WO2018025793A1 - 免疫賦活因子産生促進用組成物 - Google Patents

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WO2018025793A1
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promoting
stranded rna
double
immunostimulatory factor
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尚志 藤田
博己 加藤
鉄也 中崎
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a composition for promoting production of immunostimulatory factors.
  • the effective treatment method for all viral diseases has not been established, and treatment methods corresponding to the respective viral diseases are usually employed.
  • interferon therapy is administered for hepatitis C and the like
  • antiviral drugs Teamiflu, Relenza, etc.
  • specific viral diseases such as influenza.
  • current antiviral drugs contain synthetic low molecular weight compounds as active ingredients, and it is difficult to continuously use them for preventive purposes from the viewpoint of cost and the like.
  • anticancer drug therapy aimed at suppressing cancer cell growth by acting on DNA synthesis, etc., aiming to suppress cancer cell growth by activating immunity Drug therapy such as interferon therapy is performed.
  • Drug therapy such as interferon therapy
  • current anticancer agents usually contain synthetic low molecular weight compounds, antibodies, and the like as active ingredients, and it is difficult to continuously use them for preventive purposes from the viewpoint of cost and the like.
  • Multiple sclerosis is also treated with low molecular weight compounds, interferon, etc., as with viral diseases and cancer, etc., but it is continuously used for preventive purposes from the viewpoint of the risk of side effects, cost, etc. It is difficult to do.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2, etc.
  • Certain RNA viruses are said to induce interferon production through signal transduction pathways such as MDA5 and RIG-I, resulting in in vivo immune activation.
  • signal transduction pathways such as MDA5 and RIG-I
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing and improving various diseases such as viral diseases, cancer, and multiple sclerosis.
  • a plant-derived endornavirus genome double-stranded RNA has an action of promoting production of immunostimulatory factors such as interferon. Furthermore, it has also been found that the double-stranded RNA can prevent and ameliorate a wide range of diseases such as viral diseases, cancer and multiple sclerosis. As a result of further research based on such knowledge, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention includes the following embodiments: Item 1. A composition for promoting production of an immunostimulatory factor, comprising a genomic double-stranded RNA of a plant-derived endornavirus.
  • Item 2. Item 2. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to Item 1, wherein the plant is a Capsicum plant, a Rice plant, or a broad bean plant.
  • Item 3. Item 3. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to Item 1 or 2, wherein the genomic double-stranded RNA has a length of 8 to 20 kbp.
  • Item 5 The composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of Items 1 to 4, which is a pharmaceutical composition.
  • Item 6. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of Items 1 to 5, which is in the form of a nasal preparation.
  • Item 7. Item 6.
  • Item 8. Item 5.
  • Item 9. Item 9. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of Items 1 to 8, which is used as an immunostimulatory composition.
  • Item 10. Item 9.
  • composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of Items 1 to 8, which is used as an antiviral composition Item 11.
  • Item 11. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to Item 10, wherein the virus is an RNA virus.
  • Item 6. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of Items 1 to 5, which is used as an adjuvant.
  • Item 13. The composition for promoting immunostimulatory factor production according to any one of claims 1 to 8, which is used as a composition for preventing or improving cancer.
  • the present invention also includes the following embodiments: Item 14. A method for promoting production of an immunostimulatory factor, comprising applying a plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA to an animal or a human. Item 15. Genomic double-stranded RNA of plant-derived endornavirus to promote production of immunostimulatory factors. Item 16. Use of plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA for the production of a composition for promoting production of immunostimulatory factors. Item 17. Use of plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA to promote production of immunostimulatory factors.
  • plant-derived endornavirus genome double-stranded RNA promotes the production of immunostimulatory factors such as interferon, thereby stimulating immunity in the body. Therefore, plant-derived endornavirus genome double-stranded RNA has various uses based on immunostimulatory factor production promoting action, immunostimulatory action (for example, prevention and improvement of viral diseases, cancer, multiple sclerosis, It can be used for adjuvants. In addition, when used for anti-virus, it can be applied to a wide variety of viruses.
  • Green® pepper indicates the case where the total RNA obtained in Example 1 was administered.
  • the result of the virus infection test 2 of Example 6 is shown.
  • the vertical axis in the left figure shows the survival rate, and the vertical axis in the right figure shows the body weight.
  • the horizontal axis indicates the number of days elapsed after infection.
  • Green® pepper indicates the case where the total RNA obtained in Example 1 was administered.
  • the result of the virus infection test 3 of Example 7 is shown.
  • the vertical axis shows the survival rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days elapsed after infection.
  • “Kyosuzu RNA” indicates the total RNA obtained in Example 1.
  • the result of the invitro immunostimulatory factor production test 2 of Example 10 is shown.
  • the vertical axis represents the relative expression level.
  • “DsRNA” indicates the total RNA obtained in Example 8.
  • the result of the in-vivo immunostimulatory factor production test 3 of Example 11 is shown.
  • the vertical axis represents the relative expression level.
  • the horizontal axis shows the elapsed time after administration.
  • the result of the virus infection test 4 of Example 12 is shown.
  • the vertical axis indicates the survival rate, and the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed after infection.
  • “DsRNA treated” indicates the case where the RNA of Example 8 is administered, and “PR / 8 control” indicates the case where water is administered instead of the RNA of Example 8.
  • the result of the virus infection test 5 of Example 13 is shown.
  • the vertical axis in the upper diagram shows the weight, and the vertical axis in the lower diagram shows the survival rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days elapsed after infection. “GP” and “Green pepper” indicate the case where the total RNA obtained in Example 1 was administered.
  • the result of the in-vivo immunostimulatory factor production test 4 of Example 14 is shown.
  • the vertical axis represents the relative expression level. In each graph, the left column shows the results of wild type mice, and the right column shows the results of MAD5 and TRIF double knockout mice.
  • the result of the toxicity test of Example 15 is shown.
  • the vertical axis represents body weight, and the horizontal axis represents the number of days elapsed from the first administration.
  • the result of the cancer treatment / prevention effect evaluation test of Example 16 is shown.
  • the vertical axis indicates the size of the tumor, and the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the subcutaneous injection of melanoma cells.
  • “DsRNA ( ⁇ )” shows the case where the total RNA of Comparative Example 1 was administered, and “dsRNA (+)” shows the case where the total RNA of Example 1 was administered.
  • the result of the evaluation test of the multiple sclerosis treatment / prevention effect of Example 17 is shown.
  • the vertical axis shows the clinical score of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which is a model for multiple sclerosis, and the horizontal axis shows the number of days since myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) administration (day 0). Show.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • the composition for promoting the production of an immunostimulatory factor (hereinafter, referred to as “the composition of the present invention”) containing a plant-derived endornavirus genome double-stranded RNA. ). This will be described below.
  • Genomic double-stranded RNA of plant-derived endornavirus hereinafter, “genomic double-stranded RNA of plant-derived endornavirus” which is an active ingredient of the composition of the present invention will be described.
  • the genomic double-stranded RNA of the plant-derived Endornavirus is not particularly limited as long as it is an Endurnavirus genomic double-stranded RNA contained in the plant.
  • Capsicum annuum (capsicum), Capsicum frutescens (capsicum pepper), Capsicum baccatum (Ahi Amarillo), Capsicum chinense (Sinense species) and other Capsicum plants; Oryza sativa (variety, for example, ) And the like; and broad bean plants.
  • Capsicum annuum varieties containing endornaviruses include California Wonder, Yolo Wonder, Kyousuzu, Kyounami, Kyoumidori, Ace, Suigyokunigou, High Green, Jumbo Colour, Marengo, Avelar, Casca Dura, King Arthur, VR-4, Magda Why's Green Bell, Red Bell, Chocolate Beauty Sweet, Pimento Sweet, Cayenne Long Red Thick, Super Cayenne and the like.
