WO2017194808A1 - Procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de aeromonas salmonicida spp. salmonicida - Google Patents

Procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de aeromonas salmonicida spp. salmonicida Download PDF

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Santiago Fernández González
Ysabel Santos Rodríguez
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Definitions

  • the present invention relates to method and kit for use in the specific detection of Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide in bacterial cultures, pure and mixed, and in fish tissue samples, using a polymerase chain reaction (PCR) procedure in real time with a fluorochrome.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the procedure is applicable in the aquaculture sector for the control of infections in salmonid and non-salmonid fish, as well as for the detection of the pathogen in natural populations.
  • Furunculosis is a bacterial disease caused by a Gram-negative bacterium called Aeromonas salmonicida spp. salmonicide or also known as typical A. salmonicide.
  • Aeromonas salmonicida spp. salmonicide or also known as typical A. salmonicide.
  • the disease has a wide geographical distribution and affects salmonids and non-salmonids of fresh and marine water, both in natural populations and in production farms (Austin and Austin, 2007).
  • Furunculosis is a systemic disease with acute, chronic and subclinical manifestations, which causes large economic losses in the aquaculture sector worldwide (Austin and Austin, 2007).
  • other subspecies of A. salmonicida have been described, such as Aeromonas salmonicida spp.
  • the diagnosis of the disease is usually based on the isolation of the pathogen, from the tissues of the diseased fish, and its identification by conventional microbiological methods that involve the isolation of the pathogen and its identification by morphological, physiological tests. and biochemistry, using classical methods or multi-characterization test systems (Santos et al., 1993. Aquaculture. 116: 111-120). Phenotypic, serological and molecular studies have shown that Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide constitutes a homogeneous group, unlike the other subspecies known as atypical Aeromonas salmonicida (A. salmonicida spp. achromogenes, A. salmonicida spp. masoucida). However, these methods present
  • the identification of A. salmonicide and its detection in diseased fish tissues can also be performed using methods that do not require isolation of the microorganism in pure culture such as the ELISA technique (Hiney et al., 1994. Dis. Aquat. Organ. 19 : 161-167), conventional PCR (Hiney et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1039-1042; Gustafson et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3816-3825; Miyata et al. ., 1996. Aquaculture, 141: 13-24), isothermal nucleic acid amplification (LAMP) (Kulkarni et al., 2009. J Rapid Methods Autom Microbiol.
  • LAMP isothermal nucleic acid amplification
  • Real-time PCR is a sensitive technique that allows quantification of the products generated in the PCR reaction, by fluorescence detection of the generated product (Higuchi et al., 1993. Biotechnology 1 1, 1026-1030). This technique has been widely used for the detection, quantification and identification of Gram-negative pathogenic bacteria that infect fish including A. salmonicida (Balcázar et al., 2007. J. Med. Microbiol., 56: 323-328; Keeling, 2013. J. Fish Dis. 36: 495-503). But none of these procedures allows differentiating between the subspecies of A. salmonicida.
  • Miyata et al. described a pair of primers using as a target a 512 base pair fragment (bp), obtained after random genome amplification (RAPD) of the reference strain ATCC14174 of A. salmonicida spp. salmonicide, using arbitrary sequences of synthetic DNA as reaction primers.
  • the conventional PCR method described by these researchers allows the differentiation of A. salmonicida ssp. salmonicide of the atypical subspecies masoucida and achromogenes.
  • this method is slow, tedious and expensive to require the extraction of DNA from bacterial cultures and the analysis of amplification products by electrophoresis.
  • the present invention relates to a method and kit for the detection, quantification and / or identification of Aeromonas salmonicida spp. salmonicide and, more specifically, for the detection, quantification and / or identification of specific DNA of Aeromonas salmonicida spp. salmonicide either from bacterial cultures, pure or mixed, or from fish tissue samples.
  • the invention is based on the amplification and quantification of DNA by real-time PCR.
  • the proposed method comprises the amplification of a 1 19 bp fragment belonging to a gene encoding an effector protein with serine / threonine kinase activity of the type III secretion system specific to Aeromonas salmonicida spp.
  • Salmonicide Said amplification includes SYBR Green fluorochrome which allows the detection of amplification products.
  • the continuous reading of the fluorescence during the process allows the pathogen to be identified based on the specific fluorescence peak. This procedure does not amplify the DNA of other subspecies of Aeromonas salmonicida, nor the DNA of host fish, being the primers designed highly specific and informative.
  • Aeromonas salmonicida spp. salmonicide from bacterial cultures, pure or mixed, and tissues as well as, their differentiation from the subspecies Aeromonas salmonicida spp. achromogenes and Aeromonas salmonicida spp. masoucida, main causative agents of atypical furunculosis. - The cost and time necessary for the diagnosis of furunculosis is reduced.
