WO2018042947A1 - ホスホール化合物 - Google Patents

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phosphole
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山口　茂弘
愛子 中
正泰 多喜
晨光 王
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国立大学法人名古屋大学
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    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present invention relates to a phosphole compound.
  • Fluorescent organic compounds with high fluorescence quantum yield are important as luminescent materials for organic EL devices or fluorescent dyes for biofluorescence imaging, and the examples reported so far are listed in both basic research and application. Have no time.
  • phosphole compounds having a specific structure are also known as fluorescent dyes (see, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • the phosphor compound of Patent Document 1 maintains a high fluorescence quantum yield from a low polarity solvent to a high solvent, and some of the phosphor compounds are fluorescent dyes having excellent light resistance.
  • the fluorescent dyes described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are fluorescent dyes having high fluorescence quantum yield and excellent light resistance, but there is room for improvement in the fluorescence quantum yield in an environment containing a lot of water. There is. For example, most of the components of cells, tissues, living bodies, etc. are water. In addition, since the objects to be observed by fluorescence bioimaging are very small and minute, in order to observe with high sensitivity and high signal / noise ratio, the water solubility of the fluorescent dye and the high fluorescence quantum yield in the aqueous solution are required. That is important. For this reason, in order to use as fluorescent dyes for fluorescent bioimaging for cells, tissues, living bodies, etc., development of molecules that emit fluorescence efficiently in water is required. The fluorescent dyes described in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 do not dissolve in water. Moreover, the fluorescence quantum yield of the fluorescent dye described in Patent Document 1 is reduced by adding water to an organic solvent.
  • Non-Patent Document 1 has an absorption peak wavelength of 367 nm and cannot be excited by a laser having these wavelengths, so that it is difficult to apply these light sources. Furthermore, it is preferable to use a longer wavelength laser in consideration of phototoxicity to cells.
  • the present invention is intended to solve the conventional problems as described above, and can maintain a high fluorescence quantum yield regardless of the polarity of the solvent, and further improve the fluorescence quantum yield even in an environment rich in water.
  • An object of the present invention is to provide a fluorescent dye that improves light resistance and can be widely applied to fluorescent bioimaging of cells, tissues, living bodies, and the like.
  • a phosphole compound having a specific structure exhibits a high fluorescence quantum yield regardless of the polarity of the solvent and also exhibits a fluorescence quantum yield even in an environment rich in water. It is a fluorescent dye that can withstand repeated observation with a super-resolution microscope such as stimulated emission suppression (STED) imaging because the yield can be further improved and light resistance can be significantly improved compared to conventional fluorescent dyes.
  • STED stimulated emission suppression
  • Ar 1 and Ar 2 are the same or different and each represents an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring or an optionally substituted heteroaromatic ring.
  • Ar 3 represents a divalent ⁇ -conjugated unit.
  • R 1 represents an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted heteroaryl group.
  • R 2 and R 3 are the same or different and are each a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted hetero An aryl group is shown.
  • Z represents a reactive group.
  • Item 2 The phosphole according to Item 1, wherein Ar 3 is an optionally substituted alkenylene group, an optionally substituted alkynylene group, an optionally substituted arylene group, or an optionally substituted heteroarylene group. Compound.
  • Item 4. The phosphole compound according to any one of Items 1 to 3, wherein Z is a carboxy group or an alkoxycarbonyl group.
  • Item 5 The phosphole compound according to any one of Items 1 to 3, wherein the reactive group is an amine reactive group or a thiol reactive group.
  • the amine-reactive group or thiol-reactive group has the general formulas (2A) to (2E):
  • R 5 represents a hydrogen atom or a sulfo group.
  • R 6 represents an alkyl group.
  • the bond indicated by the solid line and the broken line is a single bond or a double bond.
  • Item 6 The phosphole compound according to Item 5, which is a group having a structure represented by:
  • Item 7 A fluorescent dye comprising the phosphole compound according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8. The fluorescent dye according to Item 7, which is used for stimulated emission suppression (STED) imaging.
  • Item 9 A protein labeling agent using the phosphole compound according to Item 5 or 6.
  • Item 10 A stimulated emission suppression (STED) imaging method comprising using the phosphole compound according to any one of Items 1 to 6 or the fluorescent dye according to Item 7 or 8.
  • Item 11 A protein labeling kit comprising the phosphole compound according to Item 5 or 6, the fluorescent dye according to Item 7 or 8, or the protein labeling agent according to Item 9.
  • Item 12 A protein labeling method comprising a step of reacting a protein with the phosphor compound according to Item 5 or 6, the fluorescent dye according to Item 7 or 8, or the protein labeling agent according to Item 9.
  • the phosphole compound of the present invention has an absorption peak in the wavelength region of the visible light region (particularly about 400 to 500 nm) and exhibits a high fluorescence quantum yield regardless of the polarity of the solvent.
  • the phosphole compound of the present invention can improve the fluorescence quantum yield even in an environment containing a lot of water, and can be widely applied to fluorescence bioimaging of cells, tissues, living bodies, and the like.
  • the phosphole compound of the present invention is a fluorescent dye suitable for repeated observation with a super-resolution microscope such as stimulated emission suppression (STED) imaging.
  • the phosphole compound of the present invention can function as a protein labeling agent for labeling a protein when the reactive group represented by Z is an amine reactive group or a thiol reactive group.
  • FIG. 6 is a diagram showing Kohn-Sham plots and HOMO and LUMO energy levels for Phox 430 NHS Ester of Example 6 and C-Naphox of Comparative Example 3.
  • FIG. 5 is an ultraviolet-visible absorption spectrum and a fluorescence spectrum of Phox 430 NHS Ester of Example 6 in various solvents.
  • 6 is a graph showing fluorescence quantum yields of Phox 430 NHS Ester of Example 6 and C-Naphox of Comparative Example 3 in a mixed solvent of DMSO and HEPES at various ratios.
  • the solution concentration was adjusted to be an optical density (Alexa Fluor 488: 0.22, C-Naphox: 0.22, PB430: 0.21) at an excitation wavelength of 460 nm.
  • 6 is a graph showing the pH dependence of fluorescence for Phox-COOH (10 ⁇ M) of Example 8.
  • the UV-vis absorption spectrum (solid line) and fluorescence spectrum (dashed line) of Phox-COOH and Phox-antibody conjugate in PBS buffer solution (pH 7.4) are shown. It is a figure which shows the result of the confocal imaging and STED imaging of an immunofluorescence labeled vimentin.
  • FIG. 2 shows fluorescence images of immunolabeled microtubules in fixed HeLa cells.
  • A Confocal microscope image (left figure), STED microscope image (middle figure) and intensity profile (right figure).
  • the confocal microscope image and the STED microscope image also show an enlarged view of the dotted line portion.
  • the intensity profile is a black line for the confocal microscope image and a green line for the STED microscope image.
  • B First five STED microscopic images stained with Phox-COOH.
  • C First five STED microscope images stained with Alexa Fluor 488.
  • D Integrated fluorescence intensity plotted as a function of the number of STED images recorded.
  • FIG. 2 shows a two-color imaging scheme combined with STED microscope based on the distinctly different light stability of Phox-COOH (PB430) and Alexa Fluor 430.
  • Microtubules and vimentin filaments were separately immunolabeled with Phox-COOH (PB430) and Alexa Fluor 430, respectively.
  • A, b Excitation at 470 nm (WLL, 10 ⁇ W), fluorescence suppression at 592 nm (CW-STED, 30 mW), and two STED microscopic images (deconvolved data) were recorded sequentially.
  • C Image obtained by subtracting (removing) image (b) from image (a).
  • D Two-color STED microscope image combining image (b) and image (c).
  • A Two-color STED micrographs (deconvolved data) of microtubules (green) and vimentin filaments (magenta) separately immunolabeled with Phox-COOH (PB430) and Alexa Fluor 430, respectively. A plot of the intensity profile along the dotted line intersected (b) microtubules and (c) vimentin filaments in an inset of a two-color STED image. The profile was fitted to Gaussian distribution.
  • the phosphole compound of the present invention has the general formula (1):
  • Ar 1 and Ar 2 are the same or different and each represents an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring or an optionally substituted heteroaromatic ring.
  • Ar 3 represents a divalent ⁇ -conjugated unit.
  • R 1 represents an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted heteroaryl group.
  • R 2 and R 3 are the same or different and are each a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, an optionally substituted aryl group, or an optionally substituted hetero An aryl group is shown.
  • Z represents a reactive group.
  • It is a compound represented by these.
  • the phosphole compound of the present invention has a condensed phosphole skeleton, it is excellent in light resistance, and various reactive groups can be introduced through Ar 3 .
  • Ar 3 as described above, a high fluorescence quantum yield can be exhibited even in an environment with much water.
  • the phosphole compound of the present invention is fluorescent when repeatedly observed in a living body with a super-resolution microscope such as stimulated emission suppression (STED) imaging. Since it is possible to suppress a decrease in luminance, it is a compound suitable for the purpose of repeated observation with a super-resolution microscope such as stimulated emission suppression (STED) imaging in vivo.
  • STED stimulated emission suppression
  • any of a monocyclic aromatic hydrocarbon ring and a polycyclic aromatic hydrocarbon ring can be employed, for example, a monocyclic aromatic hydrocarbon ring.
  • the polycyclic aromatic hydrocarbon ring include naphthalene ring, anthracene ring, phenanthrene ring, fluorene ring, pyrene ring, and triphenylene ring.
  • the aromatic hydrocarbon ring represented by Ar 1 may have a substituent.
  • substituents include an alkyl group described later, a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group). Etc.), carbonyl group, cyano group, nitro group and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • examples of the heteroaromatic ring represented by Ar 1 include a pyrrolidine ring, a pyrrole ring, a tetrahydrothiophene ring, a thiophene ring, an oxolane ring, a furan ring, an imidazole ring, a pyrazole ring, a thiazole ring, and an oxazole ring.
  • the heteroaromatic ring represented by Ar 1 may have a substituent.
  • substituents include an alkyl group described later, a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group). Etc.), carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • Ar 1 is preferably an aromatic hydrocarbon ring which may be substituted from the viewpoint of ease of synthesis, and more preferably a polycyclic aromatic hydrocarbon ring which may be substituted.
  • the phosphole compound of the present invention has the general formula (1A):
  • the HOMO level energy level of the highest occupied orbit
  • the LUMO level lowest orbital
  • Ar 2 include an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring, particularly an unsubstituted aromatic hydrocarbon ring.
  • examples of the divalent ⁇ -conjugated unit represented by Ar 3 include an alkenylene group, an alkynylene group, an arylene group, and a heteroarylene group.
  • alkenylene group examples include alkenylene groups having 2 to 6 carbon atoms such as vinylene group, propenylene group and butenylene group, particularly 2 to 4 carbon atoms.
  • the alkenylene group may have a substituent.
  • substituents include a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.), an alkoxy group.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • the alkoxy group as a substituent means a group represented by —OR.
  • R in the alkoxy group is not only an alkyl group described later, but also a group in which an alkyl chain is ether-bonded through an oxygen atom, A group in which a carboxy group is bonded to an alkyl chain, a group in which an alkyl chain is ester-bonded via —COO—, and the like are also included.
  • alkynylene group examples include alkynylene groups having 2 to 6 carbon atoms, particularly 2 to 4 carbon atoms such as ethynylene group, propynylene group and butynylene group.
  • the alkynylene group may have a substituent.
  • substituents include a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.), Group, carbonyl group, cyano group, nitro group and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • arylene group examples include a phenylene group, a naphthylene group, an anthracenylene group, a phenanthrenylene group, a fluorenylene group, a pyrenylene group, and a triphenylenylene group.
  • the arylene group may have a substituent.
  • substituents include an alkyl group described later, a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group). Etc.), the above alkoxy group, carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • heteroarylene group examples include pyrrolidylene group, pyrrolylene group, tetrahydrothienylene group, thienylene group, oxolanylene group, furanylene group, imidazolene group, pyrazolen group, thiazolen group, oxazolen group, piperidylene group, pyridylene group, pyrazilene group, indolylene.
  • the heteroarylene group may have a substituent.
  • substituents include an alkyl group described later, a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group). Etc.), the above alkoxy group, carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • Ar 3 is preferably an arylene group which may be substituted from the viewpoint of making the absorption peak wavelength and the fluorescence peak wavelength (especially the absorption peak wavelength) longer, more preferably an unsubstituted allylene group, and a phenylene group. Further preferred.
  • the m-phenylene group is most preferable from the viewpoint of introducing a protein labeling site while further reducing the influence on the optical properties (absorption peak wavelength, fluorescence peak wavelength, fluorescence quantum yield, etc.) of the dye. preferable.
  • any of a linear alkyl group and a branched alkyl group can be employed.
  • a methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n- Examples thereof include alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms, particularly 1 to 6 carbon atoms such as butyl group, isobutyl group, sec-butyl group and tert-butyl group.
  • the alkyl group represented by R 1 may have a substituent.
  • substituents include a cycloalkyl group described later, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.), Group, carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • the cycloalkyl group represented by R 1 includes, for example, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, etc., 3 to 10 carbon atoms, particularly 4 to 8 carbon atoms. Of the cycloalkyl group.
  • the cycloalkyl group represented by R 1 may have a substituent.
  • substituents include the alkyl group, the cycloalkyl group, an aryl group described later, a heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.).
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • any of a monocyclic aryl group and a polycyclic aryl group can be adopted, and examples thereof include an aryl group having 6 to 18 carbon atoms, particularly 6 to 14 carbon atoms.
  • the monocyclic aryl group includes a phenyl group
  • the polycyclic aryl group includes a naphthyl group, an anthracenyl group, a phenanthrenyl group, a biphenyl group, a terphenyl group, a fluorenyl group, a pyrenyl group, and a triphenylenyl group.
  • the aryl group represented by R 1 may have a substituent.
  • substituents include the alkyl group, the cycloalkyl group, the aryl group, the heteroaryl group described later, an alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), an alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.), The above alkoxy group, carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like can be mentioned.
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • examples of the heteroaryl group represented by R 1 include a pyrrolidyl group, a pyrrolyl group, a tetrahydrothienyl group, a thienyl group, an oxolanyl group, a furanyl group, an imidazolyl group, a pyrazolyl group, a thiazolyl group, and an oxazolyl group.
  • the heteroaryl group represented by R 1 may have a substituent.
  • the substituent include the alkyl group, the cycloalkyl group, the aryl group, the heteroaryl group, the alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), the alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl group, etc.), Examples thereof include an alkoxy group, a carbonyl group, a cyano group, a nitro group, a halogen atom (a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, etc.).
  • the number of substituents is preferably 1 to 6, for example, and more preferably 1 to 3.
  • R 1 is preferably an aryl group which may be substituted from the viewpoint of the absorption peak wavelength and the fluorescence peak wavelength, more preferably a phenyl group which may be substituted, and even more preferably a phenyl group.
  • an aryl group which may be substituted is preferable, from the viewpoint of water solubility, a substituted aryl group is more preferable, an aryl group substituted with an alkoxy group is more preferable, and —O ( (CH 2 ) p O) q CH 3 (p represents an integer of 1 to 5, especially 1 to 3, q represents an integer of 1 to 20, especially 2 to 10), -O (CH 2 ) An aryl group substituted with r SO 3 H (r is an integer of 1 to 5, particularly 1 to 3), etc. is particularly preferred, and —O (CH 2 ) r SO 3 H (r is 1 An aryl group substituted with an integer of ⁇ 5, particularly an integer r of 1 to 3) is most preferred.
  • the reactive group represented by Z is not particularly limited as long as it is a reactive group.
  • a phosphole compound in which Z is a carboxy group; an alkoxycarbonyl group; a hydroxyl group; an amino group; a halogenated alkyl group such as a chloromethyl group; an isocyan group; an isothiocyan group (particularly a carboxy group or an alkoxycarbonyl group) By reacting with a compound having a desired substituent, Z can be easily converted into a group (an amine reactive group, a thiol reactive group, etc.) for labeling a protein.
  • Z is a carboxy group or an alkoxycarbonyl group, or a group of compounds that are groups for labeling proteins (amine-reactive groups, thiol-reactive groups, etc.) are categories of the phosphole compounds of the present invention. .
  • the amine-reactive group is a group reactive with an optionally substituted amino group of the compound to be labeled, and reacts with an optionally substituted amino group of a protein (particularly an antibody).
  • the phosphole compound of the present invention can function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent).
  • the thiol-reactive group is a group reactive with an optionally substituted thiol group possessed by a compound to be labeled, and reacts with an optionally substituted thiol group possessed by a protein (particularly an antibody).
  • the phosphole compound of the present invention can function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent).
  • Examples of such amine-reactive group or thiol-reactive group include general formulas (2A) to (2E):
  • R 4 represents a hydrogen atom or a sulfo group.
  • R 5 represents an optionally substituted alkyl group.
  • the bond indicated by the solid line and the broken line is a single bond or a double bond.
  • a group having a structure represented by (amine-reactive terminal or thiol-reactive terminal) at the terminal is preferable.
