WO2018084311A1 - 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2018084311A1
WO2018084311A1 PCT/JP2017/040115 JP2017040115W WO2018084311A1 WO 2018084311 A1 WO2018084311 A1 WO 2018084311A1 JP 2017040115 W JP2017040115 W JP 2017040115W WO 2018084311 A1 WO2018084311 A1 WO 2018084311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
sequence
seq
oligopeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/040115
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宗尚 島村
啓徳 中神
裕香 池田
森下　竜一
弘 郡山
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to JP2018549113A priority Critical patent/JP6710416B2/ja
Priority to US16/345,028 priority patent/US11819537B2/en
Priority to EP17867950.2A priority patent/EP3536382A4/en
Publication of WO2018084311A1 publication Critical patent/WO2018084311A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for inflammatory skin diseases.
  • Psoriasis is an inflammatory skin disease that typically involves a red rash, scales and the like.
  • TLR Toll-like receptor
  • TNF- ⁇ , IL-6, IL-12 / 23p40, etc. various inflammatory cytokines
  • infliximab and adalimumab are known as TNF- ⁇ inhibitors that control the expression of inflammatory cytokines
  • ustekinumab is known as a human anti-human IL-12 / 23p40 monoclonal antibody preparation.
  • a fundamental cure for psoriasis has not yet been developed.
  • Patent Document 1 reports only suppression of inflammatory cytokines via the TLR2 pathway and the TLR4 pathway.
  • Patent Document 2 discloses that RANKL protein can be effective for contact allergic dermatitis. However, in Patent Document 2, the entire length of the RANKL protein is used as an active ingredient. From the viewpoints of stability and economy, it is desirable to use a shorter oligopeptide as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a preventive or therapeutic agent for inflammatory skin diseases such as psoriasis, which comprises an oligopeptide as an active ingredient.
  • a RANKL protein DE loop sequence and an amino acid comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence It has been found that an oligopeptide comprising a sequence has a preventive and therapeutic effect on inflammatory skin diseases such as psoriasis. As a result of further research based on this finding, the present invention was completed.
  • the present invention includes the following embodiments: Item 1. A RANKL protein DE loop sequence, and an amino acid sequence comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence,
  • the DE loop sequence is the following (a) or (b): Contains (a) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or (b) an oligopeptide that is an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a preventive or therapeutic agent for inflammatory skin diseases Item 2.
  • the ⁇ -strand D sequence is the following (c) or (d): (C) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 or (d) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 Or the preventive or therapeutic agent according to Item 1, which is an inserted amino acid sequence.
  • Item 3. Item 3.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to Item 2, wherein the DE loop sequence is the amino acid sequence of (a).
  • the ⁇ -strand E sequence is the following (e) or (f): (E) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9 or (f) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9 Item 6.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to Item 5 which is an inserted amino acid sequence.
  • Item 7. Item 7.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide is the following (i) or (j): (I) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 12 to 20, or (j) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 12 to 20 Or the preventive or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 7, which is an inserted amino acid sequence.
  • Item 9 The amino acid sequence of the oligopeptide is the following (i ′) or (j ′): (I ′) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 15 or 16, or (j ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 15 or 16.
  • Item 10 Item 10. The prophylactic or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 9, wherein the oligopeptide has a length of 40 amino acid residues or less. Item 11. Item 11. The prophylactic or therapeutic agent according to Item 10, wherein the oligopeptide has a length of 30 amino acid residues or less. Item 12. Item 12. The item 1 to 11, wherein the inflammatory skin disease is at least one selected from the group consisting of psoriasis, atopic dermatitis, arthritis, lichen planus, palmoplantar pustulosis, and blistering disease. Preventive or therapeutic agent. Item 13. Item 13.
  • the preventive or therapeutic agent according to any one of Items 1 to 12, wherein the inflammatory skin disease is at least one selected from the group consisting of psoriasis and atopic dermatitis.
  • Item 14 A RANKL protein DE loop sequence, and an amino acid sequence comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence,
  • the DE loop sequence is the following (a) or (b): (A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an oligopeptide which is an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 15 A RANKL protein DE loop sequence, and an amino acid sequence comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence,
  • the DE loop sequence is the following (a) or (b): (A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an oligopeptide which is an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 16 An external preparation for prevention or treatment of inflammatory skin diseases.
  • the DE loop sequence is the following (a) or (b): (A) administering an oligopeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (b) an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a RANKL protein DE loop sequence for use as a preventive or therapeutic agent for inflammatory skin diseases, A RANKL protein DE loop sequence, and an amino acid sequence comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence,
  • the DE loop sequence is the following (a) or (b): (A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an oligopeptide having an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a RANKL protein DE loop sequence, and an amino acid sequence comprising a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence is the following (a) or (b): (A) Use of an oligopeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or (b) an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. .
  • a prophylactic or therapeutic agent for inflammatory skin diseases such as psoriasis, comprising an oligopeptide as an active ingredient can be provided.
  • RANKL protein activates osteoclasts
  • the oligopeptide used in the present invention (hereinafter sometimes referred to as “RANKL peptide”) has such properties even though it is derived from RANKL protein. Rather, the activation of osteoclasts by RANKL protein can be suppressed. For this reason, if this oligopeptide is used, it is possible to prevent or treat inflammatory skin diseases while further reducing osteoclast activation.
  • the oligopeptide used in the present invention is excellent in stability and can maintain higher activity even after long-term storage.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention contains an oligopeptide as an active ingredient, it can be provided at a lower cost than existing therapeutic agents containing an antibody as an active ingredient (for example, infliximab, adalimumab, ustekinumab, etc.). It is. For this reason, this invention can also contribute to medical expenses suppression. Inflammatory skin diseases such as psoriasis have been on the rise in recent years, and medical cost control is an important issue.
  • the administration schedule in the analysis (Example 1) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the photograph of the back after administration in analysis 1 (Example 1) of the prevention and treatment effect to inflammatory skin disease is shown.
  • IMQ means imiquimod is psoriasis symptoms inducing agent
  • dH 2 O represents a control group (MHP1 non-administration group)
  • MHP1 indicates MHP1 administered group
  • the results of quantifying the degree of white scale on the back in the analysis of the preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases (Example 1) are shown.
  • the vertical axis shows the numerical value of the degree of white scale (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since IMQ means imiquimod, which is a psoriasis symptom-inducing agent, Control indicates that neither imiquimod nor MHP1 is administered, dH2O indicates a control group (MHP1 non-administered group), and MHP1 indicates an MHP1 administered group.
  • edge in the analysis (Example 1) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the right ear is the imiquimod administration group
  • the left ear is the imiquimod non-administration group.
  • Day -1 is the day before the first administration of imiquimod
  • the others indicate the number of days that have elapsed since the first administration of imiquimod.
  • the vertical axis represents the relative value obtained by setting the ear thickness measured as 100% to the ear thickness of Day 100-1.
  • Control represents a group not administered with MHP1
  • MHP1 represents a group administered with MHP1.
  • Example 2 The result which investigated the influence which a RANKL peptide has with respect to the quantity of the inflammatory cytokine (IL-6 or TNF (alpha)) secreted from a microglial cell by Imidazoquinoline-Resiquimod (R848) which is a ligand of TLR7 / 8 is shown. ).
  • the vertical axis represents the IL-6 or TNF ⁇ concentration in the medium, measured by ELISA.
  • the concentration of MHP1 in the medium in FIGS. 5a and 5b is 30.5 ⁇ M
  • the numerical value on the horizontal axis in FIG. 5c indicates the concentration of MHP4 in the medium
  • Control does not add either R848 or RANKL peptide to the medium Show the case.
  • the vertical axis represents a value obtained by dividing the mRNA expression level to be measured by the GAPDH mRNA expression level.
  • the vertical axis represents the absorbance measured by TransAMpNFkB p65 kit (representing the amount of p65 in the nucleoprotein bound to DNA having the NF ⁇ B binding sequence).
  • the result of having investigated the influence with respect to the osteoclast of a RANKL peptide is shown (Example 6).
  • (A) shows TRAP stained images of Group A, B, and D groups
  • (b) shows TRAP stained images (upper) and nuclear stained images (lower) of Group C.
  • the result of having investigated the stability of RANKL peptide is shown (Example 7).
  • the vertical axis indicates the concentration of IL-6 or TNF- ⁇ in the medium, measured by ELISA. ** indicates that the P value for control was less than 0.01.
  • the photograph of the back of day 1 in the analysis 2 (Example 8) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the result of quantifying the degree of redness in the analysis 2 (Example 8) of the preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases is shown.
  • the vertical axis shows the numerical value indicating the degree of redness (evaluation criteria: nonemil (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis is from the first dose of imiquimod Indicates the number of days elapsed.