  • the detection of PCR products is fast, easy and objective, allowing an easy and fast diagnosis of the infection. It does not require the use of electrophoresis in agarose gels, ultraviolet light, or the use of toxic agents for the detection of the products obtained.
  • a first object of the present invention is a method for the detection, quantification and / or identification of Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide in samples of bacterial, pure and mixed cultures, and in fish tissues comprising the following stages:
  • DNA from a bacterial culture, pure or mixed, or from fish tissues b) Perform a real-time PCR assay on the samples from stage a) using a pair of primers specific for Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide identified by the sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 and a fluorochrome. c) Detect, quantify and / or identify the amplified nucleotide sequences as a result of real-time PCR.
  • An embodiment of this invention is the process of the invention, where primers having an identity of 75% with respect to the primers identified by the sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 are used.
  • a preferred embodiment is a process of the invention. where said identity is 85%.
  • a more preferred embodiment is a process of the invention where said identity is 95% and an even more preferred embodiment is a process of the invention where said identity is 99%.
  • the percentage of identity in a given sequence is calculated taking into account that 99% identity means that 99% residues of the complete sequence of the primers identified by the sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 are identical to the residues of the determined sequence.
  • Another embodiment of the invention is a kit for detecting, quantifying and / or identifying Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide in a real-time PCR assay, comprising:
  • the positive control is present in the kit to determine the correct functioning of the kit components.
  • a preferred embodiment is the kit of the invention where the fluorochrome is SYBR Green.
  • a preferred embodiment is the kit of the invention where the positive control is A. salmonicida spp. Salmonicide of the reference strain ATCC33658.
  • Another preferred embodiment is a kit of the invention wherein said deoxynucleotides triphosphate are dATP, dCTP, dGTP and dTTP at a final concentration 200 ⁇ .
  • reaction buffer is 50 mM potassium chloride, 10 mM TrisHCI pH 9.0 at room temperature, 2.5 mM MgCl 2, 20mM (NH4) 2 S0 4, 2 , 5 units of polymerase per 25 ⁇ _ reaction.
  • Figure 1 Dissociation curve of amplification products obtained using bacterial suspensions of A. salmonicida spp. Salmonicide showing a melting temperature value of 80.5-81.0 ° C, specific for the amplified 1 19 bp fragment.
  • the melting temperature is indicated on the abscissa axis and the derivative of the relative fluorescence units on the ordinate axis.
  • Specific primers were designed based on the 3735 bp sequence of the aopO gene of A. salmonicida spp. Salmonicide A449, located in plasmid pAsa5 (GenBank Accession no.DQ386862.1) which codes for a serine protein / threonine kinase type III of the virulence-linked secretion system (Dacanay et al., 2006).
  • the Pick Primer and Primer-BLAST tools of the Information Service of the National Biotechnology Center were used.
  • Bacterial infection was performed through an intraperitoneal injection to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (10.0 ⁇ 0.1 grams) with a bacterial suspension of A salmonicide SK181 / 12, SK164 / 12, MT416 and T096 7.1, following the methodology previously described (Santos et al., 1991.J Appl Ichthyol 7, 160-167).
  • the fish were anesthetized by immersion in tricaine methane sulphonate (MS-222, Sigma) (60mgL "1 , Neiffer & Stamper, 2009) and injected intraperitoneally 0, 1 mL of bacterial suspension containing between 10 6 and 10 9 cells / mL (10 fish per dose) During the experiment, the fish were kept in a 100 liter tank with aerated fresh water. The dying fish were sacrificed by an overdose of anesthetics and blood samples were extracted aseptically, spleen and kidney for analysis using culture-based methods and bacterial characterization and real-time PCR analysis with SYBR Green.
  • bacterial suspensions were prepared in sterile water free of nucleases adjusted to an approximate final concentration of between 3 x 10 9 and 3 x 10 12 cells / mL (tube 7 of the MacFarland scale) .
  • the number of colony forming units (CFU) was determined by the plate counting method, using Tryptic Soy agar medium supplemented with 1% NaCl (TSA-1) and the colonies of bacteria produced were counted.
  • tissues From healthy fish (sacrificed by anesthetic overdose), tissues (kidney, spleen and blood) were obtained, homogenized with saline solution at a final concentration of 25% weight / volume, were inoculated with an equal volume of bacterial suspensions of the reference strain of Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide ATCC33658 containing between 1.5 x 10 9 and 1.5 x 10 2 cells / mL and incubated for one hour at room temperature. The number of colony forming units (CFU) was determined by the plate count method. Homogenized non-inoculated tissues were also prepared for use as a negative control. The homogenates were used in the PCR reaction with or without prior DNA extraction.