  • amine-reactive groups or thiol-reactive groups that satisfy such conditions include groups represented by —O—, —COO—, —CONR 6 — (R 6 represents a hydrogen atom or the above alkyl group) (particularly A group having an amine-reactive terminus or a thiol-reactive terminus via a linking group such as —COO—) is preferred.
  • R 6 represents a hydrogen atom or the above alkyl group
  • the phosphole compound of the present invention can easily function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent), and can exhibit a higher fluorescence quantum yield even in an environment with a lot of water.
  • an amine reactive group or thiol reactive group specifically,
  • n an integer of 1 to 6.
  • n is preferably an integer of 1 to 6, more preferably an integer of 1 to 4.
  • n is the same as defined above. ] Is preferred.
  • the phosphole compound represented by the general formula (1) that satisfies the above conditions has an energy difference between the HOMO level (the energy level of the highest occupied orbit) and the LUMO level (the energy level of the lowest unoccupied orbit). From the viewpoint of making the absorption peak wavelength and the fluorescence peak wavelength longer, further improving the fluorescence quantum yield, and exhibiting a high fluorescence quantum yield even in an environment with a lot of water, 1B):
  • Ar 2a represents an optionally substituted aromatic hydrocarbon ring.
  • Ar 3a represents an optionally substituted arylene group.
  • R 1a represents an optionally substituted aryl group.
  • R 2a and R 3a are the same or different and each represents an aryl group substituted with an alkoxy group.
  • Ar 4 is the same as described above.
  • the phosphole compound represented by these is more preferable, and the phosphole compound shown in the below-mentioned Example is further more preferable.
  • the phosphole compound of the present invention may contain the phosphole compound represented by the general formula (1) as a hydrate or solvate, and both are included in the scope of the present invention.
  • Method for producing phosphole compound is not particularly limited.
  • Z a represents an amine reactive group or a thiol reactive group.
  • Ar 1, Ar 2, R 1, R 2, R 3, R 7 and Z a is as defined above.
  • R 8 represents an alkyl group.
  • X 1 represents a halogen atom.
  • Ar 1, Ar 2, R 1, R 7, R 8, X 1 and Z a is as defined above.
  • R 2a and R 3a are the same or different, and an aryl group substituted with a group represented by —OR 9 (R 9 is the above alkyl group, particularly a methyl group in consideration of ease of subsequent steps) Indicates.
  • R 2b and R 3b are the same or different and each represents an aryl group substituted with a hydroxyl group.
  • R 2c , R 3c and R 8c are the same or different and each represents an aryl group substituted with —O ((CH 2 ) p O) q CH 3 or —O (CH 2 ) r SO 3 H (p, q And r are the same as above).
  • the alkyl groups represented by R 8 and R 9 may be those described above.
  • the kind and number of substituents are the same.
  • examples of the halogen atom represented by X 1 include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • halogenating agent examples include iodine (I 2 ), iodine monochloride (ICl), iodine trichloride (ICl 3 ), N-iodosuccinimide (NIS), bromine (Br 2 ), N-bromosuccinimide ( NBS), chlorine (Cl 2 ), and the like, and usually 1 to 5 mol (especially 1.5 to 3 mol) is preferably used with respect to 1 mol of compound (3) or compound (3A).
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform, and carbon tetrachloride; amide solvents such as dimethylformamide, and the like from the viewpoint of ease of synthesis, yield, and the like. Halogenated hydrocarbons are preferred, and dichloromethane is more preferred.
  • These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • R 10 represents a boronic acid or boronic ester group.
  • a compound (5) or a compound (5A) can be obtained by reacting with a compound represented by the following formula: Suzuki-Miyaura coupling reaction.
  • examples of the boronic acid or boronic ester group represented by R 10 include, for example, the general formula (9):
  • R 11 are the same or different and each represents a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group. R 11 may be connected to each other to form a ring with adjacent —O—N—O—. ] The group represented by these is mentioned.
  • Examples of the boronic acid or boronic ester group represented by R 10 include, for example,
  • the compound (8) is preferably used in an amount of 1 to 5 mol (particularly 1.5 to 3 mol) per mol of the compound (4) or the compound (4A).
  • a palladium catalyst usually used for Suzuki-Miyaura coupling is used. Specifically, palladium acetate (Pd (OAc) 2 ), tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) (Pd (PPh 3 ) 4 ), palladium trifluoroacetate, palladium chloride, palladium bromide, palladium iodide, Tris (dibenzylideneacetone) dipalladium (0) (Pd 2 (dba) 3 ) and the like.
  • tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) is used from the viewpoint of ease of synthesis, yield, etc. (Pd (PPh 3 ) 4 ) is preferred.
  • the amount of the palladium catalyst used is usually preferably from 0.01 to 0.3 mol, more preferably from 0.02 to 0.1 mol, per 1 mol of compound (4) or compound (4A).
  • a ligand compound can be used as necessary.
  • a ligand compound usually used for Suzuki-Miyaura coupling can be used in an amount usually used.
  • a base can be used as necessary.
  • the base include potassium fluoride, cesium fluoride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate, potassium phosphate, sodium acetate, potassium acetate, and calcium acetate.
  • potassium phosphate is preferred.
  • the amount used is preferably from 1 to 20 mol, more preferably from 3 to 10 mol, based on 1 mol of the compound (4) or the compound (4A), from the viewpoint of ease of synthesis, yield and the like. preferable.
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; Aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; Nitrile solvents such as acetonitrile; Amide solvents such as dimethylformamide From the viewpoint of ease of synthesis, yield, etc., aromatic hydrocarbons are preferred, and toluene is more preferred.
  • These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably 0 to 150 ° C, more preferably 50 to 100 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • compound (6) or compound (6A) can be obtained by hydrolyzing compound (5) or compound (5A) using an acid catalyst.
  • an acid catalyst used for hydrolysis an acid generally used for hydrolysis of an ester can be used.
  • R 8 is a non-reactive group such as a tert-butyl group
  • a strong acid such as trifluoroacetic acid or hydrochloric acid is used. It is preferable to use it. Since the acid catalyst is usually a liquid, the amount used is preferably an excess amount.
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; Aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; Nitrile solvents such as acetonitrile; Amide solvents such as dimethylformamide From the viewpoints of ease of synthesis, yield, etc., ethers and aliphatic halogenated hydrocarbons are preferred, and anisole and dichloromethane are more preferred.
  • These reaction solvents can be
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • compound (6B) can be obtained by dealkylating compound (6A) with a Lewis acid.
  • Lewis acids examples include boron tribromide, aluminum tribromide, boron trichloride, aluminum trichloride, titanium tetrachloride, tin tetrachloride, boron trifluoride, iodotrimethylsilane, and silicon tetrachloride. Two or more types can be mentioned, and since Lewis acid is usually a liquid, it is preferable to use an excess amount relative to compound (6A).
  • reaction solvents include, for example, aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; nitrile solvents such as acetonitrile; dimethylformamide and the like Examples include amide solvents, and aliphatic halogenated hydrocarbons are preferable and dichloromethane is more preferable from the viewpoint of ease of synthesis and yield. These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • a compound (7) or a compound (6C) can be obtained by reacting with a compound represented by formula (I) and esterifying a carboxy group and, if necessary, etherifying a phenolic hydroxyl group.
  • compound (10A) is used, compound (7) is obtained, and when compound (10B) is used, compound (6C) is obtained. Therefore, when the compound (10B) is used, the step (2-6) described later can be skipped.
  • examples of the alkylene group represented by R 13 include alkylene groups having 1 to 6 carbon atoms (particularly 2 to 4 carbon atoms), such as a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, and a tetramethylene group. Groups and the like.
  • the alkylene group may have a substituent. Examples of the substituent include, but are not limited to, the alkyl group, the cycloalkyl group, the aryl group, the heteroaryl group, the alkenyl group (vinyl group, propenyl group, etc.), the alkynyl group (ethynyl group, 1-propynyl).
  • the above alkoxy group carbonyl group, cyano group, nitro group, halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.) and the like.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • the amount of compound (10A) or compound (10B) to be used is generally preferably 2 to 20 mol, more preferably 3 to 10 mol, per 1 mol of compound (6B).
  • a base can be used as necessary.
  • Bases include ammonium chloride, potassium fluoride, cesium fluoride, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium methoxide, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate, potassium phosphate, sodium acetate , Potassium acetate, calcium acetate or the like, and potassium carbonate is preferred in this step from the viewpoint of yield and ease of synthesis.
  • the amount used is preferably 3 to 50 mol, more preferably 5 to 20 mol, relative to 1 mol of compound (6B), from the viewpoint of ease of synthesis, yield and the like.
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; Aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; Nitrile solvents such as acetonitrile; Amide solvents such as dimethylformamide From the viewpoint of ease of synthesis, yield and the like, a nitrile solvent is preferable, and acetonitrile is more preferable.
  • These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, normal temperature and cooling, and it is usually more preferable to carry out the reaction under reflux.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • compound (6C) can be obtained by hydrolyzing compound (7) using a base catalyst.
  • the base catalyst used for hydrolysis a base catalyst generally used for ester hydrolysis can be used, but lithium hydroxide is preferable. Since the base catalyst is usually a liquid, the amount used is preferably an excess amount.
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; Aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; Nitrile solvents such as acetonitrile; Amide solvents such as dimethylformamide From the viewpoints of ease of synthesis, yield and the like, ether is preferable, and tetrahydrofuran is more preferable. These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • carbodiimide condensing agent N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, diisopropylcarbodiimide
  • imidazole condensing agent carbonyldiimidazole, 2- Chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride
  • triazine condensing agent (4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride
  • phosphonium Condensing agents benzotriazol-1-yloxy-trisdimethylaminophosphonium salt, hexafluorophosphoric acid (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium
  • uronium condensing agents ⁇ [(1-cyano-2- Ethoxy-2-oxoethyl
  • the phosphole compound of the present invention (compound (1C) or compound (1C1)) having a succinimide skeleton at the terminal can be obtained.
  • the phosphole compound of the present invention having a succinimide skeleton at the terminal thus obtained can function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent).
  • the amount of the condensing agent used is usually preferably 1 to 5 moles, more preferably 1.5 to 3 moles per mole of compound (6) or compound (6C).
  • a carbodiimide reagent as a coupling reagent.
  • the carbodiimide reagent include one or more of dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1- (3-dimethylamino) -propyl 3-ethylcarbodiimide (EDC), etc. These carbodiimide reagents are hydrochloride salts. Etc. (1- (3-dimethylamino) -propyl 3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI) etc.) can also be used.
  • the amount of these coupling reagents to be used is usually preferably 1 to 5 mol, more preferably 1.5 to 3 mol, per 1 mol of compound (6) or compound (6C).
  • a hydrochloride (acid salt) may be used as a coupling agent
  • a base examples include one or more of pyridine, dialkylaminopyridine (4-dimethylaminopyridine (DMAP), etc.), and the amount used is usually compound (6) or compound.
  • the amount is preferably 1 to 5 moles, more preferably 1.5 to 3 moles per mole.
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; Aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; Aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; Nitrile solvents such as acetonitrile; Amide solvents such as dimethylformamide From the viewpoints of ease of synthesis, yield, etc., amide solvents are preferred, and dimethylformamide is more preferred.
  • These reaction solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • the phosphole compound of the present invention can be obtained by purifying according to a conventional method as necessary.
  • the phosphole compound of the present invention obtained as described above is a phosphole compound having a succinimide skeleton at the terminal, it is further reacted with a maleimide compound such as N- (2-aminoethyl) maleimide.
  • a maleimide compound such as N- (2-aminoethyl) maleimide.
  • the maleimide compound used may be in the form of a salt such as trifluoroacetate.
  • the amount of maleimide compound used is usually preferably 0.2 to 5 mol, more preferably 0.5 to 2 mol, per 1 mol of compound (1C) or compound (1C1).
  • a trifluoroacetate salt (acid salt) may be used as the maleimide compound
  • a base examples include one or more of pyridine, dialkylaminopyridine (4-dimethylaminopyridine (DMAP), etc.), amine (triethylamine, etc.), and the amount used is usually It is preferable to use an excess amount with respect to 1 mol of the compound (1C) or the compound (1C1).
  • the reaction can usually be performed in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent that can be used include diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane, dimethoxyethane (DME), diglyme, cyclopentyl methyl ether (CPME), tert-butyl methyl ether (TBME), Ethers such as anisole; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, chloroform and carbon tetrachloride; nitrile solvents such as acetonitrile; amide solvents such as dimethylformamide; Examples thereof include dimethyl sulfoxide (DMSO), and dimethyl sulfoxide is preferable from the viewpoint of ease of synthesis, yield, and the like.
  • THF tetrahydrofuran
  • the reaction atmosphere can usually be an inert gas atmosphere (argon gas atmosphere, nitrogen gas atmosphere, etc.).
  • the reaction temperature can be any of heating, room temperature and cooling, and is usually preferably ⁇ 50 to 100 ° C., more preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is preferably a time for which the reaction proceeds sufficiently.
  • the phosphole compound of the present invention can be obtained by purifying according to a conventional method as necessary.
  • the synthesis method is not limited to this production method, and it can be synthesized by various synthesis methods.
  • Fluorescent dye and protein labeling agent The fluorescent dye of the present invention comprises the above-described phosphole compound of the present invention.
  • the fluorescent dye of the present invention has a condensed phosphole skeleton, it is excellent in light resistance (light stability), and various reactive groups (Z) can be introduced through Ar 3 .
  • various reactive groups (Z) can be introduced through Ar 3 .
  • Ar 3 as described above, a high fluorescence quantum yield can be exhibited even in an environment with much water.
  • the terminal reactive group (Z) various substituents can be introduced.
  • a protein particularly an antibody
  • the fluorescent dye of the present invention can be used as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent) to be labeled, and the decrease in fluorescence intensity is suppressed even after repeated imaging. It is suitable for repeated observation with a super-resolution microscope (especially stimulated emission suppression (STED) microscope) such as suppression (STED) imaging.
  • STED stimulated emission suppression
  • the target protein is, for example, avidin, streptavidin, annexin V, anti-IgG antibody, anti-IgM antibody, Anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD43 antibody, anti-CD44 antibody, anti-CD68 antibody, anti-IFN- ⁇ antibody, anti-TNF- ⁇ antibody, anti-Ly-6G antibody, anti-Ku70 antibody, Anti-IL-4 antibody, anti-IL-17 antibody, anti-IL-31 antibody, anti-Notch1 antibody, anti-Notch3 antibody, anti-FOXBP3 antibody, anti-Ki-67 antibody, anti-HLA-A2 antibody, anti- ⁇ -tubulin antibody, anti Examples include cathepsin-D antibody, anti-angiotensin antibody, anti-COX1 antibody, anti-GLUT1 antibody, anti-AKT1 / 2/3 antibody, anti-
  • the protein labeling agent of the present invention when a compound having a reactive group represented by Z as an amine reactive group or a thiol reactive group is used as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent), the protein labeling agent of the present invention (in particular, the antibody labeling agent) contains the phosphole compound of the present invention, but it is preferably dissolved in an organic solvent to form a solution, which improves the light resistance and increases the fluorescence even in a water-rich environment.
  • the content of the phosphole compound of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 8 to 1 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / L, and preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 to 1 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / L. More preferred.
  • the organic solvent that can be used is not particularly limited, and any of a polar solvent and a nonpolar solvent can be used. .
  • polar solvents examples include ether compounds (tetrahydrofuran, anisole, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, etc.), alcohols (methanol, ethanol, allyl alcohol, etc.), ester compounds (ethyl acetate, etc.), ketones (acetone, etc.) , Halogenated hydrocarbons (dichloromethane, chloroform, etc.), dimethyl sulfoxide, amide solvents (N, N-dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, N-methylpyrrolidone, etc.), nitriles A solvent (acetonitrile etc.) etc. are mentioned.
  • nonpolar solvent examples include aliphatic organic solvents such as pentane, hexane, cyclohexane and heptane; aromatic solvents such as benzene, toluene, xylene and mesitylene.
  • the fluorescent dye made of the phosphor compound of the present invention is a highly versatile dye.
  • the protein labeling agent of the present invention (particularly the antibody labeling agent) is preferably in the form of a solution.
  • the pH is preferably about 5 to 11, more preferably about 6.5 to 7.5.
  • a buffering agent Hepes buffer, Tris buffer, tricine-sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline, etc.
  • Hepes buffer, Tris buffer, tricine-sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, phosphate buffered saline, etc. can be used in combination.
  • the melting point (mp) or decomposition temperature was measured with a Yanaco MP-S3 apparatus.
  • 1 H NMR spectrum, 13 C ⁇ 1 H ⁇ NMR spectrum and 31 P ⁇ 1 H ⁇ NMR are measured by JEOL AL-400 ( 1 H: 400 MHz, 13 C: 100 MHz, 31 P: 162 MHz), or JEOL A -600 spectrometer ( 1 H: 600 MHz, 13 C: 150 MHz, 31 P: 243 MHz) was measured in CDCl 3 or DMSO-d 6 as a solvent.
  • TLC Thin layer chromatography
  • HPLC Preparative Recycle High Performance Liquid Chromatography
  • HPLC Preparative Recycle High Performance Liquid Chromatography
  • LC-918 Nippon Analytical Industrial Co., Ltd.
