WO2018164281A1 - 果実等およびそれらの培養細胞を改質させる方法 - Google Patents

果実等およびそれらの培養細胞を改質させる方法 Download PDF

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fruit
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義幸 益村
森　大輔
俊二 鈴木
允周 三神
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    • Y02A40/90—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in food processing or handling, e.g. food conservation
    • Y02A40/924—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in food processing or handling, e.g. food conservation using renewable energies

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying cultured cells such as fruits, vegetables and fruits, and more particularly to a method for improving disease resistance and repellent effect, increasing sugar content, decreasing acidity, and increasing enzyme. It is.
  • Patent Document 3 A method for supplying electricity to a conventionally known plant will be described.
  • a method for supplying electricity to a plant body for example, in Patent Document 3, a potential difference is provided between a plant body and a medium, and a minute current is passed through the plant body, thereby passing a minute current from the medium to the plant body.
  • the plant can be activated and grown to control pests and insects.
  • a stem or a branch of a plant body is sandwiched between clips. That is, an electric current is passed from the epidermis of the plant body in contact with the clip to the culture medium (earth).
  • Patent Document 3 does not describe the effect of controlling diseases and insects and the increase or decrease of functional enzymes, and the mechanism thereof is unknown.
  • the present inventors have found that the enzyme contained in fruits such as grapes can be increased by applying electrical stimulation to fruit trees such as grapes.
  • the present invention improves fruit and the like by applying electrical stimulation to fruit trees such as grapes and vegetables, increases disease resistance and repellent effect of fruits and the like, increases sugar content and decreases acidity
  • An object of the present invention is to provide a method for improving the enzyme such as an increase in enzyme.
  • the method of the present invention comprises inserting an electrode and its counter electrode into different parts of a fruit tree or an annual plant, and contacting both electrodes with the internal tissue of the plant such as a tree.
  • fruit trees are used in the meaning of including root tree plants for fruit trees such as bananas, pineapples, papayas, and passion fruits in addition to perennial woody plants that attach fruits.
  • Fruit trees include herbaceous plants that are cultivated for 2 years or more.
  • Annual plant is a herbaceous plant that germinates, grows, blooms and bears within one year and dies.
  • Fruits such as melon, strawberry, watermelon, cabbage, lettuce, radish, carrot, burdock, eggplant, tomato Including vegetables such as cucumber, onion, pumpkin, spinach, potato, sweet potato.
  • disease resistance refers to a function that prevents a plant from invading pathogens and microorganisms, but is not limited to this, and repellent (repellent effect) that avoids insects and birds by the scent of the plant. Is also used to mean.
  • repellent repellent effect
  • the modification such as increase in disease resistance of fruits and the like is to increase the expression level of a gene that produces disease resistance protein inside the plant by applying voltage to the internal tissue of the plant in which the electrode is inserted.
  • the gene that produces the disease resistance protein is chitinase or ⁇ -1,3-glucanase having a function of killing pathogenic bacteria.
  • the electrode and its counter electrode are inserted as follows. 1) In the case of fruit trees Different stems, stems and branches, stems and fruits, different branches, branches and fruits, or different fruits 2) In the case of annual plant plants Different stems, stems and leaves, stems Part and fruit part, different leaf part, leaf part and fruit part, or different fruit part
  • the voltage to be applied is a DC voltage, an AC voltage or a pulse voltage in the range of 0.1 to 100 V depending on the size of the fruit tree and the insertion position of the electrode, and the location where the electrode is inserted
  • the temperature of the internal structure is adjusted to be less than 50 ° C.
  • the applied voltage is preferably in the range of 0.1 to 20 V so as not to give an excessive stimulus to the fruit tree or the plant. More preferably, it is in the range of 0.1 to 10V, and more preferably in the range of 0.1 to 5V.
  • the magnitude of the current flowing through the internal tissue varies depending on the arrangement of the electrodes, the distance between the electrodes, and the resistance of the internal tissue of the target plant, but reducing the amount of current places an excessive burden on the internal tissue. This is because it can be avoided.
  • a low voltage is applied and a weak current is allowed to flow through the internal tissue, or a pulse current is used so that the energy supplied to the tissue does not become excessively large.
  • the temperature of the internal tissue of the target plant becomes 50 ° C. or higher, enzymes and the like become unstable. Therefore, the temperature of the internal tissue at the position where the electrode is inserted is adjusted to be lower than 50 ° C.
  • a solar panel may be connected between the electrodes, and a voltage may be applied to a fruit tree or an annual grass plant only during the daytime.
  • the method of the present invention it is possible to increase disease resistance in fruits, tubers, bulbs, tubers or leaves.
  • the sugar content in fruits, tuberous roots, bulbs, tubers or leaves can be increased and the acidity can be decreased.
  • the fruit tree is a vine, it is possible to increase the anthocyanin content and resveratrol content of the grape fruit.
  • an electrode and its counter electrode are inserted into different parts of fruits, tubers, bulbs, tubers, or leaves, and a voltage is applied between the electrodes while both electrodes are in contact with the internal tissue. It is also possible to modify the fruit and the like, to increase the disease resistance of the fruit and the like, and to increase the sugar content and the acidity of the fruit and the like.
  • an electrode and its counter electrode are inserted into an aggregate of cultured cells of fruits, tubers, bulbs, tubers, or leaves, and both electrodes are brought into contact with the fruit cultured cells.
  • a cultured cell such as a fruit is modified by applying a voltage between the electrodes. It is also possible to increase the disease resistance of cultured cells such as fruits.
  • the voltage to be applied is a DC voltage, an AC voltage, or a pulse voltage in the range of 0.1 to 20 V, and may be adjusted so that the aggregate at the position where the electrode is inserted is less than 50 ° C. preferable.
  • the expression level of the gene that produces the disease-resistant protein can be increased in the cultured cells.
  • the gene producing the disease resistance protein is probable WRKY transcription factor 33-like or class IV chitinase.
  • the culture medium used for culture is not particularly limited.
  • the cultured cells are grape cultured cells, and it is possible to increase the expression level of a gene that produces stilbene synthase (STS), resveratrol synthase, or disease resistance protein by applying voltage to the grape cultured cells. It is.
  • the culture medium used for culture is not particularly limited.
  • Agricultural products harvested from the fruit tree or annual plant plant subjected to the above-described method of the present invention and secondary processed foods including fruit juice, fruit liquor and pickles using these agricultural products can be expected to be used in various ways. Secondary processed foods include fruit juice drinks, jelly, jam, wine and the like.