  • Examples of the variety of Capsicumsifrutescens containing endornavirus include Greenleaf, LSU, PI 159239, PI 193470, and the like.
  • Capsicum baccatum varieties containing endornaviruses include, for example, Monk's Hat, PI 238061, PI 633752, PI 260549, PI 215699, PI 260590, PI 260543, PI 441589, PI 257135, PI 337524, PI 337522, C00754 (AVRDC) , C01218 (AVRDC), C01527 (AVRDC), C01300 (AVRDC) and the like.
  • Capsicum chinense containing endornavirus examples include PI 159236, PI 315008, PI 315023, PI 315024, PI 273426, C00943 (AVRDC), C00949 (AVRDC) and the like.
  • Endornaviruses contained in plants are usually not covered with capsids and are composed of double-stranded RNA that is the genome.
  • this double-stranded RNA is used as an active ingredient.
  • the genome double-stranded RNA used as an active ingredient in the present invention may be the full-length genome of Endornavirus or a fragment thereof.
  • the length of the genomic double-stranded RNA is desirably longer, for example, 8 to 20 kbp, preferably 10 to 18 kbp It is preferably 12 to 16 kpb.
  • the shape of the genomic double-stranded RNA used as an active ingredient in the present invention is not particularly limited, but is usually linear.
  • the “genomic double-stranded RNA of plant-derived endornavirus” which is an active ingredient of the composition of the present invention can be obtained by a method of purifying nucleic acid (particularly RNA) from plant cells containing endornavirus.
  • the cell lysis step, the deproteinization step, the nucleic acid concentration step, the nucleic acid solubilization step and the like can be appropriately combined and purified.
  • the plant cell as the material is not particularly limited as long as it is a plant cell containing Endornavirus.
  • the plant cell is preferably a cell of an edible plant, more preferably a cell of an edible part (for example, a fruit, a seed, or a part thereof) of the edible plant.
  • cells that are normally discarded for example, rice seed (rice) straw are used. Is desirable.
  • the cell lysis step is not particularly limited as long as it can break the cell membrane of plant cells, and various known methods can be employed.
  • the surfactant is not particularly limited, and various surfactants can be used, but a surfactant having a strength that does not break the nuclear membrane is preferable. This makes it possible to prevent contamination of the genomic DNA of the cell, and to obtain endurnavirus genomic double-stranded RNA with higher purity.
  • a surfactant is preferably sodium deoxycholate.
  • the concentration of the surfactant is appropriately adjusted depending on the type thereof. For example, in the case of sodium deoxycholate, a concentration of about 0.2 to 1%, preferably about 0.3 to 0.7% can be employed. . In the case of method 4 described later, it is preferable to employ a concentration of about 0.15 to 0.35%. After mixing, it is desirable to remove insoluble components by centrifugation or the like.
  • the protein removal step is not particularly limited as long as the protein can be insolubilized, and various known methods can be employed. For example, the process of mixing with organic solvents, such as a mixed solvent containing phenol, chloroform, phenol, and chloroform, is mentioned. After mixing, the insolubilized protein is usually removed by centrifugation or the like. The protein removal step may be performed a plurality of times (for example, 2 to 4 times) as necessary.
  • the nucleic acid concentration step is not particularly limited as long as the nucleic acid can be precipitated by centrifugation or the like, and various known methods can be employed. Examples thereof include alcohol precipitation and salting out.
  • the alcohol used for the alcohol precipitation is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, isopropanol, and polyethylene glycol.
  • Examples of the salt used for salting out include lithium chloride, sodium chloride, ammonium acetate, sodium acetate and the like, preferably lithium chloride.
  • the nucleic acid concentration step may be performed a plurality of times (for example, 2 to 3 times) by combining alcohol precipitation and salting out as necessary.
  • the nucleic acid solubilization step is not particularly limited as long as the nucleic acid (particularly double-stranded RNA) contained in the precipitate obtained by the nucleic acid concentration step can be solubilized, and various known methods can be employed. For example, a step of suspending the precipitate obtained by the nucleic acid concentration step with a solution containing a chelating agent can be mentioned.
  • the chelating agent include sodium citrate, trisodium ethylenediaminetetraacetate and the like.
  • washing step for example, rinsing with an aqueous ethanol solution
  • a further purification step for example, various chromatographies such as gel filtration
  • Method 3 is suitable for carrying out on a larger scale because the amount of the solution can be reduced by the first alcohol precipitation, thereby reducing the amount of the organic solvent used in the deproteinization step. .
  • Method 4 it is possible to obtain endornavirus double-stranded RNA as a viscous paste-like precipitate.
  • This double-stranded RNA can be stored for a long period of time by making this precipitate into powder by freeze-drying or the like.
  • the alcohol concentration in the first alcohol precipitation is relatively low (for example, the alcohol concentration is 10 to 30%, preferably 15 to 25%) in the second alcohol precipitation. It is preferable that the alcohol concentration in the alcohol precipitation is relatively high (for example, the alcohol concentration is 50 to 80%, preferably 60 to 75%, more preferably 60 to 70%).
  • composition of the present invention uses of the composition of the present invention.
  • improvement can be read as “treatment”.
  • plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA Since plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA has an immunostimulatory factor production promoting action, it can be applied to various compositions (pharmaceutical compositions, food compositions, oral compositions, etc.) for promoting immunostimulatory factor production. Can be used.
  • the plant-derived endornavirus genomic double-stranded RNA can be applied to animals and humans (eg, administration, ingestion, inoculation, etc.) as it is or as various compositions together with conventional components.
  • the composition of the present invention includes interferons (eg, IFN- ⁇ 1, IFN ⁇ 4, etc.), interferon response factors (eg, ISG56, BST2, IFITM3, CXCL1, CXCL2, Pai-1, etc.), cytokines (eg, IL-1 ⁇ , IL6, etc.) , TNF ⁇ , etc.), and the production of immunostimulatory factors such as interferon-inducible genes (eg, Cxcl10) can be promoted.
  • interferons eg, IFN- ⁇ 1, IFN ⁇ 4, etc.
  • interferon response factors eg, ISG56, BST2, IFITM3, CXCL1, CXCL2, Pai-1, etc.
  • cytokines eg, IL-1 ⁇ , IL6, etc.
  • TNF ⁇ transforming growth factor
  • immunostimulatory factors eg, TNF ⁇ , etc.
  • the target virus is not particularly limited, but for example, influenza virus (for example, type A, type B, etc.), rubella virus, Ebola virus, coronavirus, measles virus, varicella-zoster virus, herpes virus, mumps virus, arbovirus, Enterovirus, adenovirus, RS virus, norovirus, human papilloma virus, coxsackie virus, human parvovirus, encephalomyocarditis virus, poliovirus, SARS virus, hepatitis virus (eg, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C) Virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus, etc.) yellow fever virus, rabies virus, hantavirus, dengue virus, nipah virus, B virus, lisa virus, rhinovirus and the like.
  • influenza virus for example, type A, type B, etc.
  • rubella virus for example, type A, type
  • composition of the present invention can be used as an adjuvant because it has an immunostimulatory effect and promotes production of immunostimulatory factors.
  • composition of the present invention has an immunostimulatory effect and an immunostimulatory effect, it can also be used for prevention or improvement of various diseases such as multiple sclerosis (MS) and cancer.
  • MS multiple sclerosis
  • the cancer to be prevented or ameliorated is not particularly limited.
  • skin cancer multiple myeloma, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, colon cancer, colon cancer, rectum Cancer, biliary tract cancer, kidney cancer, bladder cancer, cervical cancer, uterine body cancer, ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, testicular cancer, leukemia, bone tumor, osteosarcoma, soft tissue tumor,
  • Examples include malignant lymphoma, pharyngeal cancer, head and neck cancer, and childhood cancer.
  • the form of the composition of the present invention is not particularly limited, and may take a form usually used in each application depending on the use of the composition of the present invention.
