneum is about 20% to 30% on the skin surface.
  • the water content gradually increases as it goes in the depth direction, and the water content reaches about 70% in the epidermis.
  • stratum corneum is a part that is touched by human eyes, when a foreign substance such as a chemical substance enters the skin, skin troubles such as inflammation are recognized at a glance.
  • skin troubles may occur when the skin is covered or occluded with absorbent articles such as diapers and sanitary products, wound protection materials, masks, rubber gloves, etc., and the skin is kept moist.
  • absorbent articles such as diapers and sanitary products, wound protection materials, masks, rubber gloves, etc.
  • Non-Patent Document 1 a method of applying methyl nicotinate to the skin and evaluating it as a method for evaluating the barrier function of the skin is widely used (for example, see Non-Patent Documents 1 to 3). In this method, the barrier function of the skin is evaluated based on erythema induced by the vasodilatory action of methyl nicotinate.
  • erythema is also affected by factors other than skin function, such as blood flow, outside air temperature, increased body temperature, decreased body temperature, body movement, sweating, and subject skin color. Therefore, in the above-described method, the evaluation result of the barrier function may be influenced by various factors (excluding the controlled environment and situation). Moreover, since methyl nicotinate has a vasodilatory effect, it may be a burden itself to apply methyl nicotinate to the skin of a subject.
  • the present invention comprises a contact step of maintaining a state in which a test substance or article is in contact with human skin for a predetermined time, Following the contact step, acquiring a cross-sectional image of the stratum corneum at an arbitrary depth of the skin, obtaining the post-contact state, From the cross-sectional image of the stratum corneum obtained in the obtaining step of the post-contact state, obtaining the skin area and the opening area in the skin area, obtaining information of the skin area after contact, and An opening area ratio calculating step for calculating a ratio of the opening area to the hide area area; And a method for evaluating the effect of a test substance or article on the barrier function of human skin.
  • the present invention acquires human stratum corneum structure data after contacting a test substance or article with human skin
  • a test substance or article evaluation method for evaluating the effect of a test substance or article on the barrier function of human skin by comparing the structure data of the stratum corneum after contact with the test substance or article and reference data.
  • the acquisition of the structure data of 1 or 2 selected from the opening area ratio of the skin region and the measurement of the permeability of the indicator substance by applying the indicator substance to the skin From the change from initial structure data to the structure data immediately after the end of loading of water or aqueous solution and the permeability of the indicator substance, determine the relationship between the permeability of the indicator substance and the load of water or aqueous solution, The structure data when the relevance is changed is used as reference data for the skin barrier function.
  • the present invention relates to a method for evaluating a test substance or article.
  • the present invention relates to a test substance or article evaluation method for evaluating the influence of a test substance or article on the skin barrier function,
  • the state of the internal structure of the stratum corneum when the substance permeability of the skin changes is set as the reference state, Bringing the test substance or article into contact with human skin for 1 hour or more and 6 hours or less; Obtain information on changes in the stratum corneum structure before and after contact, Compare the acquired information with the reference state, From the comparison results, the effect of the test substance or article on the barrier function of the skin is evaluated.
  • the present invention relates to a method for evaluating a test substance or article.
  • FIG. 3 It is a flowchart explaining the preferable embodiment of this invention. It is a figure explaining the calculation method of the opening part area ratio in a stratum corneum structure. It is the continuous photograph (drawing substitute photograph) of the depth direction of the skin which shows the change of the structure of the stratum corneum measured using the two-photon excitation microscope before the moisture load to skin. In FIG. 3, the white arrow indicates the cell nucleus. Continuous photographs (drawing substitute pictures) in the depth direction of the skin showing changes in the stratum corneum structure measured using a two-photon excitation microscope when the amount of moisture applied to the skin is 0.20 mL / cm 2 is there. In FIG. 4, a white arrow indicates a cell nucleus.
  • FIG. 5 (a) is a photomicrograph before moisture loading on the skin (depth from the skin surface: 4.8 ⁇ m), and FIG. 5 (b) shows that the moisture loading on the skin is 0.02 mL / cm.
  • 2 is a micrograph (depth from the skin surface: 8.4 ⁇ m)
  • FIG. 5C is a micrograph when the water load on the skin is 0.04 mL / cm 2 (skin (Depth from the surface: 8.4 ⁇ m)
  • FIG. 5 (d) is a photomicrograph when the water load on the skin is 0.20 mL / cm 2 (depth from the skin surface: 8.4 ⁇ m). .
  • the white arrow indicates the location where the opening (hole structure) exists. It is a plot figure of the variation
  • the present invention provides a test substance or article evaluation method that evaluates the influence of a test substance or article on the skin barrier function in a non-invasive manner, with less burden on the subject, safe, simple, and in a short time.
  • the swelling state (hydration state) of the stratum corneum located on the outermost layer of the skin affects the barrier function of the skin, and the permeability of the substance to the skin changes accordingly. Therefore, if it is possible to grasp the hydration state of the stratum corneum caused by the test substance or article coming into contact with the skin, the test substance or article has less burden on the subject as to how the test substance or article affects the barrier function of the skin, It is expected to be evaluated without being affected by various factors. However, the relationship between the change in substance permeability to the skin and the internal structure of the skin at that time has not been elucidated in detail.
  • the present inventors examined the relationship between the permeability of substances in living human skin and the structure of the stratum corneum located on the outermost surface of the skin. As a result, we found for the first time in living humans that there is a high relationship between the stratum corneum microstructure and the permeability of substances to the skin. Then, the influence of the test substance or article on the barrier function of the skin from the change in the stratum corneum structure of the living human skin measured non-invasively before and after the test substance or article is brought into contact with the human skin. I found that I can evaluate. The present invention has been completed based on these findings.
  • the skin barrier function is evaluated from the stratum corneum structure of the skin before and after contact with the test substance or article. Therefore, according to the present invention, the influence of the test substance or article on the skin can be known safely, simply and in a short time.
  • a test substance or article is brought into contact with human skin (S1), and information on changes in the stratum corneum before and after contact with the test substance or article is obtained (S2). From the information, the influence of the test substance or article on the barrier function of the skin is evaluated (S3).
  • analysis and evaluation of the influence on the skin barrier function are performed based on the relationship between the stratum corneum structure and the skin barrier function.
  • carrier function refers to the permeability of a substance from the outside to the inside of the skin.
  • the “test substance” means a substance (for example, a compound, a chemical substance, a pigment, a secretion or excrement derived from a living body, a moisturizing agent, or the like that penetrates into the skin by contact with the skin or application to the skin. External preparations, cosmetics).
  • the “test substance” and the “indicator substance” described later include water-soluble components and hydrophobic components.
  • substances include water or water vapor, physiological saline, phosphate buffered saline, methyl nicotinate, hexyl nicotinate, lactic acid, yellow No. 4 (tartrazine), red No. 215 (rhodamine B stearate), cafe In, ubinal, carotenoids, retinol, urine, sweat, menstrual blood, feces, simulated urine, simulated menstrual blood, simulated feces, and active ingredients contained in skin moisturizers, topical skin preparations, skin cosmetics or steam heating devices Medicinal ingredients are listed.
  • the structure of the stratum corneum at the site where the barrier function is evaluated is measured.
  • the stratum corneum structure is preferably measured non-invasively. In this case, the burden on the subject is small, and the skin barrier function can be safely evaluated.
  • a method for noninvasively measuring the stratum corneum structure can be appropriately selected from conventional methods. Examples thereof include a method using a two-photon excitation microscope, a multiphoton excitation microscope, an in vivo confocal laser microscope, an optical coherence tomography (OCT), an ultrasonic tomography apparatus, and the like.
  • the present invention using an apparatus capable of noninvasively measuring the structure of the stratum corneum, such as a two-photon excitation microscope, the internal structure of the stratum corneum, in particular, the stratum corneum thickness, the opening existing in the skin region, and the skin The ratio of the opening area to the area is measured.
  • an observation image in which keratinocytes swelled and an image in which water was accumulated between intercellular lipids were observed.
  • all previous research results required skin pieces, and the structure inside the skin could not be observed non-invasively.
  • the present inventors greatly contributed to the enhancement of the permeability of substances from the outside to the inside of the skin by changes in the stratum corneum internal structure such as the stratum corneum thickness and openings. I discovered this for the first time in a living human being. As shown in the examples described later, if the internal structure of the stratum corneum is in a certain state, the substance permeability does not increase. However, when the internal structure of the stratum corneum changes from a certain state, the substance permeability increases.
  • the state of the internal structure of the stratum corneum when the substance permeability of the skin changes is set as a “reference state” and the skin barrier function can be evaluated using the set reference state as an index.
  • the permeability of methyl nicotinate which is a water-soluble substance, was evaluated as a representative example of the indicator substance.
  • the reference state of the internal structure of the stratum corneum for evaluating the influence of the test substance or article on the skin barrier function can be appropriately set.
  • the reference state setting method according to the present invention will be described based on specific examples.
  • the present invention is not limited to this.
  • a water load test is performed on the skin by changing the water load, and the stratum corneum structure of the skin at each water load is measured by a conventional method.
  • the measured corneum structure of the skin is associated with the barrier function of the skin.
  • the skin stratum corneum structure when a change in the skin barrier function is confirmed is set as the “reference state”.
  • Examples of a method for setting the “reference state” include a method for setting from the permeability of the indicator substance from the outside to the inside of the skin. Following the water load test on the skin described above, the load test of the indicator substance on the skin was performed, and the permeability of the indicator substance was measured by a conventional method. When the change in the permeability of the indicator substance was observed, the angle of the skin The layer structure can be a “reference state”.
  • the indicator substance for evaluating the permeability to the skin can be appropriately selected. For example, methyl nicotinate, hexyl nicotinate, lactic acid, yellow No. 4, red No. 215, caffeine, ubinal, carotenoid, retinol, and effective in skin moisturizer, skin external preparation, skin cosmetic, or steam heating device Ingredients and medicinal ingredients.
  • the ratio of the opening area to the dermis area area at an arbitrary depth of the skin (in the following, it is preferable that the “opening area ratio”) be the reference state.
  • an “opening” is a cross section of a sphere or ellipsoid (hereinafter also referred to as a “hole structure”) that exists three-dimensionally in the stratum corneum when measured from the skin surface, and is parallel to the skin surface.
  • a circular or elliptical cross section having a major axis of 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, measured from the above.
  • the hole-shaped structure mainly refers to a hole-like or elliptical structure inside the stratum corneum that exists from the upper layer to the middle layer of the stratum corneum.
  • the hole-like structure is continuous from an image (for example, see FIG. 4) in which the stratum corneum is continuously taken in the skin depth direction using a two-photon excitation microscope with an imaging interval of 1.2 ⁇ m. Measured as a circle or ellipse.
  • the corneocytes When moisture is applied to the stratum corneum, the corneocytes swell and the stratum corneum thickness increases. Under the condition of stronger water load, the stratum corneum thickness further increases and the stratum corneum structure is changed to form a hole-like structure.
  • the main factors involved in the formation of the hole-like structure due to moisture loading include moisture loading time and moisture content.
  • the formation of the hole-like structure can be controlled by adjusting these factors. Specifically, according to the method of the embodiment described later, when a certain amount of moisture is applied to human skin for 1 hour or more at room temperature, the structure of the stratum corneum is disturbed, resulting in a hole-like structure or a cross-section thereof. Is formed.
  • the stratum corneum When the stratum corneum is observed with a two-photon excitation microscope after a certain time has elapsed after the water load is released, no hole-like structure or opening is observed.
  • the formation of a hole-like structure is a reversible change in the stratum corneum. From the image obtained by continuously photographing the stratum corneum in the depth direction of the skin shown in FIG. 4 with a two-photon excitation microscope, the hole-like structure is continuous, considering that the imaging interval of the image in the depth direction is 1.2 ⁇ m. Observed as a circle or ellipse, ie an opening.
  • the stratum corneum thickness when the change in the barrier function of the skin is confirmed, or when the barrier function reaches a certain state, the stratum corneum thickness can be set as the reference state.
  • the thickness of the stratum corneum hereinafter also referred to as “corneal layer thickness”
  • corner layer thickness when a change is confirmed in the barrier function of the skin, or when the barrier function reaches a certain state, the thickness of the stratum corneum (hereinafter also referred to as “corneal layer thickness”) Is preferably set to the reference state.
  • the stratum corneum structure When the stratum corneum structure is measured in the depth direction with a two-photon excitation microscope and reaches a certain depth, black circular cell nuclei and white spots that surround them appear. This spot is fluorescence derived from mitochondria localized around the cell nucleus of the granule layer. Therefore, the stratum corneum and the granular layer can be distinguished by the presence or absence of cell nuclei and surrounding white spots, and the distance from the stratum corneum surface layer to the detection of the granular layer can be the stratum corneum thickness.
  • the opening area ratio and the stratum corneum thickness are used in combination. Also good.
