ES2697949A1 - Procedimiento para la deteccion, cuantificacion e identificacion de tenacibaculum maritimum - Google Patents

Procedimiento para la deteccion, cuantificacion e identificacion de tenacibaculum maritimum Download PDF

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Abstract

La presente invención es un procedimiento para detectar, cuantificar y/o identificar el patógeno Tenacibaculum maritimum en un ensayo de PCR en tiempo real. El procedimiento comprende la realización de un ensayo de PCR en tiempo real utilizando muestras de cultivos bacterianos, puros o mixtos, o en ADN aislado a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, de tejidos o moco epidérmico de peces, o de agua de mar, usando para ello, una pareja de cebadores específicos para Tenacibaculum maritimum y detectar, cuantificar e identificar las secuencias nucleotidicas amplificadas. La invención también proporciona un kit para detectar, cuantificar e identificar Tenacibaculum maritimum que comprende los cebadores mencionados anteriormente, fragmentos de ADN control, desoxinucleótidos trifosfato, tampón de reacción y manual de instrucciones.

Description

DESCRIPCIÓN
PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN, CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE TENACIBACULUM MARITIMUM.
SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento y kit para la detección específica de Tenacibaculum maritimum en cultivos bacterianos, puros y mixtos, en muestras de tejidos de peces, de moco epidérmico y en muestras de agua de mar, mediante un procedimiento basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con un fluorocromo. El procedimiento es de aplicación en el sector de la acuicultura y del diagnóstico veterinario para el control de infecciones en especies de peces de agua marina, así como para la detección del patógeno en poblaciones naturales y en muestras de agua.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La tenacibaculosis marina es una enfermedad ulcerativa que afecta a una gran variedad de peces de gran valor comercial (rodaballo, lenguado, lubina, dorada, etc.) en todo el mundo (Austin y Austin, 2016, 6th ed. Springer-Praxis, Chichester). La enfermedad presenta una amplia distribución geográfica, produciendo elevadas pérdidas económicas en Europa, Japón y Norte América. La tenacibaculosis se caracteriza por la presencia de erosiones y úlceras en la piel de distintas zonas del cuerpo de los peces, hemorragias en la mandíbula y degradación de los tejidos inter-radiales de las aletas caudal y marginal (Austin y Austin, 2016; Pazos, 1997. Tesis doctoral. Santiago de Compostela Santos et al., 1999, Ic Es Identification Leaflets for diseases and parasites of fish and shellfish N°55, ICES, Denmark, pp:1-6). Tenacibaculum maritimum está considerado como el principal agente causal de la tenacibaculosis, en cuanto a mortalidad, en la mayor parte de especies de cultivo y peces salvajes. Sin embargo, en los últimos años se han detectado nuevas especies de bacterias filamentosas pertenecientes al género Tenacibaculum, como Tenacibaculum gallaicum, Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum discolor y Tenacibaculum dicentrarchi, que se han aislado como agentes causales de mortalidad en diferentes especies de peces marinos que mostraban signos de tenacibaculosis (Piñeiro-Vidal et al., 2008a, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
58:21-25. Piñeiro-Vidal et al., 2008b. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58:881-885. Piñeiro-Vidal et al., 2012 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62:425-429). La sintomatología de la tenacibaculosis causada por las diferentes especies de Tenacibaculum son muy similares, dificultando el diagnóstico presuntivo basado en la observación de los signos clínicos y lesiones macroscópicas. Por ello, para el diagnóstico confirmativo de la enfermedad, es necesario el aislamiento del agente patógeno a partir de tejidos de los peces enfermos, y su identificación mediante técnicas microbiológicas clásicas o sistemas multi-prueba de caracterización (Piñeiro-Vidal et al., 2008a, Piñeiro-Vidal et al., 2008b. Piñeiro-Vidal et al., 2012). Sin embargo, estos métodos presentan limitaciones, debido al lento crecimiento de la bacteria y la no diferenciación de las especies de Tenacibaculum en base a caracteres fenotípicos.
