RU2193594C1 - Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к культивированию микроорганизмов в ферментационных аппаратах на жидких питательных средах, может быть использовано при производстве продуктов микробного синтеза и исследовательской практике. Способ предусматривает порционную подачу питательной среды в первый ферментер после отлива избыточного объема культуральной жидкости. Проводят перемещение культуральной жидкости в каскадном протоке от первого ферментера к последующим с заданным интервалом, причем во всех последующих ферментерах производят полное замещение культуральной жидкости объемом культуральной жидкости из предыдущего ферментера. Управление каскадным протоком осуществляют установкой времени культивирования и паузы между циклами каскадного протока. Способ позволяет разделить ростовые фазы микроорганизмов во времени и пространстве. 1 ил.

Description

Изобретение относится к процессам культивирования микроорганизмов в ферментационных аппаратах на жидких питательных средах и может быть использовано при производстве продуктов микробного синтеза и исследовательской практике.

Известен способ выращивания микроорганизмов в условиях периодического процесса (У. Э. Виестур, М. Ж.Кристапсонс, Е.С.Былинкина, "Культивирование микроорганизмов", Москва, "Пищевая промышленность", 1980 г., с.52).

Указанный способ осуществляют в следующей пооперационной последовательности. В ферментер загружают питательную среду, вносят микроорганизмы и проводят ферментацию до тех пор, пока в среде не накопится максимально возможное количество клеток или продуктов их биосинтеза.

Способу присущи некоторые недостатки. В процессе культивирования микроорганизмы вначале размножаются в условиях избытка питательных веществ, а затем в условиях их недостатка из-за постепенно уменьшающегося количества питательных веществ за время выращивания микроорганизмов. Компоненты питательной среды часто используются неравномерно и некоторые из них могут в процессе ферментации лимитировать рост биомассы. Одновременно в среде накапливаются продукты метаболизма, которые также оказывают отрицательное влияние на конструктивный обмен и физиологию клеток, составляющих единую популяцию.

Периодический процесс культивирования не дает возможности выявить влияние внешних факторов на физиологическое состояние клеток и управлять их развитием. Это объясняется тем, что в культуре, выращиваемой в постоянном объеме питательной среды при периодическом процессе, непрерывно происходят изменения скорости развития клеток, морфологии, а также биохимической и метаболической активности клеток. Клетки в периодической культуре непрерывно находятся в переходном состоянии, и не ясно, какой фактор действует в тот или иной момент их развития.

Известен способ непрерывного выращивания микроорганизмов в ферментационных аппаратах (У.Э.Виестур, М.Ж.Кристапсонс, Е.С.Былинкина, "Культивирование микроорганизмов", Москва, "Пищевая промышленность", 1980 г. , с.53).

Указанный способ основан на постоянном протоке питательной среды через ферментер, при котором одновременно происходит приток свежей питательной среды и отток культуральной жидкости из ферментера. Объем культуральной жидкости в нем остается неизменным. При интенсивном перемешивании культуральной жидкости во всех точках ферментера ее состав остается постоянным, что позволяет поддерживать устойчивое физиологическое состояние и биохимическую активность популяции в заданной фазе культивирования микроорганизмов. При этом управление непрерывным процессом культивирования проводят изменением лимитирующего фактора питательной среды по типу хемостата или турбидостата, которые различаются по способу поддержания культуры в состоянии динамического равновесия.

Очевидно, что стабилизировать одну фазу роста микроорганизмов недостаточно для эффективного управления процессом, так как любое внешнее воздействие оказывает влияние не только на текущую фазу роста микроорганизмов, но и на весь процесс в целом. Это объясняется тем, что процесс протекает в одном объеме ферментера и после внешних воздействий не может быть возвращен в исходное состояние.

Известен отъемно-доливной способ непрерывного культивирования (У.Э. Виестур, М. Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина, "Культивирование микроорганизмов", Москва, "Пищевая промышленность", 1980 г., с.54), при котором в культуральную жидкость, находящуюся в ферментере, с заданным интервалом времени подают питательную среду, при этом объем в ферментере поддерживают на постоянном уровне путем отлива избыточной части культуральной жидкости.

Основным недостатком известного способа является невозможность управления процессом культивирования без нарушений исходно заданных параметров процесса, а также обеспечения полного использования питательной среды, так как при протоке через ферментер питательной среды неопределенная часть ее объема не успеет вступить в реакцию и будет слита из ферментера вместе с продуктом ферментации.

Наиболее близким аналогом является способ культивирования (RU 2031933, 27.03.1995), при котором осуществляют перемещение культуральной жидкости в каскадном протоке по цепи ферментеров.

В известном способе первый из последовательной цепи мини-ферментеров работает в режиме ферментации по заданной программе, рост клеток в котором происходит по классической схеме проведения периодических процессов.

По определению периодический процесс реализует все фазы роста микроорганизмов (лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу). Культивирование микроорганизмов в режиме периодического процесса заканчивается полным потреблением сбалансированных веществ из питательной среды, в связи с чем микроорганизмы на выходе из первого ферментера будут лимитированы по питанию и дальнейший проток культуральной жидкости может быть использован только для исследований одной стационарной фазы роста микроорганизмов, что не соответствует поставленной цели.