  • the change in the stratum corneum has a strong relationship with the barrier function of the skin, and as the stratum corneum increases, the permeability of the substance to the skin increases.
  • the change in the stratum corneum thickness due to the contact of the test substance or the article is measured. Evaluate the effect of contact with goods on the barrier function of the skin.
  • the change in the stratum corneum thickness after contact of the test substance or article for a certain period of time with respect to the stratum corneum thickness before contact with the test substance or article is targeted for the skin of a healthy person after the skin is washed and acclimatized for a minimum of 20 minutes
  • the reference value of the amount is set to 1.8 times, preferably 2.0 times, more preferably 2.2 times.
  • the stratum corneum thickness after contact with the actually measured test substance or article increases by more than the reference value, the permeability of the substance from the outside to the inside of the skin is enhanced, and the barrier function is caused by the contact of the test substance or article. Can be evaluated as lowered.
  • the change amount of the stratum corneum is smaller than the reference value, it can be evaluated that the barrier function is not changed by the contact of the test substance or the article.
  • the opening area ratio also affects the skin barrier function.
  • the area ratio of the opening is calculated by image processing software from the image obtained by an apparatus capable of non-invasively measuring the stratum corneum structure by the image processing software.
  • the total area of the opening included in the hide is calculated.
  • the ratio of the total area of the opening part which occupies for the area of the whole hide hill is calculated by 100 fraction, and an opening part area ratio is calculated.
  • FIG. 2A is an image obtained by photographing the internal structure of the stratum corneum having a depth of 4.8 ⁇ m from the skin surface using a two-photon excitation microscope
  • FIG. It is the image which image
  • the stratum corneum microstructure is captured three-dimensionally from images taken continuously in the depth direction of the skin, recognizing the region where the stratum corneum begins at the surface of the stratum corneum and the region where the granular layer begins at the lower stratum corneum.
  • the stratum corneum region is distinguished.
  • the skin groove and the cuticle are first distinguished (see the upper part of FIG. 2). Since the stratum corneum surface is unevenly uneven, only the hill part is easy to adhere to the window material of the objective lens, and the skin groove part is difficult to adhere to the objective lens and has a layer containing a contact agent. Since it does not exist, that is, there is no fluorescent substance, it cannot be measured. On the other hand, since the skin that is in close contact with the objective lens can be measured because of the presence of the fluorescent substance, it can be distinguished from the skin.
  • the boundary line between the skin groove and the skin hill is surrounded by a dotted line, and the opening included in the region of the skin hill is surrounded by a solid line (see the lower part of FIG. 2).
  • the sum of the internal areas enclosed by the dotted line (area of the entire hide) and the sum of the areas enclosed by the solid line (total area of the opening) are respectively calculated by ordinary methods.
  • the ratio of the total area of the opening part which occupies for the area of the whole hide hill is calculated by 100 fraction, and an opening part area ratio is calculated.
  • the range for calculating the opening area ratio is desirably an arbitrary depth in which the depth from the skin surface is up to 20 ⁇ m.
  • the excitation light attenuates in the deep stratum corneum. Or the sensitivity which detects the autofluorescence by excitation light falls. Therefore, it is more desirable that the depth from the skin surface is preferably up to 15 ⁇ m, more preferably up to 12 ⁇ m.
  • the calculation of the opening area ratio is desirably performed at a minimum in a range where the depth from the skin surface is preferably up to 6 ⁇ m, more preferably up to 9 ⁇ m.
  • the opening area ratio and the skin barrier function have a strong relationship, and as the opening area ratio increases, the permeability of the indicator substance such as methyl nicotinate to the skin increases. .
  • the stratum corneum structure before and after contact with the test substance or article is measured, and the influence on the skin barrier function from the change in the stratum corneum structure. To evaluate.
  • the skin of a healthy person after washing the skin and acclimatizing for at least 20 minutes is targeted, and from the skin surface to a predetermined depth (preferably from the skin surface (0 ⁇ m) to a maximum depth of 20 ⁇ m, preferably at most A reference value for the amount of change in the opening area ratio after contact of the test substance or article at a depth of 15 ⁇ m, more preferably at most 12 ⁇ m and at least a depth of 6 ⁇ m, preferably a depth of 9 ⁇ m, It is set to 3%, preferably 4.5%, more preferably 8%.
  • the ratio of the opening area at a predetermined depth from the skin surface after contact with the actually measured test substance or article increases more than the reference value, the permeability of the substance from the outside of the skin to the inside is enhanced. It can be evaluated that the barrier function has decreased due to contact with the test substance or article. On the other hand, when the amount of change in the opening area ratio is smaller than the reference value, it can be evaluated that the barrier function is not changed by the contact of the test substance or the article.
  • the opening area ratio before contact with the test substance or article is set to 0%, and the opening area ratio after contact with the test substance or article is It is good also as a variation
  • Examples of articles used in the present invention include absorbent articles (absorbent cotton, sanitary napkins, paper diapers, cloth diapers, training pants, adult diapers, sweat pads, urine pads, puerperium pads, panty liners, absorbent pads, etc.) , Steam heaters, wound protection materials (such as bandages, gauze, bandages, etc.), masks, and rubber gloves.
  • Examples of the test substance include water or water vapor, cosmetics, humectants or external preparations, active ingredients and medicinal ingredients contained in steam heating devices, physiological saline, phosphate buffered saline, and biologically derived secretions. And urine such as urine, sweat, menstrual blood, and feces.
  • simulated urine, simulated sweat, simulated menstrual blood, simulated stool and the like are included in living body-derived secretions and excretion.
  • the contact time of the test substance or article with the skin can also be set as appropriate.
  • the time for contacting the test substance or article with human skin is 1 hour or more and 6 hours or less, preferably 2 hours or more and 4 hours or less, more preferably 2.5 hours or more and 3.5 hours or less, and further preferably About 3 hours.
  • the evaluation method of the present invention measures the stratum corneum structure of the skin before and after contact with the test substance or article, and based on the relationship between the stratum corneum structure and the barrier function of the skin, From the change, the effect of contact with the test substance or article on the skin barrier function, in particular, the permeability of the substance is evaluated.
  • the state of the stratum corneum can be known from the stratum corneum structure measured non-invasively based on the above-described relationship between the stratum corneum structure and the barrier function.
  • the thickness of the stratum corneum before and after contact with the test substance or article is measured on the skin of a healthy person after washing the skin and acclimatizing for at least 20 minutes. Then, the stratum corneum thickness before and after contact with the test substance or article is compared.
  • goods is set to 1.8 times, Preferably it is 2.0 times, More preferably, it is 2.2 times.
  • an opening before and after contact with a test substance or article at an arbitrary depth from the skin surface to an initial stratum corneum thickness of about 12 ⁇ m is intended for the skin of a healthy person after washing the skin and acclimatizing for at least 20 minutes. Measure the area ratio. Then, the opening area ratio before and after contact with the test substance or article is compared. Then, the reference value of the amount of change in the opening area ratio before and after contact with the test substance or article is set to 3%, preferably 4.5%, more preferably 8%. And it can be evaluated that the barrier function of the stratum corneum is lowered when the area ratio of the opening after contact with the actually measured test substance or article increases by more than the reference value.
  • Absorbent articles absorbent cotton, sanitary napkins, disposable diapers, cloth diapers, training pants, adult diapers, sweat pads, urine pads, puerperium pads, panty liners, absorbent pads, etc.
  • products such as skin cosmetics or external preparations, wound protection materials (such as bandages, gauze, bandages, etc.), masks or rubber gloves, and steam heaters.
  • the performance of these products e.g., by evaluating the barrier function of the skin before and after wearing using the evaluation method of the present invention
  • the ability to absorb moisture (wet), the ability of water vapor (steaming) to spread to the outside, and the likelihood of skin problems) can be evaluated safely and simply in a short time.
  • an absorbent article containing physiological saline, simulated urine, or the like may be used for the evaluation.
  • the permeability of the substance can be evaluated without the need to apply a substance such as methyl nicotinate used in this example to human skin. Can do. Specifically, for absorbent articles, wound protection materials, and masks or rubber gloves, when comparing the current product with the improved product, the substance permeability was determined from the stratum corneum thickness before and after wearing and the hole-like structure of the stratum corneum. I can guess. If it does in this way, development of an absorptive article etc. can be performed efficiently.
  • the system for evaluating the effect of a test substance or article on the barrier function of the skin stores information on the relationship between the stratum corneum structure of the skin due to the contact of the test substance or article and the barrier function of the skin. Then, based on the information on the relevance, the influence is evaluated from the change of the stratum corneum due to the contact of the test substance or the article.
  • the system of the present invention is a so-called computer and includes, for example, a CPU (Central Processing Unit), a memory, an input / output interface, and the like that are connected to each other via a bus.
  • the memory is a RAM (Random Access Memory), a ROM (Read Only Memory), a hard disk, a portable storage medium, or the like.
  • the input / output interface is connected to a user interface device such as a display device or an input device.
  • the input / output interface may be connected to a communication device or the like that communicates with another computer via a network.
  • the evaluation method and the evaluation system of the present invention target human skin, preferably human (healthy person) skin having a normal barrier function in a state in which no test substance or article is loaded.
  • the present invention further discloses the following evaluation method and evaluation system.
  • Time for contacting the test substance or article with human skin is 1 hour to 6 hours, preferably 2 hours to 4 hours, more preferably 2.5 hours to 3.5 hours, more preferably The method according to ⁇ 1>, wherein is about 3 hours.
  • ⁇ 3> From the relationship between the ratio of the opening area to the skin area and the skin barrier function, the ratio of the opening area to the skin area when a change is confirmed in the skin barrier function is used as a reference value. Set, The test substance or article is brought into contact with human skin, and the ratio of the opening area to the dermis area is obtained. Compare the ratio of the opening area to the acquired skin area and the reference value, From the comparison results, the effect of the test substance or article on the skin barrier function is evaluated.
  • ⁇ 4> Perform a water load test on the skin by changing the amount of water load, Measure the ratio of the area of the opening to the area of the cuticle area in the depth direction of the skin, Associate the measured ratio of the opening area with the barrier function of the skin, From the relationship between the ratio of the opening area at an arbitrary depth of the skin and the barrier function of the skin, the ratio of the opening area when the change in the skin barrier function is confirmed is set as the reference value, ⁇ 3> The method according to item.
  • the permeability of the indicator substance from the outside to the inside of the skin is further measured, and the reference value is set from the result of the permeability of the indicator substance, ⁇ 3> Alternatively, the method according to ⁇ 4>.
  • the indicator substance is methyl nicotinate, hexyl nicotinate, lactic acid, yellow No. 4, red No. 215, caffeine, ubinal, carotenoid, retinol, and skin moisturizer, skin external preparation, skin cosmetic, or steam
  • a test substance or article evaluation method for evaluating the effect of a test substance or article on the barrier function of human skin by comparing the structure data of the stratum corneum after contact with the test substance or article and reference data.
  • obtain the initial structure data of the human stratum corneum Before loading the human skin with water or aqueous solution, obtain the initial structure data of the human stratum corneum, Immediately after loading water or aqueous solution on human skin, it is the ratio of the stratum corneum thickness and the skin area obtained from the cross-sectional photograph of the stratum corneum and the opening area in the skin area.
  • the acquisition of the structure data of 1 or 2 selected from the opening area ratio of the skin region and the measurement of the permeability of the indicator substance by applying the indicator substance to the skin From the change from initial structure data to the structure data immediately after the end of loading of water or aqueous solution and the permeability of the indicator substance, determine the relationship between the permeability of the indicator substance and the load of water or aqueous solution, The structure data when the relevance is changed is used as reference data for the skin barrier function. Evaluation method of test substance or article.
  • Time for contacting the test substance or article with human skin is 1 hour or more and 6 hours or less, preferably 2 hours or more and 4 hours or less, more preferably 2.5 hours or more and 3.5 hours or less, more preferably The method according to ⁇ 7>, wherein is about 3 hours.
  • ⁇ 9> The state of the internal structure of the stratum corneum when the substance permeability of the skin changes is set as the reference state, The structure data of the stratum corneum of skin obtained before and after contact with the test substance or article is compared with the reference state, From the comparison results, the effect of the test substance or article on the skin barrier function is evaluated.
  • the indicator substance is methyl nicotinate, hexyl nicotinate, lactic acid, yellow No. 4, red No. 215, caffeine, ubinal, carotenoid, retinol, and skin moisturizer, skin external preparation, skin cosmetic, or steam.
  • the method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 9>, wherein the method is at least one selected from the group consisting of an active ingredient or a medicinal ingredient contained in a heating tool.
  • the stratum corneum structure is measured in the depth direction using a two-photon excitation microscope, and the distance from the skin surface to the confirmation of the spots derived from the nucleus of the granule layer and mitochondria localized in the periphery, The method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 10>, wherein the method is determined as the stratum corneum thickness.
