WO2014119438A1 - 梗塞性疾患の予防又は治療用医薬 - Google Patents

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WO2014119438A1
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rankl
infarction
therapeutic drug
infarct
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宗尚 島村
啓徳 中神
マリアナ キョウミ オオサコ
森下　竜一
仁美 栗波
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国立大学法人大阪大学
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    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the prevention or treatment of infarct diseases.
  • Infarct diseases such as cerebral infarction and myocardial infarction are caused by ischemic sites caused by vascular occlusion.
  • ischemic sites caused by vascular occlusion.
  • oxygen and nutrients do not reach the surrounding site, and at the same time or along with this, an inflammatory reaction and free radical generation occur, and the necrotic site expands in a short period of time. Go. Therefore, for the treatment of infarct diseases, it is extremely important to administer an effective therapeutic agent relatively early after the occurrence of an ischemic site.
  • thrombolytic agents tissue plasminogen activator
  • thrombolytic drugs need to be administered within 3 hours after the occurrence of the ischemic site, patients with completely unknown ischemic site time or have already passed 3 hours after the occurrence of the ischemic site. Cannot be used for existing patients. Therefore, there is a need for the development of a therapeutic agent that exerts an effect on infarct disease even if administered after 3 hours or more after the occurrence of an ischemic site.
  • RANKL Receptor Activator of NF ⁇ B Ligand
  • NF ⁇ B IL-6 and TNF ⁇
  • RANKL IL-6 and TNF ⁇ , which are inflammatory cytokines, as the name implies. It is unclear whether RANKL actually suppresses the inflammatory response and exerts a therapeutic effect on infarct diseases. Further, in view of the fact that steroid therapy that suppresses inflammatory response is not effective for infarct disease, it can be said that it is unclear whether simply suppressing inflammatory response is effective for treating infarct disease.
  • An object of the present invention is to provide a preventive or therapeutic drug for infarct diseases.
  • Non-patent Document 2 Non-patent Document 2
  • PPAR ⁇ PPAR ⁇
  • the present inventors have found that RANKL protein not only enhances the expression of anti-inflammatory cytokines but also expresses PPAR ⁇ (Non-patent Document 2), which has an action of suppressing the expansion of necrotic sites. It was found to enhance. And it discovered that the expansion of the necrosis site was actually suppressed by the RANKL protein. It was also surprisingly found that the RANKL protein can suppress the expansion of the necrotic site even when administered after 3 hours or more after the occurrence of the ischemic site. As a result of further research based on these findings, the present invention was completed.
  • Item 1 A medicament for the prevention or treatment of infarct diseases containing RANKL protein.
  • Item 2. Item 2. The preventive or therapeutic drug according to Item 1, wherein the infarct disease is infarction.
  • Item 3. Item 1 or 2 wherein the infarct disease is at least one selected from the group consisting of cerebral infarction, myocardial infarction, pulmonary infarction, renal infarction, acute limb occlusion, and cerebral infarction due to vasospasm after subarachnoid hemorrhage Or a preventive or therapeutic drug according to 1.
  • Item 4. Item 4.
  • the RANKL protein is at least one selected from the group consisting of the protein described in (e) below and the protein described in (f) below: (E) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, (F) A protein comprising an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, and having a RANK protein binding activity.
  • Item 5. The preventive or therapeutic drug according to Item 4, wherein the RANKL protein is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the preventive or therapeutic drug according to any one of Items 1 to 5, which is a subcutaneously administered agent, a transarterial agent, or a intravenous agent.
  • Item 7. RANKL protein for use in the prevention or treatment of infarct disease.
  • Item 8. Item 7. A method for preventing or treating an infarct disease comprising administering the prophylactic or therapeutic drug according to any one of items 1 to 6 to a patient having an infarct disease or a subject who may develop the infarct disease. .
  • an excellent preventive or therapeutic drug for infarct diseases can be provided.
  • This prophylactic or therapeutic drug can be applied to a larger number of patients because it can exert a therapeutic effect on an infarcted disease even if it is administered 3 hours or more after the occurrence of an ischemic site.
  • the preventive or therapeutic drug of the present invention can exert a therapeutic effect by subcutaneous administration or the like, instead of direct administration to the affected area of the infarct disease. Therefore, by using the preventive or therapeutic drug of the present invention, it is possible to simply prevent or treat an infarct disease.
  • RANKL protein It shows that the expression of inflammatory cytokines is suppressed by RANKL protein. It shows that the expression of anti-inflammatory cytokines is enhanced by RANKL protein. It shows that the expression of PPAR ⁇ is enhanced by RANKL protein. It shows that neuronal cell death by LPS is suppressed by RANKL protein. It shows that cytokine production by LPS is suppressed by RANKL protein. It shows that neuronal cell death by LPS is suppressed by RANKL protein. It shows that infarction is suppressed by OPG knockout that enhances the function of RANKL protein. It shows that infarction is suppressed by intraventricular administration of RANKL protein.
  • infarction is suppressed even when RANKL protein is administered 3 hours or more (4 hours) after the occurrence of an ischemic site. It shows that infarction is suppressed even when RANKL protein is administered 3 hours or more (6 hours) after the occurrence of an ischemic site. It shows that infarction is suppressed even when RANKL protein is administered subcutaneously.
  • the present invention relates to a medicament for the prevention or treatment of infarct diseases containing RANKL protein.
  • RANKL protein is not particularly limited as long as it is a protein having RANK binding activity.
  • RANKL proteins derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits can be employed.
  • the RANKL protein may be a full-length (transmembrane) RANKL protein or a soluble RANKL protein lacking the N-terminal region of the full-length RANKL protein.
  • the RANKL protein may be other isoforms.
  • the human full-length RANKL protein includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the human soluble RANKL protein includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the mouse full-length RANKL protein includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the mouse soluble RANKL protein includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and human RANKL protein
  • isoforms of SEQ ID NO: 1 from the protein consisting of amino acid sequences 74 to 317 (SEQ ID NO: 5) of SEQ ID NO: 1 and from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to amino acids 48 to 317 (SEQ ID NO: 6)
  • the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • (b ′) one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6. And a protein having a RANK protein binding activity.
  • (d ′) one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. And a protein having a RANK protein binding activity.