  • Secondary processed foods include fruit juice drinks, jelly, jam, wine and the like.
  • the cultured cells subjected to the above-described method of the present invention seedlings cultured from the cultured cells, fruits produced by growing the seedlings, tubers, bulbs, tubers, or leaves are also various agricultural products. Can be used.
  • the quality of fruits such as grapes and vegetables can be improved.
  • the disease resistance and repellent effect of fruits such as grapes and vegetables can be increased, and the sugar content, anthocyanin content, and resveratrol content of grape fruits are increased. There is an effect that can be done.
  • Example 1 Schematic diagram of experiment of Example 1
  • Flow diagram of a method for modifying the vines of Example 2 Schematic diagram of comparative experiment of Example 2
  • Characteristic graph of solar panel used for comparative experiment Graph showing the increase in sugar content of grapefruit Graph showing increased anthocyanin content of grapefruit Graph showing increased resveratrol content in grapefruit Graph showing grape fruit acidity and total acid decrease Graph showing increased chlorophyll content in vine leaves
  • Graph (1) which shows disease resistance of fruit tree Graph (2) which shows disease resistance of fruit tree Graph showing the expression level of genes that produce disease-resistant proteins
  • Graph showing the increase in sugar content of grapefruits (next year)
  • FIG. 1 shows a flow of a method for modifying grape cultured cells of this example.
  • an electrode and its counter electrode are inserted into an assembly of grape culture cells (S11), and both electrodes of the grape culture cell are brought into contact with the assembly (S12).
  • the electrodes are connected to the solar panel, and a voltage is applied between the electrodes by illumination light (S13).
  • the illumination light is adjusted so that the temperature of the grape cultured cell aggregate is less than 50 ° C. (S14). And it is confirmed whether the modification
  • untreated grape culture cells without electrodes were used. Grape cultured cells were prepared from Koshu grape cultivar (Koshu), which is a red grape cultivar with strong tree vigor, and was grown at 28 ° C. on a GB medium (sucrose concentration 20 g / L) shown in Table 1 below. Cultured in dark conditions.
  • Two grape cultivated cells subjected to the above-described current treatment were prepared, and two cultured cell lumps not subjected to current treatment were prepared as controls. These cells were allowed to stand for 4 hours in a 27 ° C. incubator. Thereafter, it was flash-frozen using liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C. Cells were placed in a mortar containing liquid nitrogen, homogenized using a pestle, and total RNA was isolated from the finely ground cells.
  • Microarray analysis of total RNA was performed using a genome array (Affymetrix). With the used DNA chip (Affymetrix), it is possible to measure the expression level of 14000 transcripts from vine grapes (Vitis vinifera) and 1700 transcripts from other grapes. The expression level data of each cell obtained by microarray analysis was analyzed.
  • the microarray analysis data contains a great deal of information, but the gene (2) above was selected.
  • a gene having a background ⁇ 100 and a ratio of expression level of electrical stimulation / control (Fold > change)> 2 (P value ⁇ 0.01) was defined as a gene whose expression was increased by electrical stimulation. This will be described in detail below.
  • the expression level of the gene (probable WRKY transcription factor 33-like, class IV chitinase) that encodes a protein that functions as a disease resistance (repellency) when the current treatment of the cultured cells of grapes is performed. It was suggested that the disease resistance was increased as a result. Increasing the disease resistance of fruits and the like leads to an increase in food safety by suppressing the occurrence of plant diseases and reducing the use of agricultural chemicals such as fungicides. Moreover, the appearance quality of a fruit can be improved. By applying the method of the present invention to various plants, it can be expected that the disease resistance is enhanced at a lower cost and the safety and quality of fruits and the like are enhanced.
  • resveratrol synthase is a stilbene derivative and a kind of polyphenol
  • the key enzyme for resveratrol synthesis is stilbene synthase.
  • Anthocyanins are glycoside components in which anthocyanidins are linked to sugars and sugar chains as aglycones, and are a kind of polyphenol. Anthocyanins are known to be a factor that greatly contributes to the color of red wine. From the microarray analysis data shown in Table 2 below, it was confirmed that a gene encoding an anthocyanin synthase (UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 6-like) was highly expressed by current treatment. Moreover, it was confirmed that two genes (probable WRKY transcription factor 33-like, class IV chitinase) encoding a protein functioning as disease resistance (repellency) are highly expressed by current treatment.
  • anthocyanin synthase-encoding gene UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 6-like
  • Anthocyanin is a purple pigment of blueberry and is known to have a high immediate effect on eye strain recovery and visual acuity improvement.
  • FIG. 3 shows a flow of a method for modifying the vine according to the present embodiment.
  • an electrode and its counter electrode are inserted into different locations on the trunk of the vine (S01). Both electrodes are brought into contact with the internal tissue of the vine trunk (S02). A voltage is applied between the electrodes by irradiating the solar panel with sunlight (S03). The specification of the solar panel to be used is adjusted so that the temperature of the internal tissue is less than 50 ° C. (S04). And sugar content, total acid, total phenol content, amino acid, and resveratrol content were measured from the fruit juice of grape fruit. Moreover, the chlorophyll content of the vine leaves was measured.
  • FIG. 6 is a graph showing an increase in sugar content (Brix value) of grape fruits. In the measurement graph of fruit juice sugar content shown in FIG.
  • Brix used as the sugar content of grape fruits is the refractive index converted to "grams of sucrose contained in 100 g of sucrose solution", and the conversion formula is the International Sugar Analysis Committee (ICUMSA). ). If most of the soluble solids in the sample are sugars, such as grape juice, it is common to treat Brix as sugar content.
  • FIG. 7 is a graph showing an increase in the anthocyanin content of grapefruit.
  • “*” indicates that a significant difference was observed at the 5% level as compared with the control. That is, it was confirmed that the anthocyanin content was significantly increased by current treatment. Therefore, it was determined that current treatment increased the anthocyanin content of the fruit.
  • FIG. 8 is a graph showing an increase in resveratrol content of grape berries.
  • “**” indicates that a significant difference was observed at a level of 1% compared to the control. That is, as compared with the control group, an increase in resveratrol content was observed at a level of 1% when current treatment was performed. This suggests that current treatment may increase the resveratrol content of fruits.
  • FIGS. 9 (1) and 9 (2) are graphs showing the acidity and the total acid decrease in the fruits of the vine.