  • reversed phase column Wakosil-II 5C18 HG Prep
  • YMC-DispoPackAT ODS reversed phase column
  • Tf represents a trifluoromethanesulfonyl group.
  • TMS represents a trimethylsilyl group.
  • Pd (PPh 3 ) 4 represents tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0).
  • Et 3 N represents triethylamine. The same applies hereinafter.
  • Dry nitrogen gas is blown into a solution of 1-bromonaphthalen-2-yl triflate (99.44 g, 280 mmol) and 4-trimethylsilylphenylacetylene (48.80 g, 280 mmol) in triethylamine (Et 3 N; 500 mL) for 20 minutes. I was degassed.
  • Sc (OTf) 3 represents scandium (III) trifluoromethanesulfonate.
  • Sc (OTf) 3 represents scandium (III) trifluoromethanesulfonate.
  • a solution of Compound 3 (8.180 g, 12.27 mmol) obtained in Synthesis Example 3 and scandium (III) trifluoromethanesulfonate (Sc (OTf) 3 ; 6.039 g, 12.27 mmol) in 1,2-dichloroethane (300 mL) was stirred at room temperature. After stirring for 48 hours, H 2 O (200 mL) was added to quench the reaction. The organic phase was separated and the aqueous phase was extracted with CHCl 3 (500 mL).
  • Ts represents a tosyl group.
  • Compound 8 (200 mg, 0.299 mmol) obtained in Example 3, hexa (ethylene glycol) monomethyl ether tosylate (676 mg, 1.50 mmol), and K 2 CO 3 (415 mg, 3.00 mmol) in anhydrous CH 3 CN (3 mL) The solution was refluxed for 48 hours. After cooling to room temperature, the mixture was diluted with ethyl acetate (EtOAc; 50 mL), washed 3 times with saturated brine (15 mL), then dried over anhydrous Na 2 SO 4 and filtered.
  • EtOAc ethyl acetate
  • the resulting oily substance was purified by silica gel column chromatography (CHCl 3 to 50/1 CHCl 3 / methanol) to obtain 366 mg of the target compound 9 as a highly viscous oily substance. (0.243 mmol, yield 81%).
  • the resulting oily substance was purified by silica gel column chromatography (CHCl 3 to 20/1 CHCl 3 / methanol) to obtain 267 mg of the target compound 10 as a highly viscous oily substance. (0.218 mmol, 94% yield).
  • NHS N-hydroxysuccinimide.
  • DMAP N, N-dimethyl-4-aminopyridine.
  • EDCI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride.
  • DMF represents dimethylformamide. The same applies hereinafter.
  • N, N, N ′, N′-tetramethyl-O— was added to a solution of the compound 12 (14.0 mg, 0.0153 mmol) obtained in Example 7 and diisopropylethylamine (DIPEA; 0.10 mL, 0.61 mmol) in anhydrous DMSO (1 mL).
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • TSTU N-succinimidyl uronium tetrafluoroborate
  • Comparative Example 1 Alexa Fluor 430 As a commercially available fluorescent dye, Alexa Fluor 430 was used as the fluorescent dye of Comparative Example 1.
  • Comparative Example 2 Atto 425 As a commercially available fluorescent dye, Atto 425 was used as the fluorescent dye of Comparative Example 2.
  • Alexa Fluor 488 As a commercially available fluorescent dye, Alexa Fluor 488 was used as the fluorescent dye of Comparative Example 4.
  • Test Example 1 Molecular Orbital Calculation
  • Molecular Orbital Calculation In order to consider the difference between the UV-visible absorption spectrum and the fluorescence spectrum of Phox 430 NHS Ester in Example 6 and C-Naphox in Comparative Example 3, structural optimization by molecular orbital calculation and TD -DFT calculation was performed. The results are shown in FIG.
  • the energy level of HOMO and LUMO could be reduced by adjusting the condensation position of the benzene ring as in Phos 430 NHS Ester in Example 6.
  • the phosphole compound represented by the general formula (1B) can further reduce the energy level of HOMO and LUMO, thereby improving the fluorescence quantum yield. This suggests that the fluorescence peak wavelength can be further increased.
  • Test Example 2 Photophysical properties Phox 430 NHS Ester of Example 6 was dissolved in various solvents at a concentration of about 10 ⁇ 5 M, an ultraviolet-visible absorption spectrum and a fluorescence spectrum, an absolute fluorescence quantum yield, a fluorescence lifetime, etc. was measured.
  • Comparative Example 1 Alexa Fluor 430 and Comparative Example 2 Atto 425, UV-visible absorption spectrum and fluorescence spectrum when dissolved in HEPES at a concentration of about 10 ⁇ 5 M, absolute fluorescence quantum yield, fluorescence lifetime, etc. Measurements were made. The results are shown in Table 1 and FIG.
  • the phosphole compound of the present invention can fluoresce to light in the visible light region (especially about 400 to 500 nm) in any of various solvents (the absorption spectrum and the fluorescence spectrum exhibit almost the same behavior). Show). It can also be understood that even an aqueous solvent has high luminance.
  • the phosphor compound of the present invention is also characterized by a large Stokes shift (5020 cm ⁇ 1 ). Furthermore, the phosphor compound of the present invention has an absolute fluorescence quantum yield of 0.90 at the maximum, a brightness comparable to that of conventional fluorescent dyes, and a fluorescence lifetime of 6 ns or more, which is conventionally about 1 to 4 ns. In comparison, it has a feature that it is extremely long.
  • Test Example 3 Fluorescence Quantum Yield in DMSO / HEPES Buffer Phox 430 NHS Ester of Example 6 and C-Naphox of Comparative Example 3 at a concentration of about 10 -6 M in a mixed solvent of DMSO and HEPES After dissolution, the absolute fluorescence quantum yield was measured. At this time, the ratio of HEPES in the mixed solvent was changed in various ways to evaluate the difference in the fluorescence quantum yield with respect to the water content. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the vertical axis represents the value of the fluorescence quantum yield, and 100% represents the theoretical upper limit of the fluorescence quantum yield.
  • C-Naphox of Comparative Example 3 has a high fluorescence intensity even in a solvent containing water, as compared with the fact that the fluorescence quantum yield decreases as the water content increases. It can be seen that the quantum yield is maintained.
  • the absorbance (A 0 ) immediately after irradiation (after 0 seconds) was taken as 1.00, and the maintenance rate (A / A 0 ) of the absorbance (A) after the lapse of a predetermined time was evaluated.
  • the results are shown in FIGS.
  • the fluorescence intensity of Alexa Fluor 488 was reduced by light irradiation and decreased to about 46.2% after 5 hours of light irradiation, whereas Phox-COOH and C-Naphox showed fluorescence intensity even after 5 hours of light irradiation. was almost unchanged (about 99.9%).
  • the phosphole compound of the present invention has the same high light resistance as that of C-Naphox, and its characteristics greatly exceed that of Alexa Fluor 488.
  • Test Example 5 Evaluation of pH dependency of fluorescence
  • the fluorescence spectrum of Phox-COOH (10 ⁇ M) of Example 8 was measured in aqueous solutions having various pHs. Use citric acid / Na 2 HPO 4 buffer to adjust pH 3-6, Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer to adjust pH 7-8, and Na 2 CO to adjust pH 9-11. 3 / NaHCO 3 buffer was used.
  • Phox-NHS Ester of Example 9 was combined with goat anti-mouse IgG antibody to form a Phox-antibody conjugate.
  • the degree of labeling (DOL) was determined to be 2.8.
  • the photophysical properties of Phox-antibody conjugate are almost the same as that of Phox-COOH not bound to the antibody in PBS (pH 7.4). There is almost no interaction with.
  • the pH 8.3 labeling buffer was prepared by mixing PBS buffer (pH 7.4) and 0.2M NaHCO 3 in a ratio of 20: 1 (v / v).
  • the released Phox-NHS Ester was removed by Sephadex G-25 column chromatography, and as a result, the degree of labeling (DOL) value (number of dyes bound per antibody) was measured.
  • DOL is the “Determination of Degree of Labeling ( DOL) ”was calculated using A 280 and A 426 instead of A 280 and A 494 .
  • the DOL value calculation method is as follows.
  • ⁇ 280 and ⁇ max represent the absorption coefficient of the dye at 280 nm and the absorption maximum (426 nm), respectively.
  • a max and A 280 represent the absorption maximum of the dye (426 nm) and the absorbance of Phox-antibody conjugate at 280 nm, respectively, and the difference between A 280 and A max ⁇ CF 280 is the antibody itself at 280 nm (A protein ) Protein represents the absorption coefficient of the antibody itself at 280 nm.
  • Test Example 7 Preparation of cells HeLa cells (RIKEN Cell Bank, Japan) were treated with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco) and 1% antibiotic-antimycotic (AA, Sigma). , Sigma) at 37 ° C. in an incubator with 5% CO 2 /95% air. Three days before imaging, cells (5 ⁇ 10 4 ) were seeded in glass bottom 8-well plates. Immunofluorescence labeled tubulin and vimentin of fixed HeLa cells were prepared as follows.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • AA antibiotic-antimycotic
  • HeLa cells are incubated with 4% formaldehyde at room temperature for 20 minutes, washed once with PBS buffer (pH 7.4), treated with 0.5% Triton-X100 at room temperature for 10 minutes, and again with PBS buffer (pH 7. Washed 3 times in 4).
  • PBS buffer pH 7.4
  • BSA bovine serum albumin
  • Test Example 8 Fluorescence imaging (1) Confocal imaging and STED imaging were performed using the immunofluorescent labeled vimentin prepared in Test Example 7.
  • a super-resolution microscope TCS-SP8-STED equipped with an HCXPL-APO-100x.1.40 oil immersion lens was used for confocal imaging and STED imaging.
  • a 470 nm laser tunable white excitation laser, 80 MHz, output 30%, AOTF 90%
  • a fluorescence signal in the range of 480 to 585 nm was detected.
  • a tunable white excitation laser (470nm, 80MHz, output 40%, AOTF 90%) and CW-STED laser (592nm CW laser, output 20%, AOTF 80%)
  • the emission detection window was 480 to 585 nm, and the time gate method (time range 0.5 to 12 ns) was adopted.
  • Two-color STED imaging uses a tunable white excitation laser (470nm, 80MHz, output 80%, AOTF 90%) and CW-STED laser (592nm CW laser, output 20%, AOTF% 80%).
  • the time gate method (time range 0.5 to 12 ns) was adopted.
  • FIG. 8 shows the results of confocal imaging and STED imaging of immunofluorescent labeled vimentin using Phox-NHSNHEster (Example 9).
  • FIG. 8 shows confocal (a) and STED (b) micrographs of tubulin filaments immunolabeled with Phox-NHS Ester (Example 9) in fixed HeLa cells and corresponding confocals. (Orange line) and STED (crimson line) microscopic image optical resolution (c).
  • an enlarged image of the selected portion is inserted.
  • a tunable white pump laser (470nm, 80MHz, output 40%, AOTF 90%) and CW-STED laser (592nm CW laser, output 20%, AOTF 80%) were used.
  • the scale bar is 2 ⁇ m.
  • FIG. 9 shows a comparison of photostability between Alexa-Fluor 488 (Comparative Example 4) and Phox-NHS-Ester (Example 9) under STED conditions.
  • Alexa-Fluor 488 Comparative Example 4
  • Phox-NHS-Ester Example 9
  • FIG. 9C shows a plot of changes in fluorescence intensity against the number of STED imaging repetitions, and shows how much the fluorescence intensity can be maintained from the initial value.
  • the tubulin filaments labeled with Alexa Fluor 488 (Comparative Example 4) and Phox-NHS Ester (Example 9) were all imaged under the same conditions.
  • a tunable white pump laser (470nm, 80MHz, output 40%, AOTF 90%) and CW-STED laser (592nm CW laser, output 20%, AOTF 80%) were used.
  • 9 (a) and 9 (b) the scale bar is 2 ⁇ m.
  • FIG. 10 Comparison of photostability in Z-scan STED imaging of Alexa Fluor 488 (Comparative Example 4) and Phox-NHS Ester (Example 9) is shown in FIG. 10 and FIG. 11 (FIG. 10: Example 9, FIG. 11: Comparison). Example 4).
  • FIGS. 10 (a) and 11 (a) The confocal fluorescence microscope images of Alexa Fluor 488 (Comparative Example 4) and Phox-NHS Ester (Example 9) are shown in FIGS. 10 (a) and 11 (a), and the Z-scan STED microscope image at a depth of 2 ⁇ m is shown. 10 (b) and FIG. 11 (b). Eleven slides were recorded with Z-scan steps at 200 nm intervals. After analysis of 11 slides and image reconstruction, a three-dimensional structure of tubulin filaments was obtained with a size of 11.62 ⁇ 11.62 ⁇ 2.00 ⁇ m 3 as shown in FIGS. 10 (c) and 11 (c).
  • a tunable white excitation laser (470 nm, 80 MHz, output 40%, AOTF 90%) and a CW-STED laser (592 nm CW laser, output 20%, AOTF 80%) were used.
  • the tubulin filaments immunolabeled with Phox-NHS Ester (Example 9) and Alexa Fluor 488 (Comparative Example 4) were all imaged under the same conditions. 10 (a) and 11 (a), the scale bar is 2 ⁇ m.
  • Alexa Fluor 488 (Comparative Example 4) faded in the process of repeating the scan in the Z direction, and almost no fluorescence was observed on the sixth slide where the fluorescence image should be clearly observed most naturally.
  • the phosphole compound of the present invention does not show fading even in the Z-scan process, can observe an appropriate structure even after the image is reconstructed into a three-dimensional structure, and is excellent in light stability.
  • the phosphole compound of the present invention can also be applied to STED imaging that requires long-time light irradiation, such as Z-scan STED imaging and 3D STED imaging.
  • Test Example 9 Fluorescence imaging (2) The imaging experiments consisted of a DMI6000 CS equipped with a tunable (470-670nm) pulsed white light laser (WLL; 78MHz pulse repetition rate) for excitation and a STED laser (592nm continuous wave) to suppress fluorescence generation.
  • WLL tunable pulsed white light laser
  • STED laser 592nm continuous wave
  • a Leica TCS SP8 STED 3X system (Leica Microsystems) including an inverted microscope was used.
  • a HyD detector and a 100 ⁇ oil immersion objective (NA 1.4) were used.
  • the dye was excited with a WLL with a wavelength of 470 nm and the fluorescence signal was collected between 480 nm and 585 nm with a time gate interval of 0.5-12 ns.
  • z-stacked images were obtained in 50 nm increments.
  • the images were first deconvolved with Huygens Deconvolution software (Scientific Volume Imaging) and further processed with image analysis software ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).
  • ImageJ image analysis software http://imagej.nih.gov/ij/.
  • the dye-stained cells prepared above were irradiated with 470 nm (12 ⁇ W) WLL, 1024 ⁇ 1024 pixels; line average 3; frame average 1; irradiation time 5 seconds / An image was acquired in the image settings.
  • the total signal intensity for each image was normalized to the value of the first image and plotted as a function of the number of confocal images recorded.
  • the decay curve was analyzed as a pseudo first order reaction (Dyes Pigm. 1998, 37, 213-222.), And the photobleaching rate constant was calculated from the linear gradient. Relative photostability to Alexa Fluor 430 was determined using the inverse of the photobleaching rate constant.
  • the excitation wavelength 470 nm of Phox-COOH was selected from the pulse WLL.
  • ⁇ -tubulin was stained in HeLa cells fixed by indirect immunofluorescence using a Phox-COOH-labeled secondary antibody. As is apparent from the low background signal of the confocal image, it can be seen that the microtubules were stained to the extent that non-specific binding can be ignored (FIG. 12).
  • Alexa Fluor 430 has the largest difference in photostability, so we decided to use it as a comparison with Phox-COOH (PB430).
  • FIG. 19 (a) A first STED image was recorded (FIG. 19 (a)). This first STED image should include both cytoskeletons. Subsequently, when a second image was recorded under the same conditions, some filament structures disappeared (FIG. 19 (b)). Subtracting (removing) the second image (b) from the first image (a) yields an STED image of the lost filament, which corresponds to an Alexa Fluor 430 labeled vimentin filament ( Figure 19 (c)) .
