WO2018155595A1 - 人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞の作製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018155595A1
WO2018155595A1 PCT/JP2018/006588 JP2018006588W WO2018155595A1 WO 2018155595 A1 WO2018155595 A1 WO 2018155595A1 JP 2018006588 W JP2018006588 W JP 2018006588W WO 2018155595 A1 WO2018155595 A1 WO 2018155595A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
pluripotent stem
induced pluripotent
stem cells
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/006588
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
剛士 田邊
健太 須藤
英範 下田
ブランダン ケリー
Original Assignee
剛士 田邊
アイ ピース， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 剛士 田邊, アイ ピース， インコーポレイテッド filed Critical 剛士 田邊
Priority to CA3054118A priority Critical patent/CA3054118C/en
Priority to US16/485,148 priority patent/US20200385687A1/en
Priority to EP18757824.0A priority patent/EP3587559A4/en
Priority to CN201880013637.0A priority patent/CN110352238A/zh
Priority to JP2019501813A priority patent/JP7146211B2/ja
Publication of WO2018155595A1 publication Critical patent/WO2018155595A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Definitions

  • the present invention relates to cell technology and relates to a method for producing induced pluripotent stem cells.
  • iPS cells are cells having two characteristic abilities. One is the ability to change into any cell that makes up the body. Another is to have a semi-permanent proliferation ability. Since iPS cells have these two abilities, they can be applied to transplantation therapy without rejection by preparing iPS cells from their own somatic cells and changing them to the desired somatic cells. Therefore, iPS cells are considered to be a powerful technique for regenerative medicine.
  • iPS cells Numerous production methods have been established from the birth of iPS cells to the present.
  • Representative methods for producing iPS cells include a method using a retrovirus / lentivirus and a method using an episomal vector.
  • retrovirus / lentivirus The method using retrovirus / lentivirus will be described.
  • a somatic cell can be infected with a retrovirus or a lentivirus, and a gene encoding an reprogramming factor can be introduced into the cell.
  • retroviruses and lentiviruses can insert reprogramming factors into the genome of somatic cells and induce stable expression of reprogramming factors in cells.
  • the method using retrovirus / lentivirus has the following problems.
  • the insertion of reprogramming factor into the genome of somatic cells damages existing genes and promoters and can cause canceration of cells.
  • the reprogramming factor inserted on the genome may be activated again after changing iPS cells into somatic cells. Therefore, transplantation cells derived from iPS cells have a risk of canceration.
  • transplantation cells derived from iPS cells have a risk of canceration.
  • reactivation of the introduced reprogramming factor is seen in somatic cells, and it has been confirmed that it becomes cancerous (for example, see Non-Patent Document 1).
  • Episomal vectors are circular DNAs that self-amplify in the nucleus. Episomal vectors have been considered not to be integrated into the genome in principle, but in recent research, episomal vector fragments are interspersed and inserted into the episomal genome of iPS cells. It has been reported. Therefore, there is a problem that the reprogramming gene can remain in the cell. For example, if c-MYC or KLF4 remains in the cell, it causes canceration. It is very expensive to test whether or not the reprogramming gene remains in the cell. It is impossible to show that all cells in the transplant cell pool have no insertion into the genome of the episomal plasmid and no residue.
  • Non-Patent Document 2 a method for producing iPS cells using RNA has been proposed (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing safe induced pluripotent stem cells suitable for clinical use.
  • a method for producing induced pluripotent stem cells comprising preparing somatic cells and introducing Sendai virus containing reprogramming factor RNA into the somatic cells.
  • Sendai virus containing reprogramming factor RNA may be introduced into somatic cells suspended in a gel medium.
  • Sendai virus containing reprogramming factor RNA may be introduced into somatic cells that have been cultured for adhesion.
  • the above-described method for producing induced pluripotent stem cells may further include initializing somatic cells in a gel medium.
  • the somatic cell may be a fibroblast.
  • the somatic cell may be a blood cell.
  • the above-mentioned method for producing induced pluripotent stem cells may further comprise separating mononuclear cells as somatic cells using an erythrocyte separating agent.
  • the method may further comprise separating mononuclear cells as somatic cells using a filter.
  • the above-described method for producing induced pluripotent stem cells may further comprise isolating mononuclear cells as somatic cells using immunomagnetic beads.
  • the reprogramming factor RNA may include M 3 O or OCT 3/4 mRNA, SOX2 mRNA, KLF4 mRNA, and c-MYC mRNA.
  • the gel medium may not be stirred.
  • the gel medium may not contain a growth factor.
  • the gel medium may contain a growth factor at a concentration of 40% by mass or less.
  • the gel medium may not contain bFGF.
  • preparing somatic cells introducing the reprogramming factor RNA into the somatic cells using an RNA transfection reagent, reprogramming the somatic cells in a gel medium, A method for producing induced pluripotent stem cells is provided.
  • the somatic cell may be a fibroblast.
  • the somatic cell may be a blood cell.
  • the above-mentioned method for producing induced pluripotent stem cells may further comprise separating mononuclear cells as somatic cells using an erythrocyte separating agent.
  • the method may further comprise separating mononuclear cells as somatic cells using a filter.
  • the above-described method for producing induced pluripotent stem cells may further comprise isolating mononuclear cells as somatic cells using immunomagnetic beads.
  • reprogramming factor RNA may also include M 3 O or OCT3 / 4 of mRNA, SOX2 mRNA, and KLF4 mRNA, and c-MYC of mRNA.
  • the gel medium may not be stirred.
  • the gel medium may not contain a growth factor.
  • the gel medium may contain a growth factor at a concentration of 40% by mass or less.
  • the gel medium may not contain bFGF.
  • the reprogramming factor RNA may be introduced multiple times.
  • the method for producing an induced pluripotent stem cell (iPS cell) according to the first embodiment includes preparing a somatic cell and introducing Sendai virus containing reprogramming factor RNA into the somatic cell.
  • somatic cells examples include fibroblasts, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem progenitor cells.
  • Blood cells are separated from blood.
  • the blood is, for example, peripheral blood and umbilical cord blood, but is not limited thereto.
  • the blood may be collected from an adult or from a minor.
  • an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and biological preparation reference blood preservation solution A solution (ACD-A) solution is used.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ACD-A biological preparation reference blood preservation solution
  • Blood cells are nucleated cells such as mononuclear cells (Monocyte), neutrophils, eosinophils, basophils, and lymphocytes, and do not contain erythrocytes, granulocytes, and platelets.
  • the blood cells may be, for example, vascular endothelial precursor cells, blood stem / progenitor cells, T cells, or B cells.
  • the T cell is, for example, an ⁇ T cell.
  • Mononuclear cells are separated from blood using a blood cell separation medium, a centrifuge, or the like.
  • a method for separating mononuclear cells when Ficoll (GE Healthcare) is used as a blood cell separation medium is as follows.
  • the centrifuge is set at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 18 ° C. Collect 10 ⁇ L to 50 mL of blood from an adult or minor, and add a chelating agent containing EDTA to the blood and mix gently so that the blood does not solidify.
  • 5 mL of the medium for human lymphocyte separation (Ficoll-Paque PREMIUM, GE Healthcare Japan) is dispensed into two 15 mL tubes.
  • 5 mL of PBS is diluted by adding 5 mL of PBS, and 5 mL is overlaid on the human lymphocyte separation medium in a tube. At this time, diluted blood is slowly added onto the medium along the tube wall of the tube so as not to disturb the interface.
  • the solution in the tube is centrifuged at 10 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably 400 ⁇ g, 4 ° C. to 42 ° C., preferably 18 ° C. for 5 minutes to 2 hours, preferably 30 minutes. After centrifugation, a white turbid intermediate layer appears in the tube. This white, turbid intermediate layer contains mononuclear cells. Gently collect the white, turbid intermediate layer in the tube with a Pipetman and transfer to a new 15 mL tube. At this time, the lower layer should not be blotted. About 1 mL of a white turbid intermediate layer can be recovered from one tube. Transfer two intermediate layers together into one tube.
  • 1 to 48 mL, preferably 12 mL of PBS is added to the recovered mononuclear cells, and the solution is further added at 10 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably 200 ⁇ g, 4 ° C. to 42 ° C., preferably 18 ° C. Centrifuge for 1 to 60 minutes, preferably 10 minutes. Thereafter, the supernatant of the solution is aspirated and removed using an aspirator, and 1 mL to 12 mL, preferably 3 mL of a serum-free hematopoietic cell medium (X-VIVO (registered trademark) 10, Lonza) having a known composition is added and suspended. A mononuclear cell suspension is obtained. Among them, 10 ⁇ L of mononuclear cell suspension is stained with trypan blue and counted with a hemocytometer.
  • X-VIVO serum-free hematopoietic cell medium
  • the method for separating mononuclear cells when vacutainer (registered trademark, BD) is used as a blood collection tube is as follows.
  • the centrifuge is set to 4 ° C. to 42 ° C., preferably 18 ° C. 8 mL of blood is collected from an adult or a minor using a blood collection tube (Vactaina (registered trademark), BD), mixed by inversion, and mixed with an anticoagulant. The balance is then adjusted and the solution is 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C, 100xg to 3000xg, preferably 1500xg to 1800xg with a swing rotor for 1 to 60 minutes, preferably 20 minutes. Centrifuge. After centrifugation, the upper layer, which is the plasma layer, is removed and pipetting is performed to suspend the mononuclear cell layer and the blood cells attached to the gel to obtain a suspension. Transfer the resulting suspension to another 15 mL tube.
