KR20030003639A - Ｔｒａｎｃｅ를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조골세포형성과 관련된 것으로 알려진 종양괴사인자관련 활성유도 사이토카인(TRANCE)을 이용한 혈관신생 촉진방법에 관한 것이다. 본 발명의 TRANCE를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법은 혈관이 형성되지 않은 조직에 TRANCE를 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, TRANCE를 처리하여 혈관신생을 촉진시킬 수 있으므로, 화상, 건선, 궤양, 허혈, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등에 의하여 손상된 조직의 회복에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＴＲＡＮＣＥ를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법{Method for Promoting Angionenesis Using TNF-related Activation-induded Cytokine(TRANCE)}

본 발명은 TRANCE를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 조골세포형성과 관련된 것으로 알려진 TRANCE를 이용한 혈관신생 촉진방법에 관한 것이다.

기존 혈관내피로부터 새로운 혈관이 형성되는 현상인 혈관신생은 상처의 수복, 배아발생, 만성염증, 종양성장 등 여러 가지 생리학적 병리학적 효과를 일으키게 하는 중요한 과정이다. 혈관생성 과정은 생장인자, 싸이토카인, 지질대사물질과 지혈 단백질의 잠재성 단편 등 여러 종류의 촉진인자와 억제인자에 의해 엄격하게 통제되는 것으로 알려져 있다. 지금까지 보고된 혈관신생 촉진인자는 크게 두가지로 분리된다: 즉, 세포증식, 세포이동 및 중배엽 형태형성을 유도하는 VEGF와 bFGF 등의 직접유도인자와 내피세포내의 면역세포, 종양세포와 같은 부세포(accessary cell)로부터 직접적 혈관형성요인에 의해 생성되는 간접유도인자로 나누어진다.

한편, ODF(osteoclast differentiation factor), RANKL(receptor activator of NFkB ligand), OPGL(osteoprotegerin lignad)과 함께 TNF 리간드 그룹에 속하는 종양괴사인자관련 활성유도 사이토카인(TNF-related activation-induded cytokine,TRANCE)은 316개의 아미노산으로 구성된 막단백질이다(참조: Wong, B. R. et al., J. Biol. Chem., 272(40):25190-25194, 1997)). TRANCE의 세포외 도메인은 TNF와 약 20% 정도의 상동성을 나타내고, 금속성 단백질분해효소에 의해 분해되어, 수용성 형태로 존재할 수도 있으며, 주로 수용체와 결합된 TRANCE-R/RANK(TRANCE-Receptor/receptor activator of NFkB)의 형태로 존재한다. 전기 TRANCE는 병원체 감염에 대한 수지상 세포의 생존율을 증가시키고, T 세포의 작용을 조절하며, 조골세포에서도 높은 수준으로 발현되어, 칼슘대사와 혈액전구체에서 유래된 파골세포분화에도 중요한 작용을 한다. 최근, 쥐에서 TRANCE는 NF-kB의 활성화요소 수용체(RANK, receptor activator of NF-kB)에 결합하여, 골조직 손실과 연골조직 파괴를 조절함이 보고되었는데, RANK는 성숙한 수지상세포, 연골세포, 파골세포의 전구체와 성숙한 파골세포에서 발견되며, 조골세포는 TRANCE를 발현시킴으로써, 연골조직으로 이동하는 내피세포의 표면에서 RANK와 상호작용을 일으킬수 있음이 알려져 있다. 이에, TRANS가 파골세포의 분화와 뼈 형성에 미치는 영향을 규명한다면, 골조직의 파괴를 나타내는 퇴행성 질환의 치료에 전기를 마련할 것으로 기대되어, 많은 연구가 진행되고 있으나, 이에 대한 연구결과는 보고되지 않고있는 실정이다.

따라서, TRANS가 파골세포의 분화와 뼈 형성에 작용하는 기능을 규명하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 TRANS가 파골세포의 분화와 뼈 형성에 작용하는 기능을 규명하고자 예의 연구노력한 결과, TRANCE가 생체내에서 골조직의 형성시 혈관신생을 유도하고, 혈관신생과 관련된 내피세포의 분열, 이동 및 형태형성을 활성화시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 TRANCE를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 TRANCE와 VEGF를 처리한 HUVEC의 DNA 합성량을 측정한 그래프이다.