  • (f ′) an amino acid in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4
  • examples thereof include a protein comprising a sequence and having a RANK protein binding activity.
  • the plurality is, for example, 2 to 25, preferably 2 to 15, more preferably 2 to 10, More preferably, it is 2 to 5, and particularly preferably 2 to 3.
  • the site to be substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 is RANK protein binding activity It is preferable to select a site that does not affect the above.
  • the site that affects the RANK protein binding activity can be determined based on the information described in Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4, for example.
  • RANK protein binding activity can be determined, for example, as follows.
  • macrophage cells eg, RAW264.7 cells
  • the amount of anti-inflammatory cytokine (eg, IL-10) or PPAR ⁇ expressed compared to when a control protein (eg, BSA) is introduced Can be determined that the protein has RANK protein binding activity.
  • an infarcted disease means a state in which a necrotic site in a tissue around the ischemic site is expanded or expanded due to the occurrence of an ischemic site.
  • Examples of the cause of the ischemic site include vascular occlusion caused by clogging of blood vessels with thrombus, embolism, and the like.
  • Examples of the cause of vascular occlusion include clogging of blood vessels with thrombi and emboli, and stenosis of blood vessels.
  • Specific infarct diseases include, for example, cerebral infarction, myocardial infarction, pulmonary infarction, renal infarction, acute arterial occlusion of the lower limbs, cerebral infarction due to vasospasm after subarachnoid hemorrhage, infarction in spleen, infarction in liver, intestinal tract Infarction, testicular infarction, ovarian infarction, etc., preferably cerebral infarction, cerebral infarction due to vasospasm after subarachnoid hemorrhage, cerebral infarction, myocardial infarction, pulmonary infarction, renal infarction, acute limb occlusion An infarction is mentioned, More preferably, a cerebral infarction and myocardial infarction are mentioned, More preferably, a cerebral infarction is mentioned.
  • prevention or treatment of infarct disease means that administration of the medicament of the present invention before and after the occurrence of an ischemic site suppresses the expansion of a necrotic site that occurs around the ischemic site.
  • the preventive or therapeutic drug of the present invention can be the RANKL protein itself, or can be a composition containing components other than the RANKL protein (hereinafter sometimes simply referred to as “additives”).
  • the additive is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable ingredient.
  • a base a carrier, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder
  • examples include disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, and chelating agents.
  • the preventive or therapeutic drug of the present invention contains an additive, the preventive or therapeutic drug of the present invention can be produced by using the additive according to a conventional method according to the dosage form.
  • the preventive or therapeutic medicament of the present invention can be in any dosage form such as tablets, pills, powders, solutions, injections, suspensions, emulsions, powders, granules, capsules, etc. Preferably it is an injection.
  • the subject of administration of the preventive or therapeutic drug of the present invention is an infarct disease patient or a subject who may develop an infarct disease.
  • An infarct disease patient is a patient who has developed the aforementioned infarct disease.
  • a subject that has the possibility of developing an infarct disease is a subject that has been diagnosed as having a predictive symptom of the aforementioned infarct disease and that may develop an infarct disease.
  • Examples of the administration route of the preventive or therapeutic drug of the present invention include parenteral administration. More specific administration routes include administration to organs with infarcted disease, subcutaneous administration, intravenous administration, transarterial administration, intradermal administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intracardiac administration, brain Indoor administration, subarachnoid administration, and intraperitoneal administration are included.
  • the preventive or therapeutic drug of the present invention exhibits an effect, for example, by subcutaneous administration, intravenous administration, transarterial administration, or intradermal administration, without direct administration to an organ that has developed an infarct disease. It is excellent in that it can
  • the content of the RANKL protein in the preventive or therapeutic drug of the present invention is not particularly limited as long as the therapeutic effect on infarct disease can be exhibited.
  • it can be 0.00001% by weight or more, preferably 0.0001 to 1% by weight.
  • the administration form and effective dosage of the preventive or therapeutic drug of the present invention depend on the administration subject, administration route, dosage form, patient condition, doctor's judgment, etc., and are not limited, for example, An adult weighing 60 kg can be administered 1 kg to 10 ⁇ g per dose.
  • the administration form is preferably administered several times after the occurrence of the ischemic site, for example, every 1 to several tens of hours.
  • the therapeutic drug of the present invention is excellent in that the effect can be exerted even if the first administration is performed after 3 hours or more have passed after the occurrence of the ischemic site. Therefore, the therapeutic drug of the present invention is administered the first time immediately after the occurrence of an ischemic site, after 1 hour or more, after 3 hours, after 4 hours, or after 6 hours or more. Can be used.
  • the preventive or therapeutic drug of the present invention may be used in combination with other prophylactic or therapeutic drugs for infarct diseases.
  • prophylactic or therapeutic agents include alteplase, edaravone, heparin, low molecular weight heparin, ozagrel sodium, argatroban, aspirin, brazaxa, warfarin, glycerol, mannitol, clopidogrel, and cilostazol.
  • Other preventive or therapeutic drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • Example 1 Inhibition of inflammatory cytokine expression by RANKL protein After RANKL protein was allowed to act on macrophages, the expression level of inflammatory cytokines secreted from macrophages was measured. Specifically, it was performed as follows.
  • THP1 cells human monocyte cells
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • THP1 cells were differentiated into macrophages.
  • the medium was mixed with IFN ⁇ protein (Peprotech, # 315-05) (final concentration 20 ng / ml), RANKL protein (Recombinant Murin sRANKL Ligand (Cat No.315-11) ): PEPROTECH) (changed to RPMI medium (+ 4% FBS) containing final concentration of 10 ng / ml) and cultured for 24 hours.
  • CT indicates a group in which none of IFN ⁇ protein, RANKL protein, and free fatty acid is allowed to act
  • FFA indicates that free fatty acid is acted
  • IFN indicates that IFN ⁇ is acted on
  • RL indicates that the RANKL protein was allowed to act (the same applies to the notations in FIGS. 2 and 3).
  • Example 2 Increased expression of anti-inflammatory cytokine by RANKL protein After the RANKL protein was allowed to act on macrophages, the expression level of anti-inflammatory cytokines secreted from the macrophages was measured. Specifically, it was performed as follows.
