WO2018101792A2 - 표면적이 향상된 검지 구조체를 이용한 면역분석방법 - Google Patents

표면적이 향상된 검지 구조체를 이용한 면역분석방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an improved immunoassay method, and more particularly, it is possible to control the hook effect by improving the concentration of a reactant or antibody, and the convenience and analysis time are significantly reduced compared to the conventional immunoassay method. It relates to an immunoassay method.
  • a general immunoassay method is performed by sequentially reacting a sample containing a target protein on a substrate on which a receptor or an antibody is immobilized, and then washing the same, and then reacting a detection antibody polymerized with a marker. Due to the complexity, the immunoassay has to be performed by a skilled user in a laboratory and requires more than 4 hours of analysis time (FIG. 1 (A), the conventional ELISA analysis method using a sequential reaction).
  • an immunoassay technique in which a detection antibody polymerized with a marker is reacted with a target protein-containing sample, followed by reaction with a mixture of a receptor or an antibody-fixed substrate.
  • This method is very convenient because immunization analysis can be performed by one injection of sample without complicated analysis process when fixing the receptor or antibody to the substrate in advance, and the analysis time is 8 times shorter than the existing one. (One-step ELISA analysis method using the simultaneous reaction of FIG. 1 (B)).
  • an immunoassay method causes a problem in that, when a large amount of target protein is present, a residual target protein that does not react with a polymerized detection antibody reacts with an antibody immobilized on a substrate. This is called a 'hook effect', and a problem arises in that the concentration cannot be accurately determined due to the target protein without a marker.
  • the concentration of the receptor or antibody participating in the reaction should be higher than the target protein.
  • the present invention can improve the concentration of a reactant or an antibody to compensate for the hook effect, which is a disadvantage of currently known one-step ELISA, and the existing immunoassay technique. It is intended to provide an immunoassay technique with significantly increased contrast convenience and significantly shorter analysis time.
  • the present invention provides a one-step antigen detection immunoassay method comprising the following steps.
  • the present invention is characterized in that the concentration of the receptor or antibody reacted per unit volume relatively increased, so that the amount of capture antibody bound to the surface of the detection structure is equal to or greater than the amount of detection antibody bound per unit volume.
  • the surface area of the structure is modified.
  • the antigen may be any one selected from autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and bacteria.
  • the marker may be any one of a horseradish peroxidase (HRP), a basic alkaline phosphatase, and a fluorescein.
  • HRP horseradish peroxidase
  • a basic alkaline phosphatase basic alkaline phosphatase
  • a fluorescein fluorescein
  • the sample is reacted with the marker ABTS (2,2'-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt) or TMB (3,3 ' , 5,5'-tetramethylbenzidine) may further comprise a substrate solution containing a reagent.
  • the immunoassay method according to the present invention can relatively increase the concentration of the receptor or antibody reacting per unit volume, thereby further improving the sensitivity of the reaction while providing convenience of one-step analysis and significantly shorter analysis time.
  • Figure 1 (A) is a conceptual diagram showing a conventional ELISA analysis method using a sequential reaction, and a one-step ELISA analysis method using the simultaneous reaction of Figure 1 (B).
  • FIG. 2 is a conceptual diagram illustrating a hook effect to be solved by the present invention.
  • Example 3 is a result of comparing the reactivity of Example 1 and Comparative Example 1 (existing ELISA analysis) according to the present invention.
  • Example 4 is a result diagram showing the reactivity of the structure (6 layers) having improved surface area as in Example 2 according to the present invention.
  • Figure 5a is an illustration showing a limited area of the reaction area of the conventional ELISA assay
  • Figure 5b is an increase in the surface area of the reaction in the immunoassay according to the present invention that more capture antibodies can be bound
  • Figure is an illustration of an example.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram showing an improved immunoassay method according to the present invention.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view of the detection structure used in the immunoassay method according to the present invention.
  • FIG. 8A to 8E are perspective views of the detection structure having the various protrusion forms of FIG. 7.
  • Factors that influence reactivity in immunoassay vary, but the most important factor is the concentration of the protein in the sample participating in the reaction and the concentration of the receptor or antibody reacting with the protein.