  • 1 mL to 14 mL, preferably 12 mL PBS is added to the suspension in a 15 mL tube and the suspension is added at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 18 ° C., 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 200 ⁇ g.
  • a hemolyzing agent Pharmacyse (registered trademark), 10-fold concentration, BD) is diluted to 1-fold concentration with sterile water.
  • Pellet the pellet in the 15 mL tube and add 1 mL to 14 mL, preferably 1 mL of hemolytic agent. Thereafter, the solution is shielded from light at room temperature and the solution is allowed to stand for 1 to 60 minutes, preferably 1 minute.
  • 1 mL to 14 mL, preferably 12 mL of PBS is added to the 15 mL tube and 4 ° C. to 42 ° C., preferably room temperature, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 200 ⁇ g, 1 min to 60 min, Centrifuge for a minute. After centrifugation, the supernatant is removed with an aspirator, 1 mL to 15 mL, preferably 3 mL of a serum-free hematopoietic cell medium (X-VIVO (registered trademark) 10, Lonza) with a known composition is added and suspended, and a mononuclear cell suspension Obtain a liquid. Among them, 10 ⁇ L of mononuclear cell suspension is stained with trypan blue and counted with a hemocytometer.
  • X-VIVO serum-free hematopoietic cell medium
  • the method for separating mononuclear cells from blood is not limited to the above method, and for example, mononuclear cells may be separated from blood using a dialysis membrane.
  • a pure cell select system for concentrating whole blood mononuclear cells (registered trademark, PALL), a purifier for removing blood cells (Celsorber E, registered trademark, Asahi Kasei), and a leukocyte removal filter for platelet preparations (Sepacell PL, registered trademark, A filter such as PLX-5B-SCD (Asahi Kasei) can also be used.
  • Mononuclear cells may be separated using an erythrocyte separating agent capable of separating nucleated cells by gravity sedimentation or centrifugation of erythrocytes.
  • an erythrocyte separating agent capable of separating nucleated cells by gravity sedimentation or centrifugation of erythrocytes.
  • the erythrocyte separating agent include HetaSep (registered trademark, STEMCELL Technologies) and HES40 (NIPRO).
  • CTL-UP1 sold by Cellular Technology Limited
  • PBMC-001 from Sanguine Biosciences, etc. may be used.
  • blood cells as blood cells, blood cells cryopreserved using a cell cryopreservation solution such as Cell Banker 1, Stem Cell Banker GMP Grade, and Stem Cell Banker DMSO Free GMP Grade (Zenoac) may be used after thawing.
  • a cell cryopreservation solution such as Cell Banker 1, Stem Cell Banker GMP Grade, and Stem Cell Banker DMSO Free GMP Grade (Zenoac) may be used after thawing.
  • thawing mononuclear cells When thawing mononuclear cells, first, 15 mL of a 15 ml, preferably 8 mL, serum-free hematopoietic cell medium (X-VIVO (registered trademark) 10, Lonza) having a known composition was placed in a 15 mL tube and frozen. The tube containing the mononuclear cells is placed in a hot bath at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 37 ° C., to begin to dissolve the mononuclear cells.
  • X-VIVO serum-free hematopoietic cell medium
  • the tube containing the mononuclear cells is pulled out of the hot bath, and the mononuclear cells are transferred to a tube containing a known composition of serum-free hematopoietic cell medium.
  • 10 ⁇ L of mononuclear cell suspension is stained with trypan blue and counted with a hemocytometer.
  • Blood cells may be separated based on cell surface markers.
  • the blood stem / progenitor cells are positive for CD34.
  • T cells are positive for CD3, CD4, or CD8.
  • B cells are positive for CD10, CD19, or CD20.
  • Blood stem / progenitor cells, T cells, or B cells are separated from blood cells using, for example, an automated magnetic cell separator and immunomagnetic beads. Or you may prepare the mononuclear cell isolate
  • CD34 positive cells are stem / progenitor cells and tend to be reprogrammed.
  • T cell-derived iPS cells retain the TCR recombination type, and thus tend to be efficiently induced to differentiate into T cells.
  • the method for separating CD34 positive cells is as follows.
  • 10 mL of serum-free medium (StemSpan H3000, STEMCELL Technologies), 10 ⁇ L of IL-6 (100 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L of SCF (300 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L of TPO (300 ⁇ g / mL), 10 ⁇ L of FLT3 ligand (300 ⁇ g / mL) And 10 ⁇ L of IL-3 (10 ⁇ g / mL) are added to prepare a blood cell culture medium (blood stem / progenitor cell culture medium).
  • a column buffer is prepared by adding 10 ⁇ L to 1 mL, preferably 80 ⁇ L of EDTA (500 mmol / L) and 10 ⁇ L to 1 mL, preferably 200 ⁇ L of FBS to 20 mL of PBS. Dispense a mononuclear cell suspension containing 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 9 , preferably 2 ⁇ 10 7 mononuclear cells into a 15 mL tube, Centrifuge at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 4 ° C., 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 300 ⁇ g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is removed and the mononuclear cells are suspended in 100 ⁇ L to 1 mL, preferably 300 ⁇ L of column buffer.
  • the mononuclear cell suspension in a 15 mL tube is diluted by adding 1 mL to 15 mL, preferably 10 mL column buffer, and 4 ° C. to 42 ° C., preferably 4 ° C., 100 ⁇ g to 1000 ⁇ g, Centrifuge at 300 xg for 1 minute to 2 hours, preferably 10 minutes. After centrifugation, the supernatant in the 15 mL tube is removed with an aspirator and 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L column buffer is added and resuspended.
  • a column for an automatic magnetic cell separator (MS column, Miltenyi Biotec) is attached to an automatic magnetic cell separator (MiniMACS Separation Unit, Miltenyi Biotec), and the column buffer is washed with 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L.
  • the mononuclear cells are placed in the column.
  • 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 500 ⁇ L, of column buffer is added to the column, and the column is washed 1 to 10 times, preferably 3 times.
  • the column is then removed from the automated magnetic cell separator and placed in a 15 mL tube.
  • 10 ⁇ L to 10 mL, preferably 1000 ⁇ L, of column buffer is placed in the column, and the syringe is quickly pushed to drain CD34 positive cells into the 15 mL tube.
  • CD34 positive cell suspension 10 ⁇ L is stained with trypan blue and the cell count is counted with a hemocytometer.
  • the CD34 positive cell suspension in a 15 mL tube is centrifuged at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 4 ° C., 100 ⁇ g to 1000 ⁇ g, preferably 300 ⁇ g for 1 minute to 2 hours, preferably 10 minutes. . After centrifugation, the supernatant is removed with an aspirator.
  • the CD34 positive cells are resuspended in a warm blood cell medium, and the CD34 positive cells are plated on a culture plate. Thereafter, CD34 positive cells are cultured for 6 days at 4 ° C. to 42 ° C., preferably 37 ° C., 1% to 20%, preferably 5% CO 2 . During this time, the medium need not be changed.
  • the method of isolating cells with a marker other than CD34 is the same as the method of isolating CD34 positive cells.
  • Sendai virus containing reprogramming factor RNA into somatic cells that have been cultured for adhesion.
  • Sendai virus containing reprogramming factor RNA is introduced into somatic cells that are suspended in a gel medium.
  • Somatic cells into which reprogramming factor RNA has been introduced are cultured in a feeder-free manner using a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin511 (iMatrix-511, nippi).
  • a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin511 (iMatrix-511, nippi).
  • a stem cell medium such as a human ES / iPS medium such as Primate ES Cell Medium (ReproCELL) can be used as a medium for culturing somatic cells into which reprogramming factor RNA is introduced.
  • a stem cell medium such as a human ES / iPS medium such as Primate ES Cell Medium (ReproCELL) can be used as a medium for culturing somatic cells into which reprogramming factor RNA is introduced.
  • the stem cell culture medium is not limited to this, and various stem cell culture media can be used.
  • Primate ES Cell Medium Reprostem, ReproFF, ReproFF2, ReproXF (Reprocell), mTeSR1, TeSR2, TeSRE8, ReproTeSR (STEMCELL Technologies), and PruriSTM (registered trademark).
  • FF Culture Medium Human iPS and ES Cells Pluriton reprogramming medium (Stemment), PluriSTEM (registered trademark), Stemfit AK02N, Stemfit AK03 (Ajinomoto ES) Registered trademark) serum and feeder free medium for hESC / iPS (Applied StemCell), L7 (registered trademark) hPSC Culture System (LONZA), and PluriQ (may be used MTI-GlobalStem) and the like.
  • the stem cell medium is placed in, for example, a dish, well, tube, or the like.
  • the gel medium is, for example, gellan gum in a stem cell medium with a final concentration of 0.001% to 0.5%, 0.005% to 0.1%, or 0.01% to 0.05% by weight. It is prepared by adding so that.
  • Gel medium is gellan gum, hyaluronic acid, rhamzan gum, diyutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, rhamnan sulfate, and You may contain the at least 1 sort (s) of high molecular compound selected from the group which consists of those salts. Moreover, the gel culture medium may contain methylcellulose. By containing methylcellulose, aggregation between cells is further suppressed.
  • the gel medium can be poly (glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly (2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide ( NHS) ester terminated, triethoxysilane terminated, Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide), Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate), Poly (N-isopropylacrylamide-co- It may contain a small number of temperature sensitive gels selected from methacrylic acid, Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate), and N-isopropylacrylamide.
  • PGMA poly (glycerol monomethacrylate)
  • the gel medium does not contain a growth factor such as, for example, basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the gel medium contains a growth factor such as bFGF at a low concentration of 400 ⁇ g / L or less, 40 ⁇ g / L or less, or 10 ⁇ g / L or less.
  • the gel medium does not contain TGF- ⁇ or contains TGF- ⁇ at a low concentration of 600 ng / L or less, 300 ng / L or less, or 100 ng / L or less.
  • the gel medium need not be stirred. Moreover, the gel medium does not need to contain feeder cells.
  • the gel medium may contain at least one substance selected from the group consisting of cadherin, laminin, fibronectin, and vitronectin.