Para la identificación de Tenacibaculum maritimum se han utilizado técnicas serológicas como la aglutinación en portaobjetos, sin embargo, esta técnica no es útil para la identificación de este patógeno, debido a la capacidad de auto-aglutinación de algunas cepas (Pazos, 1997). Otras técnicas que se han utilizado para la identificación de cultivos puros de Tenacibaculum maritimum son: PCR convencional simple (Toyama et al., 1996. Fish Pathol. 31:25-31; Bader y Shotts, 1998. J. Aquat. Anim. Health. 10:311 — 319) o múltiple (Castro et al., 2014. Int. Microbiol. 17:111-117); PCR-ELISA (Wilson et al., 2002. J. Microbiol. Methods. 51(2):163-70); PCR con transcriptasa inversa-Ensayo de hibridación enzimática (RT-PCR-EHA) (Wilson y Carson, 2003. Dis. Aquat. Organ. 54:127-134); micro-arrays de ADN (Warsen et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70(7):4216-4221), análisis de ácidos grasos (Piñeiro-Vidal et al., 2008. Lett. Appl. Microbiol. 46(5):548-54) y espectrometría de masas MALDI-TOF (Fernández-Álvarez et al., 2017. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101(13):5377-5390). Sin embargo, todas estas técnicas requieren el aislamiento del microorganismo, lo que ralentiza y encarece el diagnóstico. Alternativamente, se han desarrollado métodos orientados a la detección directa de los antígenos del patógeno en tejidos de peces enfermos mediante el uso de métodos serológicos como la técnica indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFAT) (Yardimci y Timur, 2016. J. Aquac. Res. Development 7:2), ELISA (Yardimci y Timur, 2016. J. Aquac. Res. Development 7:2) e inmunohistoquímica (Faílde et al., 2013a. Microb. Pathog. 65:82-88; Faílde et al., 2014. Microb. Pathog. 76:1-9). También se han descrito métodos moleculares basados en PCR anidada (Cepeda et al., 2003. J. Fish. Dis. 26:65-70; Avendaño-Herrera et al., 2004c. Dis. Aquat. Org. 62:75-83), pCr múltiple (Castro et al., 2014. Int. Microbiol. 17:111-117) y PCR en tiempo real con sonda (Fringuelli et al., 2012. J. Fish. Dis. 35(8):579-90) para la detección del genoma del patógeno en los tejidos de los peces enfermos. Aunque estas técnicas serológicas y moleculares no necesitan el aislamiento del patógeno, son más lentas, costosas y requieren personal especializado para la correcta interpretación de los resultados. Además, en algunos de estos estudios no se valora la especificidad de la técnica in vitro, utilizando el ADN de especies de Tenacibaculum fenotípica y genotípicamente próximas a Tenacibaculum maritimum (Cepeda et al., 2003. J. Fish. Dis. 26:65-70; Avendaño-Herrera et al., 2004c. Dis. Aquat. Org. 62:75-83; Fringuelli et al., 2012. J. Fish. Dis. 35(8):579-90).
Recientemente, López et al. (2012) propusieron un método de diagnóstico (patente con N° de publicación ES 2371976 B1) para la detección simultánea de 4 patógenos de peces, incluyendo Tenacibaculum maritimum y otros patógenos como Tenacibaculum soleae, Photobacterium damsela y Vibrio harveyi, mediante PCR y RBL (Hibridación reversa en línea). Sin embargo, esta técnica es más lenta que otros métodos basados en PCR ya que la identificación de los microorganismos requiere de tres pasos: i) obtención del ADN; ii) amplificación de la región intergénica 16S-23S ribosomal y parte de ambos genes ribosómicos flanqueantes mediante PCR e iii) hibridación sobre membranas de nylon de los amplicones utilizando sondas específicas para identificar la presencia o ausencia de la especie de interés. Además, la hibridación necesaria para la confirmación del resultado requiere la transferencia de los productos de PCR a una membrana y el uso de sondas, lo que aumenta el riesgo de contaminación y encarece el procedimiento.