  • a microtiter plate that responds to an immunoassay is limited to a region containing a sample, and thus a receptor or antibody that participates in the reaction in the volume of the same sample.
  • the concentration is bound to be limited.
  • the inventors of the present invention by adding a characteristic structure to improve the surface area in the analysis vessel containing the sample to participate in the reaction immunoreactivity by involving more receptors or antibodies in the volume of the same sample A method to increase the reactivity of the
  • the inventors of the present invention have derived a method including a method of adding a characteristic structure as well as a method of forming a nanostructure or attaching the formed nanostructure to a surface as a method for improving the surface area.
  • the present invention improves the surface area to relatively increase the concentration of the receptor or antibody participating in the reaction, the sensitivity is improved compared to the conventional ELISA method, and particularly, the hook occurs when the protein is present at a concentration higher than the concentration of the receptor. This has the advantage of controlling the hook effect.
  • the one-step antigen detection immunoassay method comprising the following steps according to the present invention uses a detection structure capable of relatively increasing the concentration of a receptor or antibody reacting per unit volume, and capture antibody bound to the surface of the detection structure.
  • the surface area of the detection structure is modified so that the amount of is equal to or greater than the amount of detection antibody bound per unit volume.
  • the detection structure 10 used in the immunoassay method according to the present invention is formed in a plate shape, the outer surface on the surface Protruding protrusion 11 is formed, the capture antibody 1 may be coupled to the outer surface of the protrusion 11.
  • the detection structure 10 having the projections 11 has an improved surface area compared to the surface of the planar detection structure, a larger amount of capture antibody 1 is bound to the detection structure 10 to participate in the reaction.
  • the protrusions 11 may be formed in various forms on one or both surfaces of the detection structure 10.
  • the protrusion 11 may be formed in a hemisphere shape (see FIG. 8A). At this time, the hemispherical protrusions 11 are arranged in a zigzag shape so that adjacent protrusions 11 are in contact with each other.
  • the protrusion 11 may be formed in a prism form of a triangular prism (see FIG. 8B), or a semi-cylindrical shape (see FIG. 8C).
  • the square side surface of each pillar is coupled to the surface of the detection structure 10, so that the outer surface is angled or rounded.
  • the projection 11 may be formed in the form of a square pyramid (see FIG. 8D), or a truncated cone (see FIG. 8E), whose cross section gradually decreases in a direction perpendicular to the surface of the detection structure 10.
  • a plurality of recessed recesses may be provided on the outer surface of the protrusion 11 (not shown).
  • the concentration of the receptor or antibody participating in the reaction can be relatively increased, thereby improving sensitivity compared to the conventional ELISA method, and especially higher concentration than the concentration of the receptor. It is possible to effectively control the hook effect that occurs when the protein of.
  • the antigen may be any one selected from among autoantibodies, ligands, natural extracts, peptides, proteins, metal ions, synthetic drugs, natural drugs, metabolites, genomes, viruses and bacteria, and the markers are horseradish peroxidase (HRP), It may be any one of basic alkaline phosphatase and fluorescein, and the sample may be reacted with the marker ABTS (2,2'-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid). ] -Diammonium salt) or TMB (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) reagent may further comprise a substrate solution.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Comparative Example 1 ELISA test method (microtiter plate; 96 wells)
  • mice IgG diluted by concentration in 0.5% casein in PBS buffer to which 0.1% Tween 20 is added is dispensed on a microtiter plate. (0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / mL / total 100 ⁇ l per well, 1 hour, 37 °C)
  • Example 1 As a result of comparing the reactivity of Example 1 according to the present invention and the existing ELISA analysis method, as shown in Figure 3, 1 the analysis method according to the present invention showed a 10 times more sensitive reactivity, 2 The analysis time was reduced by 8 times compared to the conventional ELISA method (Example 1-Plex EliCuve: 30 minutes, ELISA: 4 hours), 3 In addition, the hook effect is controlled (0.1 ⁇ 100 ng / mL concentration) Mouse IgG measurements were possible.
