WO2017221591A1 - 細胞処理システム及び細胞供給方法 - Google Patents

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WO2017221591A1
WO2017221591A1 PCT/JP2017/018406 JP2017018406W WO2017221591A1 WO 2017221591 A1 WO2017221591 A1 WO 2017221591A1 JP 2017018406 W JP2017018406 W JP 2017018406W WO 2017221591 A1 WO2017221591 A1 WO 2017221591A1
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WO
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cell
culture
cells
container
chlamydomonas
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PCT/JP2017/018406
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卓朗 伊藤
友 星野
Original Assignee
学校法人 慶應義塾
国立大学法人九州大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell processing system and a cell supply method.
  • the microalgae to be analyzed are cultured, and the cultured microalgae are analyzed to extract, for example, an individual in which a desired character is expressed.
  • a large amount of microalgae can be continuously analyzed at high speed using an analyzer such as a flow cytometer.
  • the apparatus for culturing microalgae includes, for example, a culture tank that accommodates a medium together with microalgae, lighting for causing the microalgae to perform photosynthesis, and the like. In such a culture apparatus, microalgae grow by repeating cell division.
  • the state of microalgae changes according to the progress of the cell cycle, the state of the cells varies greatly depending on the stage of the cell cycle.
  • the cell cycle of individual cells of microalgae is synchronized with the light-dark cycle, and so-called synchronized culture in which stages in the cell cycle of individual cells are aligned can be achieved.
  • the light-dark cycle is 24 hours, microalgae divide and grow once a day.
  • the cell cycle of individual cells of microalgae is repeated and proliferated by repeating cell division.
  • a culture apparatus using a liquid surface floating culture method in which culture vessels for microalgae are arranged in multiple stages and the culture efficiency per installation area is increased is known (see Patent Document 1).
  • the stages of the growth process such as the induction period, the logarithmic growth period, the oil accumulation period, and the growth stop period are shifted between the culture tanks.
  • cells such as microalgae change the state of the cells according to the progress of the cell cycle, so it is possible to analyze the specific state of the cell and whether the cell expresses a specific function. For example, it is necessary to supply cells in a specific phase or timing of the cell cycle to the analyzer, and the timing at which the cells can be supplied is limited.
  • the state of the cells changes with the passage of time since the stimulus, so analyze the cells in a state where a predetermined time has passed. It is necessary to supply to the apparatus, and the timing that can be supplied is also limited. For this reason, it is desired to provide cells in a desired state in a timely manner.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a cell treatment system and a cell supply method capable of providing cells in a target state in a timely manner.
  • the cell processing system of the present invention includes a plurality of containers that contain cells, a stimulation unit that provides stimulation to the cells in each container, and a control unit that shifts the timing of stimulation given by the stimulation unit between the containers. are provided.
  • the present invention provides a cell supply method for supplying cells from a cell processing apparatus to an analyzer, a preparation step of preparing a plurality of containers containing cells in the cell processing apparatus, and the cells in each container, Select a container that contains the cells that can be considered in the analysis, and the stimulation step that gives stimulation at different timings between each container, and the specific state that the analyzer analyzes, and acquires the cells from the selected container And a supplying step of supplying the analyzer to the analyzer.
  • the timing of stimulation given to the cells between the containers is shifted with respect to the cells contained in the plurality of containers, the specific phase and timing of the cell cycle, the timing from the stimulation Since cells that have shifted in time are prepared, cells in the target state can be provided in a timely manner.
  • the cell processing system 10 of 1st Embodiment is equipped with the culture apparatus 11 and the cell supply apparatus 12, and culture
  • the supply device 12 is configured to supply the analysis device 13 as a supply destination.
  • the culture apparatus 11 performs synchronized culture in each of the plurality of culture units 15 and shifts the phase of the synchronized culture in each culture unit 15 to maximize the cell volume as a target state (specific state).
  • the timing Chlamydomonas can be supplied continuously.
  • the cell processing system 10 and the analysis device 13 constitute a cell analysis system, and the cell processing system 10 is a cell processing device in the cell analysis system.
  • the culture apparatus 11 includes a plurality of culture units 15, a control unit 16, a CO 2 supply unit 17, and a medium supplement unit 18.
  • the control unit 16 controls the culture apparatus 11 in an integrated manner.
  • the culture device 11 is provided with a cell density adjusting device 19.
  • Each culture unit 15 includes a culture tank 21, a constant temperature water tank 22, and an illumination panel 23, respectively.
  • the culture tank 21 as a container accommodates Chlamydomonas together with a culture medium (culture solution) in the tank.
  • the thermostatic water tank 22 is configured such that water adjusted by the thermostatic device 25 circulates in the tank, and thereby maintains the medium in the culture tank 21 at a constant temperature suitable for culturing Chlamydomonas.
  • the CO 2 supply unit 17 supplies air in which carbon dioxide is adjusted to a predetermined concentration into the culture medium in each culture tank 21 through the air supply pipe 26. Thereby, carbon dioxide required for photosynthesis of Chlamydomonas is dissolved in each medium.
  • the temperature of the medium in which Chlamydomonas is cultured is maintained constant, but the medium may be adjusted to a temperature suitable for the culture according to the cells to be cultured, and the temperature of the medium is not constant. Also good.
  • the medium replenishing unit 18 replenishes the culture tank 21 with a new medium.
  • the medium replenishing unit 18 discharges the medium in the culture tank 21 together with Chlamydomonas when the medium in the culture tank 21 is taken out together with Chlamydomonas by the cell supply device 12 as described later. Are activated respectively. Thereby, the culture medium in the culture tank 21 is maintained at a constant amount.
  • the medium replenishing unit 18 supplies the medium through the air supply pipe 26.
  • the culture tank 21 and the constant temperature water tank 22 of each culture unit 15 are containers with transparent walls so that illumination light necessary for photosynthesis is irradiated from the illumination panel 23 to Chlamydomonas in the culture tank 21. ing.
  • the illumination panel 23 is attached to each of the front surface and the back surface of the constant temperature water tank 22.
  • the illumination panel 23 has, for example, a configuration in which a plurality of light emitting diodes 23 a are provided on one surface, and the light emitting diodes 23 a are arranged in a posture toward the constant temperature water tank 22.
  • the culture tank 21 has a thin rectangular parallelepiped shape, and is disposed in the constant temperature water tank 22 so that a pair of lighting panels 23 are arranged in the thickness direction. Thereby, the illumination light from the illumination panel 23 reaches the center of the culture tank 21.
  • Each illumination panel 23 is driven by a drive unit 27 (see FIG. 1) for each culture unit 15.
  • the lighting panel 23 is turned on and off by the control unit 16 for each culture unit 15. Thereby, for each culture unit 15, the lighting period when the illumination panel 23 is turned on to illuminate the Chlamydomonas and the dark period when the illumination panel 23 is extinguished and the illumination light is not radiated to the Chlamydomonas are alternately switched. By this switching, synchronized culture in which the cell cycle of each Chlamydomonas synchronizes with the light-dark cycle is performed for each culture unit 15.
  • a light-dark cycle consists of one continuous light cycle and dark phase, and one cycle of the light-dark cycle corresponds to one cycle of the Chlamydomonas cell cycle under synchronized culture.
  • the light period is set to 14 hours and the dark period is set to 10 hours.
  • these times, that is, the light-dark cycle can be arbitrarily set within the range in which Chlamydomonas is synchronized with the light-dark cycle. I can decide.
  • the control unit 16 will be described in detail later.
  • the phase of the light / dark cycle is shifted between the culture units 15.
  • the lighting panel 23 is a stimulating unit, and the lighting panel 23 gives Chlamydomonas as light and darkness, which is one of environmental factors, as a stimulus.
  • a light shielding plate 28 is disposed on each side of each constant temperature water tank 22. These light shielding plates 28 prevent illumination light from the illumination panel 23 of one culture unit 15 from entering the culture tank 21 of another culture unit 15. Each culture unit 15 is arranged in a dark place, for example, and prevents light other than illumination light from the corresponding illumination panel 23 from entering. In addition, it is also preferable to extend the light shielding plate 28 upward so that illumination light from other culture units 14 does not enter from above.
  • the cell density adjusting device 19 includes a sensor 31, a discharge pipe 32, a discharge valve 33, a discharge pump 34, a density control unit 35, and the like.
  • a sensor 31, a discharge pipe 32, and a discharge valve 33 are provided in each culture tank 21.
  • the sensor 31 measures the turbidity of the medium in the culture tank 21 and outputs a signal corresponding to the turbidity.
  • the density control unit 35 opens the discharge valve 33 corresponding to the culture tank 21 when the turbidity of the culture medium in any one of the culture tanks 21 exceeds a specified value, After the other discharge valve 33 is closed, the discharge pump 34 is operated, and a part of Chlamydomonas and the medium in the culture tank 21 are taken out through the discharge pipe 32 and discharged.
  • the medium replenishing unit 18 described above also functions as a part of the cell density adjusting device 19 and replenishes the culture tank 21 from which the Chlamydomonas and medium solution has been discharged by the discharge pump 34 to thereby increase the Chlamydomonas density. (The volume or number of Chlamydomonas occupying per unit volume of medium) is lowered. Thereby, the density of Chlamydomonas in each culture tank 21 is suppressed, and Chlamydomonas is prevented from being a shadow of the illumination light with respect to other Chlamydomonas so that the illumination light is uniformly irradiated to Chlamydomonas. ing.
  • the turbidity of the medium is measured as a parameter related to the density of Chlamydomonas in the culture tank 21 to adjust the density of Chlamydomonas.
  • the dissolved oxygen content of the medium is a parameter related to the density of Chlamydomonas.
  • a sensor that measures the amount of dissolved carbon dioxide or the dielectric constant of the medium may be used, and the density of Chlamydomonas in the medium may be adjusted based on the measurement result.
  • the number of Chlamydomonas remaining in the culture tank 21 after being taken out by the supply device 12 may be adjusted.
  • the cell supply device 12 includes an extraction pipe 41 and a supply valve 42 provided for each culture tank 21, a supply pump 43, and a supply control unit 44.
  • the supply control unit 44 cooperates with the control unit 16 of the culture apparatus 11 to select the supply valve 42 sequentially and exclusively in synchronization with the light / dark cycle, opens only the selected one supply valve 42, and turns on the supply pump 43. For example, each time the supply valve 42 is newly opened, it operates for a certain period of time. In this way, the cell supply device 12 sequentially selects the culture tank 21 from which Chlamydomonas is extracted by opening the supply valve 42 in synchronization with the light / dark cycle, and the selected culture tank 21 is connected via the extraction tube 41.
  • the Chlamydomonas is taken out together with the medium and sent to the analyzer 13.
  • the culture tank 21 immediately after the light period ends is selected after about 14 hours have passed since the light period.
  • the operation time of the supply pump 43 is adjusted so that a part of Chlamydomonas remains in the culture tank 21 when Chlamydomonas is taken out from the culture tank 21.
  • Chlamydomonas remaining in the culture tank 21 is used for growing Chlamydomonas. That is, Chlamydomonas is disrupted in the dark period after removal.
  • the number of Chlamydomonas remaining in the culture tank 21 is adjusted to be the same as or higher than that before supply at the next light period.