도 2는 TRANCE와 VEGF의 효과에 대한 VEGF의 항체의 역할을 나타내는 그래프이다.

도 3은 TRANCE의 농도에 따른 세포이동성을 나타내는 그래프이다.

도 4a는 대조군의 매트리젤을 나타내는 사진이다.

도 4b는 실험군의 매트리젤을 나타내는 사진이다.

도 4c는 대조군에 대한 실험군의 관형성정도를 나타내는 그래프이다.

도 5a는 대조군의 CAM을 나타내는 현미경사진이다.

도 5b는 비교군의 CAM을 나타내는 현미경사진이다.

도 5c는 실험군의 CAM을 나타내는 현미경사진이다.

도 5d는 전체 CAM의 수에 대한 혈관신생을 나타내는 CAM의 수를 실험군과 대조군을 비교하여 나타내는 그래프이다.

도 6a는 대조군의 매트리젤을 나타내는 현미경사진이다.

도 6b는 대조군의 매트리젤을 나타내는 현미경사진이다.

도 6c는 대조군과 실험군에서 생성된 혈관의 면적을 비교한 그래프이다.

본 발명의 TRANCE를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법은 혈관이 형성되지 않은 조직에 TRANCE를 처리하는 단계를 포함한다: 이때, 혈관이 형성되지 않은 조직은 화상, 건선, 궤양, 허혈, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등에 의하여 손상된 후, 새로이 형성된 진피조직, 근육조직 또는 결합조직이다.

본 발명자들은 TRANCE가 수지상세포와 파골세포내에서의 ERKs, AKT 및 NF-kB 의 신호전달과정을 유발시킨다는 점에 착안하여, TRANCE가 혈관신생을 유도할 수 있는지 알아본 결과, TRANCE는 사람의 탯줄정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)의 증식을 촉진시키고, 주화성 이동(chemotactic motility)의 측정으로 인한 세포이동을 조사한 결과, TRANCE를 처리한 경우 세포의 이동성이 증가시키며, TRANCE의 생체내에서의 혈관신생 측정을 위하여 CAM 실험을 수행한 결과, TRANCE가 신생혈관 형성을 촉진함을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: TRANCE에 의해 유도되는 HUVEC에서의 DNA 합성

HUVEC을 24-웰 플레이트에 넣어 세포들을 성장배지(M199(Sigma Chem. Co., U.S.A.), 20%(v/v) fetal bovine serum(FBS), 100 units/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신, 3ng/ml bFGF, 5units/ml 헤파린)에서 37℃, 95%(v/v) CO₂, 5%(v/v) 공기의 조건으로, 24시간 동안 배양시킨 후, 배지를 1%(v/v) FBS를 포함하는 성장배지로 교환하여 동일한 조건에서 6시간 동안 배양하였다. 이어, 5㎍/ml의 농도로 TRANCE를 처리한 실험군, 혈관세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려진 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 처리한 대조군 및 아무것도 처리하지 않은 무처리군(CON)을 준비하고, 전기 실험군, 대조군 및 무처리군에³H-티미딘을 첨가한 후, 동일조건에서 6시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포를 분쇄하고, 이에 5%(v/v)가 되도록 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 첨가하여, 배양액의 고분자물질을 침전시키고, 0.2N NaOH를 첨가하여 중화시킨후, 이 중 새로이 합성되어 방사선 물질을 포함하는 DNA의 양을 측정하였다(참조: 도 1) 도 1은 TRANCE와 VEGF를 처리한 HUVEC의 DNA 합성량을 측정한 그래프이다. 도 1에서 보듯이, TRANCE를 처리한 경우, VEGF의 효과보다는 낮았으나, DNA 합성량이 증가함을 나타내어, HUVEC세포의 증식에 있어서, VEGF와는 다른 역할을 수행함을 시사하였다.

실시예 2: TRANCE와 VEGF와의 관련성 측정

상기 실시예 1로부터, TRANCE가 VEGF와는 독립적으로 작용할 것이라고 추측하였으므로, 이를 확인하기 위하여 VEGF의 항체를 50㎍/ml의 농도로 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여, DNA의 합성량을 측정하였다(참조: 도 2). 도 2는 TRANCE와 VEGF의 효과에 대한 VEGF의 항체의 역할을 나타내는 그래프로서, (■)는 항체를 처리한 것을 나타내고, (□)는 항체를 처리하지 않은 것을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, VEGF 항체를 처리할 경우, VEGF의 효과는 억제되었으나, TRANCE의 효과는 억제되지 않았으므로, TRANCE가 VEGF와는 독립적으로 작용함을 알 수 있었다.