  • ⁇ 12> The skin layer of a healthy subject is evaluated, the stratum corneum thickness before and after contact with the test substance or article is measured, and the stratum corneum thickness after contact with the test substance or article is the stratum corneum before contact with the test substance or article.
  • the barrier function is lowered, preferably the permeability of the substance from the outside to the inside is enhanced, 7.
  • the method according to any one of 7> to ⁇ 11>. ⁇ 13> The thickness of the stratum corneum before and after contact with the test substance or article is measured on the skin of a healthy person, and the stratum corneum after contact with the test substance or article is the stratum corneum before contact with the test substance or article. If the thickness is smaller than 2.2 times, preferably 2 times, more preferably 1.8 times the thickness, the barrier function is not changed, preferably the permeability of the substance from the outside to the inside is not enhanced.
  • ⁇ 14> From the skin surface to a depth of up to 20 ⁇ m, preferably up to a depth of 15 ⁇ m, more preferably up to a depth of 12 ⁇ m, and a depth of at least 6 ⁇ m, preferably up to a depth of 9 ⁇ m, The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the ratio of the opening area of the skin region in the stratum corneum structure is calculated.
  • the skin area of the skin after contact with the test substance or article is calculated by calculating the opening area ratio of the skin region after contact with the test substance or article at a depth of 12 ⁇ m from the skin surface, with the skin of the healthy subject being evaluated.
  • the opening area ratio of the hill area is 3% or more, preferably 4.5% or more, more preferably 8% or more with respect to the opening area ratio of the skin area before contact with the test substance or article.
  • Skin of the healthy subject after the contact of the test substance or article is calculated by calculating the opening area ratio of the skin area after contact of the test substance or article at a depth of 12 ⁇ m from the skin surface.
  • the amount of change in the opening area ratio of the hill area is 8%, preferably 4.5%, more preferably 3% increase relative to the opening area ratio of the skin area before contact with the test substance or article. If it is small, it is evaluated that the barrier function is not changed, preferably the permeability of the substance from the outside to the inside of the skin is not enhanced, any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 10> and ⁇ 14> The method described in 1.
  • a test substance or article evaluation method for evaluating the influence of a test substance or article on the barrier function of the skin The state of the internal structure of the stratum corneum when the substance permeability of the skin changes is set as the reference state, The test substance or article is brought into contact with human skin for 1 hour or more and 6 hours or less, preferably 2 hours or more and 4 hours or less, more preferably 2.5 hours or more and 3.5 hours or less, more preferably about 3 hours, Obtain information on changes in the stratum corneum structure before and after contact, Compare the acquired information with the reference state, From the comparison results, the effect of the test substance or article on the barrier function of the skin is evaluated. Evaluation method of test substance or article.
  • ⁇ 18> Perform a water load test on the skin by changing the amount of water load, Measuring the stratum corneum structure of the skin, Associate the measured skin stratum corneum with the skin barrier function, From the relationship between the skin stratum corneum structure and the skin barrier function, the skin stratum corneum structure when the change in the skin barrier function is confirmed is set as the reference data or the reference state.
  • ⁇ 19> In order to confirm the change in the barrier function of the skin, the permeability of the indicator substance from the outside to the inside of the skin is further measured, and the reference state is set from the result of the permeability of the indicator substance, ⁇ 17> Alternatively, the method according to ⁇ 18>.
  • the indicator substance is methyl nicotinate, hexyl nicotinate, lactic acid, yellow No. 4, red No. 215, caffeine, ubinal, carotenoid, retinol, and skin moisturizer, skin external preparation, skin cosmetic, or steam
  • ⁇ 22> The method according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 21>, wherein the stratum corneum thickness is measured as the stratum corneum structure.
  • the stratum corneum structure is measured in the depth direction using a two-photon excitation microscope, and the distance from the skin surface until the spots derived from the cell nucleus of the granule layer and mitochondria localized in the periphery are confirmed, The method according to ⁇ 22>, wherein the method is determined as the stratum corneum thickness.
  • the skin layer of a healthy person is evaluated, the stratum corneum thickness before and after contact with the test substance or article is measured, and the stratum corneum thickness after contact with the test substance or article is the stratum corneum before contact with the test substance or article.
  • the thickness is increased by 1.8 times or more, preferably by 2.0 times or more, more preferably by 2.2 times or more, it is evaluated that the barrier function is lowered, preferably the permeability of the substance from the outside to the inside of the skin is enhanced, The method according to item 22> or ⁇ 23>.
  • ⁇ 25> The skin layer of a healthy person is evaluated, the stratum corneum thickness before and after contact with the test substance or article is measured, and the stratum corneum thickness after contact with the test substance or article is the stratum corneum before contact with the test substance or article. If the thickness is smaller than 2.2 times, preferably 2 times, more preferably 1.8 times the thickness, the barrier function is not changed, preferably the permeability of the substance from the outside to the inside is not enhanced.
  • ⁇ 26> The method according to any one of ⁇ 17> to ⁇ 21>, wherein an opening in the skin region is measured as the stratum corneum structure.
  • ⁇ 27> Measure the stratum corneum structure using a two-photon excitation microscope, measure the presence or absence of openings in the skin layer region, or calculate the ratio of the opening area to the skin region area in the stratum corneum structure, preferably The method according to ⁇ 26>, wherein the ratio of the opening area to the skin area of the stratum corneum is calculated.
  • ⁇ 28> In the range from the skin surface to a depth of up to 20 ⁇ m, preferably up to a depth of 15 ⁇ m, more preferably up to a depth of 12 ⁇ m, and a depth of at least 6 ⁇ m, preferably up to a depth of 9 ⁇ m, The method according to ⁇ 26> or ⁇ 27>, wherein the ratio of the opening area to the skin area of the stratum corneum is calculated.
  • the ratio of the opening area to the area of the skin area after contact of the test substance or article is 3% or more with respect to the ratio of the opening area to the area of the skin area before contact of the test substance or article,
  • it is increased by a change amount of preferably 4.5% or more, more preferably 8% or more it is evaluated that the barrier function is lowered, and preferably the permeability of the substance from the outside to the inside of the skin is enhanced.
  • ⁇ 35> Measuring the stratum corneum using a two-photon excitation microscope, a multiphoton excitation microscope, an in vivo confocal laser microscope, an optical coherence tomography, or an ultrasonic tomography apparatus, ⁇ 1> to ⁇ 10>, The method according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 20>, ⁇ 22>, ⁇ 24> to ⁇ 26>, and ⁇ 28> to ⁇ 34>.
  • the test substance is water or water vapor, skin cosmetic, skin moisturizer or external preparation for skin, active ingredient or medicinal ingredient contained in steam heating device, physiological saline, phosphate buffered saline, and biological origin
  • the method according to any one of the above items ⁇ 1> to ⁇ 35>, wherein the method is at least one selected from the group consisting of secretions and excrements of ⁇ 37>
  • the article is an absorbent article (preferably absorbent cotton, sanitary napkin, paper diaper, cloth diaper, training pants, adult diaper, sweat pad, urine pad, puerperal pad, panty liner, or absorbent pad),
  • the method is a steam heating device, a wound protection material (preferably a bandage, a gauze, or a bandage), a mask, or a rubber glove.
  • ⁇ 38> The method according to ⁇ 37>, wherein the absorbent article contains physiological saline, simulated urine, or the like.
  • ⁇ 39> Stores information on the relationship between the stratum corneum structure of the skin due to the contact of the test substance or article with human skin and the barrier function of the skin, and based on the information on the relation, the angle due to the contact of the test substance or article A system for evaluating the influence of a test substance or article on the barrier function of the skin from the change in the layer structure.
  • Test Example 1 Permeability of methyl nicotinate before and after water load and measurement of stratum corneum (1) Measurement of erythema score Healthy males and 10 females (20s to 40s) were subjects. A different amount of water was loaded on the inner side of the forearm, and the permeability of methyl nicotinate after the water load was evaluated. The measurement was performed after acclimatization for 20 to 30 minutes in an environment variable room at 24 to 25 ° C. and a relative humidity of 40 to 50%.
  • Moisture load per cm 2 of absorbent cotton is 0 mL (0 mL / cm 2 ), 0.02 mL (0.02 mL / cm 2 ), 0 on 2.5 cm ⁇ 2.5 cm member cut cotton (manufactured by White Cross)
  • Add distilled water to make 0.04 mL (0.04 mL / cm 2 ), 0.20 mL (0.20 mL / cm 2 ), place this on the inner side of the forearm, and use a moisture-permeable adhesive bandage (trade name: Skinnagate) to surround it. Fixed and affixed for 3 hours.
  • the surface of the member cut cotton that does not come into contact with the skin is covered with a dressing material (trade name: Tegaderm TM Transparent Dressing), and the dressing material is used to prevent the skin from stuffy during application. Made 8 holes per 1 cm 2 with a needle 29G (TERUMO, Japan). While applying the member cut cotton, the participants were prohibited from exercising or working outdoors for a long time.
  • a dressing material trade name: Tegaderm TM Transparent Dressing
  • a filter paper (trade name: Advantec No. 2) hollowed out to a diameter of 5 mm containing 5.0 ⁇ L of 0.007 mass% methyl nicotinate aqueous solution was loaded on the test site for 15 seconds. After 30 minutes from the load of methyl nicotinate, the resulting erythema was visually determined according to the following evaluation criteria. From the erythema score obtained by visual determination, the permeability of methyl nicotinate at each water load was evaluated. IBM SPSS version 23 software was used for statistical analysis. The results are shown in Table 1. (Evaluation criteria) Score 0: No response. Score 0.5: Slightly red.
  • Score 1 More than half of the area of the filter paper is red.
  • Score 2 The area on which the filter paper is applied is clearly red.
  • Score 3 larger than the area of the filter paper.
  • Score 4 Red area is larger than the area of the filter paper and swollen.
  • the load amount of water as compared with the case of 0.00mL / cm 2 or 0.02 mL / cm 2, to load a moisture 0.04 mL / cm 2 or 0.20 mL / cm 2
  • the erythema score due to methyl nicotinate was significantly increased. That is, the permeation of methyl nicotinate into the skin was significantly enhanced by applying a certain amount or more of moisture to the skin.
  • the skin barrier function is lowered when the water load is at least 0.04 mL / cm 2 . Therefore, the state of the skin when the moisture load is 0.04 mL / cm 2 can be set as a reference state for evaluating the barrier function of the skin.
  • Erythema is observed on the skin when the loaded methyl nicotinate penetrates or passes through the skin and acts on the peripheral blood vessels to exert a vasodilating action. As shown in Table 1, erythema is hardly observed on the skin before water load (water load: 0 mL / cm 2 ) even when methyl nicotinate is loaded. This is probably because methyl nicotinate is difficult to penetrate into the skin and cannot reach the peripheral blood vessels. That is, it can be inferred that the barrier function is maintained in the skin before moisture loading. On the other hand, erythema is observed in the skin after a certain amount of water load due to the load of methyl nicotinate. From this result, it can be determined that loading with moisture caused methyl nicotinate to penetrate or pass through the skin, that is, the barrier function of the skin was reduced.
  • oil immersion oil Immersol 518, ZEISS
  • ZEISS oil immersion oil
  • the stratum corneum appears white due to autofluorescence such as keratin with a peak mainly at 450 nm.
  • the stratum corneum region is white, that is, the skin is measured.
  • the part other than the skin hill is measured in black because there is no layer where the contact exists, that is, no autofluorescence, that is, it can be distinguished from the skin groove.
  • the area of the skin increases.
  • the cell nucleus appears black, and the autofluorescence of NADH derived from mitochondria appears granular around it. That is, a site where cell nucleus or NADH autofluorescence is detected can be distinguished from granule cells. In this way, imaging was performed up to the granular layer.
  • the measurement conditions of the two-photon excitation microscope are as follows. Excitation light 780nm Acquisition time per image 3.7 seconds Pixel size of image 256 ⁇ 256 pixel field of view 120 ⁇ 120 ⁇ m Step distance of consecutive images in the depth direction of the three nearby visual fields per site 1.2 ⁇ m
  • the cell nucleus appears black, and the autofluorescence of NADH derived from mitochondria appears granular around it, and granule cells appear.
  • Autofluorescence such as keratin was uniformly measured over the entire cuticle before water loading, whereas black openings in the skin area were measured after water loading.
  • FIG. 5 shows a two-photon excitation micrograph of a structure having a depth of 4.8 ⁇ m, and in other cases, a structure having a depth of 8.4 ⁇ m corresponding to the depth before the water load.
  • the water load was 0 mL / cm 2 or 0.02 mL / cm 2 , almost no openings were confirmed.
