JP6789522B2

JP6789522B2 - マクロファージ活性化剤及びマクロファージ活性化用食品組成物

Info

Publication number: JP6789522B2
Application number: JP2016179217A
Authority: JP
Inventors: 卓也菅原; 浩幸恩田
Original assignee: Ehime University NUC
Current assignee: Ehime University NUC
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2016-09-14
Publication date: 2020-11-25
Anticipated expiration: 2036-09-14
Also published as: JP2018043942A

Description

本発明は、マクロファージ活性化剤及びマクロファージ活性化用食品組成物に関する。本発明のマクロファージ活性化剤及びマクロファージ活性化用食品組成物によれば、マクロファージを活性化することができる。

マクロファージは体内の老廃物の処理、並びに病原体（例えば、ウイルス又は微生物など）及び腫瘍細胞に対する防御機能を担っている。また、Ｔ細胞への抗原の提示とインターロイキン（ＩＬ）の産生を介し、細胞性免疫のエフェクターとしての機能も有している。したがって、感染症及び腫瘍などの治療にはマクロファージを活性化させることが重要である。

従来より核酸及び多糖類等のマクロファージを活性化する様々な物質が提案されている（特許文献１）。しかしながら、所望のマクロファージ活性化機能を十分に有しており、医薬品又は食品として実際に使用できる物質の開発は未だなされていない現状にある。

一方で、香辛料は我々の食生活において使用頻度の高い食品の１つであり、その中でも、コリアンダーは、独特の芳香を有し、コリアンダーの葉、茎、果実、及び種子は、香辛料として、肉料理、豆料理、及び煮込み料理などに主に用いられている。

特開２００１−３１４１７２号公報

本発明者らは、種々の香辛料について、その抽出物のマクロファージ活性化能を比較検討したところ、コリアンダーの抽出物がマクロファージ活性化能を示すことを新たに見出した。コリアンダーの抽出物がマクロファージを活性化することは全く知られておらず、本発明はこうした知見に基づくものである。

従って、本発明は、
［１］コリアンダーの抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化剤、
［２］前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［１］に記載のマクロファージ活性化剤、
［３］前記抽出物が、エタノール、水性溶媒、又はエタノールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［２］に記載のマクロファージ活性化剤、
［４］前記抽出物が、種子の抽出物である、［１］〜［３］のいずれかに記載のマクロファージ活性化剤、
［５］コリアンダーの抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化用食品組成物、
［６］前記抽出物が、アルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［５］に記載のマクロファージ活性化用食品組成物、
［７］前記抽出物が、エタノール、水性溶媒、又はエタノールと水性溶媒との混合物による抽出物である、［６］に記載のマクロファージ活性化用食品組成物、及び
［８］前記抽出物が、種子の抽出物である、［５］〜［７］のいずれかに記載のマクロファージ活性化用食品組成物
に関する。

本発明のマクロファージ活性化剤によれば、マクロファージを活性化することができる。さらに、本発明のマクロファージ活性化剤によれば、マクロファージ活性化能を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することができる。

コリアンダー水溶性抽出物がマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がＰ−Ｍａｃのサイトカイン産生に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞の遺伝子発現に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダーのエタノール抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がＲＡＷ２６４．７細胞の貪食活性に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がＮＯ産生に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がｉＮＯＳ遺伝子発現に及ぼす影響を表すグラフである。ＴＬＲ４を介したマクロファージ活性化シグナル経路を表す模式図である。コリアンダー水溶性抽出物がＮＦ−κＢ経路に及ぼす影響を表す図及びグラフである。コリアンダー水溶性抽出物がＭＡＰキナーゼ経路に及ぼす影響を表す図及びグラフである。ＴＬＲ４阻害剤がコリアンダー水溶性抽出物の活性発現に及ぼす影響を表すグラフである。エンドトキシン阻害剤がコリアンダー水溶性抽出物の活性発現に及ぼす影響を表すグラフである。コリアンダー水溶性抽出物のマウス経口投与実験のスケジューリングを示す模式図である。マウス経口投与実験における各実験群のマウスの体重変化を示すグラフである。マウス経口投与実験における各実験群のマウスのＩＬ−６産生量を示すグラフである。