  • the form when the use is a pharmaceutical composition, health enhancer, nutritional supplement (supplement, etc.), etc., for example, tablets (orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly drops, etc.) Suitable for oral intake of pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, syrups), and jelly Formulation forms suitable for parenteral ingestion (such as oral dosage forms), nasal drops, inhalants, rectal suppositories, inserts, enemas, jellies, injections, patches, lotions, creams, etc. (Parenteral preparation form). Of the parenteral preparation forms, the nasal preparation form is preferred.
  • a liquid, gel or solid food such as juice, soft drink, tea, soup, soy milk, salad oil, dressing, yogurt, jelly, pudding, sprinkle, infant formula , Cake mix, powdered or liquid dairy products, bread, cookies and the like.
  • an oral composition for example, liquid (solution, emulsion, suspension, etc.), semi-solid (gel, cream, paste, etc.), solid (tablet, particulate agent, capsule, Film, kneaded material, molten solid, waxy solid, elastic solid, etc.), more specifically, dentifrice (toothpaste, liquid toothpaste, liquid toothpaste, powder toothpaste etc.), mouthwash,
  • a coating agent for example, chewing gum, tablet candy, candy, gummi, film, troche and the like.
  • composition of the present invention may further contain other components as necessary.
  • Other components are not particularly limited as long as they are components that can be blended in pharmaceutical compositions, food compositions, oral compositions, etc., for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers Agents, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances, chelating agents and the like.
  • the content of the active ingredient in the composition of the present invention depends on the use, use mode, application target, application target state, etc., and is not limited, but is, for example, 0.0001 to 95% by weight, preferably 0.001. It can be up to 50% by weight.
  • the amount of application (for example, administration, ingestion, inoculation, etc.) of the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits a medicinal effect, and generally, as the weight of the compound of the present invention that is an active ingredient, 0.1 to 1000 mg / kg body weight per day for oral administration, preferably 0.5 to 50 mg / kg body weight per day, 0.01 to 100 mg / kg body weight per day for parenteral administration, Preferably, it is 0.1 to 10 mg / kg body weight.
  • the above dose is preferably administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and can be appropriately increased or decreased depending on age, disease state, and symptoms.
  • Example 1 Purified total RNA from green pepper (Capsicum annuum L. 'grossum', Kyosuzu) From green pepper (variety name: Kyo Suzu) known to contain intracellular double-stranded RNA of endornavirus Total RNA was purified. Specifically, it was performed as follows.
  • RNA was dissolved in RNase free water so that the nucleic acid was 1000 ⁇ ng / ⁇ L.
  • Total RNA was subjected to agarose gel electrophoresis and confirmed to contain about 14.7 kb double-stranded RNA (endoluna virus genomic double-stranded RNA). The amount of double-stranded RNA was about 0.058% (w / w) of the total nucleic acid.
  • Example 2 In vitro immunostimulatory factor production test 1 Lung fibroblasts were collected from 6-week-old C57BL / 6J mice ( ⁇ ) and cultured on a 6 cm dish for 3 days according to a standard method. Then, seeded on a 12-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well and cultured overnight, the aqueous solution of total RNA of Example 1 or Comparative Example 1 (nucleic acid: 1000 ng / ⁇ L) or water was added at 50 ⁇ L / Dish was added and cultured for 24 hours. After culture, the mRNA expression level of interferon responsive genes (ISG56 and CXCL10) was measured by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • the expression of the interferon-responsive gene was increased by the genome double-stranded RNA (Example 1) of the pepper-derived endoluna virus.
  • the expression of interferon and interferon responsive genes increased in a concentration-dependent manner by the genome double-stranded RNA (Example 1) of pepper-derived endoluna virus.
  • Example 4 In vivo immunostimulatory factor production test 2
  • the total RNA aqueous solution of Example 1 was treated in the same manner as in Example 3 except that oral administration (300 ⁇ L / body) was used. Administration was performed.
  • Each organ (lung, large intestine, small intestine, stomach, liver, and spleen) was collected 24 hours after administration, and the mRNA expression level of the interferon responsive gene (ISG56) in each organ was measured by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • the expression of the interferon-responsive gene in each tissue increased due to the genome double-stranded RNA (Example 1) of the pepper-derived endoluna virus.
  • Example 6 Virus infection test 2 (nasal administration) The test was conducted in the same manner as in Example 5 except that the virulent influenza A virus (H5N1) was used as the virus to be infected. The results are shown in FIG.
  • the decrease in the survival rate and the weight loss due to the infection with the virulent influenza A virus were suppressed by the genome double-stranded RNA (Example 1) of the pepper-derived endornavirus.
  • Example 7 Virus infection test 3 (oral administration) In the afternoon of the day before virus infection (Day-1), the total RNA aqueous solution of Example 1 was orally administered (300 ⁇ L / body) to 6-week-old C57BL / 6J mice ( ⁇ ). On the morning of the next day (Day 0), 3.2 ⁇ 10 7 pfu / head (200 ⁇ L) of encephalomyocarditis virus (EMCV) was infected orally. The total RNA aqueous solution of Example 1 was orally administered (300 ⁇ L / body) on the afternoon of the infection day (Day 0) and on the day after the infection day (Day 1). The survival rate of the mice was measured over a certain period from the infection. The results are shown in FIG.
  • Example 8 Double-stranded RNA purification from rice bran (Oryza sativa, Koshihikari (variety)) Two from rice bran (Koshihikari) known to contain intracellular double-stranded RNA of endornavirus Strand RNA was purified. Specifically, it was performed as follows.
  • Lithium chloride was added to the resulting solution to a final concentration of 2.25 ⁇ M, mixed, then left on ice for 2 hours, and then centrifuged (4 ° C, 15000 ⁇ rpm, 15 minutes) to recover the supernatant. did. Lithium chloride was added to the supernatant to a final concentration of 4 ⁇ M and mixed, and then allowed to stand on ice for 2 hours and then centrifuged (4 ° C., 15000 ⁇ rpm, 35 minutes). The supernatant was removed to obtain RNA. The RNA was subjected to agarose gel electrophoresis and confirmed to contain about 14 kb double-stranded RNA (endornavirus genomic double-stranded RNA).
  • Example 9 Double-stranded RNA-purified Koshihikari (variety ) from rice bran (Oryza sativa, koshihikari (variety)) 60 g of rice bran added with 15 mL of 0.5% DOC buffer, and then centrifuged (4 ° C, 10000 rpm for 15 minutes) and the supernatant was collected. To the supernatant, sodium chloride was added to a final concentration of 1.6 M, PEG # 6000 was further added to a final concentration of 6.5%, and the mixture was stirred and allowed to stand on ice for 2 hours, followed by centrifugation (4 ° C, 10000 rpm for 60 minutes) and the supernatant was removed.
  • the precipitate was washed twice with 70% ethanol aqueous solution and air-dried, and then dissolved in 5 mL TE buffer. After adding an equal amount of phenol to the resulting solution and stirring vigorously, the supernatant was recovered by centrifugation (4 ° C., 8000 rpm, 10 minutes). This phenol extraction operation was repeated twice. An equal amount of chloroform was added to the supernatant and stirred vigorously, followed by centrifugation (4 ° C., 3500 rpm, 3 minutes) to recover the supernatant. After adding an equal amount of isopropanol to the supernatant and stirring, the supernatant was removed by centrifugation (4 ° C., 10,000 rpm, 30 minutes). About 14 kb of double-stranded RNA was purified by gel filtration (Sepharose 4B) by dissolving the precipitate in 1 mL ultrapure.