  • the stratum corneum thickness changed according to the amount of moisture to be applied. Specifically, when the water load was 0.02 mL / cm 2 , the stratum corneum thickness after the water load increased 1.34 times compared with that before the water load. Similarly, when the moisture load is 0.04 mL / cm 2 in the above-described reference state, the stratum corneum thickness after moisture load increases 1.90 times compared to before moisture load, and the moisture load is 0. It increased 2.18 times at 20 mL / cm 2 . Therefore, the stratum corneum thickness can be used as an index for evaluating the influence on the barrier function of the skin.
  • the amount of change in the stratum corneum thickness changed according to the amount of moisture to be applied. Specifically, compared to the amount of change in the stratum corneum thickness when the water load is 0.02 mL / cm 2 where the permeability of the substance is not enhanced, the water load of 0.04 mL / From cm 2 , it was found that the amount of change in stratum corneum increased greatly. Therefore, the amount of change in the stratum corneum thickness can also be used as an index for evaluating the influence on the skin barrier function.
  • the opening area ratio at a depth of 12 ⁇ m from the stratum corneum surface was calculated. From the image obtained by the two-photon excitation microscope, the area of the entire dermis surrounded by the skin groove was calculated by image processing software (ImageJ) according to a general method as described above with reference to FIG. . Next, the area of the opening (hole-shaped structure) included in the cuticle was calculated. When there were a plurality of openings, the areas of all the openings were added up. And the ratio of the total area of the opening part which occupies for the area of the whole cuticle was calculated by 100 fraction, and the opening area ratio was calculated. Then, the amount of change in the opening area ratio after moisture loading ((opening area ratio after moisture loading) ⁇ (opening area ratio before moisture loading)) after each moisture loading was calculated. The results are shown in Table 4. IBM SPSS version 23 software was used for statistical analysis.
  • the opening area ratio in the stratum corneum from the skin surface after moisture loading to 12 ⁇ m increased depending on the moisture loading. That is, the structure of the stratum corneum of the skin changed according to the amount of moisture to be applied. Therefore, the opening area ratio can also be used as the reference value in the evaluation method of the present invention.
  • Test Example 2 Performance Comparison Test of Absorbent Article (1) Moisture load on skin One healthy woman (30's) was the subject, and the effect of the absorbent article on the skin on the inner side of the forearm was evaluated. The measurement was performed after acclimatization for 20 to 30 minutes in an environment variable room at 24 to 25 ° C. and a relative humidity of 40 to 50%.
  • the aperture area ratio from the stratum corneum surface to a depth of 12 ⁇ m was measured with a two-photon excitation microscope, as in Test Example 1, and the amount of change in the aperture area ratio from the stratum corneum surface to a depth of 12 ⁇ m was calculated. Calculated. Table 5 shows the results of changes in the stratum corneum thickness, and Table 6 shows the results of changes in the opening area ratio.
  • the opening area ratio in the stratum corneum was increased as compared to the case where the absorbent article A was affixed. Further, the amount of change in the opening area ratio when the absorbent article A was affixed was the amount of change in the opening area ratio when the moisture load was 0.04 mL / cm 2 , which was the reference value in Test Example 1 ( 4.52 ⁇ 3.4 (%)). Therefore, even if the absorbent article A is pasted, it can be evaluated that the barrier function is not changed. On the other hand, since the amount of change in the opening area ratio when the absorbent article B is affixed is larger than the reference value, it can be evaluated that the barrier function decreases when the absorptive article B is affixed.
  • the absorbent article A when the absorbent article A was affixed, it was possible to evaluate that both the increase in the stratum corneum thickness and the change in the opening area ratio were small compared to the reference value. Therefore, when the absorbent article A is affixed, it is determined that the water-soluble substance has low permeability. When the absorbent article A was applied and the permeability of the water-soluble substance was actually judged, the permeability of the water-soluble substance from the outside to the inside of the skin was low. That is, from the above results, it can be said that the absorbent article A is an absorbent article that does not increase the permeability of the water-soluble substance to the skin and hardly causes skin troubles.

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Abstract

被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触した状態を所定時間維持する接触工程、　前記接触工程に続く、皮膚の任意の深さにおける角層の断面画像を取得する、接触後状態の取得工程、　前記の、接触後状態の取得工程において取得した角層の断面画像より、皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積とを取得する、接触後の皮丘領域の情報取得工程、及び　前記皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を演算する、開口部面積比演算工程、 を有する、被験物質又は物品のヒトの皮膚のバリア機能への影響を評価する方法。

Description

被験物質又は物品が皮膚に与える影響を評価する方法
　本発明は、被験物質又は物品が皮膚に与える影響を評価する方法に関する。
　皮膚は、体内からの水分や生体成分の損失、並びに外部からの異物の進入を防ぐ機能を有している。このような機能は一般に、「皮膚のバリア機能」と呼ばれている。皮膚のバリア機能は主に、皮膚の最外層に存在する角層が担っている。
　健常な皮膚の一般的性質として、角層の水分量は皮膚表面で約２０％～３０％であることが知られている。深さ方向へ進むにつれ徐々に水分量は増加し、表皮では水分量は約７０％となる。そして、角層は人の目に触れる部分であるため、化学物質などの異物が皮膚に侵入した場合、炎症などの肌トラブルが一目瞭然で認識される。
　また、おむつ、生理用品などの吸収性物品や、創傷保護材、マスク、ゴム手袋などで皮膚を被覆又は閉塞し、皮膚を湿潤状態におくと、皮膚トラブルが生じる場合がある。実際に多くの女性は、生理用品の使用期間中に、かゆみやかぶれ等の皮膚トラブルに悩んでいる。また、赤ちゃんのおむつかぶれも頻度高く認められている。このような皮膚トラブルも、汗、尿、経血などの水分が皮膚に接触することで、角層が水和、膨潤し、皮膚のバリア機能が低下するためと考えられている。
　これとは逆に、医薬品、医薬部外品、化粧料を皮膚に塗布してケアする場合、これらに含まれる有効成分を角層に十分に浸透させることが重要である。
　このように、角層に対する物質の浸透性は、医療分野や美容分野において非常に重要な要素の１つである。
　これまでに、ヒトの前腕内側に過剰な水分を含むガーゼやおむつを貼付した場合、皮膚の水分量が増加して角層が膨潤し、その結果ニコチン酸メチルの物質透過性が亢進することが知られている（非特許文献１参照）。このような現象に基づき、皮膚のバリア機能の評価方法として、ニコチン酸メチルを皮膚に塗布し評価する方法が汎用されている（例えば、非特許文献１～３参照）。この方法では、ニコチン酸メチルが有する血管拡張作用により誘導される紅斑に基づき、皮膚のバリア機能を評価する。
　しかし紅斑は、血流、外気温度、体温上昇、体温降下、身体の動き、発汗、被験者の皮膚色など、皮膚機能以外の要因によっても影響を受ける。よって、前述の方法ではバリア機能の評価結果が様々な要因（制御された環境や状況を除く）に左右されるおそれがあった。また、ニコチン酸メチルは血管拡張作用を有するため、被験者の皮膚にニコチン酸メチルを塗布すること自体、負担である可能性も考えられる。
Skin Res. Technol., 2002, vol. 8(1), p. 13-18 Contact Dermatitis, 1991, vol. 25(1), p. 35-38 Pharmaceutical Research, 2000, vol. 17(2), p. 141-147
　本発明は、被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触した状態を所定時間維持する接触工程、
　前記接触工程に続く、皮膚の任意の深さにおける角層の断面画像を取得する、接触後状態の取得工程、
　前記の、接触後状態の取得工程において取得した角層の断面画像より、皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積とを取得する、接触後の皮丘領域の情報取得工程、及び
　前記皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を演算する、開口部面積比演算工程、
を有する、被験物質又は物品のヒトの皮膚のバリア機能への影響を評価する方法に関する。
　また本発明は、被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させた後のヒトの角層の構造データを取得し、
　被験物質又は物品の接触後の角層の構造データと基準データとを比較することで、被験物質又は物品が、ヒトの皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷前に、ヒトの角層の初期構造データを取得し、
　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷終了直後に、角層厚、及び角層の断面写真を取得し断面写真より得られる皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積との比率である、皮丘領域の開口部面積比から選ばれる１又は２の構造データの取得と、指標物質を皮膚に適用して該指標物質の浸透度の測定を行い、
　初期構造データから水又は水溶液の負荷終了直後の構造データへの変化と、指標物質の浸透度から、指標物質の浸透度と水又は水溶液の負荷量との関連性を決定し、
　前記関連性が変化したときの前記構造データを、皮膚バリア機能の基準データとする、
被験物質又は物品の評価方法に関する。
　さらに本発明は、被験物質又は物品が皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
　皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を基準状態と設定し、
　被験物質又は物品をヒトの皮膚に１時間以上６時間以下接触させ、
　接触前後の皮膚の角層構造の変化の情報を取得し、
　取得した情報を基準状態と比較し、
　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、
被験物質又は物品の評価方法に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