  • the result of having quantified the degree of the white scale in the analysis 2 (Example 8) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the vertical axis shows the numerical value of the degree of white scale (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since The results of quantifying the degree of skin thickening in Analysis 2 (Example 8) of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases are shown.
  • the vertical axis shows the value of the degree of skin thickening (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since The measurement result of the thickness of the ear in the analysis 3 (Example 9) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the vertical axis represents the difference between the measured ear thickness and the ear thickness before mite antigen administration.
  • the results of quantifying the degree of skin thickening in the analysis 4 (Example 10) of the preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases are shown.
  • the vertical axis shows the value of the degree of skin thickening (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since The results of quantifying the degree of redness in analysis 5 (Example 11) of the preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases are shown.
  • the vertical axis shows the numerical value indicating the degree of redness (evaluation criteria: nonemil (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis is from the first dose of imiquimod Indicates the number of days elapsed.
  • the result of having digitized the grade of the white scale in the analysis 5 (Example 11) of the prevention and treatment effect with respect to an inflammatory skin disease is shown.
  • the vertical axis shows the numerical value of the degree of white scale (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since
  • the results of quantifying the degree of skin thickening in Analysis 5 (Example 11) of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases are shown.
  • the vertical axis shows the value of the degree of skin thickening (evaluation criteria: none (0), mild (1), moderate (2), severe (3), very severe (4)), and the horizontal axis shows the first dose of imiquimod Indicates the number of days since
  • amino acid sequence identity refers to the degree of amino acid sequence match between two or more comparable amino acid sequences. Therefore, the higher the identity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters.
  • FASTA a sequence analysis tool
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes” Proc Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2ul (Sci.A. It can be determined using “Applications and statistics” for multiple, high-scoring, segments, in, molecular, sequences.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution.
  • amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan
  • Amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine
  • Aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine
  • substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.
  • Oligopeptide is an oligopeptide consisting of an amino acid sequence comprising a RANKL protein DE loop sequence and a RANKL protein ⁇ -strand D sequence arranged adjacent to the N-terminal side of the DE loop sequence. May be referred to as “oligopeptides”).
  • Examples of the DE loop sequence of the RANKL protein include the following amino acid sequences (a) or (b): (A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (b) an amino acid sequence in which one amino acid is substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ -strand D sequence of the RANKL protein is not particularly limited as long as it is an amino acid sequence that forms ⁇ -strand D in the amino acid sequence of the RANKL protein.
  • the biological species from which the ⁇ -strand D sequence is derived is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits. Among these, human, monkey, mouse, rat and the like are preferable, human, mouse and the like are more preferable, and human is more preferable.
  • the ⁇ -strand D sequence of each species is known, and for example, described in Non-Patent Documents 1 and 2 for mice and rats.
  • the sequence can be easily determined based on known information (for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the ⁇ -strand D sequence of RANKL protein for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (part of the ⁇ -strand D sequence of mouse-derived RANKL protein), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (mouse-derived RANKL ⁇ -strand D sequence of protein), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (part of ⁇ -strand D sequence of human-derived RANKL protein), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 ( ⁇ -strand D sequence of human-derived RANKL protein) Etc.
  • the ⁇ -strand D sequence may be mutated as long as the oligopeptide of the present invention can exert an effect of preventing or treating inflammatory skin diseases.
  • the N-terminal leucine residue of SEQ ID NOs: 2 and 4 and the leucine residue that is the fourth amino acid from the N-terminus of SEQ ID NOs: 3 and 5 are used for the prevention and treatment of inflammatory skin diseases. It is important to show the effect. In the ⁇ -strand D sequence, it is desirable that this leucine residue is not mutated.
  • the ⁇ -strand D sequence of the RANKL protein preferably includes the following amino acid sequence (c) or (d): (C) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 or (d) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 Or an inserted amino acid sequence.
  • the number of amino acids mutated is preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • the amino acid sequence (d) is preferably the amino acid sequence (d ′) below: (D ′) an amino acid sequence having 1 to 3 amino acids added to the N-terminus or C-terminus (preferably N-terminus) of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • the number of added amino acids is preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • “Arranged adjacent to the N-terminal side” means that the N-terminal amino acid of the DE loop sequence and the C-terminal amino acid of the ⁇ -strand D sequence are linked by a peptide bond.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention may contain other sequences than the above as long as the oligopeptide of the present invention can exert the preventive or therapeutic effect on inflammatory skin diseases.
  • Other sequences are not particularly limited, but are desirably determined from the viewpoint of a longer intracellular half-life. Whether hydrophilic or not and the intracellular half-life can be predicted on various websites (for example, expasy (http://web.expasy.org/protparam/)). In the case of using expancy, it is preferable to design the array so that “Grand average of hydropathicity” shows a negative value for hydrophilicity.
  • the other sequence is preferably a ⁇ -strand E sequence of RANKL protein.
  • the ⁇ -strand E sequence is preferably arranged adjacent to the C-terminal side of the DE loop sequence. Note that “adjacent to the C-terminal side” indicates that the C-terminal amino acid of the DE loop sequence and the N-terminal amino acid of the ⁇ -strand E sequence are linked by a peptide bond.
  • the ⁇ -strand E sequence of the RANKL protein is not particularly limited as long as it is an amino acid sequence that forms ⁇ -strand E in the amino acid sequence of the RANKL protein.
  • the biological species from which the ⁇ -strand E sequence is derived is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits. Among these, human, monkey, mouse, rat and the like are preferable, human, mouse and the like are more preferable, and human is more preferable.
  • the ⁇ -strand E sequence of each species is known, and is described in, for example, Non-Patent Documents 1 and 2 for mice and rats.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Specific examples of the ⁇ -strand E sequence of RANKL protein include, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 ( ⁇ -strand E sequence of mouse-derived RANKL protein), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 ( ⁇ of the RANKL protein derived from mouse) Part of the strand E sequence), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 ( ⁇ -strand E sequence of human-derived RANKL protein), amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (part of ⁇ -strand E sequence of human-derived RANKL protein) Etc.
  • the ⁇ -strand E sequence may be mutated as long as the oligopeptide of the present invention can exert an effect of preventing or treating inflammatory skin diseases.
  • the ⁇ -strand E sequence of the RANKL protein preferably includes the following amino acid sequence (e) or (f): (E) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9 or (f) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 6 to 9 Or an inserted amino acid sequence.
  • the number of amino acids that are mutated is preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • the amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention preferably does not include the CD loop sequence of the RANKL protein.
  • the CD loop sequence of the RANKL protein is not particularly limited as long as it is an amino acid sequence that forms a CD loop in the amino acid sequence of the RANKL protein.
  • the biological species from which the CD loop sequence is derived is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats and rabbits. Among these, human, monkey, mouse, rat and the like are preferable, human, mouse and the like are more preferable, and human is more preferable.
  • the CD loop sequence of each species is known, and is described in, for example, Non-Patent Documents 1 and 2 for mice and rats.
  • CD loop sequence of RANKL protein for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (CD loop sequence of mouse-derived RANKL protein), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (CD loop sequence of human-derived RANKL protein) ) And the like.
  • the CD loop sequence of the RANKL protein preferably includes the following amino acid sequence (g) or (h): (G) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11, or (h) the amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, added or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11 .
  • the number of amino acids that are mutated is preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • the length of the oligopeptide of the present invention is not particularly limited as long as it is a general length as an oligopeptide.
  • the length is, for example, 50 amino acid residues or less, preferably 40 amino acid residues or less, more preferably 35 amino acid residues or less, more preferably 30 amino acid residues or less, still more preferably 25 amino acid residues or less, More preferably, it is 20 amino acid residues or less, and still more preferably 18 amino acid residues or less.
  • the length is, for example, 11 amino acid residues or more, preferably 13 amino acid residues or more, more preferably 15 amino acid residues or more.