  • “*” indicates a significant difference at a level of 5% compared to the control.
  • the measurement graph of the total acid (g / L) of the fruit of the vine shown in FIG. 9 (2) “*” indicates that a significant difference was observed at a level of 5% compared to the control.
  • 9 (1) and 9 (2) compared to the control group, a decrease in acidity and a decrease in total acid were observed in the experimental group with only current treatment and electrodes.
  • FIG. 10 shows a graph showing the increase in leaf chlorophyll content during the harvest time of vine fruit.
  • an increase in the chlorophyll content is observed in the experimental group with only current treatment and electrodes.
  • FIG. 11 shows a flow of a method for modifying the vine according to the present embodiment.
  • an electrode and its counter electrode are inserted into different locations on the trunk of the vine (S01). Both electrodes are brought into contact with the internal tissue of the vine trunk (S02).
  • a voltage is applied between the electrodes by irradiating the solar panel with sunlight (S03).
  • the specification of the solar panel to be used is adjusted so that the temperature of the internal tissue is less than 50 ° C. (S04). Then, the number of healthy bunches of grape fruits was measured, and the incidence of disease was measured.
  • two sets of electrodes 4 and solar panels 3 are installed on one tree, and a current section in which current treatment is performed, and only the electrodes are inserted as a comparison control.
  • Three types of vines were used: an electrode group not connected to a solar panel and not subjected to current treatment (electrode only), and an untreated control group without treatment (no treatment).
  • the performance of the solar panel is the same as in Example 2.
  • Example 2 the fruit tree was a typical red wine grape cultivar “Merlot” that originated in Bordeaux, France.
  • FIG. 13 is a graph showing the disease resistance (repellency) of vines. In each of the current group (current treatment), the electrode group (electrode only), and the control group (no treatment), the grapevine and the disease are affected.
  • RNA ribonucleic acid
  • FIG. 14 is a graph showing the expression level of a gene that produces disease resistance protein.
  • four graphs are shown, the horizontal axis represents the number of days after the current process, and the vertical axis represents the relative intensity.
  • Proteins encoded by the four genes (chitinase I, chitinase IV, ⁇ -1,3-glucanase, and thaumatin-like protein) are all involved in disease resistance.
  • chitinase and ⁇ -1,3-glucanase are proteins that have the effect of directly degrading the cell walls of pathogenic bacteria and killing pathogenic bacteria, and are effective against a wide variety of pathogenic bacteria. is there. As shown in FIG.
  • FIGS. 15 to 19 are graphs showing measurement results of increase / decrease in sugar content, increase / decrease in anthocyanin content, increase / decrease in resveratrol content, increase / decrease in acidity, and increase / decrease in leaf chlorophyll content in the following fiscal year, respectively. .
  • Example 2 when it confirmed about the increase in the total phenol content in the fruit of a vine, as shown in FIG. 20, about the fruit of a vine, the total phenol content of a grape fruit in the experimental section of an electric current treatment. It was confirmed that was significantly higher.