  • Example 10 In vitro immunostimulatory factor production test 2 Mouse fetal fibroblasts were cultured on a 6-well plate dish according to a conventional method. To the medium, the RNA aqueous solution of Example 8 (containing 0.25 ⁇ g of double-stranded RNA) or 1 ⁇ g of PolyIC was added (/ dish) together with lipofectamine and cultured for 6 hours. After the culture, the mRNA expression levels of interferon (IFN- ⁇ 1) and interferon responsive gene (ISG56) were measured by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • IFN- ⁇ 1 interferon
  • ISG56 interferon responsive gene
  • Example 11 In vivo immunostimulatory factor production test 3
  • the RNA aqueous solution of Example 8 (containing 20 ⁇ g of double-stranded RNA) was intranasally administered to 6-week-old C57BL / 6J mice ( ⁇ ) in the same manner as in Example 3. Lungs were removed at 0, 4, 8, and 24 hours after administration, and various mRNA expression levels were measured by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • Interferon eg, IFN- ⁇ 1, IFN ⁇ 4, etc.
  • interferon response factor eg, ISG56, BST2, IFITM3, CXCL1, CXCL2
  • cytokines for example, IL-1 ⁇ , IL6, TNF ⁇ , etc.
  • the expression increase of interferon and interferon-responsive gene by the double-stranded RNA (Example 1) of pepper-derived endoluna virus found in wild type mice is observed in MAD5 and TRIF double knockout mice. Did not happen. From these results, it was suggested that the effect of the genome double-stranded RNA of Endornavirus is an effect through a signal transduction pathway via MAD5 and / or TRIF.
  • the change in body weight when the genome double-stranded RNA (Example 1) of pepper-derived endoluna virus was administered was similar to the change in body weight when water was administered instead.
  • Example 17 Evaluation test of therapeutic / prophylactic effect for multiple sclerosis
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • p-toxin pertussis toxin
  • p-toxin pertussis toxin
  • Example which contains 30 ⁇ g of double-stranded RNA only on 9 out of the whole (n 17) from MOG administration (day 0) to 7, 8, and 9th (day 7, 8, 9)
  • MOG administration day 0
  • clinical score (0: normal (no symptoms), 1: decreasing muscle tonus in tail, 2) complete paralysis in tail (tail complete paralysis)
  • gait abnormality (4: hind-limb paralysis). The results are shown in FIG.
  • Example 18 Double-stranded RNA purified Koshihikari (variety ) from rice bran (Oryza sativa, koshihikari (variety)) 200 g of rice bran with 0.25% sodium cholate solution (composition: 0.1 M NaCl, 0.25% sodium cholate) 2000 After adding mL and mixing, the mixture was centrifuged (4 ° C., 3500 rpm, 10 minutes) or left at 4 ° C. After centrifugation or standing, the supernatant (milky white / cloudy) was collected.
  • RNA solubilizing solution composition: 0.1 M NaCl, chelating agent (50 mM sodium citrate or 50 mM ethylenediaminetetraacetic acid trisodium salt)
  • the suspension was centrifuged (4 ° C., 10000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected.
  • the obtained precipitate contained endornavirus double-stranded RNA.
  • the obtained precipitate is a viscous paste and can be stored for a long period of time by pulverizing it by freeze-drying or the like.
  • Example 19 In vivo immunostimulatory factor production test 4 A 5 kg microminiature pig was anesthetized, and the aqueous total RNA solution of Example 1 (containing 4 mg of pepper-derived RNA (total RNA)) was administered intranasally. Lungs were collected 24 hours after administration, and the mRNA expression level of interferon-inducible gene (Cxcl10) in the lungs was measured by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG. In FIG. 15, “RNA (individual 1)” and “RNA (individual 2)” indicate the results of two micro-mini pigs, respectively.
  • the expression of the interferon-inducible gene was increased by the genome double-stranded RNA (Example 1) of the pepper-derived endoluna virus.

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Abstract

本発明によれば、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを含有する、免疫賦活因子産生促進用組成物により、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等の多様な疾患を予防及び改善することができる。

Description

免疫賦活因子産生促進用組成物
　本発明は、免疫賦活因子産生促進用組成物に関する。
　ウイルス性疾患全般に対して有効な治療法は確立されておらず、通常、それぞれのウイルス性疾患に応じた治療法が採られている。例えば、C型肝炎等に対してはインターフェロン療法が、インフルエンザ等の特定のウイルス性疾患に対しては抗ウイルス薬（タミフル、リレンザ等）の投与が行われている。ただ、副作用のリスク、コスト等の観点から、インターフェロン療法を予防目的で継続的に利用することは困難である。また、現状の抗ウイルス薬は合成低分子化合物を有効成分とするものであり、コスト等の観点から、やはり予防目的で継続的に利用することは困難である。
　がんに対しては、DNA合成等に作用してがん細胞の増殖を抑制することを目的とする抗がん剤療法、免疫を活性化してがん細胞の増殖を抑制することを目的とするインターフェロン療法等の薬物療法が行われている。ただ、副作用のリスクやコスト等の観点から、インターフェロン療法を予防目的で継続的に利用することは困難である。また、現状の抗がん剤は、通常は合成低分子化合物、抗体等を有効成分とするものであり、コスト等の観点から、やはり予防目的で継続的に利用することは困難である。
　多発性硬化症についても、ウイルス性疾患、がん等と同様に、低分子化合物、インターフェロン等による治療が行われているが、副作用のリスク、コスト等の観点から、予防目的で継続的に利用することは困難である。
　このように、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等に対しての様々な疾患に対して広範囲に適用可能であり、さらにこれらの疾患の予防にも利用可能（すなわち副作用のリスクが少なく、低コスト）な治療法は知られていない。
　一方、エンドルナウイルスは、植物、特にピーマン、イネ等の日常的に摂取している食用植物に存在していることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２等）。ある種のRNAウイルスは、MDA5、RIG-I等を介するシグナル伝達経路を通じてインターフェロン産生を誘導し、その結果、生体内の免疫賦活化を起こすといわれている。しかし、エンドルナウイルスとウイルス性疾患との関連については知られていない。
Journal of General Virology (2011), 92, 2664-2673. Journal of General Virology (2011), 92, 2674-2678.