Каскадный проток культивационной среды через мини-ферментеры осуществляется с заданной частотой.

Такое управление каскадным протоком не позволяет дифференцировать время культивирования и время разгрузки ферментеров по фазам роста микроорганизмов, что снижает качество управления и не позволяет концентрировать фиксированные участки роста микроорганизмов и оптимизировать разгрузку мини-ферментеров с учетом меняющейся реалогии культуральной жидкости.

Технический результат изобретения заключается в разделении ростовых фаз микроорганизмов в процессе культивирования во времени и пространстве, что создает возможность оперативного внешнего воздействия на каждой из фаз и позволяет обеспечить оптимальные условия для роста микроорганизмов, тем самым повысить качество и выход целевых продуктов.

Технический результат достигают благодаря проведению следующих операций:
1. Рост клеток в первом ферментере осуществляется в режиме хемостата, который по определению предусматривает стабилизацию любой выбранной фазы роста микроорганизмов, что позволяет в условиях каскадного протока распределять и фиксировать в пространстве любые фазы роста микроорганизмов.

2. Каскадный проток осуществляется временным алгоритмом, учитывающим время культивирования в ферментерах и время паузы между циклами каскадного протока. Раздельное управление параметрами каскадного протока обеспечивает полную разгрузку ферментеров и позволяет группировать ферментеры на выбранных фазах роста микроорганизмов.

Поставленная задача достигается тем, что в способе каскадно-проточного культивирования микроорганизмов. предусматривающем порционную подачу питательной среды с заданным интервалом времени в культуральную жидкость, находящуюся в установке для культивирования, и поддержание постоянного объема культуральной жидкости в установке путем отлива ее избыточной части, согласно изобретению процесс культивирования разбивают на фазы, по количеству ферментеров в установке, путем перемещения избыточного объема культуральной жидкости от первого ферментера к последующим с заданным интервалом, причем во всех последующих ферментерах производят полное замещение вытесненного объема культуральной жидкости объемом культуральной жидкости из предыдущего ферментера, при этом каждая из фаз культивирования соответствует определенной фазе роста микроорганизмов.

Способ позволяет реализовать перемещение культуральной жидкости фиксированного объема через цепь ферментеров с заданным интервалом времени, в результате чего исследуемый процесс условно делится по количеству ферментеров на ряд локализованных процессов, каждый из которых определен фиксированной и периодически восстанавливаемой фазой роста микроорганизмов.

Зоны ростовых фаз культивирования микроорганизмов задают временными интервалами алгоритма каскадного протока культуральной жидкости (время культивирования в ферментерах и время паузы между циклами каскадного протока). Так, при увеличении временного интервала происходит увеличение времени культивирования в ферментерах, соответствующие фазы роста микроорганизмов расширяются в пространстве и стремятся к моделированию известного периодического процесса от лаг-фазы до глубокого стационара, а при их уменьшении соответствующие фазы роста микроорганизмов сужаются, моделируя только часть указанного процесса, определенную заданным временным интервалом и расположением ферментера, и стремятся к точке на кривой роста микроорганизмов.

Время паузы между циклами каскадного протока обеспечивает одновременное смещение процессов, протекающих в цепи ферментеров, по кривой роста микроорганизмов. Так, при увеличении указанного времени процессы, протекающие в ферментерах, сжимаются к стационарной фазе роста микроорганизмов, а при его уменьшении - к лаг-фазе. Таким образом, изменение указанными временными параметрами алгоритма каскадного протока культуральной жидкости обеспечивает возможность одновременного доступа к различным ростовым фазам микробиологического процесса и сужает или расширяет ростовые зоны. Например, предложенный способ обеспечивает возможность сконцентрировать все ферментеры в экспоненциальной фазе роста микроорганизмов, или в стационарной фазе, или на участках перехода из одной фазы в другую при одновременной фиксации всех исследуемых ростовых фаз, что не позволяет сделать ни один из известных способов культивирования микроорганизмов.

Предложенный способ культивирования микроорганизмов позволяет развернуть исследуемый процесс в пространстве, фиксировать ростовые фазы и проводить в них необходимые процедурные работы, исследовать результаты внешних воздействий на последующих стадиях процесса при периодическом восстановлении исходного состояния исследуемых фаз роста.

Предложенным способом каскадно-проточного культивирования микроорганизмов были проведены исследования роста дрожжей рода Saccharomyces, которые выращивали на питательной среде, приготовленной из гидролизованного отвара зерна.

На чертеже изображена схема установки, позволяющей реализовать способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов.

Схема содержит ферментеры 1 - 5, емкость 6 с питательной средой, дозатор 7, сливной трубопровод 8 с управляемыми клапанами 9 - 13, емкость 14 для сбора выходного продукта и прибор 15 программного управления.

Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов осуществляют следующим образом.

Пример 1.

Перед началом эксперимента из емкости 6 дозатором 7 в ферментер 1 загружают фиксированный объем питательной среды, вносят инокулюм, например, дрожжей, а на приборе 15 программного управления задают временной интервал, равный времени культивирования дрожжей в ферментерах, например два часа, и производят запуск алгоритма каскадного протока культуральной жидкости.