  • the total phenol content was measured by centrifuging the fruit juice at 16,000 ⁇ g, and then filtering the supernatant with a 0.2 ⁇ m membrane filter (Pall), and measuring the total phenolic compound in the filtrate.
  • anthocyanins and resveratrol in the fruits increased in the vines given electrical stimulation.
  • the electrical stimulation increased the anthocyanin content and resveratrol content of the vine fruits to which electrical stimulation was applied in both of the two years compared to the control and electrode treatment groups.
  • the resveratrol content of the vine fruit treated with electrical stimulation increased by 200-300% compared to the control.
  • the present invention is useful for improving the quality of agricultural products such as fruits and vegetables.
  • it is useful for improving disease resistance and repellent effect of agricultural products.

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Abstract

ブドウ等の果樹や野菜に電気刺激を与えることにより、果実等を改質させ、果実等の病害抵抗性や忌避効果の増大、糖度の増加や酸度の減少、酵素の増加といった改質を図る方法を提供する。果樹又は一年生草木植物の異なる箇所に電極とその対極を挿入し、両電極を内部組織に接触させた状態で、電極間に電圧を印加して、果実等を改質させ、例えば、病害抵抗性を増大させる。果樹とは、果実をつける永年性の木本性植物に加えて、バナナ、パイナップル、パパイヤ、パッションフルーツなどの果樹の台木用植物を含む。これにより、植物内部で病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を増大させ、又は、果実の糖度を増加させ、酸度を減少させることができる。特に、果樹がブドウ樹である場合には、ブドウ果実のアントシアニン含有量やレスベラトロール含有量を増加させることができる。

Description

果実等およびそれらの培養細胞を改質させる方法
　本発明は、果実、野菜、および果実等の培養細胞を改質させる方法、特に、病害抵抗性や忌避効果の増大、糖度の増加や酸度の減少、酵素の増加といった改質を図る方法に関するものである。
　近年、炭酸ガス濃度の増加に伴う地球温暖化の問題から、植物や森林の保護とそれらの活性化による必要性がクローズアップされている。
　かかる状況下、植物生体の機能的活性化と成長を図る農業技術として、植物生体の内側の内部高電位と表皮サイドの外部低電位とを結ぶ通電体を、外部の表皮サイドより植物生体に差し込み、植物生体の表皮サイドの電位を増大させることにより、植物生体の機能的活性化と成長の促進を図る技術が知られている（特許文献１，２を参照）。
従来公知の植物体に電気を流す方法について説明する。植物体に電気を流す方法として、例えば、特許文献３には、植物体と培地間に電位差を設け、植物体内に微電流を通電することにより、培地内から植物体内に微電流を通電させて、植物の活性化や生長を図り、病虫害の防除を図れるとするものである。しかしながら、特許文献３の技術では、クリップで植物体の茎や枝を挟むものである。すなわち、クリップと接する植物体の表皮から培地（アース）に電流を流すものである。また、特許文献３には、病虫害の防除の効果や機能性の酵素の増減についての記載はなく、そのメカニズムも不明であった。
特開２００９－２７８９６３号公報 国際公開パンフレットＷＯ２０１１／０５２２０３ 特開平７－７５４４６号公報
　従来から植物体に電気を流して成長を促すことが様々な文献で言われているが、これらの技術は植物体と培地との間に電圧を印加して電流を流すものである。
　また、上述した植物生体の機能的活性化と成長の促進を図る技術では、植物生体の中心柱の近傍の電位と外部の皮層近傍の電位は中心柱近傍電位が約１５０～２００ｍＶ電位が高いことに着目し、また、植物全体がそれぞれ有する極性的電位である自己の生体電位（培地と生体茎）が、植物生体の成長力を示す指標として用いられることに着目して、通電体を挿し込んで電位バランスの調整を図るものである。
　本発明者らは、ブドウ等の果樹に電気刺激を与えることにより、ブドウ等の果実に含まれる酵素を増加させることができることを知見した。かかる状況に鑑みて、本発明は、ブドウ等の果樹ならびに野菜に電気刺激を与えることにより、果実等を改質させ、果実等の病害抵抗性や忌避効果の増大、糖度の増加や酸度の減少、酵素の増加といった改質を図る方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決すべく、本発明の方法は、果樹又は一年生草木植物の異なる箇所に電極とその対極を挿入し、両電極を樹木など植物の内部組織に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することによって果実等を改質させるものである。
　本明細書において、果樹とは、果実をつける永年性の木本性植物に加え、バナナ、パイナップル、パパイヤ、パッションフルーツなどの果樹の台木用植物を含む意味で用いている。また、果樹には、２年以上栽培する草本植物を含む。また、一年生草木植物は、一年以内に発芽，生長，開花，結実を完了して枯れる草本植物であり、メロン、イチゴ、スイカなどの果物、キャベツ、レタス、大根、ニンジン、ゴボウ、ナス、トマト、キュウリ、タマネギ、カボチャ、ホウレンソウ、ジャガイモ、サツマイモなどの野菜を含む。
　上記の改質は、例えば、果実等の病害抵抗性の増大である。本明細書において、病害抵抗性とは、植物が病原菌や微生物が侵入しようとするのを妨げる機能をいうが、これにとどまらず、植物の香りにより、虫や鳥を避ける忌避性（忌避効果）も含まれる意味で用いている。病害抵抗性を高めることにより、植物の病気の発生を抑制できるものである。また、忌避性（忌避効果）を高めることにより、葉や果実を食べる虫や動物などを植物に寄せ付けなくすることができる。
　ここで、果実等の病害抵抗性の増大といった改質は、電極を挿入した植物の内部組織に対する電圧印加により、植物内部で病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を増大させることである。病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子は、具体的には、病原菌を殺菌する作用を有するキチナーゼ（chitinase）、又は、β-1,3-グルカナーゼ（β-1,3-glucanase）である。
　本発明の方法において、電極とその対極を挿入する箇所としては下記の通りである。
１）果樹の場合
　異なる幹部、幹部と枝部、幹部と果実部、異なる枝部、枝部と果実部、若しくは異なる果実部
２）一年生草木植物の場合
　異なる茎部、茎部と葉部、茎部と果実部、異なる葉部、葉部と果実部、若しくは異なる果実部