Todo lo expuesto pone de manifiesto la necesidad de desarrollar un procedimiento específico, sensible, rápido y barato para la identificación de Tenacibaculum maritimum en muestras de peces, así como, para su diferenciación de otras especies causantes de tenacibaculosis. Un procedimiento que comprende la realización de una PCR en tiempo real con un fluorocromo junto a la curva de fusión para la identificación del patógeno de peces Tenacibaculum maritimum, sería un procedimiento adecuado para alcanzar este fin.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento y kit para la detección, cuantificación y/o identificación de Tenacibaculum maritimum y, más concretamente, para la detección, cuantificación y/o identificación de ADN específico de Tenacibaculum maritimum obtenido a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, de tejidos de peces, de moco epidérmico o muestras de agua. La invención desarrollada se basa en la amplificación y cuantificación de ADN mediante la tecnología de PCR en tiempo real que utiliza el fluorocromo SYBR Green para la detección de los productos de amplificación y el análisis de la curva de desnaturalización para determinar la especificidad del fragmento amplificado en base a su temperatura de desnaturalización (Tm). El procedimiento propuesto comprende la amplificación de un fragmento de un tamaño de 164 pares de bases (pb) perteneciente al gen diana del ARN ribosómico 16S (ARNr 16S) (GenBank, número de acceso KU885458.1) y específico de Tenacibaculum maritimum. En dicha amplificación se incluye el fluorocromo SYBR Green que permite la detección de productos de amplificación concretos a partir de la temperatura de fusión (Tm), específica para el fragmento amplificado, que se obtiene al analizar la curva de disociación de las muestras de ADN analizadas. Este procedimiento no amplifica el ADN de otras especies de Tenacibaculum, ni el ADN de peces hospedadores, siendo los cebadores diseñados altamente específicos e informativos.
El procedimiento propuesto es más rápido, barato, sensible y específico que otros métodos moleculares descritos hasta la fecha y presenta las siguientes ventajas:
i. La identificación específica de Tenacibaculum maritimum a partir de cultivos bacterianos, puros o mixtos, tejidos infectados, moco epidérmico y agua, así como su diferenciación de otras especies ambientales o patógenas de peces del género Tenacibaculum filogenéticamente relacionadas (Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum discolor, Tenacibaculum gallaicum, Tenacibaculum dicentrarchi, Tenacibaculum ovolyticum).
ii. Reducir el coste y el tiempo necesario para el diagnóstico de la tenacibaculosis producida por Tenacibaculum maritimum.
iii. La detección de los productos de PCR es rápida, fácil y objetiva, permitiendo un fácil y rápido diagnóstico de la infección.
iv. No requiere utilizar electroforesis en geles de agarosa, luz ultravioleta, ni el uso de agentes tóxicos para la detección de los productos obtenidos.
v. Gracias al uso de la PCR en tiempo real utilizando un fluorocromo, no se requiere el uso de sondas para la detección del microorganismo, y al no requerirse la manipulación de los productos de PCR al final de la amplificación para confirmar la identificación, se disminuye el riesgo de contaminación.
vi. Permite la monitorización de la respuesta a los diversos tratamientos, así como, la detección temprana de recidivas.
vii. Es susceptible de ser automatizado.
Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para la detección, cuantificación y/o identificación de Tenacibaculum maritimum en muestras de cultivos bacterianos, puros y mixtos, en tejidos de peces, en moco epidérmico y en muestras de aguas que comprende las siguientes etapas: a) Aislar muestras de:
- Cultivos bacterianos, puros o mixtos o,
- ADN de un cultivo bacteriano, puro o mixto, de tejidos de peces, de moco epidérmico, o de muestras de agua.
b) Realizar un ensayo de PCR en tiempo real sobre las muestras de la etapa a) utilizando una pareja de cebadores específicos para Tenacibaculum maritimum identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 y un fluorocromo.
c) Detectar, cuantificar y/o identificar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de la PCR en tiempo real.