  • the range of the length is, for example, 11 to 50 amino acid residues, preferably 11 to 40 amino acid residues, more preferably 13 to 30 amino acid residues, still more preferably 13 to 20 amino acid residues, and even more preferably. Is 15-18 amino acid residues long.
  • a preferred amino acid sequence of the oligopeptide of the present invention includes an oligopeptide consisting of the following amino acid sequence (i) or (j): (I) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 12 to 20, or (j) the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 12 to 20 Or an inserted amino acid sequence.
  • More preferred amino acid sequences of the oligopeptide of the present invention include oligopeptides consisting of the following amino acid sequences (i ′) or (j ′): (I ′) 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 15 or 16, or (j ′) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, 15 or 16. Or an inserted amino acid sequence.
  • the number of amino acids mutated is preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • the oligopeptide of the present invention may be chemically modified as long as it can exert an effect of preventing or treating inflammatory skin diseases.
  • the C-terminus may be any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁇ ), an amide (—CONH 2 ), or an ester (—COOR).
  • R in the ester for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl; 14 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group is used.
  • a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl
  • a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group or acetyl group).
  • a protecting group for example, a C 1-6 acyl group such as C 1-6 alkanoyl such as formyl group or acetyl group.
  • oligopeptides having an N-terminal acetylation are excellent in activity and can be mentioned as preferred oligopeptides.
  • oligopeptides with C-terminal amidation and N-terminal acetylation are superior, and more preferred oligopeptides with C-terminal amidation and N-terminal acetylation Is mentioned.
  • Particularly preferred oligopeptides include CHP-terminal amidated and N-terminal acetylated MHP1, C-terminal amidated and N-terminal acetylated MHP4.
  • a known modification used for the purpose of improving drug stability, pharmacokinetics, bioavailability and the like may be added to the oligopeptide of the present invention.
  • examples of such a modified product include a polyethylene glycol chain.
  • the oligopeptide of the present invention includes various forms such as linear, branched, and cyclic, but is preferably linear. Furthermore, the oligopeptide of the present invention may be cross-linked according to or according to known means as long as it can exert an effect of preventing or treating inflammatory skin diseases.
  • the oligopeptide of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or a base.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be employed.
  • acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple Organic acid salts such as acid salts, citrate salts, methanesulfonate salts, and paratoluenesulfonate salts; and amino acid salts such as aspartate salts and glutamate salts.
  • basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.
  • the oligopeptide of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the oligopeptide of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method depending on its amino acid sequence.
  • the oligopeptide of the present invention has an effect of preventing or treating inflammatory skin diseases, an inhibitory effect of at least one pathway selected from the group consisting of Toll-like receptor 7 pathway and Toll-like receptor 8 pathway (more specifically, Has a suppressive effect on the inflammatory response induced through this (or these) pathway), preventive or therapeutic agent for inflammatory skin diseases, Toll-like receptor 7 pathway and Toll-like receptor 8 pathway It can be used as an active ingredient of an inhibitor of at least one pathway selected from the group consisting of (which may be collectively referred to as “the agent of the present invention” in the present specification).
  • the agent of the present invention can be an agent used in various fields such as pharmaceuticals and cosmetics.
  • the agent of the present invention can be applied to animals and humans (for example, administration, ingestion, inoculation, etc.) as it is or as various compositions together with conventional ingredients.
  • the oligopeptide of the present invention may be used alone or in combination of two or more.
  • inflammatory skin diseases include psoriasis, atopic dermatitis, arthritis, lichen planus, palmoplantar pustulosis, and blistering.
  • psoriasis atopic dermatitis, etc. are mentioned, More preferably, psoriasis is mentioned.
  • the content of the active ingredient in the agent of the present invention can be appropriately set in consideration of the type of target disease, target therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, patient weight, and the like. it can.
  • the content of the active ingredient in the agent of the present invention can be about 0.0001 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the entire agent of the present invention.
  • the dosage form of the agent of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, and oral administration and parenteral administration (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, topical administration) It can be administered to mammals including humans by any route of administration.
  • the preferred dosage form is parenteral administration, more preferably topical administration, transdermal administration, and the like. Dosage forms for oral administration and parenteral administration and methods for producing the same are well known to those skilled in the art, and the active ingredient can be produced according to a conventional method by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier or the like. it can.
  • the dosage form for parenteral administration includes external preparations (eg, ointments, poultices, lotions, creams, gels), suppositories, inhalants, ophthalmic preparations, ophthalmic ointments, nasal drops, ear drops , Liposome preparations, injectable preparations (for example, intravenous injection, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intradermal injection) and the like.
  • an injectable preparation is prepared by dissolving the oligopeptide of the present invention in distilled water for injection, and if necessary, a solubilizer, buffer, pH adjuster, isotonic agent, soothing agent, preservative , And stabilizers can be added.
  • the agent of the present invention can also be made into a lyophilized preparation for business preparation.
  • the agent of the present invention may further contain another drug effective for treating or preventing a disease.
  • the agent of this invention can also mix
  • Carriers used for the formulation of the agent of the present invention include excipients, binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring agents, and optionally stabilizers, emulsifiers, Use absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, extenders, wetting agents, surface activators, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, soothing agents, etc. be able to.
  • the dosage of the agent of the present invention includes, for example, pharmacological findings such as administration route, disease type, symptom severity, patient age, sex, body weight, disease severity, pharmacokinetics and toxicological characteristics, It can be determined based on various factors such as whether or not a drug delivery system is utilized and whether it is administered as part of a combination of other drugs.
  • the dose of the agent of the present invention can be, for example, about 1 ⁇ g / kg (body weight) to about 10 g / kg (body weight) per day.
  • the administration schedule of the agent of the present invention can also be determined in consideration of the same factors as the dosage. For example, the above-mentioned daily dose can be administered 1 to 4 times per day to January.
  • the agent of the present invention is preferably used for external use.
  • One aspect of the present invention is an external preparation for the prevention or treatment of inflammatory skin diseases containing the oligopeptide of the present invention.
  • the external preparation includes a preparation applied to the skin, a preparation applied to the rectum, a preparation applied to the vagina, a preparation applied to the eye, a preparation applied to the ear, and a preparation applied to the nose.
  • Examples of the dosage form include ointments, creams, gels, liquids (lotions, liniments, etc.), patches (patches, tapes), sprays, aerosols, suppositories, eye ointments, eye drops. Nasal drops and ear drops.
  • An external preparation can be administered directly to a lesion, is excellent in terms of preventive and therapeutic effects on inflammatory diseases, and is safe in terms of side effects.
  • Preferred embodiments (embodiment 1) of the external preparation of the present invention are ointments, creams, gels and liquids, and particularly preferred embodiments are ointments and creams.
  • Preferably hydrophilic bases such as hydrophilic petrolatum and a hydrophilic cream, are used.
  • the oligopeptide of the present invention may be mixed with the base as it is, but is preferably mixed with the base in a state dissolved in a solvent.
  • the solvent include water and various organic solvents (glycol ether, alcohol, ether, etc.), preferably glycol ether.
  • the content of the active ingredient in the external preparation in aspect 1 is preferably 0.00001 to 2%, 0.00005 to 1%, 0.0001 to 0.5%, 0.0003 to 0.1%, 0.0005 to 0.05%, 0.0008 to 0.01%. More preferably, the content is 0.001 to 0.005%, and still more preferably 0.002 to 0.003%.
  • the DE loop sequence and the ⁇ -strand D sequence are preferably relatively short (preferably 15 to 20 amino acid residues long, more preferably 15 to 18 amino acid residues long, and still more preferably 15 to 16 amino acid residues).
  • Base length RANKL peptide (for example, MHP4) can be employed. According to the above aspect, the RANKL peptide can exhibit a desired effect efficiently even at a very low concentration.
  • the content of the active ingredient in the external preparation in aspect 1 is preferably 0.00001 to 2%, 0.00005 to 1%, 0.0001 to 0.5%, 0.0003 to 0.1%, 0.001 to 0.05%, 0.005 to It is 0.03%, more preferably 0.008 to 0.025%.
  • it preferably includes a DE loop sequence and a ⁇ -strand D sequence (more preferably further includes a ⁇ -strand E sequence) and is relatively short (preferably 15 to 40 amino acid residues long, more preferably 20 to 35).
  • Amino acid residue length, more preferably 25-35 amino acid residue length, still more preferably 27-33 amino acid residue length) RANKL peptide (eg, MHP1) can be employed.
  • the RANKL peptide can exhibit a desired effect efficiently even at a very low concentration.
  • the amino acid sequence of MHP5 is SEQ ID NO: 17
  • the amino acid sequence of MHP6 is SEQ ID NO: 18
  • the amino acid sequence of MHP12 is SEQ ID NO: 19