　本発明の方法において、印加する電圧は、果樹の大きさ、電極の挿入位置に応じて、０．１～１００Ｖの範囲の直流電圧、交流電圧又はパルス電圧であり、かつ、電極を挿入した箇所の内部組織の温度が５０℃未満となるように調整される。果樹や草木植物に過度な刺激を与えないようにするため、印加する電圧は、０．１～２０Ｖの範囲とすることが好ましい。より好ましくは、０．１～１０Ｖの範囲、さらに好ましくは、０．１～５Ｖの範囲にする。内部組織に流れる電流の大きさは、電極の配置、電極間の距離によって、また、対象となる植物の内部組織の抵抗により異なるが、電流量を小さくする方が内部組織に過度の負担がかかることを回避できるからである。対象となる植物の大きさなどによって、低電圧を印加し微弱電流を内部組織に流すか、パルス電流とし、組織に供給するエネルギーが過度に大きくならないようにする。対象となる植物の内部組織の温度が５０℃以上になると、酵素などが不安定になるため、電極を挿入した箇所の内部組織の温度が５０℃未満となるように調整する。
　本発明の方法では、例えば、電極間に太陽光パネルを接続し、昼間のみに果樹又は一年生草木植物に電圧を印加させることでもよい。
　本発明の方法によって、果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉における病害抵抗性を増大させることが可能である。
　本発明の方法によって、果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉における糖度を増加させ、酸度を減少させることができる。特に、果樹がブドウ樹である場合には、ブドウ果実のアントシアニン含有量とレスベラトロール含有量を増加させることが可能である。
　また、本発明の方法では、果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の異なる箇所に電極とその対極を挿入し、両電極を内部組織に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することにより果実等を改質させることも可能であり、果実等の病害抵抗性を増大させ、更に、果実等の糖度の増加や酸度の減少を図ることも可能である。
　本発明の果実等の培養細胞を改質させる方法では、果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の培養細胞の集合体に電極とその対極を挿入し、両電極を果実培養細胞に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することにより果実等の培養細胞を改質させるものである。果実等の培養細胞の病害抵抗性を増大させることも可能である。
　ここで、印加する電圧は、０．１～２０Ｖの範囲の直流電圧、交流電圧又はパルス電圧であり、かつ、電極を挿入した箇所の集合体が５０℃未満となるように調整されることが好ましい。
　培養細胞に対する電圧印加により、培養細胞において、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を増大させることができる。病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子は、具体的には、probable WRKY transcription factor 33-like、又は、class IV chitinaseである。なお、培養に用いる培地などは特に限定されない。
　培養細胞に対する電圧印加により、培養細胞において、酵素等を産出する遺伝子の発現量を増大させることができる。特に、培養細胞がブドウ培養細胞であり、ブドウ培養細胞に対する電圧印加により、スチルベン合成酵素（ＳＴＳ）、レスベラトロール合成酵素、又は病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を増大させることが可能である。
　なお、培養に用いる培地などは特に限定されない。
　上述の本発明の方法を施した果樹又は一年生草木植物から収穫された農産物、それらの農産物を用いた果汁、果実酒、漬物を含む２次的加工食品は、様々な利用が期待できる。２次的加工食品とは、果汁飲料、ゼリー、ジャム、ワインなどである。
　また、上述の本発明の方法を施した培養細胞、その培養細胞から培養された苗木、その苗木を生育して収穫された果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の何れかの農産物も様々な利用が期待できる。
　本発明の方法によれば、ブドウ等の果実や野菜の品質を向上できるといった効果がある。特に、本発明の方法によれば、ブドウ等の果実や野菜の病害抵抗性や忌避効果を増大できるといった効果があり、ブドウ樹の果実の糖度、アントシアニン含有量、及びレスベラトロール含有量を増大できるといった効果がある。
実施例１のブドウ培養細胞を改質させる方法のフロー図 実施例１の実験の模式図 実施例２のブドウ樹を改質させる方法のフロー図 実施例２の比較対照実験の模式図 比較対照実験に用いたソーラーパネルの特性グラフ ブドウ果実の糖度の増大を示すグラフ ブドウ果実のアントシアニン含有量の増大を示すグラフ ブドウ果実のレスベラトロール含有量の増大を示すグラフ ブドウ果実の酸度、総酸の減少を示すグラフ ブドウ樹の葉のクロロフィル含有量の増大を示すグラフ 実施例３の果実等の病害抵抗性（忌避性）を増大させる方法のフロー図 果樹の病害抵抗性を示すグラフ（１） 果樹の病害抵抗性を示すグラフ（２） 病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を示すグラフ ブドウ果実の糖度の増大を示すグラフ（次年度） ブドウ果実のアントシアニン含有量の増大を示すグラフ（次年度） ブドウ果実のレスベラトロール含有量の増大を示すグラフ（次年度） ブドウ果実の総酸の減少を示すグラフ（次年度） ブドウ樹の葉のクロロフィル含有量の増大を示すグラフ（次年度） ブドウ果実の総フェノール含有量の増大を示すグラフ
　以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
（ブドウ培養細胞に対する電流刺激について）
　ブドウ培養細胞に電気刺激を与えることによって、ブドウ培養細胞を改質できることについて説明する。
　図１は、本実施例のブドウ培養細胞を改質させる方法のフローを示している。図１に示すように、ブドウ培養細胞の集合体に電極とその対極を挿入し（Ｓ１１）、ブドウ培養細胞の両電極を集合体に接触させる（Ｓ１２）。電極はソーラーパネルと繋がっており、照明光により電極間に電圧を印加する（Ｓ１３）。ブドウ培養細胞の集合体の温度が５０℃未満となるように照明光を調整する（Ｓ１４）。そして、ブドウ培養細胞における改質（酵素の増加、病害抵抗性の向上）が生じるか否かの確認を行う。
　具体的には、図２の模式図に示すように、容器に入れたブドウ培養細胞にステンレス製の電極を挿して、両電極を内部組織に接触させた状態で、蛍光灯に照らしたソーラーパネルに繋げ、電極間に４．５Ｖの電圧を４時間印加し、ブドウ培養細胞に対して電流処理を行った。その後、発現する遺伝子について確認（マイクロアレイ解析を用いて確認）を行った。比較対照として、電極を挿していない無処理のブドウ培養細胞を用いた。
　ブドウ培養細胞は、赤系ブドウ品種で樹勢が強い甲州ブドウ由来の品種（甲州）から培養細胞を作製し、下記表１に示すＧＢ培地（ショ糖濃度２０ g／Ｌ）上で、２８℃、暗条件で培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述の電流処理を施したブドウ培養細胞を２塊用意し、またコントロールとして電流処理を施していない培養細胞２塊を用意した。これらの細胞を２７℃の恒温器で４時間静置した。その後、液体窒素を用いて瞬間冷凍し、－８０℃で保存した。液体窒素を含む乳鉢に細胞を入れ、乳棒を用いてホモジナイズし、微粉砕した細胞から全ＲＮＡを単離した。
