WO2018097127A1 - 肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞への段階的誘導方法 - Google Patents

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健二 長船
敏 松井
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • This application relates to a method for stepwise induction of biliary epithelial progenitor cells from human hepatoblasts in vitro.
  • the present application relates to a method for inducing differentiation of biliary epithelial progenitor cells into a remodeling / ductal / plate stage via a ductal / plate stage.
  • the present application also relates to a method for producing a cell culture having a three-dimensional structure from remodeling ductal plate stage bile duct epithelial progenitor cells.
  • Bile duct epithelial cell development begins when hepatic blasts derived from the endoderm and foregut exhibit a single layer of epithelial structure.
  • This structure consisting of one layer of biliary epithelial progenitor cells appears from around 8 weeks of gestation (week) (GW) and is called the ductal plate (DP) stage.
  • GW ductal plate
  • This structure subsequently forms a two-layer structure, with the formation of a lumen between them, and the development of a bile duct with a lumen structure proceeds.
  • the time when this lumen appears is called the remodeling ductal plate (RDP) period, which is after GW12.
  • Non-patent Document 1 biliary epithelial progenitor cells begin to express mature markers such as AQP1 and CK7 only at this time.
  • the biliary system develops from the portal vein in an efferent manner, and this bile duct development process is called DPM (Ductal Plate Malformation).
  • This DPM is used as an initial phenotype, and many diseases for which there is still no curative treatment are known.
  • the disease group includes autosomal recessive polycystic kidney disease (Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease or ARPKD), Alagille syndrome, congenital biliary atresia, and the development of new therapies are desired.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Analysis of human fetal samples is technically and ethically difficult, and so far pathological analysis and development of treatment methods for various diseases resulting from abnormalities in the development of the bile ducts It was difficult.
  • Non-patent Document 3 disease models using iPS cells (Non-patent Document 3) developed by Yamanaka et al.
  • the present inventors have established a method for inducing pancreatic blast cells, hepatocytes, pancreatic hormone-producing cells and the like from human iPS cells (Patent Documents 1 to 3).
  • human iPS cells can be differentiated gradually into endoderm, hepatoblast, Ductal Plate (DP), Remodeling Ductal Plate (RDP), and mature bile duct epithelium according to the development process. If possible, it will be a tool for analyzing the disease phenotype according to the time of occurrence.
  • organ-specific marker genes such as albumin of hepatocytes and insulin of pancreatic ⁇ cells are not known, and this is a barrier to developing a stepwise differentiation induction method for bile duct epithelial progenitor cells. It has become.
  • Non-Patent Document 4 conducts three-dimensional culture from hepatoblasts, but what is being evaluated is the final product, which was induced after a period corresponding to the DP and RDP phases. Whether or not is unknown.
  • Dianat et al. also do not discuss bile duct epithelial progenitor cells.
  • Only the report of Sampaziotis et al. (Non-patent Document 7) refers to the identification of Cholangiocyte Progenitors (CPs), but there is no description as to whether the progenitor cells are in the DP or RDP stage.
  • the present application aims to provide a method for stepwise induction of biliary epithelial progenitor cells from hepatoblasts.
  • it provides a method for inducing DuctallatePlate (DP) phase-like biliary epithelial progenitor cells from hepatic blasts, such as iPS cells, followed by Remodeling Ductal Plate (RDP) phase-like biliary epithelial progenitor cells .
  • DP DuctallatePlate
  • RDP Remodeling Ductal Plate
  • the present application also provides a method for constructing a tissue having a three-dimensional lumen-like structure from biliary epithelial progenitor cells. Furthermore, the present application provides identification of biliary epithelial progenitor cells corresponding to the RDP phase and a method for isolating the cells.
  • the present application provides a method for producing biliary epithelial progenitor cells, comprising the steps of providing hepatoblasts and culturing the hepatoblasts in a medium containing TGF ⁇ and EGF.
  • DP phase-like and RDP phase-like biliary epithelial progenitor cells can be induced over time.
  • hepatoblasts may be cells derived from pluripotent stem cells.
  • Various methods for obtaining hepatoblasts from pluripotent stem cells have been reported, and any known method may be used.
  • the present application also includes a step of culturing hepatoblasts or bile duct epithelial progenitor cells in a medium containing HGF, EGF, Notch signal ligand and GSK3 inhibitor in the presence of a three-dimensional scaffold material.
  • a method for constructing a three-dimensional lumen-like tissue is provided.
  • the present application further provides a culture of biliary epithelial progenitor cells obtained by the above method, and a three-dimensional lumen-like tissue of a biliary epithelial progenitor cell having a lumen-like structure.
  • the present application further provides a method for confirming the maturity of biliary epithelial progenitor cells using AQP1 expression as an index and a method for isolating biliary epithelial progenitor cells according to the maturity.
  • the method of the present application is to elucidate the mechanism of differentiation of biliary progenitor cells from the DP phase to the RDP phase, to analyze the pathophysiology of diseases related to DPM, to construct in vitro models of the diseases, and to screen candidate substances for the treatment of the diseases Application to the construction of methods can be expected.
  • the cells induced until Day 18 were divided into GFP (+) which is an AQP1 positive cell and GFP ( ⁇ ) which is an AQP1 negative cell, and the gene expression profile was confirmed by PCR for each.
  • GFP (+) which is an AQP1 positive cell
  • GFP ( ⁇ ) which is an AQP1 negative cell
  • the gene expression profile was confirmed by PCR for each.
  • the gene expression profile of cells obtained from fetal liver at 20 weeks of fetal life was similarly confirmed.
  • the cells induced until Day 18 were divided into GFP (+) which is an AQP1 positive cell and GFP ( ⁇ ) which is an AQP1 negative cell, and the gene expression profile was confirmed by PCR for each.
  • GFP (+) which is an AQP1 positive cell
  • GFP ( ⁇ ) which is an AQP1 negative cell
  • the gene expression profile of cells obtained from fetal liver at 20 weeks of fetal life was similarly confirmed.
  • Day 11 hepatoblasts and Day 14 biliary epithelial progenitor cells were each three-dimensionally cultured for 10 days. In all cases, the construction of a lumen-like structure by cells expressing CK19 was observed.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • derived from the bile duct epithelial progenitor cell of Day 14 is shown. Rhodamine was incorporated in the absence of verapamil. The scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • hepatoblasts are cultured in a medium containing transforming growth factor ⁇ (TGF ⁇ ) and epidermal growth factor (EGF).
  • TGF ⁇ transforming growth factor ⁇
  • EGF epidermal growth factor
  • hepatoblasts are cells having the ability to differentiate into hepatocytes and bile duct epithelial cells.