［１］マクロファージ活性化剤
本発明のマクロファージ活性化剤は、コリアンダーの抽出物を有効成分として含む。

本発明のマクロファージ活性化剤の有効成分の抽出に用いる、コリアンダーの使用部位は、特に限定されるものではなく、植物全体、根、茎、葉、花、果実、又は種子、あるいは、それらの少なくとも２種以上の混合物を挙げることができるが、好ましくは、種子を用いる。種子を用いる場合は、その他の部分が含まれてもよい。コリアンダーは、抽出操作を行う際に、生のまま用いてもよいが、乾燥させたものの方が、抽出効率がよいので好ましく使用できる。また、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工してもよい。

（抽出物）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるコリアンダーの抽出物を抽出するための抽出溶媒は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、例えば、有機溶媒、水性溶媒、又は有機溶媒及び水性溶媒の混合物を使用することができる。

（有機溶媒）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるコリアンダーの抽出物は、有機溶媒、例えば、アルコール、アセトン、ベンゼン、エステル、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルム、及びジエチルエーテルなどにより抽出されることができるが、好ましくはアルコールにより抽出されることができる。アルコールとしては、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、及びブチルアルコール等の炭素数１〜５の一価アルコールを使用することができる。１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びグリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールを使用することもできる。好ましいアルコールは、炭素数１〜５の一価アルコールであり、より好ましいアルコールは、メタノール及びエタノールであり、最も好ましいアルコールは、エタノールである。

（水性溶媒）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるコリアンダーの抽出物は、水性溶媒により抽出されることができる。水性溶媒としては、水を含んでいる限りにおいて限定されるものではなく、例えば水、生理食塩水、又は緩衝液などを使用することができる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及びトリス緩衝液などが挙げられる。好ましい水性溶媒は、リン酸ナトリウム緩衝液である。前記水性溶媒のｐＨは、特に制限されず、例えば、３〜１０、好ましくは、５〜８、より好ましくは、７〜８である。

（有機溶媒と水性溶媒との混合物）
本発明のマクロファージ活性化剤に含まれるコリアンダーの抽出物は、有機溶媒と水性溶媒との混合物により抽出されることができる。抽出溶媒中に含まれる水性溶媒の量は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることができる限りにおいては限定されないが、抽出溶媒の全体量に対して、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５．０％以下、４．０％以下、３．０％以下、２．０％以下、若しくは１．０％以下であることができ、又は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上であることができる。

本発明のマクロファージ活性化剤に含まれる有効成分は、水性溶媒であるリン酸ナトリウム緩衝液又は有機溶媒であるエタノールにより抽出することができる。すなわち、前記有効成分は、様々な溶媒で抽出可能であると考えられ、リン酸ナトリウム緩衝液以外の水性溶媒又はエタノール以外の有機溶媒によっても抽出可能である。

抽出温度は、抽出液中に有効成分が充分に抽出されることのできる温度である限り、特に限定されるものではないが、−５０℃〜１００℃であることが好ましく、−２５℃〜５０℃であることがより好ましく、−２５℃〜２５℃であることがさらに好ましく、−１０℃〜１０℃であることがさらに好ましく、０℃〜１０℃であることが最も好ましい。

また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、コリアンダーの部位（すなわち、根、茎、葉、花、果実、又は種子のいずれかの部分）、コリアンダーの状態（生、又は乾燥物であるか、更には破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、抽出液の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１分〜７２時間であり、１時間〜４８時間であることが好ましく、１２時間〜３６時間であることが最も好ましい。