  • RAW cells (mouse-derived macrophage-like cells) were cultured in DMEM medium (+ 10% FBS) for 48 hours.
  • DMEM medium containing RANKL protein final concentration 10 ng / ml
  • IFN ⁇ protein final concentration 20 ng / ml
  • IL-4 protein Peprotech, # 214-14
  • the medium was replaced with (+ 4% FBS) and cultured for 24 hours.
  • total RNA was extracted from RAW cells, and the expression level of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, was measured by realtime RT-PCR. The measurement results are shown in FIG.
  • FIG. 2 shows that the expression of anti-inflammatory cytokine (IL-10) is enhanced by the action of RANKL protein (comparison between CT and RL, comparison between IFN and IFN + RL, and IL-4). And IL-4 + RL).
  • Example 3 Increased expression of PPAR ⁇ by RANKL protein After allowing RANKL protein to act on macrophages, the expression level of PPAR ⁇ secreted from macrophages was measured. Specifically, it was performed as follows.
  • the medium was RPMI medium (+ 4% FBS) containing IFN ⁇ protein (final concentration 20 ⁇ ng / ml) and RANKL protein (final concentration 10 ⁇ ng / ml). And cultured for 24 hours. After culture, total RNA was extracted from THP1 cells, and the expression level of PPAR ⁇ was measured by realtime RT-PCR. The measurement results are shown in FIG.
  • FIG. 3 shows that the expression level of PPAR ⁇ is increased by the action of RANKL protein (comparison between CT and RL).
  • PPAR ⁇ is known to suppress the expansion of a necrotic site accompanying the occurrence of an ischemic site (Non-patent Document 2). From this, it was found that RANKL is useful for the treatment of infarct diseases.
  • Example 4 Protective effect of RANKL protein on nerve cells (neuron cell-glia cell mixed culture system) It was investigated whether neuronal cell death caused by lipopolysaccharide (LPS), which induces an inflammatory response, is suppressed by the action of RANKL before addition of LPS or simultaneously with LPS. Specifically, it was performed as follows.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Nerve tissue (mixed state of nerve cells and glial cells) was taken out from mouse fetuses on the 21st day after fertilization (embryonic day 21) and cultured in Neurobasal medium (+ B-27, + 5% HS) for 10 days (before RANKL) Treatment group).
  • a RANKL pretreatment group a group in which RANKL protein was added to a final concentration of 100 ng / ml on the ninth day of culture and further cultured for 24 hours was prepared.
  • a RANKL day pretreatment group a group to which BSA was added to a final concentration of 100 ⁇ g / ml was also prepared.
  • the medium was replaced with Neurobasal medium (+ N2, + 1% HS) containing LPS (final concentration 100 ⁇ g / ml) or RANKL protein (final concentration 100 ⁇ ng / ml) and cultured for 5 days.
  • Immunstaining was performed using an antibody against MAP2 which is a neuronal marker (Sigma-Aldrich, M4403), and the ratio of the stained area on the culture dish (representing the amount of remaining neurons) was measured.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • Normal indicates a RANKL non-pretreated group and none of LPS, BSA, and RANKL protein is allowed to act
  • BSA indicates a BSA pretreated group (RANKL non-pretreated group).
  • RANKL is a RANKL pre-treatment group and LPS is acted on
  • RANKL simu is a RANKL non-pre-treatment group and RANKL is simultaneously treated with LPS. The group which acted is shown.
  • FIG. 4 shows that neuronal cell death due to LPS is suppressed both when RANKL is allowed to act before addition of LPS and when RANKL is allowed to act simultaneously with LPS (BSA and RANKL or RANKL). Comparison with simu).
  • LPS ⁇ is the LPS untreated group
  • LPS + is the LPS treated group
  • RANKL ⁇ - is a group that has not been pre-treated with RANKL before LPS treatment
  • RNS 10 is a group that has been pre-treated with RANKL at a concentration of 10 ng / ml
  • RRANKL 100 is a group that is 100 ng.
  • FIG. 5 shows that when RANKL is allowed to act before LPS is added, cytokine production by LPS is suppressed.
  • Example 5 Protecting effect of RANKL protein on nerve cells (neuron cell single culture system) It was investigated whether neuronal cell death caused by culturing neurons in a macrophage culture medium in which an inflammatory reaction was induced by LPS was suppressed by the action of RANKL protein. Specifically, it was performed as follows.
  • the medium was replaced with Neurobasal medium (+ N2, + 1% HS) containing RANKL protein (final concentration 10 ng / ml) and cultured for 24 hours. Thereafter, LPS was added to a final concentration of 10 ng / ml and cultured for 24 hours, and the cultured medium (macrophage culture medium) was recovered.
  • hippocampal neurons were taken out of mouse fetuses at 16-18 days after fertilization (embryo) and cultured in Neurobasal medium (+ B27, + 5% HS) for 14 days. Thereafter, this medium was replaced with a macrophage culture medium and cultured for 24 hours. After the culture, immunostaining was performed using an antibody against MAP2, which is a neuronal marker, and the ratio of the amount of staining around the observation field (representing the amount of remaining neurons) was measured. The results are shown in FIG.
  • Normal indicates a group in which neither LPS nor RANKL protein was allowed to act when preparing a macrophage culture medium
  • LPS indicates a group in which only LPS was allowed to act during the preparation
  • RANKL + LPS indicates a group in which both RANKL and LPS were allowed to act during the preparation.
  • FIG. 6 shows that neuronal cell death caused by culturing neurons in a macrophage culture medium in which an inflammatory reaction is induced by LPS is suppressed by the action of RANKL protein (LPS and RANKL + LPS). Comparison).
  • Example 6 Inhibition of necrosis by OPG knockout OPG protein antagonizes RANK protein, which is a true receptor of RANKL protein, as a so-called decoy receptor of RANKL protein (ligand). Since the binding ability of the RANKL protein to the OPG protein is higher than that of the RANKL protein to the RANK protein, the function of the RANKL protein is suppressed by the OPG protein. Therefore, in the state where OPG is knocked out, the function of the RANKL protein is enhanced. Thus, the effect of RANKL protein on the size of the necrotic site after cerebral ischemia was examined using OPG knockout mice. Specifically, it was performed as follows.