　ゲノムアレイ（Affymetrix社製）を用いて、全ＲＮＡのマイクロアレイ分析を行った。使用したＤＮＡチップ（Affymetrix製）では、醸造用ブドウ（Vitis vinifera）からの14000転写産物と他のブドウからの1700転写産物の発現量を計測することが可能である。マイクロアレイ解析により得られた各細胞の発現量データについて解析を行った。
　マイクロアレイ解析データより、ＤＮＡチップ上の各遺伝子が電流処理によりどのように発現変動しているかを計算し、以下の基準により、標的とするべき遺伝子を選抜した。
（１）ＤＮＡチップ上の全遺伝子のうち、２倍以上あるいは２分の１以下発現変動した遺伝子
（２）上記（１）の遺伝子の内、機能が明確で、ブドウ果実の品質に関与すると推定される遺伝子
（３）上記（１）の遺伝子の内、機能が未知な遺伝子
　マイクロアレイ解析データは非常に多くの情報を含んでいるが、上記（２）の遺伝子が選抜された。バックグラウンド＜100、電気刺激／対照の発現量の比（Fold change）＞２（Ｐ値＜０．０１）となった遺伝子を、電気刺激によって発現が増大した遺伝子と定義した。以下に詳細に説明する。
　マイクロアレイ解析データから、下記表２に示すように、病害抵抗性（忌避性）として機能するタンパク質をコードする２つの遺伝子（probable WRKY transcription factor 33-like，class IV chitinase）が電流処理により高発現することが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表２に示すマイクロアレイ解析データから、ブドウ培養細胞への電流処理が、病害抵抗性（忌避性）として機能するタンパク質をコードする遺伝子（probable WRKY transcription factor 33-like，class IV chitinase）の発現量を増大し、結果として病害抵抗性を高めることが示唆された。
　果実等の病害抵抗性を高めることは、植物の病気の発生を抑制して、殺菌剤などの農薬の使用量を減らすことによって、食の安全性を高めることにつながる。また、果実の外観品質を高めることができる。種々の植物に対して、本発明の方法を施すことにより、より低コストで病害抵抗性を高め、果実等の安全性や品質を高めることが期待できる。
　また、マイクロアレイ解析データからstilbene synthaseをコードする遺伝子の発現量を確認したところ、下記表３に示すように、スチルベン合成酵素をコードする３つの遺伝子（stilbene synthase 2， stilbene synthase 4，stilbene synthase 1-like）と、レスベラトロール合成酵素をコードする遺伝子（resveratrol synthase）の４つの遺伝子が電流処理により高発現することが確認できた。ここで、レスベラトロールはスチルベン誘導体でポリフェノールの一種であり、レスベラトロール合成の鍵酵素はstilbene synthaseである。
　また、アントシアニンは、アントシアニジンがアグリコンとして糖や糖鎖と結びついた配糖体成分でポリフェノールの一種である。アントシアニンは、赤ワインの色に大きく寄与する因子であることが知られている。下記表２に示すマイクロアレイ解析データから、アントシアニン合成酵素をコードする遺伝子（UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 6-like）が電流処理により高発現することが確認できた。
　また、病害抵抗性（忌避性）として機能するタンパク質をコードする２つの遺伝子（probable WRKY transcription factor 33-like，class IV chitinase）が電流処理により高発現することが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記表３に示すマイクロアレイ解析データから、ブドウ培養細胞への電圧印加による電流刺激（電流処理）が、stilbene synthase遺伝子の発現量を増大し、結果としてレスベラトロールの合成量を増やすことが示唆された。
　レスベラトロールは抗酸化作用をもち、近年、サプリメントとしても市場を広げている。レスベラトロールサプリメントにおいて、ブドウからレスベラトロールを抽出する他にイタドリなどもまた原料として使用されている。レスベラトロールを合成する種々の植物に対して、本発明の方法を施すことにより、より低コストで高品質なレスベラトロールサプリメント生産のための高含有レスベラトロール原料植物を開発できる可能性がある。
　また、マイクロアレイ解析データから、ブドウ培養細胞への電流処理が、アントシアニン合成酵素をコードする遺伝子（UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 6-like）の発現量を増大し、結果としてアントシアニンの合成量を増やすことが示唆された。
　アントシアニンは、ブルーベリーの紫色の色素であり、眼精疲労回復、視力改善作用に高い即効性を有することが知られている。アントシアニンを合成する種々の植物に対して、本発明の方法を施すことにより、より低コストで高品質なアントシアニンサプリメント生産のための高含有アントシアニン原料植物を開発できる可能性がある。
（ブドウ樹に対する電流刺激について）
　本実施例では、ブドウ樹の幹に電極を埋め込み、ソーラーパネルを繋いで電極に電圧を印加し、電流処理を行った結果について説明する。
　図３は、本実施例のブドウ樹を改質させる方法のフローを示している。図３に示すように、ブドウ樹の幹の異なる箇所に電極とその対極を挿入する（Ｓ０１）。両電極をブドウ樹の幹の内部組織に接触させる（Ｓ０２）。ソーラーパネルに太陽光が照射されることによって電極間に電圧が印加される（Ｓ０３）。内部組織の温度が５０℃未満となるように使用するソーラーパネルの仕様を調整する（Ｓ０４）。そして、ブドウ果実の果汁から、糖度、総酸、総フェノール含有量、アミノ酸、レスベラトロール含有量を実測した。また、ブドウ樹の葉のクロロフィル含有量を実測した。
　図４の実験の模式図に示すように、１樹木に電極４とソーラーパネル３を２組設置し、電流処理を行う電流区と、比較対照として、電極のみ挿してソーラーパネルを繋げず電流処理を行わない電極区（電極のみ）と、電極を挿していない無処理の対照区（処理なし）の３種のブドウ樹を用いた。ソーラーパネルの性能は、最大電圧が５Ｖ、最大電流が８０ｍＡ、最大出力電力が０．４Ｗのものを用いた。ソーラーパネルを２組用いた場合で、実際に照度による電極間の電圧の変化を確認すると、図５の特性グラフとなった。図５のグラフから本実施例で用いたソーラーパネルの場合、電極間に約１０Ｖを印加できることがわかる。
　具体的には、ブドウ樹の成長期である５月上旬から９月中旬にかけて、ブドウ樹の幹に電極を埋め込み、ソーラーパネルを繋いで電極に電圧を印加し、電流処理を行った。
　ここで、ブドウ樹としては、フランスのボルドーを発祥地とする代表的な赤ワイン用ブドウ品種の“メルロー”で、垣根仕立ての３０齢樹を実験に用いた。
　なお、以下の実験は、母平均について群間ですべての対比較を同時に検定するための多重比較法の１つであるダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定法を用い、後述する図６～１０のグラフの値は、平均値±標準誤差（ｎ＝１０）で示している。
（ブドウ果実の糖度について）
　電気刺激を処理したブドウ樹の果実品質を、対照区のブドウ樹の果実品質と比較するために、ブドウ果実の糖度（Brix値）と酸度の両方から判断して熟成果実がある房を収穫期（９月上旬～中旬）に採取した。ブドウ樹から採取した５房を果実品質の測定に用いた。果汁は、各房から果実を５０粒集め、各房を手で押して搾汁し調製したものである。果汁のBrix値は、屈折計（株式会社アタゴ製）を用いて評価した。