  • the amino acid sequence of MHP13 is the sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • Example 1 Analysis of preventive and therapeutic effects for inflammatory skin diseases 1 It was investigated whether psoriasis symptoms caused by administration of imiquimod (IMQ), a psoriasis symptom-inducing agent, could be improved by RANKL peptide (MHP1). Specifically, according to the administration schedule shown in FIG.
  • IMQ imiquimod
  • MHP1 RANKL peptide
  • a BALB / c 6-week-old mouse ( ⁇ ) from which a part of the back was removed was prepared.
  • 5% imiquimod (IMQ) was applied (62.5 mg / 1 mouse) to the hair removal part and ears of the mouse (day 0 (0d)).
  • (1) and (2) were applied every day for 5 days (day 2 to 6 (2d to 6d)).
  • Fig. 2 shows a photograph of the observation site on the back.
  • Example 2 Analysis of influence on TLR7 / 8 signal 1 (IL-6 and TNF ⁇ , microglia cells)
  • MG6 cells mouse-derived microglia cell line
  • DMEM medium (+ 4% FBS DMEM medium (+ 4% FBS
  • the ELISA method was performed using a kit (Quantikine ELISA Mouse TNF-a or Quantikine ELISA Mouse IL-6, manufactured by R & D Systems).
  • the results when MHP1 is added are shown in FIG. 5a (detection is IL-6) and FIG. 5b (detection is TNF ⁇ ), and the results when MHP4 is added are shown in FIG. 5c (detection is IL-6).
  • FIG. 5 shows that the increase in the amount of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF ⁇ ) secreted by R848 (comparison between the first column and the second column from the left) is suppressed by MHP1 and MHP4. (Comparison between the second column from the left and the third column (FIGS. 5a and 5b) or the third to fifth columns (FIG. 5c)). From this, it was suggested that MHP1 and MHP4 suppress TLR7 / 8 signal.
  • IL-6 and TNF ⁇ inflammatory cytokines secreted by R848
  • Example 3 Analysis of influence on TLR7 / 8 signal 2 (IL-6, macrophage cells)
  • the effect of the RANKL peptide on the amount of inflammatory cytokine (IL-6) secreted from macrophage cells upon stimulation with the ligand (R848) of TLR7 / 8 was examined. Specifically, it was performed as follows.
  • THP-1 cells human-derived macrophage cell line
  • MHP1 or hMHP4 final concentration 30.5 ⁇ M
  • R848 final concentration 10 ⁇ g / ml
  • DMEM medium (+ 4% FBS DMEM medium (+ 4% FBS) supplemented only with R848 (final concentration 10 ⁇ g / ml)
  • THP-1 cells human-derived macrophage cell line
  • FIG. 6 shows that increase in inflammatory cytokine (IL-6) secretion by R848 (comparison between the first column and the second column from the left) is suppressed by MHP1 and hMHP4 ( Comparison between the second column from the left and the third to fourth columns). This suggests that MHP1 and hMHP4 suppress TLR7 / 8 signal. Moreover, the TLR7 / 8 signal suppression effect of MHP1 and hMHP4 was comparable.
  • IL-6 inflammatory cytokine
  • Example 4 Analysis of influence on TLR7 / 8 signal 3 (IL-12 / 23, macrophage cells) The effect of the RANKL peptide on the amount of inflammatory cytokine (IL-12 / 23) secreted from macrophage cells upon stimulation with the ligand (R848) of TLR7 / 8 was examined. Specifically, it was performed as follows.
  • DMEM medium (+ 4% FBS) supplemented with MHP1, MHP4, or hMHP4 (final concentration 30.5 ⁇ M, respectively) and R848 (final concentration 10 ⁇ g / ml), or DMEM medium supplemented only with R848 (final concentration 10 ⁇ g / m) THP-1 cells (human-derived macrophage cell line) were cultured in (+ 4% FBS) for 24 hours according to a conventional method. After the culture, the concentration of IL-12 / 23 in the medium was measured by ELISA using a kit (Quantikine® ELISA® Kits, manufactured by R & D® Systems). The results are shown in FIG.
  • FIG. 7 shows that the increase in inflammatory cytokine (IL-12 / 23) secretion by R848 (comparison between the first column and the second column from the left) is suppressed by the RANKL peptide. (Comparison of the second column from the left and the third to fifth columns). This suggests that the RANKL peptide suppresses TLR7 / 8 signal.
  • Example 5 Analysis of the effect of RANKL peptide on osteoclasts 1
  • osteoclast activation is caused by administering RANKL protein to mice. Therefore, the effect of RANKL peptide on osteoclasts was examined. Specifically, it was performed as follows.
  • MHP1 final concentration 100 ⁇ g / ml
  • RANKL protein final concentration 10 ng / ml
  • DMEM medium (+ 4% FBS medium in which RAW264.7 cells are cultured
  • the nuclear protein of the cells was extracted using Nuclear extract Kit (Active Motif), and the degree of NF ⁇ B (p65) activation was measured using TransAM NFkB p65 kit (Active Motif).
  • the expression levels of NFATc1 and ACP5 mRNA were analyzed by Realtime RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • FIG. 8 shows that MHP1 slightly activates NF ⁇ B but does not promote the expression of osteoclast-related mRNA.
  • Example 6 Analysis of the effect of RANKL peptide on osteoclasts 2 Osteoclast culture kit V-2 (OSC33, manufactured by Cosmo Bio) was used. According to the method of use of the kit, osteoclast precursor cells, group A and group B in the presence of M-CSF (final concentration 50 ng / ml), group C and group D M-CSF (final concentration 50 ng / ml) The culture was started in the presence of MHP1 (final concentration 30, 50, or 100 ⁇ g / ml).
  • M-CSF final concentration 50 ng / ml
  • MHP1 final concentration 30, 50, or 100 ⁇ g / ml
  • group A was in the presence of M-CSF (final concentration 50 ng / ml)
  • group B was M-CSF (final concentration 50 ng / ml) and RANKL protein (final concentration).
  • group C is in the presence of M-CSF (final concentration 50 ng / ml) and MHP1 (final concentration 30, 50, or 100 ⁇ g / ml)
  • group D is M-CSF (final concentration) 50 ng / ml), RANKL protein (final concentration 50 ng / ml), and MHP1 (final concentration 30, 50, or 100 ⁇ g / ml) were cultured.
  • FIG. 9A shows the TRAP stained images of the A group, the B group, and the D group
  • FIG. 9B shows the TRAP stained images and the nuclear stained images of the C group.
  • FIG. 9 (a) shows that osteoclast differentiation promoted by RANKL is suppressed by MHP1 (comparison between group B and group C).
  • FIG. 9 (b) shows that osteoclast differentiation does not occur even when MHP1 is added.
  • Example 7 Stability of RANKL peptide The stability of the RANKL peptide was examined. Specifically, it was performed as follows.
  • MHP1 was dissolved in water at a concentration of 2 mg / ml and stored at 4 ° C. for 208 days. Then, MG6 cells (mouse-derived microglia cell line) were cultured in a DMEM medium (+ 4% FBS) containing MHP1 (final concentration 100 ⁇ g / ml) and LPS (final concentration 2 ng / ml) for 24 hours according to a standard method. did. After the culture, the concentrations of IL-6 and TNF ⁇ in the medium were measured by ELISA. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 shows that MHP1 exhibits a high inhibitory effect on inflammatory cytokine secretion even after storage for a long period of time, as before storage. This indicates that MHP1 has high stability.
  • Oligopeptide synthesis 2 Oligopeptide (MHP1-3) in which the methionine residue of MHP1 (Reference Example 1) is replaced by D-form, Oligopeptide (MHP1-6) in which the N-terminus of MHP1 (Reference Example 1) is acetylated, MHP1 An oligopeptide (MHP1-7) in which the N-terminus of (Reference Example 1) is acetylated and the C-terminus is amidated, and an oligopeptide (MHP1-) in which the C-terminus of MHP1 (Reference Example 1) is amidated 8) was commissioned to ILS and synthesized. It was confirmed by HPLC and MS that an oligopeptide having the desired sequence could be synthesized with high purity. Hereinafter, this peptide may be referred to as “RANKL peptide”.
  • Example 8 Analysis of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases 2 It was investigated whether psoriasis symptoms caused by administration of imiquimod (IMQ), a psoriasis symptom-inducing agent, could be improved by RANKL peptide (MHP4). Specifically, it was carried out as follows according to the same schedule as the administration schedule shown in FIG. 1 except that the ointment was first applied 6 hours after the initial application of imiquimod. In Example 1, an aqueous solution of RANKL peptide was administered, whereas in this example, a RANKL peptide ointment was administered.
  • IMQ imiquimod
  • MHP4 RANKL peptide
  • a BALB / c 9-week-old mouse ( ⁇ ) from which a part of the back was removed was prepared.
  • FIG. 1 A photograph of the observation site on the back of Day 6 is shown in FIG.
  • FIGS. 11 to 14 show that administration of MHP4 improves psoriasis symptoms.
  • Example 9 Analysis of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases 3 It was investigated whether the RANKL peptide (MHP1-8) can improve the atopic dermatitis caused by intradermal administration of mite antigen, which is an atopic dermatitis inducer. Specifically, it was performed as follows.
  • FIG. 15 shows that administration of MHP1-8 improves the atopic skin inflammation state.
  • Example 10 Analysis of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases 4 It was examined whether psoriasis symptoms caused by administration of imiquimod (IMQ), a psoriasis symptom-inducing agent, were improved by the RANKL peptide (MHP1-7). Specifically, it was carried out as follows according to the same schedule as the administration schedule shown in FIG. 1 except that the ointment was first applied 6 hours after the initial application of imiquimod. As in Example 8, RANKL peptide ointment was administered in this example.
  • IMQ imiquimod
  • MHP1-7 psoriasis symptom-inducing agent
  • FIG. 16 shows that administration of MHP1-7 improves psoriasis symptoms.
  • Example 11 Analysis of preventive and therapeutic effects on inflammatory skin diseases 5 It was examined whether psoriasis symptoms caused by administration of imiquimod (IMQ), a psoriasis symptom-inducing agent, were improved by the RANKL peptide (MHP1-7). Specifically, it was carried out as follows according to the same schedule as the administration schedule shown in FIG. 1 except that the ointment was first applied 6 hours after the initial application of imiquimod.
  • IMQ imiquimod
  • MHP1-7 RANKL peptide
  • IMQ imiquimod
  • Hydrophilic cream ointment 1 was prepared by mixing an aqueous solution of MHP1-7 with a hydrophilic cream.
  • Hydrophilic cream ointment 2 was prepared by mixing a transcutol P (diethylene glycol monoethyl ether) solution of MHP1-7 with a hydrophilic cream. And created.
  • FIGS. 17 to 19 show that administration of MHP1-7 improves psoriasis symptoms.
  • Hydrophilic cream ointment 2 in which a glycol ether solution of RANKL peptide was ointed had a stronger improvement effect.
  • Example 12 RANKL peptide-containing lotions Various RANKL peptides were each dissolved in water at a concentration of 2 mg / ml to prepare RANKL peptide-containing lotions.
  • RANKL peptide-containing ointment RANKL peptide (MHP4) was mixed with hydrophilic petrolatum to prepare an ointment having a concentration of 25 ⁇ g / g.
  • RANKL peptide (MHP1-7) was mixed with hydrophilic petrolatum to make ointments with concentrations of 100 ⁇ g / g and 200 ⁇ g / g.
  • Example 14 RANKL peptide (MHP1-7) was mixed with hydrophilic cream to prepare a cream having a concentration of 100 ⁇ g / g.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