  • PB430 Phox-COOH
  • Alexa-Fluor430-conjugated secondary antibody Alexa-Fluor430-conjugated secondary antibody

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Abstract

一般式：［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換されていてもよい芳香族炭化水素環又は置換されていてもよい複素芳香環を示す。Ar3は2価のπ共役ユニットを示す。R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。R2及びR3は同一又は異なって、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Zは反応性基を示す。］ で表される、ホスホール化合物は、溶媒の極性にかかわらず高い蛍光量子収率を維持できるとともに、水を多く含む環境下でも蛍光量子収率をより向上させ、耐光性を向上させた蛍光色素を提供することができる。

Description

ホスホール化合物
　本発明は、ホスホール化合物に関する。
　高い蛍光量子収率を有する蛍光性有機化合物は、有機EL素子の発光材料又は生体蛍光イメージングのための蛍光色素として重要であり、これまでに報告された例は、基礎研究及び応用の両面で枚挙に暇がない。
　しかしながら、従来から知られている蛍光性有機化合物の多くが、光照射を続けると徐々に分解し、退色してしまう。例えば、蛍光プローブとしては、耐光性を高めた色素群として、Alexa Fluor色素、ATTO色素等が有名であるが、これらを用いた場合でも、誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察することは困難である。このため、最先端の蛍光顕微鏡技術の観察対象が限定されているのが現状であり、蛍光色素の耐光性の向上が求められている。
　このような従来技術のなか、蛍光色素としては、特定の構造を有するホスホール化合物も知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。特許文献１のホスホール化合物には、極性の低い溶媒から高い溶媒まで高い蛍光量子収率を維持するとともに、そのうち一部のホスホール化合物は耐光性にも優れる蛍光色素である。
国際公開第２０１５／１１１６４７号
Chem. Asian J. 2009, 4, 1729-1740.
　特許文献１及び非特許文献１に記載の蛍光色素は高い蛍光量子収率を有し、耐光性に優れる蛍光色素であるが、水を多く含む環境下での蛍光量子収率には改善の余地がある。例えば、細胞、組織、生体等はその構成要素の大部分が水である。また、蛍光バイオイメージングによって観察する対象は微量及び微小であることから、高い感度と高いシグナル／ノイズ比で観察を行うためには、蛍光色素の水溶性及び水溶液中での蛍光量子収率の高さは重要である。このため、細胞、組織、生体等を対象とした蛍光バイオイメージングのための蛍光色素として用いるには、水中でも効率よく蛍光を発する分子の開発が求められている。非特許文献１及び特許文献１に記載の蛍光色素は、水に溶解しない。また、特許文献１に記載の蛍光色素は、有機溶媒に水を添加することで蛍光量子収率が低下する。
　さらに、一般に、蛍光イメージング用の共焦点レーザー顕微鏡に搭載されている汎用レーザーのうちよく用いられるのは、波長が短いもので405nm、430nm、488nm等のレーザーである。特に、非特許文献１に記載の蛍光色素は、吸収ピーク波長が367nmであり、これらの波長のレーザーでは励起することができないため、これらの光源を適用することが難しい。さらに、細胞に対する光毒性を考慮するとより長波長のレーザーを使用することが好ましい。
　本発明は、上記のような従来の課題を解決しようとするものであり、溶媒の極性にかかわらず高い蛍光量子収率を維持できるとともに、水を多く含む環境下でも蛍光量子収率をより向上させ、耐光性を向上させ、且つ、細胞、組織、生体等の蛍光バイオイメージングに広く適用できる蛍光色素を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有するホスホール化合物は、溶媒の極性にかかわらず高い蛍光量子収率を示すとともに、水を多く含む環境下でも蛍光量子収率をより向上させ、従来の蛍光色素と比較して耐光性を著しく向上させることができることから、誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察にも耐える蛍光色素であることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づき、さらに研究を重ね本発明を完成した。即ち、本発明は、以下の構成を包含する。
　項１．一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換されていてもよい芳香族炭化水素環又は置換されていてもよい複素芳香環を示す。Ar3は2価のπ共役ユニットを示す。R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。R2及びR3は同一又は異なって、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Zは反応性基を示す。］
で表される、ホスホール化合物。
　項２．前記Ar3が置換されていてもよいアルケニレン基、置換されていてもよいアルキニレン基、置換されていてもよいアリーレン基、又は置換されていてもよいヘテロアリーレン基である、項１に記載のホスホール化合物。
　項３．一般式（1B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式中、Ar2、Ar3、R1、R2、R3及びZは前記に同じである。Ar4は置換されていてもよい芳香族炭化水素環を示す。］
で表される、項１又は２に記載のホスホール化合物。
　項４．前記Zがカルボキシ基又はアルコキシカルボニル基である、項１～３のいずれかに記載のホスホール化合物。
　項５．前記反応性基が、アミン反応性基又はチオール反応性基である、項１～３のいずれかに記載のホスホール化合物。
　項６．前記アミン反応性基又はチオール反応性基が、一般式（2A）～（2E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、R5は水素原子又はスルホ基を示す。R6はアルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
で表される構造を末端に有する基である、項５に記載のホスホール化合物。
　項７．項１～６のいずれかに記載のホスホール化合物からなる蛍光色素。
　項８．誘導放出抑制（STED）イメージング用である、項７に記載の蛍光色素。
　項９．項５又は６に記載のホスホール化合物を用いたタンパク質標識剤。
　項１０．項１～６のいずれかに記載のホスホール化合物又は項７若しくは８に記載の蛍光色素を用いることを特徴とする、誘導放出抑制（STED）イメージング方法。
　項１１．項５若しくは６に記載のホスホール化合物、項７若しくは８に記載の蛍光色素、又は項９に記載のタンパク質標識剤を含有する、タンパク質標識化キット。
　項１２．項５若しくは６に記載のホスホール化合物、項７若しくは８に記載の蛍光色素、又は項９に記載のタンパク質標識剤と、タンパク質とを反応させる工程
を備える、タンパク質標識化方法。
　本発明のホスホール化合物は、溶媒の極性の高低にかかわらず、可視光領域の波長域（特に400～500nm程度）に吸収ピークを有するとともに、高い蛍光量子収率を示す。また、本発明のホスホール化合物は、水を多く含む環境下でも、蛍光量子収率を向上させることができるとともに、細胞、組織、生体等の蛍光バイオイメージングに広く適用することが可能である。
　このため、本発明のホスホール化合物は、誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察するのに適した蛍光色素である。
　さらに、本発明のホスホール化合物は、Zで示される反応性基をアミン反応性基又はチオール反応性基とする場合には、タンパク質を標識するタンパク質標識剤として機能することもできる。
実施例6のPhox 430 NHS Esterと、比較例3のC-Naphoxについて、Kohn-Shamプロットと、HOMO及びLUMOのエネルギーレベルを示す図である。 様々な溶媒中における実施例6のPhox 430 NHS Esterの紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルである。 様々な比率のDMSOとHEPESとの混合溶媒中における実施例6のPhox 430 NHS Esterと比較例3のC-Naphoxの蛍光量子収率を示すグラフである。 実施例8のPhox-COOHと、比較例3のC-Naphoxと、比較例4のC-Bphoxについて、DMSO / HEPES緩衝液 (pH = 7.3, v/v = 7/3) 混合溶媒中で、レーザー照射後様々な時間経過後の蛍光量子収率維持率を示すグラフである。 各蛍光色素（a: Alexa Fluor 488、b: C-Naphox、c: PB430）DMSO / HEPES緩衝液 (pH = 7.3, v/v = 7/3) 混合溶媒中で、レーザー照射後様々な時間経過後の吸収スペクトルを示す。溶液濃度は、460nmの励起波長で光学密度（Alexa Fluor 488: 0.22、C-Naphox: 0.22、PB430: 0.21）となるように調整した。 実施例8のPhox-COOH（10μM）について、蛍光のpH依存性を示すグラフである。 PBS緩衝溶液（pH= 7.4）中のPhox-COOH及びPhox-antibody conjugateのUV-vis吸収スペクトル（実線）及び蛍光スペクトル（破線）を示す。 免疫蛍光標識化ビメンチンの共焦点イメージング及びSTEDイメージングの結果を示す図である。（a）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンの共焦点蛍光顕微鏡像、（b）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンのSTED顕微鏡像、（c）は対応する共焦点（橙色線）及びSTED（深紅色線）顕微鏡像の光学的分解能を示すグラフである。 STED条件におけるAlexa Fluor 488（比較例4）とPhox-NHS Ester（実施例9）の光安定性を示す図である。（a）はAlexa Fluor 488（比較例4）で免疫標識化されたチューの5回の繰り返しSTED顕微鏡像、（b）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンの5回の繰り返しSTED顕微鏡像、（c）は記録されたSTED顕微鏡像の数の関数とする正常化細胞内蛍光強度プロットを示す。 （a）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンの共焦点蛍光顕微鏡像、（b）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンの2μmの深さにおけるZスキャンSTED顕微鏡像、（c）はPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンの3D構造である。 （a）はAlexa Fluor 488（比較例4）で免疫標識化されたチューブリンの共焦点蛍光顕微鏡像、（b）はAlexa Fluor 488（比較例4）で免疫標識化されたチューブリンの2μmの深さにおけるZスキャンSTED顕微鏡像、（c）はAlexa Fluor 488（比較例4）で免疫標識化されたチューブリンの3D構造である。 （a）固定されたHeLa細胞中でPhox-COOHで免疫標識された微小管の共焦点顕微鏡画像を示す。選択した領域の拡大図も示す。（b）図１３（a）の矢印に沿ってフィラメントを横切って撮影されたラインプロファイルを示す。 固定されたHeLa細胞における免疫標識微小管の蛍光画像を示す。（a）共焦点顕微鏡像（左図）、STED顕微鏡像（中図）及び強度プロファイル（右図）。共焦点顕微鏡像及びSTED顕微鏡像には、点線部分の拡大図も示す。強度プロファイルは、共焦点顕微鏡像が黒線、STED顕微鏡像が緑線である。（b）Phox-COOHで染色された最初の5つのSTED顕微鏡画像。（c）Alexa Fluor 488で染色された最初の5つのSTED顕微鏡画像。（d）記録されたSTEDイメージの数の関数としてプロットされた統合蛍光強度。すべての画像を470nmで励起して記録し、592nmのSTEDレーザー（CW-STED、30mW）をSTEDに使用した。スケールバーは2μmを示す。 STED条件下で細胞の同じ領域の繰り返し写真を示す（スケールバー: 2μm）。 固定されたHeLa細胞の微小管をPhox-COOHで免疫標識した。画像は、470nmでの励起（WLL、5μW）、592nmでの蛍光抑制（CW-STED、30mW）、及びTg= 0.5nsでのゲート検出を記録した。（a）繰り返されるSTED顕微鏡画像。各数字はフレームの数を示す。（b）各画像におけるPhox-COOHで標識された微小管の典型的な強度プロファイル（フレーム番号は、それぞれ1、10、20及び30である）。半値全幅（FWHM）を、Gaussian fitから計算した微小管の解像度によって計算した。（c）10個の蛍光スポットのGaussian fitを用いて得られたFWHMの統計分析。 （a）高さに対応するカラースケール（z方向の増分: 50nm、スケールバー: 5μm）を含む、Phox-COOHで免疫標識されたHeLa細胞微小管の3次元STED画像である。画像は、後述するSTED条件: 470nmでの励起（WLL、5μW）、592nmでの蛍光抑制（CW-STED、30mW、STED 3D zドーナツ、50%）、tg= 0.5nsでのゲート検出。各画像はHuygens Deconvolution Software（信号対雑音比: 7、品質閾値: 0.05）を用いてデコンボリューションし、z切片画像を着色してz深度を表した。（b）図１５（a）の対応するxz平面及びyz平面に沿ったSTED画像。 各色素で免疫標識された微小管のz-スキャンSTED画像の比較を示す。（a）Alexa Fluor 488、（b）Alexa Fluor 430、（c）Star 440SXP、（d）Atto 425、（e）Phox-COOH（PB430）。 各数字は、記録されたz-スキャン画像の数を示す。z-スキャンイメージングは、50nmのステップ、470nmの励起及び592nmの蛍光抑制レーザー（CW-STED、30mW; STED 3D zドーナツ、50%）で行った。スケールバーは2μmを示す。 （a-e）各色素で免疫標識された微小管を、470nmの共焦点レーザー（WLL、12μW）を照射しながら撮影した反復蛍光像の比較を示す。（a）Alexa Fluor 430、（b）STAR 440SX、（c）Alexa Fluor 488、（d）Atto 425、（e）Phox-COOH（PB430）。各数字は、記録された共焦点画像の数を示す。スケールバー: 2μm。（f）記録された数の関数としての初期値（10）に対する積分蛍光強度（1）のプロットを示す。（g）蛍光強度の変化に基づく一次プロットを示す。光退色速度は、直線の傾きから計算し、Alexa Fluor 430に正規化した。相対的光安定性は、表２で正規化された光退色速度の逆数を意味する。 STED条件下でのAlexa Fluor 430（a-c）とPhox-COOH（PB430）（d-f）との間の光安定性の比較を示す。Alexa Fluor 430標識ビメンチン（a, b）及びPhox-COOH（PB430）標識チューブリン（d, e）の第1及び第2のSTED画像を連続的に撮影し（スケールバー: 2μm）、それらの相対蛍光強度を比較した（c, f ）。同じイメージング条件：470nmでの励起（WLL、10μW）、592nmでの蛍光抑制（CW-STED、30mW）、Tg= 0.5nsでのゲート検出を、両者のイメージングに適用した。 Phox-COOH（PB430）及びAlexa Fluor 430のはっきりと異なる光安定性に基づくSTED顕微鏡と組合せた2色イメージングスキームを示す。微小管及びビメンチンフィラメントをそれぞれPhox-COOH（PB430）及びAlexa Fluor 430で別々に免疫標識した。（a, b）470nmで励起し（WLL、10μW）、592nmで蛍光抑制し（CW-STED、30mW）、2つのSTED顕微鏡像（デコンボリューションされたデータ）を連続して記録した。（c）画像（a）から画像（b）を引いた（除去した）画像。（d）画像（b）と画像（c）とを組合せた2色STED顕微鏡像。 異なる光安定性に基づく2色STEDイメージングの解像度の決定を示す。（a）微小管（緑色）及びビメンチンフィラメント（マゼンタ）をそれぞれPhox-COOH（PB430）及びAlexa Fluor 430で別々に免疫標識した2色STED顕微鏡像（デコンボリューションされたデータ）。点線に沿った強度プロファイルのプロットは、2色STED画像のインセットにおける（b）微小管及び（c）ビメンチンフィラメントと交差した。プロファイルはGaussian分布にフィッティングした。（d）半値全幅（FWHM）分解能の統計分析（n= 10）。
　本明細書において、「含有する（comprise）」は、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」も包含する概念である。また、本明細書において、数値範囲を「A～B」で示す場合、A以上B以下を意味する。
　１．ホスホール化合物
　本発明のホスホール化合物は、一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換されていてもよい芳香族炭化水素環又は置換されていてもよい複素芳香環を示す。Ar3は2価のπ共役ユニットを示す。R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。R2及びR3は同一又は異なって、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Zは反応性基を示す。］
で表される化合物である。
　このように、本発明のホスホール化合物は、縮環ホスホール骨格を有するために耐光性に優れるとともに、Ar3を介することにより種々様々な反応性基を導入することが可能である。また、このように、Ar3を介することにより、水が多い環境下でも高い蛍光量子収率を示すことができる。
　この末端の反応性基としては、様々な置換基を導入することが可能であり、例えば、アミン反応性基、チオール反応性基等を導入した場合には、タンパク質（特に抗体）を標識化するタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として使用することが可能であることから、本発明のホスホール化合物は、生体内で誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察する際に蛍光輝度の低下を抑制することができることから生体内で誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡で繰り返し観察する用途に適した化合物である。
　一般式（1）において、Ar1で示される芳香族炭化水素環としては、単環芳香族炭化水素環及び多環芳香族炭化水素環のいずれも採用でき、例えば、単環芳香族炭化水素環としてベンゼン環が挙げられ、多環芳香族炭化水素環としてナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、フルオレン環、ピレン環、トリフェニレン環等が挙げられる。
　Ar1で示される芳香族炭化水素環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　一般式（1）において、Ar1で示される複素芳香環としては、例えば、ピロリジン環、ピロール環、テトラヒドロチオフェン環、チオフェン環、オキソラン環、フラン環、イミダゾール環、ピラゾール環、チアゾール環、オキサゾール環、ピペリジン環、ピリジン環、ピラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾイミダゾール環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環等が挙げられる。
　Ar1で示される複素芳香環は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　Ar1としては、合成の容易さの観点から、置換されていてもよい芳香族炭化水素環が好ましく、置換されていてもよい多環芳香族炭化水素環がより好ましい。
　Ar1が置換されていてもよい多環芳香族炭化水素環である場合、本発明のホスホール化合物は、一般式（1A）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中、Ar2、Ar3、R1、R2、R3及びZは前記に同じである。Ar4は置換されていてもよい芳香族炭化水素環を示す。］
で表されるホスホール化合物と、
一般式（1B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［式中、Ar2、Ar3、Ar4、R1、R2、R3及びZは前記に同じである。］
で表されるホスホール化合物のいずれも採用できる。
　一般式（1A）及び（1B）において、Ar4で示される芳香族炭化水素環としては、上記したものを採用することができる。置換基の種類及び数も同様である。
　上記した一般式（1A）で表されるホスホール化合物と一般式（1B）で表されるホスホール化合物のなかでも、HOMO準位（最高被占有軌道のエネルギー準位）及びLUMO準位（最低空軌道のエネルギー準位）のエネルギー差をより小さくし、吸収ピーク波長及び蛍光ピーク波長をより長くする観点から、一般式（1B）で表されるホスホール化合物が好ましい。
　一般式（1）において、Ar2で示される芳香族炭化水素環としては、上記したものを採用することができる。置換基の種類及び数も同様である。
　一般式（1）において、Ar2で示される複素芳香環としては、上記したものを採用することができる。置換基の種類及び数も同様である。
　好ましいAr2の例としては、置換されていてもよい芳香族炭化水素環、特に非置換芳香族炭化水素環が挙げられる。
　一般式（1）において、Ar3で示される2価のπ共役ユニットとしては、例えば、アルケニレン基、アルキニレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基等が挙げられる。
　アルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基等の炭素数2～6、特に炭素数2～4のアルケニレン基等が挙げられる。
　アルケニレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　なお、置換基としてのアルコキシ基は、－ORで示される基を意味し、本明細書においてアルコキシ基におけるRは後述のアルキル基のみならず、アルキル鎖が酸素原子を介してエーテル結合した基、アルキル鎖にカルボキシ基が結合した基、アルキル鎖が－COO－を介してエステル結合した基等も包含する。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、n－プロポキシ基、イソプロポキシ基、n－ブトキシ基、イソブトキシ基、sec－ブトキシ基、tert－ブトキシ基、－O((CH2)pO)qCH3（pは1～5の整数、特に1～3の整数を示し、qは1～20の整数、特に2～10の整数を示す）、－O－CH2－COOH、－O－CH2－COOC2H5、－O((CH2)r－COO)sCH3（rは1～5の整数、特に1～3の整数を示し、sは1～20の整数、特に2～10の整数を示す）等が挙げられる。
　アルキニレン基としては、例えば、エチニレン基、プロピニレン基、ブチニレン基等の炭素数2～6、特に炭素数2～4のアルキニレン基等が挙げられる。
　アルキニレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　アリーレン基としては、例えば、フェニレン基、ナフチレン基、アントラセニレン基、フェナントレニレン基、フルオレニレン基、ピレニレン基、トリフェニレニレン基等が挙げられる。
　アリーレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　ヘテロアリーレン基としては、例えば、ピロリジレン基、ピロリレン基、テトラヒドロチエニレン基、チエニレン基、オキソラニレン基、フラニレン基、イミダゾレン基、ピラゾレン基、チアゾレン基、オキサゾレン基、ピペリジレン基、ピリジレン基、ピラジレン基、インドリレン基、イソインドリレン基、ベンゾイミダゾリレン基、キノリレン基、イソキノリレン基、キノキサリレン基等が挙げられる。
　ヘテロアリーレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のアルキル基、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　なかでも、Ar3としては、吸収ピーク波長及び蛍光ピーク波長（特に吸収ピーク波長）をより長くする観点から、置換されていてもよいアリーレン基が好ましく、非置換アルーレン基がより好ましく、フェニレン基がさらに好ましい。なかでも、Ar3としては、色素の光物性（吸収ピーク波長、蛍光ピーク波長、蛍光量子収率等）への影響をより低減しつつタンパク質標識部位を導入する観点から、m－フェニレン基が最も好ましい。
　一般式（1）において、R1で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用でき、例えば、メチル基、エチル基、n－プロピル基、イソプロピル基、n－ブチル基、イソブチル基、sec－ブチル基、tert－ブチル基等の炭素数1～10、特に1～6のアルキル基が挙げられる。
　R1で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、後述のシクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　一般式（1）において、R1で示されるシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等の炭素数3～10、特に炭素数4～8のシクロアルキル基が挙げられる。
　R1で示されるシクロアルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記アルキル基、上記シクロアルキル基、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　一般式（1）において、R1で示されるアリール基としては、単環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、炭素数6～18、特に炭素数6～14のアリール基が挙げられる。例えば、単環アリール基としてフェニル基が挙げられ、多環アリール基としてナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等が挙げられる。
　R1で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記アルキル基、上記シクロアルキル基、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　一般式（1）において、R1で示されるヘテロアリール基としては、例えば、ピロリジル基、ピロリル基、テトラヒドロチエニル基、チエニル基、オキソラニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
　R1で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、上記アルキル基、上記シクロアルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、例えば、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　なかでも、R1としては、吸収ピーク波長及び蛍光ピーク波長の観点から、置換されていてもよいアリール基が好ましく、置換されていてもよいフェニル基がより好ましく、フェニル基がさらに好ましい。
　一般式（1）において、R2及びR3で示されるアルキル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基としては、上記したものが採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
　なかでも、R2及びR3としては、置換されていてもよいアリール基が好ましく、水溶性の観点から、置換アリール基がより好ましく、アルコキシ基で置換されたアリール基がさらに好ましく、－O((CH2)pO)qCH3（pは1～5の整数、特に1～3の整数を示し、qは1～20の整数、特に2～10の整数を示す）、－O(CH2)rSO3H（rは1～5の整数、特に1～3の整数ｒを示す）等で置換されたアリール基が特に好ましく、－O(CH2)rSO3H（rは1～5の整数、特に1～3の整数ｒを示す）等で置換されたアリール基が最も好ましい。
　一般式（1）において、Zで示される反応性基としては、反応性を有する基であれば特に制限されない。Zがカルボキシ基；アルコキシカルボニル基；水酸基；アミノ基；クロロメチル基等のハロゲン化アルキル基；イソシアン基；イソチアシアン基等（特にカルボキシ基又はアルコキシカルボニル基）であるホスホール化合物は、当該反応性基と所望の置換基を有する化合物とを反応させることにより、Zを容易に、タンパク質を標識するための基（アミン反応性基、チオール反応性基等）とすることが可能である。このため、Zがカルボキシ基やアルコキシカルボニル基である場合や、タンパク質を標識するための基（アミン反応性基、チオール反応性基等）である化合物群は、本発明のホスホール化合物の範疇である。
　上記アミン反応性基は、標識対象となる化合物が有する置換されていてもよいアミノ基と反応性を有する基であり、タンパク質（特に抗体）が有する置換されていてもよいアミノ基と反応することにより、本発明のホスホール化合物がタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。
　また、上記チオール反応性基は、標識対象となる化合物が有する置換されていてもよいチオール基と反応性を有する基であり、タンパク質（特に抗体）が有する置換されていてもよいチオール基と反応することにより、本発明のホスホール化合物がタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。
　このようなアミン反応性基又はチオール反応性基としては、例えば、一般式（2A）～（2E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、R4は水素原子又はスルホ基を示す。R5は置換されていてもよいアルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
で表される構造（アミン反応性末端又はチオール反応性末端）を末端に有する基が好ましい。
　一般式（2C）において、R5で示されるアルキル基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
　このような条件を満たすアミン反応性基又はチオール反応性基としては、－O－、－COO－、－CONR6－（R6は水素原子又は上記アルキル基を示す）で表される基（特に－COO－）等の連結基を介してアミン反応性末端又はチオール反応性末端を有する基が好ましい。これにより、本発明のホスホール化合物をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能しやすいとともに、水が多い環境下でもより高い蛍光量子収率を示すことができる。このようなアミン反応性基又はチオール反応性基としては、具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、nは1～6の整数を示す。］
等が挙げられる。
　上記式中、nは1～6の整数が好ましく、1～4の整数がより好ましい。
　なかでも、合成の容易さ、タンパク質（特に抗体）の標識しやすさ等の観点から、アミン反応性基としては
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
等が好ましく、チオール反応性基としては
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、nは前記に同じである。］
が好ましい。
　上記のような条件を満たす一般式（1）で表されるホスホール化合物としては、HOMO準位（最高被占有軌道のエネルギー準位）及びLUMO準位（最低空軌道のエネルギー準位）のエネルギー差をより小さくし、吸収ピーク波長及び蛍光ピーク波長をより長くするとともに、蛍光量子収率をより向上させるとともに、水が多い環境下でも高い蛍光量子収率を示すことができる観点から、一般式（1B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式中、Ar2、Ar3、Ar4、R1、R2、R3及びZは前記に同じである。］
で表されるホスホール化合物が好ましく、一般式（1B1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［式中、Ar2aは置換されていてもよい芳香族炭化水素環を示す。Ar3aは置換されていてもよいアリーレン基を示す。R1aは置換されていてもよいアリール基を示す。R2a及びR3aは同一又は異なって、アルコキシ基で置換されたアリール基を示す。Ar4は前記に同じである。］
で表されるホスホール化合物がより好ましく、後述の実施例において示されるホスホール化合物がさらに好ましい。
　また、本発明のホスホール化合物は、上記一般式（1）で表されるホスホール化合物が水和物又は溶媒和物として含有する場合もあり、いずれも本発明の範囲に包含される。
　2．ホスホール化合物の製造方法
　本発明のホスホール化合物の製造方法は特に制限されない。例えば、Zがアミン反応性基又はチオール反応性基である一般式（1C）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、Ar1、Ar2、Ar3、R1、R2及びR3は前記に同じである。Zaはアミン反応性基又はチオール反応性基を示す。］
で表されるホスホール化合物は、例えば、特許文献１の化合物7a, 7b等の合成方法に準じて合成した一般式（3）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、Ar1、Ar2、R1、R2及びR3は前記に同じである。R7は保護基を示す。］
で表されるホスホール化合物を出発物質として、以下の反応式1：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、Ar1、Ar2、R1、R2、R3、R7及びZaは前記に同じである。R8はアルキル基を示す。X1はハロゲン原子を示す。］
にしたがって合成することが好ましい。
　なお、R2及びR3として－O((CH2)pO)qCH3又は－O(CH2)rSO3Hで置換されたアリール基を採用する場合、以下の反応式2：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、Ar1、Ar2、R1、R7、R8、X1及びZaは前記に同じである。R2a及びR3aは同一又は異なって、－OR9（R9は上記アルキル基、後の工程の行いやすさを考慮して特にメチル基を示す）で表される基で置換されたアリール基を示す。R2b及びR3bは同一又は異なって、水酸基で置換されたアリール基を示す。R2c、R3c及びR8cは同一又は異なって、－O((CH2)pO)qCH3又は－O(CH2)rSO3Hで置換されたアリール基を示す（p、q及びrは前記に同じである）。］
にしたがって合成することが好ましい。
　反応式1及び2において、R8及びR9で示されるアルキル基としては、上記したものを採用することができる。置換基の種類及び数も同様である。
　反応式1及び2において、X1で示されるハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　反応式2において、アリール基としては、上記したものを採用することができる。
　（2－1）化合物（3）→化合物（4）、化合物（3A）→化合物（4A）
　本工程では、ハロゲン化剤を用いて、化合物（3）又は化合物（3A）の末端の保護基をハロゲン化することが好ましい。
　ハロゲン化剤としては、例えば、ヨウ素（I2）、一塩化ヨウ素（ICl）、三塩化ヨウ素（ICl3）、N－ヨードコハク酸イミド（NIS）、臭素（Br2）、N－ブロモコハク酸イミド（NBS）、塩素（Cl2）等が挙げられ、通常、化合物（3）又は化合物（3A）1モルに対して、1～5モル（特に1.5～3モル）使用することが好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、ハロゲン化炭化水素が好ましく、ジクロロメタンがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－2）化合物（4）→化合物（5）、化合物（4A）→化合物（5A）
　本工程では、上記工程（2－1）で得られた化合物（4）又は化合物（4A）と、一般式（8）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［式中、Ar3及びR8は前記に同じである。R10はボロン酸又はボロン酸エステル基を示す。］
で表される化合物とを、鈴木－宮浦カップリング反応により反応させて化合物（5）又は化合物（5A）を得ることができる。
　一般式（8）において、R10で示されるボロン酸又はボロン酸エステル基としては、例えば、一般式（9）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、R11は同一又は異なって、水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を示す。R11同士は互いに連結し、隣接する－O－N－O－とともに環を形成してもよい。］
で表される基が挙げられる。
　一般式（9）において、R11で示されるアルキル基としては、上記したものが採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
　このようなR10で示されるボロン酸又はボロン酸エステル基としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
等が挙げられる。
　化合物（8）の使用量は、通常、化合物（4）又は化合物（4A）1モルに対して、1～5モル（特に1.5～3モル）使用することが好ましい。
　本工程では、鈴木－宮浦カップリングに通常使用されるパラジウム触媒が使用される。具体的には、酢酸パラジウム（Pd(OAc)2）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（Pd(PPh3)4）、トリフルオロ酢酸パラジウム、塩化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（0）（Pd2(dba)3）等が挙げられ、本工程では、合成の容易さ、収率等の観点から、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（Pd(PPh3)4）が好ましい。パラジウム触媒の使用量は、通常、化合物（4）又は化合物（4A）1モルに対して、0.01～0.3モルが好ましく、0.02～0.1モルがより好ましい。
　本工程では、必要に応じて配位子化合物を使用することもできる。配位子化合物としては、鈴木－宮浦カップリングに通常使用される配位子化合物を通常使用される量使用することができる。
　本工程では、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、フッ化カリウム、フッ化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム等が挙げられ、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、リン酸カリウムが好ましい。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、化合物（4）又は化合物（4A）1モルに対して、1～20モルが好ましく、3～10モルがより好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、芳香族炭化水素が好ましく、トルエンがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。なお、これらの有機溶媒と水との混合溶媒を採用することもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、0～150℃が好ましく、50～100℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－3）化合物（5）→化合物（6）、化合物（5A）→化合物（6A）
　本工程では、化合物（5）又は化合物（5A）に対して酸触媒を用いて加水分解することで、化合物（6）又は化合物（6A）を得ることができる。
　加水分解に使用する酸触媒は、一般にエステルの加水分解に用いられる酸を使用できるが、R8がtert－ブチル基等の反応しにくい基である場合は、トリフルオロ酢酸、塩酸等の強酸を用いることが好ましい。酸触媒は通常液体であるため、その使用量は過剰量とすることが好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、エーテル及び脂肪族ハロゲン化炭化水素が好ましく、アニソール及びジクロロメタンがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－4）化合物（6A）→化合物（6B）
　本工程では、化合物（6A）に対して、ルイス酸を用いて脱アルキル化することで、化合物（6B）を得ることができる。
　ルイス酸としては、例えば、三臭化ホウ素、三臭化アルミニウム、三塩化ホウ素、三塩化アルミニウム、四塩化チタン、四塩化スズ、三フッ化ホウ素、ヨードトリメチルシラン、四塩化ケイ素等の1種又は2種以上が挙げられ、通常、ルイス酸は液体であるため、化合物（6A）に対して過剰量を使用することが好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、脂肪族ハロゲン化炭化水素が好ましく、ジクロロメタンがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－5）化合物（6B）→化合物（7）、化合物（6C）
　本工程では、化合物（6B）に対して、一般式（10A）：
R12O((CH2)pO)qCH3　　　（10A）
［式中、p及びqは前記に同じである。R12はトシル基を示す。］
で表される化合物、又は一般式（10B）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
［式中、R13は置換されていてもよいアルキレン基を示す。］
で表される化合物とを反応させ、カルボキシ基のエステル化及び必要に応じてフェノール性水酸基のエーテル化を行うことにより化合物（7）又は化合物（6C）を得ることができる。なお、化合物（10A）を使用した場合は化合物（7）が得られ、化合物（10B）を使用した場合は化合物（6C）が得られる。このため、化合物（10B）を使用する場合は、後述の（2－6）工程を飛ばすことができる。
　一般式（10B）において、R13で示されるアルキレン基としては、炭素数1～6（特に炭素数2～4）のアルキレン基が挙げられ、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等が挙げられる。アルキレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、上記アルキル基、上記シクロアルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、アルケニル基（ビニル基、プロペニル基等）、アルキニル基（エチニル基、1－プロピニル基等）、上記アルコキシ基、カルボニル基、シアノ基、ニトロ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　化合物（10A）又は化合物（10B）の使用量は、通常、化合物（6B）1モルに対して、2～20モルが好ましく、3～10モルがより好ましい。