Una realización de esta invención es el procedimiento de la invención, donde se utilizan cebadores que tienen una identidad del 75% respecto a los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2. Una realización preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 85%. Una realización más preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 95% y una realización aún más preferente es un procedimiento de la invención donde dicha identidad es del 99%.
En la presente solicitud, el porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 99% de identidad significa que un 99% de residuos de la secuencia completa de los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.
Otra realización de la invención es un kit para detectar, cuantificar y/o identificar Tenacibaculum maritimum en un ensayo de PCR en tiempo real, que comprende:
a) La pareja de cebadores específicos para Tenacibaculum maritimum identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y s Eq ID NO 2,
b) Un fluorocromo,
c) Desoxinucleótidos trifosfato,
d) Tampón de reacción,
e) Un control positivo,
f) Manual de instrucciones que detalla el procedimiento a seguir.
El control positivo está presente en el kit para permitir determinar el correcto funcionamiento de los componentes del kit.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el fluorocromo es SYBR Green.
Una realización preferente es el kit de la invención donde el control positivo es ADN de Tenacibaculum maritimum de la cepa de referencia NCIMB2154.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dichos desoxinucleótidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP a una concentración final 200 pM.
Otra realización preferente es un kit de la invención donde dicho tampón de reacción es 50 mM de cloruro de potasio, 10 mM TrisHCl pH 9,0 a temperatura ambiente, 2,5 mM de MgCh, 20mM (NH4)2SO4, 2,5 unidades de polimerasa por 25 pL de reacción.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Curva de disociación de los productos de amplificación obtenidos utilizando suspensiones bacterianas de Tenacibaculum maritimum que muestra un valor de Tm de 80,0-80,5°C, específica para el fragmento de 164 pb amplificado. En el eje de abscisas se indica la Tm y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia.
Figura 2. Curvas de disociación obtenidas utilizando ADN extraído a partir de tejidos infectados con suspensiones de Tenacibaculum maritimum de diferentes concentraciones (5x107 hasta 5 x 101 células/mL) que muestra el producto de amplificación característico de Tm=80,0-80,5°C. En el eje de abscisas se indica la Tm y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia.
Figura 3. Curvas de disociación obtenidas utilizando suspensiones bacterianas de Tenacibaculum maritimum y de otras especies ambientales o patógenas de peces del género Tenacibaculum que muestra la ausencia del producto de amplificación característico de la especie Tenacibaculum maritimum (Tm=80,0-80,5°C) en las otras especies de Tenacibaculum (Tenacibaculum soleae, Tenacibaculum discolor, Tenacibaculum gallaicum, Tenacibaculum dicentrarchi. Tenacibaculum ovolyticum). En el eje de abscisas se indica la Tm y en el eje de ordenadas la derivada de las unidades de fluorescencia.
Figura 4. Recta de calibrado obtenida utilizando los cebadores y el procedimiento de PCR en tiempo real descrito utilizando como fuente de ADN suspensiones de Tenacibaculum maritimum con diferentes concentraciones (1x 108 hasta 1 x 102 células/mL). Coeficiente de correlación (R2) =0,993.
Figura 5. Recta de calibrado obtenida utilizando los cebadores y el procedimiento de PCR en tiempo real descrito utilizando ADN obtenido a partir de tejidos infectados con diferentes concentraciones de Tenacibaculum maritimum. Coeficiente de correlación (R2) = 0,990.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo 1. Diseño de cebadores específicos
Los cebadores específicos se diseñaron en base a la secuencia del gen de ARN ribosómico 16s (ARNr 16S) de la cepa de Tenacibaculum maritimum NLF-15 (n° acceso en la base de datos GenBank KU885458.1). Para el diseño de los cebadores y para testar su especificidad, se utilizaron las herramientas Pick Primer y Primer-BLAST, del Servicio de Información del Centro Nacional de Biotecnología disponibles en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Para la evaluación de las propiedades de los cebadores y para optimizar las condiciones de la PCR en tiempo real se utilizaron las herramientas IDT SciTools Web Tools de la empresa Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) disponibles en http://eu.idtdna.com/pages/scitools. Se desarrollaron el cebador directo, Tm-rRNA16S-FW y el cebador inverso Tm-rRNA16S-RV (Tabla 1). La especificidad de los cebadores se evaluó usando la herramienta BLAST para alineamiento frente a otras secuencias recogidas en la base de datos GenBank. Estos cebadores franquean un fragmento interno de 164 pb del gen rRNA16S.