  • the amount of the medium remaining in the culture tank 21 may be adjusted by adjusting the vertical position of the end of the take-out pipe 41 arranged in the culture tank 21 to adjust the number of remaining Chlamydomonas.
  • the time for the cell supply device 12 to take out Chlamydomonas together with the culture medium from the single culture tank 21 and the time for supplying it to the analysis device 13 do not necessarily have to coincide with each other.
  • Chlamydomonas and the medium taken out from the culture tank 21 are once stored in a buffer and Chlamydomonas is gradually supplied from the buffer to the analyzer 13, it is taken out from the culture tank 21 rather than the supply time to the analyzer 13. Time can be shortened.
  • the cell volume increases or decreases in accordance with the light / dark cycle in a state of being cultured in synchronization with the light / dark cycle. This is because, as is well known, the cell volume increases during the light period, and when entering the dark period, cell division occurs and the cell volume rapidly decreases.
  • n is the total number of the culture units 15 and is referred to as a first culture unit 15, a second culture unit 15,..., An nth culture unit 15. .
  • the culture tank 21, the lighting panel 23, and the supply valve 42 are also given the ordinal numbers (first, second,.
  • the control unit 16 drives the illumination panel 23 by setting the same light / dark cycle for each culture unit 15.
  • the light period is 14 hours
  • the dark period is 10 hours
  • the light-dark period is 24 hours.
  • the supply control unit 44 supplies the corresponding supply valve 42 for each culture tank 21 for a certain time immediately before the end of the light period as described above. open.
  • each culture unit 15 alternates between the light period and the dark period so that the first culture unit 15 again enters the light period after the delay period Td from the light period of the n-th culture unit 15.
  • the corresponding supply valve 42 is controlled to open only for a certain time immediately before the end of the light period. Accordingly, Chlamydomonas is continuously supplied to the analyzer 13 while sequentially switching the culture tank 21 with the delay time Td, and Chlamydomonas at a timing at which the cell volume becomes maximum is supplied to the analyzer 13.
  • the delay time Td can be set as appropriate, but within the time when the Chlamydomonas is substantially the same, in this example, the time when the cell volume can be considered to be the maximum (hereinafter referred to as the stable time), the next time from one culture vessel 21 If the delay time Td (Td ⁇ stable time) is set so that the supply source of Chlamydomonas is switched to the culture tank 21, Chlamydomonas in substantially the same state can be continuously supplied.
  • the stabilization time may be set as a time in which cells can be regarded as being substantially in the same state according to the purpose of analysis, analysis technique, etc. In this example, the change in the cell volume of Chlamydomonas is within 5%. Set as time.
  • the stabilization time Tk is set to 20 minutes
  • Chlamydomonas in the same state is continuously supplied over a period of one light / dark cycle. be able to.
  • Chlamydomonas is again supplied from the culture unit 15 after the passage of one period of the light / dark cycle, but is approximately the same as the number before supply by division through a plurality of light / dark cycles. Chlamydomonas can also be propagated by now.
  • the value k is an integer of 1 or more. Further, the number of the culture tanks 21 in the conditional expression is counted as one from which Chlamydomonas is taken out at the same timing.
  • Chlamydomonas remaining after being supplied to the analyzer 13 is grown in the dark period after the supply so that Chlamydomonas grows to the same degree or more than the number before supply.
  • Chlamydomonas continuously in the same state can be supplied over a period corresponding to a plurality of light and dark periods. Therefore, as described above, the number of Chlamydomonas remaining in the culture tank 21 immediately after the supply is adjusted by the operation time of the supply pump 43 and the like.
  • Chlamydomonas Prior to supplying Chlamydomonas from the cell treatment system 10, Chlamydomonas is put into each culture tank 21 together with the medium to start initial culture.
  • the initial culture is intended to synchronize the cell cycle of Chlamydomonas with the light-dark cycle created by the lighting panel 23 at the same time that Chlamydomonas is grown to a sufficient number in the culture tank 21.
  • Chlamydomonas can be synchronized with the light / dark cycle in about 3 cycles.
  • the control unit 16 controls lighting / extinguishing of the lighting panel 23 in the same manner as in a normal case except that the cell supply device 12 is not operated.
  • the first illumination panel 23 is turned on to enter the light period, and after 14 hours have elapsed since the start of lighting, the first illumination panel 23 is turned off to enter the dark period.
  • the first lighting panel 23 is turned on again, and the first culture unit 15 enters the light period. In this way, in the first culture unit 15, the light period and the dark period are alternately repeated.
  • the second culture unit 15 the light period and the dark period are repeated alternately, but the second culture unit 15 is delayed by a delay time Td from the start of the light period of the first culture unit 15.
  • the second lighting panel 23 is turned on, the light period is reached, and the dark period is delayed by a delay time Td from the start of the dark period of the first culture unit 15. Then, the second lighting panel 23 becomes light again after a delay time Td after the first culture unit 15 becomes light again.
  • the second culture unit 15 has a light / dark cycle whose phase is delayed by the delay time Td with respect to the first culture unit 15.
  • the first culture unit 15 enters the light period when the delay time Td elapses after the n-th culture unit 15 enters the light period.
  • each sensor 31 measures the turbidity of the medium in the corresponding culture tank 21.
  • the density control part 35 is connected to the said culture tank 21, when the turbidity of the culture medium in one of the culture tanks 21 exceeds predetermined value based on the measurement result by one of the sensors 31.
  • the discharge pump 34 is operated for a predetermined time. Thereby, a certain amount of the medium whose turbidity exceeds the specified value is discharged from the culture tank 21 together with Chlamydomonas.
  • the culture tank 21 from which the medium has been discharged is supplemented with the same amount of medium as the amount discharged from the medium supplementing unit 18.
  • the density of Chlamydomonas in the culture medium in the said culture tank 21 is made low.
  • illumination light is uniformly irradiated to Chlamydomonas in the culture medium. Therefore, Chlamydomonas is cultured in a uniform growth environment.
  • the cell supply device 12 After completion of the initial culture, the cell supply device 12 is operated at an arbitrary timing to start supply to the analysis device 13. Even after the supply to the analyzer 13 is started, the culture device 11 operates in the same manner as the above-described initial culture.
  • the third supply valve 42 is opened at the timing when the time from the start of the light period of the third culture tank 21 is approximately 14 hours, and the other supply valves 42 is closed, and the supply pump 43 starts operating.
  • Chlamydomonas is taken out from the 3rd culture tank 21 with a culture medium, and a part of Chlamydomonas remains in the 3rd culture tank 21 with a culture medium.
  • the supply pump 43 is stopped, the third supply valve 42 is closed, and the extraction of Chlamydomonas from the third culture tank 21 is completed.
  • the Chlamydomonas taken out from the third culture tank 21 is temporarily stored in, for example, a buffer and then sent to the analyzer 13 so that the analysis is completed within the delay time Td.
  • a new culture medium having the same amount as the extracted amount is supplied from the medium replenishing unit 18 to the third culture tank 21 where the extraction of Chlamydomonas has been completed.
  • the third culture tank 21 then enters the dark period, and the remaining Chlamydomonas splits during the dark period and increases to the number before supply or more, and each carries out photosynthesis in the next light period.
  • the fourth culture tank 21 that reaches the next take-out timing is selected, and the selected fourth culture tank 21 has passed after the start of the light period and almost 14 hours have passed.
  • the supply control unit 44 opens the fourth supply valve 42, then operates the supply pump 43, stops the supply pump 43 after a certain period of time, and closes the fourth supply valve 42.
  • Chlamydomonas is taken out of the fourth culture tank 21 together with the medium from the fourth culture tank 21 and sent to the analyzer 13 via the buffer, with a delay of the delay time Td.
  • a part of Chlamydomonas remains in the 4th culture tank 21 with a culture medium.
  • the fifth culture tank 21 that reaches the next extraction timing is selected, and when the fifth culture tank 21 reaches the extraction timing, the fifth supply valve 42 is opened, and then the supply pump 43 is operated to take out Chlamydomonas and send it to the analyzer 13.
  • the sixth culture tank 21 to the n-th culture tank 21 are sequentially selected, and Chlamydomonas is taken out from the selected culture tank 21 and sent to the analyzer 13.
  • the culture tank 21 is sequentially selected from the first culture tank 21 toward the n-th culture tank 21, and Chlamydomonas is taken out from the selected culture tank 21 to the analyzer 13. send.
  • Chlamydomonas is continuously taken out from the n culture vessels 21 while shifting the time by the delay time Td, and sent to the analyzer 13.
  • Td delay time
  • Chlamydomonas is continuously taken out from the n culture vessels 21 while shifting the time by the delay time Td, and sent to the analyzer 13.
  • a part of Chlamydomonas is left and is divided during the dark period to increase to the number before supply, so that Chlamydomonas can be taken out from the same culture tank 21.
  • the culture cycle 21 is cultivated while shifting the phase of the light-dark cycle, so that Chlamydomonas is prepared so that Chlamydomonas in a target state can be supplied in a timely manner. It is in the state.
  • the timing at which Chlamydomonas is taken out differs for each culture tank 21, but Chlamydomonas is taken out from each culture tank 21 at the same timing in the light / dark cycle, so that the analyzer 13 has a timing at which the cell volume becomes maximum. Chlamydomonas is continuously taken out and supplied to the analyzer 13 continuously.
  • Chlamydomonas was cultured for 6 periods under two light and dark periods (one is phase A and the other is phase B) with shifted phases, and changes in the cell volume of the other Chlamydomonas were examined.
  • the length of one cycle of the light-dark cycle was 1 day (24 hours)
  • the light period was 14 hours
  • the dark period was 10 hours
  • the phase was shifted by 12 hours.
  • the cell volume of Chlamydomonas was measured for each of phase A and phase B during 6 cycles of the culture period, that is, at 6 hours, 9 o'clock, 12 o'clock, 15 o'clock, 18 o'clock and 21 o'clock.
  • the measurement at 21:00 was performed only in the 1st to 4th cycles (1st to 4th days).
  • the time 21:00 is the time when 14 hours have elapsed from the start of the light period in the phase A
  • the time 9:00 is the time when 14 hours have elapsed from the start of the light period in the phase B.
  • the cell volume of Chlamydomonas with an arbitrary number (multiple) of cells was measured at each measurement time in each cycle, and the average value was taken as the cell volume at the measurement time.
  • the results are shown in FIG.
  • a turbidostat continuous culture apparatus was used, and the culture was performed at room temperature using AF-6 medium as a medium.
  • a particle counting analyzer (CDA-1000 manufactured by Sysmex Corporation) was used for measuring the cell volume.
  • Chlamydomonas in the same state may be supplied every 30 minutes.
  • Chlamydomonas can also be supplied continuously or intermittently for a predetermined supply period. If the supply period coincides with the operation period of the supply destination of the analyzer 13 or the like, efficient supply without waste is possible.
  • the Chlamydomonas in a specific state is not limited to Chlamydomonas at the timing when the cell volume becomes maximum. For example, Chlamydomonas just before the end of the dark period may be supplied.
  • each culture tank 21 is cultivating Chlamydomonas in a state where the phase of the light-dark cycle is shifted, Chlamydomonas in any specific state to be analyzed can be obtained at any timing.