  • a human hepatoblast is a cell that is positive for at least one marker gene selected from the group consisting of AFP, CK19, Dlk, E-cadherin, Liv2, CD13, and CD133. AFP and CK19 positive cells are preferred.
  • the hepatoblast may be provided as a cell population containing other cell types, or may be a purified population.
  • staining is performed using an antibody against a gene marker such as AFP, CK19, Dlk, E-cadherin, Liv2, CD13 or CD133, and the stained cells are analyzed using a flow cytometer (FACS) or magnetic cells.
  • FACS flow cytometer
  • MCS separation apparatus
  • the medium used for inducing biliary epithelial progenitor cells from the hepatoblasts of the present invention can be prepared by appropriately adding TGF ⁇ and EGF to the basal medium.
  • basal medium examples include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and Lonza's HBM.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium Ham's F12 medium
  • RPMI 1640 medium Fischer's medium
  • Lonza's HBM examples include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and Lonza's HBM.
  • TM Basal Medium HCM TM SingleQuots TM Kit
  • albumin For serum as necessary, for example, albumin, transferrin, KnockOut TM Serum Replacement (KSR) ( serum replacement during ES cell cultures) (ThermoFisher Scientific), N2 supplement (ThermoFisher Scientific), B27 supplement (ThermoFisher Scientific ), One or more serum replacements such as fatty acids, insulin, sodium selenite, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, and the like.
  • KSR KnockOut TM Serum Replacement
  • N2 supplement ThermoFisher Scientific
  • B27 supplement ThermoFisher Scientific
  • serum replacements such as fatty acids, insulin, sodium selenite, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, and the like.
  • the medium also contains lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), non-essential amino acids (NEAA), vitamins (eg, nicotinamide, ascorbic acid), growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid May also contain one or more substances such as buffering agents, inorganic salts, glucagon, hydrocortisone, dexamethasone, and the like.
  • TGF ⁇ any of TGF ⁇ 1, TGF ⁇ 2 and TGF ⁇ 3 may be used, but TGF ⁇ 2 is preferably used.
  • TGF ⁇ 2 When TGF ⁇ 2 is used as TGF ⁇ , the concentration of TGF ⁇ 2 in the medium is 1 to 100 ng / ml, preferably 2 to 50 ng / ml, for example about 10 ng / ml.
  • EGF epidermal growth factor
  • human-derived EGF is preferably used as EGF.
  • concentration of EGF in the medium is 2.5 to 250 ng / ml, preferably 5 to 125 ng / ml, for example about 25 ng / ml.
  • a medium with the following added to HBM TM Hepatocyte Basal Medium is used: 10% 10% KnockOut TM serum replacement (KSR: ThermoFisher Scientific) 10 ng / ml TGF ⁇ 2 (Peprotech) 25 ng / ml EGF (R & D)
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30-40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is preferably about 2-5%.
  • Cultivation is preferably performed while changing the medium daily.
  • hepatoblasts are induced to differentiate into biliary epithelial progenitor cells. Differentiation into biliary epithelial progenitor cells progresses over time from the DP phase to the RDP phase cells.
  • AQP1 is not expressed in hepatic buds or early DP but starts to be expressed from RDP, and AQP1 is a marker of biliary epithelial progenitor cells in RDP phase in differentiation induction I thought it could be a gene.
  • AQP1 is a marker of biliary epithelial progenitor cells in RDP phase in differentiation induction I thought it could be a gene.
  • cells expressing AQP1 in addition to CK19 and SOX9 showed the same gene expression profile as fetal biliary epithelial progenitor cells at around 12 to 20 weeks of embryo. From these results, in differentiation induction from hepatoblasts, cells expressing CK19 and SOX9 but not expressing AQP1 correspond to cells in the DP phase, and cells expressing CK19, SOX9 and AQP1 correspond to cells corresponding to the RDP phase. It can be judged.
  • the present application provides a method for confirming biliary epithelial progenitor cells corresponding to the RDP phase or later and a method for isolating the cells.
  • a method for confirming whether a bile duct epithelial cell is a BDP duct progenitor progenitor cell in the RDP stage or after the RDP stage the expression of the AQP1 gene in the bile duct epithelial progenitor cell can be used as an index.
  • using the expression of the AQP1 gene as an index cells in the RDP phase or later and cells in the DP phase can be separated.
  • the hepatoblast is derived from a mammalian pluripotent stem cell.
  • a pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency capable of differentiating into all cells present in a living body and also has proliferative ability.
  • ES embryonic stem
  • JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev.
  • Biol., 38: 133-165 obtained by nuclear transfer Embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936 ; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502), sperm stem cells ("GS cells”) (M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69: 612-616 ; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012), embryonic germ cells (“EG cells”) (Y.
  • GS cells sperm stem cells
  • pluripotent stem cells derived from cultured fibroblasts and bone marrow stem cells (Muse cells) (WO2011 / 007900). More preferably, the pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells, such as human ES cells and human iPS cells. More preferred are human iPS cells.
  • pluripotent stem cells Even if pluripotent stem cells are produced using known methods, commercially available pluripotent stem cells or pluripotent stem cells stored together with individual information derived from them for research or transplantation medical treatment can be used. It may be used.
  • a project to construct a highly versatile iPS cell bank by using a human having a homologous HLA haplotype as a donor is currently underway in Japan (CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139 (2012))
  • pluripotent stem cells obtained from such an iPS cell bank may be used.
  • the pluripotent stem cell used in the method of the present application can be cultured as a single cell state by substantially separating (or dissociating) by any method, or a cell aggregate state in which cells adhere to each other You may culture by.
  • Examples of the separation method in the case of culturing in a single cell state include mechanical separation and separation solutions having protease activity and collagenase activity (for example, solutions containing trypsin and collagenase Accutase TM and Accumax TM ( innovative Cell Technologies, Inc)) or separation using a separation solution having only collagenase activity.
  • Pluripotent stem cells can be adherently cultured using a coated culture dish.
  • endoderm cells are induced from pluripotent stem cells, and hepatoblasts are induced from endoderm cells.
  • pluripotent stem cells are cultured in a medium containing activin receptor-like kinase-4,7 activator, GSK3 inhibitor and ROCK inhibitor to obtain endoderm cells.
  • the endoderm cells can then be cultured in a medium containing BMP4 and FGF2 to obtain hepatoblasts.
  • the activin receptor-like kinase-4,7 activator is a substance having an activating action on ALK-4 and / or ALK-7, and preferably activin, particularly activin A is used.