  • cerebral ischemic sites were artificially generated using embolic threads. Specifically, a nylon thread was inserted into the intracranial internal carotid artery from the right external carotid artery to temporarily occlude the right middle cerebral artery. The embolic thread was removed 45 minutes after the ischemic site and blood was reperfused. Three days after the occurrence of the ischemic site, the brain was taken out, and brain sections including the left brain part and the right brain part at positions 1.4, 0.7, and 0 mm before and after the bregma were prepared, and the sections were stained with cresyl violet. The area of the cresyl violet staining site was defined as the cerebral infarction area (necrosis site), and the ratio of the cerebral infarction area was determined by the following formula. The results are shown in FIG.
  • Ratio of cerebral infarction area ([normal side brain area] ⁇ ([cerebral infarction side total area] ⁇ [cerebral infarction area]) / normal side brain area) ⁇ 100
  • FIG. 7 shows that the OPG knockout mouse (OPG ⁇ / ⁇ ) in which the function of the RANKL protein is enhanced has a smaller cerebral infarction area after cerebral ischemia than the wild type mouse (WT). This suggests that the RANKL protein suppresses necrosis.
  • Example 7 Necrosis suppression by intraventricular administration of RANKL protein (administration within 3 hours after occurrence of ischemic site) The effect of intraventricular administration of RANKL protein on the size of the necrotic site after cerebral ischemia was examined. Specifically, it was performed as follows.
  • cerebral ischemic sites were generated in wild-type mice (C57BL6 / J). 70 minutes after ischemic site development, the embolic thread was removed and blood was reperfused. 75 minutes, 24 hours, and 48 hours after the occurrence of the ischemic site, 2 ⁇ l of RANKL protein solution (artificial cerebrospinal fluid (aCSF) containing RANKL protein at a concentration of 2.5 ⁇ ng / ⁇ l) was injected into the ventricle. Administered.
  • RANKL protein solution artificial cerebrospinal fluid (aCSF) containing RANKL protein at a concentration of 2.5 ⁇ ng / ⁇ l
  • the brain was taken out, a brain section including a left brain portion and a right brain portion at a position of 0 mm from bregma was prepared, and the section was stained with cresyl violet. Based on the staining result, the ratio of the cerebral infarction area was determined in the same manner as in Example 6. The results are shown in FIG.
  • FIG. 8 shows that the area of cerebral infarction that occurs after cerebral ischemia is smaller in the RANKL protein administration group (RANKL (75 min)) than in the RANKL protein non-administration group (aCSF). That is, it was shown that necrosis can be suppressed by administration of RANKL protein.
  • Example 8 Necrosis suppression by intracerebral administration of RANKL protein (administration after 3 hours or more after ischemic site development) It was investigated whether necrosis could be suppressed even when RANKL protein was administered 3 hours or more after the occurrence of ischemic sites. Specifically, the administration of the RANKL protein solution was performed in the same manner as in Example 7 except that the administration of the RANKL protein solution was performed 4 hours, 24 hours, and 48 hours after the occurrence of the ischemic site. The results are shown in FIG.
  • FIG. 9 shows that necrosis can be suppressed even when RANKL protein is administered 4 hours after the occurrence of ischemic site (comparison between aCSF and RANKL (4 hr)).
  • Example 9 Inhibition of necrosis by intracerebral administration of RANKL protein (administration after 3 hours or more after ischemic site development) It was investigated whether necrosis could be suppressed even when RANKL protein was administered 3 hours or more after the occurrence of ischemic sites. Specifically, the administration of the RANKL protein solution was performed in the same manner as in Example 7 except that the administration of the RANKL protein solution was performed 6 hours, 24 hours, and 48 hours after the occurrence of the ischemic site. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 shows that necrosis can be suppressed even when RANKL protein is administered 6 hours after the occurrence of the ischemic site (comparison between aCSF and RANKL (6 hr)).
  • Example 10 Necrosis inhibition by subcutaneous administration of RANKL (administration after 3 hours or more after the occurrence of ischemic site) It was investigated whether necrosis could be suppressed even when the RANKL protein administration site was subcutaneous. Specifically, 4 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, and 56 hours after the occurrence of the ischemic site, 200 ⁇ l of PBS containing RANKL protein at a concentration of 5 ⁇ g / ml on the back This was carried out in the same manner as in Example 7 except that the injection was carried out subcutaneously at one location. The results are shown in FIG.
  • FIG. 11 shows that necrosis can be suppressed even when RANKL is administered subcutaneously.