  • the culture tank 21 containing the Chlamydomonas in a specific state to be analyzed by the analyzer 13 may be selected, and Chlamydomonas may be acquired from the selected culture tank 21 and supplied to the analyzer 13.
  • Chlamydomonas that is brought into the same state as the specific state is analyzed in the analysis apparatus 13 in consideration of the time from the supply from the culture tank 21 to the actual analysis in the analysis apparatus 13.
  • the culture tank 21 in which the same state as the specific state to be analyzed and the Chlamydomonas that can be considered in the analysis are accommodated.
  • the culture tank 21 is selected by opening the supply valve 42 corresponding to the culture tank 21 to be selected.
  • the specification of the specific state and the supply timing of Chlamydomonas can be performed by an arbitrary method.
  • the analyzer 13 may request the cell processing system 10 to supply Chlamydomonas specifying the specific state. Good.
  • the supply control unit 44 responds to the request from the analyzer 13, and the culture tank 21 containing the same specific state as specified and the Chlamydomonas that can be considered in the analysis is stored.
  • the selected Chlamydomonas from the selected culture tank 21 is acquired and supplied to the analyzer 13. It is also possible to take out and supply Chlamydomonas of each state (phase) in the light / dark cycle or cell cycle almost simultaneously.
  • Examples of cells cultured and supplied by the cell treatment system 10 include other microalgae such as Chlamydomonas, but are not limited to this, and any cells that can be cultivated in synchronization can be used. It may be a cell. Although the cells are synchronously cultured with the light / dark cycle as a synchronization factor, the cells may be synchronously cultured with another synchronization factor, such as a temperature cycle.
  • Environmental factors including tuning factors may be changed periodically.
  • the environmental factor include, in addition to light and darkness and temperature, for example, the concentration of CO 2 in the medium and the concentration of nutrient components.
  • the cells may not be in synchronized culture. In the above, the cells are in the state of aiming at Chlamydomonas at the timing when the cell volume becomes the maximum in the cell cycle, so synchronous culture is performed, but whether to use synchronous culture depends on the purpose of analysis and the type of cell You can decide accordingly. For example, when environmental factors are periodically changed, when analyzing changes in cells that are expressed at a specific timing in the cycle of environmental factors, regardless of the cell cycle, or cells that express such changes For example, it is not necessary to use synchronized culture. Further, in this case, if the cell type is not synchronized, it is naturally not necessary to perform synchronized culture.
  • the containers are sequentially selected, and the cells in the selected containers are stimulated.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Euglena euglena
  • the cells and the stimulus are limited to these. Is not to be done.
  • the cell processing system 60 sends a suspension containing the stimulated Euglena to the analyzer 61 as a supply destination.
  • the cell processing system 60 includes a plurality of containers 63, a rotary table 64 that conveys the containers 63, a suspension supply unit 65 that supplies a suspension to the container 63, and a stimulus that adds PBS to the suspension in the container 63.
  • a unit 66, a cell supply device 67, and a control unit 68 that controls each unit in an integrated manner are provided.
  • the cell processing system 60 supplies the analyzer 61 as a cell in a specific state for analyzing the Euglena after a certain time has elapsed after adding PBS, that is, the Euglena at the timing when the cell volume is minimized by the change in osmotic pressure.
  • the rotary table 64 has a disk shape and is provided with a plurality of holding holes for holding the containers 63 at a constant pitch along the circumferential direction.
  • the rotary table 64 is intermittently rotated by a predetermined rotation angle by a motor 71 driven under the control of the control unit 68, and sequentially conveys the containers 63 held in the holding holes to the stations S1 to S7. It is controlled so that the container 63 moves from one station to the next station and the container 63 advances by one station by one-step rotation in which the rotary table 64 rotates by a predetermined rotation angle.
  • the rotation table 64 is rotated by one step at regular time intervals Tp. In FIG. 6, the circumferential direction of the rotary table 64 is drawn in the left-right direction. Further, the container 63 may be transported using a chain conveyor or the like instead of the rotary table 64.
  • a container supply unit 72 is disposed in the container supply station S1.
  • the container supply unit 72 sets an empty container 63 in the holding hole of the turntable 64 and holds the container 63 on the turntable 64.
  • the container 63 held in the holding hole is conveyed toward the downstream (left direction in the figure). Since the container supply unit 72 sets the empty container 63 in the holding hole every time the turntable 64 rotates by one step, the plurality of containers 63 are sequentially conveyed downstream.
  • the empty container 63 is transported from the container supply station S1 and transported to the suspension supply station S2.
  • a suspension supply unit 65 is disposed in the suspension supply station S2. Each time the empty container 63 is transported to the suspension supply station S2, the suspension supply unit 65 supplies the suspension to the container 63.
  • the suspension is, for example, a suspension of a number of Euglena in a medium (culture solution).
  • the Euglena in the suspension can be in a state according to the purpose of analysis by the analyzer 61. For example, if the suspension supply unit 65 has the same configuration as that of the cell processing system 10 (see FIG. 1) of the first embodiment, the Euglena in a specific state such as the timing at which the cell volume becomes maximum can be obtained.
  • a suspension containing nutrient deficient Euglena may be supplied to the container 63.
  • the suspension may be a suspension of Euglena in water.
  • a container containing a solid medium together with the cells may be supplied.
  • the container 63 to which the suspension is supplied at the suspension supply station S2 is sent to the next addition station S3 by the rotation of the rotary table 64.
  • a stimulation unit 66 is disposed in the addition station S3.
  • the stimulating unit 66 adds PBS as a stimulating substance to the suspension in the container 63 to stimulate the Euglena in the suspension. Since the addition of PBS is performed every time a new container 63 is conveyed to the addition station S3, stimulation is given to the Euglena in the suspension by shifting the timing among the plurality of containers 63.
  • the timing deviation of the stimulus is the same as the time interval Tp of one step rotation of the rotary table 64 between the containers 63 moving back and forth in the transport direction.
  • the container 63 in which PBS is added to the suspension is transported from the addition station S3 through the dummy stations S4 and S5 to the take-out station S6 by the rotation of the rotary table 64.
  • the stimulating substance for cells can be determined according to the purpose of analysis, the type of cells, and the like, and examples thereof include salts such as PBS, saccharides, amino acids, nitrogen, phosphorus and the like, but are not particularly limited. Temporary light irradiation, non-irradiation, cooling, heating, vibration, or the like may be given as a stimulus.
  • Dummy stations S4 and S5 are provided between the addition station S3 and the extraction station S6 as described above. These dummy stations S4 and S5 are provided to adjust a time interval from when PBS is added by the stimulating unit 66 until the suspension is taken out by the cell supply device 67. In this example, two dummy stations S4 and S5 are provided. The number of dummy stations is equal to the time interval Tp when the rotary table 64 rotates by one step rotation, and the suspension is added after PBS is added. It is determined according to the time required to take out (hereinafter referred to as reaction waiting time). When the reaction waiting time is shorter than the time interval Tp, no dummy station is provided.
  • the reaction waiting time can be finely adjusted, or the time interval Tp can be adjusted. It can be shortened.
  • a cell supply device 67 is arranged in the extraction station S6.
  • the cell supply device 67 has a suction tube 67a that can be expanded and contracted in the vertical direction.
  • the cell supply device 67 extends the suction tube 67a into the container 63 and sucks out the suspension.
  • the cell supply device 67 takes out the suspension from the container 63 and sends the suspension to the analyzer 61.
  • Euglena which makes the state where the reaction waiting time has elapsed from the addition of PBS a specific state is supplied to the analyzer 61.
  • a container recovery station S7 is provided downstream of the extraction station S6, and the container 63 from which the suspension has been extracted is conveyed to the container recovery station S7.
  • a container recovery unit 73 is disposed in the container recovery station S7.
  • the container collection part 73 takes out the container 63 from the holding hole and collects it.
  • the holding hole from which the container 63 has been taken out by the container recovery unit 73 moves to the container supply station S1, and a new empty container 63 is set again by the container supply unit 72. In this way, Euglena in a specific target state can be provided in a timely manner.
  • FIG. 7 shows the Euglena ⁇ ⁇ gracilis NIES-48 cultured in AF-6 medium (culture solution), and the volume change of Euglena cells was examined when PBS containing Euglena-containing medium was added as a suspension. Results are shown.
  • Euglena was cultured at room temperature using AF-6 medium as the medium.
  • the Euglena cell volume was plotted in FIG. 7 as an average value obtained by measuring an arbitrary number of cells (plurality) for each measurement time using a particle counting analyzer (CDA-1000 manufactured by Sysmex Corporation).
  • Euglena cell volume decreases immediately after adding PBS, cell volume is minimized in about 3 minutes, and then cell volume increases (FIG. 7 (A)). For this reason, for example, when analyzing Euglena in which the cell volume is minimized by adding PBS, the number of dummy stations and the time interval of one step rotation of the turntable 64 are set so that the reaction waiting time is 3 minutes. What is necessary is just to determine Tp.
  • the time interval Tp is 1 minute, and two dummy stations S4 and S5 may be provided as shown in FIG. .
  • PBS is added to the container 63 at the addition station S3, and the suspension is taken out from the container 63 and sent to the analyzer 61 at the extraction station S6.
  • the reaction waiting time can be set to 3 minutes, and the suspension can be supplied at intervals of 10 minutes.
  • the time interval Tp is set to 10 minutes, which is the suspension supply interval.
  • PBS is added to the suspension in the container 63 of the addition station S3 immediately before the one-step rotation is performed, and in the extraction station S6, the reaction waiting time is 3 minutes after the completion of the one-step rotation.
  • the suspension is taken out of the container 63. In this way, a suspension containing Euglena at a timing at which the cell volume is minimized by adding PBS is extracted from each container 63 (FIG. 7B), and Euglena in a specific state to be analyzed. Is supplied to the analyzer 61 at intervals of 10 minutes.
  • FIG. 8 and FIG. 9 show the results of examining the volume change of Chlamydomonas cells when a medium containing Chlamydomonas inreinhardtii CC-503 is cultured and PBS containing the Chlamydomonas-containing medium as a suspension is added. Yes. From these results, it can be seen that, as in the case of Euglena, for example, Chlamydomonas having a minimum cell volume can be supplied continuously or intermittently as a target state.
  • the change in cell volume shown in the graph of FIG. 8 uses AF-6 medium as the medium, and the time until the cell volume becomes the minimum is about 3 minutes after adding PBS.
  • TP medium as the medium, and the time until the cell volume becomes the minimum is about 10 minutes after adding PBS.
  • Chlamydomonas was cultured at room temperature, and using a particle counting analyzer (CDA-1000 manufactured by Sysmex Corporation), the average value of the cell volume obtained by measuring an arbitrary number of cells (plurality) was plotted for each measurement time. .
  • the specific state that is, the reaction waiting time is fixed, but the time length may be arbitrarily changed.
  • the cell supply device 67 is provided so as to be movable along the conveyance direction of the container 63, and each station downstream of the addition station S3 is provided.
  • the cell supply device 67 is set in any of the above, and the container 63 that is transported to the station or transported to the station is selected.
  • the cell supply device 67 is set at a station close to the addition station S3, and the suspension is taken out from the container 63.
  • the cell supply device 67 is set.