　本工程では、必要に応じて、塩基を使用することもできる。塩基としては、塩化アンモニウム、フッ化カリウム、フッ化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメトキシド、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム等の1種又は2種以上が挙げられ、本工程では、収率及び合成の容易さの観点から、炭酸カリウムが好ましい。塩基を使用する場合の使用量は、合成の容易さ、収率等の観点から、化合物（6B）1モルに対して、3～50モルが好ましく、5～20モルがより好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、ニトリル系溶媒が好ましく、アセトニトリルがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、還流下に行うことがより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－6）化合物（7）→化合物（6C）
　本工程では、化合物（7）に対して塩基触媒を用いて加水分解することで、化合物（6C）を得ることができる。
　加水分解に使用する塩基触媒は、一般にエステルの加水分解に用いられる塩基触媒を使用できるが、水酸化リチウムが好ましい。塩基触媒は通常液体であるため、その使用量は過剰量とすることが好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、エーテルが好ましく、テトラヒドロフランがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－7）化合物（6）→化合物（1C）、化合物（6C）→化合物（1C1）
　本工程では、化合物（6）又は化合物（6C）に対して、常法により、化合物（6）又は化合物（6C）のカルボキシ基を所望の反応性基に置換することができる。この際、例えば、カルボジイミド系縮合剤（N,N’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド）、イミダゾール系縮合剤（カルボニルジイミダゾール、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド）、トリアジン系縮合剤（4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド）、ホスホニウム系縮合剤（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリスジメチルアミノホスホニウム塩、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム）、ウロニウム系縮合剤（{{[(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデン)アミノ]オキシ}-4-モルホリノメチレン}ジメチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸塩、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、スクシンイミド系縮合剤（N－ヒドロキシスクシンイミド、N,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU））等の縮合剤を使用することができる。例えば、N－ヒドロキシスクシンイミド、TSTU等を反応させることで、末端にスクシンイミド骨格を有する本発明のホスホール化合物（化合物（1C）又は化合物（1C1））を得ることができる。このようにして得られる末端にスクシンイミド骨格を有する本発明のホスホール化合物は、タンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。
　縮合剤の使用量は、通常、化合物（6）又は化合物（6C）1モルに対して、1～5モルが好ましく、1.5～3モルがより好ましい。
　本工程では、カップリング試薬として、カルボジイミド試薬を使用することが好ましい。カルボジイミド試薬としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1－(3－ジメチルアミノ)－プロピル3－エチルカルボジイミド（EDC）等の1種又は2種以上が挙げられ、これらのカルボジイミド試薬は、塩酸塩等の塩（1－(3－ジメチルアミノ)－プロピル3－エチルカルボジイミド塩酸塩（EDCI）等）を使用することもできる。これらカップリング試薬の使用量は、通常、化合物（6）又は化合物（6C）1モルに対して、1～5モルが好ましく、1.5～3モルがより好ましい。
　本工程では、カップリング剤として塩酸塩（酸性塩）を使用することがあるため、塩基を使用することが好ましい。このような塩基としては、例えば、ピリジン、ジアルキルアミノピリジン（4－ジメチルアミノピリジン（DMAP）等）等の1種又は2種以上が挙げられ、その使用量は、通常、化合物（6）又は化合物（6C）1モルに対して、1～5モルが好ましく、1.5～3モルがより好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、アミド系溶媒が好ましく、ジメチルホルムアミドがより好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることにより、本発明のホスホール化合物を得ることができる。
　また、上記のようにして得られた本発明のホスホール化合物が、末端にスクシンイミド骨格を有するホスホール化合物である場合には、さらに、N-(2-アミノエチル)マレイミド等のマレイミド化合物と反応させることで、末端にマレイミド骨格を有する本発明のホスホール化合物を得ることもできる。使用されるマレイミド化合物は、トリフルオロ酢酸塩等のような塩の形態であってもよい。
　マレイミド化合物の使用量は、通常、化合物（1C）又は化合物（1C1）1モルに対して、0.2～5モルが好ましく、0.5～2モルがより好ましい。
　本工程では、マレイミド化合物としてトリフルオロ酢酸塩（酸性塩）を使用することがあるため、塩基を使用することが好ましい。このような塩基としては、例えば、ピリジン、ジアルキルアミノピリジン（4－ジメチルアミノピリジン（DMAP）等）、アミン（トリエチルアミン等）等の1種又は2種以上が挙げられ、その使用量は、通常、化合物（1C）又は化合物（1C1）1モルに対して、過剰量とすることが好ましい。
　反応は通常反応溶媒の存在下で行うことができる。使用できる反応溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、1,4－ジオキサン、ジメトキシエタン（DME）、ジグライム、シクロペンチルメチルエーテル（CPME）、tert－ブチルメチルエーテル（TBME）、アニソール等のエーテル；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の脂肪族ハロゲン化炭化水素；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド（DMSO）等が挙げられ、合成の容易さ、収率等の観点から、ジメチルスルホキシドが好ましい。これらの反応溶媒は単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　反応雰囲気は、通常、不活性ガス雰囲気（アルゴンガス雰囲気、窒素ガス雰囲気等）を採用し得る。反応温度は、加熱下、常温下及び冷却下のいずれでも行うことができ、通常、－50～100℃が好ましく、0～50℃がより好ましい。反応時間は特に制限されず、反応が十分に進行する時間とすることが好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることにより、本発明のホスホール化合物を得ることができる。
　なお、上記では、本発明のホスホール化合物の一態様の合成方法の一例について記載したが、この製造方法に限定されることはなく、様々な合成方法で合成することができる。
　3．蛍光色素及びタンパク質標識剤
　本発明の蛍光色素は、上記の本発明のホスホール化合物からなる。
　本発明の蛍光色素は、縮環ホスホール骨格を有するために耐光性（光安定性）に優れるとともに、Ar3を介することにより種々様々な反応性基（Z）を導入することが可能である。また、このように、Ar3を介することにより、水が多い環境下でも高い蛍光量子収率を示すことができる。
　この末端の反応性基（Z）としては、様々な置換基を導入することが可能であり、例えば、アミン反応性基、チオール反応性基等を導入した場合には、タンパク質（特に抗体）を標識化するタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として使用することが可能であり、繰り返しイメージングを行っても蛍光輝度の低下が抑制されることから、本発明の蛍光色素は、生体内で誘導放出抑制（STED）イメージング等の超解像顕微鏡（特に誘導放出抑制（STED）顕微鏡）で繰り返し観察するのに適している。
　本発明のホスホール化合物をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として使用する場合、その対象となるタンパク質（特に抗体）としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、アネキシンV、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD20抗体、抗CD25抗体、抗CD43抗体、抗CD44抗体、抗CD68抗体、抗IFN-γ抗体、抗TNF-α抗体、抗Ly-6G抗体、抗Ku70抗体、抗IL-4抗体、抗IL-17抗体、抗IL-31抗体、抗Notch1抗体、抗Notch3抗体、抗FOXBP3抗体、抗Ki-67抗体、抗HLA-A2抗体、抗α-チューブリン抗体、抗カテプシン-D抗体、抗アンジオテンシン抗体、抗COX1抗体、抗GLUT1抗体、抗AKT1/2/3抗体、抗Apg3抗体、抗βカテニン抗体、抗CDK5抗体、抗CEA抗体、抗HER2抗体等が挙げられる。
　本発明のホスホール化合物のうち、Zで示される反応性基をアミン反応性基又はチオール反応性基とした化合物をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）に用いる場合は、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）は、本発明のホスホール化合物を含有しているが、有機溶媒中に溶解させて溶液とすることが好ましく、耐光性をより向上させつつ、水が多い環境下でもより高い蛍光量子収率を示す観点から、本発明のホスホール化合物の含有量は、1×10-8～1×10-4 mol/Lが好ましく、1×10-7～1×10-5 mol/Lがより好ましい。
　本発明の蛍光色素（ホスホール化合物）を溶液からなるタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）とする場合、使用し得る有機溶媒としては、特に制限はなく、極性溶媒及び非極性溶媒のいずれも使用できる。
　極性溶媒としては、例えば、エーテル化合物（テトラヒドロフラン、アニソール、1,4-ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル等）、アルコール（メタノール、エタノール、アリルアルコール等）、エステル化合物（酢酸エチル等）、ケトン（アセトン等）、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム等）、ジメチルスルホキシド、アミド系溶媒（N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、N-メチルピロリドン等）、ニトリル系溶媒（アセトニトリル等）等が挙げられる。
　非極性溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の脂肪族有機溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族溶媒等が挙げられる。
　このように、様々な溶媒中において、同様に蛍光させることが可能であるため、本発明のホスホール化合物からなる蛍光色素は、汎用性の高い色素である。
　本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）は、上記のとおり、溶液の形態が好ましいが、生体内で観測する場合は、pHは5～11程度が好ましく、6.5～7.5程度がより好ましい。pHを調整するために、緩衝剤（ヘペス緩衝剤、トリス緩衝剤、トリシン－水酸化ナトリウム緩衝剤、リン酸系緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水等）等を併用することもできる。
　実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらのみに限定されるものではない。
　本実施例において、融点（mp）又は分解温度は、Yanaco MP-S3装置で測定した。1H NMRスペクトル、13C {1H} NMRスペクトル及び31P {1H}NMRは、JEOL AL-400（1H: 400 MHz、13C: 100 MHz、31P: 162 MHz）、又はJEOL A-600 spectrometer（1H: 600 MHz、13C: 150 MHz、31P: 243 MHz）を用いて、溶媒としてCDCl3又はDMSO-d6中で測定した。化学シフトはδppmで表記し、1H NMR測定はCHCl3 (7.26 ppm)、CH2Cl2 (5.30 ppm)、アセトン(2.05 ppm)及びDMSO (2.50 ppm)のシグナルを内部標準として用い、13C NMR測定はCDCl3 (77.16 ppm)、CD2Cl2 (53.84 ppm)及びDMSO-d6 (39.52 ppm)のシグナルを内部標準として用いた。また、31P NMRは、H3PO4 (0.00 ppm)を外部標準として用いた。マススペクトルは、大気圧化学イオン化法（APCI）により、Bruker micrOTOF Focus spectrometry systemで測定した。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、シリカゲル60F254（Merck）を0.25mmの厚さで塗布したガラスプレート上で行った。カラムクロマトグラフィーは、中性シリカゲルPSQ100B（富士シリシア化学（株））を用いて行った。分取リサイクル高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、逆相カラム（Wakosil-II 5C18 HG Prep）を備えたLC-918（日本分析工業（株））、又は逆相カラム（YMC-DispoPackAT ODS）を備えたYMC LC-forte/Rを用いて行った。特に断りのない限り、全ての反応は窒素雰囲気下でおこなった。特に断りのない限り、溶媒及び試薬は市販品を精製せずに使用した。無水テトラヒドロフラン（THF）、トルエン、ジエチルエーテル（Et2O）及びCH2Cl2は関東化学（株）から購入し、Glass Contour Solvent Systemsで精製した。2-ブロモ-3-ヨードナフタレン（Cottet, F. et al. Synthesis, 5, 798-803 (2005).）、1-ブロモナフタレン-2-イルトリフレート（Weimar, M. et al. Org. Lett., 15, 1706-1709 (2013).）及び(4-トリメチルシリルフェニル)アセチレン（Wu, J. et al. J. Org. Chem., 69, 8194-8204 (2004).）は、既報にしたがい合成した。
　合成例1：化合物1（1-ブロモ-2-(4-トリメチルシリルフェニルエチニル)ナフタレン）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式中、Tfはトリフルオロメタンスルホニル基を示す。TMSはトリメチルシリル基を示す。Pd(PPh3)4はテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)を示す。Et3Nはトリエチルアミンを示す。以下同様である。］
　1-ブロモナフタレン-2-イルトリフレート（99.44g, 280mmol）、4-トリメチルシリルフェニルアセチレン（48.80g, 280mmol）をトリエチルアミン（Et3N; 500mL）に溶解させた溶液に20分間乾燥窒素ガスを吹き込むことで脱気した。テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（Pd(PPh3)4; 3.24 g, 2.80mmol）、及びCuI（0.533g, 2.80mmol）を添加した後、混合物を60℃で20時間撹拌した。混合物を室温まで冷ました後、ろ過して無機塩を除去し、トルエン（200mL）で洗浄した。全ての揮発性物質を減圧下で留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン、Rf= 0.24）で分離し、得られた粗生成物をメタノール（MeOH; 100mL）で再結晶することで、目的物である化合物1を白色粉末として30.50g得た（80.4mmol, 収率29%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000025
　合成例2：化合物2（3-ブロモ-1-フェニル-2-(4-トリメチルシリルフェニル)ナフト[1,2-b]ホスホール-P-オキシド）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
［式中、tBuLiはtert-ブチルリチウムを示す。PhP(NEt2)Clはクロロフェニルジエチルアミノホスフィンを示す。PBr3は三臭化リンを示す。Phはフェニル基を示す。以下同様である。］
　合成例1で得た化合物1（30.50g, 80.4mmol）の無水テトラヒドロフラン（THF; 400mL）の溶液に、tert-ブチルリチウム（tBuLi）のペンタン溶液（1.60M, 100.5mL, 160.8mmol）を、-78℃で滴下した。-78℃で1時間撹拌した後、懸濁液を-40℃まで2時間かけてゆっくりと昇温した。混合物を-78℃まで冷却した後、クロロフェニルジエチルアミノホスフィン（PhP(NEt2)Cl; 15.5 mL, 80.5 mmol）を0.5時間かけて添加し、混合物を0℃まで0.5時間かけてゆっくりと昇温した。混合物を-78℃まで再度冷却した後、三臭化リン（PBr3; 7.64mL, 80.4mmol）を0.5時間かけて添加し、得られた混合物を室温まで昇温した。ほとんどのペンタン（約100mL）を留去した後、混合物を80℃で48時間還流させた。冷却した後、ほとんどの揮発性物質を減圧下で留去した。残渣を酢酸エチル（EtOAc; 100mL）で希釈し、過酸化水素水（10mL, 30%）を加えて0℃で1時間攪拌した。0℃でNa2SO3水溶液（100mL, 10%）で反応をクエンチし、混合物を酢酸エチル（EtOAc; 300mL）で2回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水（100mL）で洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2 to 10/1 CH2Cl2/酢酸エチル）及びメタノール（MeOH; 100mL）による再結晶によって精製し、目的物である化合物2を黄色固体として19.48g得た（38.7mmol, 収率48%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000027
　合成例3：化合物3の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
［式中、Meはメチル基を示す。以下同様である。］
　合成例2で得た化合物2（10.07g, 20.0mmol）の無水トルエン（30mL）の懸濁液に、HSiCl3（8.07mL, 80.0mmol）を一度に添加した。50℃で1時間撹拌した後、全ての揮発性物質を減圧下で留去した。次に、ここにトルエン（20mL）を添加し、窒素雰囲気下、得られた懸濁液をCelite（登録商標）でろ過し、トルエン（10mL）で洗浄した。減圧下でろ液を濃縮した後、得られた白色固体を無水ジエチルエーテル（Et2O; 100mL）中に懸濁させた。この懸濁液に、tert-ブチルリチウム（tBuLi）のペンタン溶液（1.60M, 25.0mL, 40.0mmol）を、-78℃で30分かけて添加した。同じ温度で2時間撹拌した後、4,4’-ジメトキシベンゾフェノン（4.85g, 20.0mmol）を添加し、得られた混合物を一晩かけて室温までゆっくりと昇温した。次に、飽和NH4Cl水溶液（50mL）で反応をクエンチし、過酸化水素水（10mL, 30%）を加え、室温で0.5時間撹拌した。0℃で10%Na2SO3水溶液（100mL）で反応をクエンチした後、混合物をCHCl3（2000mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（200mL）で洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、得られた粗生成物をトルエン（200mL）からの再結晶を2回行って精製し、目的物である化合物3を白色固体として8.50 g得た（12.7mmol, 収率64%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
　合成例4：化合物4の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
［式中、Sc(OTf)3はトリフルオロメタンスルホン酸スカンジウム(III)を示す。以下同様である。］
　合成例3で得た化合物3（8.180g, 12.27mmol）、及びトリフルオロメタンスルホン酸スカンジウム(III)（Sc(OTf)3; 6.039g, 12.27mmol）の混合物の1,2-ジクロロエタン（300mL）溶液を室温で撹拌した。48時間撹拌した後、H2O（200mL）を添加して反応をクエンチした。有機相を分離し、水相をCHCl3（500mL）で抽出した。合わせた有機層をH2O（200mL）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下に濃縮し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2 to 10/1 CH2Cl2/酢酸エチル、Rf= 0.31 in 10/1 CH2Cl2/酢酸エチル）、及び続くエタノール（20mL）からの再結晶により精製し、目的物である化合物4を黄色固体として3.99g得た（6.15mmol, 収率50%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000031