  • a GSK3 inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many substances are already known, and may be appropriately selected.
  • An example is CHIR99021.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • An example is Y-27632.
  • the present application also provides a method for obtaining a culture having a bile duct-like three-dimensional lumen-like structure from hepatoblasts.
  • hepatoblasts biliary epithelial progenitor cells corresponding to DP phase or RDP phase derived from hepatoblasts, in the presence of a three-dimensional scaffold material, hepatocyte growth factor (HGF), EGF, Further culturing is carried out in a medium containing Notch signal ligand and GSK3 inhibitor.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the three-dimensional scaffold material various materials for constructing a three-dimensional structure of cultured cells are known and sold, and are not particularly limited.
  • collagen-based materials polymer-based materials such as polycaprolactone and polyglycolic acid, or composites thereof can be used.
  • the form is not particularly limited, and examples thereof include a sponge-like structure.
  • the three-dimensional scaffold material may be a material made of a living body-derived sample (for example, an extracellular matrix or a basement membrane). Specific examples include Matrigel TM (Becton Dickinson), type I collagen gel, type IV collagen gel, and the like.
  • Matrigel TM Basement Membrane Matrix is a soluble basement membrane preparation extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma rich in extracellular matrix proteins, mainly from laminin, collagen IV, entactin, and heparan sulfate proteoglycans Composed. In addition, it contains other growth factors such as TGF- ⁇ , fibroblast growth factor, tissue plasminogen activator, EHS.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • examples of the three-dimensional scaffold material include a gel produced by mixing type I collagen and Matrigel TM .
  • a gel is prepared by mixing 60% type I collagen and 40% Matrigel TM basement membrane matrix growth factor reduced.
  • the cells are encapsulated in a three-dimensional scaffold by mixing hepatoblasts or biliary epithelial progenitor cells into the gel and allowing to stand to solidify the gel.
  • the cells encapsulated in the three-dimensional scaffold are cultured in a medium supplemented with HGF, EGF, Notch signal ligand, and GSK3 inhibitor.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • human-derived HGF and EGF are preferably used.
  • Any known GSK3 inhibitor may be used, and examples thereof include CHIR99021.
  • ligands for the Notch signal include Delta-like signals (Delta like Protein 1, Delta Like Protein 3, Delta Like Protein 4) and Jagged ligands (Jagged-1 and Jagged-2). Jagged-1 is preferably used.
  • the amount of each component added to the medium may be appropriately determined.
  • the concentration of HGF in the medium is 2-200 ng / ml, preferably 4-100 ng / ml, for example about 20 ng / ml.
  • the concentration of EGF in the medium is 5-500 ng / ml, preferably 10-250 ng / ml, for example about 50 ng / ml.
  • JAG1 is used as the Notch signal ligand
  • the concentration of JAG1 in the medium is 5-500 ng / ml, preferably 10-250 ng / ml, for example about 50 ng / ml.
  • CHIR99021 is used as a GSK3 ⁇ inhibitor
  • the concentration in the medium is 0.3-30 ⁇ M, preferably 0.6-15 ⁇ M, for example about 3 ⁇ M.
  • a medium obtained by adding the following to a hepatocyte basic medium HBM TM Hepatocyte Basal Medium, Lonza
  • 10% KnockOut TM serum replacement KSR: ThermoFisher Scientific
  • 20 ng / ml HGF Peprotech
  • 50 ng / ml EGF R & D
  • 50 ng / ml Jagged-1 R & D
  • 3 ⁇ M CHIR99021 StemRD
  • the culture is preferably performed using a culture vessel provided with a culture insert.
  • the cells encapsulated in the three-dimensional scaffold material may be placed on the culture insert, and the culture medium may be placed on the top and bottom of the culture insert and cultured.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 to 5%. is there.
  • Cultivation is preferably performed while changing the medium every two days.
  • the culture period is not particularly limited, but may be 8-15 days, for example, about 10 days regardless of the cell type at the start of the three-dimensional culture.
  • the human iPS cell line was used after being cultured until it became 80% confluent. They were seeded at a density of undifferentiated human iPS cells cultured 7.7 ⁇ 10 4 cells / cm 2 (3.0 ⁇ 10 5 cells /3.9cm 2) (Day0).
  • the obtained cells were fixed by a conventional method, and the expression of SOX17 was examined by immunostaining. Hoechst33342 was used for nuclear staining. The results are shown in FIG. The obtained cells were SOX17 positive, and it was confirmed that iPS cells were induced into endoderm cells.
  • the medium was changed every day and cultured for 6 days (Day 5-11).
  • a part of the obtained cells was fixed by a conventional method, and expression of each marker of CK19 and AFP was examined by immunostaining. Hoechste33342 was used for nuclear staining. The results are shown in FIG.
  • the obtained cells are CK19 positive and AFP positive cells, and are judged to be hepatoblasts.
  • Bile duct epithelial progenitor cells were induced from the hepatoblast culture (Day 11) obtained in (2).
  • a medium for inducing differentiation of bile duct epithelium a medium obtained by adding the following to HBM TM Hepatocyte Basal Medium (Lonza) was used: 10% KnockOut TM serum replacement (KSR; ThermoFisher Scientific) 10 ng / ml TGF ⁇ 2 (Peprotech) 25 ng / ml EGF (R & D)
  • the culture medium was replaced with a new medium every day and cultured for 7 days (Day 11-18). After culturing for 3 days (Day 14), some cells were taken out, fixed by a conventional method, and immunostained for a bile duct epithelial progenitor cell marker. The results are shown in FIG. The obtained cultured cells were negative for APQ1. Since APQ1 is expressed in about 12 to 16 weeks of embryonic life, the cultured cells on Day 14 are presumed to be less than these stages. SOX9, which was found by around 6-8 weeks, was positive in a wide range. From these results, it was confirmed that Day 14 had a gene expression profile similar to that of the biliary epithelial progenitor cells in the Ductal Plate stage of about 8 weeks of gestation.
  • Fig. 5-3 In the obtained cultured cells, many cells in which expression of AQP1 expressed in about 12 to 16 weeks of embryo was observed were confirmed. Day 18 cells were subjected to more detailed immunostaining. The results are shown in Fig. 5-4. The cells of Day 18 were positive for SOX9, CK19, AQP1 and CK7, and were confirmed to be remodeling Ductal Plate stage-like biliary epithelial progenitor cells of about 12 weeks of embryonic life.
  • AQP1-positive cells and AQP1-negative cells were isolated from the cell population obtained on Day 18 in (3) by using a flow cytometer to isolate GFP-positive cells.