　本発明は、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等の種々の疾患に対する予防及び改善法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAがインターフェロン等の免疫賦活因子の産生促進作用を有することを見出した。さらに、該二本鎖RNAにより、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等の幅広い疾患の予防及び改善が可能であることをも見出した。本発明者らはこのような知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
　項１．　植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを含有する、免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項２．　前記植物がトウガラシ属植物、イネ属植物、又はソラマメ属植物である、項１に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項３．　前記ゲノム二本鎖RNAの長さが8～20 kbpである、項１又は２に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項４．　前記ゲノム二本鎖RNAが直鎖状である、項１～３のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項５．　医薬組成物である、項１～４のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項６．　経鼻製剤形態である、項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項７．　経口製剤形態である、項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項８．　食品組成物である、項１～４のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項９．　免疫賦活用組成物として用いられる、項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項１０．　抗ウイルス用組成物として用いられる、項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項１１．　前記ウイルスがRNAウイルスである、項１０に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項１２．　アジュバントとして用いられる、項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　項１３．　がんの予防又は改善用組成物として用いられる、請求項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物．
　また、本発明は、下記の態様も包含する：
　項１４．　植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを動物又はヒトに適用することを含む、免疫賦活因子産生促進方法．
　項１５．　免疫賦活因子産生促進のための、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA．
　項１６．　免疫賦活因子産生促進用組成物の製造のための、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAの使用．
　項１７．　免疫賦活因子産生促進のための、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAの使用．
　本発明によれば、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを用いることより、インターフェロン等の免疫賦活因子の産生を促進させ、これにより体内の免疫を賦活することができる。よって、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、免疫賦活因子産生促進作用、免疫賦活作用に基づく種々の用途（例えば、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等の予防及び改善、アジュバント等）に利用することができる。また、抗ウイルス用に用いる場合は、幅広い種類のウイルスに対して適用することも可能である。
　さらに、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、植物（特に食用植物）に含まれている成分であるので、その安全性は高いと考えられる。また、本発明によれば、植物から効率的に該二本鎖RNAを精製することも可能である。したがって、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、より安全且つより低コストで利用することが可能であり、ウイルス性疾患、がん、多発性硬化症等等の疾患の予防目的で継続的に利用することに適している。
実施例2のin vitro免疫賦活因子産生試験1の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。 実施例3のin vivo免疫賦活因子産生試験1の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。 実施例4のin vivo免疫賦活因子産生試験2の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。「京鈴RNA」は実施例1で得られたtotal RNAを示す。 実施例5のウイルス感染試験1の結果を示す。左側の図の縦軸は生存率を示し、右側の図の縦軸は体重を示す。横軸は、感染後の経過日数を示す。「Green pepper」は実施例1で得られたtotal RNAを投与した場合を示す。 実施例6のウイルス感染試験2の結果を示す。左側の図の縦軸は生存率を示し、右側の図の縦軸は体重を示す。横軸は、感染後の経過日数を示す。「Green pepper」は実施例1で得られたtotal RNAを投与した場合を示す。 実施例7のウイルス感染試験3の結果を示す。縦軸は生存率を示す。横軸は、感染後の経過日数を示す。「京鈴RNA」は実施例1で得られたtotal RNAを示す。 実施例10のin vitro免疫賦活因子産生試験2の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。「dsRNA」は実施例8で得られたtotal RNAを示す。 実施例11のin vivo免疫賦活因子産生試験3の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。横軸は投与後の経過時間を示す。 実施例12のウイルス感染試験4の結果を示す。縦軸は生存率を示し、横軸は、感染後の経過日数を示す。「dsRNA treated」は実施例8のRNAを投与した場合を示し、「PR/8 control」は実施例8のRNAに代えて水を投与した場合を示す。 実施例13のウイルス感染試験5の結果を示す。上側の図の縦軸は体重を示し、下側の図の縦軸は生存率を示す。横軸は、感染後の経過日数を示す。「GP」及び「Green pepper」は実施例1で得られたtotal RNAを投与した場合を示す。 実施例14のin vivo免疫賦活因子産生試験4の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。各グラフ中、左側のカラムは野生型マウスの結果を示し、右側のカラムはMAD5及びTRIFのダブルノックアウトマウスの結果を示す。 実施例15の毒性試験の結果を示す。縦軸は体重を示し、横軸は初回投与からの経過日数を示す。 実施例16のがん治療／予防効果の評価試験の結果を示す。縦軸は、腫瘍の大きさを示し、横軸は、メラノーマ細胞の皮下注射からの経過日数を示す。「dsRNA (-)」は比較例1のtotal RNAを投与した場合を示し、「dsRNA (+)」は実施例1のtotal RNAを投与した場合を示す。 実施例17の多発性硬化症治療／予防効果の評価試験の結果を示す。縦軸は、多発性硬化症モデルとなる実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の臨床スコアを示し、横軸はミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白質(MOG)投与（day 0）からの経過日数を示す。「GP」は実施例1で得られたtotal RNAを投与した場合を示す。 実施例19のin vivo免疫賦活因子産生試験4の結果を示す。縦軸は相対発現量を示す。横軸中、「mock」は水を投与した場合を示し、「RNA（個体1）」及び「RNA（個体2）」は、実施例1で得られたtotal RNAを投与した場合について、2頭のマイクロミニブタの結果をそれぞれ示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本発明は、その一態様において、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを含有する、免疫賦活因子産生促進用組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある）に係る。以下、これについて説明する。
　1．植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA
　以下に、本発明の組成物の有効成分である「植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA」について説明する。
　植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、植物に含まれるエンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAである限り特に制限されない。
　エンドルナウイルスを含む植物は、種々知られている。該植物の例としては、Capsicum annuum（トウガラシ）、Capsicum frutescens（キダチトウガラシ）、Capsicum baccatum（アヒ・アマリージョ）、Capsicum chinense（シネンセ種）等のトウガラシ属植物；　Oryza sativa（品種としては、例えばKoshihikari等）等のイネ属植物；　ソラマメ属植物等が挙げられる。エンドルナウイルスを含むCapsicum annuumの品種としては、例えばCalifornia Wonder、Yolo Wonder、Kyousuzu、Kyounami、Kyoumidori、Ace、Suigyokunigou、High Green、Jumbo Colour、Marengo、Avelar、Casca Dura、King Arthur、VR-4、Magda、Bonnie’s Green Bell、Red Bell、Chocolate Beauty Sweet、Pimento Sweet、Cayenne Long Red Thick、Super Cayenne等が挙げられる。エンドルナウイルスを含むCapsicum frutescensの品種としては、例えばGreenleaf、LSU、PI 159239、PI 193470等が挙げられる。エンドルナウイルスを含むCapsicum baccatumの品種としては、例えばMonk’s Hat、PI 238061、PI 633752、PI 260549、PI 215699、PI 260590、PI 260543、PI 441589、PI 257135、PI 337524、PI 337522、C00754 (AVRDC)、C01218 (AVRDC)、C01527 (AVRDC)、C01300 (AVRDC)等が挙げられる。エンドルナウイルスを含むCapsicum chinenseの品種としては、例えばPI 159236、PI 315008、PI 315023、PI 315024、PI 273426、C00943 (AVRDC)、C00949 (AVRDC)等が挙げられる。