  • CFU colony forming units
  • tissues of 40 cultured rainbow trout (10g ⁇ 1g) and 40 turbot (45g ⁇ 5g) with and without clinical symptoms of furunculosis and 20 turbot with symptoms of tenacibaculosis were processed as described above. of being used in real-time PCR assays and microbiological methods.
  • DNA was obtained from tissue homogenates using Dynabeads® DNA Direct TM Universal (Dynal).
  • the DNA obtained from bacterial cultures and tissue homogenates were stored at -20 ° C until use.
  • Example 4 Amplification of DNA fragments from pure and mixed cultures.
  • reaction mixture was used in the amplification: 12.5 pL of SYBR Green qPCR Master Mix Maximum (2x), non ROX, (Thermo Scientifics), 1 pL of each primer (SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2) (400 nmoles), 5 ⁇ _ of the problem bacterial suspension or 2 ⁇ _ of purified bacterial DNA.
  • the reaction volume was completed with sterile distilled water to 25 ⁇ _.
  • the reaction mixture was subjected to amplification in a MiniOpticon thermocycler for real-time PCR, with the CFX Manager TM detection software (BioRad), under the following conditions: an initial incubation step at 95 ° C for 15 min, followed by 35 cycles consisting of a denaturation at 95 ° C for 30 seconds, and a hybridization at 62 ° C for 30 seconds.
  • the analysis of the melting curves of the amplified products was carried out by gradually increasing the temperature from 60 ° C to 100 ° C at intervals of 0.5 ° C for 10 seconds and continuous reading of the fluorescence to determine the Tm of the specific amplification product for A. salmonicida spp. Salmonicide In all positive samples for Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide was detected an amplification peak with a melting temperature of 80.5-81.0 ° C ( Figure 1).
  • Example 5 Amplification of DNA fragments from fish tissues.
  • reaction mixture 12.5 ⁇ _ of SYBR Maximum Green qPCR Master Mix (2x) (Thermo Scientifics), 1 ⁇ _ of each primer (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) (concentration 400 nm end) and 2-5 ⁇ _ of DNA extracted.
  • the reaction volume was completed with sterile distilled water to 25 ⁇ _.
  • the reaction mixture was subjected to amplification in a MiniOpticon thermocycler for real-time PCR, with the CFX Manager TM detection software (BioRad), under the following conditions: a first incubation step at 95 ° C for 5 min, followed by 35 cycles consisting of a denaturation at 95 ° C for 1 minute, hybridization at 62 ° C for 30 seconds.
  • the analysis of the melting curves of the amplified products was carried out by gradually increasing the temperature from 65 ° C to 95 ° C at intervals of 0.5 ° C for 10 seconds and continuous reading of the fluorescence to determine the Tm of the specific amplification product for Aeromonas salmonicida spp.
  • Example 6 Specificity and sensitivity of real-time PCR with SYBR Green.
  • Aeromonas salmonicida spp. salmonicide 40 strains
  • Aeromonas sobria 2
  • Aeromonas caviae 2
  • Aeromonas bestiarum 1
  • Aeromonas hydrophila 2
  • Aeromonas media 1
  • Aeromonas allosaccharophila 1)
  • Aeromonas popoffii 1
  • Aeromonas simiae 1
  • Aeromonas trota 1
  • Aeromonas eucrenophila 1
  • Aeromonas jandeii 1
  • Aeromonas pisc ⁇ cola 2).
  • the aopO gene was detected in all strains of Aeromonas salmonicida spp. Salmonicide, when bacterial suspensions were used directly or DNA extracted from them.
  • the melting curve showed a single peak with an average Tm value between 80.5 and 81.0 ° C.
  • No amplification was obtained when bacterial suspensions or DNA extracted from atypical subspecies (Aeromonas salmonicida spp. Achromogenes, Aeromonas salmonicida spp. Masoucida) ( Figure 3) or other non-taxonomically related bacterial species were used.

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Abstract

La presente invención es un procedimiento para detectar, cuantificar y/o identificar Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en un ensayo de PCR en tiempo real. El procedimiento comprende realizar un ensayo de PCR en tiempo real en muestras de cultivos bacterianos, puros o mixtos, o en ADN aislado de cultivos bacterianos, puros o mixtos o en tejidos de peces, usando una pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida y detectar, cuantificar e identificar las secuencias nucleotídicas amplificadas. La invención también proporciona un kit para detectar, cuantificar e identificar Aeromonas salmonicida spp. salmonicida que comprende los cebadores mencionados anteriormente, fragmentos de ADN control, desoxinucleótidos trifosfato, tampón de reacción y manual de instrucciones.