  • the immunoassay method according to the present invention in order to comparatively analyze the effect of increasing sensitivity by relatively increasing the concentration of the receptor or antibody reacting per unit volume, as shown in FIG.
  • the immunoassay was carried out in the same manner as in Example 1 by varying the number, and as a result, it showed a more sensitive reactivity in 6 layer conditions having a higher surface area than the 2 layer (based on 0.1 ng / mL concentration). .
  • the present invention can improve the concentration of the reactant or antibody to compensate for the hook effect, which is a disadvantage of currently known one-step ELISA, and is more convenient than conventional immunoassay techniques. It provides an immunoassay technique with significantly increased analysis time and significantly shortened analysis time, and thus industrial applicability is recognized.

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Abstract

본 발명은 반응체 또는 항체의 농도를 향상시켜 후크 효과(hook effect)를 제어할 수 있고, 기존의 면역분석방법 대비 편리성과 분석시간이 현저히 단축된 면역분석방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 면역분석방법은 단위 부피당 반응하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시킬 수 있도록 하여, 원-스텝 분석의 편의성과 현저히 단축된 분석 시간을 제공하면서 반응 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.

Description

표면적이 향상된 검지 구조체를 이용한 면역분석방법
본 발명은 향상된 면역분석방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 반응체 또는 항체의 농도를 향상시켜 후크 효과(hook effect)를 제어할 수 있고, 기존의 면역분석방법 대비 편리성과 분석시간이 현저히 단축된 면역분석방법에 관한 것이다.
일반적인 면역분석방법은 수용체 혹은 항체가 고정되어 있는 기판에 타켓 단백질이 포함된 시료를 순차적으로 반응시키고, 이를 세척한 이후에 표지자가 중합된 탐지항체를 반응시켜 이루어지는 것으로서, 이와 같은 순차적인 반응과정의 복잡성으로 인하여 면역분석은 숙련된 사용자가 연구실 내에서 실시해야 하며, 4시간 이상의 분석시간이 필요하다는 제한점을 지니고 있다(하기 도 1의 (A), 순차반응을 이용한 종래의 ELISA 분석방법).
이를 해결하기 위한 방법으로 타켓 단백질이 포함된 시료에 표지자가 중합된 탐지항체를 먼저 혼합하여 반응시키고, 그 혼합물을 수용체 혹은 항체가 고정된 기판에 반응시키는 면역분석기법이 알려져 있다. 이 방법은 사전에 수용체 혹은 항체를 기판에 고정하는 과정을 진행할 경우, 복잡한 분석과정 없이 한 번의 시료 주입으로 면역분석을 실시할 수 있기 때문에 매우 편리하며, 분석시간이 기존 대비 8 배 가량 단축되는 효과가 있다(하기 도 1의 (B) 동시반응을 이용한 원-스텝 ELISA 분석방법).
하지만, 이와 같은 면역분석기법은 다량의 타켓 단백질이 존재할 경우에 표지자가 중합된 탐지 항체와 반응하지 못한 잔여 타켓 단백질이 기판 고정된 항체와 반응하는 문제가 발생한다. 이를 '후크 효과(hook effect)'라고 부르며, 표지자가 없는 타겟 단백질로 인하여 농도를 정확하게 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 반응에 참여하는 수용체 또는 항체의 농도가 타겟 단백질보다 높게 하여야 한다.
본 발명은 상기와 같이, 현재 알려져 있는 원-스텝(one-step) ELISA의 단점인 후크 효과(hook effect)를 보완하기 위하여, 반응체 또는 항체의 농도를 향상시킬 수 있고, 기존의 면역분석기법 대비 편리성이 현저히 증대되고 분석시간이 현저히 단축된 면역분석기법을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 원-스텝 항원검출 면역분석방법을 제공한다.
(a) 검출 대상 항원과 표지자가 중합된 검출항체(detection-antibody)가 결합된 접합체를 포함하는 시료를 준비하는 단계.
(b) 검출 대상 항원에 결합 가능한 포획 항체(capture-antibody)가 표면에 결합된 검지 구조체를 상기 시료에 침지하는 단계,
(c) 상기 침치된 상태에서 흡광도를 측정하는 단계.