　図６は、ブドウ果実の糖度（Brix値）の増大を示すグラフである。図６に示す果汁糖度の測定グラフにおいて、＊は対照と比較し５％水準で有意差が見られたものである。すなわち、電流処理および電極のみの実験区で果汁糖度が有意に高かったことが確認できた。
　ここで、ブドウ果実の糖度として用いたBrixは、屈折率を「ショ糖液100ｇ中に含まれるショ糖のグラム数」に換算したものであり、その換算式は国際砂糖分析統一委員会（ＩＣＵＭＳＡ）で採択されているものである。ブドウ果汁のように、サンプル中の可溶性固形分のほとんどが糖であるものでは、Brixを糖度と扱うことが一般的である。
（ブドウ果実のアントシアニン含有量について）
　各房から採取した５０粒の果実の果皮を剥がし、試料として用いた。剥がした果皮からアントシアニンを抽出し定量した。アントシアニン含有量は、新鮮な果皮重量１グラムあたりに含まれるマルビジン-3-グルコシドのｍｇ数に換算した。
　図７は、ブドウ果実のアントシアニン含有量の増大を示すグラフである。図７に示す果皮のアントシアニン含有量の測定グラフにおいて、“＊”は対照と比較して５％水準で有意差が見られたものである。すなわち、電流処理でアントシアニン含有量が有意に高くなっていたことが確認できた。したがって、電流処理は果実のアントシアニン含有量を増加すると判断した。
（ブドウ果実のレスベラトロール含有量について）
　レスベラトロール含有量の分析は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて行った。低純度であるトランス型レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ社提供）を標準物質として用いた。果汁中のレスベラトロール含有量を計算するために、数段階の濃度既知の標準液を測定することによって検量線を作成した。
　図８は、ブドウ果実のレスベラトロール含有量の増大を示すグラフである。図８に示すレスベラトロール含有量の測定グラフにおいて、“＊＊”は対照と比較して１％の水準で有意差が見られたものである。すなわち、対照区と比較し、電流処理を施術した場合に１％水準でレスベラトロール含有量の増加が認められた。これより、電流処理は果実のレスベラトロール含有量を増加する可能性が示唆された。
（ブドウ果実の酸度について）
　総酸（酒石酸換算）は、自動滴定装置（自動的滴定装置ＣＯＭ－１６００；平沼産業株式会社製）を用いてＮａＯＨで果汁を滴定して測定した。
　図９（１），（２）は、それぞれブドウ果樹の果実の酸度と総酸の減少を示すグラフである。図９（１）に示す果汁酸度（％）の測定グラフにおいて、“＊”は対照と比較して５％の水準で有意差が見られたものである。同様に、図９（２）に示すブドウ樹の果実の総酸（ｇ／Ｌ）の測定グラフにおいて、“＊”は対照と比較して５％の水準で有意差が見られたものである。図９（１）、（２）から、対照区と比較し、電流処理および電極のみの実験区で酸度の減少及び総酸の減少が認められた。
（葉のクロロフィル含有量について）
　図１０は、ブドウ樹の果実の収穫時期における葉のクロロフィル含有量の増大を示すグラフを示している。図１０に示すブドウ樹の葉のクロロフィル含有量の測定グラフにおいて、電流処理および電極のみの実験区でクロロフィル含有量の増加が見られる。
（ブドウ樹に対する電流刺激について）
　本実施例では、ブドウ樹の幹に電極を埋め込み、ソーラーパネルを繋いで電極に電圧を印加し、電流処理を行った結果について説明する。
　図１１は、本実施例のブドウ樹を改質させる方法のフローを示している。図１１に示すように、ブドウ樹の幹の異なる箇所に電極とその対極を挿入する（Ｓ０１）。両電極をブドウ樹の幹の内部組織に接触させる（Ｓ０２）。ソーラーパネルに太陽光が照射されることによって電極間に電圧が印加される（Ｓ０３）。内部組織の温度が５０℃未満となるように使用するソーラーパネルの仕様を調整する（Ｓ０４）。そして、ブドウ果実の健康な房の数を測定し、病気の発生率を実測した。
　実施例２と同様に、図４の実験の模式図に示すように、１樹木に電極４とソーラーパネル３を２組設置し、電流処理を行う電流区と、比較対照として、電極のみ挿してソーラーパネルを繋げず電流処理を行わない電極区（電極のみ）と、電極を挿していない無処理の対照区（処理なし）の３種のブドウ樹を用いた。ソーラーパネルの性能は、実施例２と同様である。
　果樹は、実施例２と同様に、フランスのボルドーを発祥地とする代表的な赤ワイン用ブドウ品種の“メルロー” を用い、垣根仕立ての３０齢樹を実験に使用した。
（忌避効果について）
　果樹の病害抵抗性（忌避性）として、まず、野外栽培ブドウにおける房の発病率に及ぼす電気刺激の影響について説明する。
　下記表３は、電流区（電流処理）と電極区（電極のみ）と対照区（処理なし）のそれぞれについて、病気（灰色かび病、晩腐病）に罹っている房の数、健康な房の数を測定し、病気の発生率を算出した結果を示している。ここで、“＊”は対照区および電極区と比較してカイ二乗検定による有意差が見られたものである。
　表４の結果から、病気（灰色かび病、晩腐病）に罹っている房の数は、電気処理で有意に減っていることが確認できる。ここで、病気の発生率（％）＝病気に罹った房の数／（病気に罹った房の数＋健康な房の数）×１００で算出している。
　図１２は、表４における病気の発生率をグラフ化したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、果樹の病害抵抗性（忌避性）として、野外栽培ブドウにおける葉の被害率に及ぼす電気刺激の影響について説明する。葉の被害率は、ブドウベと病に罹っている葉の数を用いて算出した。ブドウベと病は、ブドウの重大な病害の１つで、かびによる病害であり、始めは淡黄色の斑点が葉の表面に現れ、その後、葉の裏面に白色の毛足の長いかびが密生して、 酷くなると落葉するといった葉の被害である。
　図１３は、ブドウ樹の病害抵抗性（忌避性）を示すグラフであり、電流区（電流処理）と電極区（電極のみ）と対照区（処理なし）のそれぞれについて、ブドウベと病に罹っている葉の数、健康な葉の数を測定し、病気の発生率を算出した結果をグラフ化したものである。
　図１３に示すように、葉の被害率の測定結果では、電流処理の実験区で葉の被害率の減少が対照と比較して０．０１％の水準で有意差が見られた。
　次に、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量に及ぼす電気刺激の影響について説明する。遺伝子の発現量の測定は、鉢植えのブドウ樹の苗の下から４～６番目の葉を使用した。鉢植えのブドウ樹の苗に対して、同様に、電流区（電流処理）と電極区（電極のみ）と対照区（処理なし）を準備し、３日後、１０日後、２０日後、及び３０日後のそれぞれ期間に、葉からＲＮＡ（ribonucleic acid）を単離し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を測定した。
　図１４は、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を示すグラフである。図１４では、４つのグラフを示しており、横軸は電流処理後の日数であり、縦軸は相対強度を示している。４つの遺伝子（chitinase I、chitinase IV、β-1,3-glucanase、thaumatin-like protein）がコードするタンパク質はすべて病害抵抗性に関与するものである。特に、キチナーゼ（chitinase）、β-1,3-グルカナーゼ（β-1,3-glucanase）は病原菌の細胞壁を直接分解し、病原菌を殺菌する作用があり、多種多様な病原菌に効果をもつタンパク質である。
　図１４に示すように、４つの遺伝子は、何れも、電流処理の実験区が、他の実験区や対照区と比べて、遺伝子の増幅が２０～３０日後に有意差が認められることから、電気処理による病害抵抗性（忌避性）の即効性は少ないものの、予防的効果に期待できる。
　なお、図１４の４つのグラフにおいて、バーは、３つの独立した苗から計算した平均±標準偏差を示している。また、“＊”は電流処理の電流区で対照区と比較して０．０５％の水準で有意差が見られたことを示している。