  • the reprogramming factor RNA introduced into somatic cells includes, for example, OCT3 / 4 mRNA, SOX2 mRNA, KLF4 mRNA, and c-MYC mRNA.
  • M 3 O obtained by improving OCT3 / 4 may be used as the reprogramming factor RNA.
  • the reprogramming factor RNA is LIN28A, FOXH1, LIN28B, GRIS1, p53-dominant negative, p53-P275S, L-MYC, NANOG, DPPA2, DPPA4, DPPA5, ZIC3, BCL-2, E-RAS, TPT1, SALL2 , NAC1, DAX1, TERT, ZNF206, FOXD3, REX1, UTF1, KLF2, KLF5, ESRRB, miR-291-3p, miR-294, miR-295, NR5A1, NR5A2, TBX3, MBD3sh, TH2A, TH2B, TH2P It may further contain mRNA of at least one factor selected from the group consisting of: These mRNAs are available from TriLink.
  • gene symbol is described in humans here, it is not intended to limit the species by capital letter / lower case notation. For example, all capital letters do not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, gene symbols are written according to the biological species actually used.
  • mRNA is pseudouridine ( ⁇ ), 5-methyluridine (5 meU), N1-methyl pseudouridine (me1 ⁇ ), 5-methoxyuridine (5 moU), 5-hydroxymethyluridine (5 hmU), 5-formyluridine (5 fU).
  • MRNA may be polyadenylated.
  • MRNA may be prepared by polyadenylation of in vitro transcribed (IVT) RNA.
  • the mRNA may be polyadenylated during IVT by using a DNA template that encodes the poly (A) terminus.
  • mRNA may be capped. In order to maximize the efficiency of expression in cells, it is preferred that most mRNA molecules contain a cap.
  • the mRNA may have a 5'cap [m7G (5 ') ppp (5') G] structure. This sequence is a sequence that stabilizes mRNA and promotes transcription. From the mRNA having 5 'triphosphate, 5' triphosphate may be removed by dephosphorylation treatment.
  • the mRNA may have [3'O-Me-m7G (5 ') ppp (5') G] as Anti-Reverse Cap Analog (ARCA).
  • ARCA is a sequence inserted before the transcription start point, and the efficiency of transcribed mRNA is doubled.
  • the mRNA may have a PolyA tail.
  • the mRNA may be a replicative RNA having self-proliferating ability.
  • Replicative RNA is RNA having self-proliferation ability, and unlike normal RNA, it also has the ability to express proteins necessary for RNA replication.
  • Replicative RNA is derived from Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus, a type of alphavirus.
  • VEE Venezuelan equine encephalitis
  • the sequence of the replicative RNA is alphavirus replicon RNA, Eastern equine encephalitis virus (EEE), Venezuelan equine encephalitis virus (VEE), Everglades virus, Mucambo virus, Pixuna virus, and western part. It may comprise a sequence derived from an alphavirus selected from the group consisting of equine encephalitis virus (WEE).
  • replicative RNA includes Sindbis virus, Semliki Forest virus, Middelburg virus, Chikungunya virus, O'nyong-nyongos virus, Ross River R virus R , Barmah Forest virus, Getah virus, Sagiyama virus, Bebaru virus, Mayaro virus, Una virus, Aura virus, Wataroa virus , Babanki virus, Kyzylagach virus, Hira De J (Highlands J) virus, Fort Morgan (Fort Morgan) virus, Nudumu (Ndumu) virus, and it may include sequences derived from the alpha virus selected from the group consisting of buggy Creek (Buggy Creek) virus.
  • the replicative RNA is (VEE RNA replicase)-(promoter)-(RF1)-(self-cleaving peptide)-(RF2)-(self-cleaving peptide)-(from 5 ′ to 3 ′) RF3)-(IRES or core promoter)-(RF4)-(IRES or any promoter)-(optional marker)-(VEE 3′UTR and poly A tail)-(optional marker) -Contains a promoter.
  • RF1-4 described above is a factor that induces somatic cell dedifferentiation into pluripotent cells.
  • the above RF2-3, RF3-4, and RF4 are arbitrary.
  • RF1-4 is OCT3 / 4, KLF4, SOX-2, c-MYC, LIN28A, LIN28B, GRIS1, FOXH1, p53-dominant negative, p53-P275S, L-MYC, NANOG, DPPA2, DPPA5, DPPA5, ZIC3, BCL-2, E-RAS, TPT1, SALL2, NAC1, DAX1, TERT, ZNF206, FOXD3, REX1, UTF1, KLF2, KLF5, ESRRB, miR-291-3p, miR-294, miR-295, NR5A1, It may be selected from the group consisting of NR5A2, TBX3, MBD3sh, TH2A, and TH2B.
  • the reprogramming factor RNA is introduced into somatic cells using Sendai virus.
  • CytoTune registered trademark, Invitrogen
  • the Sendai virus carrying the reprogramming factor RNA can be used as the Sendai virus carrying the reprogramming factor RNA.
  • multiplicity of infection MOI
  • the MOI of Sendai virus is, for example, 0.1 to 100.0, or 1.0 to 50.0.
  • the somatic cells After introducing the reprogramming factor RNA into somatic cells using Sendai virus, the somatic cells are initialized in a liquid medium or gel medium that is not a gel medium.
  • somatic cells have been induced (reprogrammed) into induced pluripotent stem cells can be confirmed, for example, from the cell morphology.
  • whether or not somatic cells are induced by induced pluripotent stem cells is determined by a cytoflow meter, which is a cell surface marker indicating undifferentiated TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1 And by analyzing whether at least one surface marker selected from SSEA5 is positive.
  • TRA-1-60 is an antigen specific for iPS / ES cells and is not detected in somatic cells. Since iPS cells can be produced only from the TRA-1-60 positive fraction, TRA-1-60 positive cells are considered to be iPS cell species.
  • an RNA capable of expressing reprogramming factor RNA is efficiently introduced into somatic cells to express reprogramming factor RNA. It is possible to produce induced pluripotent stem cells.
  • Example 1 of the first embodiment 1 ⁇ 10 5 fibroblasts (HDF2443 or HDF2802, Cell Applications, Inc.) suspended in 2 mL of DMEM (Gibco) containing 10% FBS (Gibco), which is a liquid medium that is not a gel medium, Each well of the dish was seeded, and the well dish was allowed to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C., and fibroblasts were cultured for adhesion. After 24 hours, Sendai virus capable of expressing the fluorescent protein EGFP (CytoTune, registered trademark, EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Invitrogen) was added to the liquid medium so that the multiplicity of infection (MOI) was 3.0.
  • DMEM Gibco
  • FBS Gibco
  • FIG. 1 (HDF2443) and FIG. 2 (HDF2802)
  • the fluorescence intensity of fibroblasts was observed using a fluorescence microscope. Further, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that fibroblasts were infected with Sendai virus.
  • DMEM fetal calf serum
  • FBS gellan gum fetal bovine serum
  • EGFP fluorescent protein
  • the fluorescence intensity of fibroblasts was observed using a fluorescence microscope. Further, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that fibroblasts were infected with Sendai virus.
  • Example 3 of the first embodiment 1 ⁇ 10 suspended in 2 mL of gel medium in which gellan gum (Nissan Chemical) was added to 0.02 mass% in hES medium (Prime ES Cell Medium, Reprocell) containing 4 ng / mL of bFGF (Gibco) five fibroblasts (HDF1419, cell Applications, Inc.) were seeded in tubes, allowed to stand the tube in a CO 2 incubator at 37 ° C., and suspension culture fibroblasts. After 24 hours, Sendai virus (Invitrogen) capable of expressing the reprogramming factor OSKM (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) was added to the gel medium.
  • hES medium Primary ES Cell Medium, Reprocell
  • bFGF Gibco
  • fibroblasts HDF1419, cell Applications, Inc.
  • Sendai virus was added to the gel medium so that the MOI of hKOS (KLF4, OCT3 / 4, SOX2) was 5.0, the MOI of c-MYC was 5.0, and the MOI of hKLF was 5.0.
  • the tube was allowed to stand in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • the cells continued to be cultured for 23 days. Meanwhile, every 48 hours, 500 ⁇ L of bFGF-containing gel medium was added to the tube.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-containing gel medium.
  • the iPS cell produced with the bFGF containing gel culture medium was re-worn on a feeder and the form of the colony was confirmed, it was a form of an undifferentiated iPS cell colony as shown in FIG.
  • the cells were immunostained with an antibody against OCT3 / 4, which is a marker of pluripotent stem cells, the cells were OCT3 / 4 positive as shown in FIG.
  • Example 4 of the first embodiment Sendai virus was added to the gel medium so that the MOI of hKOS (KLF4, OCT3 / 4, SOX2) was 2.5, the MOI of c-MYC was 2.5, and the MOI of hKLF was 2.5.
  • Fibroblasts HDF1419, Cell Applications, Inc.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-containing gel medium.
  • the iPS cell produced with the bFGF containing gel culture medium was re-worn on a feeder and the form of the colony was confirmed, it was a form of an undifferentiated iPS cell colony as shown in FIG.
  • the cells were immunostained with an antibody against OCT3 / 4, which is a marker of pluripotent stem cells, the cells were OCT3 / 4 positive as shown in FIG.
  • Fibroblasts (HDF1419, Cell Applications, Inc.) were initialized in the same manner as in Example 3 of the first embodiment except that a gel medium containing no bFGF was used.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-free gel medium.
  • iPS cells prepared in a bFGF-free gel medium were re-sown on the feeder and the morphology of the colonies was confirmed, as shown in FIG. 3, they were in the form of undifferentiated iPS cell colonies.
  • OCT3 / 4 which is a marker of pluripotent stem cells, as shown in FIG. 6, the cells were OCT3 / 4 positive.
  • Example 6 of the first embodiment Except for using fibroblasts (HDF2802, Cell Applications, Inc.), fibroblasts (HDF2802, Cell Applications, Inc.) were initialized in the same manner as in Example 5 of the first embodiment.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-free gel medium.
  • iPS cells prepared in a bFGF-free gel medium were re-sown on the feeder and the morphology of the colonies was confirmed, as shown in FIG. 3, they were in the form of undifferentiated iPS cell colonies.
  • OCT3 / 4 which is a marker of pluripotent stem cells
  • Examples 3 to 6 of the first embodiment indicate that iPS cells could be induced by Sendai virus from a plurality of types of fibroblasts using a bFGF-containing gel medium and a bFGF-free gel medium. .
  • a liquid medium is not a gel medium, seeded 5 ⁇ 10 4 cells of the blood cells suspended in StemspanACF of 750 [mu] L (Stemcell Technologies) (mononuclear cells, Stanford University Blood Center) to each well of the well dish, wells The dish was placed in a 37 ° C. CO 2 incubator to culture blood cells.
  • 20 ng / mL FLT3, 10 ng / mL TPO, 50 ng / mL IL6, 10 ng / mL GCSF, 50 ng / mL SCF, and 20 ng / mL IL3 were added to Stemspan ACF as growth factors. The same applies to the following examples using Stemspan ACF.
  • Sendai virus capable of expressing fluorescent protein EGFP (CytoTune, registered trademark, EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Invitrogen) was added to the liquid medium so that the MOI was 3.0.