Tabla 1. Secuencias de los cebadores específicos diseñados para Tenacibaculum maritimum
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Ejemplo 2. Aislamiento de ADN a partir de cultivos bacterianos, tejidos de peces, moco epidérmico y muestras de agua.
A partir de cultivos puros y mixtos de los microorganismos problema, se prepararon suspensiones bacterianas en agua estéril libre de nucleasas ajustadas a una concentración final aproximada de entre 1x108-1x101 células/mL (tubo 3 de la escala MacFarland). El número de unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó mediante el método de recuento en placa, usando medio Flexibacter maritimus (FMM) y se contaron las colonias de bacterias producidas. Las suspensiones bacterianas se utilizaron en la reacción de amplificación directamente o previa extracción del ADN.
Las muestras de agua de mar (estéril o no estéril) fueron inoculadas con un volumen igual de suspensiones bacterianas de la cepa de referencia de Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 conteniendo entre 1 x 108 y 1 x 101 células/mL y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El número de UFC se determinó mediante el método de recuento en placa. Se prepararon también muestras de agua no inoculadas para utilizarlas como control negativo. Las muestras se centrifugaron a 12000 rpm durante 15 minutos y los pellets bacterianos se lavaron dos veces con agua estéril libre de nucleasas. Finalmente, el precipitado se suspendió en 100pl de agua estéril. Los homogenizados obtenidos se utilizaron en la reacción de amplificación directamente o previa extracción del ADN.
El ADN de cultivos bacterianos (puros o mixtos) y del agua de mar se obtuvo utilizando el sistema comercial InstaGene Matrix (Bio-Rad).
A partir de peces sanos (sacrificados por sobredosis del anestésico tricaína metanosulfonato, MS-222, Sigma), se obtuvieron tejidos (riñón, bazo y sangre) y moco epidérmico, que se homogenizaron con solución salina a una concentración final del 25% peso/volumen, se inocularon con un volumen igual de suspensiones bacterianas de la cepa de referencia de Tenacibaculum maritimum NCIMB2154 conteniendo entre 1 x 108 y 1 x 101 células/mL y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El número de UFC se determinó mediante el método de recuento en placa. Se prepararon también homogenizados de tejidos y moco epidérmico no inoculados para utilizarlos como control negativo.
El ADN de todos los homogenizados (tejidos o moco) se obtuvo utilizando el sistema comercial Dynabeads® DNA Direct™ Universal (Dynal).
Ejemplo 3. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de cultivos puros y mixtos.
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 pL de Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x), no ROX, (Thermo Scientifics), 1 pL de cada cebador (SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2) (400 nmoles), 2 pL de la suspensión bacteriana problema o 2 pL de ADN bacteriano purificado. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25pL.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX Manager™ (Bio-Rad), en las siguientes condiciones: un paso inicial de incubación a 95°C durante 10 min, seguido de 30 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, y una hibridación a 60°C durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 60°C a 100°C en intervalos de 0,5°C durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar el valor de Tm del producto de amplificación específico para Tenacibaculum maritimum. En todas las muestras positivas para Tenacibaculum maritimum se detectó un pico de fluorescencia con una Tm de 80,0-80,5°C (Figura 1). Estos resultados indican que la técnica de PCR y los cebadores descritos en la presente invención, permiten un diagnóstico sensible, rápido y económico de la tenacibaculosis causada por Tenacibaculum maritimum.