본 발명은 단위 부피당 반응하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시킨 것을 특징으로 하는 것으로서, 상기 검지 구조체의 표면에 결합된 포획 항체의 양이 단위 부피당 결합하는 검출 항체의 양 이상이 되도록, 상기 검지 구조체의 표면적이 개질된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 박테리아 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 표지자는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase) 및 형광물질(fluorescein) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 시료는 상기 표지자와 반응하는 ABTS(2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-다이암모늄염) 또는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 시약을 포함하는 기질 용액을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역분석방법은 단위 부피당 반응하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시킬 수 있도록 하여, 원-스텝 분석의 편의성과 현저히 단축된 분석 시간을 제공하면서 반응 민감도를 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1의 (A)는 순차반응을 이용한 종래의 ELISA 분석방법과, 도 1의 (B) 동시반응을 이용한 원-스텝 ELISA 분석방법를 나타낸 개념도이다.
도 2는 본 발명이 해결하고자 하는 후크 효과(hook effect)를 나타낸 개념도이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1과 비교예 1(기존 ELISA 분석)의 반응성을 비교한 결과 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 2와 같이 표면적을 향상시킨 구조체(6 레이어)의 반응성을 나타낸 결과 도면이다.
도 5a는 종래 ELISA 분석의 반응하는 면적이 한정적인 제한점이 있음을 보여주는 일 예시의 도면이고, 도 5b는 본 발명에 따른 면역분석에서 반응하는 표면적이 증대되어 보다 많은 포획 항체가 결합될 수 있음을 보여주는 일 예시의 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 향상된 면역분석방법을 보여주는 개념도이다.
도 7은 본 발명에 따른 면역분석방법에 사용되는 검지 구조체의 단면도이다.
도 8a 내지 도 8e는 도 7의 다양한 돌기 형태를 구비한 검지 구조체의 사시도이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
면역분석에서 반응성을 좌우하는 요인은 다양하지만 그 중에서도 반응에 참여하는 시료 내 단백질의 농도와 해당 단백질과 반응하는 수용체 혹은 항체의 농도가 가장 중요한 요소이다.
일반적인 ELISA 분석의 경우, 예를 들어 하기 도 5a와 같이, 면역분석에 반응하는 면적(microtiter plate)이 시료를 포함하고 있는 영역으로 한정되어 있어, 동일 시료의 부피에서 반응에 참여하는 수용체 혹은 항체의 농도가 제한적일 수밖에 없다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 예를 들어 하기 도 5b와 같이, 시료를 포함하는 분석 용기에 표면적을 향상시키고자 특징적 구조체를 추가하여 동일 시료의 부피에서 보다 많은 수용체 또는 항체를 반응에 참여시켜 면역분석의 반응성을 증가시키는 방안을 도출하였다.
특히, 본 발명의 발명자들은 표면적을 향상시키기 위한 방안으로 특징적 구조체를 추가하는 방법뿐만 아니라, 표면에 나노 구조체를 형성하거나 형성된 나노 구조체를 부착시키는 방법을 포함하는 방안을 도출하였다.
이에 따라 본 발명은 표면적을 향상시켜 반응에 참여하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시키기 때문에, 기존 ELISA 분석방법 대비 민감도가 향상되며, 특히 수용체의 농도보다 높은 농도의 단백질이 존재할 때 발생하는 후크 효과(hook effect)를 제어할 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 하기 단계를 포함하는 원-스텝 항원검출 면역분석방법은 단위 부피당 반응하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시킬 수 있는 검지 구조체를 이용한 것으로서, 상기 검지 구조체의 표면에 결합된 포획 항체의 양이 단위 부피당 결합하는 검출 항체의 양 이상이 되도록, 상기 검지 구조체의 표면적이 개질된 것을 특징으로 한다.