本発明における有効成分である、コリアンダーの抽出物は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、結核及びインフルエンザなどの各種感染症、並びに肺癌及び胃がんなどの癌の治療又は予防が必要な対象［動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に有効量で投与することができる。また、ヒト以外の動物には、飼料として飲食物の形で与えることも可能である。

本発明のマクロファージ活性化剤の投与剤型としては、特には限定がなく、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は非経口剤を挙げることができる。

前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、若しくは合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。

非経口剤としては、例えば、注射剤を挙げることができる。注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。

本発明のマクロファージ活性化剤は、これに限定されるものではないが、コリアンダーの抽出物を、タンパク質濃度として、例えば、０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．０５〜５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．３〜２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは０．６〜３ｍｇ／ｍＬ含むことができる。

本発明のマクロファージ活性化剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができるが、例えば、０．０１〜１００ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日、好ましくは、０．０５〜５０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．１〜３０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは０．３〜２０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日、さらに好ましくは０．５〜１０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日、最も好ましくは０．６〜３ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日であることができる。

（マクロファージ活性化）
本発明のマクロファージ活性化剤が奏する具体的なマクロファージ活性化の作用としては、例えば、サイトカイン分泌促進、貪食活性促進、活性酸素（例えば、一酸化窒素）産生促進、及び／又は抗原提示作用の増強が挙げられる。

分泌が促進されるサイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、造血因子、細胞増殖因子、及び細胞傷害因子などが挙げられる。インターロイキンとしては、ＩＬ１、６、１０、１２、１５、及び１８などが挙げられる。インターフェロンとしては、ＩＦＮ−αなどが挙げられる。ケモカインとしては、ＭＩＰ及びＣＣＬなどが挙げられる。造血因子としては、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。細胞増殖因子としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などが挙げられる。細胞傷害因子としては、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βなどが挙げられる。分泌が促進されるサイトカインは、好ましくは、ＩＬ−６及び／又はＴＮＦ−αである。分泌が促進されるサイトカインは、これらの１種であってもよく、又は２種以上であってもよい。

マクロファージの貪食作用とは、マクロファージが、細菌、ウイルス、又は死細胞等の異物を取り込み、これらを分解する機能であり、食作用又はファゴサイトーシスとも呼ばれる。本発明のマクロファージ活性化剤は、このマクロファージの貪食作用を促進することができる。

［２］マクロファージ活性化用食品組成物
本発明のマクロファージ活性化用食品組成物は、コリアンダーの抽出物を有効成分として含む。具体的には、コリアンダーの抽出物を含む飲料、又はコリアンダーの抽出物を適当な手段（例えば、凍結乾燥）で水分を除去した乾燥体として含む、飲料又は食品を挙げることができる。

飲料としては、お茶、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料、又はヨーグルトなどを挙げることができる。また、食品としては、クッキー、パン、ビスケット、乾パン、ケーキ、煎餅、羊羹、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、チューインガム、クラッカー、チップス、若しくは飴等の菓子類、うどん若しくはそば等の麺類、かまぼこ、ハム、若しくは魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品、チーズ若しくはバターなどの乳製品、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ若しくは甘味料等の調味類、豆腐、又はこんにゃくなどを挙げることができる。

食品組成物には、機能性食品や健康食品（飲料）が含まれる。本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、前記の種々の生体調節機能（すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《製造例１：コリアンダー水溶性抽出物の調製》
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰＢ；ｐＨ７．４）を溶媒として水溶性成分を抽出した。０．１ｇ／ｍＬとなるように、コリアンダー種子粉末を１０ｍＭＮａＰＢに懸濁し、４℃で２０時間、ローテーターで懸濁抽出した。抽出後、遠心（７０，０００ｒｐｍで２０分間）した。上清を回収し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．４に調整した後、ＮａＰＢを再度添加して、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌を行ったものを粗抽出サンプルとして実験に使用した。