本発明の好ましい実施態様を説明するフローチャートである。 角層構造における開口部面積比の算出方法を説明する図である。 皮膚への水分負荷前の２光子励起顕微鏡を用いて計測した角層の構造の変化を示す、皮膚の深さ方向の連続写真（図面代用写真）である。なお図３において、白抜きの矢印は細胞核を示す。 皮膚への水分の負荷量が０．２０mL/cm2の場合における、２光子励起顕微鏡を用いて計測した角層の構造の変化を示す、皮膚の深さ方向の連続写真（図面代用写真）である。なお図４において、白抜きの矢印は細胞核を示す。 ２光子励起顕微鏡を用いて撮影した、皮膚角層の図面代用写真である。図５（ａ）は、皮膚への水分負荷前の顕微鏡写真であり（皮膚表面からの深さ：４．８μｍ）、図５（ｂ）は、皮膚への水分負荷量が０．０２mL/cm2の場合の顕微鏡写真であり（皮膚表面からの深さ：８．４μｍ）、図５（ｃ）は、皮膚への水分負荷量が０．０４mL/cm2の場合の顕微鏡写真であり（皮膚表面からの深さ：８．４μｍ）、図５（ｄ）は、皮膚への水分負荷量が０．２０mL/cm2の場合の顕微鏡写真である（皮膚表面からの深さ：８．４μｍ）。なお図５（ｃ）及び（ｄ）において、白抜きの矢印は開口部(穴状構造)の存在部位を示す。 皮膚への水分の負荷後における、紅斑スコアの変化量と、角層厚の変化量とのプロット図である。 皮膚への水分の負荷後における、紅斑スコアの変化量と、角層表面から１２μｍの深さにおける開口部面積比の変化量とのプロット図である。
　本発明は、非侵襲的で、被験者に対して負担が少なく安全、簡便かつ短時間に、被験物質又は物品が皮膚バリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法を提供する。
　従来より、皮膚の最表層に位置する角層の水分による膨潤状態（水和状態）が皮膚のバリア機能に影響し、それに伴い皮膚への物質の透過性も変化することが考えられていた。よって、被験物質又は物品が皮膚と接触することによって生じる角層の水和状態を把握できれば、被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能にどのような影響を与えるかを、被験者に負担が少なく、様々な要因による影響を受けずに評価できるものと期待される。
　しかし、皮膚への物質透過性変化と、その際の皮膚内部の構造との関係性について、詳細には解明されていなかった。
　そこで本発明者らは、生きたヒト皮膚における物質の透過性と、皮膚の最表面に位置する角層の構造との間の関連性について検討を行った。その結果、角層の微細構造と、皮膚への物質の透過性との間で高い関連性があることを生きたヒトにおいて初めて見出した。そして、被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させた前後での、非侵襲的に計測した生きたヒトの皮膚の角層構造の変化から、被験物質又は物品が皮膚のバリア機能に与える影響を評価できることを見い出した。
　本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
　本発明では、角層の微細構造と皮膚のバリア機能との関連性に基づき、被験物質又は物品の接触前後の皮膚の角層構造から皮膚のバリア機能を評価する。よって本発明によれば、被験物質又は物品が皮膚に与える影響を安全、簡便かつ短時間に知ることができる。
　本発明では、図１に示すように、被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させ（S1）、被験物質又は物品の接触前後に角層構造の変化の情報を取得し（S2）、取得した情報から、前記被験物質又は物品が皮膚のバリア機能に与える影響を評価する（S3）。ここで、皮膚のバリア機能に与える影響の解析と評価は、角層構造と皮膚のバリア機能との関連性に基づいて行われる。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本明細書において「バリア機能」とは、皮膚外部から内部への物質の浸透性を指す。
　本明細書において「被験物質」とは、皮膚との接触や皮膚への適用により、皮膚内へ浸透する物質（例えば、化合物、化学物質、色素、生体由来の分泌物や排泄物、保湿剤、外用剤、化粧料）をいう。なお「被験物質」及び後述する「指標物質」には、水溶性成分や疎水性成分も包含される。物質の具体例としては、水若しくは水蒸気、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号（タートラジン）、赤色215号（ローダミンＢステアレート）、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、尿、汗、経血、便、擬似尿、擬似経血、擬似便、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分や薬効成分が挙げられる。
　まず、被験物質又は物品の皮膚への接触前後で、バリア機能の評価を行う部位の角層の構造を計測する。角層構造は、非侵襲的に計測することが好ましい。この場合、被験者に対して負担が少なく、安全に皮膚のバリア機能を評価できる。
　角層の構造を非侵襲的に計測する方法は、常法から適宜選択することができる。例えば、２光子励起顕微鏡、多光子励起顕微鏡、In vivo共焦点レーザー顕微鏡、光干渉断層計（ＯＣＴ）、超音波断層撮影装置などを用いる方法が挙げられる。
　本発明では、２光子励起顕微鏡などの、角層の構造を非侵襲的に計測できる装置を用いて、角層の内部構造、特に角層厚、皮丘領域に存在する開口部や、皮丘領域面積に対する開口部面積の比率など、を計測する。
　ヒトの皮膚に水分を負荷すると、角質細胞が膨潤した観察像や、また細胞間脂質の間にも水分が貯留した像が観察されていた。しかしこれまでの研究結果はいずれも皮膚片が必要であり非侵襲に皮膚内部の構造を観察することはできなかった。
　このような知見に対して、本発明者らは、角層厚や開口部などの角層の内部構造の変化が、皮膚の外部から内部への物質の浸透性の亢進に大きく寄与していることを生きたヒトではじめて見出した。後述の実施例でも示すように、角層の内部構造がある一定状態であれば、物質浸透性は亢進しない。しかし、角層の内部構造がある一定状態から変化すると、物質浸透性が亢進する。そこで本発明では、皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を「基準状態」と設定し、設定した基準状態を指標として皮膚のバリア機能を評価できることをはじめて見出した。なお、後述の実施例では、指標物質の代表例として、水溶性物質であるニコチン酸メチルの浸透性の評価を行った。角層の内部構造がある一定状態（基準状態）から変化すると、皮膚内への物質が分配されやすくなり、物質が皮膚により浸透すると考えられる。
　そして、本発明によれば、非侵襲的に計測した角層の内部構造から、前述の角層細胞や細胞間脂質の間で変化した現象を生きたヒトでかつ非侵襲で捉えることができる。
　本発明において、被験物質又は物品が皮膚バリア機能に与える影響を評価するための、角層の内部構造の基準状態は適宜設定することができる。以下、本発明における基準状態の設定方法ついて、具体例に基づき説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
　まず、水の負荷量を変えて皮膚への水負荷試験を行い、各水負荷量での皮膚の角層構造を常法により計測する。次に、測定した皮膚の角層構造と、皮膚のバリア機能との関連付けを行う。
　そして、皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認された状態に達したときの皮膚の角層構造を「基準状態」として設定する。「基準状態」の設定方法としては、皮膚外部から内部への前記指標物質の浸透性から設定する方法が挙げられる。前述の皮膚への水負荷試験に続いて皮膚への指標物質の負荷試験を行って指標物質の浸透性を常法により測定し、指標物質の浸透性に変化がみられたときの皮膚の角層構造を「基準状態」とすることができる。
　本発明おいて、皮膚への浸透性を評価するための指標物質は、適宜選択することができる。例えば、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分や薬効成分が挙げられる。
　本発明の好ましい態様として、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときや、バリア機能が一定の状態に達したときの、皮膚の任意の深さにおける皮丘領域面積に対する開口部面積の比率（以下、「開口部面積比」ともいう）を前記基準状態とすることが好ましい。
　本明細書において「開口部」とは、皮膚の表面から計測したとき角層内部に立体的に存在する球体、楕円球（以下、「穴状構造」ともいう）を皮膚表面と平行な横断面から計測される、長径が２μｍ～５０μｍの円状や楕円状の断面をいう。穴状構造は主に、角層上層から中層に存在する、角層内部の穴状や楕円状の構造体を指す。
　なお、穴状構造は、２光子励起顕微鏡を用いて、撮影間隔を１．２μｍとして、角層を皮膚の深さ方向に連続撮影した画像（例えば、図４参照）から、穴状構造は連続した円又は楕円として計測される。
　角層に水分を負荷すると、角質細胞は膨潤し、角層厚が増加する。水負荷がより強い条件では角層厚が更に増加するとともに角層構造に変化が生じ、穴状構造が形成される。
　水分の負荷による穴状構造の形成に関与する主な因子としては水分の負荷時間や水分量が挙げられる。これらの因子を調整することで穴状構造の形成を制御できる。具体的には、後述の実施例の方法に従うと、常温で一定以上の水分量を１時間以上ヒトの皮膚へ負荷した場合、角層の構造などが乱れ、その結果として穴状構造又はその断面である開口部が形成される。
　水負荷を解除した後、一定時間経過後は２光子励起顕微鏡で角層を観察すると穴状構造又は開口部は観察されない。穴状構造の形成は角層において可逆的な変化である。
　図４に示す、角層を皮膚の深さ方向に２光子励起顕微鏡で連続撮影した画像から、深さ方向の画像の撮影間隔は１．２μｍであることを踏まえると、穴状構造は連続した円又は楕円、すなわち開口部として観察される。
　本発明において、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときや、バリア機能が一定の状態に達したときの、角層厚を前記基準状態とすることもできる。
　本発明の別の好ましい態様として、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときや、バリア機能が一定の状態に達したときの角層構造の厚さ（以下、「角層厚」ともいう）を前記基準状態とすることが好ましい。本発明によれば、角層厚の変化を測定することで、定量的かつ客観的に皮膚のバリア機能に与える影響を評価できる。
　２光子励起顕微鏡で角層構造を深さ方向に計測し、一定の深さに達すると、黒い円状の細胞核とその周囲を取り囲む白い斑点が出現する。この斑点は顆粒層の細胞核の周囲に局在するミトコンドリア由来の蛍光である。よって、細胞核と周囲の白い斑点の有無で角層と顆粒層とを区別でき、角層表層から顆粒層が検出されるまでの領域の距離を角層厚とすることができる。
　さらに本発明において、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときや、バリア機能が一定の状態に達したときの基準状態の指標として、前記開口部面積比と角層厚とを組合せて用いてもよい。
　後述の実施例でも示すように、角層厚の変化と皮膚のバリア機能とは強い関連性を有し、角層厚が増加すると物質の皮膚への浸透性が亢進する。
　本発明の好ましい態様では、上述のような角層厚の変化とバリア機能との関連性に基づいて、被験物質又は物品の接触による角層厚の変化を計測し、計測結果から、被験物質又は物品の接触により皮膚のバリア機能に与える影響を評価する。
　例えば、皮膚を洗浄し、最低２０分間順化した後の健常者の皮膚を対象とし、被験物質又は物品の接触前の角層厚に対する被験物質又は物品の一定時間接触後の角層厚の変化量の基準値を、１．８倍、好ましくは２．０倍、より好ましくは２．２倍に設定する。そして、実際に測定した被験物質又は物品の接触後の角層厚が前記基準値以上増加した場合に、皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進し、被験物質又は物品の接触によりバリア機能は低下した、と評価できる。これに対して、角層厚の変化量が前記基準値より小さい場合、被験物質又は物品の接触によってもバリア機能は変化していないと評価できる。
　後述の実施でも示すように、開口部面積比も、皮膚のバリア機能に影響する。
　本発明では、２光子励起顕微鏡などを用いて開口部の有無や開口部面積比を計測又は算出することが好ましい。バリア機能との関連性を有する開口部面積比を算出することで、定量的かつ客観的に皮膚のバリア機能に与える影響を評価できる。
　本明細書において、開口部面積比は、角層の構造を非侵襲的に計測できる装置により得られた画像から皮溝で囲まれる皮丘全体の面積を画像処理ソフトウェアで算出する。次に、その皮丘内に含まれる開口部の全面積を算出する。そして、皮丘全体の面積に占める、開口部の総面積の割合を100分率で計算し、開口部面積比を算出する。
　角層構造における開口部面積比の算出方法を、図２を参照して具体的に説明する。ここで、図２（ａ）は、皮膚表面からの深さが４．８μｍの角層の内部構造を、２光子励起顕微鏡を用いて撮影した画像であり、図２（ｂ）は、皮膚表面からの深さが８．４μｍの角層の内部構造を、２光子励起顕微鏡を用いて撮影した画像である。
　まず、皮膚の深さ方向に連続で撮影した画像から角層の微細構造を３次元的にとらえ、およそ角層表層での角層が始まる領域と角層下層での顆粒層がはじまる領域を認識することで、角層の領域を区別する。そして、角層の表層、特に角層の領域が始まる画像ではまず皮溝と皮丘を区別する（図２の上段参照）。角層表層は不均一に起伏しているため、対物レンズの窓材には皮丘部分のみが密着しやすく、皮溝部分は対物レンズには密着しにくくコンタクト剤が存在する層となり構造等が存在しない、すなわち蛍光物質が存在しないため、計測することができない。一方で対物レンズと密着した皮丘は蛍光物質が存在するため計測可能であることから、皮丘と皮溝を区別できる。そして、皮溝と皮丘との境界線を点線で、皮丘の領域の中に含まれる開口部を実線で、それぞれ囲む（図２の下段参照）。
　次に、点線で囲んだ内部の面積の総和（皮丘全体の面積）と、実線で囲んだ部分の面積の総和（開口部の総面積）とを、それぞれ常法により算出する。そして、皮丘全体の面積に占める、開口部の総面積の割合を100分率で計算し、開口部面積比を算出する。
　本発明において開口部面積比を算出する範囲は、皮膚表面からの深さが、最大２０μｍまでの間の任意の深さとするのが望ましい。ただし、角層の深いところでは、励起光が減衰する。あるいは励起光による自家蛍光を検出する感度が低下する。そのため、皮膚表面からの深さが好ましくは１５μｍまで、より好ましくは１２μｍまで、の範囲がより望ましい。一方、皮膚の表面に近い、角層の浅いところでは、開口部（穴状構造）の形成が少ない。そのため、開口部面積比の算出は、皮膚表面からの深さが好ましくは６μｍまで、より好ましくは９μｍまでの範囲で、最低限行うことが望ましい。
　後述の実施例でも示すように、開口部面積比と皮膚のバリア機能とは強い関連性を有し、開口部面積比が増加するとニコチン酸メチルなどの指標物質の皮膚への浸透性が亢進する。
　本発明では、上述のような角層構造とバリア機能との関連性に基づいて、被験物質又は物品の接触前後の角層構造を計測し、角層構造の変化から皮膚のバリア機能に与える影響を評価する。
　例えば、皮膚を洗浄し、最低２０分間順化した後の健常者の皮膚を対象とし、皮膚表面から所定の深さまで（好ましくは皮膚表面（０μｍ）から最大で２０μｍの深さまで、好ましくは最大で１５μｍの深さまで、より好ましくは最大で１２μｍまで、かつ、少なくとも６μｍの深さまで、好ましくは９μｍの深さまで）における、被験物質又は物品の接触後の開口部面積比の変化量の基準値を、３％、好ましくは４．５%、より好ましくは８%に設定する。そして、実際に測定した被験物質又は物品の接触後の、皮膚表面から所定の深さにおける開口部面積比が前記基準値以上増加した場合に、皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進し、被験物質又は物品の接触によりバリア機能は低下した、と評価することができる。これに対して、開口部面積比の変化量が前記基準値より小さい場合、被験物質又は物品の接触によってもバリア機能は変化していないと評価できる。
　また、通常健常者の皮膚には穴状構造は計測されない場合が多いので、被験物質又は物品の接触前の開口部面積比を０％とし、被験物質又は物品の接触後の開口部面積比を開口部面積比の変化量としてもよい。
　本発明で用いる物品としては、例えば、吸収性物品（脱脂綿、生理用ナプキン、紙おむつ、布おむつ、トレーニングパンツ、成人用おむつ、汗止めパット、尿取りパット、産褥パット、パンティーライナー、吸収パットなど）、蒸気温熱具、創傷保護材（絆創膏、ガーゼ、包帯など）、マスク、ゴム手袋などが挙げられる。
　また、前記被験物質としては、水若しくは水蒸気、化粧料、保湿剤若しくは外用剤、蒸気温熱具に含まれる有効成分や薬効成分、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び生体由来の分泌物や排泄物である尿、汗、経血、便などが挙げられる。なお、本発明において、擬似尿、擬似汗、擬似経血、擬似便などは生体由来の分泌物や排泄物に含まれる。