Ejemplo 4. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de tejidos de peces y moco epidérmico. En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 pL de Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Thermo Scientifics), 1 pL de cada cebador (SEC ID NO: 1 y SEC ID n O : 2) (concentración final de 400 nm) y 2.5 pL de ADN extraído de tejidos o moco epidérmico. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25pL.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX Manager™ (Bio-Rad), en las siguientes condiciones: un primer paso de incubación a 95°C durante 5 min, seguido de 35 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, hibridación a 60°C durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 65°C a 95°C en intervalos de 0,5°C durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar el valor de Tm del producto de amplificación específico para Tenacibaculum maritimum. En todas las muestras de tejido y moco epidérmico analizadas, la presencia de un pico de fluorescencia con una Tm de 80,0-80,5°C (Figura 2), indicó la presencia de Tenacibaculum maritimum. No se obtuvo amplificación con muestras de ADN de tejidos o moco epidérmico de peces sanos o infectados con otras especies bacterianas. Además, la técnica de PCR cuantitativa y los cebadores descritos en la presente invención pueden ser empleados como un método de diagnóstico no letal si se utiliza sangre o moco epidérmico como fuente de ADN.
Ejemplo 5. Amplificación de fragmentos de ADN a partir de muestras de agua.
En la amplificación se utilizó la siguiente mezcla de reacción: 12,5 pL de Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x), no ROX, (Thermo Scientifics), 1 pL de cada cebador (SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2) (400 nmoles), 2 pL de la suspensión bacteriana problema o 2 pL de ADN bacteriano purificado. Se completó el volumen de la reacción con agua destilada estéril hasta los 25pL.
La mezcla de reacción se sometió a amplificación en un termociclador MiniOpticon para PCR en tiempo real, con el software de detección CFX Manager™ (Bio-Rad), en las siguientes condiciones: un primer paso de incubación a 95°C durante 10 min, seguido de 30 ciclos consistentes en una desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, hibridación a 60°C durante 30 segundos. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados se llevó a cabo mediante el aumento gradual de la temperatura desde 65°C a 95°C en intervalos de 0,5°C durante 10 segundos y lectura continua de la fluorescencia para determinar el valor de Tm del producto de amplificación específico para Tenacibaculum maritimum. En todas las muestras de tejido analizadas, la presencia de un pico de fluorescencia con una Tm de 80,0-80,5°C (Figura 2), indicó la presencia de Tenacibaculum maritimum en las muestras de agua. No se obtuvo amplificación con muestras de ADN de agua no inoculada, o inoculadas con otras especies bacterianas. Estos resultados indican que la técnica de PCR cuantitativa y los cebadores descritos en la presente invención pueden ser empleados para la monitorización de la presencia de Tenacibaculum maritimum en aguas de granjas de cultivo.
Ejemplo 6. Especificidad y sensibilidad de la PCR en tiempo real con SYBR Green.
La especificidad del ensayo de PCR en tiempo real y la existencia de amplificaciones cruzadas se evaluaron utilizando muestras de ADN obtenidas a partir de 10 cepas pertenecientes a la especie Tenacibaculum maritimum, y de diferentes bacterias no diana incluyendo otras especies del género Tenacibaculum (Tenacibaculum soleae (n=5), Tenacibaculum discolor (n=5), Tenacibaculum gallaicum (n=3), Tenacibaculum dicentrarchi (n=1), Tenacibaculum litoreum (n=1), Tenacibaculum ovolyticum (n=1), Tenacibaculum litoreum (n=1)), así como de otras especies patógenas de peces no relacionadas como Aeromonas salmonicida (n=1), Aeromonas eucrenophila (n=1), Aeromonas veronii (n=1), Aeromonas hydrophila (n=1), Aeromonas caviae (n=1), Aeromonas allosacharophila (n=1), Aeromonas media (n=1), Edwarsiella tarda (n=2), Escherichia coli (n=1), Flavobacterium psychrophilum, (n=1) Lactococcus garviae (n=1), Streptococcus iniae (n=1), Streptococcus parauberis (n=1), Streptococcus suis (n=1), Pseudomonas anguilliseptica (n=1), Vibrio anguillarum (n=1), Vibrio parahaemolyticus (n=1) y Vibrio alginolyticus (n=1) que afectan a peces de agua dulce o agua salada.