  • the expression of a marker gene known to be expressed in biliary epithelial progenitor cells at around 12 to 20 weeks of gestation in each cell population was confirmed by PCR.
  • the expression of each gene was similarly examined by PCR using fetal 20-week liver. For some marker genes, expression in adult liver including bile duct epithelial cells was also examined.
  • genes known as marker genes characteristic of brain, pancreas, large intestine and trachea was examined by PCR.
  • FIGS. 6-1 to 6-3 The results are shown in FIGS. 6-1 to 6-3. It was confirmed that the biliary epithelial progenitor cells obtained by the method of the present application showed the same gene expression profile as biliary epithelial progenitor cells (remodeling ductal plate stage) of about GW12-20. On the other hand, no expression of genes characteristic of other organs was observed (FIG. 6-3).
  • 3D scaffold materials BD Matrigel TM basement membrane matrix growth factors Reduce DOO, 10ml vials (BD three hundred and fifty-four thousand two hundred thirty) Collagen type I, Rat Tail, (ThermoFisher Scientific A1048301) Cell culture insert companion plate (BD falcon 353504) 1.0 ⁇ m PET transparent for culture insert 24 well (FALCON # 353104)
  • a gel was prepared by mixing collagen type I + 40% Matrigel TM . Each cell of Day 11 and Day 14 was separately mixed with the gel so as to be 1.0 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L. 100 ⁇ L of gel was added per well of culture insert and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours to solidify the gel. Thereafter, 200 ⁇ L of the medium was added to the top of the insert, and 500 ⁇ L of the medium was added to the bottom of the insert and cultured for 10 days. The medium was changed every two days.
  • HBM Hepatocyte Basal Medium
  • KSR KnockOut TM serum replacement
  • Peprotech 50 ng / ml EGF
  • R & D 50 ng / ml Jagged-1
  • StemRD CHIR99021
  • Rhodamine 123 Catalog number R8004, Sigma-Aldrich Verapamil: Catalog No. V106-5MG, Sigma-Aldrich
  • Rhodamine 123 is taken up by a transporter called MDR1 / p-glycoprotein expressed in the bile duct epithelium.
  • Verapamil is an MDR1 / p-glycoprotein inhibitor.

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Abstract

肝芽細胞をＴＧＦβおよびＥＧＦを含む培地で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞の製造方法、並びに肝芽細胞または胆管上皮前駆細胞を、HGF、EGF、Notch阻害剤およびGSK３阻害剤を含む培地にて、三次元スキャホールド材の存在下で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞三次元管腔様組織の構築方法を提供する。

Description

肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞への段階的誘導方法
　本願は、インビトロでヒト肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞を段階的に誘導する方法に関する。特に本願は、胆管上皮前駆細胞をductal plate期を経てremodeling ductal plate期へ分化誘導する方法に関する。本願はまた、remodeling ductal plate期の胆管上皮前駆細胞から三次元構造を有する細胞培養物を製造する方法に関する。
　胆管上皮細胞の発生は、内胚葉、前腸から派生する肝芽細胞のうち、門脈周囲間葉に接する細胞が一層の上皮様構造を示すことから開始される。この一層の胆管上皮前駆細胞からなる構造は胎生(gestation week; GW)8週程度から出現し、ductal plate（DP)期と呼ばれる。この構造は続いて二層構造を形成し、その間に管腔が形成されることによって管腔構造を持つ胆管の発生が進む。この管腔が出現する時期をremodeling ductal plate（RDP)期と呼びGW12以降にあたる。胆管上皮前駆細胞は、この時期になってはじめてAQP1、CK7といった成熟マーカーの発現を始めることが知られている(非特許文献1)。門脈周囲から遠心性に発生が進み胆道系が構築されるが、この胆管発生過程の異常はDPM(Ductal Plate Malformation)と呼ばれる。
　このDPMを初期表現型とし、未だ根治的治療法のない多くの疾患が知られている。その疾患群には常染色体劣性多発性嚢胞腎（Autosomal Recessive Polycystic Kidney DiseaseあるいはARPKD)、アラジール（Alagille）症候群、先天性胆道閉鎖症などが含まれ、新たな治療法の開発が望まれている。
　しかしながら、これらのヒト病態を正確に模倣するモデルがないこと、ヒトと齧歯類では胆管上皮細胞における遺伝子発現パターンが異なり(非特許文献2)、齧歯類モデルでは正確なヒト病態の解析はできないこと、およびヒト胎児サンプルを解析することは技術的・倫理的に困難であることから、これまで胆管発生過程の異常に起因する種々の疾患についての発生初期の病態解析や治療法の開発が困難であった。
　近年、京都大学山中らにより開発されたiPS細胞(非特許文献3)を用いた疾患モデル作製が盛んに行われている。本発明者らは、ヒトiPS細胞から膵芽細胞、肝細胞、膵ホルモン産生細胞などを誘導する方法を確立している（特許文献１～３）。胆管上皮前駆細胞についても、ヒトiPS細胞を発生過程に応じて、内胚葉、肝芽、Ductal Plate(DP)、Remodeling Ductal Plate(RDP)、成熟した胆管上皮へと段階的な分化誘導法が確立できれば、発生時期に応じた疾患表現型の解析を行うためのツールとなると考えられる。
　しかしながら、胆管上皮細胞において、肝細胞のアルブミン、膵臓β細胞のインスリンのごとき臓器特異的マーカー遺伝子は知られておらず、段階的な胆管上皮前駆細胞への分化誘導法を開発することの障壁となっている。
　最近になって、胆管上皮細胞への分化誘導法が報告され始めたが、数は極めて少ない。しかも、いずれも胆管上皮前駆細胞を段階的に誘導することについては言及されていない。Ogawaらの報告(非特許文献4)では肝芽細胞から三次元培養を行っているが、評価しているのは最終産物であり、DP期、RDP期に相当する時期を経て誘導されたものか否かは不明である。Assancaoら、Dianatらの報告(非特許文献5および6)でも、胆管上皮前駆細胞に関する検討はない。Sampaziotisらの報告(非特許文献7)においてのみCholangiocyte Progenitors(CPs)の同定に言及しているが、DP、RDPいずれの段階にある前駆細胞であるかについては何ら記載が無い。
国際公開公報WO2015/020113 国際公開公報WO2015/178431 国際公開公報WO2016/104717
Vestentoft et al. BMC Developmental Biology 2011, 11:56. Glaser S et al. World J Gastroenterol. 2006 Jun 14;12(22):3523-36. Takahashi, K et al. Cell 131, 861-872. Ogawa M et al. Nat Biotechnol. 2015 Aug;33(8):853-61. De Assuncao TM et al. Lab Invest. 2015 Jun;95(6):684-96. Dianat N et al. Hepatology. 2014 Aug;60(2):700-14. Sampaziotis F et al. Nat Biotechnol. 2015 Aug;33(8):845-52.