オリゴペプチドを有効成分とする、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤を提供すること。 RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤。

Description

炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤
　本発明は、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤などに関する。
　乾癬は、典型的には赤い発疹、鱗屑などを伴う炎症性皮膚疾患である。乾癬の発症には、T細胞や角化細胞の異常、Toll様受容体（Toll-like receptor：TLR）7経路やTLR8経路の活性化及びそれによる各種炎症性サイトカインの分泌（TNF-α、IL-6、IL-12/23p40など）などが関与しているといわれている。
　乾癬の治療薬としては、炎症性サイトカインの発現を制御するTNF-α阻害剤としてインフリキシマブ、アダリムマブが、ヒト型抗ヒトIL-12/23p40モノクローナル抗体製剤としてウステキヌマブが知られている。しかしながら、乾癬の根本的な治療法は未だ開発されていない。
　乾癬患者数は近年増加傾向にあり、またその治療薬の市場規模も近年増加している。
　一方、本発明者などによって、RANKLタンパク質が炎症性サイトカインを抑制することが報告されている（特許文献１）。ただ、特許文献１では、TLR2経路やTLR4経路を介した炎症性サイトカイン抑制しか報告されていない。
　また、特許文献２では、RANKLタンパク質が接触性アレルギー性皮膚炎に有効であり得ることが開示されている。ただ、特許文献２ではRANKLタンパク質全長を有効成分としているところ、安定性、経済性などの観点からは、より短いオリゴペプチドを有効成分とすることが望ましい。
国際公開第2014/051202号 特表2009-536171号公報
The Journal of Clinical Investigation, No.7, Vol.108, 2001, pages 971-979. Mol Endocrinol, January 2009, 23(1):35-46.
　本発明は、オリゴペプチドを有効成分とする、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、驚くべきことに、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防及び治療効果を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
　項１．　RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤．
　項２．　前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
（c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１に記載の予防又は治療剤．
　項３．　前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、項２に記載の予防又は治療剤．
　項４．　前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、項２又は３に記載のオリゴペプチド．
　項５．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、項１～４のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項６．　前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
（e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項５に記載の予防又は治療剤．
　項７．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、項１～６のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項８．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
（i）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項９．　前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
（i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項１０．　前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、項１～９のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項１１．　前記オリゴペプチドの長さが30アミノ酸残基長以下である、項１０に記載の予防又は治療剤．
　項１２．　前記炎症性皮膚疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、及び水疱症からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～１１のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項１３．　前記炎症性皮膚疾患が乾癬及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～１２のいずれかに記載の予防又は治療剤．
　項１４．　RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有する、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤．
　項１５．　RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
である、オリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤。
　項１６．　RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドを投与することを含む、炎症性皮膚疾患を予防又は治療する方法．
　項１７．　炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤としての使用のための、
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチド．
　項１８．　炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤の製造のための、
RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
であるオリゴペプチドの使用．
　本発明によれば、オリゴペプチドを有効成分とする、乾癬などの炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤を提供することができる。
　RANKLタンパク質は破骨細胞を活性化するのに対して、本発明に用いるオリゴペプチド（以下、「RANKLペプチド」と記載することもある）はRANKLタンパク質由来でありながらもそのような性質を有さず、寧ろRANKLタンパク質による破骨細胞の活性化を抑制することができる。このため、このオリゴペプチドを用いれば、破骨細胞活性化をより低減しつつ、炎症性皮膚疾患の予防又は治療を行うことが可能である。
　本発明に用いるオリゴペプチドは、安定性に優れており、長期間保存後であってもより高い活性を維持することが可能である。
　本発明の予防又は治療剤は、オリゴペプチドを有効成分としているので、既存の、抗体を有効成分とする治療剤（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブなど）に比べて、より安価に提供することが可能である。このため、本発明は医療費抑制にも資することができる。乾癬などの炎症性皮膚疾患は近年増加傾向にあるところ、医療費抑制は重要な課題である。
炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、投与スケジュールを示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析1（実施例1）における、投与後の背中の写真を示す。IMQは乾癬症状誘発剤であるイミキモドを意味し、dH2Oはコントロール群（MHP1非投与群）を示し、MHP1はMHP1投与群を示し、6d及び7dはイミキモド初回投与から6日目及び7日目を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、背中の白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。IMQは乾癬症状誘発剤であるイミキモドを意味し、Controlがイミキモド及びMHP1をいずれも投与していない場合を示し、dH2Oはコントロール群（MHP1非投与群）を示し、MHP1はMHP1投与群を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析（実施例1）における、耳の厚さの測定結果を示す。右耳（Right ear）はイミキモド投与群であり、左耳はイミキモド非投与群である。横軸中、Day -1はイミキモド初回投与の前日であり、その他はイミキモド初回投与からの経過日数を示す。縦軸は、測定された耳の厚さを、Day -1の耳の厚さを100％として新たした相対値である。ControlはMHP1非投与群を示し、MHP1はMHP1投与群を示す。 TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6又はTNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例2）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNFα濃度を示す。図５ａ及び図５ｂにおけるMHP1の培地中の濃度は30.5μMであり、図５ｃの横軸における数値はMHP4の培地中の濃度を示し、Controlは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示す。**は、R848のみを添加した場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.01未満であったことを示す。 TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例3）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸における数値はRANKLペプチドの培地中の濃度を示し、Normalは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示し、No treatは培地にR848のみを添加した場合を示す。**は、R848のみを添加した場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.01未満であったことを示す。 TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-12/23）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例4）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-12/23濃度を示す。Controlは培地にR848及びRANKLペプチドのいずれも添加していない場合を示し、No treatmentは培地にR848のみを添加した場合を示す。 RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例5）。図８Ａ及びＢ中、縦軸は、測定対象のmRNA発現量をGAPDH mRNA発現量で除した値を示す。図８Ｃ中、縦軸は、TransAM NFkB p65 kitによって測定された吸光度（NFκB結合配列を有するDNAに結合した、核タンパク中のp65量を表わす）を示す。 RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例6）。（ａ）は、A群、B群、及びD群のTRAP染色像を、（ｂ）は、C群のTRAP染色像（上段）及び核染色像（下段）を示す。 RANKLペプチドの安定性を調べた結果を示す（実施例7）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNF－αの濃度を示す。**は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、day 1の背中の写真を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、発赤の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、発赤の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2（実施例8）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析3（実施例9）における、耳の厚さの測定結果を示す。縦軸は、測定された耳の厚さと、ダニ抗原投与前の耳の厚さとの差である。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析4（実施例10）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、発赤の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、発赤の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、白色鱗屑の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、白色鱗屑の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。 炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5（実施例11）における、皮膚肥厚の程度を数値化した結果を示す。縦軸が、皮膚肥厚の程度を表す数値を示し（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）、横軸がイミキモド初回投与からの経過日数を示す。
　1．定義
　本明細書において、アミノ酸配列の表記は全て一文字表記で表わす。
　本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　2．オリゴペプチド
　以下に、RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（本明細書において、「本発明のオリゴペプチド」と示すこともある。）について説明する。
　RANKLタンパク質のDEループ配列としては、下記（a）又は（b）のアミノ酸配列が挙げられる：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　RANKLタンパク質のβストランドD配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドDを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドD配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドD配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドD配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドD配列として、具体的には、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号3に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）、配列番号4に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号5に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）などが挙げられる。βストランドD配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異したものであってもよい。
　なお、配列番号2～5において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基、及び配列番号3及び5のN末端から4番目アミノ酸であるロイシン残基は、炎症性皮膚疾患の予防及び治療効果の発揮に重要である。βストランドD配列においては、このロイシン残基は変異していないことが望ましい。
　RANKLタンパク質のβストランドD配列として、好ましくは下記（c）又は（d）のアミノ酸配列が挙げられる：
（c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（d）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1～2個であり、より好ましくは1個である。
　上記（d）のアミノ酸配列として、好ましくは下記（d’）のアミノ酸配列が挙げられる：