  • the fluorescence intensity of blood cells was observed using a fluorescence microscope. Further, as shown in FIG. 8, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that blood cells were infected with Sendai virus.
  • Example 8 of the first embodiment 5 ⁇ 10 4 blood cells (mononuclear cell, Stanford University blood) suspended in 750 ⁇ L gel medium supplemented with 0.02% by mass of deacylated gellan gum (Nissan Chemical) to Stemspan ACF (Stemcell Technologies) Center) was seeded in a tube, and the tube was left in a 37 ° C. CO 2 incubator to culture blood cells.
  • Sendai virus capable of expressing fluorescent protein EGFP (CytoTune, registered trademark, EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Invitrogen) was added to the gel medium so that the MOI was 3.0 or 30.0.
  • the fluorescence intensity of blood cells was observed using a fluorescence microscope. Further, as shown in FIG. 8, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that blood cells were infected with Sendai virus. It was also confirmed that Sendai virus can be efficiently introduced into cells with higher MOI.
  • Example 9 of the first embodiment 5 ⁇ 10 4 blood cells (mononuclear cells, Stanford University Blood Center) suspended in 100 ⁇ L of gel medium in which Gellan gum (Nissan Chemical) was added to Stemspan ACF (Stemcell Technologies) to 0.02 mass% The cells were seeded and placed in a 37 ° C. CO 2 incubator to culture blood cells in suspension.
  • Sendai virus capable of expressing fluorescent protein EGFP (CytoTune, registered trademark, EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Invitrogen) was added to the gel medium so that the MOI was 30.0.
  • the fluorescence intensity of blood cells was observed using a fluorescence microscope. Further, as shown in FIG. 8, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that blood cells were infected with Sendai virus.
  • Example 10 of the first embodiment 1 ⁇ 10 6 blood cells (mononuclear cells, Stanford University Blood Center) suspended in 750 ⁇ L Stemspan ACF (Stemcell Technologies) are seeded in each well of the well dish, and the well dish is in a CO 2 incubator at 37 ° C. And blood cells were cultured for adhesion. Three days later, 750 ⁇ L of Stemspan ACF was added to each well and left in a 37 ° C. CO 2 incubator to continue culturing blood cells.
  • stemcell Technologies Stemspan ACF
  • Sendai virus (Invitrogen) capable of expressing the reprogramming factor OSKM (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) was added to the gel medium.
  • Sendai virus was added to the gel medium so that the MOI of hKOS (KLF4, OCT3 / 4, SOX2) was 10.0, the MOI of c-MYC was 10.0, and the MOI of hKLF was 10.0.
  • the tube was allowed to stand in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • the cells continued to be cultured for 30 days. Meanwhile, every 48 hours, 500 ⁇ L of bFGF-free gel medium was added to the tubes.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-free gel medium.
  • iPS cells prepared in a bFGF-free gel medium were re-wound on the feeder and the morphology of the colonies was confirmed, as shown in FIG. 9, they were in the form of undifferentiated iPS cell colonies.
  • OCT3 / 4 which is a marker of pluripotent stem cells
  • Example 11 of the first embodiment Sendai virus was added to the gel medium so that the MOI of hKOS (KLF4, OCT3 / 4, SOX2) was 5.0, the MOI of c-MYC was 5.0, and the MOI of hKLF was 2.5.
  • Blood cells monoonuclear cells, Stanford University Blood Center) were initialized as in Example 10 of the first embodiment.
  • iPS cell clamp formation was observed in the bFGF-free gel medium.
  • iPS cells prepared in a bFGF-free gel medium were re-wound on the feeder and the morphology of the colonies was confirmed, as shown in FIG. 9, they were in the form of undifferentiated iPS cell colonies.
  • OCT3 / 4 which is a marker of pluripotent stem cells
  • the cells were OCT3 / 4 positive as shown in FIG.
  • Example 12 of the first embodiment To 8 mL of whole blood, 2 mL of HetaSep (registered trademark, Stem Cell Technologies) or HES40 (NIPRO) was added and incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 30 minutes to 1 hour to precipitate erythrocytes. Thereafter, the plasma component was transferred to a tube, and the number of mononuclear cells was counted. The results are shown in FIG. Mononuclear cells could be separated as much as or better than when using Ficoll (GE Healthcare).
  • HetaSep registered trademark, Stem Cell Technologies
  • HES40 NIPRO
  • the isolated mononuclear cells were immunostained with a CD3 conjugate antibody, and the concentration rate of the T cell fraction was confirmed by FACS. The results are shown in FIG. It was shown that mononuclear cells can be efficiently separated using an erythrocyte separating agent.
  • Example 13 of the first embodiment 5 ⁇ 10 4 mononuclear cells separated in Example 12 of the first embodiment were suspended in 750 ⁇ L of Stemspan ACF (Stemcell Technologies), which is a liquid medium that is not a gel medium. The suspension was seeded in each well of the well dish, and the well dish was allowed to stand in a 37 ° C. CO 2 incubator to culture mononuclear cells.
  • Stemspan ACF Stemspan ACF
  • Sendai virus capable of expressing fluorescent protein EGFP (CytoTune, registered trademark, EmGFP Sendai Fluorescence Reporter, Invitrogen) was added to the liquid medium so that the MOI was 3.0.
  • the fluorescence intensity of the cells was observed using a fluorescence microscope as shown in FIG. Further, as shown in FIG. 15, the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that mononuclear cells were infected with Sendai virus.
  • Example 14 of the first embodiment 1 ⁇ 10 6 mononuclear cells separated in Example 12 of the first embodiment were suspended in 750 ⁇ L of Stemspan ACF (Stemcell Technologies), which is a liquid medium that is not a gel medium. The suspension was seeded in each well of the well dish, and the well dish was allowed to stand in a 37 ° C. CO 2 incubator to culture mononuclear cells. Three days later, 750 ⁇ L of Stemspan ACF was added to each well and left in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • Stemspan ACF Stemspan ACF
  • hES cell medium Primary ES Cell Medium, Reprocell
  • bFGF-free Stempan ACF Stemcell Technologies
  • Sendai virus (Invitrogen) capable of expressing the reprogramming factor OSKM (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) was added to the medium.
  • Sendai virus was added to the medium so that the MOI of hKOS (KLF4, OCT3 / 4, SOX2) was 10.0, the MOI of c-MYC was 10.0, and the MOI of hKLF was 10.0.
  • bFGF-containing hES cell medium Primary ES Cell Medium, Reprocell
  • bFGF-containing hES cell medium Primary ES Cell Medium, Reprocell
  • the method for producing induced pluripotent stem cells according to the second embodiment includes preparing somatic cells, introducing reprogramming factor RNA into somatic cells using an RNA transfection reagent, and somatic cells in a gel medium. Initializing.
  • somatic cells examples include fibroblasts, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem progenitor cells.
  • the details of the blood cells are as described in the first embodiment.
  • the details of the reprogramming factor RNA are also as described in the first embodiment.
  • Somatic cells into which reprogramming factor RNA has been introduced are cultured in a feeder-free manner using a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin511 (iMatrix-511, nippi).
  • a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin511 (iMatrix-511, nippi).
  • stem cell medium such as human ES / iPS medium such as PluriQ (MTI-GlobalStem) and Primate ES Cell Medium (ReproCELL) can be used. is there.
  • the stem cell culture medium is not limited to this, and various stem cell culture media can be used.
  • Primate ES Cell Medium Reprostem, ReproFF, ReproFF2, ReproXF (Reprocell), mTeSR1, TeSR2, TeSRE8, ReproTeSR (STEMCELL Technologies), and PruriSTM (registered trademark).
  • FF Culture Medium Human iPS and ES Cells Pluriton reprogramming medium (Stemment), PluriSTEM (registered trademark), Stemfit AK02N, Stemfit AK03 (Ajinomoto ES) Registered trademark) serum and feeder free medium for hESC / iPS (Applied StemCell), and L7 (may use a registered trademark) hPSC Culture System (LONZA) or the like.
  • the stem cell medium is placed in, for example, a dish, well, tube, or the like.
  • the reprogramming factor RNA is introduced into somatic cells using an RNA transfection reagent.
  • Lipofectamine Messenger Max (registered trademark) can be used as the RNA transfection reagent.
  • RNA transfection reagent for example, mRNA-In (registered trademark, Molecular Transfer, Inc.) is used as the RNA transfection reagent.
  • RNA transfection reagents Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX (ThermoFisher Scientific), Lipofectamine (registered trademark) 2000, Lipofectamine (registered trademark) 3000, NeonTransfection System (ThermofectStemFensentism).
  • RNA Transfection Reagent BiooScientific
  • Amaxa registered product
  • Human T cell Nucleofector (registered product) kit Lid, VAPA-1002
  • Amaxa registered trade
  • Human CD34 cell Nucleofector (registered trade) kit Lid, Inc., VAPA-1003
  • ReproRNA may be utilized lipofection reagent such as (R) transfection reagent (STEMCELL Technologies).
  • reprogramming factor RNA may be performed multiple times. Introduction of reprogramming factor RNA into somatic cells is performed, for example, once every two days or once a day, for 5 to 15 days, 7 to 13 days, or 10 days. However, when the mRNA is a replicative RNA, the reprogramming factor RNA may be introduced into the somatic cell only once.
  • the somatic cells After introducing the reprogramming factor RNA into the somatic cells, the somatic cells are placed in a gel medium to initialize the somatic cells.
  • the gel medium is, for example, gellan gum in a stem cell medium with a final concentration of 0.001% to 0.5%, 0.005% to 0.1%, or 0.01% to 0.05% by weight. It is prepared by adding so that.
  • Gel medium is gellan gum, deacylated gellan gum, hyaluronic acid, rhamzan gum, diyutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectinic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate , Rhamnan sulfate, and at least one polymer compound selected from the group consisting of salts thereof may be contained.
  • the gel culture medium may contain methylcellulose. By containing methylcellulose, aggregation between cells is further suppressed.