《実施例１：コリアンダー水溶性抽出物による細胞株におけるサイトカイン産生促進効果の検討》
本実施例では、コリアンダー水溶性抽出物が、マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞及びマウス腹腔から回収した初代マクロファージ（Ｐ−Ｍａｃ）において、インターロイキン（ＩＬ）−６及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α産生に及ぼす効果を評価した。１０％ウシ胎児血清−ＤＭＥＭ培地に製造例１で調製したコリアンダー水溶性抽出物を、０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、及び２０００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ＲＡＷ２６４．７細胞又はＰ−Ｍａｃを細胞密度１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように接種した。６時間培養後、培養上清中のＩＬ−６及びＴＮＦ−α濃度を、ＥＬＩＳＡキット（ＭｏｕｓｅＩＬ−６ＥＬＩＳＡＭＡＸＳｔａｎｄａｒｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製；ＭｏｕｓｅＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡＲｅａｄｙ−ｓｅｔ−ｇｏ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。

その結果、ＲＡＷ２６４．７細胞において、コントロールである０μｇ／ｍＬではＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生量は、それぞれ、３０．５±１０．４ｐｇ／ｍＬ及び２０．５±１．３ｐｇ／ｍＬとなったが、図１に示したように、コリアンダー水溶性抽出物は、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生を濃度依存的に促進することが明らかになった。また、Ｐ−Ｍａｃにおいて、コントロールである０μｇ／ｍＬではＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生量は、それぞれ、１．３５±０．９１ｐｇ／ｍＬ及び５．０±０．５ｐｇ／ｍＬとなったが、コリアンダー水溶性抽出物は、培養細胞に対する効果と同様、Ｐ−Ｍａｃに対しても強力な産生促進効果を示すことが明らかになった（図２）。このことは、コリアンダー水溶性抽出物の効果が、特定の細胞株に対する特殊事例ではなく、マクロファージに広く作用することを示しており、効果の汎用性が示された。

（ＲＮＡの抽出）
コリアンダー水溶性抽出物が、マクロファージのサイトカイン産生を顕著に促進することから、その作用メカニズムを明らかにするため、サイトカインの遺伝子発現に及ぼす影響をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて検討した。
コリアンダー水溶性抽出物あるいは１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を添加した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で３時間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を回収し、１ｍＬのＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡＩＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク社製）を加えて５分間室温静置し、その後、２００μＬのクロロホルム（和光純薬社製）を加えて、撹拌した。７０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心した後、上層を回収した。回収した上層に２−プロパノール（和光純薬社製）を５００μＬ添加し、１０分間室温静置した。７０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、上層を除去し、７５％エタノールを１ｍＬ加え、転倒混和した。７０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、上層を除去し、風乾した。ＤＥＰＣ水を適量添加し、氷上で１５分以上静置することで、ＲＮＡの沈殿を完全に溶解させた。

（ｃＤＮＡ合成）
ＰＣＲ用チューブに１μｇのＲＮＡと１０μＭのオリゴｄＴを加え、サーマルサイクラー５分間７０℃処理した後、氷冷した。そこに、逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｄＮＴＰミックス（東洋紡社製）を加え、４２℃で６０分間インキュベートした。

（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ（東洋紡社製）、センスプライマー、アンチセンスプライマー及びｃＤＮＡを加え、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にて、９５℃ １分−（９５℃ ３秒、６０℃ ３０秒）×４０サイクルの条件で反応させ、遺伝子発現レベルを解析した。内部標準として、βアクチン遺伝子を用いた。
ＩＬ−６センスプライマー：ＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＡＴ（配列番号１）
ＩＬ−６アンチセンスプライマー：ＴＴＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＧＣ（配列番号２）
ＴＮＦ−αセンスプライマー：ＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣＡＡ（配列番号３）
ＴＮＦ−αアンチセンスプライマー：ＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＣＴＴＴＣ（配列番号４）
βアクチンセンスプライマー：ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣ（配列番号５）
βアクチンアンチセンスプライマー：ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号６）
その結果、コリアンダー水溶性抽出物は、図３に示したように、ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−６及びＴＮＦ−αの遺伝子発現を濃度依存的に促進することが明らかになった。