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Abstract

梗塞性疾患に対する治療用医薬を提供すること。特に、虚血部位の発生後3時間以上経過後に投与しても、梗塞性疾患に対して治療効果を発揮する医薬を提供すること。【解決手段】RANKLタンパク質を含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬。

Description

梗塞性疾患の予防又は治療用医薬
　本発明は、梗塞性疾患の予防又は治療用医薬に関する。
　脳梗塞や心筋梗塞などの梗塞性疾患は、血管閉塞等により虚血部位が生じることに起因する。通常、虚血部位が生じることによりその周辺部位に酸素や栄養が行き届かなくなり、さらにこれと同時に或いはこれに伴って炎症反応やフリーラジカル生成が起こることにより、壊死部位が短期間に拡大していく。したがって、梗塞性疾患の治療には、虚血部位の発生後、比較的早期に有効な治療薬を投与することが極めて重要となる。
　このような治療薬として、国際的に有効性が認められているものとしては、例えば血栓溶解薬（組織プラスミノーゲンアクチベーター）が知られている。しかしながら、血栓溶解薬は、虚血部位の発生後3時間以内に投与される必要があるので、虚血部位の発生時刻が全く不明である患者や既に虚血部位の発生後3時間以上経過している患者に対しては用いることができない。そこで、虚血部位の発生後3時間以上経過した後に投与しても梗塞性疾患に対して効果を発揮する治療薬の開発が求められている。
　RANKL（Receptor Activator of NFκB Ligand）は破骨細胞を活性化することにより骨吸収を促進する因子としてよく知られている。一部において、RANKLが炎症性サイトカインを抑制するという報告があるものの（非特許文献1）、そもそもRANKLは、その名称が示すようにNFκB（炎症性サイトカインであるIL-6やTNFαの発現を促進する機能を有する）を活性化する因子として発見されたものであるため、RANKLが実際に炎症反応を抑制して梗塞性疾患に対する治療効果を発揮するか否かは不明である。また、炎症反応を抑制するステロイド療法が梗塞性疾患に対して有効ではない実情に鑑みれば、単に炎症反応を抑制することが梗塞性疾患の治療に有効であるか否かも不明であるといえる。
The Journal of Immunology, 2006, 177: 3799-3805 The FASEB Journal, 2006, 20: 1162-1175 The Journal of Immunology, 2010, 184: 6910-6919 The Journal of Clinical Investigation, 2001, 108(7): 971-979
　本発明は、梗塞性疾患に対する予防又は治療用医薬を提供することを課題とする。特に、虚血部位の発生後3時間以上経過後に投与しても、梗塞性疾患に対して治療効果を発揮する医薬を提供することを課題とする。
　本発明者等は鋭意研究を進めた結果、RANKLタンパク質が、抗炎症性サイトカインの発現を亢進させるのみならず、壊死部位の拡大を抑制する作用を有するPPARγ（非特許文献2）の発現をも亢進させることを見出した。そして、実際にRANKLタンパク質により壊死部位の拡大が抑制されることを見出した。さらに驚くべきことに、RANKLタンパク質は、虚血部位の発生後3時間以上経過後に投与しても、壊死部位の拡大を抑制できることをも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
項１．RANKLタンパク質を含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬。
項２．梗塞性疾患が梗塞である項１に記載の予防又は治療用医薬。
項３．梗塞性疾患が脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、及びクモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞からなる群より選択される少なくとも１種である項１又は２に記載の予防又は治療用医薬。
項４．RANKLタンパク質が下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である項１～３のいずれかに記載の予防又は治療用医薬：
（e）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（f）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質。
項５．RANKLタンパク質が配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である項４に記載の予防又は治療用医薬。
項６．皮下投与剤、経動脈投与剤、又は経静脈投与剤である項１～５のいずれかに記載の予防又は治療用医薬。
項７．梗塞性疾患の予防又は治療における使用のための、RANKLタンパク質。
項８．項１～６のいずれかに記載の予防又は治療用医薬を、梗塞性疾患患者若しくは梗塞性疾患を発症する可能性がある被検体に投与することを包含する、梗塞性疾患の予防又は治療方法。
項９．梗塞性疾患の予防又は治療用医薬の製造におけるRANKLタンパク質の使用。
　本発明によれば、梗塞性疾患に対する優れた予防又は治療用医薬を提供することができる。この予防又は治療用医薬は、虚血部位の発生後3時間以上経過後に投与しても、梗塞性疾患に対して治療効果を発揮できるので、より多くの患者に対して適用することができる。さらに、本発明の予防又は治療用医薬は、梗塞性疾患患部への直接投与でなくとも、皮下投与等により治療効果を発揮することができる。したがって、本発明の予防又は治療用医薬を用いることにより、梗塞性疾患の予防又は治療を簡便に行うことができる。
RANKLタンパク質により炎症性サイトカインの発現が抑制されていることを示す。 RANKLタンパク質により抗炎症性サイトカインの発現が亢進していることを示す。 RANKLタンパク質によりPPARγの発現が亢進していることを示す。 LPSによる神経細胞死が、RANKLタンパク質によって抑制されていることを示す。 LPSによるサイトカインの産生が、RANKLタンパク質によって抑制されていることを示す。 LPSによる神経細胞死が、RANKLタンパク質によって抑制されていることを示す。 RANKLタンパク質の機能を亢進するOPGノックアウトにより梗塞が抑制されることを示す。 RANKLタンパク質の脳室内投与により梗塞が抑制されることを示す。 RANKLタンパク質を、虚血部位発生後3時間以上（4時間）経過後に投与しても、梗塞が抑制されることを示す。 RANKLタンパク質を、虚血部位発生後3時間以上（6時間）経過後に投与しても、梗塞が抑制されることを示す。 RANKLタンパク質を皮下投与しても梗塞が抑制されることを示す。
　本発明は、RANKLタンパク質を含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬に関する。
　RANKLタンパク質は、RANK結合活性を有するタンパク質である限り特に限定されない。RANKLタンパク質としては、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、及びウサギ等の種々の哺乳類由来のRANKLタンパク質を採用することができる。また、RANKLタンパク質としては、全長型（膜貫通型）RANKLタンパク質であってもよいし、全長型RANKLタンパク質のN末端側領域が欠失している可溶型RANKLタンパク質であってもよい。さらに、RANKLタンパク質は、その他のアイソフォームであってもよい。