En los ensayos de PCR en tiempo real realizados se detectó el gen ARNr 16S en todas las cepas de Tenacibaculum maritimum, cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas directamente o el ADN extraído a partir de ellas. Las curvas de fusión mostraron un único pico de fluorescencia con un valor de Tm medio de entre 80,0-80,5°C (Figura 3). No se obtuvo amplificación cuando se utilizaron las suspensiones bacterianas o el ADN extraído de otras especies del género Tenacibaculum o de otras especies bacterianas no relacionadas taxonómicamente (Figura 3). Estos resultados corroboran que la técnica de PCR en tiempo real y los cebadores descritos permiten una identificación específica del agente causal de la tenacibaculosis.
Para el ensayo de sensibilidad, tanto las suspensiones bacterianas (con y sin previa extracción de ADN) como el ADN obtenido a partir de tejidos de peces, moco epidérmico o agua de mar inoculados con Tenacibaculum maritimum fueron utilizados para generar una recta de calibrado usada para la cuantificación de la carga bacteriana en las muestras desconocidas. La recta de calibrado se construye representando el logaritmo decimal (log10) de la concentración de ADN o de la suspensión bacteriana frente al número de ciclo (Ct). La eficiencia de los ensayos de la PCR en tiempo real se calculó utilizando la pendiente de la recta de acuerdo con la ecuación E=10(-1/m) -1. La linealidad de la curva de calibración se expresó como coeficiente de correlación (R2). Las Figura 4 y 5 muestran las rectas de calibrado obtenidas utilizando suspensiones bacterianas o ADN obtenido a partir de tejidos, respectivamente.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para detectar, cuantificar y/o identificar Tenacibaculum maritimum en un único ensayo de PCR en tiempo real que comprende:
a. Aislar muestras de:
i. Cultivo bacteriano, puro o mixto, o,
ii. ADN de un cultivo bacteriano, puro o mixto, o de tejidos de peces, o de moco epidérmico o muestras de agua.
b. Realizar dicho ensayo de PCR en tiempo real sobre las muestras de la etapa a) utilizando una sola pareja de cebadores específicos para Tenacibaculum maritimum identificados por las secuencias SEQ ID nO 1 y SEQ ID NO 2.
c. Detectar las secuencias nucleotídicas amplificadas como resultado de dicha PCR en tiempo real.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde se utilizan cebadores que tienen una identidad del 75% respecto a los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 85%.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 95%.
5. Procedimiento según la reivindicación 2, donde dicha identidad es del 99%.
6. Procedimiento según la reivindicación 1 a 5 en el que la temperatura de fusión del producto de amplificación obtenido mediante la PCR en tiempo real está comprendida entre 80,0°C y 80,5°C
7. Kit para la detección, cuantificación y/o identificación de Tenacibaculum maritimum en un único ensayo de PCR en tiempo real, que comprende:
a. Los cebadores específicos identificados por las secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.
b. Un fluorocromo
c. Control positivo
d. Desoxinucleótidos trifosfato
e. Tampón de reacción
f. Manual de instrucciones que detalla el procedimiento a seguir.
8. Kit según la reivindicación 7, donde el fluorocromo se selecciona de la lista que consiste en:
FAM, DABCYL, CY-3, JOE, VIC, CY-5, TAMRA, SYBR Green, ROX, Rojo de Texas.
9. Kit según la reivindicación 8, donde el fluorocromo es SYBR Green.
10. Kit según la reivindicación 7 a 9 donde los desoxinucleotidos trifosfato son dATP, dCTP, dGTP y dTTP en una 30 concentración final de 200 pM.
11. Kit según una de las reivindicaciones 7 a 10, donde dicho tampón de reacción es 50 mM de cloruro de potasio, 10 mM TrisHCl pH 9,0 a temperatura ambiente, 2,5 mM de MgCh, 20mM (NH4)2SO4, 2,5 unidades de polimerasa por 25 pL de reacción.
12. Kit según una de las reivindicaciones 7 a 11, donde el control positivo es ADN de Tenacibaculum maritimum de la cepa de referencia NCIMB2154.
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