《製造例２：コリアンダーアルコール抽出物の調製》
コリアンダーの種子又は葉の粉末に１０倍量の１００％エタノールを加え、ボルテックスで十分に撹拌し、４℃で２４時間震盪抽出後、直ちに３，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清を回収しエバポレーターで濃縮乾固させ重量を測定した。濃度を１ｍｇ／ｍＬとなるようにエタノールを加えて溶解し、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌を行ったものを粗抽出サンプルとして実験に使用した。

《実施例２：コリアンダーアルコール抽出物による細胞株におけるサイトカイン産生促進効果の検討》
本実施例では、コリアンダーアルコール抽出物が、ＲＡＷ２６４．７細胞において、インターロイキン（ＩＬ）−６産生に及ぼす効果を評価した。１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に製造例２で調製したコリアンダーアルコール抽出物を種々の濃度で添加し、ＲＡＷ２６４．７細胞を細胞密度１．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように接種した。１２時間培養後、培養上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡキット（ＭｏｕｓｅＩＬ−６ＥＬＩＳＡＭＡＸＳｔａｎｄａｒｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて測定した。
その結果、図４に示したように、種子及び葉の各々のコリアンダーアルコール抽出物は、ＩＬ−６の産生を促進することが明らかになった。

《実施例３：コリアンダー水溶性抽出物による細胞株における貪食活性促進効果の検討》
本実施例では、コリアンダー水溶性抽出物が、ＲＡＷ２６４．７細胞において貪食活性に及ぼす効果を、ＴｅｘａｓＲｅｄで標識したザイモサンＡ（商品名：ＺｙｍｏｓａｎＡＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ，ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて評価した。蛍光強度は、フローサイトメーターにより測定した。製造例１で調製したコリアンダー水溶性抽出物をＲＡＷ２６４．７細胞に様々な濃度で２４時間作用させた。上清除去後、３７℃に温めたＰＢＳで細胞を洗浄した。暗室にてザイモサンＡ存在下で１時間培養した。培養上清除去後、氷冷ＰＢＳで細胞を遠心（１０００ｒｐｍ、５分、４℃）により回収した。再度、氷冷ＰＢＳで洗浄後、１ｍＬの２％ＦＢＳ−ＰＢＳに懸濁し、ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により分析を行った。解析はＷｉｎｄｏｗｓＭｕｌｔｉｐｌｅＤｏｃｕｍｅｎｔＩｎｔｅｒｆａｃｅｆｏｒＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙｖｅｒｓｉｏｎ２．９で行った。
テキサスレッドで蛍光標識したザイモサンＡの取込をフローサイトメーターで計測することで、貪食活性を評価した結果、コリアンダー水溶性抽出物は、ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食活性を促進することが明らかになった（図５）。

《実施例４：コリアンダー水溶性抽出物による細胞株における一酸化窒素（ＮＯ）産生促進効果の検討》
ＮＯは活性酸素の一種であり、体内に侵入した微生物の殺傷のためにマクロファージによって産生される。本実施例では、ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生に及ぼすコリアンダー水溶性抽出物の効果を検討するために、コリアンダー水溶性抽出物を０μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬ、及び２０００μｇ／ｍＬの濃度で添加してＮＯ産生量を測定した。その結果、コントロールである０μｇ／ｍＬにおいては、ＮＯの産生量は、０．１７±０．１５μＭとなったが、図６に示したように、コリアンダー水溶性抽出物は、濃度依存的にＮＯ産生を促進することが明らかになった。その作用メカニズムを明らかにするため、ＮＯ産生に関与する誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の遺伝子発現に及ぼす効果をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて検討した。

（ｃＤＮＡ合成）
ＰＣＲ用チューブに１μｇのＲＮＡと１０μＭのオリゴｄＴを加え、サーマルサイクラーで５分間７０℃処理した後、氷冷した。そこに、逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｄＮＴＰミックス（東洋紡社製）を加え、４２℃で６０分間インキュベートした。