　合成例5：化合物5の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　合成例4で得た化合物4（3.945g, 6.08mmol）の無水CH2Cl2（50mL）溶液に、一塩化ヨウ素（ICl）のCH2Cl2溶液（1.00M, 12.16mL, 12.16mmol）を0℃で添加し、得られた混合物を室温で2時間撹拌した。5%Na2S2O3水溶液（100mL）で反応をクエンチした後、有機相を分離し、水相をCHCl3（200mL）で抽出した。合わせた有機層をH2O（50mL）で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2 to 10/1 CH2Cl2/酢酸エチル、Rf= 0.29 in 10/1 CH2Cl2/酢酸エチル）、及び続くエタノール（20mL）からの再結晶により精製し、目的物である化合物5を黄色固体として3.782g得た（5.38mmol, 収率88%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000033
　実施例1：化合物6の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
［式中、tBuはtert-ブチル基を示す。以下同様である。］
　脱気したトルエン（24mL）及びH2O（6mL）の混合溶媒に、合成例5で得た化合物5の固体（1.405g, 2.00mmol）、3-(tert-ブトキシカルボニル)フェニルボロン酸（0.888g, 4.00mmol）、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（Pd(PPh3)4; 0.116g, 0.100mmol）、及びK3PO4（2.547g, 12.0mmol）を添加し、得られた混合物を80℃で12時間撹拌した。室温まで冷却した後、有機相を分離し、水相を酢酸エチル（EtOAc; 50mL）で抽出した。合わせた有機層をH2O（20mL）、及び飽和食塩水（20mL）で洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（2/1 to 1/1 ヘキサン/酢酸エチル、Rf= 0.29 in 1/1 ヘキサン/酢酸エチル）により精製し、目的物である化合物6を黄色固体として1.444g得た（1.92mmol, 収率96%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000035
　実施例2：化合物7の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　実施例1で得た化合物6（1.400g, 1.86mmol）のCH2Cl2（20mL）溶液に、アニソール（2mL）及びトリフルオロ酢酸（TFA; 5mL）を順番に添加し、得られた混合物を室温で4時間撹拌した。全ての揮発性物質を減圧下で留去した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 to 5/1 CHCl3/酢酸エチル、Rf= 0.04 in 5/1 CHCl3/酢酸エチル）、及び続く酢酸エチル（10mL）からの再結晶により精製し、目的物である化合物7を黄色固体として1.230g得た（1.77mmol, 収率95%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000037
　実施例3：化合物8の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　実施例2で得た化合物7（500mg, 0.718mmol）の無水CH2Cl2（30mL）溶液に、三臭化ホウ素（BBr3; 1.38mL, 14.3mmol）を-78℃で滴下し、得られた混合物を室温まで一晩かけてゆっくりと昇温した。0℃でH2O（20mL）で反応をクエンチし、混合物を酢酸エチル（300mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（50mL）で3回洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル to 10/3 酢酸エチル/メタノール）、及びHPLC（2/1 酢酸エチル/メタノール）により精製し、目的物である化合物8を黄色固体として382mg得た（0.571mmol, 収率80%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000039
　実施例4：化合物9の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
［式中、Tsはトシル基を示す。以下同様である。］
　実施例3で得た化合物8（200mg, 0.299mmol）、ヘキサ(エチレングリコール)モノメチルエーテルトシラート（676mg, 1.50mmol）、及びK2CO3（415mg, 3.00mmol）の無水CH3CN（3mL）溶液を48時間還流した。室温まで冷却した後、混合物を酢酸エチル（EtOAc; 50mL）で希釈し、飽和食塩水（15mL）で3回洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 to 50/1 CHCl3/メタノール）により精製し、目的物である化合物9を高粘性油状物質として366mg得た（0.243mmol, 収率81%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000041
　実施例5：化合物10の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
［式中、THFはテトラヒドロフランを示す。以下同様である。］
　実施例4で得た化合物9（350mg, 0.233mmol）のテトラヒドロフラン（THF; 10mL）及びH2O（10mL）の溶液に、水酸化リチウム・1水和物（LiOH・H2O; 1.00g, 23.8mmol）を添加した。室温で16時間撹拌した後、混合物を塩酸（1M, 30mL）で酸性にした。混合物を酢酸エチル（EtOAc; 200mL）で2回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水（50mL）で3回洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 to 20/1 CHCl3/メタノール）により精製し、目的物である化合物10を高粘性油状物質として267mg得た（0.218mmol, 収率94%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000043
　実施例6：化合物11（Phox 430 NHS Ester）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
［式中、NHSはN-ヒドロキシスクシンイミドを示す。DMAPはN,N-ジメチル-4-アミノピリジンを示す。EDCIは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を示す。DMFはジメチルホルムアミドを示す。以下同様である。］
　実施例5で得た化合物10（180mg, 0.147mmol）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS; 33.8mg, 0.294mmol）、及びN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP; 35.9mg, 0.294mmol）の無水ジメチルホルムアミド（DMF; 5mL）溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDCI; 56.4mg, 0.294mmol）を添加した。室温で4時間撹拌した後、混合物を酢酸エチル（EtOAc; 50mL）で希釈し、飽和食塩水（15mL）で3回洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3 to 50/1 CHCl3/メタノール）により精製し、目的物である化合物11を高粘性油状物質として153mg得た（0.116mmol, 収率79%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000045
　実施例7：化合物12の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　実施例2で得た化合物7（200mg, 0.287mmol）の無水CH2Cl2（10mL）溶液に、三臭化ホウ素（BBr3; 0.55mL, 5.7mmol）を-78℃で滴下し、得られた混合物を室温まで一晩かけてゆっくりと昇温した。0℃でH2O（5mL）で反応をクエンチし、混合物を酢酸エチル（200mL）で抽出した。有機層を飽和食塩水（30mL）で3回洗浄し、次いで、無水Na2SO4で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮した後、得られた固体を乾燥ジメチルホルムアミド（DMF; 5mL）中に溶解した。次いで、この溶液にCs2CO3（2.22g, 6.81mmol）、及び1,3-プロパンスルトン（0.500mL, 5.69mmol）を添加し、得られた混合物を室温で2時間撹拌した。全ての揮発性物質を減圧下で留去した後、得られた固体を水（10mL）に溶解させた。次いで、この水溶液にLiOH・H2O（1.00g, 23.8mmol）を添加し、得られた溶液を室温で2時間撹拌した。濃塩酸で酸性にした後、混合物を逆相HPLC（H2O to 1/1 H2O/CH3CN, +0.1%トリフルオロ酢酸（TFA））により精製し、目的物である化合物12を橙色固体として235mg得た（0.257mmol, 収率90%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000047
　実施例8：化合物13（Phox-COOH; PB430）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　実施例7で得た化合物12（14.0mg, 0.0153mmol）とジイソプロピルエチルアミン（DIPEA; 0.10mL, 0.61mmol）の無水DMSO（1mL）溶液にN,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU; 9.2mg, 0.031mmol）を添加した。室温で1時間攪拌したのち、4-アミノブチル酸（10.3mg, 0.100mmol）を反応混合物に加えた。これを室温で12時間攪拌したのち、混合物を逆層HPLC（6/4 H2O/CH3CN, + 0.1% TFA）で精製し、目的物である 化合物13（Phox-COOH）を黄色固体として9.3mg（0.0093mmol, 収率61%）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000049
　実施例9：化合物14（Phox-NHS Ester）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　実施例8で得たPhox-COOH（5.0mg, 5.0μmol）と ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA; 17μL, 100μmol）の無水DMSO（0.5mL）溶液にN,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU; 4.5mg, 15μmol）を添加した。室温で1時間攪拌したのち、トリフルオロ酢酸（TFA; 17μL, 220μmol）を水（2mL）に溶かした溶液を加えて反応をクエンチし、混合物を逆層HPLC（55/45 H2O/CH3CN, + 0.1% TFA）で精製し、目的物である 化合物14（Phox-NHS ester）を黄色固体として4.3mg（3.9μmol, 収率79%）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000051
　実施例10：化合物14（Phox-maleimide）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　実施例6で得た化合物11（10.0mg, 9.9μmol）、及びN-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩（2.5mg, 9.8μmol）の無水ジメチルスルホキシド（DMSO; 1mL）溶液に、トリエチルアミン（Et3N; 28μL, 200μmol）を添加した。室温で2時間撹拌した後、混合物を逆相HPLC（55/45 H2O/CH3CN, +0.1%トリフルオロ酢酸（TFA））で精製し、目的物である化合物12（Phox-maleimide）を黄色固体として3.2mg得た（3.1μmol, 収率32%）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000053
　比較例1：Alexa Fluor 430
　市販の蛍光色素として、Alexa Fluor 430を比較例1の蛍光色素とした。
　比較例2：Atto 425
　市販の蛍光色素として、Atto 425を比較例2の蛍光色素とした。
　比較例3：C-Naphox
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　国際公開第２０１５／１１１６４７号の化合物7bと同様に合成した。
　比較例4：Alexa Fluor 488
　市販の蛍光色素として、Alexa Fluor 488を比較例4の蛍光色素とした。
　試験例1：分子軌道計算
　実施例6のPhox 430 NHS Esterと、比較例3のC-Naphoxについて、紫外可視吸光スペクトル及び蛍光スペクトルの違いを考察するために、分子軌道計算による構造最適化及びTD-DFT計算を行った。結果を図１に示す。
　この結果、実施例6のPhos 430 NHS Esterのように、ベンゼン環の縮合位置を調整することにより、HOMO及びLUMOのエネルギーレベルを低減することができた。このため、本発明のホスホール化合物のなかでも、上記一般式（1B）で表されるホスホール化合物は、HOMO及びLUMOのエネルギーレベルをより低減することができるため、蛍光量子収率を向上させることができるのみならず、より蛍光ピーク波長を大きくすることができることが示唆される。
　試験例2：光物性
　実施例6のPhox 430 NHS Esterについて、様々な溶媒中に濃度約10-5Mで溶解させた場合の紫外可視吸光スペクトル及び蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率、蛍光寿命等の測定を行った。比較例1のAlexa Fluor 430及び比較例2のAtto 425についても、HEPES中に濃度約10-5Mで溶解させた場合の紫外可視吸光スペクトル及び蛍光スペクトル、絶対蛍光量子収率、蛍光寿命等の測定を行った。結果を表１及び図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　以上から、本発明のホスホール化合物は、様々な溶媒中のいずれにおいても、可視光領域（特に400～500nm程度）の光に対して蛍光することができる（吸収スペクトル及び蛍光スペクトルがほとんど同じ挙動を示す）。また、水系の溶媒であっても、高い輝度を有することが理解できる。また、本発明のホスホール化合物は、ストークスシフトが大きい（5020cm-1）という特徴も有している。さらに、本発明のホスホール化合物は、絶対蛍光量子収率が最大で0.90と、従来の蛍光色素と同程度の輝度を有するとともに、蛍光寿命が6ns以上と、従来は1～4ns程度であるのと比較して著しく長いという特徴も有している。
　次に、本発明のホスホール化合物と従来の蛍光色素について、PBS緩衝液（PH= 7.4）中における光物性を同様に測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　試験例3：DMSO/HEPES緩衝液中での蛍光量子収率
　実施例6のPhox 430 NHS Esterと、比較例3のC-Naphoxについて、DMSOとHEPESの混合溶媒中に濃度約10-6Mで溶解させ、絶対蛍光量子収率の測定を行った。この際、混合溶媒中のHEPESの割合を様々に変更し、水の含有量に対する蛍光量子収率の違いを評価した。結果を図３に示す。なお、図３において、縦軸は蛍光量子収率の値を示し、100%は蛍光量子収率の理論的な上限値を示す。この結果から、比較例3の C-Naphox は水の含有量が高くなるとその蛍光量子収率が低下するのと比較して、本発明のホスホール化合物は、水を含む溶媒中においても、高い蛍光量子収率を維持することが理解できる。
　試験例4：耐光性
　実施例8のPhox-COOHと、比較例3のC-Naphoxと、比較例4のAlexa Fluor 488について、DMSO / HEPES緩衝液（pH = 7.3, v/v = 7/3）混合溶媒中に溶解させた。この際の濃度は、460nmにおける吸光度が同程度になるように調整した。460nm±11nm の光を透過するバンドパスフィルターを備えたキセノンランプ（300W）で光を照射し、様々な時間経過後の紫外可視吸収スペクトルの測定を行った。そして、各試料について、照射直後（0秒後）の吸光度（A0）を1.00として、所定時間経過後の吸光度（A）の維持率（A/A0）を評価した。結果を図４～５に示す。この結果、Alexa Fluor 488は光照射によって蛍光強度が低下し、5時間の光照射で約46.2%となったのに対し、Phox-COOH及びC-Naphoxは、5時間光照射しても蛍光強度はほとんど変わらなかった（約99.9%）。本発明のホスホール化合物は、C-Naphox と同程度の高い耐光性を有しており、その特性はAlexa Fluor 488 を大きく上回っていることが理解できる。
　試験例5：蛍光のpH依存性の評価
　実施例8のPhox-COOH（10μM）の蛍光スペクトルを、様々なpHの水溶液中で測定した。pH3～6の調整にはクエン酸/Na2HPO4緩衝液を用い、pH7～8の調整にはNa2HPO4/NaH2PO4緩衝液を用い、pH9～11の調整にはNa2CO3/NaHCO3緩衝液を用いた。その他、蛍光スペクトルの測定方法は試験例2と同様に行った。結果を図６に示す。この結果、蛍光波長はpHによって変化せず、蛍光強度もpHによって若干変化する（pH=9が最も大きい）もののほぼ維持できていた。
　試験例6：ホスホール化合物と抗体との結合
　STEDイメージングを行うため、実施例9のPhox-NHS Esterをヤギ抗マウスIgG抗体と結合させてPhox-antibody conjugateとした。標識バッファー（pH= 8.3）0.25mL中の0.50mgのIgG抗体及び20μgのPhox-NHS Esterから調製した試料について、標識度（DOL）は2.8と決定した。Phox-antibody conjugateの光物理学的特性は、図７に示すとおり、PBS（pH7.4）中の抗体と結合していないPhox-COOHとほとんど同じであり、色素間、又は抗体のアミノ酸残基との相互作用がほとんどないことを示している。
　pH8.3の標識バッファーは、PBS緩衝液（pH7.4）と0.2M NaHCO3とを20: 1 (v/v)の比で混合することにより調製した。ヤギ抗マウス抗体IgG（0.50mg）の標識バッファー（pH= 8.3, 0.25mL）に、Phox-NHS Ester（実施例9; 0.020mg）のDMSO（10μL）溶液を添加し、得られた混合物を室温で1時間培養した。遊離しているPhox-NHS EsterをSephadex G-25カラムクロマトグラフィーにより除去し、結果、標識度（DOL）値（抗体1個あたり結合している色素の数）を測定した。なお、DOLはThermoFisher Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）488 Microscale Protein Labeling Kitのマニュアル（https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp30006.pdf）の「Determination of Degree of Labeling (DOL)」に記載の計算方法に準拠して、A280及びA494の代わりに、A280及びA426を用いて計算した。
　なお、DOL値の計算方法は以下のとおりである。
　まず、Phox-COOHの補正係数CF280を以下の式にしたがって計算した。以下の式において、ε280及びεmaxは、それぞれ280nm及び吸収極大（426nm）における色素の吸収係数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000057
　次に、Phox-antibody conjugateの標識度（DOL、色素対タンパク質比）を以下の式にしたがって計算した。以下の式において、Amax及びA280は、それぞれ色素の吸収極大（426nm）及び280nmにおけるPhox-antibody conjugateの吸光度を示し、A280とAmax×CF280の差は280nmにおける抗体自体（Aprotein）の吸光度を意味し、εproteinは280nmにおける抗体自体の吸収係数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000058
　なお、Phox-NHS Esterと抗体との結合は、同じ条件下で3回行った。結果を表３に示す。全ての結果のDOL値は同等であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
　試験例7：細胞の調製