（d’）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列のN末端又はC末端（好ましくはN末端）に対して1～3個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列。
　上記（d’）において、付加しているアミノ酸の数は、好ましくは1～2個であり、より好ましくは1個である。
　「N末端側に隣接して配置された」とは、上記DEループ配列のN末端のアミノ酸と上記βストランドD配列のC末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
　本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、上記した配列以外の他の配列を含んでいてもよい。他の配列は特に限定されないが、細胞内半減期がより長いという観点などから決定することが望ましい。なお、親水性か否か、及び細胞内半減期については、各種ウェブサイト（例えばエクスパシー（http://web.expasy.org/protparam/））上で予測することができる。エクスパシーを利用する場合、親水性については、「Grand average of hydropathicity」がマイナスの値を示すように配列を設計することが好ましい。
　他の配列としては、好ましくはRANKLタンパク質のβストランドE配列が挙げられる。βストランドE配列は、DEループ配列のC末端側に隣接して配置されていることが好ましい。なお、「C末端側に隣接して」とは、上記DEループ配列のC末端のアミノ酸と上記βストランドE配列のN末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
　RANKLタンパク質のβストランドE配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドEを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドE配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドE配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のβストランドE配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドE配列として、具体的には、例えば配列番号6に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号7に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）、配列番号8に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号9に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）などが挙げられる。βストランドE配列は、本発明のオリゴペプチドが炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、変異していてもよい。
　RANKLタンパク質のβストランドE配列として、好ましくは下記（e）又は（f）のアミノ酸配列が挙げられる：
（e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（f）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1～2個であり、より好ましくは1個である。
　本発明のオリゴペプチドのアミノ酸配列は、RANKLタンパク質のCDループ配列を含まないことが好ましい。
　RANKLタンパク質のCDループ配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、CDループを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該CDループ配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラットなど、より好ましくはヒト、マウスなど、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のCDループ配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献１、２などに記載されている。また、ある生物種由来のCDループ配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献１、２など）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のCDループ配列として、具体的には、例えば配列番号10に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のCDループ配列）、配列番号11に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のCDループ配列）などが挙げられる。
　RANKLタンパク質のCDループ配列として、好ましくは下記（g）又は（h）のアミノ酸配列が挙げられる：
（g）配列番号10又は11に示されるアミノ酸配列、又は
（h）配列番号10又は11に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（h）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1～2個であり、より好ましくは1個である。
　本発明のオリゴペプチドの長さとしては、オリゴペプチドとして一般的な長さである限り特に限定されない。該長さは、例えば50アミノ酸残基長以下、好ましくは40アミノ酸残基長以下、より好ましくは35アミノ酸残基以下、より好ましくは30アミノ酸残基以下、さらに好ましくは25アミノ酸残基長以下、さらに好ましくは20アミノ酸残基長以下、よりさらに好ましくは18アミノ酸残基長以下である。また、該長さは、例えば11アミノ酸残基長以上、好ましくは13アミノ酸残基長以上、より好ましくは15アミノ酸残基長以上である。該長さの範囲は、例えば11～50アミノ酸残基長、好ましくは11～40アミノ酸残基長、より好ましくは13～30アミノ酸残基、さらに好ましくは13～20アミノ酸残基長、よりさらに好ましくは15～18アミノ酸残基長である。
　本発明のオリゴペプチドの好ましいアミノ酸配列としては、下記（i）又は（j）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　本発明のオリゴペプチドのより好ましいアミノ酸配列としては、下記（i’）又は（j’）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
（j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
　上記（j）及び（j’）において、変異（置換、欠失、付加又は挿入）しているアミノ酸の数は、好ましくは1～2個であり、より好ましくは1個である。
　本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　本発明のオリゴペプチドは、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO‐）、アミド（－CONH2）またはエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　また、本発明のオリゴペプチドには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、なども包含される。
　上記化学修飾の中でも、C末端のアミド化、N末端のアセチル基による保護などが好ましく挙げられる。特に、N末端がアセチル化されたオリゴペプチドは活性が優れており好ましいオリゴペプチドとして挙げられる。安定性の観点からは、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたオリゴペプチドが優れており、さらに好ましいオリゴペプチドとして、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたオリゴペプチドが挙げられる。特に好ましいオリゴペプチドとして、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたMHP1、C末端がアミド化されかつN末端のアセチル化されたMHP4が挙げられる。
　さらに、本発明のオリゴペプチドには、薬物の安定性、薬物動態、生物学的利用能などを改善する目的で用いられる公知の修飾物が付加されていてもよい。このような修飾物としては、例えばポリエチレングリコール鎖などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、直鎖状、分枝状、環状などの種々の形態のものを包含するが、直鎖状であることが好ましい。また、本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果を発揮し得る限りにおいて、公知の手段に従って又は準じて架橋されていてもよい。
　本発明のオリゴペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；　酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩；　アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩などが挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；　カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸などが挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
　3．用途
　本発明のオリゴペプチドは、炎症性皮膚疾患の予防又は治療効果、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制効果（より具体的には、この（又はこれらの）経路を介して惹起される炎症反応の抑制効果）を有することから、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤（本明細書において、これらをまとめて「本発明の剤」と示すこともある。）の有効成分として利用することができる。本発明の剤は、例えば医薬、化粧品などの種々の分野で用いられる剤とすることができる。本発明の剤は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
　本発明の剤において、本発明のオリゴペプチドは、1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
　炎症性皮膚疾患としては、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、水疱症などが挙げられる。これらの中でも、好ましくは乾癬、アトピー性皮膚炎などが挙げられ、より好ましくは乾癬が挙げられる。
　本発明の剤中の有効成分の含有量は、対象とする疾患の種類、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、及び患者の体重などを考慮して適宜設定することができる。例えば、本発明の剤中の有効成分の含量は、本発明の剤全体を100重量部として0.0001重量部～100重量部程度をすることができる。
　本発明の剤の投与形態は、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、及び非経口投与（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、局所投与）のいずれかの投与経路でヒトを含む哺乳類に投与することができる。好ましい投与形態は非経口投与であり、より好ましくは局所投与、経皮投与などである。経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、有効成分を、薬学的に許容される坦体などと混合などすることにより、常法に従って製造することができる。
　非経口投与のための剤形は、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤、クリーム、ゲル剤）、坐剤、吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）などが挙げられる。例えば、注射用製剤は、本発明のオリゴペプチドを注射用蒸留水に溶解して調製し、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、及び安定化剤などを添加することができる。本発明の剤は、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
　本発明の剤は、疾患の治療又は予防に有効な他の薬剤を更に含有していてもよい。本発明の剤は、必要に応じて殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、及びアミノ酸などの成分を配合することもできる。
　本発明の剤の製剤化に用いる担体には、当該技術分野において通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤や、必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、pH調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、無痛化剤などを用いることができる。
　本発明の剤の投与量は、例えば、投与経路、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、薬物動態および毒物学的特徴などの薬理学的知見、薬物送達系の利用の有無、並びに他の薬物の組合せの一部として投与されるか、など様々な因子を元に、決定することができる。本発明の剤の投与量は、例えば、一日当たりで、1μg/kg（体重）～10g/kg（体重）程度とすることができる。本発明の剤の投与スケジュールも、その投与量と同様の要因を勘案して決定することができる。例えば、上記の1日当たりの投与量で、1日～1月に1～4回投与することできる。
　本発明の剤は、好ましくは外用として用いる。本発明の一態様は、本発明のオリゴペプチドを含有する炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤である。本発明の外用剤における、外用剤には、皮膚に適用する製剤、直腸に適用する製剤、膣に適用する製剤、目に適用する製剤、耳に適用する製剤、鼻に適用する製剤が含まれる。剤形としては、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤（ローション剤、リニメント剤等）、貼付剤（パップ剤、テープ剤）、スプレー剤、エアゾール剤、坐剤、眼軟膏、点眼剤、点鼻剤、点耳剤が挙げられる。外用剤は病変部に直接投与することが可能であり、炎症性疾患の予防治療効果の点で優れており、また、副作用の点で安全である。
　本発明の外用剤の好ましい態様（態様1）は、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤であり、特に好ましい態様は、軟膏剤とクリーム剤である。基剤としては、特に制限されないが、好ましくは親水ワセリン、親水クリーム等の親水性基剤が使用される。本発明のオリゴペプチドは、そのまま基剤と混合されてもよいが、好ましくは溶媒に溶解した状態で基剤と混合される。該溶媒としては、例えば水、各種有機溶媒（グリコールエーテル、アルコール、エーテル等）が挙げられ、好ましくはグリコールエーテルが挙げられる。
　態様1における外用剤中の有効成分の含有量は、一態様においては、好ましくは0.00001～2％、0.00005～1％、0.0001～0.5％、0.0003～0.1％、0.0005～0.05％、0.0008～0.01％、より好ましくは0.001～0.005％、さらに好ましくは0.002～0.003％である。また、この場合、好ましくはDEループ配列とβストランドD配列を含む比較的短い（好ましくは15～20アミノ酸残基長、より好ましくは15～18アミノ酸残基長、さらに好ましくは15～16アミノ酸残基長）RANKLペプチド（例えば、MHP4）を採用することができる。上記態様によれば、RANKLペプチドが非常に低い濃度でありながらも、効率的に所望の効果を発揮することができる。
　態様1における外用剤中の有効成分の含有量は、別の一態様においては、好ましくは0.00001～2％、0.00005～1％、0.0001～0.5％、0.0003～0.1％、0.001～0.05％、0.005～0.03％、より好ましくは0.008～0.025％である。また、この場合、好ましくはDEループ配列とβストランドD配列を含む（より好ましくは、さらにβストランドE配列も含む）比較的短い（好ましくは15～40アミノ酸残基長、より好ましくは20～35アミノ酸残基長、さらに好ましくは25～35アミノ酸残基長、よりさらに好ましくは27～33アミノ酸残基長）RANKLペプチド（例えば、MHP1）を採用することができる。上記態様によれば、RANKLペプチドが非常に低い濃度でありながらも、効率的に所望の効果を発揮することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　参考例1：オリゴペプチドの合成1