（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
ＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄＳＹＢＲｑＰＣＲＭｉｘ（東洋紡社製）、センスプライマー、アンチセンスプライマー及びｃＤＮＡを加え、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にて、９５℃ １分−（９５℃ ３秒、６０℃ ３０秒）×４０サイクルの条件で反応させ、遺伝子発現レベルを解析した。内部標準として、実施例１と同様にβアクチン遺伝子を用いた。
ｉＮＯＳセンスプライマー：ＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣ（配列番号７）
ｉＮＯＳアンチセンスプライマー：ＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＧＧ（配列番号８）
その結果、コリアンダー水溶性抽出物はｉＮＯＳ遺伝子発現を促進しており（図７）、コリアンダー水溶性抽出物は、一酸化窒素合成酵素の発現を活性化することで、ＮＯ産生を促進したと考えられる。

《実施例５：コリアンダー水溶性抽出物によるマクロファージ活性化作用メカニズムの検討》
コリアンダー水溶性抽出物は、遺伝子発現を活性化することで、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＮＯ産生を促進していることが明らかになった。マクロファージ表面上には、活性化に関与するいくつかの受容体が存在する。その一つにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４がある。ＴＬＲ４はリポ多糖（ＬＰＳ）の受容体であり、その下流に転写活性の促進に関与するシグナル伝達系、すなわち、ＮＦ−κＢ経路及びＭＡＰキナーゼ経路がある（図８）。そこで、コリアンダー水溶性抽出物のＮＦ−κＢ経路及びＭＡＰキナーゼ経路の活性化に及ぼす影響について解析した。なお、ポジティブコントロールとしてＴＬＲ４のリガンドであるＬＰＳを用いた。

（１）コリアンダー水溶性抽出物がＮＦ−κＢ経路活性化に及ぼす影響
細胞質内においてはＮＦ−κＢはＩκＢと結合しており、不活性化状態にある。ＴＬＲ４が活性化されるとシグナルが伝達され、ＩκＢがリン酸化を受けることで分解が誘導され、ＮＦ−κＢは遊離状態となる。遊離状態のＮＦ−κＢは核内に移行し、転写因子として作用する。そこで、コリアンダー水溶性抽出物の作用により、ＲＡＷ２６４．７細胞内のＮＦ−κＢの核移行がどの様な影響を受けるかを抗マウスＮＦ−κＢ抗体及び抗マウスＨｉｓｔｏｎＨ３抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用してウエスタンブロット法により解析した。
その結果、図９に示したように、コリアンダー水溶性抽出物の作用により、細胞質ＮＦ−κＢ量が減少し、核内ＮＦ−κＢ量が増加することが明らかになった。このことから、コリアンダー水溶性抽出物は、ＮＦ−κＢの核移行を促進することにより、転写活性を上昇させ、サイトカイン産生及びＮＯ産生を促進していることが明らかになった。

（２）コリアンダー水溶性抽出物がＭＡＰキナーゼ経路活性化に及ぼす影響
次に、ＭＡＰキナーゼ経路に及ぼすコリアンダー水溶性抽出物の効果を検討した。ＭＡＰキナーゼファミリーである、ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８のリン酸化による活性化に及ぼす影響を、抗マウスＥＲＫ抗体、抗マウスリン酸化ＥＲＫ抗体、抗マウスＪＮＫ抗体、抗マウスリン酸化ＪＮＫ抗体、抗マウスｐ３８抗体、抗マウスリン酸化ｐ３８抗体、及び抗マウスＡｃｔｉｎ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用してウエスタンブロット法により検討した。
その結果、コリアンダー水溶性抽出物の作用により、ＲＡＷ２６４．７細胞のＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８のリン酸化による活性化が顕著に促進され、ＭＡＰキナーゼ経路が活性化されることが明らかになった（図１０）。