(a) 검출 대상 항원과 표지자가 중합된 검출항체(detection-antibody)가 결합된 접합체를 포함하는 시료를 준비하는 단계,
(b) 검출 대상 항원에 결합 가능한 포획 항체(capture-antibody)가 표면에 결합된 검지 구조체를 상기 시료에 침지하는 단계,
(c) 상기 침치된 상태에서 흡광도를 측정하는 단계.
본 발명의 구체적인 구현예에 의하면, 하기 도 7 내지 도 8e에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 면역분석방법에 사용되는 검지 구조체(10)는 판(plate) 형상으로 형성되되, 그 표면에 외측으로 돌출된 돌기(11)가 형성되어, 그 돌기(11)의 외면에 포획 항체(1)가 결합될 수 있다. 이때 돌기(11)를 구비한 검지 구조체(10)는 평면형 검지 구조체의 표면에 비해 표면적이 향상되므로, 더 많은 양의 포획 항체(1)가 검지 구조체(10)에 결합되어 반응에 관여한다.
여기서, 돌기(11)는 다수개로, 검지 구조체(10)의 일면 또는 양면에, 다양한 형태로 형성될 수 있다.
예시적으로, 돌기(11)는 반구(hemisphere)형으로 형성될 수 있다(도 8a 참조). 이때, 반구형 돌기(11)는 지그재그 형태로 배열되어 인접하는 돌기(11)끼리 서로 접촉하도록 배치된다. 또한, 돌기(11)는 삼각기둥의 프리즘 형태(도 8b 참조), 또는 반원기둥 형태(도 8c 참조)로 형성될 수 있다. 여기서, 각각의 기둥의 사각형 옆면이 검지 구조체(10)의 표면에 결합되어, 외면이 각지거나, 라운드(round)지게 형성된다. 한편, 돌기(11)는 검지 구조체(10)의 표면에 수직한 방향으로 갈수록 그 횡단면이 점점 작아지는 사각뿔대(도 8d 참조), 또는 원뿔대(도 8e 참조) 형태로 형성될 수도 있다.
또한, 돌기(11)의 외면에는 오목하게 함몰된 홈 형상의 함몰부가 다수 개 구비될 수도 있다(도시되지 않음).
이와 같이 본 발명에 따른 표면적이 향상된 검지 구조체를 이용하는 경우에 반응에 참여하는 수용체 또는 항체의 농도를 상대적으로 증가시킬 수 있기 때문에, 기존 ELISA 분석방법 대비 민감도가 향상되며, 특히 수용체의 농도보다 높은 농도의 단백질이 존재할 때 발생하는 후크 효과(hook effect)를 유효하게 제어할 수 있다.
상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 박테리아 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 표지자는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase) 및 형광물질(fluorescein) 중 어느 하나일 수 있고, 상기 시료는 상기 표지자와 반응하는 ABTS(2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-다이암모늄염) 또는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 시약을 포함하는 기질 용액을 더 포함하는 것일 수 있다.
<실시예>
실시예 1 : Plex EliCuve
1. 10 ㎍/mL 농도로 희석된 Goat anti-mouse IgG in PBS 버퍼를 cuvette에 분주한다. (400 ㎕ per cuvette, 2 시간, 37 ℃)
2. 증류수로 5회 세척 후, 0.5% casein in PBS 버퍼를 cuvette에 분주한다. (500 ㎕ per cuvette, 2 시간, 37 ℃)
3-1. 0.1% Tween 20이 첨가된 0.5% casein PBS 버퍼에 mouse IgG을 농도별로 각각 희석한다. (0, 0.02, 0.2, 2, 20, 200 ng/mL / 전체 200 ㎕)
3-2. 0.1% Tween 20이 첨가된 0.5% casein PBS 버퍼에 Goat anti-mouse IgG-HRP을 1/1250로 희석한다. (전체 200 ㎕)
4. 상기 3-1과 3-2를 혼합하여 cuvette에 분주한다. (400 ㎕ per cuvette, 30분, 상온)
5. 증류수로 5회 세척 후, 효소기질액(50 mM sodium acetate, pH 5.1 : TMB : H2O2 = 1000 : 10 : 1)을 microtiter plate에 분주한다. (500 ㎕ per well, 15분, 상온)
6. 655 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
비교예 1 : ELISA 실험방법 (microtiter plate; 96 well)
1. 10 ㎍/mL Goat anti-mouse IgG in PBS 버퍼를 microtiter plate에 분주한다. (100 ㎕ per cuvette, 2 시간, 37 ℃)
2. 증류수로 5회 세척 후, 0.5% casein in PBS 버퍼를 microtiter plate에 분주한다. (500 ㎕ per cuvette, 2 시간, 37 ℃)