　表１に示すアミノ酸配列のオリゴペプチドをILS株式会社に委託して合成した。HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。なお、これらのペプチドにおけるアミノ酸残基は、全てL体である。以下、これらのペプチドを総称して「RANKLペプチド」と総称することもある。なお、MHP1のアミノ酸配列は配列番号12に、MHP2のアミノ酸配列は配列番号13に、MHP3のアミノ酸配列は配列番号14に、MHP4のアミノ酸配列は配列番号15に、hMHP4のアミノ酸配列は配列番号16に、MHP5のアミノ酸配列は配列番号17に、MHP6のアミノ酸配列は配列番号18に、MHP12のアミノ酸配列は配列番号19に、
MHP13のアミノ酸配列は配列番号20に示される配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例1：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析1
　乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、図１に示す投与スケジュールに従って、次のように行った。
　被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c　6週齢のマウス（♀）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）した（day 0（0d））。1日経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1水溶液（200μg / 100μL / 匹、n＝2）又はdH2O（コントロール、n＝2）を塗布し、その後（2）5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）した（day 1（1d））。その後、5日間毎日、（1）及び（2）の塗布を行った（day 2～6（2d～6d））。
　背中の観察部位の写真を図２に示す。
　また、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って、背中の白色鱗屑の程度を数値化した（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図３に示す。
　さらに、耳の厚さを測定した。この結果を図４に示す。
　図２～４より、MHP1の投与により乾癬症状が改善することが示された。
　実施例2：TLR7/8シグナルに対する影響の解析1（IL-6及びTNFα、ミクログリア細胞）
　TLR7/8のリガンドであるImidazoquinoline Resiquimod（R848、インビトロジェン社製）刺激によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　MHP1又はMHP4（終濃度7.6μM、15.3μM、又は30.5μM）、及びR848（終濃度1μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度1μg/ml）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。なお、本願実施例において、ELISA法は、キット（Quantikine ELISA Mouse TNF-a又はQuantikine ELISA Mouse IL-6、R&D Systems社製）を用いて行った。MHP1を添加した場合の結果を図５ａ（検出はIL-6）及び図５ｂ（検出はTNFα）に、MHP4を添加した場合の結果を図５ｃ（検出はIL-6）に示す。
　図５より、R848による炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1及びMHP4によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3つ目（図５ａ及び図５ｂ）又は3～5つ目（図５ｃ）のカラムとの比較）。このことから、MHP1及びMHP4はTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。
　実施例3：TLR7/8シグナルに対する影響の解析2（IL-6、マクロファージ細胞）
　TLR7/8のリガンド（R848）刺激によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　MHP1又はhMHP4（終濃度30.5μM）、及びR848（終濃度10μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度10μg/ml）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、THP-1細胞（ヒト由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6の濃度をELISA法で測定した。結果を図６に示す。
　図６より、R848による炎症性サイトカイン（IL-6）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1及びhMHP4によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3～4つ目のカラムとの比較）。このことから、MHP1及びhMHP4はTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。また、MHP1とhMHP4のTLR7/8シグナル抑制作用は、同程度であった。
　実施例4：TLR7/8シグナルに対する影響の解析3（IL-12/23、マクロファージ細胞）
　TLR7/8のリガンド（R848）刺激によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-12/23）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　MHP1、MHP4、又はhMHP4（それぞれ、終濃度30.5μM）、及びR848（終濃度10μg/ml）を添加したDMEM培地（＋4％FBS）、或いはR848（終濃度10μg/m）のみを添加したDMEM培地（＋4％FBS）中で、THP-1細胞（ヒト由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-12/23の濃度を、キット（Quantikine ELISA Kits、R&D Systems社製）を用いてELISA法で測定した。結果を図７に示す。
　図７より、R848による炎症性サイトカイン（IL-12/23）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、RANKLペプチドによって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3～5つ目のカラムとの比較）。このことから、RANKLペプチドはTLR7/8シグナルを抑制することが示唆された。
　実施例5：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析1 
　近年、RANKLタンパク質をマウスに投与することによって破骨細胞の活性化を引き起こされることが報告されている。そこで、RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた。具体的には次のように行った。
　RAW264.7細胞を培養している培地（DMEM培地（＋4％FBS））に、MHP1（終濃度100μg/ml）又はRANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）を添加し、10分後及び3日後に細胞を回収した。
　10分後に回収したサンプルについては、Nuclear extract Kit（Active Motif）を用いて細胞の核タンパクを抽出し、TransAM NFkB p65 kit（Active Motif）によりNFκB（p65）活性化の程度を測定した。一方で、3日後に回収したサンプルについては、Realtime RT-PCRにて、NFATc1及びACP5のmRNAの発現量を解析した。結果を図８に示す。
　図８より、MHP1はNFκBを軽度活性化するが、 破骨細胞関連mRNAの発現を促進しないことが示された。
　実施例6：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析2
　破骨細胞培養キットV-2（OSC33、コスモ・バイオ社製）を使用した。キットの使用方法に従って、破骨前駆細胞を、A群及びB群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群及びD群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養開始した。その後、培養開始24時間後から7日間は、A群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、B群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びRANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、D群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）、RANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）、及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養した。培養後、細胞を定法に従ってTRAP染色及び核染色した。結果を図９に示す。A群、B群、及びD群のTRAP染色像を図９（ａ）に、C群のTRAP染色像及び核染色像を図９（ｂ）に示す。
　図９（ａ）より、RANKLによって促進される破骨細胞の分化が、MHP1により抑制されることが示された（B群とC群との比較）。図９（ｂ）より、MHP1を添加しても、破骨細胞の分化は起こらないことが示された。
　実施例7：RANKLペプチドの安定性
　RANKLペプチドの安定性を調べた。具体的には次のように行った。
　MHP1を2 mg/mlの濃度で水に溶解し、4℃で208日間保管した。その後、MHP1（終濃度100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。
結果を図１０に示す。
　図１０より、MHP1は長期間保存後であっても、保存前と同様に高い炎症性サイトカイン分泌抑制効果を発揮することが示された。このことから、MHP1の安定性が高いことが示された。
　参考例2：オリゴペプチドの合成2
　MHP1（参考例1）のメチオニン残基がD体に置換されてなるオリゴペプチド（MHP1-3）、MHP1（参考例1）のN末端がアセチル化されてなるオリゴペプチド（MHP1-6）、MHP1（参考例1）のN末端がアセチル化され且つC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-7）、及びMHP1（参考例1）のC末端がアミド化されてなるオリゴペプチド（MHP1-8）をILS株式会社に委託して合成した。HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。以下、このペプチドを「RANKLペプチド」と記すこともある。
　実施例8：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析2
　乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP4）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。なお、実施例1ではRANKLペプチドの水溶液を投与したのに対して、本実施例ではRANKLペプチド軟膏を投与した。
　被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c　9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP4親水ワセリン軟膏（375ng（MHP4） / 15mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、親水ワセリン（コントロール（未治療）、n＝2）、又はMCT/BBP（マーデュオックス（登録商標）軟膏）（15 mg / 匹、n＝2）を塗布した。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1～（1d～））。
　day 6の背中の観察部位の写真を図１１に示す。
　また、背中の発赤の程度、背中の白色鱗屑の程度、及び背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１２～１４に示す。
　図１１～１４より、MHP4の投与により乾癬症状が改善することが示された。
　実施例9：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析3
　アトピー性皮膚炎誘発剤であるダニ抗原の皮内投与によるアトピー性皮膚炎症状が、RANKLペプチド（MHP1-8）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には次のように行った。
　被検動物として、BALB/c  6週齢のマウス（♀）を準備した。マウスの耳介にダニ抗原を皮内投与した（day 0（0d））。day 0及びday 1に、耳に、（1）MHP1-8水溶液（50μg / 25μL / 匹、n＝10）又はdH2O（コントロール（vehicle）、n＝10）を塗布した。
　day 1に、耳の厚さを測定した。この結果を図１５に示す。
　図１５より、MHP1-8の投与によりアトピー性皮膚炎症状が改善することが示された。
　実施例10：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析4
　乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1-7）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。実施例8と同様に、本実施例でもRANKLペプチド軟膏を投与した。
　被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c　9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1-7親水ワセリン軟膏1（3μg（MHP1-7） / 15 mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、MHP1-7親水ワセリン軟膏2（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水ワセリン） / 匹、n＝2）、又は親水ワセリン（コントロール（未治療）、n＝2）を塗布した（day 1（1d））。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1～（1d～））。
　また、背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１６に示す。
　図１６より、MHP1-7の投与により乾癬症状が改善することが示された。
　実施例11：炎症性皮膚疾患に対する予防及び治療効果の解析5
　乾癬症状誘発剤であるイミキモド（IMQ）の投与による乾癬症状が、RANKLペプチド（MHP1-7）によって改善されるかどうかを調べた。具体的には、イミキモド初回塗布から6時間後に軟膏の初回塗布を行う以外は、図１に示す投与スケジュールと同様のスケジュールに従って、次のように行った。
　被検動物として、背中の一部を除毛した、BALB/c　9週齢のマウス（♂）を準備した。マウスの背中の除毛部と耳に 5% イミキモド（IMQ）を塗布（62.5 mg / 1匹）し（day 0（0d））、6時間経過後、背中と耳それぞれに、（1）MHP1-7親水クリーム軟膏1（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水性クリーム） / 匹、n＝4）、MHP1-7親水クリーム軟膏2（1.5μg（MHP1-7） / 15 mg（親水性クリーム） / 匹、n＝4）、又は親水性クリーム（コントロール（未治療）、n＝4）を塗布した（day 1（1d））。その後、毎日、イミキモドと上記（1）の塗布を行った（day 1～（1d～））。なお、親水クリーム軟膏1は、MHP1-7の水溶液を親水性クリームに混合して作成し、親水クリーム軟膏2は、MHP1-7のトランスクトールP（ジエチレングリコールモノエチルエーテル）溶液を親水性クリームに混合して作成した。
　また、背中の発赤の程度、背中の白色鱗屑の程度、及び背中の皮膚肥厚の程度を数値化した。なお、数値化は、文献（van der Fits, L. et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J. Immunol. 182, 5836-45 (2009).）の記載に従って行った（評価基準：none (0)、mild (1)、moderate (2)、severe (3)、very severe (4)）。この結果を図１７～１９に示す。
　図１７～１９より、MHP1-7の投与により乾癬症状が改善することが示された。RANKLペプチドのグリコールエーテル溶液を軟膏化した親水クリーム軟膏2は、その改善作用がより強かった。
　実施例12
RANKLペプチド含有ローション
　各種RANKLペプチドを各々、2mg/mlの濃度で水に溶解し、RANKLペプチド含有ローションを作製した。
　実施例13
RANKLペプチド含有軟膏
　RANKLペプチド（MHP4）を親水性ワセリンと混合し、25μg/gの濃度の軟膏を作製した。
　RANKLペプチド（MHP1-7）を親水性ワセリンと混合し、100μg/gおよび200μg/gの濃度の軟膏を作製した。
　実施例14
　RANKLペプチド（MHP1-7）を親水性クリームと混合し、100μg/gの濃度のクリームを作製した。