　具体的には、例えば、ヒト全長型RANKLタンパク質としては配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ヒト可溶型RANKLタンパク質としては配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、マウス全長型RANKLタンパク質としては配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、マウス可溶型RANKLタンパク質としては配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、ヒトRANKLタンパク質のアイソフォームとしては配列番号1のアミノ酸番号74～317のアミノ酸配列（配列番号5）からなるタンパク質（アイソフォーム2）や、配列番号1のアミノ酸番号48～317のアミノ酸配列（配列番号6）からなるタンパク質（アイソフォーム3）が挙げられる。
　RANKLタンパク質として、
好ましくは、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質:
（a）配列番号1～6のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）配列番号1～6のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、
より好ましくは、下記（c）に記載するタンパク質及び下記（d）に記載するタンパク質:
（c）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（d）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、
よりさらに好ましくは、下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質:
（e）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（f）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
　上記（b）、（d）、及び（f）において、同一性は、好ましくは90％以上であり、より好ましくは95％以上であり、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1～6のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質が挙げられ、
上記（d）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（d’）配列番号1～4のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質が挙げられ、
上記（f）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（f’）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質が挙げられる。
　上記（b’）、（d’）、及び（f’）において、複数個とは、例えば2～25個であり、好ましくは2～15個であり、より好ましくは2～10個であり、よりさらに好ましくは2～5個であり、特に好ましくは2～3個である。
　上記（b）、（d）、又は（f）に記載されるタンパク質において、配列番号1～6に示されるアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加、又は挿入させる部位は、RANKタンパク質結合活性に影響を与えない部位を選択することが好ましい。RANKタンパク質結合活性に影響を与える部位は、例えば非特許文献3や非特許文献4に記載の情報に基づいて決定することができる。
　RANKタンパク質結合活性は、例えば次のように判定することができる。活性測定対象のタンパク質をマクロファージ細胞（例えばRAW264.7細胞）に導入した場合に、コントロールタンパク質（例えばBSA）を導入した場合に比べて、抗炎症性サイトカイン（例えばIL-10）やPPARγの発現量が増加していた場合は、該タンパク質がRANKタンパク質結合活性を有すると判定することができる。
　本発明において、梗塞性疾患とは、虚血部位が生じることに起因して、該虚血部位周辺の組織の壊死部位が拡大している状態又は拡大した状態を意味する。虚血部位が生じる原因としては、例えば、血栓や塞栓等が血管に詰まることにより生じる血管閉塞が挙げられる。血管閉塞の原因としては、例えば血栓や塞栓が血管に詰まることや、血管が狭窄することが挙げられる。
　具体的な梗塞性疾患としては、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、クモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞、脾臓における梗塞、肝臓における梗塞、腸管における梗塞、睾丸における梗塞、及び卵巣における梗塞等が挙げられ、好ましくは脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、クモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞、脾臓における梗塞が挙げられ、より好ましくは脳梗塞及び心筋梗塞が挙げられ、よりさらに好ましくは脳梗塞が挙げられる。
　本発明において、梗塞性疾患の予防または治療とは、虚血部位発生の前後に本発明の医薬を投与することにより、虚血部位周辺に生じる壊死部位の拡大が抑制されることを意味する。
　本発明の予防又は治療用医薬は、RANKLタンパク質そのものであることもできるし、RANKLタンパク質以外の成分（以下、単に「添加剤」と表記することもある）を含む組成物であることができる。添加剤としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。本発明の予防又は治療用医薬が添加剤を含む場合は、剤形に応じた慣用の方法に従って添加剤を用いることにより、本発明の予防又は治療用医薬を製造することができる。
　本発明の予防又は治療用医薬は、任意の剤形、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等であることができるが、好ましくは注射剤である。
　本発明の予防又は治療用医薬の投与対象は、梗塞性疾患患者若しくは梗塞性疾患を発症する可能性がある被検体である。梗塞性疾患患者とは、前述の梗塞性疾患を発症した患者である。梗塞性疾患を発症する可能性がある被検体とは、前述の梗塞性疾患の前兆症状が認められ、梗塞性疾患を発症する可能性があると診断された被検体である。
　本発明の予防又は治療用医薬の投与経路としては、例えば非経口投与が挙げられる。より具体的な投与経路としては、梗塞性疾患を発症している臓器への投与、皮下投与、経静脈投与、経動脈投与、皮内投与、筋肉内投与、骨内投与、心臓内投与、脳室内投与、クモ膜下投与、及び腹腔内投与が挙げられる。本発明の予防又は治療用医薬は、梗塞性疾患を発症している臓器に直接投与することによらず、例えば皮下投与、経静脈投与、経動脈投与、又は皮内投与することによって効果を発揮できる点で優れている。
　本発明の予防又は治療用医薬中の、RANKLタンパク質の含有量としては、梗塞性疾患に対する治療効果を発揮できる限りにおいて特に限定されない。例えば0.00001重量％以上、好ましくは0.0001～1重量％であることができる。
　本発明の予防又は治療用医薬の投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば、体重60 kgの成人に対して、1回当たり、1 ng～10μgを投与することができる。なお、投与形態としては、虚血部位の発生後、複数回、例えば1～数十時間毎に投与することが好ましい。本発明の治療用医薬は、虚血部位の発生後3時間以上経過した後に第1回目の投与を行っても効果を発揮できる点で優れている。したがって、本発明の治療用医薬は、虚血部位の発生直後、1時間以上経過後、3時間以上経過後、4時間以上経過後、又は6時間以上経過後に第1回目の投与を行うように用いられることができる。