Description

DESCRIPCIÓN
PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y/O IDENTIFICACIÓN DE
AEROMONAS SALMONICIDA SPP. SALMONICIDA
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimiento y kit para su utilización en la detección específica de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en cultivos bacterianos, puros y mixtos, y en muestras de tejidos de peces, mediante un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con un fluorocromo. El procedimiento es de aplicación en el sector de la acuicultura para el control de infecciones en peces salmónidos y no salmónidos, así como para la detección del patógeno en poblaciones naturales.
ESTADO DE LA TÉCNICA La furunculosis clásica es una enfermedad bacteriana causada por una bacteria Gram-negativa denominada Aeromonas salmonicida spp. salmonicida o también conocida como A. salmonicida típica. La enfermedad presenta una amplia distribución geográfica y afecta a peces salmónidos y no salmónidos de agua dulce y marina, tanto en poblaciones naturales como en granjas de producción (Austin y Austin, 2007). La furunculosis es una enfermedad sistémica con manifestaciones aguda, crónica y subclínica, que causa grandes pérdidas económicas en el sector de la acuicultura a nivel mundial (Austin y Austin, 2007). Sin embargo, se han descrito otras subespecies de A. salmonicida, como Aeromonas salmonicida spp. achromogenes, Aeromonas salmonicida spp. masoucida y Aeromonas salmonicida spp. smithia que también son capaces de afectar a una gran variedad de especies de peces, produciendo furunculosis atípica. Los signos clínicos de las furunculosis causadas por las subespecies típicas y atípicas de A. salmonicida en los peces afectados son muy similares, dificultando el diagnóstico presuntivo basado en la clínica.
Debido a esto, el diagnóstico de la enfermedad se basa habitualmente en el aislamiento del agente patógeno, a partir de tejidos de los peces enfermos, y su identificación mediante métodos microbiológicos convencionales que implican el aislamiento del agente patógeno y su identificación mediante pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas, empleando métodos clásicos o sistemas multiprueba de caracterización (Santos et al., 1993. Aquaculture. 116: 111- 120). Los estudios fenotípicos, serológicos y moleculares han demostrado que Aeromonas salmonicida spp. salmonicida constituye un grupo homogéneo, a diferencia de las restantes subespecies conocidas como Aeromonas salmonicida atípicas (A. salmonicida spp. achromogenes, A. salmonicida spp. masoucida). Sin embargo, estos métodos presentan
i limitaciones importantes como son: i) lento crecimiento de la bacteria y ii) dificultad para distinguir entre las subespecies de Aeromonas salmonicida en base a caracteres fenotípicos.
La identificación de A. salmonicida y su detección en tejidos de peces enfermos también puede realizarse utilizando métodos que no requieran el aislamiento del microorganismo en cultivo puro como son la técnica de ELISA (Hiney et al., 1994. Dis. Aquat. Organ. 19: 161-167), PCR convencional (Hiney et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1039-1042; Gustafson et al., 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3816-3825; Miyata et al., 1996. Aquaculture, 141 : 13-24), amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP) (Kulkarni et al., 2009. J Rapid Methods Autom Microbiol. 17: 476-489), PCR múltiple (mPCR) (Altinok et al., 2008. Vet. Microbiol. 131 :332-338; Onuk et al., 2010. J Vet Sci. 11 (3): 235-241 ; Kulkarni et al., 2010. Aquac. Res. 41 , 1533-1538), mPCR combinada con microarrays (González et al., 2004. J Clin Microbiol., 42: 1414-1419). Sin embargo, ninguno de los métodos descritos hasta el momento permiten la diferenciación de Aeromonas salmonicida a nivel de subespecies.
La PCR en tiempo real es una técnica sensible que permite la cuantificación de los productos generados en la reacción de PCR, mediante la detección por fluorescencia del producto generado (Higuchi et al., 1993. Biotechnology 1 1 , 1026-1030). Esta técnica ha sido ampliamente utilizada para la detección, cuantificación e identificación de bacterias patógenas Gram-negativas que infectan a peces incluyendo A. salmonicida (Balcázar et al., 2007. J. Med. Microbiol., 56: 323-328; Keeling, 2013. J. Fish Dis. 36: 495-503). Pero ninguno de estos procedimientos permite diferenciar entre las subespecies de A. salmonicida.