（３）コリアンダー水溶性抽出物がＴＬＲ４に及ぼす影響
以上の結果から、コリアンダー水溶性抽出物は、ＮＦ−κＢの核移行及びＭＡＰキナーゼを活性化することにより転写活性を促進し、サイトカイン産生を活性化していることが確認された。これら活性化経路は、ＴＬＲ４受容体の下流に存在するシグナル経路であることから、コリアンダー水溶性抽出物がＴＬＲ４を刺激することで細胞内シグナル伝達系を活性化しているのかどうかについて検討した。ＲＡＷ２６４．７細胞をＴＬＲ４の選択的阻害剤であるＴＡＫ−２４２（フナコシ社製）で処理した後にコリアンダー水溶性抽出物の効果を検討した。
その結果、ＴＬＲ４のリガンドであるＬＰＳ及びコリアンダー水溶性抽出物の効果は、ＴＬＲ４阻害剤処理により抑制され、ＩＬ−６及びＴＮＦ−α産生に対する促進効果は有意に低下した（図１１）。このことから、コリアンダー水溶性抽出物は、ＴＬＲ４を刺激することで、ＮＦ−κＢ経路とＭＡＰキナーゼ経路を活性化することが明らかになった。

（４）混入エンドトキシンがマクロファージ活性化に与える影響
コリアンダー水溶性抽出がＴＬＲ４を刺激してマクロファージを活性化したことから、コリアンダー水溶性抽出物のマクロファージ促進効果が、抽出物に混入するエンドトキシンの影響である可能性が懸念される。そこで、エンドトキシン阻害剤でサンプルを処理した後に活性評価した。エンドトキシン阻害剤としてＰｏｌｙｍｙｘｉｎＢ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。コリアンダー水溶性抽出物に５０μｇ／ｍＬとなるようＰｏｌｙｍｙｘｉｎＢを添加し、１０分間室温で反応させた後に活性評価した。
その結果、図１２に示したように、ポジティブコントロールとして用いたＬＰＳのＩＬ−６及びＴＮＦ−α産促進効果は、ＰｏｌｙｍｙｘｉｎＢ処理により顕著に抑制された。一方、コリアンダー水溶性抽出物の促進効果は、ＰｏｌｙｍｙｘｉｎＢ処理の影響を全く受けなかった。このことから、コリアンダー水溶性抽出物のマクロファージ活性化効果は、混入するエンドトキシンの影響ではなく、コリアンダー成分による効果であることが示唆された。

《実施例６：マウスにおけるコリアンダー水溶性抽出物によるサイトカイン産生促進効果の検討》
（１）サンプル調製
コリアンダー（ＣｏｒｉａｎｄｒｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．）種子粉末を１０ｍＭＮａＰＢに０．１ｇ／ｍＬとなるよう調整し、２４時間４℃の条件下で懸濁した。２４時間後、２８，０００×ｇ、４℃、２０分の条件で遠心した。遠心後、上部の白濁層をアスピレーターで除去し、上清を回収した。再度２８，０００×ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上部の白濁層をアスピレート除去して上清を回収した。回収した上清を分子量１４ｋＤａカットの透析膜を用いて１０ｍＭＮａＰＢに対して一晩透析した。透析後のコリアンダー種子水溶性抽出物を０．２２μｍフィルターでフィルター滅菌し、ＮａＰＢを再度添加して、タンパク質濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるように調整したものを、コリアンダー種子水溶性抽出物（ＣＡＥ）として用いた。

（２）マウスへの経口投与
（１）で調製したＣＡＥを、図１３に示されている投与スケジュールに従い、マウスに投与した。１週間の馴化後、体重を基にマウスを１群５匹の３群に群分けした（Ｃｏｎｔｒｏｌ＝５、Ｈｉｇｈｄｏｓｅ＝５、Ｌｏｗｄｏｓｅ＝５）。翌日から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群には１０ｍＭＮａＰＢを１日１回２０μＬずつ１週間経口投与し、Ｈｉｇｈｄｏｓｅ群にはＣＡＥの原液を１日１回、３ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日で１週間経口投与し、Ｌｏｗｄｏｓｅ群には１／５に希釈したＣＡＥを１日１回、０．６ｍｇタンパク質／ｋｇ体重／日で１週間経口投与した。