  • the gel medium can be poly (glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly (2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide ( NHS) ester terminated, triethoxysilane terminated, Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide), Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate), Poly (N-isopropylacrylamide-co- It may contain a small number of temperature sensitive gels selected from methacrylic acid, Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate), and N-isopropylacrylamide.
  • PGMA poly (glycerol monomethacrylate)
  • the gel medium does not contain a growth factor such as, for example, basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the gel medium contains a growth factor such as bFGF at a low concentration of 400 ⁇ g / L or less, 40 ⁇ g / L or less, or 10 ⁇ g / L or less.
  • the gel medium does not contain TGF- ⁇ or contains TGF- ⁇ at a low concentration of 600 ng / L or less, 300 ng / L or less, or 100 ng / L or less.
  • the gel medium need not be stirred. Moreover, the gel medium does not need to contain feeder cells.
  • the gel medium may contain at least one substance selected from the group consisting of cadherin, laminin, fibronectin, and vitronectin.
  • somatic cells have been induced (reprogrammed) into induced pluripotent stem cells can be confirmed by the method described in the first embodiment.
  • RNA capable of expressing the reprogramming factor is efficiently introduced into the somatic cell, so that the somatic cell is efficiently produced in the gel medium. It is possible to prepare artificial pluripotent stem cells by initializing them.
  • Example of the second embodiment In each well of the well plate, a diluted solution of a basement membrane matrix in which iMatrix-511 (nippi) was diluted to 0.5 ⁇ g / cm 2 with respect to 1.5 mL of PBS was added. Thereafter, the well plate was placed in a 37 ° C. incubator for 1 hour or longer. Next, the diluted solution of the basement membrane matrix is removed from each well of the well plate, and about 1 ⁇ 10 5 fibroblasts suspended in 10% FBS medium are seeded in each well of the well plate to adhere the fibroblasts. Cultured.
  • a master mix of reprogramming factor mRNA shown in FIG. 17 was prepared.
  • the medium in each well of the well plate was replaced with 2 mL of PluriQ (registered trademark, MTI-GlobalStem).
  • a tube A and a tube B containing the contents shown in FIG. 18 were prepared.
  • the contents of tube A and tube B are mixed to prepare an RNA transfection reagent, mRNA-In (registered trademark, Molecular Transfer, Inc.), and an mRNA master mix. I put it.
  • mRNA-In registered trademark, Molecular Transfer, Inc.
  • mRNA master mix I put it.
  • a mixture of RNA-In and mRNA master mix was added to each well, and the well plate was shaken to diffuse the mixture of RNA-In and mRNA master mix into the medium.
  • the fibroblasts were then incubated overnight at 37 ° C., 5% CO 2 to transfect the cells with reprogramming factor RNA.
  • the medium was removed from each well, and the cells were washed with PBS.
  • 300 ⁇ L of cell detachment solution (TrypLE Select, registered trademark, Life Technologies) was added to each well, and the well plate was placed in a 37 ° C. incubator for 10 minutes. Thereafter, 700 ⁇ L of PluriQ was added to each well, and the cell mass was dissociated into single cells by pipetting to prepare a cell suspension.
  • a gel medium was prepared by blending polymer FP001 at a concentration of 0.02% by mass with human ES medium (Primate ES Cell Medium, Reprocell). The gel medium did not contain bFGF. FP001 is a medium additive mainly composed of gellan gum. The cell suspension was then transferred to a 15 mL tube and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Furthermore, the supernatant was removed from the 15 mL tube and the cells were resuspended in 2 mL of gel medium. Thereafter, 1 mL of gel medium was added to the 15 mL tube every other day.
  • the iPS cells prepared in the gel medium were re-sipped on the feeder and the colony morphology was confirmed. As shown in FIG. 19, in the form of undifferentiated iPS cell colonies. there were.
  • Human blood cells were obtained from healthy adult men. Modified mRNA (TriLink), non-adhesive dish, 15 mL tube, 50 mL tube, Ficoll, cytoflow meter (BD), antibody against CD34 (Miltenyi Biotec), antibody against CD3 (Miltenyi Biotec), MACS (registered trademark) Buffer (Miltenyi Biotec), T cell medium, low serum medium (Opti-MEM (registered trademark), Gibco), siRNA transfer reagent (Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX, ThermoFisherScience), and antibody to TRA-1-60 (BD) Prepared.
  • TriLink Modified mRNA
  • non-adhesive dish 15 mL tube, 50 mL tube, Ficoll, cytoflow meter (BD), antibody against CD34 (Miltenyi Biotec), antibody against CD3 (Miltenyi Biotec), MACS (registered trademark) Buffer (Miltenyi Biotec), T
  • the T cell (CD3 positive cell) medium was a mixture of A medium and B medium below.
  • the A medium was a mixed solution of 15 mL of X vivo-10 (Lonza, 04-743Q) and IL-2 (10 ug / mL).
  • B medium was mixed with 50 ⁇ L of X vivo-10 and Dynabeads CD3 / CD28 (Life Technologies, 111-31D) in a 1.5 mL tube, vortexed for 5 seconds, spun down, and placed in DynaMag-2 (Thermo Fisher Science). Then, after standing for 1 minute, the supernatant was removed.
  • IL-6 100 ⁇ g / mL
  • 10 ⁇ L of SCF 300 ⁇ g / mL
  • 10 ⁇ L of TPO 300 ⁇ g / mL
  • 10 ⁇ L of FLT3 ligand 300 ⁇ g
  • an OCT3 / 4 mRNA-containing solution, a SOX2 mRNA-containing solution, a KLF4 mRNA-containing solution, a c-MYC mRNA-containing solution, a LIN28A mRNA-containing solution, and a green fluorescent protein (GFP) each having a concentration of 100 ng / ⁇ L.
  • An mRNA-containing solution was prepared.
  • the centrifuge was set at 18 ° C. 5 to 50 mL of blood was collected, and EDTA was added to the blood and mixed gently. Further, 5 mL of a medium for separating human lymphocytes (Ficoll-Paque PREMIUM, GE Healthcare Japan) was dispensed into two 15 mL tubes. 5 mL of PBS was added to the blood for dilution, and 5 mL was overlaid on the medium for separating human lymphocytes in the tube. At this time, diluted blood was slowly added onto the medium along the tube wall of the tube so as not to disturb the interface.
  • a medium for separating human lymphocytes (Ficoll-Paque PREMIUM, GE Healthcare Japan) was dispensed into two 15 mL tubes. 5 mL of PBS was added to the blood for dilution, and 5 mL was overlaid on the medium for separating human lymphocytes in the tube. At this time, diluted blood was slowly added onto the medium along the tube wall of the
  • the solution in the tube was centrifuged at 400 ⁇ g and 18 ° C. for 30 minutes. At this time, both acceleration and deceleration went slowly. After centrifuging, a white turbid intermediate layer appeared in the tube. This white, turbid intermediate layer contains mononuclear cells. The white, turbid intermediate layer in the tube was slowly collected with a pipetman and transferred to a new 15 mL tube. At this time, the lower layer was not sucked up. About 1 mL of the intermediate layer, which was cloudy in white, could be recovered from one tube. Two intermediate layers were transferred together into one tube.
  • the separated 5 ⁇ 10 6 mononuclear cells were suspended in 1 mL of T cell medium or blood stem / progenitor cell medium, seeded in a 12-well plate, and cultured.
  • the culture conditions were a CO 2 concentration of 5%, an oxygen concentration of 19%, and a temperature of 37 ° C.
  • Opti-MEM low serum medium
  • Opti-MEM low serum medium
  • reprogramming factor mixed solution 100 ⁇ L of low serum medium (Opti-MEM (registered trademark), Gibco) and 25 ⁇ L of reprogramming factor mixed solution were mixed to obtain a first mixed solution. Further, 112.5 ⁇ L of low serum medium (Opti-MEM (registered trademark), Gibco) and 12.5 ⁇ L of siRNA introduction reagent (Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX, ThermoFisherScience) were mixed to form a second mixed solution. Then, the 1st liquid mixture and the 2nd liquid mixture were mixed, and it left still at room temperature for 15 minutes, and was set as the lipofection reaction liquid.
  • siRNA introduction reagent Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX, ThermoFisherScience
  • the obtained lipofection reaction solution was gently added to a 12-well plate in which mononuclear cells were cultured, and then the mononuclear cells were cultured at 37 ° C. for 18 hours in a feeder-free manner.
  • the culture conditions were a CO 2 concentration of 5%, an oxygen concentration of 19%, and a temperature of 37 ° C.
  • the density of mononuclear cells when the lipofection reaction solution was added was 3 ⁇ 10 6 . After 18 hours, mononuclear cells were collected in a 15 mL tube, centrifuged at 300 g, and the supernatant was removed.
  • CD34 blood cell medium 1.25 m was added to a 15 mL tube, the mononuclear cell suspension was returned to the same 12-well plate, and mononuclear cells were cultured at 37 degrees overnight in a feeder-free manner.
  • the culture conditions were a CO 2 concentration of 5% and an oxygen concentration of 19%. The above process was repeated once every two days for 7 days.
  • the density of the cells that had undergone a total of 4 lipofections was 3 ⁇ 10 6 .
  • a part of the cells was taken out from the 12-well plate and the expression of GFP was confirmed with a fluorescence microscope.
  • GFP expression was confirmed as shown in FIG.
  • TRA-1-60 (Confirmation of expression of TRA-1-60)
  • TRA-1-60 On the 7th day from the start of lipofection, a part of the cells is removed from the 12-well plate, and the removed cells are treated with an antibody against TRA-1-60, which is a surface antigen specifically expressed in the cells that have begun to be initialized. And stained with an antibody labeled with Allophycocynin (APC) fluorescent dye. Subsequently, reprogramming is initiated in the cells by confirming the proportion of TRA-1-60 positive cells with a fluorescence activated cell sorter (FACS®, BD), iPS cell genes are expressed, and iPS cells are I confirmed that it could be done.
  • FACS® fluorescence activated cell sorter
  • a dot plot was prepared with the autofluorescence intensity on the x-axis and the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled anti-TRA-1-60 antibody on the y-axis.
  • TRA-1-60 positive cells were not detected.
  • Experiments 1, 2 and 3 TRA-1-60 positive cells were detected.
  • the result was derived from the whole mononuclear cells that were not separated by the marker
  • Experiment 2 was the result derived from cells separated by CD3 positive
  • Experiment 3 was separated by CD34 positive. This is a result derived from cells. Therefore, it was shown that reprogramming factor RNA can be used to induce iPS cells by introducing reprogramming factor into blood-derived cells using lipofection of reprogramming factor RNA.