  • the reaction waiting time is arbitrarily changed as described above, increasing the number of stations from the addition station S3 to which the cell supply device 67 can be set to the container recovery station S7 widens the range of the reaction waiting time. This is advantageous. Further, in consideration of the time from the supply from the container 63 to the actual analysis by the analysis device 61, the same state as the specific state is analyzed so that the analysis device 13 analyzes the Euglena that can be considered to be the same state as the specific state. The station where the cell supply device 67 is set is determined so as to select the container 63 containing the Euglena which can be considered in the analysis.
  • designation of a specific state (reaction waiting time) and designation of Euglena supply timing can be performed by any method, but from the analysis device 61 to the cell treatment system 60, It may be configured to request the supply of Euglena specifying a specific state.
  • the control unit 68 responds to a request from the analysis device 61, and a container 63 containing Chlamydomonas that can be considered in the analysis in the same state as the specified specific state.
  • the cell supply device 67 is moved and set so as to select, and Euglena is acquired and supplied to the analysis device 61.
  • the cell processing system of the third embodiment is configured to apply stimulation while culturing cells. Except for the details described below, the second embodiment is the same as the second embodiment, and substantially the same components are denoted by the same reference numerals and detailed description thereof is omitted.
  • the container 63 is moved to the medium replenishment station S11, the culture stations S12 1 to S12 p , S13 1 to S13 q , the addition station S3, the dummy station S4 by the intermittent rotation of the turntable 64.
  • S5 is sequentially sent to the take-out station S6, and is configured to return from the take-out station S6 to the medium replenishment station S11 via the station S14.
  • the station S14 can be omitted.
  • a medium replenishment unit 81 is arranged in the medium replenishment station S11.
  • the culture stations S12 1 to S12 p and S13 1 to S13 q are provided in the culture apparatus 82.
  • the cell supply device 67 removes the cells and the medium from the container 63 while leaving some cells and the medium in the container 63.
  • the cell is not particularly limited, in this example, the cell consumes a specific nutrient component (for example, sugar or amino acid) given as a stimulus added by the stimulating unit 66.
  • the container 63 in which cells are left together with the medium at the take-out station S6 as described above is conveyed via the station S14.
  • the medium replenishment unit 81 replenishes the container 63 with a medium for culturing cells.
  • a container 63 containing a medium containing cells may be set in the holding hole of the turntable 64.
  • the stimulating unit 66 of the addition station S3 adds a stimulating solution containing the nutrient component that has become nutrient deficient at the culture stations S13 1 to S13 q as a stimulating substance as described above to the medium in the container 63.

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Abstract

目的とする状態にある細胞を適時に提供することができる細胞処理システム及び細胞供給方法を提供する。細胞処理システム（１０）は、複数の培養ユニット（１５）を備えている。各培養ユニット（１５）は、培養槽（２１）と照明パネル（２３）等を備えている。各培養槽（２１）内には、クラミドモナスと培地とがそれぞれ収容されている。培養槽（２１）内の細胞は、照明パネル（２３）の点灯と消灯とによって、培養ユニット（１５）ごとに一定の明暗周期の下で同調培養される。制御部（１６）は、照明パネル（２３）による明暗周期を培養ユニット（１５）の相互間でずらす。細胞供給装置（１２）は、この明暗周期のずれに対応した時間間隔で培養槽（２１）を順次に切り替えて、培養槽（２１）内からクラミドモナスを培地とともに取り出す。培養槽（２１）から取り出されたクラミドモナスは、分析装置（１３）に送られる。

Description

細胞処理システム及び細胞供給方法
　本発明は、細胞処理システム及び細胞供給方法に関する。
　細胞、例えば微細藻類を分析する手順は、分析対象とする微細藻類を培養し、培養された微細藻類を分析して、例えば所望とする形質が発現している個体を抽出する。例えばフローサイトメータ等の分析装置を用いて、多量の微細藻類を連続的に高速に分析することが可能である。微細藻類の培養装置は、例えば微細藻類とともに培地を収容する培養槽、微細藻類に光合成を行わせるための照明などで構成される。このような培養装置において微細藻類は、細胞分裂を繰り返して増殖する。
　微細藻類は、その状態が細胞周期の進行に応じて変化するため、細胞の状態は細胞周期の段階に応じて大きく異なる。照明からの光量を適切に増減する場合には、微細藻類の個々の細胞の細胞周期が明暗周期に同期したものとなり、個々の細胞の細胞周期における段階が揃ったいわゆる同調培養とすることができる。同調培養において、明暗周期を２４時間とした場合、微細藻類は、１日に１分裂して増殖する。光量を増減せずに照明を照射することによって連続明期とする場合には、微細藻類の個々の細胞の細胞周期が同期せずに細胞分裂を繰り返して増殖する。
　微細藻類の培養槽を多段に配置し、設置面積あたりの培養効率を高めた液面浮遊培養法を用いた培養装置が知られている（特許文献１を参照）。この特許文献１に記載された培養装置では、誘導期、対数増殖期、オイル蓄積期、増殖停止期といった増殖過程の時期を培養槽の相互間でずらしている。
特開２０１５－５７９９０号公報
　ところで、上記のように微細藻類のような細胞は、細胞周期の進行に応じて細胞の状態が変化するため、細胞の特定状態を分析したり、細胞が特定の機能を発現しているか否かを分析したりするには、細胞周期の特定のフェイズやタイミングにある細胞を分析装置に供給する必要があり、供給できるタイミングが限定されていた。また、微細藻類に限らないが、外部からの刺激に対する細胞の応答性を分析する場合には、刺激からの時間経過によって細胞の状態が変化するので、所定の時間が経過した状態の細胞を分析装置に供給する必要があり、やはり供給できるタイミングが限定されていた。このため、目的とする状態にある細胞を適時に提供することが望まれている。
　本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、目的とする状態にある細胞を適時に提供することができる細胞処理システム及び細胞供給方法を提供することを目的とする。
　本発明の細胞処理システムは、細胞を収容する複数の容器と、各容器内の細胞に対してそれぞれ刺激を与える刺激部と、刺激部により与える刺激のタイミングを各容器間で相互にずらす制御部とを備えるものである。
　また、本発明は、細胞処理装置からの細胞を分析装置に供給する細胞供給方法において、細胞を収容した複数の容器を細胞処理装置に準備する準備ステップと、各容器内の細胞に対して、各容器間でタイミングをずらして刺激を与える刺激ステップと、分析装置が分析する特定状態と同じ状態と分析の際に看做せる細胞が収容された容器を選択し、選択した容器から細胞を取得して分析装置に供給する供給ステップとを有するものである。
　本発明によれば、複数の容器に収容されている細胞に対して、容器の相互間で細胞に与える刺激のタイミングがずらされるので、細胞周期の特定のフェイズやタイミングとなる時期、刺激からの時間経過がずれた細胞が用意された状態になるため、目的とする状態にある細胞を適時に提供することができる。