（３）腹腔内マクロファージの回収
Ｄａｙ４に、マウスの腹腔内に３％チオグリコレート培地をマウス１匹あたり２ｍＬずつ２６Ｇニードルと５ｍＬシリンジを用いて投与した。Ｄａｙ７の最終投与の１時間後、マウスをジエチルエーテルで麻酔死させ、氷冷ＰＢＳを腹腔内に２６Ｇニードルと５ｍＬシリンジを用いて注入した。１分間腹腔を揉み込み、２２Ｇニードルと１ｍＬシリンジを用いて腹腔内の細胞を回収した。回収した細胞を７５０×ｇ、４℃、５分の条件で遠心した。上清の除去後、細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、再度７５０×ｇ、４℃、５分の条件で遠心した。上清の除去後、細胞を５ｍＬの１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁し、６ｃｍディッシュに撒いてインキュベートした。１時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、マクロファージ以外の細胞を除去した。（この方法で得られた接着細胞の９０％以上が腹腔内マクロファージとされている。）

（４）細胞培養
接着細胞を氷冷ＰＢＳで剥がし、遠心管に回収した。１２００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心した後、上清を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞を再懸濁して洗浄した。再度１２００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心した後、上清を除去し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞数を１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう調製した。４８ウェル培養プレートに２０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、その後、調製した細胞懸濁液を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した（培地の終濃度：１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地、最終細胞数：２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。２４ウェル培養プレートに２０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地を５００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、その後、調製した細胞懸濁液を５００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ−１６４０培地、最終細胞数：５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）。各プレートを２４時間培養した後、培養上清中のＩＬ−６産生量をＥＬＩＳＡキット（ＭｏｕｓｅＩＬ−６ＥＬＩＳＡＭＡＸＳｔａｎｄａｒｄ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて測定した。

（５）統計処理
有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いた。＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１は統計学的に有意であると考えられる。

（６）結果
各マウス群の体重測定の結果を図１４に示す。体重測定は、ＮａＰＢ又はＣＡＥの投与前に行った。Ｄａｙ５で体重の減少が見られるのは、Ｄａｙ４にチオグリコレート培地を腹腔内に注入したためと考えられる。３群の間で体重の減少に有意差は認められなかったことから、サンプル投与による体重への影響はないと考えられる。

各マウス群におけるＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−６量の測定結果を図１５に示す。その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比べて、Ｈｉｇｈｄｏｓｅ群及びＬｏｗｄｏｓｅ群の両方において、上清中ＩＬ−６量の有意な増加（ｐ＜０．０５）が認められた。したがって、ＣＡＥの経口投与により、腹腔内マクロファージのＩＬ−６産生能が活性化されることが示唆された。

本発明のマクロファージ活性化剤は、マクロファージを活性化することができる。さらに、本発明のマクロファージ活性化剤は、マクロファージ活性化作用を有し、かつ安全性の高い飲食品を提供することができる。

Claims

コリアンダーの葉又は種子の、−５０℃〜１００℃のアルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化剤。
前記抽出物が、エタノール、水性溶媒、又はエタノールと水性溶媒との混合物による抽出物である、請求項１に記載のマクロファージ活性化剤。
コリアンダーの葉又は種子の−５０℃〜１００℃のアルコール、水性溶媒、又はアルコールと水性溶媒との混合物による抽出物を有効成分として含むことを特徴とするマクロファージ活性化用食品組成物。
前記抽出物が、エタノール、水性溶媒、又はエタノールと水性溶媒との混合物による抽出物である、請求項３に記載のマクロファージ活性化用食品組成物。