　さらに、皮膚への被験物質又は物品の接触時間も適宜設定することができる。例えば、前記被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させる時間は、１時間以上６時間以下、好ましくは２時間以上４時間以下、より好ましくは２．５時間以上３．５時間以下、さらに好ましくは３時間程度、である。
　本発明の評価方法は前述のように、被験物質又は物品の接触前後の皮膚の角層構造を計測し、角層構造と皮膚のバリア機能との関連性に基づいて、計測した角層構造の変化から、被験物質又は物品の接触により皮膚のバリア機能、特に物質の浸透性に与える影響を評価する。
　また、前述の、角層構造とバリア機能との関連性に基づいて、非侵襲的に計測した角層構造から、角層の状態を知ることができる。
　例えば、皮膚を洗浄し、最低２０分間順化した後の健常者の皮膚を対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を測定する。そして、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を比較する。そして、被験物質又は物品の接触前後の角層厚の変化量の基準値を、１．８倍、好ましくは２．０倍、より好ましくは２．２倍に設定する。そして、実際に測定した被験物質又は物品の接触後の角層厚が前記基準値以上増加した場合に、角層のバリア機能が低下したと評価できる。
　あるいは、皮膚を洗浄し、最低２０分間順化した後の健常者の皮膚を対象とし、皮膚表面から初期の角層厚１２μｍ程度までの任意の深さにおける、被験物質又は物品の接触前後の開口部面積比を測定する。そして、被験物質又は物品の接触前後の開口部面積比を比較する。そして、被験物質又は物品の接触前後の開口部面積比の変化量の基準値を、３％、好ましくは４．５%、より好ましくは８%に設定する。そして、実際に測定した被験物質又は物品の接触後の開口部面積比が前記基準値以上増加した場合に、角層のバリア機能が低下したと評価できる。
　本発明の評価方法を利用して、吸収性物品（脱脂綿、生理用ナプキン、紙おむつ、布おむつ、トレーニングパンツ、成人用おむつ、汗止めパット、尿取りパット、産褥パット、パンティーライナー、吸収パットなど）、皮膚化粧料若しくは外用剤、創傷保護材（絆創膏、ガーゼ、包帯など）、マスク若しくはゴム手袋、蒸気温熱具などの製品の性能を評価することができる。
　例えば、吸収性物品、創傷保護材、並びにマスク若しくはゴム手袋については、これらの着用前後の皮膚のバリア機能を本発明の評価方法を利用して評価することで、これらの製品の性能（例えば、水分（濡れ）の吸収性、水蒸気（蒸れ）の外部への発散性、皮膚トラブルの起こしやすさ）を、安全で簡便に短時間で評価できる。なお、吸収性物品の評価の際には、生理食塩水や擬似尿などを含ませた吸収性物品を評価に用いてもよい。
　本発明により物品の着用や適用後の角層構造の変化を評価すれば、ヒトの皮膚に本実施例で使用したニコチン酸メチルなどの物質を塗布する必要なく、物質の透過性を評価することができる。具体的には、吸収性物品、創傷保護材、並びにマスク若しくはゴム手袋について、現行品と改良品との比較の際に、装着前後の角層厚や角層の穴状構造から物質透過性を推し量ることができる。このようにすれば、吸収性物品などの開発を効率よく行うことができる。
　また、皮膚の水和状態を利用して、化粧料、外用剤などに含まれる有効成分を皮膚に浸透させることができることが報告されている（例えば、J. Invest. Dermatol., 1963, vol. 41, p. 307-311参照）。よって、化粧料、外用剤、蒸気温熱具などの皮膚への塗布、貼付又は着用前後の皮膚のバリア機能を本発明の評価方法を利用して評価することで、これらの製品に含まれる有効成分などの皮膚への透過性を、安全で簡便に短時間で評価できる。
　本発明の、被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するためのシステムは、被験物質又は物品の接触による皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性に関する情報を格納し、関連性に関する情報に基づき、被験物質又は物品の接触による角層構造の変化から、前記影響を評価する。
　本発明のシステムはいわゆるコンピュータであり、例えば、バスで相互に接続される、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、メモリ、入出力インタフェース等を有する。メモリは、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ハードディスク、可搬型記憶媒体等である。入出力インタフェースは、表示装置や入力装置等のようなユーザインタフェース装置と接続される。入出力インタフェースは、ネットワークを介して他のコンピュータと通信を行う通信装置等と接続されてもよい。
　本発明の評価方法及び評価システムは、ヒトの皮膚、好ましくは、被験物質又は物品を負荷していない状態で正常なバリア機能を有するヒト（健常者）の皮膚、を対象とすることが好ましい。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の評価方法、及び評価システムを開示する。
＜１＞被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触した状態を所定時間維持する接触工程、
　前記接触工程に続く、皮膚の任意の深さにおける角層の断面画像を取得する、接触後状態の取得工程、
　前記の、接触後状態の取得工程において取得した角層の断面画像より、皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積とを取得する、接触後の皮丘領域の情報取得工程、及び
　前記皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を演算する、開口部面積比演算工程、
を有する、被験物質又は物品のヒトの皮膚のバリア機能への影響を評価する方法。
＜２＞前記被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させる時間が、１時間以上６時間以下、好ましくは２時間以上４時間以下、より好ましくは２．５時間以上３．５時間以下、より好ましくは３時間程度、である、前記＜１＞項に記載の方法。
＜３＞皮丘領域面積に対する開口部面積の比率と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を基準値として設定し、
　被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させ、皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を取得し、
　取得した皮丘領域面積に対する開口部面積の比率と基準値とを比較し、
　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚バリア機能に与える影響を評価する、
前記＜１＞又は＜２＞項に記載の評価方法。
＜４＞水の負荷量を変えて皮膚への水負荷試験を行い、
　皮膚の深さ方向における、皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を測定し、
　測定した開口部面積の比率と、皮膚のバリア機能とを関連付け、
　皮膚の任意の深さにおける開口部面積の比率と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの開口部面積の比率を、前記基準値として設定する、前記＜３＞項に記載の方法。
＜５＞皮膚のバリア機能の変化を確認するために、皮膚外部から内部への指標物質の浸透性をさらに測定し、指標物質の浸透性の結果から前記基準値を設定する、前記＜３＞又は＜４＞項に記載の方法。
＜６＞前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜５＞項に記載の方法。
＜７＞被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させた後のヒトの角層の構造データを取得し、
　被験物質又は物品の接触後の角層の構造データと基準データとを比較することで、被験物質又は物品が、ヒトの皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷前に、ヒトの角層の初期構造データを取得し、
　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷終了直後に、角層厚、及び角層の断面写真を取得し断面写真より得られる皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積との比率である、皮丘領域の開口部面積比から選ばれる１又は２の構造データの取得と、指標物質を皮膚に適用して該指標物質の浸透度の測定を行い、
　初期構造データから水又は水溶液の負荷終了直後の構造データへの変化と、指標物質の浸透度から、指標物質の浸透度と水又は水溶液の負荷量との関連性を決定し、
　前記関連性が変化したときの前記構造データを、皮膚バリア機能の基準データとする、
被験物質又は物品の評価方法。
＜８＞前記被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させる時間が、１時間以上６時間以下、好ましくは２時間以上４時間以下、より好ましくは２．５時間以上３．５時間以下、より好ましくは３時間程度、である、前記＜７＞項に記載の方法。
＜９＞皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を基準状態と設定し、
　被験物質又は物品の接触前後に取得した皮膚の角層の構造データを、前記基準状態と比較し、
　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚バリア機能に与える影響を評価する、
前記＜７＞又は＜８＞項に記載の方法。
＜１０＞前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜７＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を深さ方向に計測し、皮膚表面から、顆粒層の細胞核とその周囲に局在するミトコンドリアに由来する斑点が確認されるまでの距離を、前記角層厚として決定する、前記＜７＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１２＞健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の1.8倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは2.2倍以上増加した場合、バリア機能は低下した、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進した、と評価する、前記＜７＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１３＞健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の2.2倍、好ましくは2倍、より好ましくは1.8倍、の増加より小さい場合、バリア機能は変化していない、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性は亢進していない、と評価する、前記＜７＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１４＞皮膚表面から、最大で２０μｍの深さまで、好ましくは最大で１５μｍの深さまで、より好ましくは最大で１２μｍまで、かつ、少なくとも６μｍの深さまで、好ましくは９μｍの深さまで、の範囲で、角層構造における皮丘領域の開口部面積比を算出する、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１５＞健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域の開口部面積比を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域の開口部面積比が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域の開口部面積比に対して、３％以上、好ましくは４．５%以上、より好ましくは８％以上の値の変化量で増加した場合、バリア機能は低下した、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進した、と評価する、前記＜１＞～＜１０＞及び＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１６＞健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域の開口部面積比を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域の開口部面積比の変化量が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域の開口部面積比に対して、８％、好ましくは４．５%、より好ましくは３％の増加より小さい場合、バリア機能は変化していない、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性は亢進していない、と評価する、前記＜１＞～＜１０＞及び＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１７＞被験物質又は物品が皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
　皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を基準状態と設定し、
　被験物質又は物品をヒトの皮膚に１時間以上６時間以下、好ましくは２時間以上４時間以下、より好ましくは２．５時間以上３．５時間以下、より好ましくは３時間程度、接触させ、
　接触前後の皮膚の角層構造の変化の情報を取得し、
　取得した情報を基準状態と比較し、
　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、
被験物質又は物品の評価方法。
＜１８＞水の負荷量を変えて皮膚への水負荷試験を行い、
　皮膚の角層構造を測定し、
　測定した皮膚の角層構造と、皮膚のバリア機能とを関連付け、
　皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの皮膚の角層構造を、前記基準データ又は基準状態として設定する、
前記＜１７＞項に記載の方法。
＜１９＞皮膚のバリア機能の変化を確認するために、皮膚外部から内部への指標物質の浸透性をさらに測定し、指標物質の浸透性の結果から前記基準状態を設定する、前記＜１７＞又は＜１８＞項に記載の方法。
＜２０＞前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜１９＞項に記載の方法。
＜２１＞２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を計測する、前記＜１７＞～＜２０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２２＞前記角層構造として角層厚を測定する、前記＜１７＞～＜２１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２３＞２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を深さ方向に計測し、皮膚表面から、顆粒層の細胞核とその周囲に局在するミトコンドリアに由来する斑点が確認されるまでの距離を、前記角層厚として決定する、前記＜２２＞項に記載の方法。
＜２４＞健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の1.8倍以上、好ましくは2.0倍以上、より好ましくは2.2倍以上増加した場合、バリア機能は低下した、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進した、と評価する、前記＜２２＞又は＜２３＞項に記載の方法。
＜２５＞健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の2.2倍、好ましくは2倍、より好ましくは1.8倍、の増加より小さい場合、バリア機能は変化していない、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性は亢進していない、と評価する、前記＜２２＞又は＜２３＞に記載の方法。
＜２６＞前記角層構造として皮丘領域内の開口部を計測する、前記＜１７＞～＜２１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２７＞２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を計測し、皮丘領域内の開口部の有無を計測し、又は角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、好ましくは角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、前記＜２６＞項に記載の方法。