　植物に含まれるエンドルナウイルスは、通常、キャプシドで覆われておらず、ゲノムである二本鎖RNAから構成されている。本発明においては、この二本鎖RNAを有効成分として利用する。
　本発明において有効成分として利用するゲノム二本鎖RNAは、エンドルナウイルスのゲノム全長であってもよいし、その断片であってもよい。ただ、免疫賦活因子産生促進作用をより効率的に発揮できるという観点から、該ゲノム二本鎖RNAの長さは、より長い方が望ましく、例えば8～20 kbp、好ましくは10～18 kbp、より好ましくは12～16 kpbである。
　本発明において有効成分として利用するゲノム二本鎖RNAの形状は、特に制限されないが、通常は直鎖状である。
　本発明において有効成分として利用するゲノム二本鎖RNAの配列は特に制限されない。本発明においては、2つの異なる植物から精製したエンドルナウイルスゲノム二本鎖RNAが、すなわち互いに配列の異なるゲノム二本鎖RNAが、免疫賦活因子産生促進作用を有することを見出している。このため、この免疫賦活因子産生促進効果は、植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAの配列に依存しない効果であると考えられる。
　2．製造方法
　以下に、本発明の組成物の有効成分である「植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA」の製造方法について説明する。
　本発明の組成物の有効成分である「植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA」は、エンドルナウイルスを含む植物細胞から核酸（特にRNA）を精製する方法により得ることができる。例えば、細胞溶解工程、除タンパク工程、核酸濃縮工程、核酸可溶化工程等を適宜組み合わせて精製することができる。
　材料である植物細胞は、エンドルナウイルスを含む植物の細胞である限り特に制限されない。安全性の観点から、植物細胞は、好ましくは食用植物の細胞であり、より好ましくは食用植物の食用部位（例えば果実、種子、或いはこれらの一部分）の細胞である。また、より低コストに目的物を得ることができるという観点から、食用部位であっても、通常であれば廃棄される部位（例えば、イネの種子（米）の糠等）の細胞を用いることが望ましい。
　細胞溶解工程は、植物細胞の細胞膜を壊すことができる限りにおいて特に制限されず、公知の方法を各種採用することができる。例えば、界面活性剤を含む溶液と混合する工程が挙げられる。界面活性剤は、特に制限されず各種界面活性剤を使用することができるが、核膜を壊さない程度の強さの界面活性剤が好ましい。これにより、細胞のゲノムDNAの混入を防ぐことが可能となり、より高い純度でエンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを得ることができる。このような界面活性剤としては、好ましくはデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤の濃度はその種類によって適宜調整されるものであるが、例えばデオキシコール酸ナトリウムの場合であれば例えば0.2～1％程度、好ましくは0.3～0.7％程度の濃度を採用することができる。また、後述の方法4の場合であれば0.15～0.35％程度の濃度を採用することが好ましい。混合後は、遠心分離等により不溶成分を除去することが望ましい。
　除タンパク工程は、タンパク質を不溶化させることができる限りにおいて特に制限されず、公知の方法を各種採用することができる。例えば、フェノール、クロロホルム、フェノール及びクロロホルムを含有する混合溶媒等の有機溶媒と混合する工程が挙げられる。混合後は、通常、遠心分離等により不溶化タンパク質を除去する。除タンパク工程は、必要に応じて複数回（例えば2～4回）行ってもよい。
　核酸濃縮工程は、核酸を遠心分離等により沈殿させることができる限りにおいて特に制限されず、公知の方法を各種採用することができる。例えばアルコール沈殿、塩析等が挙げられる。アルコール沈殿に用いるアルコールとしては、特に制限されず、例えばエタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。塩析に用いる塩としては、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等が挙げられ、好ましくは塩化リチウムが挙げられる。核酸濃縮工程は、必要に応じてアルコール沈殿と塩析を組み合わせて複数回（例えば2～3回）行ってもよい。
　核酸可溶化工程は、核酸濃縮工程により得られる沈殿に含まれる核酸（特に二本鎖RNA）を可溶化できる限りにおいて特に制限されず、公知の方法を各種採用することができる。例えば、核酸濃縮工程により得られる沈殿をキレート剤含む溶液で懸濁する工程が挙げられる。キレート剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸水素三ナトリウム等が挙げられる。
　上記工程に加えて、必要に応じて他の工程、例えば洗浄工程（例えば、エタノール水溶液によるリンス等）、さらなる精製工程（例えばゲルろ過等の各種クロマトグラフィー等）等を組み合わせてもよい。
　本発明の組成物の有効成分である「植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA」を得る具体的な方法としては、例えば除タンパク工程、アルコール沈殿の順に行う方法（方法1）、細胞溶解工程、除タンパク工程、アルコール沈殿、塩析の順に行う方法（方法2）、細胞溶解工程、アルコール沈殿（好ましくはポリエチレングリコール沈殿）及び塩析、除タンパク工程、アルコール沈殿の順に行う方法（方法3）、細胞溶解工程、アルコール沈殿、核酸可溶化工程、アルコール沈殿の順に行う方法（方法4）等が挙げられる。
　これらの中でも、方法3は、1回目のアルコール沈殿により溶液量を減らすことができ、これにより除タンパク工程で用いる有機溶媒の量も減らすことができるので、より大スケールで行うのに適している。
　また、方法4は、エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを粘性のあるペースト状の沈殿として得ることが可能である。この沈殿を凍結乾燥等によって粉末にすることにより、該二本鎖RNAを長期保存することが可能になる。なお、方法4においては、2回のアルコール沈殿の内、1回目のアルコール沈殿におけるアルコール濃度を比較的低く（例えば、アルコール濃度を10～30％、好ましくは15～25％に）し、2回目のアルコール沈殿におけるアルコール濃度を比較的高く（例えば、アルコール濃度を50～80％、好ましくは60～75％、より好ましくは60～70％に）することが好ましい。
　3．用途
　以下に、本発明の組成物の用途について説明する。なお、以下、本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、「改善」を「治療」に読み替えることができる。
　植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、免疫賦活因子産生促進作用を有することから、免疫賦活因子産生促進用の各種組成物（医薬組成物、食品組成物、口腔用組成物等）への利用が可能である。植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAは、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物およびヒトに適用（例えば、投与、摂取、接種等）することができる。
　本発明の組成物は、インターフェロン（例えば、IFN-β1、IFNα4等）、インターフェロン応答因子（例えば、ISG56、BST2、IFITM3、CXCL1、CXCL2、Pai-1等）、サイトカイン（例えば、IL-1β、IL6、TNFα等）、インターフェロン誘導遺伝子（例えば、Cxcl10等）等の免疫賦活因子の産生を促進することができる。これにより、本発明の組成物は体内の免疫を賦活することができる。よって、本発明の組成物は、免疫賦活用組成物として用いることができる。
　本発明の組成物は、抗ウイルス用組成物（ウイルス感染症の予防又は改善用組成物）として用いることもできる。これは、本発明の組成物の上記作用（免疫賦活因子産生促進作用及び免疫賦活作用）に基づくものであると考えられており、このため本発明の組成物は、ウイルスの種類を問わず、種々のウイルスに対して抗ウイルス作用を発揮できると考えられる。
　対象ウイルスとしては、特に制限されないが、例えばインフルエンザウイルス（例えばA型、B型等）、風疹ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、アルボウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ノロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、SARSウイルス、肝炎ウイルス（例えば、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス等）黄熱ウイルス、狂犬病ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ニパウイルス、Bウイルス、リッサウイルス、ライノウイルス等が挙げられる。これらの中でも、インフルエンザウイルス、脳心筋炎ウイルス等のRNAウイルスが好ましく挙げられる。
　本発明の組成物は、免疫賦活因子産生促進用、免疫賦活作用があることから、アジュバントとしても用いることができる。
　本発明の組成物は、免疫賦活因子産生促進用、免疫賦活作用があることから、各種疾患、例えば多発性硬化症(MS)、がん等の予防又は改善用に用いることもできる。
　予防又は改善対象のがんとしては、特に制限されず、例えば皮膚がん、多発性骨髄腫、肺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、すい臓がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、胆道がん、腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、精巣がん、白血病、骨腫瘍、骨肉種、軟部腫瘍、悪性リンパ腫、咽頭がん、頭頸部のがん、小児がん等が挙げられる。
　本発明の組成物の形態は、特に限定されず、本発明の組成物の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
　形態としては、用途が医薬組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメント等）等である場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。非経口製剤形態の中でも、点鼻製剤形態が好ましい。