第１実施形態に係る細胞処理システムの構成を示す概略図である。 培養ユニットの構成を示す分解斜視図である。 明暗周期に対応したクラミドモナスの細胞体積の変化を模式的に示す説明図である。 各培養ユニットの明期及び暗期と供給バルブの開閉タイミングを示すタイミングチャートである。 明暗周期の位相のずれた各培養条件下でのクラミドモナスの細胞体積の変化を示すグラフである。 第２実施形態に係る細胞処理システムの構成を示す概略図である。 刺激を与えてからのユーグレナの細胞体積の変化を示すグラフである。 ＡＦ―６培地で培養しているクラミドモナスに刺激を与えてからの細胞体積の変化を示すグラフである。 ＴＰ培地で培養しているクラミドモナスの刺激を与えてからの細胞体積の変化を示すグラフである。 第３実施形態に係る細胞処理システムの構成を示す概略図である。
［第１実施形態］
　第１実施形態の細胞処理システム１０は、培養装置１１と、細胞供給装置１２とを備え、培養装置１１において細胞としてのクラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii CC-503）を培養し、その培養されたクラミドモナスを細胞供給装置１２により、供給先としての分析装置１３に供給するように構成されている。後述するように、培養装置１１は、複数の培養ユニット１５でそれぞれ同調培養し、各培養ユニット１５で同調培養の位相をずらすことで、目的とする状態（特定状態）として細胞体積が最大となるタイミングのクラミドモナスを連続的に供給できるようにしている。なお、細胞処理システム１０と分析装置１３とは、細胞分析システムを構成しており、細胞処理システム１０が細胞分析システムにおける細胞処理装置となっている。
　培養装置１１は、複数の培養ユニット１５と、制御部１６と、ＣＯ２供給部１７、培地補充部１８を備えている。制御部１６は、培養装置１１を統括的に制御する。培養装置１１には、細胞密度調節装置１９が設けられている。各培養ユニット１５は、培養槽２１、恒温水槽２２、照明パネル２３をそれぞれ備えている。
　容器としての培養槽２１は、その槽内に培地（培養液）とともにクラミドモナスを収容する。恒温水槽２２は、その槽内に恒温器２５で調温した水が循環するようになっており、これにより培養槽２１内の培地をクラミドモナスの培養に適した一定の温度に維持する。ＣＯ２供給部１７は、二酸化炭素が所定の濃度に調整された空気を空気供給管２６を通して各培養槽２１内の培地中に供給する。これにより、クラミドモナスの光合成に必要な二酸化炭素を各培地に溶解する。なお、この例では、クラミドモナスを培養する培地の温度を一定に維持しているが、培養する細胞に応じてその培養に適した温度に培地を調整すればよく、培地の温度が一定でなくてもよい。
　培地補充部１８は、培養槽２１内に新規の培地を補充する。この例では、培地補充部１８は、後述するように細胞供給装置１２によって培養槽２１内の培地がクラミドモナスとともに取り出された場合、及び細胞密度調節装置１９によって培養槽２１内の培地がクラミドモナスとともに排出された場合に、それぞれ作動される。これにより、培養槽２１内の培地を一定量に保つ。なお、この例では、培地補充部１８は、空気供給管２６を通して培地に供給する。
　図２において、各培養ユニット１５の培養槽２１及び恒温水槽２２は、照明パネル２３から光合成に必要な照明光が培養槽２１内のクラミドモナスに照射されるように、それぞれ壁面が透明な容器になっている。恒温水槽２２の前面と背面とのそれぞれに照明パネル２３が取り付けられている。照明パネル２３は、例えば、一方の面に複数の発光ダイオード２３ａを設けた構成であり、その発光ダイオード２３ａが恒温水槽２２に向けた姿勢で配されている。培養槽２１は、厚みの薄い直方体形状であり、その厚み方向に一対の照明パネル２３が配されるように恒温水槽２２内に配置されている。これにより、培養槽２１の中心部にまで照明パネル２３からの照明光が達するようにしてある。各照明パネル２３は、培養ユニット１５ごとの駆動部２７（図１参照）によって駆動される。
　上記照明パネル２３は、培養ユニット１５ごとに点灯と消灯とが制御部１６によって制御される。これにより、培養ユニット１５ごとに、照明パネル２３を点灯してクラミドモナスに照明光が照射される明期と、照明パネル２３を消灯して照明光がクラミドモナスに照射されない暗期とを交互に切り替える。この切り替えよって、培養ユニット１５ごとに、各クラミドモナスの細胞周期が明暗周期に同調した同調培養を行う。
　１周期の明暗周期は、連続したそれぞれ１回の明期と暗期とからなり、同調培養下において、明暗周期の１周期がクラミドモナスの細胞周期の１周期に相当する。この例では、明期の時間を１４時間、暗期の時間を１０時間としているが、これらの時間、すなわち明暗周期は、その明暗周期に同調してクラミドモナスが同調培養される範囲内で任意に決めることができる。制御部１６は、詳細を後述するように。明暗周期の位相を培養ユニット１５の相互でずらしている。この例は、照明パネル２３が刺激部であり、照明パネル２３は、クラミドモナスに対して環境因子の１つである明暗を刺激として与えている。
　各恒温水槽２２の両側には、遮光板２８がそれぞれ配してある。これら遮光板２８により、１つの培養ユニット１５の照明パネル２３からの照明光が他の培養ユニット１５の培養槽２１に入射することを防止している。各培養ユニット１５は、例えば暗所に配されており、それぞれ対応した照明パネル２３からの照明光以外の光が入射しないようにしてある。なお、上部等から他の培養ユニット１４からの照明光が入射しないように、遮光板２８を上方に延設することも好ましい。
　細胞密度調節装置１９は、センサ３１、排出管３２、排出バルブ３３、排出ポンプ３４と、密度制御部３５等とから構成される。センサ３１、排出管３２、排出バルブ３３は、各培養槽２１にそれぞれ設けられている。センサ３１は、培養槽２１内の培地の濁度を測定し、その濁度に応じた信号を出力する。密度制御部３５は、各センサ３１からの信号に基づき、いずれかの培養槽２１内の培地の濁度が規定値を超えている場合に、当該培養槽２１に対応する排出バルブ３３を開き、他の排出バルブ３３を閉じた状態にしてから排出ポンプ３４を作動させ、排出管３２を介して当該培養槽２１内の一部のクラミドモナスと培地とを取り出して排出する。
　上述の培地補充部１８は、細胞密度調節装置１９の一部としても機能し、排出ポンプ３４によってクラミドモナスと培地液が排出された培養槽２１内に新たな培地を補充することによって、クラミドモナスの密度（単位体積の培地に対して占めるクラミドモナスの体積または個数）を低くする。これにより、各培養槽２１内のクラミドモナスの密度が過大になることを抑制し、クラミドモナスが他のクラミドモナスに対する照明光の影になることを抑制して照明光がクラミドモナスに均一に照射されるようにしている。
　なお、この例では、培養槽２１内のクラミドモナスの密度に関連するパラメータとして培地の濁度を測定してクラミドモナスの密度を調節しているが、クラミドモナスの密度に関連するパラメータとして培地の溶存酸素量、溶存二酸化炭素量、あるいは培地の誘電率を測定するセンサを用い、その測定結果に基づいて培地中のクラミドモナスの密度を調節してもよい。
　また、細胞密度調節装置１９を設ける代わりに、細胞供給装置１２によってクラミドモナスが取り出されるまでの間に、クラミドモナスの密度が規定値を超えないように、培養初期に投入されるクラミドモナスの個数、及び細胞供給装置１２で取り出された後に培養槽２１内に残るクラミドモナスの個数を調整してもよい。
　細胞供給装置１２は、培養槽２１ごとに設けた取出管４１及び供給バルブ４２と、供給ポンプ４３、供給制御部４４とを備える。供給制御部４４は、培養装置１１の制御部１６と協調し、明暗周期に同期して供給バルブ４２を順次に排他的に選択し、選択した１つの供給バルブ４２だけを開き、供給ポンプ４３を、例えば新たに供給バルブ４２が開かれるごとに一定時間ずつ作動する。このようにして、細胞供給装置１２は、明暗周期に同期して、供給バルブ４２を開くことでクラミドモナスを取り出す培養槽２１を順次に選択し、選択している培養槽２１から取出管４１を介してクラミドモナスを培地とともに取り出して分析装置１３に送る。この例では、細胞体積が最大となるタイミングのクラミドモナスを供給するため、明期となった時点からほぼ１４時間が経過して、明期が終了する直前の培養槽２１を選択している。
　細胞供給装置１２は、培養槽２１からクラミドモナスを取り出した際に、一部のクラミドモナスが培養槽２１内に残るように供給ポンプ４３の作動時間が調整されている。培養槽２１内に残ったクラミドモナスは、クラミドモナスを増殖させるために用いられる。すなわち、取り出し後の暗期においてクラミドモナスを分裂させる。培養槽２１内に残るクラミドモナスの個数が、次回の明期のときに供給前と同程度またはそれ以上になるように調整される。なお、培養槽２１内に配された取出管４１の端部の上下方向の位置を調整で培養槽２１内に残る培地の量を増減し、残るクラミドモナスの個数を調整するようにしてもよい。
　なお、１つの培養槽２１から細胞供給装置１２がクラミドモナスを培地とともに取り出す時間と、分析装置１３に供給する時間とは、必ずしも一致させる必要はない。例えば、培養槽２１から取り出したクラミドモナスと培地とを一旦バッファに貯め、このバッファから徐々にクラミドモナスを分析装置１３に供給するようにした場合、分析装置１３への供給時間よりも培養槽２１から取り出す時間を短くすることができる。ただし、クラミドモナスが分析の際に特定状態（この例では細胞体積が最大となるタイミング）にあると看做せる時間内に分析装置１３に供給する必要がある。
　分析装置１３は、多量の細胞を高速に分析することができるフローサイトメータを用いている。分析装置１３は、フローサイトメータに限定されるものではなく、また供給先は分析装置に限定されるものではない。
　図３に概略的に示すように、クラミドモナスは、明暗周期に同調して同調培養されている状態では、明暗周期に応じて細胞体積が増減する。これは、周知のように、明期で細胞体積を増大し、暗期に入ると細胞分裂をして細胞体積が急激に減少するためである。
　以下では、複数の培養ユニット１５の個々を特に区別する場合には、ｎを培養ユニット１５の全個数として、第１培養ユニット１５、第２培養ユニット１５、・・・第ｎ培養ユニット１５と称する。また、培養槽２１、照明パネル２３、供給バルブ４２についても、個々を特に区別する場合には、対応する培養ユニット１５の序数（第１、第２、・・・第ｎ）を付す。
　図４に示すように、制御部１６は、各培養ユニット１５について、同じ明暗周期を設定して照明パネル２３を駆動する。この例では、明期は１４時間、暗期は１０時間であり、明暗周期は２４時間となっている。また、培養槽２１からクラミドモナスを分析装置１３に供給するために、供給制御部４４は、各培養槽２１のそれぞれについて、上記のように明期の終了直前の一定の時間だけ対応する供給バルブ４２を開く。
　ここで、ｉを２、３・・・ｎとしたときに、第ｉ培養ユニット１５（第ｉ培養槽２１）の明期は、第（ｉ－１）培養ユニット１５（第（ｉ－１）培養槽２１）の明期よりも遅延時間Ｔｄだけ位相が遅れ、第ｉ培養槽２１に接続された第ｉ供給バルブ４２が開くタイミングは、第（ｉ－１）培養槽２１に接続された第（ｉ－１）供給バルブ４２が開くタイミングよりも遅延時間Ｔｄだけ遅れるように供給制御部４４によって制御される。この例においては、第ｎ培養ユニット１５の明期から遅延時間Ｔｄだけ遅れて、第１培養ユニット１５が再び明期となるようにして、各培養ユニット１５が明期と暗期とを交互に繰り返し、明期の終了直前の一定の時間だけ対応する供給バルブ４２が開くように制御される。これにより、遅延時間Ｔｄで培養槽２１を順次に切り替えながらクラミドモナスを分析装置１３に連続供給し、細胞体積が最大となるタイミングのクラミドモナスを分析装置１３に供給する。
　遅延時間Ｔｄは、適宜設定できるが、クラミドモナスが実質的に同じ状態、この例では細胞体積が最大となるタイミングにあるとみなせる時間（以下、安定時間という）内に、１つの培養槽２１から次の培養槽２１にクラミドモナスの供給元を切り替えるように遅延時間Ｔｄ（Ｔｄ≦安定時間）を設定すれば、実質的に同じ状態にあるクラミドモナスを連続して供給することが可能になる。なお、安定時間は、分析の目的、分析の手法等に応じて細胞が実質的に同じ状態にあるとみなせる時間として設定すればよく、この例ではクラミドモナスの細胞体積の変化が５％以内となる時間として設定している。