Claims (15)

  1. RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
    前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
    （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
    （b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    であるオリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤。
  2. 前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）：
    （c）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （d）配列番号2～5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
  3. 前記DEループ配列が前記（a）のアミノ酸配列である、請求項２に記載の予防又は治療剤。
  4. 前記（d）のアミノ酸配列において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基並びに配列番号3及び5のN末端から4番目のアミノ酸残基であるロイシン残基は置換又は欠失されていない、請求項２又は３に記載のオリゴペプチド。
  5. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、前記DEループ配列のC末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドE配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  6. 前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）：
    （e）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （f）配列番号6～9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
  7. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、RANKLタンパク質CDループ配列を含まない、請求項１～６のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  8. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i）又は（j）：
    （i）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
    （j）配列番号12～20のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  9. 前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が下記（i’）又は（j’）：
    （i’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列、又は
    （j’）配列番号12、15若しくは16に示されるアミノ酸配列に対して1～3個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、請求項１～７のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  10. 前記オリゴペプチドの長さが40アミノ酸残基長以下である、請求項１～９
    のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  11. 前記オリゴペプチドの長さが30アミノ酸残基長以下である、請求項１０に記載の予防又は治療剤。
  12. 前記炎症性皮膚疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎、扁平苔癬、掌蹠膿疱症、及び水疱症からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～１１のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  13. 前記炎症性皮膚疾患が乾癬及びアトピー性皮膚炎からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～１２のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  14. RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
    前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
    （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
    （b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、オリゴペプチドを含有する、Toll様受容体7経路及びToll様受容体8経路からなる群より選択される少なくとも1種の経路の抑制剤。
  15. RANKLタンパク質DEループ配列、及び該DEループ配列のN末端側に隣接して配置されたRANKLタンパク質βストランドD配列を含むアミノ酸配列からなり、
    前記DEループ配列が下記（a）又は（b）：
    （a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
    （b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列
    である、オリゴペプチドを含有する、炎症性皮膚疾患の予防又は治療用外用剤。
     
PCT/JP2017/040115 2016-11-07 2017-11-07 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤 WO2018084311A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018549113A JP6710416B2 (ja) 2016-11-07 2017-11-07 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤
US16/345,028 US11819537B2 (en) 2016-11-07 2017-11-07 Preventive or therapeutic method for inflammatory skin disease
EP17867950.2A EP3536382A4 (en) 2016-11-07 2017-11-07 PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR INFLAMMATORY SKIN DISEASES

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016216958 2016-11-07
JP2016-216958 2016-11-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018084311A1 true WO2018084311A1 (ja) 2018-05-11

Family

ID=62076547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/040115 WO2018084311A1 (ja) 2016-11-07 2017-11-07 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11819537B2 (ja)
EP (1) EP3536382A4 (ja)
JP (1) JP6710416B2 (ja)
WO (1) WO2018084311A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200062975A (ko) * 2018-11-27 2020-06-04 서상준 아토피성 질환의 완화 및 치료용 패드
WO2022071220A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07 国立大学法人大阪大学 Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制剤

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030003639A (ko) * 2001-06-30 2003-01-10 영 근 권 Ｔｒａｎｃｅ를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법
JP2005514919A (ja) * 2001-10-15 2005-05-26 バーンズ−ジューイッシュ ホスピタル 骨抗吸収化合物
JP2009536171A (ja) 2006-05-08 2009-10-08 イーエムベーアー−インスティトゥート・フューア・モレクラレ・ビオテヒノロギー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング Ｒａｎｋｌ活性を有する化合物の使用
WO2014051202A1 (ko) 2012-09-25 2014-04-03 (주)유양디앤유 작물의 발아 및 육묘 환경을 제공하는 조사료 재배장치
WO2016186071A1 (ja) * 2015-05-20 2016-11-24 国立大学法人大阪大学 炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有するオリゴペプチド

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014119438A1 (ja) 2013-01-29 2014-08-07 国立大学法人大阪大学 梗塞性疾患の予防又は治療用医薬

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030003639A (ko) * 2001-06-30 2003-01-10 영 근 권 Ｔｒａｎｃｅ를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법
JP2005514919A (ja) * 2001-10-15 2005-05-26 バーンズ−ジューイッシュ ホスピタル 骨抗吸収化合物
JP2009536171A (ja) 2006-05-08 2009-10-08 イーエムベーアー−インスティトゥート・フューア・モレクラレ・ビオテヒノロギー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング Ｒａｎｋｌ活性を有する化合物の使用
WO2014051202A1 (ko) 2012-09-25 2014-04-03 (주)유양디앤유 작물의 발아 및 육묘 환경을 제공하는 조사료 재배장치
WO2016186071A1 (ja) * 2015-05-20 2016-11-24 国立大学法人大阪大学 炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有するオリゴペプチド

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG, XIN ET AL.: "Disabling of Receptor Activator of Nuclear Factor-kB (RANK) Receptor Complex by Novel Osteoprotegerin-like Peptidomimetics Restores Bone Loss in Vivo", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 9, 2004, pages 8269 - 8277, XP055486198 *
J. IMMUNOL., vol. 182, 2009, pages 5836 - 45
KARLIN SALTSCHUL SF: "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 90, 1993, pages 5873 - 7, XP001030852, DOI: doi:10.1073/pnas.90.12.5873
KARLIN SALTSCHUL SF: "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 87, 1990, pages 2264 - 2268, XP001030853, DOI: doi:10.1073/pnas.87.6.2264
MOL ENDOCRINOL, vol. 23, no. 1, January 2009 (2009-01-01), pages 35 - 46
See also references of EP3536382A4
THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 108, no. 7, 2001, pages 971 - 979

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200062975A (ko) * 2018-11-27 2020-06-04 서상준 아토피성 질환의 완화 및 치료용 패드
KR102125625B1 (ko) 2018-11-27 2020-06-22 서상준 아토피성 질환의 완화 및 치료용 패드
WO2022071220A1 (ja) * 2020-10-02 2022-04-07 国立大学法人大阪大学 Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
EP3536382A4 (en) 2019-11-13
JP6710416B2 (ja) 2020-06-17
EP3536382A1 (en) 2019-09-11
US11819537B2 (en) 2023-11-21
US20190365859A1 (en) 2019-12-05
JPWO2018084311A1 (ja) 2019-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barr et al. PAR2 pepducin-based suppression of inflammation and itch in atopic dermatitis models
JP2017512757A (ja) 経口投与するためのペントサンポリ硫酸塩の組成物および使用の方法
US20180264080A1 (en) TOPICAL APPLICATIONS OF Kv1.3 CHANNEL BLOCKING PEPTIDES TO TREAT SKIN INFLAMMATION
US20220106359A1 (en) Inhibitors of nf kappa-b activity for treatment of diseases and disorders
JP6710416B2 (ja) 炎症性皮膚疾患の予防又は治療剤
JP5336384B2 (ja) Ｍｎｔｆペプチドおよびその類似体を用いて神経細胞障害を治療する方法
Stegemann et al. The α7 nicotinic acetylcholine receptor: a promising target for the treatment of fibrotic skin disorders
US10517926B2 (en) Oligopeptide having proinflammatory cytokine secretion-inhibiting activity
JP2023126760A (ja) 抗炎症剤
WO2021132201A1 (ja) 脱髄疾患の予防又は治療剤
WO2014095977A1 (en) Novel pellino peptide
JP7464310B2 (ja) Ｗｎｔシグナル伝達経路の抑制剤
JP2018507853A (ja) 代謝障害の治療薬としてのデルマトポンチン
Qiu et al. Continuous injection of high-dose lipopolysaccharide modulates microglia polarization via TREM2 to alter the status of septic mice
CA2957714A1 (en) Myristoylated leptin-related peptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17867950

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018549113

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017867950

Country of ref document: EP

Effective date: 20190607