En 1996, Miyata et al. describieron una pareja de cebadores utilizando como diana un fragmento de 512 pares de bases (pb), obtenido tras la amplificación aleatoria del genoma (RAPD) de la cepa de referencia ATCC14174 de A. salmonicida spp. salmonicida, utilizando como cebadores de la reacción secuencias arbitrarias de ADN sintético. El método de PCR convencional descrito por estos investigadores permite la diferenciación de A. salmonicida ssp. salmonicida de las subespecies atípicas masoucida y achromogenes. Sin embargo, este método es lento, tedioso y costoso al requerir la extracción del ADN a partir de los cultivos bacterianos y el análisis de los productos de amplificación mediante electroforesis. Además, la secuencia diana descrita por Miyata et al. (1996) no tiene una función conocida, no está depositada en GenBank y se desconoce si se trata de una secuencia de copia única o múltiple, lo cual dificulta el diseño de otros procedimientos de diagnóstico basados en PCR no convencional. En 2014, otros autores proponen un método de diagnóstico para A. salmonicida spp. salmonicida basado en la detección de producto final (CN 104357570), mediante amplificación isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP), utilizando tres parejas de cebadores. Sin embargo, este método cuenta con una especificidad baja ya que, no es capaz de detectar niveles bajos de ADN o ADN de baja calidad (Fukuta et al., 2003. Arch. Virol. 148: 1713-1720; Kubota et al., 2008. Phytopathology 98:1045-1051). Sumado a esto, la técnica LAMP precisa la confirmación de los resultados mediante métodos espectrofotométricos o de electroforesis, lo que incrementa el coste y tiempo necesario para el diagnóstico.
Todo lo expuesto pone de manifiesto la necesidad de desarrollar un procedimiento específico, sensible, rápido y barato para la identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en muestras de peces así como, para su diferenciación de las especies que producen la furunculosis atípica. Un procedimiento que comprende la realización de una PCR en tiempo real con un fluorocromo junto a la curva de fusión para la identificación del patógeno de peces A. salmonicida spp. salmonicida, sería un procedimiento adecuado para alcanzar este fin.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento y kit para la detección, cuantificación y/o identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida y, más concretamente, para la detección, cuantificación y/o identificación de ADN específico de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida o bien, a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, o bien a partir de muestras de tejidos de peces. La invención se basa en la amplificación y cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real. El procedimiento propuesto comprende la amplificación de un fragmento de 1 19 pb perteneciente a un gen que codifica una proteína efectora con actividad serina/treonina quinasa del sistema de secreción Tipo III específica de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida. En dicha amplificación se incluye el fluorocromo SYBR Green que permite la detección de los productos de la amplificación. La lectura continua de la fluorescencia durante el proceso permite identificar al patógeno en base al pico de fluorescencia específico. Este procedimiento no amplifica el ADN de otras subespecies de Aeromonas salmonicida, ni el ADN de peces hospedadores, siendo los cebadores diseñados altamente específicos e informativos.
La técnica propuesta es más sensible y específica que los métodos moleculares descritos hasta la fecha y presenta las siguientes ventajas:
La identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, y de tejidos así como, su diferenciación de las subespecies Aeromonas salmonicida spp. achromogenes y Aeromonas salmonicida spp. masoucida, principales agentes causales de furunculosis atípica. - Se reduce el coste y tiempo necesario para el diagnóstico de la furunculosis.
La detección de los productos de PCR es rápida, fácil y objetiva, permitiendo un fácil y rápido diagnóstico de la infección. No requiere utilizar electroforesis en geles de agarosa, luz ultravioleta, ni el uso de agentes tóxicos para la detección de los productos obtenidos.
- Gracias al uso de la PCR en tiempo real, donde no se requiere la manipulación de los productos de PCR al final de la amplificación, se disminuye el riesgo de contaminación. - Permite la monitorización de la respuesta a los diversos tratamientos así como, la detección temprana de recidivas
Es susceptible de ser automatizado.
Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en muestras de cultivos bacterianos, puros y mixtos, y en tejidos de peces que comprende las siguientes etapas:
a) Aislar muestras de: i. Cultivo bacteriano, puro o mixto o,
¡i. ADN de un cultivo bacteriano, puro o mixto, o de tejidos de peces b) Realizar un ensayo de PCR en tiempo real sobre las muestras de la etapa a) utilizando una pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 y un fluorocromo. c) Detectar, cuantificar y/o identificar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de la PCR en tiempo real.
Una realización de esta invención es el procedimiento de la invención, donde se utilizan cebadores que tienen una identidad del 75% respecto a los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Una realización preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 85%. Una realización más preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 95% y una realización aún más preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 99%.
En la presente solicitud, el porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 99% de identidad significa que un 99% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada. Otra realización de la invención es un kit para detectar, cuantificar y/o identificar Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en un ensayo de PCR en tiempo real, que comprende:
a) La pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, b) Un fluorocromo, c) Desoxinucleotidos trifosfato, d) Tampón de reacción, e) Un control positivo, f) Manual de instrucciones que detalla el procedimiento a seguir.