　本願は、肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞を段階的に誘導する方法を提供することを目的とする。特に多能性幹細胞、例えばiPS細胞から肝芽細胞を経てDuctal Plate（DP)期様の胆管上皮前駆細胞、続いてRemodeling Ductal Plate（RDP）期様の胆管上皮前駆細胞を誘導する方法を提供する。
　本願はまた胆管上皮前駆細胞から三次元管腔様構造を有する組織を構築する方法を提供する。さらに本願は、RDP期に相当する胆管上皮前駆細胞の同定並びに当該細胞を単離する方法を提供する。
　本願は肝芽細胞を提供する工程、および
　肝芽細胞をTGFβおよびEGFを含む培地中で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞を製造する方法を提供する。本願の方法によって、経時的にDP期様、RDP期様の胆管上皮前駆細胞を誘導することができる。
　本願において、肝芽細胞は多能性幹細胞から誘導された細胞であってよい。多能性幹細胞から肝芽細胞を得る方法は種々報告されており、公知のいずれの方法を用いても良い。
　本願はまた、三次元スキャホールド材の存在下、肝芽細胞または胆管上皮前駆細胞をHGF、EGF、NotchシグナルリガンドおよびGSK3阻害剤を含有する培地内で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞の三次元管腔様組織の構築方法を提供する。
　本願はさらに、上記方法にて得られる胆管上皮前駆細胞の培養物、並びに管腔様構造を有する胆管上皮前駆細胞三次元管腔様組織を提供する。
　本願はさらに、AQP1の発現を指標として、胆管上皮前駆細胞の成熟度を確認する方法並びに胆管上皮前駆細胞を成熟度に応じて単離する方法を提供する。
　本願の方法によって、肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞へと段階的に誘導することが可能となった。また、胆管上皮前駆細胞の三次元管腔様組織を構築することが可能となった。
　本願の方法は、胆管前駆細胞のDP期からRDP期への分化のメカニズムの解明、DPMに関連する疾患の病態解析、当該疾患のインビトロモデルの構築、当該疾患の治療のための候補物質のスクリーニング方法の構築などへの応用が期待できる。
実施例で用いたAQP1-GFPコンストラクトの概略図である。 本願実施例全体の概略図である。 ヒトiPS細胞から内胚葉を誘導する工程の概略図並びに、誘導された細胞におけるSOX17の発現を示す。Hoechstは細胞の核を染色している。 内胚葉から肝芽細胞を誘導する工程の概略図、並びに誘導された細胞におけるAFP、CK19の発現を示す。Hoechstは細胞の核を染色している。 肝芽細胞からDP期の胆管上皮前駆細胞を経てRDP期の胆管上皮前駆細胞を誘導する工程の概略図である。 Day 14まで誘導された細胞の、SOX9およびAQPIの発現を調べた写真である。SOX9は広範囲に発現したが、AQP1の発現は認められなかった。 Day 18まで誘導された細胞の、SOX9およびAQPIの発現を調べた写真である。AQP1を発現する細胞が多く認められた。 Day18まで誘導された細胞のSOX9、CK19、ALB、AQP1およびCK7の発現を調べた写真である。SOX9、CK19、ALB、AQP1およびCK7の全てについて発現が認められた。 Day18まで誘導された細胞を、AQP1陽性細胞であるGFP（＋）とAQP1陰性細胞であるGFP(-)に分け、それぞれについて遺伝子発現プロファイルをPCRで確認した。コントロールとして胎生20週の胎児肝から得た細胞の遺伝子発現プロファイルを同様に確認した。 Day18まで誘導された細胞を、AQP1陽性細胞であるGFP（＋）とAQP1陰性細胞であるGFP(-)に分け、それぞれについて遺伝子発現プロファイルをPCRで確認した。コントロールとして胎生20週の胎児肝から得た細胞の遺伝子発現プロファイルを同様に確認した。 Day18まで誘導された細胞を、AQP1陽性細胞であるGFP（＋）とAQP1陰性細胞であるGFP(-)に分け、それぞれについて遺伝子発現プロファイルをPCRで確認した。コントロールとして胎生20週の胎児肝から得た細胞の遺伝子発現プロファイルを同様に確認した。 Day11の肝芽細胞およびDay14の胆管上皮前駆細胞をそれぞれ10日間三次元培養した。いずれの場合も、CK19を発現する細胞による管腔様構造の構築が認められた。スケールバーは50μｍを示す。 Day 14の胆管上皮前駆細胞から誘導した三次元管腔様構造を有する細胞培養物のローダミン１２３取り込み試験の結果を示す。ベラパミル非存在下ではローダミンが取り込まれた。スケールバーは50μｍを示す。
　本願の方法においては、肝芽細胞をトランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）および上皮成長因子（EGF）を含有する培地中にて培養する。
　本願において、肝芽細胞とは、肝細胞および胆管上皮細胞へ分化する能力を有する細胞である。ヒト肝芽細胞は、AFP、CK19、Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13およびCD133から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が陽性である細胞である。好ましくは、AFPおよびCK19陽性の細胞である。
　本願の方法において、肝芽細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。肝芽細胞を純化する方法として、AFP、CK19、Dlk、E-cadherin、Liv2、CD13またはCD133などの遺伝子マーカーに対する抗体を用いて染色し、染色された細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）を用いて濃縮する方法が例示される。
　本発明の肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞を誘導する際に用いられる培地は、基礎培地へTGFβおよびEGFを適宜添加して調製することができる。
　基礎培地としては、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Lonza社のHBMTM Basal Medium、HCMTM SingleQuotsTM Kit、HMMTM Basal MediumまたはHMMTM SingleQuotsTM Kit、PromoCell社のHepatocyte Growth MediumまたはHepatocyte Maintenance Medium、もしくはSigma-Aldrich社のHepatocyte Mediumおよびこれらの混合培地などが包含される。これらの基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清の場合は必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOutTM Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（ThermoFisher Scientific）、N2サプリメント（ThermoFisher Scientific）、B27サプリメント（ThermoFisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。培地にはまた、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（ThermoFisher Scientific）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン類（例えば、ニコチンアミド、アスコルビン酸）、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、グルカゴン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、およびこれらの同等物など１つ以上の物質も含有し得る。