　本発明の予防又は治療用医薬は、梗塞性疾患の他の予防又は治療薬と併用してもよい。他の予防又は治療薬としては、例えば、アルテプラーゼ、エダラボン、ヘパリン、低分子ヘパリン、オザグレルナトリウム、アルガトロバン、アスピリン、ブラザキサ、ワルファリン、グリセロール、マンニトール、クロピドグレル、及びシロスタゾール等が挙げられる。他の予防又は治療用医薬は１種又は２種以上を組み併せて用いてもよい。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例１：RANKLタンパク質による炎症性サイトカインの発現抑制
　マクロファージに対してRANKLタンパク質を作用させた後、マクロファージから分泌される炎症性サイトカインの発現量を測定した。具体的には次のように行った。
　PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）を終濃度5 ng/mlになるように添加したRPMI培地（＋10％FBS）中で、THP1細胞（ヒト由来単球用細胞）を48時間培養することにより、THP1細胞をマクロファージに分化させた。THP1細胞が培養ディッシュに付着したことを確認した後、培地を、IFNγタンパク質（Peprotech, #315-05）（終濃度20 ng/ml）、RANKLタンパク質（Recombinant Murin sRANKL Ligand（Cat No.315-11）：PEPROTECH社）（終濃度10 ng/ml）を含有するRPMI培地（＋4％FBS）に交換し、24時間培養した。その後、遊離脂肪酸の一種であるパルミチン酸を終濃度100μMになるように培地に添加し、12時間培養した。培養後、THP1細胞からtotal RNAを抽出し、炎症性サイトカインであるTNFα及びIL-6の発現量をrealtime RT-PCRで測定した。測定結果を図１に示す。
　図１中、「CT」は、IFNγタンパク質、RANKLタンパク質、及び遊離脂肪酸のいずれも作用させていない群を示し、「FFA」は遊離脂肪酸を作用させたことを示し、「IFN」はIFNγを作用させたことを示し、「RL」はRANKLタンパク質を作用させたことを示す（図２及び３の表記においても同様である）。
　図１より、マクロファージを活性化する機能を有する遊離脂肪酸、及び炎症性サイトカインの発現を誘導させる機能を有するIFNγを作用させることによる炎症性サイトカイン（TNFα及びIL-6）の発現量の増加（CT及びFFAと、IFN＋FFAとの比較）が、RANKLタンパク質をさらに作用させることにより抑制されることが示された（IFN＋FFAとIFN＋RL＋FFAとの比較）。
　実施例２：RANKLタンパク質による抗炎症性サイトカインの発現亢進
　マクロファージに対してRANKLタンパク質を作用させた後、マクロファージから分泌される抗炎症性サイトカインの発現量を測定した。具体的には次のように行った。
　DMEM培地（＋10％FBS）中でRAW細胞（マウス由来マクロファージ様細胞）を48時間培養した。培地を、RANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）、IFNγタンパク質（終濃度20 ng/ml）、IL-4タンパク質（Peprotech, #214-14）（終濃度20 ng/ml）を含有するDMEM培地（＋4％FBS）に交換し、24時間培養した。培養後、RAW細胞からtotal RNAを抽出し、抗炎症性サイトカインであるIL-10の発現量をrealtime RT-PCRで測定した。測定結果を図２に示す。
　図２より、RANKLタンパク質を作用させることにより、抗炎症性サイトカイン（IL-10）の発現が亢進することが示された（CTとRLとの比較、IFNとIFN＋RLとの比較、及びIL-4とIL-4＋RLとの比較）。
　実施例３：RANKLタンパク質によるPPARγの発現亢進
　マクロファージに対してRANKLタンパク質を作用させた後、マクロファージから分泌されるPPARγの発現量を測定した。具体的には次のように行った。
　実施例１と同様にTHP1細胞をマクロファージに分化させた後、培地を、IFNγタンパク質（終濃度20 ng/ml）、RANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）を含有するRPMI培地（＋4％FBS）に交換し、24時間培養した。培養後、THP1細胞からtotal RNAを抽出し、PPARγの発現量をrealtime RT-PCRで測定した。測定結果を図３に示す。
　図３より、RANKLタンパク質を作用させたことにより、PPARγの発現量が亢進することが示された（CTとRLとの比較）。PPARγは、虚血部位の発生に伴う壊死部位の拡大を抑制することが知られている（非特許文献2）。このことから、RANKLが梗塞性疾患の治療に有用である可能性が見出された。
　実施例４：RANKLタンパク質の神経細胞保護効果（神経細胞－グリア細胞混合培養系）
　炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）による神経細胞死が、LPSの添加前またはLPSと同時にRANKLを作用させることにより抑制されるか否かを調べた。具体的には次のように行った。
　受精後21日目（胎生21日目）のマウス胎児から神経組織（神経細胞及びグリア細胞の混合状態）を取り出し、Neurobasal培地（＋B-27、＋5％HS）で10日間培養した（RANKL非前処理群）。なお、RANKL前処理群として、培養9日目においてRANKLタンパク質を終濃度100 ng/mlになるように添加してさらに24時間培養した群も作成した。一方で、RANKL日前処理群として、BSAを終濃度100μg/mlになるように添加した群も作成した。その後、LPS（終濃度100μg/ml）、又はRANKLタンパク質（終濃度100 ng/ml）を含有するNeurobasal培地（＋N2、＋1％HS）に交換し、5日間培養した。培養後、神経細胞マーカーであるMAP2に対する抗体（Sigma-Aldrich, M4403）を用いて免疫染色し、培養ディッシュ上の染色面積の割合（残存神経細胞量を示す）を測定した。この測定結果を図４に示す。また、培養後の培地を回収し、該培地中のサイトカイン（TNFα及びIL-6）の濃度をELISAによって測定した。この測定結果を図５に示す。
　図４中、「Normal」は、RANKL非前処理群であってLPS、BSA、及びRANKLタンパク質のいずれも作用させていない群を示し、「BSA」はBSA前処理群（RANKL非前処理群）であってLPSを作用させた群を示し、「RANKL」はRANKL前処理群であってLPSを作用させた群を示し、「RANKL simu」はRANKL非前処理群であってLPSと同時にRANKLを作用させた群を示す。
　図４より、LPSの添加前にRANKLを作用させた場合、及びLPSと同時にRANKLを作用させた場合の両方において、LPSによる神経細胞死が抑制されることが示された（BSAとRANKL又はRANKL simuとの比較）。
　図５中、「LPS －」はLPS未処理群であり、「LPS ＋」はLPS処理群である。また、「RANKL －」は、LPS処理前にRANKL前処理していない群であり、「RANKL 10」は10 ng/mlの濃度でRANKL前処理した群であって、「RANKL 100」は100 ng/mlの濃度でRANKL前処理した群である。
　図５より、LPSの添加前にRANKLを作用させた場合、LPSによるサイトカインの産生が抑制されることが示された。
　実施例５：RANKLタンパク質の神経細胞保護効果（神経細胞単独培養系）
　LPSによって炎症反応が惹起されたマクロファージ培養培地中で神経細胞を培養することによる神経細胞死が、RANKLタンパク質を作用させることにより抑制されるか否かを調べた。具体的には次のように行った。