　したがって、同じ状態にあるとみなせるクラミドモナスを連続して供給するためには、安定時間をＴｋとしたときに「Ｔｄ≦Ｔｋ」を満たすようにすればよく、「Ｔｄ＝Ｔｋ」とすれば培養槽（培養ユニット１５）の個数を少なくすることができ、培養装置１１、細胞処理システム１０の小型化に寄与する。一方、ｎ個の培養槽２１を用いて、明暗周期の１周期分の期間Ｔｓにわたりクラミドモナスを供給するには、「Ｔｄ＝Ｔｓ／ｎ」とすればよい。安定時間Ｔｋに基づいて、「Ｔｄ＝Ｔｋ」と「Ｔｄ＝Ｔｓ／ｎ」との条件式を同時に満たすようにすれば、培養槽２１の個数を最小にしながら、明暗周期の１周期分の期間にわたって連続的に同じ状態とみなせるクラミドモナスを供給することができる。
　例えば、明暗周期を２４時間とし、安定時間Ｔｋを２０分とした場合、７２個の培養槽２１を用いることで、明暗周期の１周期分の期間にわたり同じ状態にあるクラミドモナスを連続的に供給することができる。
　上記のように、この例では明暗周期の１周期分の期間の経過後の培養ユニット１５から再びクラミドモナスを供給しているが、複数周期の明暗周期を通した分裂によって供給前の個数と同程度までにクラミドモナスを増殖させることもできる。培養槽２１からクラミドモナスを取り出してから明暗周期のｋ周期分の期間の経過後に同じ培養槽２１から再びクラミドモナスを取り出す場合、「Ｔｄ＝Ｔｓ／（ｋ・ｎ）」の条件式を満たすように、培養槽２１の個数（ｋ・ｎ）を決めればよい。なお、値ｋは、１以上の整数である。また、上記条件式における培養槽２１の個数は、同じタイミングでクラミドモナスが取り出されるもの１個と計数する。
　また、この例では、各培養槽２１のそれぞれについて、分析装置１３への供給後に残るクラミドモナスが供給後の暗期における分裂によって、供給前の個数と同程度またはそれ以上にクラミドモナスを増殖させることにより、明暗周期の複数周期分の期間にわたって連続的に同じ状態にあるクラミドモナスを供給できるようにしている。このため、上記のように、供給ポンプ４３の作動時間等により、供給直後に培養槽２１内に残るクラミドモナスの個数が調整される。
　次に上記構成の作用について説明する。細胞処理システム１０からクラミドモナスを供給するのに先立ち、クラミドモナスを培地とともに各培養槽２１に投入して初期培養を開始する。この初期培養は、培養槽２１内でクラミドモナスを十分な個数に増殖させるのと同時に、照明パネル２３によって作り出される明暗周期にクラミドモナスの細胞周期を同調させることを目的としている。クラミドモナスは、３周期程度で明暗周期に同調させることができる。
　上記初期培養では、細胞供給装置１２を作動させない他は、制御部１６によって、通常の場合と同様に照明パネル２３の点灯・消灯が制御される。例えば、第１培養ユニット１５では、第１照明パネル２３が点灯して明期になり、点灯を開始してから１４時間が経過すると第１照明パネル２３が消灯されて暗期となる。第１照明パネル２３の消灯から１０時間が経過すると、第１照明パネル２３が再び点灯されて第１培養ユニット１５は明期となる。このようにして、第１培養ユニット１５では、明期と暗期とが交互に繰り返される。
　これに対して、第２培養ユニット１５では、同様に明期と暗期とが交互に繰り返されるが、第２培養ユニット１５は、第１培養ユニット１５の明期の開始から遅延時間Ｔｄだけ遅れて第２照明パネル２３が点灯することで明期となり、第１培養ユニット１５の暗期開始から遅延時間Ｔｄだけ遅れて暗期となる。そして、第２照明パネル２３は、第１培養ユニット１５が再び明期となってから遅延時間Ｔｄだけ遅れて再び明期となる。結果として、第１培養ユニット１５に対して第２培養ユニット１５は、遅延時間Ｔｄだけ位相が遅れた明暗周期とされる。同様に、第３～第ｎ培養ユニット１５についても、明暗周期が繰り返されるが、位相が遅延時間Ｔｄずつ遅くなっている。そして、第１培養ユニット１５と第ｎ培養ユニット１５との関係では、第ｎ培養ユニット１５が明期になってから遅延時間Ｔｄが経過した時点で第１培養ユニット１５が明期になる。
　また、ＣＯ２供給部１７から二酸化炭素の濃度が調整された空気が培地中に供給され、恒温器２５によって調温された水が恒温水槽２２内を循環することで培養槽２１内の培地がクラミドモナスの培養に適した一定の温度に維持される。これらにより、各培養槽２１内のクラミドモナスは、それぞれ明期中に光合成し、暗期中に分裂して増殖するように、培養槽２１ごとに明暗周期に細胞周期が同調した状態で培養されるようになる。
　上記のようにして各培養槽２１内でのクラミドモナスの培養が行われている間では、各センサ３１は、対応する培養槽２１内の培地の濁度を測定している。そして、密度制御部３５は、いずれかのセンサ３１による測定結果に基づいて、いずれかの培養槽２１内の培地の濁度が既定値を超えている場合には、当該培養槽２１に接続された排出バルブ３３を開いてから排出ポンプ３４を所定時間作動させる。これにより、濁度が規定値を超えている培地がクラミドモナスとともに培養槽２１から一定量排出される。排出ポンプ３４の停止後には、密度制御部３５からの指示に基づき、培地が排出された培養槽２１に培地補充部１８から排出量と同量の培地が補充される。これにより、当該培養槽２１内の培地中のクラミドモナスの密度が低くされる。このようにして、各培養槽２１内の培地中のクラミドモナスの密度が過大にならないようにされているため、培地中のクラミドモナスに均一に照明光が照射される。したがって、均一な生育環境でクラミドモナスが培養される。
　初期培養の完了後、任意のタイミングで細胞供給装置１２を作動させて分析装置１３への供給を開始する。なお、分析装置１３への供給を開始してからも、培養装置１１は、上記の初期培養と同様に動作する。
　細胞供給装置１２を作動させると、供給制御部４４は、その直後の最も早く取り出しタイミングを迎える、すなわち明期の開始からの時間がほぼ１４時間になる培養槽２１を特定する。そして、その特定した培養槽２１が取り出しタイミングとなると、当該培養槽２１に接続された供給バルブ４２を開いてから、供給ポンプ４３を一定時間作動させる。
　例えば、第３培養槽２１が特定された場合、この第３培養槽２１が明期の開始からの時間がほぼ１４時間になったタイミングで、第３供給バルブ４２が開かれ、他の供給バルブ４２を閉じた状態とされて、供給ポンプ４３が作動を開始する。これにより、第３培養槽２１から培地とともにクラミドモナスが取り出され、一部のクラミドモナスが培地とともに第３培養槽２１内に残る。この後に、供給ポンプ４３の一定時間の作動後、供給ポンプ４３が停止されるとともに、第３供給バルブ４２が閉じられ、第３培養槽２１からのクラミドモナスの取り出しが終了する。第３培養槽２１から取り出されたクラミドモナスは、例えばバッファに一旦貯められてから、遅延時間Ｔｄ内で分析が完了されるように分析装置１３に送られる。
　また、クラミドモナスの取り出しが終了した第３培養槽２１には、取り出された量と同じ量の新たな培地が培地補充部１８から供給される。この第３培養槽２１は、続いて暗期を迎え、残ったクラミドモナスが暗期中に分裂して供給前の個数またはそれ以上に増加し、それぞれが次の明期で光合成をする。
　第３培養槽２１からの取り出し終了後、次に取り出しタイミングを迎える第４培養槽２１を選択し、その選択した第４培養槽２１が明期の開始からほぼ１４時間が経過して取り出しタイミングを迎えると、供給制御部４４は、第４供給バルブ４２を開いてから、供給ポンプ４３を作動させ、一定時間の経過後に供給ポンプ４３を停止するとともに、第４供給バルブ４２を閉じる。これにより、第３培養槽２１からの取り出しに遅延時間Ｔｄだけ遅れて、第４培養槽２１から培地とともにクラミドモナスが取り出されてバッファを介して分析装置１３に送られる。また、一部のクラミドモナスが培地とともに第４培養槽２１内に残る。第４培養槽２１についても、取り出し終了後には、新たな培地が培地補充部１８から供給され、明期に続く暗期中に残ったクラミドモナスが分裂して増加し、それぞれが次の明期で光合成をする。
　第４培養槽２１からの取り出し終了後、次に取り出しタイミングを迎える第５培養槽２１を選択し、第５培養槽２１が取り出しタイミングを迎えると、第５供給バルブ４２を開いてから、供給ポンプ４３を作動させ、クラミドモナスを取り出して分析装置１３に送る。以下、同様に第６培養槽２１から第ｎ培養槽２１までを順次に選択して、選択した培養槽２１からクラミドモナスを取り出して分析装置１３に送る。第ｎ培養槽２１からクラミドモナスを取り出した後には、第１培養槽２１から第ｎ培養槽２１に向けて培養槽２１を順次に選択し、選択した培養槽２１からクラミドモナスを取り出して分析装置１３に送る。このようにして、遅延時間Ｔｄずつ時間をずらしながら、ｎ個の培養槽２１から連続的にクラミドモナスを取り出して分析装置１３に送る。もちろん、各培養槽２１は、一部のクラミドモナスが残されて暗期中に分裂して供給前の個数まで増加するので、同じ培養槽２１からクラミドモナスを取り出すことができる。
　上記のように、細胞処理システム１０では、各培養槽２１の相互間で明暗周期の位相をずらして培養されているため、目的とする状態にあるクラミドモナスを適時に供給できるようにクラミドモナスが用意された状態になっている。そして、クラミドモナスが取り出されるタイミングは、培養槽２１ごとに異なるが、各培養槽２１からは明暗周期における同じタイミングでクラミドモナスを取り出しているので、分析装置１３には、細胞体積が最大となるタイミングのクラミドモナスが連続的に取り出されて、連続的に分析装置１３に供給される。
　位相をずらした２つの明暗周期（一方を位相Ａ、他方を位相Ｂとする）下で６周期にわたりクラミドモナスを培養し、そのたクラミドモナスの細胞体積の変化を調べた。この培養では、明暗周期の１周期の長さを１日（２４時間）、明期１４時間、暗期１０時間とし、位相を１２時間ずらした。クラミドモナスの細胞体積は、位相Ａ、位相Ｂのいずれについても６周期の培養期間中すなわち６日間のそれぞれの時刻９時、１２時、１５時、１８時、２１時に測定した。ただし、位相Ｂについては、時刻２１時の測定は、１～４周期目（１～４日目）のみ行った。時刻２１時は、位相Ａにおける明期の開始から１４時間が経過した時点の時刻であり、時刻９時は、位相Ｂにおける明期の開始から１４時間が経過した時点の時刻である。各周期の測定時刻ごとに任意の細胞数（複数）のクラミドモナスの細胞体積を測定し、その平均値を当該測定時刻の細胞体積とした。この結果を図５及び下記表１に示す。なお、この培養では、タービドスタット連続培養装置を用い、培地としてＡＦ－６培地を用いて、室温で培養した。また、細胞体積の測定には粒子計数分析装置（シスメックス株式会社製ＣＤＡ－１０００）を用いた。
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　位相Ａの時刻９時、位相Ｂの時刻２１時の各クラミドモナスの細胞体積を比較し、また位相Ａの時刻２１時、位相Ｂの時刻９時の細胞体積を比較した結果、ほぼ同じ計測結果が得られている。Paired t-testのｐ値は、前者が「ｐ＝０．９４」、後者が「ｐ＝０．９９」であり、いずれも有意な差が見られなかった。したがって、明暗周期の位相をずらしても各培養槽２１から明暗周期の位相のずれに同期したタイミングで統計的に差の無い状態のクラミドモナスが得られることがわかる。
　上記では、明暗周期の１周期分の期間（この例では２４時間）にわたって同じ状態にあるクラミドモナスを連続的に供給する例について説明したが、１周期分よりも短い時間間隔で間欠的に、例えば３０分ごとに同じ状態にあるクラミドモナスを供給するようにしてもよい。また、所定の供給期間だけ連続的または間欠的にクラミドモナスを供給することもできる。その供給期間を分析装置１３等の供給先の稼働期間と一致させれば、無駄のない効率的な供給が可能である。なお、特定状態にあるクラミドモナスとしては、細胞体積が最大になるタイミングにあるクラミドモナスに限定されない。例えば、暗期の終了直前にあるクラミドモナスを供給してもよい。