　TGFβとしては、TGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3のいずれを用いても良いが、TGFβ2が好適に用いられる。
　TGFβとしては、市販品を用いれば良い。TGFβとしてTGFβ2を用いる場合、TGFβ2の培地中の濃度は１～100ng/ml、好ましくは2～50ng/ml、例えば約10ng/mlである。
　EGF（上皮成長因子）は市販品を用いれば良い。ヒト肝芽細胞を用いる場合には、EGFとしてはヒト由来のEGFが好適に用いられる。EGFの培地中の濃度は2.5～250ng/ml、好ましくは5～125ng/ml、例えば約25ng/mlである。
　ひとつの態様においては、
HBMTMHepatocyte Basal Medium（Lonza）に下記を添加した培地が用いられる：
10% 10% KnockOutTM serum replacement (KSR： ThermoFisher Scientific)
10 ng/ml TGFβ2 (Peprotech)
25 ng/ml EGF (R&D)
　肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞へ誘導する工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。培養は好ましくは毎日培地を交換しながら行う。
　本願の方法において、肝芽細胞は胆管上皮前駆細胞へと分化誘導される。胆管上皮前駆細胞への分化は経時的にDP期からRDP期細胞へと進む。
　本発明者らは、非特許文献１より、AQP1が肝芽や初期のDPでは発現してらず、RDPから発現を始めることに注目し、AQP1が分化誘導においてRDP期の胆管上皮前駆細胞のマーカー遺伝子となりうるのではないかと考えた。本願の方法によって肝芽細胞から胆管上皮前駆細胞へ分化誘導したところ、CK19およびSOX9を発現するが、AQP1を発現しない培養3日目の細胞が胎生8週程度の胎児の胆管上皮前駆細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを示した。また、7日目まで分化誘導を進めたところCK19、SOX9に加えてAQP1を発現する細胞が、胎生12～20週程度の胎児の胆管上皮前駆細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを示した。これらの結果より、肝芽細胞からの分化誘導において、CK19およびSOX９を発現しAQP1を発現しない細胞をDP期に相当する細胞と、CK19、SOX9、AQP1を発現する細胞をRDP期に相当する細胞と判断することができる。
　本願は、RDP期あるいはそれ以降に相当する胆管上皮前駆細胞を確認する方法並びに同細胞を単離する方法を提供する。胆管上皮細胞が、RDP期あるいはRDP期以降の胆管上皮前駆細胞であるかどうかを確認する方法としては、胆管上皮前駆細胞のAQP1遺伝子の発現を指標とすることができる。例えば、ヒト組織や培養細胞を免疫染色することによって、胆管上皮細胞がDP期にあるのかRDP期またはそれ以降にあるのかの確認することができる。また、AQP1遺伝子の発現を指標として、RDP期またはそれ以降にある細胞と、DP期にある細胞を分離することができる。
　本願の方法の一態様において、肝芽細胞は哺乳動物の多能性幹細胞から誘導されたものである。多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、例えばヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞である。更に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
　多能性幹細胞は、公知の方法を用いて製造したものを用いても、市販の多能性幹細胞や、研究あるいは移植医療のためにその由来する個体の情報と共に保存された多能性幹細胞を用いてもよい。頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するヒトをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中であり（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）、例えばかかるｉＰＳ細胞バンクから取得された多能性幹細胞を用いてもよい。
　本願の方法において用いられる多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養しても、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。単一細胞の状態に分離して培養する場合の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液AccutaseTMおよびAccumaxTM（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。
　多能性幹細胞から肝芽細胞を誘導する方法は公知であり、例えば国際公開公報WO2001/081549、国際公開公報WO2016/104717、Takayama K, et al, Stem Cell Reports. 1:322-335, 2013.、Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 12538-12543, 2012およびHay DC, et al, Stem Cells. 26: 894-902, 2008などに開示されている。
　肝芽細胞を誘導するには、まず、多能性幹細胞から内胚葉細胞を誘導し、内胚葉細胞から肝芽細胞を誘導する。一つの態様として、多能性幹細胞をアクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤、GSK3阻害剤およびROCK阻害剤を含有する培地中で培養して内胚葉細胞を得る。次いで内胚葉細胞をBMP4およびFGF２を含有する培地中で培養して肝芽細胞を得ることができる。
　アクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤とは、ＡＬＫ－４および／又はＡＬＫ－７に対し活性化作用を有する物質であり、好ましくは、アクチビン、特にアクチビンAが用いられる。GSK3阻害剤とは、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られており、適宜選択すればよい。例えばCHIR99021が挙げられる。ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されない。例えば、Y-27632が挙げられる。
　本願はまた、肝芽細胞から胆管様三次元管腔様構造を有する培養物を得る方法を提供する。本方法においては、肝芽細胞、肝芽細胞から誘導されたDP期またはRDP期に相当する胆管上皮前駆細胞を、三次元スキャホールド材の存在下で、肝細胞増殖因子（HGF）、EGF、NotchシグナルリガンドおよびGSK3阻害剤を含む培地中でさらに培養する。
　三次元スキャホールド材としては、培養細胞の三次元立体構造構築用のものが種々知られており、また販売されており、特に限定されない。例えばコラーゲンベースの材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の材料、又はそれらの複合体を使用することができる。また、その形態についても特に限定されないが、例えばスポンジ状構造物などが挙げられる。また、三次元スキャホールド材は、生体由来の試料を材料（例えば細胞外マトリックスや基底膜など）とするものであってもよい。具体的には、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン社）、typeIコラーゲンゲル、typeIＶコラーゲンゲルなどを挙げることができる。