　上記実施例２におけるブドウ樹に対する電流刺激から１年後（次年度）に、再び、１年後の同時期に、実施例２と同様な実験を行い、ブドウ樹に対する電流刺激を付与し、ブドウ果実の糖度の増減、アントシアニン含有量の増減、レスベラトロール含有量の増減、酸度の増減、葉のクロロフィル含有量の増減を測定した。以下に、測定結果について説明する。
　図１５～１９は、それぞれ次年度におけるブドウ果実の糖度の増減、アントシアニン含有量の増減、レスベラトロール含有量の増減、酸度の増減、葉のクロロフィル含有量の増減についての測定結果のグラフである。
　図１５に示すとおり、ブドウ樹の果実について、電流処理および電極のみの実験区でブドウ果実の糖度（Brix）が有意に高かったことが確認できた。
　図１６に示すとおり、ブドウ樹の果実について、電流処理の実験区でブドウ果実のアントシアニン含有量が有意に高くなっていたことが確認できた。
　図１７に示すとおり、ブドウ樹の果実について、電流処理の実験区でブドウ果実のレスベラトロール含有量が有意に高くなっていたことが確認できた。
　図１８に示すとおり、ブドウ樹の果実について、電流処理の実験区でブドウ果実の総酸の減少傾向が確認できた。
　図１９に示すとおり、１年後（次年度）のブドウ樹の果実の収穫時期における葉のクロロフィル含有量は、電流処理および電極のみの実験区でクロロフィル含有量の増加傾向が確認できた。
　実施例２では示していないが、ブドウ樹の果実における総フェノール含有量の増大について確認したところ、図２０に示すとおり、ブドウ樹の果実について、電流処理の実験区でブドウ果実の総フェノール含有量が有意に高くなっていたことが確認できた。
　なお、総フェノール含有量の測定は、果汁を１６，０００×ｇで遠心分離した後、上清を０．２μｍ膜フィルター（Ｐａｌｌ社製）で濾過し、濾液中の総フェノール化合物を測定した。
　電気刺激がブドウ樹の成長と発育に影響を及ぼすかどうかを評価するために、２ヵ年の成長期に電気刺激を処理した圃場栽培ブドウ樹の生殖成長と栄養成長を観察した。電気刺激を処理したブドウ樹の開花、栽培、ベレゾーン、収穫期は、処理しなかったブドウ樹（対照）および電極処理したブドウの木と同等であった。供試したブドウ樹の芽・葉・房にも変化は一切観察されなかった。これらの結果を総合すると、電気刺激を処理したブドウ樹は正常に成長し、検出できる悪影響はなかった。
　上述の如く、ブドウ樹の果実は電気刺激を付与することにより改質された。果実重量は供試したどのブドウ樹でもほぼ同じであるが、電気刺激を付与したブドウ樹と電極処理区の果実のBrix値は、２ヵ年とも対照区よりも高かった。また、電気刺激を付与したブドウ樹では果実内へのアントシアニンとレスベラトロールの蓄積が増大した。電気刺激によって、２ヵ年のいずれも、対照区と電極処理区に比べて、電気刺激を付与したブドウ樹の果実のアントシアニン含有量およびレスベラトロールの含有量は増加した。特に、電気刺激を処理したブドウ樹の果実のレスベラトロール含有量は、対照区に比べて２００～３００％増加した。
　これらの結果を総合すると、電気刺激の付与がブドウ樹の果実品質を変化させる可能性が強く示唆されたことがわかる。
　本発明は、果実や野菜などの農産物の品質改善に有用である。特に、農産物の病害抵抗性や忌避効果の向上に有用である。
　　１　実験装置
　　２　ブドウ培養細胞
　　３　ソーラーパネル
　　４　電極
 

Claims (18)

  1. 　果樹又は一年生草木植物の異なる箇所に電極とその対極を挿入し、両電極を内部組織に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することにより果実等を改質させる方法。
  2. 　果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の異なる箇所に電極とその対極を挿入し、両電極を内部組織に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することにより果実等を改質させる方法。
  3. 　果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の培養細胞の集合体に電極とその対極を挿入し、両電極を前記集合体に接触させた状態で、電極間に電圧を印加することにより果実等の培養細胞を改質させる方法。
  4. 　前記改質は、病害抵抗性の増大であることを特徴とする請求項１～３の何れかに記載の方法。
  5. 　上記の内部組織に対する電圧印加により、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量を増大させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 　上記の病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子は、病原菌を殺菌する作用を有するキチナーゼ（chitinase）、又は、β-1,3-グルカナーゼ（β-1,3-glucanase）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 　前記改質は、果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉における、糖度の増加及び酸度の減少であることを特徴とする請求項１～６の何れかに記載の方法。
  8. 　上記の果樹がブドウ樹であり、前記改質は、ブドウ果実のアントシアニン含有量とレスベラトロール含有量とを増加させることを特徴とする請求項１～６の何れかに記載の方法。
  9. 　上記の電極とその対極を挿入する箇所は、
    　果樹の場合、異なる幹部、幹部と枝部、幹部と果実部、異なる枝部、枝部と果実部、若しくは異なる果実部であり、
    　一年生草木植物の場合、異なる茎部、茎部と葉部、茎部と果実部、異なる葉部、葉部と果実部、若しくは異なる果実部である、ことを特徴とする請求項１～８の何れかに記載の方法。
  10. 　印加する電圧は、０．１～２０Ｖの範囲の直流電圧、交流電圧又はパルス電圧であり、かつ、電極を挿入した箇所の内部組織が５０℃未満となるように調整されることを特徴とする請求項１～９の何れかに記載の方法。
  11. 　電極間に太陽光パネルを接続し、昼間のみに電圧を印加させることを特徴とする請求項１～１０の何れかに記載の方法。
  12. 　上記の培養細胞に対する電圧印加による前記改質は、酵素を産出する遺伝子の発現量の増大、又は、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子の発現量の増大であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  13. 　上記の培養細胞がブドウ培養細胞であり、ブドウ培養細胞に対する電圧印加による前記改質は、スチルベン合成酵素（ＳＴＳ）もしくはレスベラトロール合成酵素を産出する遺伝子の発現量の増大、又は、病害抵抗性タンパク質を産出する遺伝子であるprobable WRKY transcription factor 33-likeもしくはclass IV chitinaseの遺伝子の発現量の増大であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  14. 　請求項１～１１の何れかの方法を施し得られた農産物。
  15. 　請求項１２又は１３の方法を施した培養細胞。
  16. 　請求項１５の培養細胞から培養された苗木。
  17. 　請求項１６の苗木を生育して収穫された果実、塊根、球根、塊茎、若しくは葉の何れかの農産物。
  18. 　請求項１４又は１７の農産物を用いた果汁、果実酒、漬物を含む２次的加工食品。
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