3. 증류수로 5회 세척 후, 0.1% Tween 20이 첨가된 0.5% casein in PBS 버퍼에 농도별로 희석한 mouse IgG를 microtiter plate에 분주한다. (0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng/mL / 전체 100 ㎕ per well, 1시간, 37 ℃)
4. 증류수로 5회 세척 후, 0.1% Tween 20이 첨가된 0.5% casein in PBS 버퍼에에 1/5000로 Goat anti-mouse IgG-HRP를 microtiter plate에 분주한다. (100 ㎕ per well, 1시간, 37 ℃)
5. 증류수로 5회 세척 후, 효소기질액(50 mM sodium acetate, pH 5.1 : TMB : H2O2 = 1000 : 10 : 1)을 microtiter plate에 분주한다. (200 ㎕ per well, 15분, 상온)
6. 반응정지액(2M sulfuric acid)을 microtiter plate에 분주한다. (50 ㎕ per well)
7. 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
상기 본 발명에 따른 실시예 1과 기존의 ELISA 분석방법의 반응성을 비교하여 본 결과, 하기 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 ① 본 발명에 따른 분석방법이 10배 가량 더 민감한 반응성을 보였으며, ② 분석시간은 기존의 ELISA 분석방법 대비 8배 가량 단축되었으며(실시예 1-Plex EliCuve : 30분, ELISA : 4시간), ③ 또한, 후크 효과(hook effect)가 제어되어 0.1 ~ 100 ng/mL 농도 mouse IgG 측정이 가능하였다.
실시예 2
본 발명에 따른 면역분석방법에서, 단위 부피당 반응하는 수용체 혹은 항체의 농도를 상대적으로 증가시켜 민감도가 향상되는 효과를 비교분석하기 위해, 하기 도 4에서 보는 바와 같이 표면적을 향상시키는 보조기구체의 layer의 수를 다르게 하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 면역분석을 실시하였으며, 그 결과 2 layer 대비 더 높은 표면적을 지닌 6 layer 조건에서 좀 더 민감한 반응성을 나타냄을 알 수 있다(0.1 ng/mL 농도 기준).
본 발명은 현재 알려져 있는 원-스텝(one-step) ELISA의 단점인 후크 효과(hook effect)를 보완하기 위하여, 반응체 또는 항체의 농도를 향상시킬 수 있고, 기존의 면역분석기법 대비 편리성이 현저히 증대되고 분석시간이 현저히 단축된 면역분석기법을 제공하는바, 산업상 이용가능성이 인정된다.

Claims (5)

  1. (a) 검출 대상 항원과 표지자가 중합된 검출항체(detection-antibody)가 결합된 접합체를 포함하는 시료를 준비하는 단계;
    (b) 검출 대상 항원에 결합 가능한 포획 항체(capture-antibody)가 표면에 결합된 검지 구조체를 상기 시료에 침지하는 단계; 및
    (c) 상기 침치된 상태에서 흡광도를 측정하는 단계;를 포함하는 항원 검출 면역분석방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 검지 구조체는 판(plate) 형상으로 형성되되, 일면 또는 양면에 외측으로 돌기가 돌출되고,
    상기 돌기의 외면에 상기 포획 항체가 결합되는 것을 특징으로 하는 면역분석방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항원은 자가항체, 리간드, 천연 추출물, 펩타이드, 단백질, 금속 이온, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 박테리아 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역분석방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표지자는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase) 및 형광물질(fluorescein) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역분석방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 상기 표지자와 반응하는 ABTS(2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]-다이암모늄염) 또는 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 시약을 포함하는 기질 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석방법.
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