　マトリゲルTM基底膜マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主にラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成される。さらに、TGF-β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、EHSなどの他の増殖因子を含む。
　本態様において、三次元スキャホールド材としては例えば、I型コラーゲンとマトリゲルTMとを混合して生成されるゲルが例示される。具体的には、６０％I型コラーゲンと４０％マトリゲルTM基底膜マトリックス グロースファクターリデューストとを混合してゲルを調製する。ゲルへ肝芽細胞または胆管上皮前駆細胞を混合し、静置してゲルを固形化させることによって、三次元スキャホールドに細胞を封入する。
　三次元スキャホールド材に封入した細胞を、HGF、EGF、Notchシグナルリガンド、およびGSK3阻害剤を添加した培地にて培養する。
　HGF（肝細胞増殖因子）およびEGF（上皮成長因子）は市販品を用いれば良い。ヒト肝芽細胞を出発物質として用いる場合には、ヒト由来のHGFおよびEGFが好適に用いられる。
　GSK3阻害剤としては、公知のもの、いずれを用いてもよく、例えばCHIR99021が例示される。
　Notchシグナルのリガンドとしては、Delta様シグナル(Delta like Protein 1、Delta Like Protein 3, Delta Like Protein 4) 及びJaggedリガンド（Jagged-1 and Jagged-2）が例示される。Jagged-１が好適に用いられる。
　各成分の培地への添加量は適宜定めれば良い。HGFの培地中の濃度は2-200 ng/ml、好ましくは4～100 ng/ml、例えば約20ng/mlである。EGFの培地中の濃度は5-500 ng/ml、好ましくは10-250 ng/ml、例えば約50ng/mlである。NotchシグナルリガンドとしてJAG1を用いる場合、JAG1の培地中の濃度は5-500 ng/ml、好ましくは10-250 ng/ml、例えば約50ng/mlである。GSK3β阻害剤としてCHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は0.3-30μM、好ましくは0.6-15μM、例えば約3μMである。
　ひとつの態様としては、肝細胞基礎培地HBMTM （Hepatocyte Basal Medium、Lonza）に下記を添加した培地が用いられる：
10% KnockOutTM serum replacement (KSR： ThermoFisher Scientific)
20 ng/ml　HGF (Peprotech)
50 ng/ml　EGF (R&D)
50 ng/ml　Jagged-1(R&D)
3μM　CHIR99021 （StemRD)
　培養は、カルチャーインサートを設置した培養容器を用いて行うことが好ましい。カルチャーインサート上に三次元スキャホールド材に封入した細胞を乗せ、カルチャーインサートの上下に培地を投入して培養すればよい。
　培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　培養は好ましくは２日毎に培地を交換しながら行う。培養期間は特に限定的ではないが、三次元培養の開始時の細胞種にかかわらず８－１５日、例えば約１０日間行えばよい。
　本発明の方法により、肝芽細胞からDP期様の胆管上皮前駆細胞、RDP期様の胆管上皮前駆細胞を段階的に誘導することが可能となる。
ヒトiPS細胞の樹立
　ヒトiPS細胞株23C27の樹立
　ヒトAQP1の塩基配列が挿入されている大腸菌 (Bacterial Artificial Chromosome：Children's Hospital Oakland Research Instituteより入手)にGFP-PGK-Neoの塩基配列を挿入し、AQP1-GFPコンストラクトを作製した。コンストラクトの概略図を図１に示す。
　AQP1-GFPコンストラクトをヒトiPS細胞585A1（京都大学iPS細胞研究所にて樹立）にエレクトロポレーションにより導入し、AQP1-GFPトランスジェニックヒトiPS細胞株 23C27を樹立した。このiPS細胞株から胆管上皮前駆細胞を誘導した。実施例の概略を図２に示す。
（１）ヒトiPS細胞から内胚葉への分化誘導
　ヒトiPS細胞株は80% コンフルエントとなるまで培養して用いた。培養された未分化ヒトiPS細胞を7.7×104細胞/cm2(3.0×105細胞/3.9cm2)の密度で播種した（Day０）。
　使用培地：
RPMI1640 (Nacalai Tesque) に下記添加：
1× B27 サプリメント (ThermoFisher Scientific)
1× ペニシリン/ストレプトマイシン (ThermoFisher Scientific)
100 ng/mL アクチビンA (R&D)
1-3 μM CHIR99021 (Day0: 3 μM, Day1-3: 1μM, Day3-5: 0 μM)(StemRD)
10 μM Y27632 (Day0: 10 μM, Day1-5: 0 μM)(Wako)
　培養は5日間行い、毎日新たに作製した培地と交換した。CHIR99021の濃度はDay 1およびDay 2は１μM、Day3およびDay4では0μMとした。またY27832の濃度はDay1以降は0μMとした。得られた細胞を常法により固定化し、免疫染色によりSOX１７の発現を調べた。核染色のため、Hoechst33342を用いた。結果を図３に示す。得られた細胞はSOX17陽性であり、iPS細胞より内胚葉細胞へと誘導されたことが確認された。
（２）内胚葉細胞から肝芽細胞への分化誘導
　（１）で得た内胚葉細胞培養物（Day5）において、培地を下記に示す肝芽細胞誘導用培地へと交換した。肝芽細胞誘導用培地として、KnockOutTM DMEM (KODMEM; ThermoFisher Scientific) に下記を添加した培地を使用した：
10% KnockOutTM serum replacement (KSR： ThermoFisher Scientific)
1 mM L-グルタミン(ThermoFisher Scientific)
1% (vol/vol) 非必須アミノ酸(ThermoFisher Scientific)
1× ペニシリン／ストレプトマイシン
0.1 mM 2-メルカプトエタノール (ThermoFisher Scientific)
1% (vol/vol) DMSO (Sigma)
20 ng/ml BMP4 (Peprotech)
10 ng/ml FGF2 (Wako)
　培地交換は毎日行い、6日間(Day5-11)培養を行った。得られた細胞の一部を常法により固定化し、免疫染色によりCK19およびAFPそれぞれのマーカーの発現を調べた。また核染色のため、Hoechste33342を用いた。結果を図４に示す。得られた細胞はCK19陽性およびAFP陽性細胞であり、肝芽細胞であると判断される。
（３）胆管上皮前駆細胞への分化誘導
（２）において得られた肝芽細胞培養物（Day11）から胆管上皮前駆細胞を誘導した。胆管上皮分化誘導用培地としては、HBMTM Hepatocyte Basal Medium (Lonza) に下記を添加した培地を用いた：
10% KnockOutTM serum replacement (KSR; ThermoFisher Scientific)
10 ng/ml TGFβ2 (Peprotech)
25 ng/ml EGF (R&D)
　毎日新たな培地へ交換し、7日間 (Day11-18)の培養を行った。