실시예 3: 세포이동성에 미치는 TRANCE의 효과

TRANCE에 의한 HUVEC 세포의 이동성 촉진효과를 알아보기 위하여, 주화성 이동실험을 수행하였다. 즉, 6.5mm 직경을 가지며, 기공 크기가 8㎛인 폴리카보네이트 필터가 있는 인서트 체임버(insert chamber)의 필터의 아랫부분 표면을 젤라틴 10㎍으로 코팅하고, 필터의 윗부분은 매트리겔(Matrigel: Collaborative Research, Inc., Waltham, MA) 25㎍으로 코팅하였다. TRANCE를 각각 0, 0.1, 1, 3 또는 5㎍/ml의 농도로 포함하는 1%(v/v) FBS를 포함하는 성장배지 600㎕과 5 ×10⁴세포/웰의 배양된 HUVEC 세포를 메인 체임버(main chamber: 24웰 멀티플레이트)에 넣었다. 이어, 37℃의 배양기에서 18시간 동안 배양한 후, 인서트 체임버의 폴리카보네이트 필터를 떼어내어 세포를 고정시켰다. 이어, 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 다음, 매트리겔을 분해하여, 필터를 통과한 각 실험군의 HUVEC 세포의 수를 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 TRANCE의 농도에 따른 세포이동성을 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, TRANCE의 농도의존적으로 세포의 이동성이 약 40% 정도 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 1 내지 실시예 3의 결과로부터, TRANCE가 신생혈관형성 단계인 세포증식과 이동을 활성화함을 알 수 있었다.

실시예 4: 관형성에 미치는 TRANCE의 효과

성장인자를 제거한 매트리젤(martrigel)을 직경 16mm의 조직배양용 웰에 넣고, 37℃에서 30분간 반응시켜서, 준비하였다. 이어, HUVEC를 1%(v/v) FBS를 포함하는 M199 배지(Sigma Chem Co., U.S.A.)에서 6시간 동안 배양하고, 트립신을 처리하여 단일세포로 분리한 다음, 준비된 매트리젤에 이식하고, 1%(v/v) FBS 및 5㎍/ml TRANCE를 포함하는 M199 배지하에, 37℃에서 다시 20시간 동안 배양한 실험군과 1%(v/v) FBS를 포함하는 M199 배지하에, 37℃에서 다시 20시간 동안 배양한 대조군을 준비한 후, 형성된 관모양 형성도를 광학 이미지 기술로 촬영하고, 이미지분석기를 사용하여 형성된 관의 면적을 정량화 하였다(참조: 도 4a, 도 4b, 도 4c). 도 4a는 대조군의 매트리젤을 나타내는 사진이고, 도 4b는 실험군의 매트리젤을 나타내는 사진이며, 도 4c는 대조군에 대한 실험군의 관형성정도를 나타내는 그래프이다. 도 4a 및 도 4b에서 보듯이, 성장인자를 제거한 매트리젤에서는 불완전하며 얇은 관모양이 형성되었으나, TRANCE를 처리하면, 훨씬 많은 수의 세포들에 의한 연장되어지고 강화된 관모양의 구조가 형성됨을 알 수 있었고, 도 4c에서 보듯이, 실험군의 경우 대조군 보다 2배 이상으로 관의 면적이 증가함을 알 수 있었다.

이로부터, TRANCE가 관형의 기본 구조물이 되는 특징적인 세포-세포간 상호작용을 촉진하는 효과를 가지고 있음을 추측할 수 있었다.