　HeLa細胞（RIKEN Cell Bank、日本）を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）及び1%抗生物質－抗真菌薬（AA、Sigma）を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM、Sigma）で、37℃で5%CO2／95%空気のインキュベーター中で培養した。イメージングの3日前に、細胞（5×104）を、ガラスボトム8ウェルプレートに播種した。固定したHeLa細胞の免疫蛍光標識化チューブリン及びビメンチンを以下のようにして調製した。1) HeLa細胞を4%ホルムアルデヒドで室温で20分間培養し、PBS緩衝液（pH7.4）で1回洗浄し、0.5%Triton-X100で室温で10分間処理し、再度PBS緩衝液（pH7.4）で3回洗浄した。2) 1%ウシ血清アルブミン（BSA）で室温で30分間ブロックし、PBS緩衝液（pH7.4）で3回洗浄した。3) 0.5μg/mLの抗α－チューブリンマウスモノクローナル抗体（017-25031, Wako）、及び／又は0.5μg/mLの抗ビメンチンウサギモノクローナル抗体（ab92547, abcam）で室温で1時間培養し、PBS緩衝液（pH7.4）で3回洗浄した。4) 対応する蛍光色素で標識化した二次抗体（10μg/mLのPhox-NHS Ester（実施例9; DOL= 2.5）を結合した抗マウスIgG、10μg/mLのAlexa Fluor 430（比較例1）を結合した抗ウサギIgG（A-11064, Invitrogen）、10μg/mLのAlexa Fluor 430（比較例1）を結合した抗マウスIgG（DOL= 1.9）、10μg/mLのAtto 425（比較例2）を結合した抗マウスIgG（DOL= 1.7）、4μg/mLのAlexa Fluor 488（比較例4）を結合した抗マウスIgG（ab150113, abcam）を室温で4時間培養し、PBS緩衝液（pH7.4）で3回洗浄した。最後に、細胞をPBS及びグリセロール（体積比1/1）にマウントした。
　試験例8：蛍光イメージング（その1）
　試験例7で調製した免疫蛍光標識化ビメンチンを用いて、共焦点イメージング及びSTEDイメージングを行った。
　HCXPL APO 100x.1.40油浸レンズを備えた超解像顕微鏡TCS SP8 STEDを、共焦点イメージング及びSTEDイメージングに使用した。共焦点イメージングには、470nmのレーザー（波長可変白色励起レーザー, 80MHz, 出力30%, AOTF 90%）を照射し、480～585nmの範囲の蛍光シグナルを検出した。繰り返しSTEDイメージング及びZスキャンSTEDイメージングには、波長可変白色励起レーザー（470nm, 80MHz, 出力40%, AOTF 90%）及びCW-STEDレーザー（592nm CWレーザー, 出力20%, AOTF 80%）を使用し、発光検出窓を480～585nmとし、時間ゲート法（時間範囲0.5～12ns）を採用した。二色STEDイメージングには、波長可変白色励起レーザー（470nm, 80MHz, 出力80%, AOTF 90%）及びCW-STEDレーザー（592nm CWレーザー, 出力20%, AOTF 80%）を使用し、発光検出窓を480～585nmとし、時間ゲート法（時間範囲0.5～12ns）を採用した。チューブリンの3D構造の構築には、ZスキャンSTEDイメージのHuygens deconvolutionを行った。二色STEDイメージングの解析には、Huygens deconvolutionを行った。これらの画像解析には、ImageJソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いた。
　Phox-NHS Ester（実施例9）を用いた免疫蛍光標識化ビメンチンの共焦点イメージング及びSTEDイメージングの結果を図８に示す。図８には、固定されたHeLa細胞中で、Phox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンフィラメントの共焦点（a）及びSTED（b）顕微鏡像と、対応する共焦点（橙色線）及びSTED（深紅色線）顕微鏡像の光学的分解能（c）を示している。図８（a）及び図８（b）には、選択箇所の拡大イメージが差し込まれている。波長可変白色励起レーザー（470nm, 80MHz, 出力40%, AOTF 90%）及びCW-STEDレーザー（592nm CWレーザー, 出力20%, AOTF 80%）を使用した。図８（a）及び図８（b）において、スケールバーは2μmである。この結果、本発明のホスホール化合物を用いて、タンパク質（特に抗体）を標識化して蛍光させることができ、これを用いたSTEDイメージングにより200nmを超える空間分解能が実現できることが理解できる。
　次に、STED条件におけるAlexa Fluor 488（比較例4）とPhox-NHS Ester（実施例9）の光安定性の比較を図９に示す。試験は、Alexa Fluor 488（比較例4; a）及びPhox-NHS Ester（実施例9; b）で免疫標識化されたチューブリンフィラメントの5回の繰り返しSTED顕微鏡像を連続的に行った。そのうえで、STEDイメージングの繰り返し回数に対して蛍光強度の変化をプロットしたものを図９（c）に示し、蛍光強度が初期値からどの程度維持できるかを示している。なお、Alexa Fluor 488（比較例4）及びPhox-NHS Ester（実施例9）で標識化されたチューブリンフィラメントはいずれも、同じ条件でイメージングを行った。波長可変白色励起レーザー（470nm, 80MHz, 出力40%, AOTF 90%）及びCW-STEDレーザー（592nm CWレーザー, 出力20%, AOTF 80%）を使用した。図９（a）及び図９（b）において、スケールバーは2μmである。この結果、本発明のホスホール化合物は、繰り返しSTEDイメージングをしても蛍光強度を維持することができ、光安定性に優れることが理解できる。
　次に、Alexa Fluor 488（比較例4）及びPhox-NHS Ester（実施例9）のZスキャンSTEDイメージングにおける光安定性の比較を図１０及び図１１（図１０：実施例9、図１１：比較例4）に示す。
　試験は、Alexa Fluor 488（比較例4）及びPhox-NHS Ester（実施例9）で免疫標識化されたチューブリンフィラメントのSTEDイメージングを深さ（Z軸）方向に連続的に行った。
　Alexa Fluor 488（比較例4）及びPhox-NHS Ester（実施例9）の共焦点蛍光顕微鏡像を図１０（a）及び図１１（a）に、2μmの深さにおけるZスキャンSTED顕微鏡像を図１０（b）及び図１１（b）に示す。Zスキャンのステップは200nm間隔とし、11スライドを記録した。11スライドの解析及び画像再構築の後、チューブリンフィラメントの3次元構造を、図１０（c）及び図１１（c）に示すように、11.62×11.62×2.00μm3の大きさで得た。STEDイメージングには、波長可変白色励起レーザー（470nm, 80MHz, 出力40%, AOTF 90%）及びCW-STEDレーザー（592nm CWレーザー, 出力20%, AOTF 80%）を使用した。なお、Phox-NHS Ester（実施例9）及びAlexa Fluor 488（比較例4）で免疫標識化されたチューブリンフィラメントはいずれも、同じ条件でイメージングを行った。図１０（a）及び図１１（a）において、スケールバーは2μmである。結果、Alexa Fluor 488（比較例4）はZ方向にスキャンを繰り返す過程で褪色してしまい、本来最も蛍光像が明瞭に確認されるべき6枚目のスライドでほとんど蛍光が観測されなかったのに対し、本発明のホスホール化合物ではZスキャンの過程でも褪色が見られず、画像を3次元構造に再構築した後も妥当な構造が観察でき、光安定性に優れることが理解できる。このことから、本発明のホスホール化合物は、ZスキャンSTEDイメージングや3D STEDイメージング等の長時間にわたる光照射を要するSTEDイメージングにも応用可能であることが示唆される。
　試験例9：蛍光イメージング（その2）
　イメージング実験は、励起のために調整可能な（470-670nm）パルス白色光レーザー（WLL; 78MHzのパルス繰り返し率）と、蛍光発生抑制のためにSTEDレーザー（592nmの連続波）を備えたDMI6000 CS倒立顕微鏡を含むLeica TCS SP8 STED 3X system（Leica Microsystems）を用いた。共焦点イメージング及びSTEDイメージングのために、HyD検出器及び100倍油浸対物レンズ（NA 1.4）を使用した。色素を波長470nmのWLLで励起し、蛍光シグナルを480nmと585nmとの間で収集し、時間ゲート間隔を0.5-12nsとした。z-スタックした画像は、50nmの増分で得た。2色イメージングには、画像を最初にHuygens Deconvolution software（Scientific Volume Imaging）でデコンボリューションし、さらに画像分析ソフトウェアImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/）で処理した。共焦点条件下での光安定性の評価には、上記で調製した色素染色細胞に470nm（12μW）のWLLを照射し、1024×1024ピクセル；ライン平均3；フレーム平均1；照射時間5秒/画像の設定で画像を取得した。各画像の全シグナル強度を第1の画像の値に正規化し、記録された共焦点画像の数の関数としてプロットした。減衰曲線を擬一次反応（Dyes Pigm. 1998, 37, 213-222.）として解析し、直線勾配から光退色速度定数を計算した。Alexa Fluor 430に対する相対的光安定性を、光退色速度定数の逆数を用いて決定した。
　ゲートされたCW-STEDモードで高分解能画像を得るため、パルスWLLからPhox-COOHの励起波長470nmを選択した。タンパク質の蛍光標識試薬としてのPhox-COOHの実用性を確認するため、Phox-COOH標識二次抗体を用いた間接的免疫蛍光法により固定されたHeLa細胞中でα-チューブリンを染色した。共焦点画像のバックグラウンドシグナルが低いことから明らかなように、非特異的結合が無視できる程度に微小管が染色されたことがわかる（図１２）。STED条件（λSTED= 592nm、STEDレーザー出力= 約30mW、ゲート検出= 0.5ns）では、個々の微小管は分離していた（図１３（a））。STED像の半値全幅（FWHM）分解能は76±7nmであった（図１４（c））。
　さらに、高い蛍光輝度を保持しながら、Phox-COOH結合二次抗体で標識されたチューブリンのSTEDイメージングを繰り返すことが可能であった。反復走査の間、染色された細胞の全蛍光シグナル強度をモニターした。5枚の画像を記録した後、Phox-COOHは初期蛍光強度の80％以上を保持しており、微小管を明瞭に視覚化できた（図１３（b））。対照的に、チューブリンがAlexa Fluor 488結合二次抗体で標識された場合、同一のSTED条件下で有意な光退色が見られ、初期強度の15％未満しか維持しなかった（図１３（c））。特に、同じ領域の30回の連続スキャンの後でさえ、Phox-COOHは83±8nmのFWHM分解能（図１４）で初期強度の50％以上を保持した（図１３（d））。
　STED顕微鏡におけるPhox-COOHの有用性をさらに実証するため、微小管のz-スキャンSTEDイメージングを行った。従来の色素を用いた場合、連続したxy-スキャン中の迅速な光退色は通常避けられないので、2次元STED画像からの3次元画像の構築は困難である。細胞の核周辺の免疫標識微小管を、z軸に沿って50nmのステップでスキャンした。Phox-COOHの場合、STED画像を細胞の底部から頂部まで（z深度4.0μm）記録する間に、微小管の十分な輝度及び超解像度が維持できた。81枚のxy画像から、デコンボリューション及び再構成した結果、160nmのz軸解像度を有する微小管の超解像3次元構造が得られた（図１５）。対照的に、同じSTEDイメージング条件下では、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 430及びSTAR 440SXを含む市販の色素の蛍光シグナルは、観察中に急速に消失した（図１６）。Atto 425は、他の色素（図１６）よりも比較的高い光安定性を示したが、超解像による3次元再構成には依然として不十分であった。
　多色イメージングを行うために、Alexa Fluor 430、STAR 440SX、Atto 425等の市販の蛍光色素の光安定性を最初に評価し、Phox-COOH（PB430）の適切な比較対象を選択した。また、異なる光学特性を有する代表的な色素として、Alexa Fluor 488とも比較した。微小管をこれらの色素で免疫標識し、470nm（WLL、12μW）の共焦点レーザーを照射しながら共焦点画像を繰り返し撮影した。図１７に示すように、Phox-COOH（PB430）の初期強度の70%以上が、50個の共焦点画像の取得後でさえも保持できていた。対照的に、Alexa Fluor 430及びSTAR 440SXを用いた場合、10枚の画像の後ではほとんど蛍光シグナルを保持できなかった。一方、Alexa Fluor 488及びAtto 425は、わずかに優れた光安定性を有し、これらの色素の退色速度はAlexa Fluor 430よりもそれぞれ2.3及び5.3倍遅かった（表２）。Alexa Fluor 430は光安定性の差が最も大きいことから、Phox-COOH（PB430）の比較対象として使用することにした。
　最初は、Alexa Fluor 430結合二次抗体を用いて固定した細胞のビメンチンフィラメントを染色した。同じSTED条件（λex= 470nm、λSTED= 592 nm）で光安定性をPhox-COOH（PB430）と比較した（図１８）。Phox-COOH（PB430）の蛍光強度は有意な減少は観察されなかったが、第2の画像におけるAlexa Fluor 430の蛍光強度は、Alexa Fluor 430の蛍光への寄与にもかかわらず第1の画像と比較して劇的に減少した（<10%）。
　次いで、固定した細胞のチューブリン及びビメンチンをそれぞれPhox-COOH（PB430）結合二次抗体及びAlexa Fluor430結合二次抗体で染色した。第1のSTED画像を記録した（図１９（a））。この第1のSTED画像には、両方の細胞骨格が含まれるはずである。続いて、同じ条件下で第2の画像を記録したところ、いくつかのフィラメント構造が消失していた（図１９（b））。第1の画像（a）から第2の画像（b）を引く（除去する）と消失したフィラメントのSTED画像が得られ、これはAlexa Fluor 430標識ビメンチンフィラメントに対応する（図１９（c））。このようにして得られた2つの画像（b）及び（c）の異なる色のリコンストラクションから、図１９（a）に示される2種類の細胞骨格の部分的に重なり合ったネットワークを明瞭に示す2色STED画像（図１９（d））が得られた。したがって、これらの2種類の細胞骨格は、Phox-COOH（PB430）を利用したこの方法によって明白に区別することができる。統計分析に基づいて、微小管及びビメンチンフィラメントのFWHM分解能は、それぞれ85±3nm及び87±4nmであった（図２０）。この値は、Phox-COOH（PB430）で免疫標識された微小管の単色STED画像のFWHM分解能に匹敵している。したがって、異なる光安定性に基づく2色STEDイメージングは、光学顕微鏡の回折限界を破った超解像を得る信頼できる方法であった。

Claims (12)

  1. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ar1及びAr2は同一又は異なって、置換されていてもよい芳香族炭化水素環又は置換されていてもよい複素芳香環を示す。Ar3は2価のπ共役ユニットを示す。R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。R2及びR3は同一又は異なって、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよいヘテロアリール基を示す。Zは反応性基を示す。］
    で表される、ホスホール化合物。
  2. 前記Ar3が置換されていてもよいアルケニレン基、置換されていてもよいアルキニレン基、置換されていてもよいアリーレン基、又は置換されていてもよいヘテロアリーレン基である、請求項１に記載のホスホール化合物。
  3. 一般式（1B）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ar2、Ar3、R1、R2、R3及びZは前記に同じである。Ar4は置換されていてもよい芳香族炭化水素環を示す。］
    で表される、請求項１又は２に記載のホスホール化合物。
  4. 前記Zがカルボキシ基又はアルコキシカルボニル基である、請求項１～３のいずれかに記載のホスホール化合物。
  5. 前記反応性基が、アミン反応性基又はチオール反応性基である、請求項１～３のいずれかに記載のホスホール化合物。
  6. 前記アミン反応性基又はチオール反応性基が、一般式（2A）～（2E）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、R5は水素原子又はスルホ基を示す。R6はアルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
    で表される構造を末端に有する基である、請求項５に記載のホスホール化合物。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のホスホール化合物からなる蛍光色素。
  8. 誘導放出抑制（STED）イメージング用である、請求項７に記載の蛍光色素。
  9. 請求項５又は６に記載のホスホール化合物を用いたタンパク質標識剤。
  10. 請求項１～６のいずれかに記載のホスホール化合物又は請求項７若しくは８に記載の蛍光色素を用いることを特徴とする、誘導放出抑制（STED）イメージング方法。
  11. 請求項５若しくは６に記載のホスホール化合物、請求項７若しくは８に記載の蛍光色素、又は請求項９に記載のタンパク質標識剤を含有する、タンパク質標識化キット。
  12. 請求項５若しくは６に記載のホスホール化合物、請求項７若しくは８に記載の蛍光色素、又は請求項９に記載のタンパク質標識剤と、タンパク質とを反応させる工程
    を備える、タンパク質標識化方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021161860A1 (ja) * 2020-02-10 2021-08-19 三菱ケミカル株式会社 半導体ナノ粒子含有組成物、カラーフィルタ、及び画像表示装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008056630A (ja) * 2006-09-01 2008-03-13 Univ Nagoya リン架橋スチルベン及びその製法
JP2014535054A (ja) * 2011-11-07 2014-12-25 ライニッシュ−ヴェストフェリッシェ・テクニッシェ・ホッホシューレ・アーヘンＲｈｅｉｎｉｓｃｈ−Ｗｅｓｔｆａｌｉｓｃｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ａａｃｈｅｎ 石灰化の傾向を判定する方法
JP2015516068A (ja) * 2012-05-04 2015-06-04 ナノコ テクノロジーズ リミテッド 量子ドットを用いたガスバリア膜における欠陥の検出方法
WO2015111647A1 (ja) * 2014-01-24 2015-07-30 国立大学法人名古屋大学 ホスホール化合物及びそれを含有する蛍光色素

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008056630A (ja) * 2006-09-01 2008-03-13 Univ Nagoya リン架橋スチルベン及びその製法
JP2014535054A (ja) * 2011-11-07 2014-12-25 ライニッシュ−ヴェストフェリッシェ・テクニッシェ・ホッホシューレ・アーヘンＲｈｅｉｎｉｓｃｈ−Ｗｅｓｔｆａｌｉｓｃｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ａａｃｈｅｎ 石灰化の傾向を判定する方法
JP2015516068A (ja) * 2012-05-04 2015-06-04 ナノコ テクノロジーズ リミテッド 量子ドットを用いたガスバリア膜における欠陥の検出方法
WO2015111647A1 (ja) * 2014-01-24 2015-07-30 国立大学法人名古屋大学 ホスホール化合物及びそれを含有する蛍光色素

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN, HUI ET AL.: "Benzofuran-fused Phosphole: Synthesis, Electronic, and Electroluminescence Properties", ORGANIC LETTERS, vol. 15, no. 2, 2013, pages 330 - 333, XP055603789 *
FUKAZAWA, AIKO ET AL.: "Bis-Phosphoryl-Bridged Stilbenes Synthesized by an Intramolecular Cascade Cyclization", ORGANIC LETTERS, vol. 10, no. 5, 2008, pages 913 - 916, XP055603807 *
FUKAZAWA, AIKO ET AL.: "Ladder π-Conjugated Materials Containing Main-Group Elements", CHEMISTRY-AN ASIAN JOURNAL, vol. 4, no. 9, 2009, pages 1386 - 1400 *
HE, XIAOMING ET AL.: "Synthesis of P -Triazole Dithienophospholes and a Cyclodextrin-Based Sensor via Click Chemistry", ORGANIC LETTERS, vol. 15, no. 20, 2013, pages 5322 - 5325, XP055603764 *
TAKAHASHI,MOTONOBU ET AL.: "Synthesis and Properties of Benzophospholo[3,2- b ]benzofuran Derivatives", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 80, no. 8, 2015, pages 3790 - 3797, XP055374562 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021161860A1 (ja) * 2020-02-10 2021-08-19 三菱ケミカル株式会社 半導体ナノ粒子含有組成物、カラーフィルタ、及び画像表示装置

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