　さらに、各培養槽２１は、それぞれ明暗周期の位相をずらした状態でクラミドモナスを培養しているから、分析の目的とする任意の特定状態にあるクラミドモナスを任意のタイミングに得ることもできる。この場合、分析装置１３によって分析する特定状態となっているクラミドモナスが収容された培養槽２１を選択し、その選択した培養槽２１からクラミドモナスを取得して分析装置１３に供給すればよい。培養槽２１を選択する場合には、培養槽２１から供給されて分析装置１３で実際に分析されるまでの時間を考慮して、特定状態と同じ状態と做せるクラミドモナスが分析装置１３において分析されるように、分析する特定状態と同じ状態と分析の際に看做せるクラミドモナスが収容された培養槽２１を選択することが好ましい。培養槽２１の選択は、選択すべき培養槽２１に対応する供給バルブ４２を開くことによって行う。
　特定状態の指定やクラミドモナスの供給タイミングの指定は、任意の手法で行うことができるが、例えば分析装置１３から細胞処理システム１０に対して、特定状態を指定したクラミドモナスの供給を要求する構成としてもよい。この場合、細胞処理システム１０では、分析装置１３からの要求に供給制御部４４が応答して、指定される特定状態と同じ状態と分析の際に看做せるクラミドモナスが収容された培養槽２１を選択して、その選択した培養槽２１からのクラミドモナスを取得して分析装置１３に供給する。また、明暗周期ないし細胞周期における各状態（位相）のクラミドモナスをほぼ同時に取り出して供給することも可能である。
　細胞処理システム１０によって培養・供給する細胞としては、クラミドモナスをはじめとする他の微細藻類を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、同調培養が可能な細胞であれば、どのような細胞であってもよい。明暗周期を同調因子として細胞を同調培養しているが、他の同調因子、例えば温度周期によって同調培養してもよい。
　同調因子を含む環境因子（環境の条件）を周期的に変化させてもよい。環境因子としては、明暗や温度の他に、例えば培地におけるＣＯ２の濃度、栄養成分の濃度等が挙げられる。細胞が同調培養とならなくてもよい。上記では、細胞周期において細胞体積が最大になるタイミングのクラミドモナスを目的とする状態にある細胞としているため、同調培養を行っているが、同調培養とするか否かは分析目的や細胞の種類に応じて決めればよい。例えば、環境因子を周期的に変化させたときに、細胞周期とは無関係に、環境因子の周期の特定のタイミングで発現する細胞の何らかの変化を分析する場合や、そのような変化を発現する細胞を抽出するような場合には、同調培養とする必要はない。また、この場合、同調培養とならない細胞の種類であれば、当然に同調培養にする必要がない。
［第２実施形態］
　第２実施形態の細胞処理システムは、容器を順次に選択し、選択した容器内の細胞に刺激を与えるようにしたものである。以下では、細胞としてのユーグレナ（ミドリムシ）を懸濁した懸濁液に、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）を刺激として与える例について説明するが、細胞及び刺激は、これらに限定されるものではない。
　図６において、細胞処理システム６０は、刺激を与えたユーグレナを含む懸濁液を供給先としての分析装置６１に送る。細胞処理システム６０は、複数の容器６３、これら容器６３を搬送する回転テーブル６４、容器６３に懸濁液を供給する懸濁液供給部６５、容器６３内の懸濁液にＰＢＳを添加する刺激部６６、細胞供給装置６７、及び各部を統括に制御する制御部６８等を備えている。例えば、細胞処理システム６０は、分析装置６１にＰＢＳの添加後、一定時間経過したユーグレナすなわち浸透圧の変化によって細胞体積が最小になるタイミングのユーグレナを分析する特定状態にある細胞として供給する。
　回転テーブル６４は、円板形状であり、その周方向に沿って一定のピッチで容器６３を保持する複数の保持穴が設けられている。この回転テーブル６４は、制御部６８の制御下で駆動されるモータ７１によって間欠的に所定の回転角度ずつ回転し、保持穴に保持した容器６３を、各ステーションＳ１～Ｓ７に順次に搬送する。回転テーブル６４が所定の回転角度だけ回転する１ステップの回転で、容器６３を１つのステーションから次のステーションに移動して、容器６３が１ステーション分ずつ進むように制御される。回転テーブル６４の１ステップの回転は、一定の時間間隔Ｔｐごとに行われる。なお、図６では、回転テーブル６４の周方向を左右方向に展開して描いてある。また、回転テーブル６４に代えてチェーンコンベア等を用いて容器６３を搬送してもよい。
　容器供給ステーションＳ１には、容器供給部７２が配置されている。この容器供給部７２は、空の容器６３を回転テーブル６４の保持穴にセットして、その容器６３を回転テーブル６４に保持させる。回転テーブル６４の回転によって、保持穴に保持された容器６３は、下流（図中左方向）に向けて搬送される。この容器供給部７２は、回転テーブル６４が１ステップの回転するごとに空の容器６３を保持穴にセットするので、複数の容器６３が順次に下流に向けて搬送される。
　空の容器６３は、容器供給ステーションＳ１から搬送されて懸濁液供給ステーションＳ２に搬送される。この懸濁液供給ステーションＳ２には、懸濁液供給部６５が配置されている。懸濁液供給部６５は、懸濁液供給ステーションＳ２に空の容器６３が搬送されてくるごとに、その容器６３に懸濁液を供給する。懸濁液は、例えば培地（培養液）に多数のユーグレナを懸濁させたものである。懸濁液中のユーグレナは、分析装置６１による分析目的に応じた状態のものとすることができる。例えば、懸濁液供給部６５を、第１実施形態の細胞処理システム１０（図１参照）と同様な構成にすれば、例えば細胞体積が最大となるタイミングのように特定の状態にあるユーグレナを含む懸濁液を常に容器６３に供給することもできる。また、栄養欠乏のユーグレナを含む懸濁液を容器６３に供給してもよい。なお、懸濁液は、水にユーグレナを懸濁させたものでもよい。さらに、空の容器６３に懸濁液を供給することに代えて、細胞とともに固体培地を収容した容器を供給してもよい。
　懸濁液供給ステーションＳ２で懸濁液が供給された容器６３は、回転テーブル６４の回転により次の添加ステーションＳ３に送られる。添加ステーションＳ３には、刺激部６６が配置されている。この刺激部６６は、容器６３内の懸濁液に刺激物質としてのＰＢＳを添加して、その懸濁液中のユーグレナに刺激を与える。ＰＢＳの添加は、添加ステーションＳ３に新たな容器６３が搬送されてくるごとに行われるので、複数の容器６３の相互間でタイミングをずらして懸濁液中のユーグレナに対して刺激が与えられる。刺激のタイミングずれは、搬送方向に前後する容器６３間で回転テーブル６４の１ステップの回転の時間間隔Ｔｐと同じである。ＰＢＳが懸濁液に添加された容器６３は、回転テーブル６４の回転により、添加ステーションＳ３からダミーステーションＳ４、Ｓ５を経て、取出ステーションＳ６に搬送される。
　細胞に対する刺激物質は、分析目的、細胞の種類等に応じて決めることができ、例えばＰＢＳ等の塩類、糖類、アミノ酸、窒素、リン等を挙げることができるが、特に限定されるものでない。一時的な光の照射、あるいは非照射、冷却、加温、振動等を刺激として与えてもよい。
　ダミーステーションＳ４、Ｓ５は、上述のように添加ステーションＳ３と取出ステーションＳ６との間に設けられている。これらダミーステーションＳ４、Ｓ５は、刺激部６６によってＰＢＳを添加してから細胞供給装置６７によって懸濁液を取り出すまでの時間間隔を調整するために設けられている。この例では、２つのダミーステーションＳ４、Ｓ５を設けているが、ダミーステーションの数は、回転テーブル６４が１ステップ回転ずつ回転する際の時間間隔Ｔｐとともに、ＰＢＳを添加してから懸濁液を取り出すまでに必要な時間（以下、反応待機時間という）に応じて決められる。反応待機時間が、時間間隔Ｔｐ以下の短い場合には、ダミーステーションを設けない。
　なお、１ステップ回転のタイミングに対する懸濁液へのＰＢＳの添加タイミングと細胞供給装置６７による懸濁液の取り出しタイミングとを調整することにより、反応待機時間を微調整したり、時間間隔Ｔｐよりも短くしたりすることができる。
　取出ステーションＳ６には、細胞供給装置６７が配置されている。細胞供給装置６７は、上下方向に伸縮自在な吸引管６７ａを有している。この細胞供給装置６７は、取出ステーションＳ６に容器６３が搬送されてくると、吸引管６７ａを容器６３内に伸ばして懸濁液を吸引して取り出す。細胞供給装置６７は、容器６３が搬送されてくるごとに、容器６３から懸濁液を取り出して、懸濁液を分析装置６１に送る。これにより、ＰＢＳの添加から反応待機時間が経過した状態を特定状態とするユーグレナを分析装置６１に供給する。
　取出ステーションＳ６よりも下流に容器回収ステーションＳ７が設けられており、懸濁液が取り出された容器６３が容器回収ステーションＳ７に搬送される。この容器回収ステーションＳ７には、容器回収部７３が配置されている。容器回収部７３は、容器６３を保持穴から取り出して回収する。容器回収部７３によって容器６３が取り出された保持穴は、容器供給ステーションＳ１に移動し、容器供給部７２によって新たな空の容器６３が再びセットされる。このようにして、目的とする特定状態にあるユーグレナを適時に提供できるようになる。
　図７は、ユーグレナ（Euglena gracilis NIES-48）をＡＦ－６培地（培養液）で培養し、そのユーグレナを含む培地を懸濁液としてＰＢＳを加えた場合のユーグレナの細胞の体積変化を調べた結果を示している。なお、培地としてＡＦ－６培地を用い、室温でユーグレナを培養した。ユーグレナの細胞の体積は、粒子計数分析装置（シスメックス株式会社製ＣＤＡ－１０００）を用いて、それぞれの測定時間について任意の細胞数（複数）を測定した平均値を図７にプロットした。
　ユーグレナは、ＰＢＳを添加した直後から細胞体積が減少して、３分程度で細胞体積が最小となり、その後細胞体積が増大する（図７（Ａ））。このため、例えば、ＰＢＳの添加によって細胞体積が最小となるユーグレナを分析する場合には、反応待機時間が３分となるように、ダミーステーションの数と、回転テーブル６４の１ステップ回転の時間間隔Ｔｐを決めればよい。
　連続的、例えば１分間隔で、３分経過した状態のユーグレナを供給する場合では、時間間隔Ｔｐを１分とし、図６に示されるように、２つのダミーステーションＳ４、Ｓ５を設ければよい。そして、例えば１ステップ回転の完了直後に、添加ステーションＳ３においては容器６３内にＰＢＳを添加し、取出ステーションＳ６においては容器６３から懸濁液を取り出して分析装置６１に送る。
　また、例えば、刺激液を添加してから反応待機時間を３分として、懸濁液を１０分間隔で供給することもできる。この場合、ダミーステーションを設けずに、時間間隔Ｔｐを懸濁液の供給間隔である１０分とする。そして、添加ステーションＳ３では、１ステップ回転が行われる直前に添加ステーションＳ３の容器６３内の懸濁液にＰＢＳを添加し、取出ステーションＳ６では１ステップ回転完了した時点から反応待機時間である３分が経過した時点で容器６３から懸濁液を取り出す。このようにすることにより、各容器６３からは、ＰＢＳの添加によって細胞体積が最小となるタイミングにあるユーグレナを含む懸濁液が取り出され（図７（Ｂ））、分析する特定状態にあるユーグレナを含む懸濁液が１０分間隔で分析装置６１に供給される。
　図８、図９は、クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii CC-503）を含む培地を培養し、そのクラミドモナスを含む培地を懸濁液としてＰＢＳ加えた場合のクラミドモナスの細胞の体積変化を調べた結果を示している。これらの結果から、ユーグレナの場合と同様にして、目的とする状態として例えば細胞体積が最小となる状態のクラミドモナスを連続的あるいは間欠的に供給できることがわかる。なお、図８のグラフに示す細胞体積の変化は、培地としてＡＦ－６培地を用いており、細胞体積が最小となるまでの時間は、ＰＢＳを添加してから約３分である。また、図９のグラフに示す細胞体積の変化は、培地としてＴＰ培地を用いており、細胞体積が最小となるまでの時間は、ＰＢＳを添加してから約１０分である。いずれも室温でクラミドモナスを培養し、粒子計数分析装置（シスメックス株式会社製ＣＤＡ－１０００）を用いて、それぞれの測定時間について、任意の細胞数（複数）を測定した細胞体積の平均値をプロットした。