El control positivo está presente en el kit para permitir determinar el correcto funcionamiento de los componentes del kit.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el fluorocromo es SYBR Green.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el control positivo es ADN de A. salmonicida spp. salmonicida de la cepa de referencia ATCC33658.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dichos desoxinucleotidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP a una concentración final 200 μΜ.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dicho tampón de reacción es 50 mM de cloruro de potasio, 10 mM TrisHCI pH 9,0 a temperatura ambiente, 2,5 mM de MgCI2, 20mM (NH4)2S04, 2,5 unidades de polimerasa por 25 μΙ_ de reacción.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Curva de disociación de los productos de amplificación obtenidos utilizando suspensiones bacterianas de A. salmonicida spp. salmonicida que muestra un valor de temperatura de fusión de 80,5-81 ,0°C, específica para el fragmento de 1 19 pb amplificado.
Figura 2. Curvas de disociación obtenidas utilizando ADN extraído a partir de tejidos infectados con suspensiones de A. salmonicida spp. salmonicida de diferentes concentraciones (2 x 109 hasta 2 x 102 células/mL) que muestra el producto de amplificación característico de la subespecie salmonicida (Tm=80,5-81 ,0°C). En el eje de abscisas se indica la temperatura de fusión y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia relativa.
Figura 3. Curvas de disociación obtenidas utilizando suspensiones bacterianas de A. salmonicida típica y atípicas que muestra la ausencia del producto de amplificación característico de la subespecie salmonicida (Tm=80,5-81 ,0°C) en las subespecies atípicas (A salmonicida spp. achromogenes, y A. salmonicida spp. masoucida). En el eje de abscisas se indica la temperatura de fusión y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia relativa.
Figura 4. Recta de calibrado obtenida con el protocolo de PCR cuantitativa descrito utilizando como fuente de ADN suspensiones de A. salmonicida spp. salmonicida con diferentes concentraciones (2 x 109 hasta 2 x 102 células/mL). Coeficiente de correlación (R2)=0,992. Figura 5. Recta de calibrado obtenida con el protocolo de PCR cuantitativa descrito utilizando ADN obtenido a partir de tejidos infectados con diferentes concentraciones de A. salmonicida spp. salmonicida. Coeficiente de correlación (R2)=0,981
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo 1. Diseño de cebadores específicos
Los cebadores específicos se diseñaron en base a la secuencia de 3735 pb del gen aopO de A. salmonicida spp. salmonicida A449, localizado en el plásmido pAsa5 (GenBank Accession no.DQ386862.1) el cual codifica para una proteína serina/treonina kinasa de tipo III del sistema de secreción ligada a la virulencia (Dacanay et al., 2006). Para el diseño de los cebadores y para testar su especificidad, se utilizaron las herramientas Pick Primer y Primer-BLAST, del Servicio de Información del Centro Nacional de Biotecnología. Para la evaluación de las propiedades de los cebadores y para optimizar las condiciones de la PCR en tiempo real se utilizó IDT SciTools Web Tools (Integrated DNA Technologies, Inc.). Se desarrollaron el cebador directo, Asal-aopO-F\N y el cebador inverso Asal-aopO-RV (Tabla 1). La especificidad de los cebadores se evaluó usando la herramienta BLAST para alineamiento frente a otras secuencias recogidas en la base de datos GenBank. Estos cebadores franquean un fragmento interno de 119 pb del gen aopO. Tabla 1. Secuencias de los cebadores específicos diseñados para A. salmonicida spp. salmonicida.
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Ejemplo 2. Ensayos de patogenicidad
La infección bacteriana se realizó a través de una inyección intraperitoneal a juveniles de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) (10,0 ±0, 1 gramos) con una suspensión bacteriana de A salmonicida SK181/12, SK164/12, MT416 y T096 7.1 , siguiendo la metodología previamente descrita (Santos et al., 1991.J Appl Ichthyol 7, 160-167). En resumen, los peces fueron anestesiados por inmersión en tricaina metano sulfonato (MS-222, Sigma) (60mgL"1 , Neiffer & Stamper, 2009) y se les inyectó intraperitonealmente 0, 1 mL de suspensión bacteriana que contenía entre 106 y 109 células/mL (10 peces por dosis). Durante el experimento, los peces fueron mantenidos en un tanque de 100 litros con agua dulce aireada. Los peces moribundos fueron sacrificados mediante una sobredosis de anestésicos y se extrajeron en condiciones asépticas muestras de sangre, bazo y riñon para su análisis mediante métodos basados en cultivo y caracterización bacteriana y análisis de PCR en tiempo real con SYBR Green.