Abstract

本開示によれば、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。また、本開示によれば、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。

Description

人工多能性幹細胞の作製方法
　本発明は、細胞技術に関し、人工多能性幹細胞の作製方法に関する。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている。
　ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、数多くのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法について説明する。体細胞をレトロウイルスやレンチウイルスに感染させて、初期化因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することができる。さらに、レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムに初期化因子を挿入することができ、初期化因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
　しかし、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法には、以下の問題点がある。まず、体細胞のゲノムへの初期化因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化の原因になり得る。また、ゲノム上に挿入された初期化因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には癌化のリスクがある。実際、マウスモデルにおいては、導入された初期化因子の再活性化が体細胞で見られ、癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　エピソーマルベクターは環状ＤＮＡであり、核内で自己増幅する。エピソーマルベクターは、原理的にはゲノムに組み込まれないと考えられてきたが、最近の研究では、エピソーマルで作成されたｉＰＳ細胞のゲノム上に、エピソーマルベクターの断片が散在して挿入されることが報告されている。そのため、リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しうるという問題がある。例えばｃ－ＭＹＣやＫＬＦ４が細胞内に残存すると、癌化の原因になる。リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しているか否かを検査するには膨大な費用が必要である。移植細胞プール中の全ての細胞にエピソーマルプラスミドのゲノムへの挿入がなく、残存がないことを示すことは不可能である。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案されている（例えば、非特許文献２参照。）。
Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
　初期化因子ＲＮＡを効率的に体細胞に導入する方法が求められている。本発明は、臨床利用に適した安全な人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入してもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、接着培養されている体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入してもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、ゲル培地中で体細胞を初期化することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が繊維芽細胞であってもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、赤血球分離剤を用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、フィルターを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、免疫磁気ビーズを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡが、Ｍ３Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地が攪拌されなくともよい。ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含んでいてもよい。ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
　また、本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が繊維芽細胞であってもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法が、赤血球分離剤を用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、フィルターを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、免疫磁気ビーズを用いて、体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡが、Ｍ３Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含んでいてもよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、ゲル培地が攪拌されなくもよい。ゲル培地が、成長因子を含まなくともよい。ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含んでいてもよい。ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まなくともよい。
　上記の人工多能性幹細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡの導入を複数回行ってもよい。
　本発明によれば、臨床利用に適した安全な人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供可能である。
第１実施形態の実施例１の結果を示す蛍光顕微鏡の写真と、フローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１の結果を示す蛍光顕微鏡の写真と、フローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例３に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第１実施形態の実施例３に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例４に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例５に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例６に係る免疫染色された細胞の写真である。 第１実施形態の実施例７から９の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１０、１１に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第１実施形態の実施例１０に係る免疫染色された細胞の写真であるである。 第１実施形態の実施例１１に係る免疫染色された細胞の写真であるである。 第１実施形態の実施例１２に係る１０ｍＬ血液当たりの平均単核球細胞数を示すグラフである。 第１実施形態の実施例１２の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１３の結果を示す蛍光顕微鏡の写真である。 第１実施形態の実施例１３の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 第１実施形態の実施例１４に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第２実施形態の実施例で用いた初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスの成分を示す表である。 第２実施形態の実施例で用いたキットの内容物を示す表である。 第２実施形態の実施例に係るｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 第２実施形態の参考例に係る蛍光顕微鏡写真である。 第２実施形態の参考例に係る蛍光活性化フローサイトメーターによる分析結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　（第１実施形態）
　第１実施形態に係る人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、を含む。
　体細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。
　血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
　血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
　単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
　チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
　回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
　１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
　次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ－５Ｂ－ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。
　単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球分離剤を用いて分離されてもよい。赤血球分離剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。
　また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ－ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ－００１等を使用してもよい。
　あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー　ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー　ＤＭＳＯフリー　ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
　単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
　ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
　ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。
　６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベーターに入れて温める。
　２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０４から１×１０９個、好ましくは２×１０７個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。
　１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。
　次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。
　自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。
　１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ２でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。
　ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。
　接着培養されている体細胞に、初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する。あるいは、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞に、初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する。
　初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養する。
　初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
　ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　（登録商標）ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ａｎｄ　ＥＳ　Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＬＯＮＺＡ）、及びＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
　ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。
　ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
　あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
　ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まない。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
　また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含まないか、ＴＧＦ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
　ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
　ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
　体細胞に導入される初期化因子ＲＮＡは、例えば、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。初期化因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、初期化因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５－フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５－フォルムシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’－ＯＵ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
　ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
　ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
　また、ｍＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスの一種であるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、リプログラミング因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、初期化因子ＲＮＡを細胞に複数回導入することを省くことが可能となる。
　リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
　また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ　Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ　Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ　Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ　Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ　Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ　Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
　リプリケイティブＲＮＡは、例えば、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ　ＲＮＡレプリカーゼ）－（プロモーター）－（ＲＦ１）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ２）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ３）－（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）－（ＲＦ４）－（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）－（任意に選択可能なマーカー）－（ＶＥＥ　３’ＵＴＲ及びポリＡテール）－（任意に選択可能なマーカー）－プロモーターを含んでいる。上記のＲＦ１－４は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子である。上記のＲＦ２－３、ＲＦ３－４、ＲＦ４は任意である。上記のＲＦ１－４は、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ－２、ｃ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
　初期化因子ＲＮＡは、センダイウイルスを用いて体細胞に導入される。初期化因子ＲＮＡを搭載したセンダイウイルスとしては、ＣｙｔｏＴｕｎｅ（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が使用可能である。センダイウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。センダイウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である。
　センダイウイルスを用いて、体細胞へ初期化因子ＲＮＡの導入を行った後、ゲル培地ではない液体培地あるいはゲル培地中で、体細胞を初期化させる。
　体細胞が人工多能性幹細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。あるいは、体細胞が人工多能性幹細胞に誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行う。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
　以上説明した第１実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法によれば、初期化因子ＲＮＡを発現させることができるＲＮＡを体細胞に効率的に導入して、初期化因子ＲＮＡを発現させ、人工多能性幹細胞を作製することが可能である。
　（第１実施形態の実施例１）
　ゲル培地ではない液体培地である、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含む２ｍＬのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁した１×１０５個の繊維芽細胞（ＨＤＦ２４４３又はＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を、ウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を接着培養した。２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、感染多重度（ＭＯＩ）が３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１（ＨＤＦ２４４３）及び図２（ＨＤＦ２８０２）に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
　（第１実施形態の実施例２）
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した２ｍＬのゲル培地に懸濁した１×１０５個の繊維芽細胞（ＨＤＦ２４４３又はＨＤＦ２８０２）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を浮遊培養した。２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１（ＨＤＦ２４４３）及び図２（ＨＤＦ２８０２）に示すように、繊維芽細胞の蛍光強度を観察した。また、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、繊維芽細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
　また、第１実施形態の実施例１、２の結果から、液体培地中で接着培養したときより、ゲル培地中で浮遊培養したときのほうが、蛍光タンパク質ＥＧＦＰが多く発現していた。これは、液体培地中で接着培養したときより、ゲル培地中で浮遊培養したときのほうが、センダイウイルスを細胞に効率的に導入できたことを示している。
　（第１実施形態の実施例３）
　ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を４ｎｇ／ｍＬ含有しているｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した２ｍＬのゲル培地に懸濁した１×１０５個の繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置し、繊維芽細胞を浮遊培養した。２４時間後、初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゲル培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが５．０、ｃ－ＭＹＣのＭＯＩが５．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが５．０となるようゲル培地に添加した。
　以降、３７℃のＣＯ２インキュベーター中にチューブを静置した。２３日間、細胞を培養し続けた。その間、４８時間毎に、５００μＬのｂＦＧＦ含有ゲル培地をチューブに加えた。
　その結果、ｂＦＧＦ含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図４に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　（第１実施形態の実施例４）
　センダイウイルスを、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが２．５、ｃ－ＭＹＣのＭＯＩが２．５、及びｈＫＬＦのＭＯＩが２．５となるようゲル培地に添加した以外は、第１実施形態の実施例３と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を初期化した。
　その結果、ｂＦＧＦ含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図５に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　（第１実施形態の実施例５）
　ｂＦＧＦを含有しないゲル培地を用いた以外は、第１実施形態の実施例３と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を初期化した。
　その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図６に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　（第１実施形態の実施例６）
　繊維芽細胞（ＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を用いた以外は、第１実施形態の実施例５と同様にして、繊維芽細胞（ＨＤＦ２８０２、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を初期化した。
　その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図３に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図７に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　第１実施形態の実施例３から６の結果は、複数種類の繊維芽細胞から、ｂＦＧＦ含有ゲル培地及びｂＦＧＦ非含有ゲル培地を用いて、センダイウイルスによってｉＰＳ細胞を誘導できたことを示している。
　（第１実施形態の実施例７）
　ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した５×１０４個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。なお、ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦには、成長因子として、２０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、１０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３を添加した。ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを使用する以下の実施例においても、同様である。