　実施例１と同様にTHP1細胞をマクロファージに分化させた後、培地を、RANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）を含有するNeurobasal培地（＋N2、＋1％HS）に交換し、24時間培養した。その後、LPSを終濃度10 ng/mlになるように添加して24時間培養し、培養後の培地（マクロファージ培養培地）を回収した。一方で、受精後（胎生）16～18日目のマウス胎児から海馬神経細胞を取り出し、Neurobasal培地（＋Ｂ27、＋5％HS）中で14日間培養した。その後、この培地を、マクロファージ培養培地に交換して24時間培養した。培養後、神経細胞マーカーであるMAP2に対する抗体を用いて免疫染色し、観察視野辺りの染色量の割合（残存神経細胞量を示す）を測定した。結果を図６に示す。
　図６中、「Normal」はマクロファージ培養培地を調製する際に、LPS及びRANKLタンパク質のいずれも作用させなかった群を示し、「LPS」は該調製の際にLPSのみを作用させた群を示し、「RANKL＋LPS」は該調製の際にRANKL及びLPSの両方を作用させた群を示す。
　図６より、LPSによって炎症反応が惹起されたマクロファージ培養培地中で神経細胞を培養することによる神経細胞死が、RANKLタンパク質を作用させることにより抑制されることが示された（LPSとRANKL＋LPSとの比較）。
　実施例６：OPGノックアウトによる壊死抑制
　OPGタンパク質は、RANKLタンパク質（リガンド）のいわゆるおとり受容体として、RANKLタンパク質の真の受容体であるRANKタンパク質と拮抗する。RANKLタンパク質のOPGタンパク質に対する結合性は、RANKLタンパク質のRANKタンパク質に対する結合性よりも高いため、OPGタンパク質によりRANKLタンパク質の機能が抑制される。したがって、OPGノックアウトされた状態においては、RANKLタンパク質の機能は亢進する。そこで、RANKLタンパク質が脳虚血後の壊死部位のサイズに与える影響を、OPGノックアウトマウスを用いて調べた。具体的には次のように行った。
　野生型マウス（C57BL6/J）及びOPGノックアウトマウス（日本クレア）に対して、塞栓糸を用いて人為的に脳虚血部位を発生させた。具体的には、右外頸動脈からナイロン糸を頭蓋内内頚動脈に挿入し右中大脳動脈を一過性に閉塞した。虚血部位発生から45分後に塞栓糸を取り除き、血液を再灌流させた。虚血部位発生から3日後に脳を取り出し、bregmaから前後に1.4、0.7、及び0 mmの位置における、左脳部分及び右脳部分を含む脳切片を作成し、該切片をcresyl violetで染色した。cresyl violet染色部位の面積を脳梗塞面積（壊死部位）とし、下記式により脳梗塞面積の割合を求めた。結果を図７に示す。
［数１］
脳梗塞面積の割合＝（［正常側脳面積］－（［脳梗塞側全面積］－［脳梗塞面積］）／正常側脳面積）×１００
　図７より、RANKLタンパク質の機能が亢進しているOPGノックアウトマウス（OPG－／－）では、野生型マウス（WT）に比べて、脳虚血後に生じる脳梗塞面積が小さいことが示された。このことは、RANKLタンパク質が壊死を抑制することを示唆する。
　実施例７：RANKLタンパク質の脳室内投与による壊死抑制（虚血部位発生後3時間以内の投与）
　RANKLタンパク質の脳室内投与が、脳虚血後の壊死部位のサイズに与える影響を調べた。具体的には次のように行った。
　野生型マウス（C57BL6/J）に対して、実施例６と同様に脳虚血部位を発生させた。虚血部位発生から70分後に、塞栓糸を取り除き、血液を再灌流させた。虚血部位発生から75分後、24時間後、及び48時間後に、2μlのRANKLタンパク質溶液（2.5 ng/μlの濃度でRANKLタンパク質を含有する人工脳脊髄液（aCSF））を、注射により脳室内に投与した。虚血部位発生から72時間後に脳を取り出し、bregmaから0 mmの位置における、左脳部分及び右脳部分を含む脳切片を作成し、該切片をcresyl violetで染色した。該染色結果に基づいて、実施例６と同様に脳梗塞面積の割合を求めた。結果を図８に示す。
　図８より、RANKLタンパク質非投与群（aCSF）に比べて、RANKLタンパク質投与群（RANKL(75 min)）においては、脳虚血後に生じる脳梗塞面積が小さいことが示された。すなわち、RANKLタンパク質投与により壊死を抑制できることが示された。
　実施例８：RANKLタンパク質の脳質内投与による壊死抑制（虚血部位発生後3時間以上経過後の投与）
　虚血部位発生後3時間以上経過後にRANKLタンパク質を投与しても、壊死を抑制できるか否かを調べた。具体的には、RANKLタンパク質溶液の投与を、虚血部位発生から4時間後、24時間後、及び48時間後に行う以外は実施例７と同様に行った。結果を図９に示す。
　図９より、虚血部位発生後4時間経過後にRANKLタンパク質を投与しても、壊死を抑制できることが示された（aCSFとRANKL(4 hr)との比較）。
　実施例９：RANKLタンパク質の脳質内投与による壊死抑制（虚血部位発生後3時間以上経過後の投与）
　虚血部位発生後3時間以上経過後にRANKLタンパク質を投与しても、壊死を抑制できるか否かを調べた。具体的には、RANKLタンパク質溶液の投与を、虚血部位発生から6時間後、24時間後、及び48時間後に行う以外は実施例７と同様に行った。結果を図１０に示す。
　図１０より、虚血部位発生後6時間経過後にRANKLタンパク質を投与しても、壊死を抑制できることが示された（aCSFとRANKL(6 hr)との比較）。
　実施例１０：RANKL皮下投与による壊死抑制（虚血部位発生後3時間以上経過後の投与）
　RANKLタンパク質の投与部位が皮下であっても、壊死を抑制できるか否かを調べた。具体的には、虚血部位発生から4時間後、12時間後、24時間後、36時間後、48時間後、及び56時間後に、5μg/mlの濃度でRANKLタンパク質を含有するPBS 200μlを背部の一箇所の皮下に注射する以外は、実施例７と同様に行った。結果を図１１に示す。
　図１１より、RANKLを皮下投与しても、壊死を抑制できることが示された。

Claims (8)

  1. RANKLタンパク質を含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬。
  2. 梗塞性疾患が梗塞である請求項１に記載の予防又は治療用医薬。
  3. 梗塞性疾患が脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、及びクモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載の予防又は治療用医薬。
  4. RANKLタンパク質が下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～３のいずれかに記載の予防又は治療用医薬：
    （e）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （f）配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つRANKタンパク質結合活性を有するタンパク質。
  5. RANKLタンパク質が配列番号3又は4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項４に記載の予防又は治療用医薬。
  6. 皮下投与剤、経動脈投与剤、又は経静脈投与剤である請求項１～５のいずれかに記載の予防又は治療用医薬。
  7. 梗塞性疾患の予防又は治療において使用されるための、RANKLタンパク質。
  8. 請求項１～６のいずれかに記載の予防又は治療用医薬を、梗塞性疾患患者若しくは梗塞性疾患を発症する可能性がある被検体に投与することを包含する、梗塞性疾患の予防又は治療方法。
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