Ejemplo 3. Aislamiento de ADN a partir de cultivos bacterianos y/o tejidos de peces
A partir de cultivos puros y mixtos de los microorganismos problema, se prepararon suspensiones bacterianas en agua estéril libre de nucleasas ajustadas a una concentración final aproximada de entre 3 x 109 y 3 x 1012 células/mL (tubo 7 de la escala MacFarland). El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó mediante el método de recuento en placa, usando medio agar Soja Tríptica suplementado con 1 % de NaCI (TSA-1) y se contaron las colonias de bacterias producidas.
El ADN de cultivos bacterianos, puros y mixtos, se obtuvo usando InstaGene Matrix (BioRad).
A partir de peces sanos (sacrificados por sobredosis de anestésico), se obtuvieron tejidos (riñon, bazo y sangre), se homogenizaron con solución salina a una concentración final del 25% peso/volumen, se inocularon con un volumen igual de suspensiones bacterianas de la cepa de referencia de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida ATCC33658 conteniendo entre 1 ,5 x 109 y 1 , 5x 102 células/mL y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó mediante el método de recuento en placa. Se prepararon también homogenizados de tejidos no inoculados para utilizarlos como control negativo. Los homogenizados se utilizaron en la reacción de PCR con o sin extracción previa de ADN.
A partir de tejidos obtenidos a partir de peces infectados experimentalmente con A. salmonicida spp salmonicida (cepas SK181/12, SK164/12, MT416 y T096 7.1), se prepararon homogenizados en solución salina como se describió en el párrafo anterior. Los homogenizados obtenidos se utilizaron en la reacción de amplificación directamente o previa extracción del ADN.
Además, para la validación y comparación del procedimiento, tejidos de 40 truchas arcoíris cultivadas (10g ±1g) y 40 rodaballos (45g ± 5g) con y sin síntomas clínicos de furunculosis y 20 rodaballos con síntomas de tenacibaculosis fueron procesados como se describió anteriormente antes de ser utilizados en los ensayos de PCR en tiempo real y métodos microbiológicos.
El ADN se obtuvo a partir de los homogenizados de tejidos utilizando Dynabeads® DNA Direct™ Universal (Dynal).
El ADN obtenido a partir de cultivos bacterianos y de homogenizados de tejidos se almacenaron a -20°C hasta su uso. Ejemplo 4. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de cultivos puros y mixtos.
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 pL de Máxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x), no ROX, (Thermo Scientifics), 1 pL de cada cebador (SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2) (400 nmoles), 5 μΙ_ de la suspensión bacteriana problema o 2 μΙ_ de ADN bacteriano purificado. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25μΙ_.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX Manager™ (BioRad), en las siguientes condiciones: un paso inicial de incubación a 95°C durante 15 min, seguido de 35 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, y una hibridación a 62°C durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 60°C a 100°C en intervalos de 0,5°C durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar la Tm del producto de amplificación específico para A. salmonicida spp. salmonicida. En todas las muestras positivas para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida se detectó un pico de amplificación con una temperatura de fusión de 80,5-81 ,0°C (Figura 1). Estos resultados indican que la técnica de PCR y los cebadores descritos en la presente invención, permiten un diagnóstico sensible, rápido y económico de la furunculosis típica.
Ejemplo 5. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de tejidos de peces.
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 μΙ_ de Máxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Thermo Scientifics), 1 μΙ_ de cada cebador (SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2) (concentración final de 400 nm) y 2-5 μΙ_ de ADN extraído. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25μΙ_.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX Manager™ (BioRad), en las siguientes condiciones: un primer paso de incubación a 95°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, hibridación a 62°C durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 65°C a 95°C en intervalos de 0,5°C durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar la Tm del producto de amplificación específico para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida. En todas las muestras de tejido analizadas, la presencia de un pico de amplificación con una Tm de 80,5- 81 ,0°C (Figura 2), indicó la presencia de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en el tejido del pez infectado. La bacteria se detectó en todas las muestras de peces que mostraron síntomas clínicos de furunculosis. No se obtuvo amplificación con muestras de ADN de tejidos de peces sanos o infectados con otras especies bacterianas. Estos resultados indican que la técnica de PCR cuantitativa y los cebadores descritos en la presente invención pueden ser empleados como un método de diagnóstico utilizando los tejidos de peces enfermos como fuente de ADN.
Ejemplo 6. Especificidad y sensibilidad de la PCR en tiempo real con SYBR Green.