　形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等が挙げられる。
　形態としては、用途が口腔用組成物である場合は、例えば液体（溶液、乳液、懸濁液等）、半固体（ゲル、クリーム、ペースト等）、固体（錠剤、粒子状剤、カプセル剤、フィルム剤、混練物、溶融固体、ロウ状固体、弾性固体等）等の任意の形態、より具体的には、歯磨剤（練歯磨、液体歯磨、液状歯磨、粉歯磨等）、洗口剤、塗布剤、貼付剤、口中清涼剤、食品（例えば、チューインガム、錠菓、キャンディ、グミ、フィルム、トローチ等）等が挙げられる。
　本発明の組成物は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、医薬組成物、食品組成物、口腔用組成物等に配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の組成物中の有効成分の含有量は、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～95重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の組成物の適用（例えば、投与、摂取、接種等）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分である本発明の化合物の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～50 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.1～10 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　実施例1：ピーマン（Capsicum annuum L. 'grossum', Kyosuzu）からのtotal RNA精製　エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを細胞内に含むことが知られているピーマン（品種名：京鈴）からtotal RNAを精製した。具体的には以下のように行った。
　ピーマン栽培品種である京鈴を、圧縮搾り低速ジューサー（イキイキ酵素くん、オデオコーポレーション社製）を用いて粉砕し、2,000 rpmで遠心して、上清を除いた。得られた沈殿物がすべて溶けるまでRNase free waterを加え、それに対して、フェノール・クロロホルム溶液（TE 飽和フェノール：クロロホルム＝1：1）等量を加えて激しく攪拌した後、遠心（4℃、2,380 g（遠心力）、15分間）して上清を回収した。得られた上清の1/10量に対して塩水溶液、及び2倍量の100 %エタノールを添加し、混合した後、-80℃で15分間静置した。遠心（4℃、2,380 g（遠心力）、15分間）して、上清を除去した後、沈殿を70％エタノール水溶液で洗浄した。残った溶媒を減圧乾燥により除去して、total RNAを得た。このtotal RNAを核酸が1000 ng/μLになるようにRNase free waterで溶かした。total RNAをアガロースゲル電気泳動して、約14.7 kbの二本鎖RNA（エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA）が含まれていることを確認した。また、該二本鎖RNA量は、全核酸の約0.058％（w/w）であった。
　比較例1：ピーマン（Capsicum annuum L. 'grossum', Miogi）からのtotal RNA精製　エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを細胞内に含まないことが知られているピーマン（品種名：みおぎ）から、実施例1と同様にしてtotal RNAを精製した。
　実施例2：in vitro免疫賦活因子産生試験1
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）から肺繊維芽細胞を採取し、6 cmディッシュ上で定法に従って３日間培養した。その後、1x105 cells/wellとなるように12-well plateへ播種し、１晩培養した培地に、実施例1又は比較例1のtotal RNA水溶液（核酸：1000 ng/μL）又は水を50μL／dish添加し、24時間培養した。培養後、インターフェロン応答性遺伝子（ISG56及びCXCL10）のmRNA発現量を、定量的RT-PCRで測定した。結果を図１に示す。
　図１に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により、インターフェロン応答性遺伝子の発現が増加した。
　実施例3：in vivo免疫賦活因子産生試験1
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=3）に対して、RNase free waterで100mg/mlに調製したペントバルビタールナトリウム15μLを500μLのPBSで希釈したもの（＝1.5mg/body）を腹腔内注射することにより麻酔をかけた。実施例1のtotal RNA水溶液（核酸：1000 ng/μL）を経鼻投与（12.5μL、25μL、又は50μL／body）した。投与後、マウスの鼻を指ではじき、仰向けに静置することで確実に肺に投与サンプルが行き届くようにした。投与から24時間後に肺を採取し、肺におけるインターフェロン（IFN-β1）及びインターフェロン応答性遺伝子（ISG56）のmRNA発現量を、定量的RT-PCRで測定した。結果を図２に示す。
　図２に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により、濃度依存的に、インターフェロン及びインターフェロン応答性遺伝子の発現が増加した。
　実施例4：in vivo免疫賦活因子産生試験2
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=3）に対して、実施例1のtotal RNA水溶液を、実施例3と同様にして経鼻投与（50μL／body）した。一方で、6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=3）に対して、経口投与（300μL／body）とする以外は実施例3と同様にして、実施例1のtotal RNA水溶液の投与を行った。投与から24時間後に各臓器（肺、大腸、小腸、胃、肝臓、及び脾臓）を採取し、各臓器におけるインターフェロン応答性遺伝子（ISG56）のmRNA発現量を、定量的RT-PCRで測定した。結果を図３に示す。
　図３に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により、各組織におけるインターフェロン応答性遺伝子の発現が増加した。
　実施例5：ウイルス感染試験1（経鼻投与）
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=7）に対して、実施例1のtotal RNA水溶液を、実施例3と同様にして経鼻投与（30μL／body）した。投与から1日後、1.3×107 pfu/μL×50μL/bodyのインフルエンザAウイルス（H1N1）を経鼻投与により感染させた。感染から1日後、実施例1のtotal RNA水溶液を、実施例3と同様にして経鼻投与（30μL／body）した。感染から一定期間に亘って、マウスの生存率、及び体重を計測した。結果を図４に示す。
　図４に示されるように、インフルエンザAウイルス感染による生存率の低下及び体重減少が、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により抑制された。
　実施例6：ウイルス感染試験2（経鼻投与）
　感染させるウイルスとして強毒性インフルエンザAウイルス（H5N1）を用いる以外は、実施例5と同様にして試験した。結果を図５に示す。
　図５に示されるように、強毒性インフルエンザAウイルス感染による生存率の低下及び体重減少が、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により抑制された。
　実施例7：ウイルス感染試験3（経口投与）
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）に対して、ウイルス感染前日（Day-1）の午後に、実施例1のtotal RNA水溶液を経口投与（300μL／body）した。翌日（Day0）の午前に、3.2×107pfu/head (200μL)の脳心筋炎ウイルス（EMCV）を経口投与により感染させた。感染日（Day0）の午後及び感染日の翌日（Day1）に、実施例1のtotal RNA水溶液を経口投与（300μL／body）した。感染から一定期間に亘って、マウスの生存率を計測した。結果を図６に示す。
　図６に示されるように、脳心筋炎ウイルス感染による生存率の低下が、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により抑制された。
　実施例8：米糠（Oryza sativa, Koshihikari（品種））からの二本鎖RNA精製
　エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを細胞内に含むことが知られている米（コシヒカリ）の糠から二本鎖RNAを精製した。具体的には以下のように行った。
　コシヒカリ（品種）の米糠60 gに0.5％DOC緩衝液（組成：285ml of 5M NaCl and 3MNaOAc (pH 5.2) + 15ml of 10%デオキシコール酸ナトリウム（DOC））300 mLを添加して混合した後、遠心（4℃、10000 rpm、15分間）して上清を回収した。上清に等量のフェノールを加えて激しく攪拌した後、遠心（4℃、8000 rpm、10分間）して上清を回収した。このフェノール抽出操作を2回繰り返した。上清に等量のフェノール・クロロホルム溶液を加えて激しく攪拌した後、遠心（4℃、3500 rpm、3分間）して上清を回収した。上清に等量のイソプロパノールを添加して攪拌した後、遠心（4℃、10000 rpm、30分間）して上清を除去した。沈殿を70％エタノール水溶液で洗浄し、10 mM TE緩衝液に溶解した。得られた溶液に、塩化リチウムを終濃度2.25 Mになるように添加して混合した後、氷上で2時間静置してから遠心（4℃、15000 rpm、15分間）して上清を回収した。上清に、塩化リチウムを終濃度4 Mになるように添加して混合した後、氷上で2時間静置してから遠心（4℃、15000 rpm、35分間）した。上清を除去して、RNAを得た。RNAをアガロースゲル電気泳動して、約14 kbの二本鎖RNA（エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA）が含まれていることを確認した。
　実施例9：米糠（Oryza sativa, koshihikari（品種））からの二本鎖RNA精製
　コシヒカリ（品種）の米糠60 gに0.5％DOC緩衝液15 mLを添加して混合した後、遠心（4℃、10000 rpm、15分間）して上清を回収した。上清に、終濃度1.6 Mになるように塩化ナトリウムを加え、更に終濃度6.5％になるようにPEG#6000を加えて攪拌した後、氷上で2時間静置してから遠心（4℃、10000 rpm、60分間）して上清を除去した。沈殿を70％エタノール水溶液で2回洗浄して風乾した後、5 mL TE緩衝液に溶解した。得られた溶液に等量のフェノールを加えて激しく攪拌した後、遠心（4℃、8000 rpm、10分間）して上清を回収した。このフェノール抽出操作を2回繰り返した。上清に等量のクロロホルムを加えて激しく攪拌した後、遠心（4℃、3500 rpm、3分間）して上清を回収した。上清に等量のイソプロパノールを添加して攪拌した後、遠心（4℃、10000 rpm、30分間）して上清を除去した。沈殿を1 mLの超純粋に溶解し、ゲルろ過（Sepharose 4B）により、約14 kbの二本鎖RNAを精製した。