＜２８＞皮膚表面から、最大で２０μｍの深さまで、好ましくは最大で１５μｍの深さまで、より好ましくは最大で１２μｍまで、かつ、少なくとも６μｍの深さまで、好ましくは９μｍの深さまで、の範囲で、角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、前記＜２６＞又は＜２７＞項に記載の方法。
＜２９＞健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から所定の深さ、好ましくは皮膚表面から１２μｍの深さ、における、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、３％以上、好ましくは４．５%以上、より好ましくは８%以上、の値の変化量で増加した場合、バリア機能は低下した、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進した、と評価する、前記＜２６＞～＜２８＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３０＞健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から所定の深さ、好ましくは皮膚表面から１２μｍの深さ、における、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率の変化量が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、８%、好ましくは４．５%、より好ましくは３％、の増加より小さい場合、バリア機能は変化していない、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性は亢進していない、と評価する、前記＜２６＞～＜２８＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３１＞皮膚の角層構造を非侵襲的に計測する、前記＜１＞～＜３０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３２＞被験物質又は物品を負荷していない状態で正常なバリア機能を有するヒトの皮膚で評価する、前記＜１＞～＜３１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３３＞前記被験物質又は物品の接触後の皮膚の角層構造が、基準以上の変化量で変化した場合、バリア機能は低下した、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性が亢進した、と評価する、前記＜３＞～＜１１＞、＜１４＞、＜１７＞～＜２３＞、＜２６＞～＜２８＞、＜３１＞及び＜３２＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３４＞前記被験物質又は物品の接触後の皮膚の角層構造の変化量が、基準より小さい場合、バリア機能は変化していない、好ましくは皮膚外部から内部への物質の浸透性は亢進していない、と評価する、前記＜３＞～＜１１＞、＜１４＞、＜１７＞～＜２３＞、＜２６＞～＜２８＞及び＜３１＞～＜３３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３５＞２光子励起顕微鏡、多光子励起顕微鏡、In vivo共焦点レーザー顕微鏡、光干渉断層計、又は超音波断層撮影装置を用いて角層構造を計測する、前記＜１＞～＜１０＞、＜１２＞～＜２０＞、＜２２＞、＜２４＞～＜２６＞及び＜２８＞～＜３４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３６＞前記被験物質が、水若しくは水蒸気、皮膚化粧料、皮膚保湿剤若しくは皮膚外用剤、蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、並びに生体由来の分泌物若しくは排泄物からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜１＞～＜３５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３７＞前記物品が、吸収性物品（好ましくは脱脂綿、生理用ナプキン、紙おむつ、布おむつ、トレーニングパンツ、成人用おむつ、汗止めパット、尿取りパット、産褥パット、パンティーライナー、若しくは吸収パット）、蒸気温熱具、創傷保護材（好ましくは絆創膏、ガーゼ、若しくは包帯）、マスク、又はゴム手袋である、前記＜１＞～＜３５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜３８＞前記吸収性物品が生理食塩水又は擬似尿などを含有する、前記＜３７＞項に記載の方法。
＜３９＞被験物質又は物品のヒトの皮膚への接触による皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性に関する情報を格納し、関連性に関する情報に基づき、被験物質又は物品の接触による角層構造の変化から、被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するためのシステム。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１　水分負荷前後のニコチン酸メチルの透過性と、角層構造の測定
（１）紅斑スコアの測定
　健常な男性、女性１０名（２０代～４０代）を被験者とした。前腕内側に異なる量の水分を負荷し、水分負荷後のニコチン酸メチルの透過性を評価した。測定は、２４～２５℃、相対湿度４０～５０％の環境可変室で、２０～３０分順化した後に行った。
　２．５cm×２．５cmのメンバンカット綿（白十字社製）に、脱脂綿１cm2当たりの水分負荷量が０mL（０mL/cm2）、０．０２mL（０．０２mL/cm2）、０．０４mL（０．０４mL/cm2）、０．２０mL（０．２０mL/cm2）となるように蒸留水を含ませ、これを前腕内側にのせ透湿性絆創膏（商品名：スキナゲート）で周囲を固定し３時間貼付した。メンバンカット綿から水分が漏れるのを防ぐため、メンバンカット綿の皮膚と接しない面はドレッシング材（商品名：テガダームＴＭ トランスペアレント　ドレッシング）で覆い、貼付中に皮膚が蒸れるのを防ぐためドレッシング材は注射針29G（TERUMO, Japan）で１cm2当たり８個、穴をあけた。メンバンカット綿を貼付している間、試験参加者には運動や屋外での長時間の作業は禁止した。
　メンバンカット綿を除去した直後に、０．００７質量％ニコチン酸メチル水溶液５．０μＬを含ませた、直径５ｍｍにくり抜いたろ紙（商品名：Advantec No2）を試験部位に１５秒間負荷した。ニコチン酸メチルの負荷から３０分後に、生じた紅斑を下記の評価基準に従い目視判定を行った。
　目視判定により得られた紅斑スコアから、各水分負荷量でのニコチン酸メチルの透過性を評価した。統計解析にはＩＢＭ ＳＰＳＳバージョン２３のソフトウェアを使用した。
　その結果を表１に示す。
 
（評価基準）
スコア０　　：反応なし。
スコア０．５：若干紅い。
スコア１　　：ろ紙の面積の半分以上紅い。
スコア２　　：ろ紙を当てた面積がはっきり紅い。
スコア３　　：ろ紙の面積より大きく紅い。
スコア４　　：紅みがろ紙の面積より大きく、腫れている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、水分の負荷量が０．００mL/cm2又は０．０２mL/cm2の場合と比較して、０．０４mL/cm2又は０．２０mL/cm2の水分を負荷することで、ニコチン酸メチルによる紅斑スコアが有意に上昇した。すなわち、一定量以上の水分を皮膚に負荷することで、ニコチン酸メチルの皮膚への透過性が有意に亢進した。
　本試験例の健常なヒトの前腕において、水分の負荷量が少なくとも０．０４mL/cm2の場合に皮膚バリア機能が低下していると判断することができる。よって、水分負荷量が０．０４mL/cm2の場合の皮膚の状態を、皮膚のバリア機能を評価するための基準状態とすることができる。
　負荷されたニコチン酸メチルが皮膚へ浸透又は通過し、末梢血管に働きかけ血管拡張作用を示すと、皮膚上で紅斑が観察される。表１に示すように、水分負荷前の皮膚（水分負荷量：０mL/cm2）では、ニコチン酸メチルを負荷しても紅斑は観察されにくい。これは、ニコチン酸メチルが皮膚内へ浸透されにくく、末梢血管まで到達できないためと考えられる。すなわち、水分負荷前の皮膚では、バリア機能が維持されていると推察できる。一方、一定量以上の水分負荷後の皮膚では、ニコチン酸メチルの負荷によって紅斑が観察される。この結果から、水分を負荷することでニコチン酸メチルが皮膚へ浸透又は通過した、すなわち皮膚のバリア機能が低下したと判断できる。
（２）２光子励起顕微鏡を用いた角層構造の計測
　２．５cm×２．５cmのメンバンカット綿（白十字社製）に、脱脂綿１cm2当たりの水分負荷量が０．０２mL（０．０２mL/cm2）、０．０４mL（０．０４mL/cm2）、０．２０mL（０．２０mL/cm2）となるように蒸留水を含ませ、これを前記（１）項に記載の方法と同様の方法で前記被験者の前腕内側に３時間貼付した。
　メンバンカット綿の貼付前と、メンバンカット綿の除去直後に、メンバンカット綿を貼付した部位の皮膚の角層構造を２光子励起顕微鏡（商品名：DermaInspect、JenLab社製）で計測した。対物レンズとカバーガラスのそれぞれの界面の密接な光学的接触(optical contact)のため、対物レンズに油浸オイル(Ｉｍｍｅｒｓｏｌ 518, ZEISS)を滴下し、対物レンズとカバーガラスを密着させた。次に、同様の理由でカバーガラスにJohnson’s baby ベビーオイル（ジョンソン＆ジョンソン）を5μL～10μL程度滴下した後、皮膚を密着させた。角層はケラチンなどの自家蛍光を検出し、顆粒層まで撮影した。
　角層は主に４５０nmにピークを持つケラチンなどの自家蛍光により白く見える。角層の表層では角層の領域が白く、すなわち皮丘が計測される。一方、皮丘以外の部位はコンタクトが存在する層、すなわち自家蛍光が存在しないため黒く計測され、すなわち皮溝と識別できる。
　深さ方向に計測がすすむにつれ、皮丘の面積が増加する。さらに内部に進み深さ方向の連続画像を取得していくと、細胞核が黒く見え、その周囲にミトコンドリア由来のＮＡＤＨの自家蛍光が粒状に見える。すなわち、細胞核やＮＡＤＨの自家蛍光が検出された部位を顆粒細胞と識別できる。このようにして、顆粒層まで撮影を行った。
　なお、２光子励起顕微鏡の測定条件は以下の通りである。
励起光　７８０nm
１画像あたりの取得時間　３．７秒
画像のピクセル寸法　２５６×２５６ピクセル
視野　１２０×１２０μm
１部位につき近傍の３視野計測
深さ方向の連続画像のステップ間隔　１．２μm
　水分の負荷量が０mL/cm2の場合（水分負荷前または水負荷なし）と、０．２０mL/cm2の場合について、２光子励起顕微鏡を用いて、皮膚の深さ方向の角層の構造計測を行った。水分負荷前の結果を図３に、０．２０mL/cm2の場合の結果を図４に、それぞれ示す。
　図３及び４に示すように、水分負荷の前後で、角層内部の構造に穴状構造などの変化が見られた。角層は、主に４５０nmにピークを有するケラチンなどの自家蛍光により、白く見える。さらに内部に進み連続画像を取得していくと細胞核が黒く見え、その周囲にはミトコンドリア由来のＮＡＤＨの自家蛍光が粒状に見え、顆粒細胞が出現する。水分負荷前はケラチンなどの自家蛍光が皮丘全体に均一に計測されるのに対し、水分負荷後では皮丘領域内に黒く抜けた開口部が計測された。
　さらに、水分負荷量が０mL/cm2、０．０２mL/cm2、０．０４mL/cm2、０．２０mL/cm2の場合の、皮膚表面から所定の深さの角層、水負荷の場合では深さ４．８μｍと、それ以外の場合ではおよそ水負荷前の深さに該当する部位の深さ８．４μｍの構造を撮影した、２光子励起顕微鏡写真を図５に示す。
　図５に示すように、水分負荷量が０mL/cm2又は０．０２mL/cm2の場合、開口部はほとんど確認されなかった。そして、負荷する水分量の増加に伴い、角層内部の構造に変化が見られた。特に、表１に示したように水分負荷前と比較して皮膚のバリア機能が低下し、物質透過性が変化した水分負荷量０．０４mL/cm2の場合では、図５（ｃ）の白矢印で示したような開口部が計測された。
　さらに、水分負荷量をより多くすると、サイズのより大きい開口部が、高頻度で明瞭に計測された（図５（ｄ）参照）。その大きさは、水分負荷量が０．０４mL/cm2の場合では、およそ直径３μｍ～１０μｍ、Ｚ方向（皮膚の深さ方向）の大きさはおよそ２．４μｍ～３．６μｍであった。水分負荷量が０．２０mL/cm2の場合では、およそ直径３μｍ～３０μｍ、Ｚ方向の大きさはおよそ２．４μｍ～７．５μｍ、主には３．６μｍ～４．８μｍであった。
　よって、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するための指標として、角層に存在する開口部の有無を用いることができる。
　さらに、水分負荷による角層厚の変化についても、測定を行った。
　前述のように、角層は主に４５０nmにピークを持つケラチンなどの自家蛍光により白く見える。さらに内部に進み２光子励起顕微鏡により深さ方向の連続画像を取得していくと、細胞核が黒く見え、その周囲にミトコンドリア由来のＮＡＤＨの自家蛍光が粒状に見え、顆粒細胞が出現する。
　そこで、２光子励起顕微鏡により撮影した深さ方向の連続画像から、目視により角層の始まりと顆粒層が出現する地点を判断し、角層厚を算出した。例えば、図３に示す連続写真では、角層の始まりを１枚目の顕微鏡写真（深さ０μｍ）とし、顆粒層の出現を連続画像の１２枚目（深さ１３．２μｍ）以降と判断し、その差の枚数に連続画像の深さ方向の測定間隔である１．２μｍを掛け合わせ、角層厚１３．２μｍと算出した。
　その結果を表２に示す。統計解析にはＩＢＭ ＳＰＳＳバージョン２３のソフトウェアを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、負荷する水分量に応じて、角層厚が変化した。具体的には、水分負荷量が０．０２mL/cm2では、水分負荷後の角層厚は水分負荷前と比較して１．３４倍に増加した。同様に、前述の基準状態とした、水分負荷量が０．０４mL/cm2では、水分負荷後の角層厚は水分負荷前と比較して１．９０倍に増加し、水分負荷量が０．２０mL/cm2では２．１８倍に増加した。
　よって、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するための指標として、角層厚を用いることができる。
　さらに、水分負荷前後の角層厚の変化量についても算出した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、負荷する水分量に応じて、角層厚の変化量が変化した。具体的には、物質の浸透性が亢進していない水負荷量０．０２mL/cm2の場合の角層厚の変化量と比べて、より物質浸透性が亢進した水負荷量０．０４mL/cm2以降では、角層厚の変化量が大きく増加したことがわかった。
　よって、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するための指標として、角層厚の変化量も用いることができる。
　次に、角層表面から１２μｍまでの深さにおける開口部面積比を算出した。
　２光子励起顕微鏡により得られた画像から、図２を参照して前述したような、一般的な方法に準じて、皮溝で囲まれる皮丘全体の面積を画像処理ソフトウェア（ImageJ）で算出した。次に、皮丘内に含まれる開口部（穴状構造）の面積を算出した。開口部が複数ある場合は、全ての開口部の面積を合算した。そして、皮丘全体の面積に占める、開口部の総面積の割合を１００分率で計算し、開口部面積比を算出した。そして、各水分負荷量において、水分負荷後の開口部面積比の変化量（（水分負荷後の開口部面積比）－（水分負荷前の開口部面積比））を算出した。
　その結果を表４に示す。統計解析にはＩＢＭ ＳＰＳＳバージョン２３のソフトウェアを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、水分負荷後の皮膚表面から１２μｍまでの、角層における開口部面積比は、水分の負荷量に依存的して増加した。すなわち、負荷する水分量に応じて、皮膚の角層の構造が変化した。
　よって、本発明の評価方法における基準値として、開口部面積比も用いることができる。
（３）紅斑スコアと、角層構造とのプロット図の作成
　水分含有脱脂綿処理前後のニコチン酸メチルの透過性を示す紅斑スコアの変化値と、角層厚の変化量、又は角層表面から１２μｍまでの深さにおける開口部面積比の変化量とのプロット図を作成した。角層厚の変化量についての結果を図６に、開口部面積比の変化量についての結果を図７に、それぞれ示す。
　図６及び７に示すように、水の負荷量が少ないと、角層厚の変化量は少なく、開口部面積比は低く、紅斑スコアも極めて低い。一方、水の負荷量がある一定値以上増えると、角層厚の変化量や開口部面積比が増え、紅斑スコアも増える傾向が認められる。
　よって、２光子励起顕微鏡などで非侵襲的に計測した皮膚の角層構造から、水負荷量がある一定値以上増加すると物質の透過性が増えることがわかった。すなわち、２光子励起顕微鏡などで非侵襲的に計測した皮膚の角層構造から、基準状態における角層構造との比較により、皮膚のバリア機能を評価することができる。
試験例２　吸収性物品の性能比較試験
（１）皮膚への水分の負荷
　健常な女性１名（３０代）を被験者とし、吸収性物品が前腕内側の皮膚へ与える影響を評価した。測定は２４～２５℃、相対湿度４０～５０％の環境可変室で、２０～３０分順化した後に行った。
（２）２光子励起顕微鏡を用いた角層構造の計測