　上記では、特定状態すなわち反応待機時間を一定なものとしたが、その時間長を任意に変えられるようにしてもよい。反応待機時間を任意に変えるためには、例えば、添加ステーションＳ３よりも下流側において、細胞供給装置６７を容器６３の搬送方向に沿って移動自在に設け、添加ステーションＳ３よりも下流の各ステーションのいずれかに細胞供給装置６７をセットして、そのステーションに搬送されているまたはステーションに搬送されてくる容器６３を選択するように構成する。そして、反応待機時間を短くする場合には、細胞供給装置６７を添加ステーションＳ３に近いステーションにセットして容器６３から懸濁液を取り出し、反応待機時間を長くする場合には、細胞供給装置６７を添加ステーションＳ３に離れたステーションにセットして容器６３から懸濁液を取り出す。このときに、１ステップ回転のタイミングに対する細胞供給装置６７による懸濁液を取り出しタイミングを併せて変化させれば、反応待機時間をより細かく変えることができる。
　なお、このように反応待機時間を任意に変える場合においては、細胞供給装置６７がセット可能な添加ステーションＳ３から容器回収ステーションＳ７までの間のステーション数を多くすることが反応待機時間の範囲を広げる上で有利である。また、容器６３から供給されて分析装置６１で実際に分析されるまでの時間を考慮して、特定状態と同じ状態と做せるユーグレナが分析装置１３において分析されるように、特定状態と同じ状態と分析の際に看做せるユーグレナが収容された容器６３を選択するように細胞供給装置６７をセットするステーションを決める。
　さらに、第１実施形態と同様に、特定状態（反応待機時間）の指定やユーグレナの供給タイミングの指定は、任意の手法で行うことができるが、分析装置６１から細胞処理システム６０に対して、特定状態を指定したユーグレナの供給を要求する構成としてもよい。この場合、細胞処理システム６０では、分析装置６１からの要求に、例えば制御部６８が応答して、指定される特定状態と同じ状態と分析の際に看做せるクラミドモナスが収容された容器６３を選択するように細胞供給装置６７を移動させてセットして、ユーグレナを取得して分析装置６１に供給する。
［第３実施形態］
　第３実施形態の細胞処理システムは、細胞を培養しながら刺激を加える構成である。なお、以下に詳細を説明する他は、第２実施形態と同様であり、実質的に同じ構成部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
　図１０において、細胞処理システム８０では、回転テーブル６４の間欠的な回転によって、容器６３が培地補充ステーションＳ１１、培養ステーションＳ１２１～Ｓ１２ｐ、Ｓ１３１～Ｓ１３ｑ、添加ステーションＳ３、ダミーステーションＳ４、Ｓ５、取出ステーションＳ６に順次に送られ、取出ステーションＳ６からステーションＳ１４を経て培地補充ステーションＳ１１に戻るように構成されている。なお、ステーションＳ１４は省略できる。
　培地補充ステーションＳ１１には、培地補充部８１が配置されている。また、培養ステーションＳ１２１～Ｓ１２ｐ、Ｓ１３１～Ｓ１３ｑは、培養装置８２内に設けられている。取出ステーションＳ６では、細胞供給装置６７は、一部の細胞と培地とを容器６３内に残して容器６３から細胞と培地を取り出す。細胞は、特に限定されないが、この例では刺激部６６によって添加される刺激として与えられる特定の栄養成分（例えば、糖やアミノ酸等）を消費する細胞となっている。
　培地補充ステーションＳ１１には、上記のように取出ステーションＳ６で培地とともに細胞が残された容器６３がステーションＳ１４を経て搬送される。培地補充部８１は、培地補充ステーションＳ１１に容器６３が搬送されてくるごとに、その容器６３に細胞を培養するための培地を補充する。なお、細胞処理システム８０の動作初期には、細胞を含む培地を収容した容器６３を回転テーブル６４の保持穴にセットすればよい。
　培養装置８２内では、容器６３は、培養区間となる培養ステーションＳ１２１～Ｓ１２ｐを経て、消費区間となる培養ステーションＳ１３１～Ｓ１３ｑを順次に搬送される。容器６３が培養区間を搬送されている間では、培養装置８２は、培地の温度の調整や細胞の栄養成分の追加等を行い容器６３内で細胞を増殖させる。容器６３が消費区間を搬送されている間では、培養装置８２は、特定の栄養成分の補給することなく生育ないし培養することによって、細胞を特定の栄養成分について栄養欠乏にする。なお、培養装置８２における培養の手法は、細胞に応じて適宜決めることができる。
　添加ステーションＳ３の刺激部６６は、上記のように培養ステーションＳ１３１～Ｓ１３ｑで栄養欠乏となった栄養成分を刺激物質として含む刺激液を容器６３内の培地に添加する。
　添加ステーションＳ３で刺激液が添加された容器６３は、ダミーステーションＳ４、Ｓ５を介して取出ステーションＳ６に搬送される。そして、その容器６３から、刺激液の添加から所定の待機経過時間が経過した細胞が目的とする状態にある細胞として培地とともに取り出されて分析装置６１に送られる。取出ステーションＳ６には、回転テーブル６４が１ステップ回転するごとに、容器６３が搬送されてくるため、刺激液の添加から所定の反応待機時間が経過した細胞が連続的あるいは間欠的に取り出されて分析装置６１に供給される。
　取出ステーションＳ６では、上記のように一部の細胞と培地とが容器６３内に残され、その容器６３がステーションＳ１４を経て培地補充ステーションＳ１１に戻る。そして、培地補充ステーションＳ１１に戻った容器６３には、再び培地が補充される。このようにして細胞の培養を繰り返しながら、培養された細胞に刺激を与えたものが分析装置６１に供給される。これにより、目的とする状態にあるクラミドモナスを適時に供給できるようにクラミドモナスが用意された状態になっている。培地補充ステーションＳ１１で培地が補充される容器６３内に刺激液に含まれる特定の栄養成分が残っていても、その栄養成分は、培養区間、消費区間を容器６３が搬送されている間に細胞によって消費されるので問題にならない。
　上記構成は、一例であり、本発明はこれに限定されない。上記では特定の栄養成分について栄養欠乏になった細胞に、その特定の栄養成分を刺激物質として与える場合について説明したが、これに限定されるものではない。すなわち、細胞に与える刺激物質は、細胞が栄養欠乏となった栄養成分に限定されるものではなく、また刺激を与える細胞は栄養欠乏になった細胞に限定されるものではない。例えば、細胞が栄養欠乏となった栄養成分とは異なる栄養成分を刺激として与えたり、栄養成分以外の刺激を与えたりしてもよい。
　また、上記のように、細胞の培養を繰り返しながら刺激を与える場合、細胞に対する刺激は、消失するものであればどのようなものでもよい。例えば、細胞によって消費あるいは分解される刺激物質や、時間経過とともに自然分解や揮発したりして消失する刺激物質を用いることができる。また、刺激は、一時的な光の照射や冷却、加温、振動等の刺激のように、刺激を与えていない状態に戻せるものでもよい。
　さらに、培地補充ステーションＳ１１から添加ステーションＳ３までの間で、細胞、例えば微細藻類を同調培養し、一定の状態の微細藻類に対して刺激を与えることもできる。この場合には、例えば透明にされた容器６３に対して光を照射する区間、光を照射しない区間を交互に通すようにして、容器６３を搬送すればよい。
　本発明は、植物培養細胞、動物培養細胞、微細藻類、酵母等の真核微生物、バクテリア等の原核微生物等、未分化の細胞全般について利用することができる。
　１０，６０，８０　細胞処理システム
　１１　培養装置
　１２，６７　細胞供給装置
　１３，６１　分析装置
　１５　培養ユニット
　１６，６８　制御部
　１８，８１　培地補充部
　２１　培養槽
　２３　照明パネル
　６３　容器
　６６　刺激部

 

Claims (14)

  1. 　細胞を収容する複数の容器と、
    　前記各容器内の細胞に対してそれぞれ刺激を与える刺激部と、
    　前記刺激部により与える前記刺激のタイミングを前記各容器間で相互にずらす制御部と
    　を備えることを特徴とする細胞処理システム。
  2. 　前記刺激部は、前記刺激として細胞に対する環境因子を変化させることを特徴とする請求項１に記載の細胞処理システム。
  3. 　前記容器内に、細胞とともに培地を収容し前記容器内で細胞を培養する培養装置を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞処理システム。
  4. 　前記制御部は、前記刺激部を制御して、環境因子を周期的に変化させるとともに、前記各容器の相互間における前記環境因子の周期の位相をずらすことを特徴とする請求項３に記載の細胞処理システム。
  5. 　前記制御部は、前記環境因子を細胞が同調培養となる範囲内の周期で変化させることを特徴とする請求項４に記載の細胞処理システム。
  6. 　前記刺激部は、光を細胞に照射する照明であり、
    　前記制御部は、細胞が同調培養となる範囲内の周期で前記照明の点灯と消灯を制御し、前記環境因子としての明暗を変化させることを特徴とする請求項５に記載の細胞処理システム。
  7. 　前記容器内の細胞の密度を検出し、前記容器内の細胞の密度が規定値を超える場合に、当該容器内の培地とともに細胞の一部を排出し、この排出後に培地を補充する細胞密度調節装置を備えることを特徴とする請求項６に記載の細胞処理システム。
  8. 　前記制御部は、前記環境因子の変化の１周期の期間をＴｓ、前記容器の個数をｎとしたときに、前記環境因子の変化周期の位相を「Ｔｓ／ｎ」ずつずらすことを特徴とする請求項４ないし７のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
  9. 　前記刺激部は、刺激物質を前記容器内に加えることを特徴とする請求項１に記載の細胞処理システム。
  10. 　前記容器を順次に選択し、選択した前記容器から細胞と培地とを取り出して供給先に送る細胞供給装置を備えることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
  11. 　前記容器を順次に選択し、選択した前記容器から一部の細胞と培地とを取り出して供給先に送る細胞供給装置と
    　一部の細胞と培地とを取り出した前記容器に培地を補充する培地補充部と
    　を備えることを特徴とする請求項３ないし８のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
  12. 　細胞処理装置からの細胞を分析装置に供給する細胞供給方法において、
    　細胞を収容した複数の容器を前記細胞処理装置に準備する準備ステップと、
    　前記各容器内の細胞に対して、前記各容器間でタイミングをずらして刺激を与える刺激ステップと、
    　前記分析装置が分析する特定状態と同じ状態と分析の際に看做せる細胞が収容された前記容器を選択し、選択した前記容器から細胞を取得して前記分析装置に供給する供給ステップと
    　を有することを特徴とする細胞供給方法。
  13. 　前記分析装置から前記細胞処理装置に対して、前記特定状態を指定した細胞の供給を要求する要求ステップを有し、
    　前記供給ステップは、前記要求に応答して、前記要求ステップで指定された前記特定状態と同じ状態と分析の際に看做せる細胞が収容された前記容器を選択して細胞を前記分析装置に供給する
    　ことを特徴とする請求項１２に記載の細胞供給方法。
  14. 　前記刺激ステップにおける前記各容器間の刺激のタイミングのずれは、前記分析装置によって分析する細胞の前記特定状態と同じ状態と看做せる細胞の安定時間以下である
    　ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の細胞供給方法。
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