La especificidad del ensayo de la PCR en tiempo real y la existencia de amplificaciones cruzadas fueron evaluadas utilizando una muestra de ADN de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida (40 cepas) y varias bacterias no diana incluyendo subespecies atípicas de Aeromonas salmonicida (Aeromonas salmonicida spp. achromogenes (n=3), Aeromonas salmonicida spp. masoucida (n=1) y Aeromonas salmonicida ssp. pectinolytica (n=2)) y otras especies de Aeromonas como Aeromonas sobria (n=2), Aeromonas caviae (n=2), Aeromonas bestiarum (n=1), Aeromonas hydrophila (n=2), Aeromonas media (n=1), Aeromonas allosaccharophila (n=1), Aeromonas popoffii (n=1), Aeromonas simiae (n=1), Aeromonas trota (n=1), Aeromonas eucrenophila (n=1), Aeromonas veronii (n=1), Aeromonas molluscorum (n=1), Aeromonas jandeii (n=1), Aeromonas encheleia (n=1), y Aeromonas piscícola (n=2). Además, se incluyeron otras bacterias representativas de especies patógenas de peces no relacionadas pertenecientes a los géneros Tenacibaculum (n=4), Flavobacterium (n=2), Yersinia (n=1), Vibrio (n=5), Listonella (n=2), Edwarsiella (n=2), Streptococcus (n=2), Vagococcus (n=1), Lactococcus (n=2) y Renibacterium (n=1) que afectan a peces de agua dulce y salada.
En las PCR en tiempo real realizadas se detectó el gen aopO en todas las cepas de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida, cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas directamente o el ADN extraído a partir de ellas. La curva de fusión mostró un único pico con un valor Tm medio de entre 80,5 y 81 ,0°C. No se obtuvo amplificación cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas o el ADN extraído de subespecies atípicas (Aeromonas salmonicida spp. achromogenes, Aeromonas salmonicida spp. masoucida) (Figura 3) o de otras especies bacterianas no relacionadas taxonómicamente.
Para el ensayo de sensibilidad, tanto las suspensiones bacterianas (con y sin previa extracción de ADN) como el ADN de tejidos de peces infectados, fueron utilizados para generar una curva estándar usada para la cuantificacion de las muestras desconocidas. Se preparó un gráfico representando los valores Ct frente al log 0 de ADN o concentración bacteriana. La eficiencia de los ensayos de la PCR en tiempo real se calculó con la pendiente de la recta de acuerdo con la ecuación E=10(" m)-1. La linealidad de la curva de calibración se expresó como coeficiente de correlación (R2). Las Figura 4 y 5 muestran las rectas de calibrado obtenidas utilizando ADN bacteriano o ADN obtenido a partir de tejidos, respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la detectar, cuantificar y/o identificar Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en un único ensayo de PCR en tiempo real que comprende: a. Aislar muestras de: i. Cultivo bacteriano, puro o mixto, o,
¡i. ADN de un cultivo bacteriano, puro o mixto, o de tejidos de peces b. Realizar dicho ensayo de PCR en tiempo real sobre las muestras de la etapa a) utilizando una pareja de cebadores específicos para Aeromonas salmonicida spp. salmonicida identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. c. Detectar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de dicha
PCR en tiempo real.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 , donde se utilizan cebadores que tienen una identidad del 75% respecto a los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 85%.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 95%.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 99%.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 a 5 en el que la temperatura de fusión del producto de amplificación obtenido mediante la PCR en tiempo real está comprendida entre 80,5°C y 81 ,0°C
7. Kit para la detección, cuantificación y/o identificación de Aeromonas salmonicida spp. salmonicida en un único ensayo de PCR en tiempo real, que comprende: a. Los cebadores específicos identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. b. Un fluorocromo c. Control positivo d. Desoxinucleótidos trifosfato, e. Tampón de reacción f. Manual de instrucciones que detalla el procedimiento a seguir.
8. Kit según la reivindicación 7, donde el fluorocromo se selecciona de la lista que consiste en: FAM, DABCYL, CY-3, JOE, VIC, CY-5, TAMRA, SYBR Green, ROX, Rojo de Texas.
9. Kit según la reivindicación 8, donde el fluorocromo es SYBR Green.
10. Kit según la reivindicación 7 a 9 donde los desoxinucleotidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP en una concentración final de 200 μΜ.
11. Kit según una de las reivindicaciones 7 a 10, donde dicho tampón de reacción es 50 mM de cloruro de potasio, 10 mM TrisHCI pH 9,0 a temperatura ambiente, 2,5 mM de MgCI2, 20mM (NH4)2S04, 2,5 unidades de polimerasa por 25 μΙ_ de reacción).
12. Kit según una de las reivindicaciones 7 a 11 , donde el control positivo es ADN de A. salmonicida spp. salmonicida de la cepa de referencia ATCC33658.
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