　３日間培養後（Day14）に一部の細胞を取り出し、常法により固定化し、胆管上皮前駆細胞マーカーについての免疫染色を行った。結果を図５－２に示す。得られた培養細胞はAPQ1が陰性であった。APQ1は胎生１２～１６週程度で発現することから、Day14の培養細胞はこれらの期に満たないものであると推察される。また、胎生６～８週程度までに認められるSOX9は広範囲に陽性であった。これらの結果より、Day14においては胎生８週程度のDuctal Plate期の胆管上皮前駆細胞と類似の遺伝子発現プロファイルを有していることが確認された。
　引き続き同条件下で培養し、7日間培養後（Day 18)の培養物について同様にして免疫染色を行った。結果を図５－３に示す。得られた培養細胞は、胎生１２～１６週程度で発現するAQP1の発現が認められる細胞が多く確認された。
　Day18の細胞をさらに詳細な免疫染色に供した。結果を図５－４に示す。Day18の細胞はSOX9、CK19、AQP1およびCK7が陽性であり、胎生１２週程度のRemodeling Ductal Plate期様の胆管上皮前駆細胞であることが確認された。
（４）胆管上皮前駆細胞の確認
　（３）においてDay18に得られた細胞集団からフローサイトメーターを用いてGFP陽性細胞を単離することによってAQP1陽性細胞とAQP1陰性細胞をそれぞれ単離した。胎生12～20週程度の胆管上皮前駆細胞に発現することが知られているマーカー遺伝子の各細胞集団への発現について、PCRで確認した。コントロールとして、胎生20週の肝を用いて同様に各遺伝子の発現をPCRにて調べた。また一部のマーカー遺伝子については胆管上皮細胞を含む成人肝での発現についても同時に調べた。
　さらに脳、膵臓、大腸および気管に特徴的なマーカー遺伝子として知られている遺伝子についても、その発現をPCRにて調べた。結果を図６－１から図６－３に示す。
　本願の方法にて得られた胆管上皮前駆細胞は、GW12～20程度の胆管上皮前駆細胞（remodeling ductal plate期）と同様の遺伝子発現プロファイルを示すことが確認された。一方で、他の臓器に特徴的な遺伝子についてはいずれも発現が認められなかった(図６－３）。
（５）肝芽細胞および胆管上皮前駆細胞から管腔様三次元構造の構築
　（２）で得られた肝芽細胞（Day11）、(３)で得られた胆管上皮前駆細胞 (Day14)を用いて、三次元培養を行った。
　三次元スキャホールドの材料：
　BDマトリゲルTM基底膜マトリックスグロースファクターリデュースト、10mlバイアル(BD 354230)
　コラーゲンタイプI, Rat Tail, (ThermoFisher Scientific A1048301)
　セルカルチャーインサートコンパニオンプレート(BD falcon 353504)
　カルチャーインサート24 well用 1.0μm PET 透明 (FALCON #353104)
　コラーゲンタイプI+40%マトリゲルTMを混合してゲルを作製した。Day11およびDay14の各細胞を1.0×106細胞／100μLとなるよう別個にゲルと混合した。カルチャーインサート1ウエルあたりに100μLのゲルを投入して2時間、37℃で静置し、ゲルを固形化させた。その後、インサートの上部に200 μLの培地を、インサート下に500μLの培地を投入して10日間培養した。2日おきに培地交換を行った。
　培地としてはHBMTM Hepatocyte Basal Medium (Lonza)に下記を添加したものを用いた：
10% KnockOutTM serum replacement (KSR; ThermoFisher Scientific)
20 ng/ml HGF (Peprotech)
50 ng/ml EGF (R&D)
50 ng/ml Jagged-1(R&D)
 3 μM CHIR99021 (StemRD)
　10日間培養後、細胞を封入して培養した三次元スキャホールド材を取り出し、パラホルムアルデヒド(PFA)により固定して得た切片を免疫染色してCK19の発現を調べた。核染色のため、Hoechst33342を用いた。結果を図7-1に示す。Day11およびDay14のいずれの細胞を三次元培養に供した場合であっても、得られた培養物は胆管様の三次元管腔様構造を有していることを確認した。また、胆管上皮細胞誘導のDay18の細胞を同様にして三次元培養を行った場合も、同様に三次元管腔様構造の構築が達成された。
　得られた三次元管腔様構造を有する培養物の機能を調べるため、ローダミン123の取り込み試験を行った。
使用試薬：
ローダミン123：カタログ番号R8004、Sigma-Aldrich
ベラパミル：カタログ番号V106-5MG、Sigma-Aldrich
　三次元管腔様構造を有する培養物をローダミン123の100μL溶液中、20μMベラパミルの存在、非存在下で10分間培養した。ローダミン123の取り込みを蛍光顕微鏡にて観察した。結果を図７－２に示す。
　ローダミン123は胆管上皮に発現するMDR1/p-glycoproteinとよばれるトランスポーターにより取り込まれる。べラパミルはMDR1/p-glycoproteinの阻害剤である。三次元管腔様構造を有する培養物がローダミン123を取り込むこと、およびベラパミルの存在下ではこのローダミンの細胞内への取り込みが顕著に抑えられることが確認された。この結果より、得られた三次元管腔様構造を有する培養物は、胆管としての生理機能を有していることが確認された。

Claims (14)

  1. 　肝芽細胞を提供する工程、および
    　肝芽細胞をＴＧＦβおよびＥＧＦを含む培地で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞の製造方法。
  2. 　ＴＧＦβがＴＧＦβ２である、請求項１記載の方法。
  3. 　誘導される胆管上皮前駆細胞が、CK19およびSOX9陽性、AQP1陰性の細胞である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　誘導される胆管上皮前駆細胞が、ductal plate期様胆管上皮前駆細胞である、請求項１～３いずれかに記載の方法。
  5. 　誘導される胆管上皮前駆細胞が、CK19、SOX9およびAQP1がいずれも陽性の細胞である、請求項１または２記載の方法。
  6. 　誘導される胆管上皮前駆細胞が、remodeling ductal plate期様胆管上皮前駆細胞である、請求項１、２または５記載の方法。
  7. 　さらに多能性幹細胞から肝芽細胞を誘導する工程を含む、請求項１～６いずれかに記載の方法。
  8. 　多能性幹細胞がヒト由来の細胞である、請求項７記載の方法。
  9. 　多能性幹細胞が、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞である請求項８記載の方法。
  10. 　請求項１～９いずれかの方法により得られた、胆管上皮前駆細胞培養物。
  11. 　胆管上皮前駆細胞がductal plate期様胆管上皮前駆細胞である、請求項１０記載の培養物。
  12. 胆管上皮前駆細胞がremodeling ductal plate期様胆管上皮前駆細胞である、請求項１０記載の培養物。
  13. 　肝芽細胞または、胆管上皮前駆細胞を提供する工程、および
    　肝芽細胞または胆管上皮前駆細胞を、HGF、EGF、Notch阻害剤およびGSK３阻害剤を含む培地にて、三次元スキャホールド材の存在下で培養する工程を含む、胆管上皮前駆細胞三次元管腔様組織の構築方法。
  14. 　肝芽細胞または、胆管上皮前駆細胞を提供する工程、および
    　肝芽細胞または胆管上皮前駆細胞を、HGF、EGF、Notch阻害剤およびGSK３阻害剤を含む培地にて、三次元スキャホールド材の存在下で培養する工程を含む方法により得られた、胆管上皮前駆細胞三次元管腔様組織。
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