　２種類の吸収性物品（吸収性物品Ａ及び吸収性物品Ｂ）を５．０cm×５．０cmに切断して試験片を調製し、それぞれに生理食塩水３．０mLを注入し(０．１２mL/cm2試験片面積)、これらを前腕内側に３時間貼付した。なお、吸収性物品Ａは市販の使い捨ておむつであり、吸収性物品Ｂは市販の綿製のおむつである。
　試験片の貼付による角層厚の変化を、試験例１と同様、２光子励起顕微鏡で測定した。さらに、角層表面からの深さ１２μｍまでにおける開口部面積比を、試験例１と同様、２光子励起顕微鏡で測定し、角層表面からの深さ１２μｍまでにおける開口部面積比の変化量を算出した。
　角層厚の変化量の結果を表５に、開口部面積比の変化量の結果を表６に、それぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、吸収性物品Ａの貼付後は貼付前と比較して、角層厚は１．２１倍増加した。これに対して、吸収性物品Ｂの貼付後の角層厚は、貼付前と比較して２．０倍増加した。よって、吸収性物品Ａを貼付した場合と比較して、吸収性物品Ｂを貼付した場合の方が、角層厚の増加量が大きかった。
　また、吸収性物品Ａを貼付した場合の角層厚は、試験例１において基準値とした、水分負荷量が０．０４mL/cm2の場合の角層厚の増加分（１．９０倍）よりも小さかった。よって、吸収性物品Ａを貼付しても、バリア機能は変化していないと評価できる。一方、吸収性物品Ｂを貼付した場合の角層厚の増加分は、前記基準値よりも大きいので、吸収性物品Ｂを貼付するとバリア機能は低下すると評価できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、吸収性物品Ａを貼付した場合と比較して、吸収性物品Ｂを貼付した場合、角層における開口部面積比が増加していた。
　また、吸収性物品Ａを貼付した場合の開口部面積比の変化量は、試験例１において基準値とした、水分負荷量が０．０４mL/cm2の場合の開口部面積比の変化量（4.52±3.4（％））よりも少なかった。よって、吸収性物品Ａを貼付しても、バリア機能は変化していないと評価できる。一方、吸収性物品Ｂを貼付した場合の開口部面積比の変化量は、前記基準値よりも多いので、吸収性物品Ｂを貼付するとバリア機能は低下すると評価できる。
（３）物質透過性の評価
　試験片を除去した直後に、０．００７質量％の濃度のニコチン酸メチル水溶液を１５秒、試験片を貼付した皮膚に負荷し、ニコチン酸メチル処理から２０分後の紅斑スコアを試験例１と同様にして目視判定した。
　その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、吸収性物品Ａを貼付した場合と比較して、吸収性物品Ｂを貼付した場合紅斑スコアが上昇し、ニコチン酸メチルの透過性が亢進していた。
　上記結果に示すように、吸収性物品Ａを貼付した場合、角層厚の増加量、開口部面積比の変化量はいずれも、基準値に比べて小さいと評価できた。よって、吸収性物品Ａを貼付した場合は、水溶性物質の透過性が低いと判断される。吸収性物品Ａを貼付して水溶性物質の透過性を実際に判定したところ、皮膚の外側から内側への水溶性物質の透過性が低かった。すなわち吸収性物品Ａは、上記結果から、水溶性物質の皮膚への透過性は亢進されず、皮膚トラブルを起こしにくい吸収性物品であると言える。
　一方、吸収性物品Ｂを貼付した場合、角層厚の増加量、開口部面積比の変化量はいずれも、基準値に比べて大きいと評価できた。よって、吸収性物品Ｂを貼付した場合は、水溶性物質の透過性が高いと判断される。吸収性物品Ｂを貼付して水溶性物質の透過性を実際に判定したところ、皮膚の外側から内側への水溶性物質の透過性が上昇していたことがわかった。すなわち吸収性物品Ｂは、上記結果から、水溶性物質の皮膚への透過性が亢進され、皮膚トラブルを起こしやすい吸収性物品であると言える。
　以上より、本発明の方法に従って被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させ、接触前後の皮膚の角層構造の変化を計測した結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価する方法として有効であることが確認できた。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。

Claims (39)

  1. 　被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触した状態を所定時間維持する接触工程、
    　前記接触工程に続く、皮膚の任意の深さにおける角層の断面画像を取得する、接触後状態の取得工程、
    　前記の、接触後状態の取得工程において取得した角層の断面画像より、皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積とを取得する、接触後の皮丘領域の情報取得工程、及び
    　前記皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を演算する、開口部面積比演算工程、
    を有する、被験物質又は物品のヒトの皮膚のバリア機能への影響を評価する方法。
  2. 　前記被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させる時間が、１時間以上６時間以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 　皮丘領域面積に対する開口部面積の比率と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を基準値として設定し、
    　被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させ、皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を取得し、
    　取得した皮丘領域面積に対する開口部面積の比率と基準値とを比較し、
    　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚バリア機能に与える影響を評価する、
    請求項１又は２に記載の評価方法。
  4. 　水の負荷量を変えて皮膚への水負荷試験を行い、
    　皮膚の深さ方向における、皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を測定し、
    　測定した開口部面積の比率と、皮膚のバリア機能とを関連付け、
    　皮膚の任意の深さにおける開口部面積の比率と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの開口部面積の比率を、前記基準値として設定する、請求項３に記載の方法。
  5. 　皮膚のバリア機能の変化を確認するために、皮膚外部から内部への指標物質の浸透性をさらに測定し、指標物質の浸透性の結果から前記基準値を設定する、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
  7. 　被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させた後のヒトの角層の構造データを取得し、
    　被験物質又は物品の接触後の角層の構造データと基準データとを比較することで、被験物質又は物品が、ヒトの皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
    　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷前に、ヒトの角層の初期構造データを取得し、
    　水又は水溶液のヒトの皮膚への負荷終了直後に、角層厚、及び角層の断面写真を取得し断面写真より得られる皮丘領域面積と皮丘領域内の開口部面積との比率である、皮丘領域の開口部面積比から選ばれる１又は２の構造データの取得と、指標物質を皮膚に適用して該指標物質の浸透度の測定を行い、
    　初期構造データから水又は水溶液の負荷終了直後の構造データへの変化と、指標物質の浸透度から、指標物質の浸透度と水又は水溶液の負荷量との関連性を決定し、
    　前記関連性が変化したときの前記構造データを、皮膚バリア機能の基準データとする、
    被験物質又は物品の評価方法。
  8. 　前記被験物質又は物品をヒトの皮膚に接触させる時間が、１時間以上６時間以下である、請求項７に記載の方法。
  9. 　皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を基準状態と設定し、
    　被験物質又は物品の接触前後に取得した皮膚の角層の構造データを、前記基準状態と比較し、
    　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚バリア機能に与える影響を評価する、
    請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を深さ方向に計測し、皮膚表面から、顆粒層の細胞核とその周囲に局在するミトコンドリアに由来する斑点が確認されるまでの距離を、前記角層厚として決定する、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の1.8倍以上増加した場合、バリア機能は低下したと評価する、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の2.2倍の増加より小さい場合、バリア機能は変化していないと評価する、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　皮膚表面から、最大で２０μｍの深さまでの範囲で、角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、３%以上の値の変化量で増加した場合、バリア機能は低下したと評価する、請求項１～１０及び１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率の変化量が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、８％の増加より小さい場合、バリア機能は変化していないと評価する、請求項１～１０及び１４のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　被験物質又は物品が皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、被験物質又は物品の評価方法であって、
    　皮膚の物質浸透性が変化するときの角層の内部構造の状態を基準状態と設定し、
    　被験物質又は物品をヒトの皮膚に１時間以上６時間以下接触させ、
    　接触前後の皮膚の角層構造の変化の情報を取得し、
    　取得した情報を基準状態と比較し、
    　比較結果から、前記被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価する、
    被験物質又は物品の評価方法。
  18. 　水の負荷量を変えて皮膚への水負荷試験を行い、
    　皮膚の角層構造を測定し、
    　測定した皮膚の角層構造と、皮膚のバリア機能とを関連付け、
    　皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性から、皮膚のバリア機能に変化が確認されるときの皮膚の角層構造を、前記基準データ又は基準状態として設定する、
    請求項１７に記載の方法。
  19. 　皮膚のバリア機能の変化を確認するために、皮膚外部から内部への指標物質の浸透性をさらに測定し、指標物質の浸透性の結果から前記基準状態を設定する、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 　前記指標物質が、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ヘキシル、乳酸、黄色4号、赤色215号、カフェイン、ユビナール、カロテノイド、レチノール、並びに、皮膚保湿剤、皮膚外用剤、皮膚化粧料若しくは蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１９に記載の方法。
  21. 　２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を計測する、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記角層構造として角層厚を測定する、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を深さ方向に計測し、皮膚表面から、顆粒層の細胞核とその周囲に局在するミトコンドリアに由来する斑点が確認されるまでの距離を、前記角層厚として決定する、請求項２２に記載の方法。
  24. 　健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の1.8倍以上増加した場合、バリア機能は低下したと評価する、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 　健常者の皮膚を評価対象とし、被験物質又は物品の接触前後の角層厚を計測し、被験物質又は物品の接触後の角層厚が、被験物質又は物品の接触前の角層厚の2.2倍の増加より小さい場合、バリア機能は変化していないと評価する、請求項２２又は２３に記載の方法。
  26. 　前記角層構造として皮丘領域内の開口部を計測する、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
  27. 　２光子励起顕微鏡を用いて角層構造を計測し、皮丘領域内の開口部の有無を計測し、又は角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、請求項２６に記載の方法。
  28. 　皮膚表面から、最大で２０μｍの深さまでの範囲で、角層構造における皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出する、請求項２６又は２７に記載の方法。
  29. 　健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、３%以上の値の変化量で増加した場合、バリア機能は低下したと評価する、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 　健常者の皮膚を評価対象とし、皮膚表面から１２μｍの深さにおける、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率を算出し、被験物質又は物品の接触後の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率の変化量が、被験物質又は物品の接触前の皮丘領域面積に対する開口部面積の比率に対して、８%の増加よりも小さい場合、バリア機能は変化していないと評価する、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 　皮膚の角層構造を非侵襲的に計測する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 　被験物質又は物品を負荷していない状態で正常なバリア機能を有するヒトの皮膚で評価する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 　前記被験物質又は物品の接触後の皮膚の角層構造が、基準以上の変化量で変化した場合、バリア機能は低下したと評価する、請求項３～１１、１４、１７～２３、２６～２８、３１及び３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 　前記被験物質又は物品の接触後の皮膚の角層構造の変化量が、基準より小さい場合、バリア機能は変化していないと評価する、請求項３～１１、１４、１７～２３、２６～２８及び３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 　２光子励起顕微鏡、多光子励起顕微鏡、In vivo共焦点レーザー顕微鏡、光干渉断層計、又は超音波断層撮影装置を用いて角層構造を計測する、請求項１～１０、１２～２０、２２、２４～２６及び２８～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 　前記被験物質が、水若しくは水蒸気、皮膚化粧料、皮膚保湿剤若しくは皮膚外用剤、蒸気温熱具に含まれる有効成分若しくは薬効成分、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、並びに生体由来の分泌物若しくは排泄物からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 　前記物品が、吸収性物品、蒸気温熱具、創傷保護材、マスク、又はゴム手袋である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  38. 　前記吸収性物品が生理食塩水又は擬似尿などを含有する、請求項３７に記載の方法。
  39. 　被験物質又は物品のヒトの皮膚への接触による皮膚の角層構造と皮膚のバリア機能との関連性に関する情報を格納し、関連性に関する情報に基づき、被験物質又は物品の接触による角層構造の変化から、被験物質又は物品が、皮膚のバリア機能に与える影響を評価するためのシステム。
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