　２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
　（第１実施形態の実施例８）
　ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に脱アシル化ジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した７５０μＬのゲル培地に懸濁した５×１０４個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、血液細胞を培養した。
　２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０又は３０．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。また、ＭＯＩが高いほうが、細胞にセンダイウイルスを効率的に導入できることが確認された。
　（第１実施形態の実施例９）
　ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にジェランガム（日産化学）が０．０２質量％になるよう添加した１００μＬのゲル培地に懸濁した５×１０４個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をチューブに播種し、チューブを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、血液細胞を浮遊培養した。
　２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３０．０となるようゲル培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、血液細胞の蛍光強度を観察した。また、図８に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、血液細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
　（第１実施形態の実施例１０）
　７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した１×１０６個の血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、血液細胞を接着培養した。３日後、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを各ウェルに添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、引き続き血液細胞を培養した。
　さらに３日後、各ウェル中の血液細胞を回収し、遠心分離機を利用して２８０ｇで血液細胞を遠心し、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）にジェランガムが０．０２質量％となるよう添加したゲル培地２ｍＬに血液細胞を懸濁し、血液細胞が懸濁されたゲル培地をチューブに入れた。
　初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をゲル培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが１０．０、ｃ－ＭＹＣのＭＯＩが１０．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが１０．０となるようゲル培地に添加した。
　以降、３７℃のＣＯ２インキュベーター中にチューブを静置した。３０日間、細胞を培養し続けた。その間、４８時間毎に、５００μＬのｂＦＧＦ非含有ゲル培地をチューブに加えた。
　その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図１０に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　（第１実施形態の実施例１１）
　センダイウイルスを、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが５．０、ｃ－ＭＹＣのＭＯＩが５．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが２．５となるようゲル培地に添加した以外は、第１実施形態の実施例１０と同様にして、血液細胞（単核球細胞、スタンフォード大学血液センター）を初期化した。
　その結果、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地中において、ｉＰＳ細胞のクランプの形成が認められた。また、ｂＦＧＦ非含有ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。さらに、細胞を多能性幹細胞のマーカーであるＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図１１に示すように、細胞は、ＯＣＴ３／４陽性を示した。
　（第１実施形態の実施例１２）
　８ｍＬの全血に対して２ｍＬのＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ステムセルテクノロジーズ）又はＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）を添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで３０分から１時間インキュベートし、赤血球を沈降させた。その後、血漿成分をチューブに移し、単核球細胞数を計測した。結果を図１２に示す。Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた場合と同等以上に、単核球細胞を分離できた。
　分離された単核球細胞をＣＤ３コンジュゲート抗体で免疫染色をし、ＦＡＣＳでＴ細胞画分の濃縮率を確認した。結果を図１３に示す。赤血球分離剤を用いて、単核球細胞を効率的に分離できることが示された。
　（第１実施形態の実施例１３）
　ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、第１実施形態の実施例１２で分離した５×１０４個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。
　２４時間後、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ、登録商標、ＥｍＧＦＰ　Ｓｅｎｄａｉ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を、ＭＯＩが３．０となるよう液体培地に添加した。２４時間後、蛍光顕微鏡を利用して、図１４に示すように、細胞の蛍光強度を観察した。また、図１５に示すように、フローサイトメーターを利用して蛍光強度を測定した。その結果、単核球細胞がセンダイウイルスに感染していることが確認された。
　（第１実施形態の実施例１４）
　ゲル培地ではない液体培地である、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、第１実施形態の実施例１２で分離した１×１０６個の単核球細胞を懸濁させた。当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、単核球細胞を培養した。３日後、７５０μＬのＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦを各ウェルに添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置した。
　さらに３日後、各ウェル中の細胞を回収し、遠心分離機を用いて、２８０ｇで単核球細胞を単離した。単離した単核球細胞をゲル培地ではない液体培地であるｈＥＳ細胞培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）、又はｂＦＧＦ非含有ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁し、当該懸濁液をウェルディッシュの各ウェルに入れた。
　初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加した。センダイウイルスは、ｈＫＯＳ（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）のＭＯＩが１０．０、ｃ－ＭＹＣのＭＯＩが１０．０、及びｈＫＬＦのＭＯＩが１０．０となるよう培地に添加した。
　単核球細胞をセンダイウイルスに感染させた２日後、ｂＦＧＦを含有ｈＥＳ細胞培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）をウェルに加え、さらに２日後、細胞をフィーダー細胞上に播種した。その後、１９日間、フィーダー細胞上で細胞を培養したところ、図１６に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形成が確認された。したがって、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離された単核球細胞と同様に、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ステムセルテクノロジーズ）を用いて単離された単核球細胞、及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）を用いて単離された単核球細胞から、ｉＰＳ細胞を誘導できることが確認された。
　（第２実施形態）
　第２実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法は、体細胞を用意することと、体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、ゲル培地中で体細胞を初期化することと、を含む。
　体細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞が挙げられる。
　血液細胞の詳細は、第１実施形態で説明したとおりである。初期化因子ＲＮＡの詳細も、第１実施形態で説明したとおりである。
　初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養する。
　初期化因子ＲＮＡを導入される体細胞が培養される培地としては、例えば、ＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、及びＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
　ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　（登録商標）ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ａｎｄ　ＥＳ　Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
　初期化因子ＲＮＡは、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて体細胞に導入される。ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、リポフェクタミン　メッセンジャーマックス（登録商標）が使用可能である。
　あるいは、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、例えば、ｍＲＮＡ－Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，　Ｉｎｃ．）が用いられる。さらに、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のリポフェクション試薬を利用してもよい。
　体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、複数回行ってもよい。体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、例えば、２日に１回、あるいは１日に１回、５日間以上１５日間以内、７日間以上１３日間以内、あるいは１０日間繰り返して行う。ただし、ｍＲＮＡがリプリケイティブＲＮＡである場合、体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は１回でもよい。
　体細胞への初期化因子ＲＮＡの導入を行った後、体細胞をゲル培地に入れ、体細胞を初期化させる。
　ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。
　ゲル培地は、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
　あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
　ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含まない。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
　また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含まないか、ＴＧＦ－βを６００ｎｇ／Ｌ以下、３００ｎｇ／Ｌ以下、あるいは１００ｎｇ／Ｌ以下の低濃度で含む。
　ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
　ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
　体細胞が人工多能性幹細胞に誘導（リプログラミング）されたか否かは、第１実施形態で説明した方法により確認することができる。
　以上説明した第２実施形態に係る人工多能性幹細胞の作製方法によれば、初期化因子を発現させることができるＲＮＡを体細胞に効率的に導入して、ゲル培地中で体細胞を効率的に初期化して、人工多能性幹細胞を作製することが可能である。
　（第２実施形態の実施例）
　ウェルプレートの各ウェルに、１．５ｍＬのＰＢＳに対し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）を０．５μｇ／ｃｍ２となるように希釈した基底膜マトリックスの希釈液を入れた。その後、ウェルプレートを３７℃のインキュベーターに１時間以上入れた。次に、ウェルプレートの各ウェルから基底膜マトリックスの希釈液を取り除き、ウェルプレートの各ウェルに１０％ＦＢＳ培地に懸濁した繊維芽細胞を約１×１０５個播種し、繊維芽細胞を接着培養した。
　図１７に示す初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスを用意した。また、ウェルプレートの各ウェル中の培地を２ｍＬのＰｌｕｒｉＱ（登録商標、ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）に交換した。さらに、図１８に示す内容物をいれたチューブＡとチューブＢを用意した。次に、チューブＡとチューブＢの内容物を混合し、ＲＮＡトランスフェクション試薬であるｍＲＮＡ－Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，　Ｉｎｃ．）と、ｍＲＮＡマスターミックスと、の混合物を作製し、１０分間静置した。その後、ＲＮＡ－ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を各ウェルに加え、ウェルプレートを揺らして、培地中にＲＮＡ－ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を拡散させた。次に、繊維芽細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートして初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。
　翌日以降、９日間連続で、上記と同様に、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。したがって、合計１０回、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトとした。
　初期化因子ＲＮＡを細胞に１０回トランスフェクトした後、各ウェルから培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、３００μＬの細胞剥離液（ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ライフテクノロジーズ）を各ウェルに加え、ウェルプレートを３７℃インキュベーターに１０分間置いた。その後、各ウェルに７００μＬのＰｌｕｒｉＱを加え、ピペッティングにより細胞塊をシングルセルに解離して、細胞懸濁液を作製した。
　ヒトＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に０．０２質量％の濃度でポリマーＦＰ００１を配合して、ゲル培地を作製した。ゲル培地には、ｂＦＧＦを含めなかった。ＦＰ００１は、ジェランガムを主体とする培地用添加剤である。次に、細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに移し、５分間１０００ｒｐｍで遠心した。さらに、１５ｍＬチューブから上清を取り除き、２ｍＬのゲル培地に細胞を再懸濁した。その後、１日おきに、１ｍＬのゲル培地を１５ｍＬチューブに加えた。細胞をゲル培地に移行させて１０日後、ゲル培地で作製されたｉＰＳ細胞をフィーダー上にまきなおし、コロニーの形態を確認したところ、図１９に示すように、未分化なｉＰＳ細胞コロニーの形態であった。
　（第２実施形態の参考例）
　ヒト血液細胞は健康な成人男性から入手した。また、修飾化ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ社）、非接着ディッシュ、１５ｍＬチューブ、５０ｍＬチューブ、フィコール、サイトフローメータ（ＢＤ）、ＣＤ３４に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ３に対する抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、ＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｔ細胞培地、低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）、ｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）、及びＴＲＡ－１－６０に対する抗体（ＢＤ）を用意した。
　Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）培地は、以下Ａ培地とＢ培地の混合液であった。Ａ培地は、１５ｍＬのＸ　ｖｉｖｏ－１０（Ｌｏｎｚａ社、０４－７４３Ｑ）及びＩＬ－２（１０ｕｇ／ｍＬ）の混合液であった。Ｂ培地は１．５ｍＬチューブにＸ　ｖｉｖｏ－１０及びＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，　１１１－３１Ｄ）５０μＬを混合し、５秒間ボルテックス後、スピンダウンし、ＤｙｎａＭａｇ－２（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）に静置し、一分静置後、上清を取り除いたものであった。
　また、１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製した。
　また、それぞれ濃度が１００ｎｇ／μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、ｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、ＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｍＲＮＡ含有液を用意した。次に、３８５μＬのＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ含有液、１１９μＬのＳＯＸ２のｍＲＮＡ含有液、１５６μＬのＫＬＦ４のｍＲＮＡ含有液、１４８μＬのｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡ含有液、８３μＬのＬＩＮ２８ＡのｍＲＮＡ含有液、及び１１０μＬのＧＦＰのｍＲＮＡ含有液を混合し、初期化因子混合液を得た。得られた初期化因子混合液を５０μＬずつ容量１．５ｍＬのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅのチューブ（エッペンドルフチューブ（登録商標）、エッペンドルフ）に分注し、－８０℃の冷凍庫に保存した。　
　遠心機を１８℃に設定した。５ｍＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液にＥＤＴＡを加えて優しく混ぜた。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注した。５ｍＬのＰＢＳを血液に加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層した。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加えた。
　チューブ中の溶液を、４００×ｇ、１８℃で３０分間遠心した。この際、加速、減速ともゆっくり行った。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れた。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移した。この際、下層は吸い取らないようにした。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できた。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移した。
　回収した単核球細胞に対し、１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに２００×ｇ、１８℃で１０分間遠心した。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得た。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントした。
　１×１０７個の単核球細胞と、ＣＤ３４抗体又はＣＤ３抗体と、を、４℃の溶液１００μＬ中で１５分反応させた。反応後、溶液に５ｍＬのＭＡＣＳ（登録商標）バッファ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、２７０ｇで遠心した。遠心後、上清を除去し、１ｍＬのＭＡＣＳバッファを添加した。その後、自動磁気細胞分離装置（ａｕｔｏＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）の分離プログラムを利用して、単核球細胞のうち、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３陽性細胞を分離した。
　分離した５×１０６個の単核球細胞を１ｍＬのＴ細胞培地、又は血液幹・前駆細胞培地に懸濁し、１２ウェルプレートに播種し、培養した。培養条件は、ＣＯ２濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。
　１００μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と２５μＬの初期化因子混合液を混合し、第１の混合液とした。また、１１２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）と１２．５μＬのｓｉＲＮＡ導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｃｅ）を混合し、第２の混合液とした。その後、第１の混合液と、第２の混合液と、を混合し、１５分室温で静置してリポフェクション反応液とした。
　得られたリポフェクション反応液のうち６０μＬを単核球細胞を培養している１２ウェルプレートに穏やかに添加し、引き続き、３７℃で１８時間、単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ２濃度が５％、酸素濃度が１９％、及び温度が３７℃であった。リポフェクション反応液を添加した時の単核球細胞の密度は３×１０６であった。１８時間後、単核球細胞を１５ｍＬチューブに回収し、３００ｇで遠心し、上清を除去した。その後、１．２５ｍのＣＤ３４用血球培地を１５ｍＬチューブに添加して、単核球細胞懸濁液を同じ１２ウェルプレートに戻し、一晩３７度で単核球細胞をフィーダーフリーで培養した。培養条件は、ＣＯ２濃度が５％、及び酸素濃度が１９％であった。上記工程を２日に１回、７日間繰り返した。
　リポフェクションを開始してから７日目に、リポフェクションを合計４回した細胞の密度は、３×１０６であった。細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を確認したところ、図２０に示すように、ＧＦＰの発現が確認された。これにより、単核球細胞にｍＲＮＡがトランスフェクションし、トランスフェクトされたｍＲＮＡからタンパク質が合成されていることが確認された。
　（ＴＲＡ－１－６０の発現の確認）
　リポフェクションを開始してから７日目に、細胞の一部を１２ウェルプレートから取り出し、取り出した細胞を初期化され始めた細胞で特異的に発現する表面抗原であるＴＲＡ－１－６０対する抗体であって、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ（登録商標）、ＢＤ）で、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞の割合を確認することによって、細胞においてリプログラミングが開始され、ｉＰＳ細胞遺伝子が発現し、ｉＰＳ細胞ができてくる事を確認した。
　図２１に示すように、自家蛍光の強度をｘ軸に、蛍光標識抗ＴＲＡ－１－６０抗体の蛍光強度をｙ軸にとったドットプロットを作成した。遺伝子を導入しなかったネガティブコントロールでは、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞は検出されなかった。これに対し、実験１，２及び３において、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞が検出された。なお、実験１では、マーカーによる分離をしていない単核球全体から誘導した結果であり、実験２は、ＣＤ３陽性で分離した細胞から誘導した結果であり、実験３は、ＣＤ３４陽性で分離した細胞から誘導した結果である。したがって、初期化因子ＲＮＡのリポフェクションを用いて、血液由来の細胞に初期化因子を導入し、ｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。
 