С запуском программы в ферментере 1 осуществляется процесс выращивания дрожжей продолжительностью в два часа. После истечения заданного времени открывается клапан 9 и из ферментера 1 культуральная жидкость перетекает в ферментер 2, при этом в ферментере 1 остается часть объема культуральной жидкости, фиксированная уровнем сливного трубопровода 8. После разгрузки ферментера 1 клапан 9 закрывается и включается дозатор 7, посредством которого в ферментер 1 поступает очередная порция питательной среды. На этой стадии исследуемого процесса в ферментере 1 воспроизводится первая фаза культивирования дрожжей, определенная временным интервалом в два часа, а в ферментере 2 продолжается рост дрожжей следующего 2-часового цикла, после завершения которого открывается клапан 10, культуральная жидкость из ферментера 2 перетекает в ферментер 3, после чего клапан 10 закрывается и открывается клапан 9, через который культуральная жидкость, находящаяся в ферментере 1, перетекает в ферментер 2 и после разгрузки ферментера 1 в него вновь дозируется очередная порция питательной среды. На этой стадии процесса, в результате проведенных операций в ферментере 1 возобновляется фаза роста дрожжей определенная 2-х часовым циклом, в ферментере 2 возобновляется фаза роста дрожжей, определенная 4-часовым циклом, а в ферментере 3 осуществляется рост дрожжей 6-часового цикла и т.д.

После заполнения всех ферментеров равными объемами культуральной жидкости, согласно алгоритму каскадного протока, ферментер 5 разгружается в емкость 14 для сбора продукта, а цепь ферментеров воспроизводит и фиксирует в пространстве фазы кривой роста дрожжей, определенные приращением 2-часовых интервалов.

Пример 2.

Не останавливая процесс культивирования дрожжей по примеру 1, в алгоритм управления каскадным протоком вводят временную паузу, равную одному часу. После очередной загрузки 1-го ферментера все ферментеры отрабатывали дополнительно один час, при этом в первом ферментере повысилась исходная концентрация клеток, что позволило сдвинуть все процессы, протекающие в ферментерах, в сторону стационарного состояния культивирования дрожжей. Аналогичным образом была показана возможность перемещения ростовых фаз, развернутых в пространстве, и в сторону лаг-фазы. Характеристику роста дрожжей определяли подсчетом клеток в камере Горяева.

В процессе экспериментов по примерам 1, 2 было замечено, что процесс роста дрожжей в первом ферментере-инокуляторе протекал практически не имея лаг-фазы. Это может быть объяснено тем, что условия культивирования и начальная концентрация дрожжей были стабильны, и дрожжи росли по условиям хемостата. Контроль концентрации клеток, распределенных по ростовым фазам, и их морфология на протяжении всего процесса показали высокую воспроизводимость результатов исследований. Процедурные работы, которые проводили на выбранных фазах роста (отбор проб, корректировка рН), не оказывали влияния на процесс в целом, так как при очередном каскадном замещении объемов культуральной жидкости все параметры роста дрожжей возвращались к исходным состояниям.

В результате проведенного эксперимента показана возможность реализации способа каскадно-проточного культивирования микроорганизмов и его преимущества перед известными способами культивирования микроорганизмов, а именно:
- способ позволяет создать систему культивирования микроорганизмов, состоящую из изолированных и периодически обновляемых объемов культуральной жидкости, каждый из которых воспроизводит фиксированную фазу микробиологического процесса, что позволяет одновременно анализировать все фазы процесса от лаг-фазы до фазы глубокого стационара, проводить необходимые процедурные работы на выбранных фазах процесса с периодическим их восстановлением при обновлении объемов в условиях каскадного протока культуральной жидкости;
- фиксация всех фаз развернутого в пространстве микробиологического процесса позволяет оптимизировать процесс именно на тех фазах, где достигается наибольшая эффективность, что значительно упрощает управление процессом и делает его более экономным, так как сокращается время и дорогостоящие материалы;
- распределение рабочего объема культуральной жидкости по локализованным фазам микробиологического процесса позволяет интенсифицировать массообменные процессы, протекающие в каждой из фаз в зависимости от концентрации клеток и субстрата, повысить степень защиты и информативность процесса при культивировании патогенных микроорганизмов.

Предложенный способ применим ко всем видам микроорганизмов и клеткам различных тканей животных или растений, какие только могут расти в погружной культуре.

Claims (1)

1. Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов, предусматривающий порционную подачу питательной среды в первый ферментер после отлива избыточного объема культуральной жидкости, перемещение культуральной жидкости в каскадном протоке от первого ферментера к последующим, причем во всех последующих ферментерах производят полное замещение объема культуральной жидкости объемом культуральной жидкости из предыдущего ферментера, при управлении каскадным протоком, отличающийся тем, что в первом ферментере культивирование микроорганизмов проводят в режиме хемостата, а управление каскадным протоком осуществляют установкой времени культивирования и паузы между циклами каскадного протока.