실시예 5: CAM을 이용한 TRANCE의 혈관신생 유도효과 확인

TRANCE가 실질적으로 생체내에서도 혈관신생을 유도하는지를 알아보기 위하여, CAM(chorioallantoic membrane)을 이용한 실험을 수행하였다: 즉, 혈관형성이종료된 것으로 알려진 3일령 닭의 수정란의 계란알부민을 2mL 제거하여, 난황을 껍질막과 분리하고, CAN이 관찰되도록 투명테이프로 밀봉하였다. 1이 경과 후, 3㎍/㎕의 농도로 TRANCE가 용해된 메탄올 2㎕를 놓고 건조시킨 커버슬라이드를 깨진 부분으로 CAM에 처리한 실험군, TRANCE 대신 0.12㎍/ml의 PMA를 사용한 비교군 및 메탄올 2㎕를 놓고 건조시킨 커버슬라이드를 깨진 부분으로 CAM에 처리한 대조군을 각각 제조하였다. 2일 경과 후, 10% 팻 에멀젼(fat emulsion)을 CAM에 주입하여 CAM을 수득하고, 이를 현미경하에서 관찰하여, 실험한 전체 수정란 수에 대하여, 혈관신생이 촉진되는 현상이 관찰되는 수정란 수의 비율을 측정하여 TRANCE의 혈관신생 촉진효과를 확인하였다(참조: 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 5d). 도 5a는 대조군의 CAM을 나타내는 현미경사진이고, 도 5b는 비교군의 CAM을 나타내는 현미경사진이며, 도 5c는 실험군의 CAM을 나타내는 현미경사진이고, 도 5d는 전체 CAM의 수에 대한 혈관신생을 나타내는 CAM의 수를 실험군과 대조군을 비교하여 나타내는 그래프이다. 도 5a 내지 도 5c에서 보듯이, 대조군에 비하여 PMA 또는 TRANCE를 처리한 경우, 혈관신생이 현저히 촉진되었고, 도 5d에서 보듯이, 대조군에 비하여 비교군 및 실험군은 4배 이상으로 증가함을 알 수 있었다.

실시예 6: 매트리젤을 이용한 TRANCE의 혈관신생 유도효과 확인

C57/BL 웅성생쥐에 헤파린(40units/ml)과 TRANCE(3㎍/㎕)를 포함하는 0.5ml 매트리젤(matrigel)을 피하주사한 실험군과 TRANCE가 포함되지 않은 매트리젤을 주사한 대조군을 제작하고, 5일이 경과한 후, 주사한 매트리젤을 회수하여 3.7%(w/v) PBS에 고정시켰다. 이어, 파라핀으로 표본을 만들고, 이를 트리크롬-마손(Trichrome-Masson) 염색법으로 염색하여, 생성된 혈관의 면적을 현미경하에서 측정하여하여 혈관신생을 정량화하였다(참조: 도 6a, 도 6b, 도 6c). 도 6a는 대조군의 매트리젤을 나타내는 현미경사진이고, 도 6b는 대조군의 매트리젤을 나타내는 현미경사진이며, 도 6c는 대조군과 실험군에서 생성된 혈관의 면적을 비교한 그래프이다. 도 6a 및 도 6b에서 보듯이, 대조군에서는 새로이 혈관이 거의 형성되지 않았으나, 실험군에서는 새로이 혈관이 형성되었고, 도 6c에서 보듯이, 그 차이는 현저함을 알 수 있었다.

따라서, TRANCE를 이용할 경우, 혈관신생을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

이상에서 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 조골세포형성과 관련된 것으로 알려진 TRANCE를 이용한 혈관신생 촉진방법을 제공한다. 본 발명의 TRANCE를 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법은 혈관이 형성되지 않은 조직에 TRANCE를 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, TRANCE를 처리하여 혈관신생을 촉진시킬 수 있으므로, 화상, 건선, 궤양, 허혈, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등에 의하여 손상된 조직의 회복에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (2)

1. 인간을 제외한 포유동물의 혈관이 형성되지 않은 조직에 종양괴사인자관련 활성유도 사이토카인(TNF-related activation-induded cytokine, TRANCE)를 처리하는 단계를 포함하는, 종양괴사인자관련 활성유도 사이토카인을 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   혈관이 형성되지 않은 조직은 화상, 건선, 궤양, 허혈, 심근경색,

   협심증 또는 뇌혈관성 질환에 의하여 손상된 후, 새로이 형성된

   진피조직, 근육조직 또는 결합조직인 것을 특징으로 하는

   종양괴사인자관련 활성유도 사이토카인을 이용하여 혈관신생을 촉진시키는 방법.