 
 

Claims (26)

  1. 　体細胞を用意することと、
    　前記体細胞に初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入することと、
    　を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
  2. 　ゲル培地で浮遊培養されている前記体細胞に前記初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  3. 　接着培養されている前記体細胞に前記初期化因子ＲＮＡを含むセンダイウイルスを導入する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  4. 　ゲル培地中で前記体細胞を初期化することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  5. 　前記体細胞が繊維芽細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  6. 　前記体細胞が血液細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  7. 　赤血球分離剤を用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  8. 　フィルターを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  9. 　免疫磁気ビーズを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項６に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  10. 　前記初期化因子ＲＮＡが、Ｍ３Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  11. 　前記ゲル培地が攪拌されない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  12. 　前記ゲル培地が、成長因子を含まない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  13. 　前記ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含む、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  14. 　前記ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項２又は４に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  15. 　体細胞を用意することと、
    　前記体細胞にＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて初期化因子ＲＮＡを導入することと、
    　ゲル培地中で前記体細胞を初期化することと、
    　を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
  16. 　前記体細胞が繊維芽細胞である、請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  17. 　前記体細胞が血液細胞である、請求項１５に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  18. 　赤血球分離剤を用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  19. 　フィルターを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  20. 　免疫磁気ビーズを用いて、前記体細胞として単核球細胞を分離することをさらに含む、請求項１７に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  21. 　前記初期化因子ＲＮＡが、Ｍ３Ｏ又はＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含む、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  22. 　前記ゲル培地が攪拌されない、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  23. 　前記ゲル培地が、成長因子を含まない、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  24. 　前記ゲル培地が、成長因子を４０質量％以下の濃度で含む、請求項１５から２３のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  25. 　前記ゲル培地が、ｂＦＧＦを含まない、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  26. 　前記初期化因子ＲＮＡの導入を複数回行う、請求項１５から２５のいずれか１項に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
     
     
     
     
PCT/JP2018/006588 2017-02-24 2018-02-22 人工多能性幹細胞の作製方法 WO2018155595A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3054118A CA3054118C (en) 2017-02-24 2018-02-22 Production method for artificial pluripotent stem cells
US16/485,148 US20200385687A1 (en) 2017-02-24 2018-02-22 Production method for artificial pluripotent stem cells
EP18757824.0A EP3587559A4 (en) 2017-02-24 2018-02-22 MANUFACTURING METHOD FOR ARTIFICIAL PLURIPOTENT STEM CELLS
CN201880013637.0A CN110352238A (zh) 2017-02-24 2018-02-22 诱导性多能干细胞的制作方法
JP2019501813A JP7146211B2 (ja) 2017-02-24 2018-02-22 人工多能性幹細胞の作製方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762463420P 2017-02-24 2017-02-24
US62/463,420 2017-02-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018155595A1 true WO2018155595A1 (ja) 2018-08-30

Family

ID=63253832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/006588 WO2018155595A1 (ja) 2017-02-24 2018-02-22 人工多能性幹細胞の作製方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200385687A1 (ja)
EP (1) EP3587559A4 (ja)
JP (2) JP7146211B2 (ja)
CN (1) CN110352238A (ja)
CA (1) CA3054118C (ja)
WO (1) WO2018155595A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021149822A1 (ja) * 2020-01-24 2021-07-29
JPWO2021149823A1 (ja) * 2020-01-24 2021-07-29
WO2022244670A1 (ja) * 2021-05-18 2022-11-24 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の製造方法
WO2023054357A1 (ja) * 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012063817A1 (ja) * 2010-11-09 2012-05-18 独立行政法人産業技術総合研究所 末梢血単球由来多能性幹細胞作製方法
WO2017038887A1 (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 アイ・ピース株式会社 多能性幹細胞製造システム

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9365866B2 (en) * 2009-06-03 2016-06-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Vectors for generating pluripotent stem cells and methods of producing pluripotent stem cells using the same
PL2852671T3 (pl) * 2012-05-21 2019-06-28 The Regents Of The University Of California Wytwarzanie ludzkich komórek ips z użyciem syntetycznego samoreplikującego się rna
WO2013177228A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 Loma Linda University Generation of integration/transgene-free stem cells
EP2872636A4 (en) * 2012-07-13 2016-08-17 Minerva Biotechnologies Corp METHOD FOR INDUCING A MINIMUM CELL TREATMENT CONDITION
EP3587556A4 (en) 2017-02-24 2021-04-14 Koji Tanabe CELL TREATMENT DEVICE, SUSPENSION CULTURE VESSEL AND STEM CELL INDUCTION METHOD
US20190352604A1 (en) 2017-02-24 2019-11-21 Koji Tanabe Nerve cell production method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012063817A1 (ja) * 2010-11-09 2012-05-18 独立行政法人産業技術総合研究所 末梢血単球由来多能性幹細胞作製方法
WO2017038887A1 (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 アイ・ピース株式会社 多能性幹細胞製造システム

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAIAZZO, MASSIMILIANO ET AL.: "Defined three- dimensional microenvironments boost induction of pluripotency", NATURE MATERIALS, vol. 15, no. 3, 2016, pages 344 - 352, XP055538383 *
NATURE BIOTECHNOL, vol. 26, no. 3, 2008, pages 313 - 315
NATURE, vol. 448, pages 313 - 317
See also references of EP3587559A4
YOSHIOKA, NAOHISA ET AL.: "Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA", CELL STEM CELL, vol. 13, no. 2, August 2013 (2013-08-01), pages 246 - 254, XP055228244 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021149822A1 (ja) * 2020-01-24 2021-07-29
JPWO2021149823A1 (ja) * 2020-01-24 2021-07-29
WO2021149822A1 (ja) * 2020-01-24 2021-07-29 アイ ピース， インコーポレイテッド 人工多能性幹細胞の作製方法
WO2022244670A1 (ja) * 2021-05-18 2022-11-24 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の製造方法
WO2023054357A1 (ja) * 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法
WO2023053220A1 (ja) * 2021-09-28 2023-04-06 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 多能性幹細胞の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20200385687A1 (en) 2020-12-10
JP2021175401A (ja) 2021-11-04
EP3587559A4 (en) 2020-12-23
JP7146211B2 (ja) 2022-10-04
CA3054118C (en) 2023-08-01
CA3054118A1 (en) 2018-08-30
JPWO2018155595A1 (ja) 2019-12-12
EP3587559A1 (en) 2020-01-01
CN110352238A (zh) 2019-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220119758A1 (en) Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells
JP2021175401A (ja) 人工多能性幹細胞の作製方法
JP2021176315A (ja) 神経系細胞の作製方法
WO2012043651A1 (ja) ミエロイド系血液細胞の製造方法
EP2970913B1 (en) Cells, methods and apparatuses for umbilical cord blood collection and isolation of cells
WO2016010155A1 (ja) 抗原特異的ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法
WO2021149822A1 (ja) 人工多能性幹細胞の作製方法
US20230055044A1 (en) Method for manufacturing induced pluripotent stem cells
JP2020036608A (ja) 多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法
JP6854879B2 (ja) 巨核球と血小板とを分離する方法および巨核球と血小板とを分離するための器具
US20220213446A1 (en) Method for culturing cells into which reprogramming factor is introduced
US20230061798A1 (en) Method for culturing factor-introduced cells
WO2023053994A1 (ja) 幹細胞の製造方法
CN106190970B (zh) 诱导脐带间充质干细胞直接转分化为红母细胞的方法
US20230183653A1 (en) Method for producing stem cells and method for producing somatic cells
WO2022163466A1 (ja) オリゴデンドロサイトの作製方法
KR101077042B1 (ko) 중배엽 줄기세포의 증식을 촉진하기 위한 ｃｄ45+ 세포 또는 ｃｄ45+ 세포 배양액의 용도
WO2020095029A1 (en) Method for producing erythroid cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18757824

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019501813

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3054118

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018757824

Country of ref document: EP

Effective date: 20190924