　実施例10：in vitro免疫賦活因子産生試験2
　マウス胎児線維芽細胞を、6 well plateディッシュ上で定法に従って培養した。培地に、実施例8のRNA水溶液（二本鎖RNAを0.25μg含有）又はPolyIC 1μgをリポフェクトアミンと共に添加（／dish）し、6時間培養した。培養後、インターフェロン（IFN-β1）及びインターフェロン応答性遺伝子（ISG56）のmRNA発現量を、定量的RT-PCRで測定した。結果を図７に示す。
　図７に示されるように、米糠由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例8）により、インターフェロン及びインターフェロン応答性遺伝子の発現が増加した。
　実施例11：in vivo免疫賦活因子産生試験3
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）に対して、実施例8のRNA水溶液（二本鎖RNAを20μg含有）を、実施例3と同様にして経鼻投与した。投与後0、4、8、及び24時間後に肺を摘出して、各種mRNA発現量を定量的RT-PCRで測定した。結果を図８に示す。
　米糠由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例8）の経鼻投与により肺においてインターフェロン（例えば、IFN-β1、IFNα4等）、インターフェロン応答因子（例えば、ISG56、BST2、IFITM3、CXCL1、CXCL2、Pai-1等）、サイトカイン（例えば、IL-1β、IL6、TNFα等）の産生をも促進することができることが示された（図８）。
　実施例12：ウイルス感染試験4（経鼻投与）
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=5）に対して、実施例8のRNA水溶液（二本鎖RNAを20μg含有）を、実施例3と同様にして経鼻投与した。投与から8時間後、実施例3と同様にしてインフルエンザAウイルス（H1N1）を経鼻投与により感染させると共に、実施例8のRNA水溶液（二本鎖RNAを20μg含有）を実施例3と同様にして経鼻投与した。感染から一定期間に亘って、マウスの生存率、及び体重を計測した。結果を図９に示す。
　図９に示されるように、インフルエンザAウイルス感染による生存率の低下が、米糠由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例8）により抑制された。
　実施例13：ウイルス感染試験5（経鼻投与）
　マウスとしてMAD5及びTRIFのダブルノックアウトマウス（n=5）を用いる以外は、実施例5と同様にして試験した。結果を図１０に示す。
　図１０に示されるように、MAD5及びTRIFのダブルノックアウトマウスにおいては、インフルエンザAウイルス感染による生存率の低下が、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）に回復しなかった。このことから、エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAの効果は、MAD5及び／又はTRIFを介したシグナル伝達経路を通じた効果であることが示唆された。
　実施例14：in vivo免疫賦活因子産生試験4
　マウスとしてMAD5及びTRIFのダブルノックアウトマウス（n=5）を用い、肺の採取を8時間後に行う以外は、実施例3と同様にして試験した。結果を図１１に示す。
　図１１に示されるように、野生型マウスにおいて見られるピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）によるインターフェロン及びインターフェロン応答性遺伝子の発現上昇が、MAD5及びTRIFのダブルノックアウトマウスにおいては起こらなかった。このことから、エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAの効果は、MAD5及び／又はTRIFを介したシグナル伝達経路を通じた効果であることが示唆された。
　実施例15：毒性試験
　6週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=5）に対して、実施例1のtotal RNA水溶液を、実施例3と同様にして経鼻投与（30μL／body）した。この投与を2回／週のペースで続け、マウスの体重の変化を計測した。結果を図１２に示す。
　図１２に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）を投与した場合の体重変化は、代わりに水を投与した場合の体重変化と同程度であった。
　実施例16：がん治療／予防効果の評価試験
　8週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=各群6、計12）に対して、1×106個のメラノーマ細胞（B16-F110細胞）を皮下注射した。皮下注射から1日経過後から、二本鎖RNA 250μgを含む実施例1のtotal RNA水溶液を、2回／週の頻度で腹空内投与した。皮下注射から、1日～数日毎に腫瘍の大きさを測定した。結果を図１３に示す。
　図１３に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）を投与した場合は、腫瘍の拡大をほぼ完全に抑制することができた。
　実施例17：多発性硬化症治療／予防効果の評価試験
　8週齢のC57BL/6Jマウス（♀）（n=17）に対して、ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白（MOG、200μg）及び百日咳毒素（p-toxin、0.5μg）を投与した（day 0）。MOG投与（day 0）から2日後（day 2）、百日咳毒素（p-toxin、0.5μg）を投与した。これら2回の投与により、多発性硬化症モデルとなるEAE（実験的自己免疫性脳脊髄炎）を誘発した。全体（n=17）の内の9匹に対してのみ、MOG投与（day 0）から7、8、及び9日目（day 7,8,9）に、二本鎖RNA 30μgを含む実施例1のtotal RNA水溶液を経鼻投与した。MOG投与（day 0）から、1日～数日毎に臨床スコア（0 : normal （症状なし）、1 : decreasing muscle tonus in tail（尾トーシス低下）、2 : complete paralysis in tail（尾完全麻痺）、3 : gait abnormality （歩行異常）、4 : hind-limb paralysis （後肢完全麻痺））を評価した。結果を図１４に示す。
　図１４に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）を投与した場合は、EAEの臨床スコアの悪化を抑制することができた。
　実施例18：米糠（Oryza sativa, koshihikari（品種））からの二本鎖RNA精製
　コシヒカリ（品種）の米糠200 gに0.25％コール酸ナトリウム液（組成：0.1M NaCl、0.25%コール酸ナトリウム）2000 mLを添加して混合した後、遠心（4℃、3500 rpm、10分間）又は4℃で放置した。遠心又は放置後、上清（乳白色・白濁）を回収した。上清に、1/4容積のエタノールを添加して撹拌し、氷上で60分間放置してから、遠心（4℃、3500 rpm、20分間）して上清を除去した。沈殿にRNA可溶化溶液（組成：0.1M NaCl、キレート剤（50mM クエン酸ナトリウム、あるいは50mMエチレンジアミン四酢酸水素三ナトリウム））200 mLを添加して、懸濁した。懸濁液を遠心（4℃、10000 rpm、10分間）して上清を回収した。上清に、2倍容積のエタノールを添加して撹拌し、氷上で60分間放置してから、遠心（4℃、3500 rpm、20分間）して上清を除去した。得られた沈殿がエンドルナウイルス二本鎖RNAを含むことを確認した。なお、得られた沈殿は粘性のあるペースト状であり、これを凍結乾燥等によって粉末化することにより、エンドルナウイルス二本鎖RNAを長期保存することができる。
　実施例19：in vivo免疫賦活因子産生試験4
　5 kgのマイクロミニブタを麻酔し、実施例1のtotal RNA水溶液（ピーマン由来のRNA（全RNA）を4 mg含む）を経鼻投与した。投与から24時間後に肺を採取し、肺におけるインターフェロン誘導遺伝子（Cxcl10）のmRNA発現量を、定量的RT-PCRで測定した。結果を図１５に示す。図１５中、「RNA（個体1）」、「RNA（個体2）」は、2頭のマイクロミニブタの結果をそれぞれ示す。
　図１５に示されるように、ピーマン由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNA（実施例1）により、インターフェロン誘導遺伝子の発現が増加した。
 

Claims (13)

  1. 植物由来エンドルナウイルスのゲノム二本鎖RNAを含有する、免疫賦活因子産生促進用組成物。
  2. 前記植物がトウガラシ属植物、イネ属植物、又はソラマメ属植物である、請求項１に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  3. 前記ゲノム二本鎖RNAの長さが8～20 kbpである、請求項１又は２に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  4. 前記ゲノム二本鎖RNAが直鎖状である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  5. 医薬組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  6. 経鼻製剤形態である、請求項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  7. 経口製剤形態である、請求項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  8. 食品組成物である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  9. 免疫賦活用組成物として用いられる、請求項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  10. 抗ウイルス用組成物として用いられる、請求項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  11. 前記ウイルスがRNAウイルスである、請求項１０に記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  12. アジュバントとして用いられる、請求項１～５のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
  13. がんの予防又は改善用組成物として用いられる、請求項１～８のいずれかに記載の免疫賦活因子産生促進用組成物。
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