WO2017186333A1 - Probenbehälter für eine kryokonservierte biologische probe, verfahren zur herstellung des probenbehälters, verfahren zur temperaturüberwachung einer kryokonservierten probe - Google Patents

Probenbehälter für eine kryokonservierte biologische probe, verfahren zur herstellung des probenbehälters, verfahren zur temperaturüberwachung einer kryokonservierten probe Download PDF

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indicator substance
sample
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Günter R. Fuhr
Heiko Zimmermann
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Universität des Saarlandes
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    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/0332—Cuvette constructions with temperature control

Definitions

  • the invention relates to a sample container, which is designed to receive a cryopreserved biological sample and a method for producing the sample container.
  • the invention further relates to a method for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample.
  • Cryopreservation of cells has so far been the only way to reversibly halt vital processes at the cellular level in such a way that they can restart after being heated to physiological temperatures. Cryopreservation has become an indispensable element for clinics, pharmaceutical companies, species conservation, environmental protection and health care through large biobanks in recent decades.
  • Biological material is stored in low-temperature compatible sample containers (cryobanks), eg. As tubes, straws and bags, different sizes. During cryopreservation, the stored biomaterials are frozen while maintaining the vitality of the sample material, mostly at temperatures below -80 ° C, for live collections below -140 ° C to the temperature of the liquid nitrogen.
  • cryoprobe is also used below.
  • cryopreservation For macroscopic samples, such. As blood or tissue, numerous techniques for sample storage at low temperatures have been developed. In modern medicine, genetic engineering and biology, there is a tendency to undergo increasingly small samples of cryopreservation. For example, small volumes of suspension (milliliter or below) are frozen with suspended cells or cell groups. The cryocon- Serving cells from in vitro cultures predominantly takes place in a suspension. However, most of the biomedically relevant cells require substrate contact for propagation and orderly development. Therefore, samples may be frozen after culturing in the substrate-bound state.
  • the quality of the samples is crucial as they are used for cell therapies in clinics, the development of pharmaceuticals and biotechnology products, as national resources and much more.
  • the storage time is several days to decades, with a tendency for long-term storage.
  • the samples are stored in refrigerated containers, mostly in metal drawers and racks, with which they are subject to temperature fluctuations in new deposits or withdrawals.
  • live deposits cells, cell suspensions and tissue parts
  • the uninterrupted cold chain plays a decisive role, but also the avoidance of large temperature jumps in the frozen phase.
  • cryo containers Since it is not uncommon for cryo containers to warm to temperatures of -80 ° C to -20 ° C, even though they are still frozen, quality reductions, which not only reduce the value of the sample, are unrecognized but can also lead to life-threatening situations when used in the clinical field. Even when samples are thawed for a short time, when they are frozen they do not show that they no longer correspond to the original state. However, it is not only a question of detecting a thawing of the biomaterials, but of documenting the exceeding of a limit temperature in the range between -140 ° C and -20 ° C. Temperature control and documentation for each sample is the requirement and so far only rarely - and if, then with great technical effort - to meet. In addition, there are extensive laboratory tests after thawing, which also consume valuable sample material and generate costs even in the case of now worthless cryoprobes.
  • a further object is to provide a possibility for being able to recognize at the simplest possible marker or mark whether a cryoprobe has heated above a definable limit temperature, and even if only for a short time.
  • the limit temperature must be determinable between -20 ° C and -140 ° C before freezing. This should be possible quickly and easily recognizable on every single cryoprobe and therefore with millions of samples, must not alter the biomaterials and should already take place in the deep-frozen state. If possible, the condition of the sample should also be detectable in the storage container, as each storage and retrieval brings with it the risk of sample change of a variety of samples in the stored goods, as a rule, whole racks are raised.
  • the device or the method should be easy to handle, low temperature tolerant and adjustable. It may consume little or no energy and possibly cause only the least cost, since the storage of a bioprobe in a refrigerated state should cost only a few Euros in its total expenditure. This requirement must also meet the applicable materials.
  • said objects are achieved by a sample container which is designed to receive a cryopreserved biological sample and which bears on a region of its outer surface a solidified indicator substance whose melting temperature at normal pressure, ie at 1013.25 hPa, in range from -20 ° C to -140 ° C.
  • the melting temperature may also be in a range of -20 ° C to -100 ° C.
  • the sample container is a container suitable for cryopreservation, for example a tube, a straw (also referred to as seminal tube), a bag for storing blood or stem cells, a box or another container suitable for cryopreservation.
  • Such containers are also referred to as cryotubes, Kryostraw, cryobags, cryobox or generally as a cryocontainer.
  • the sample container has a receiving space for receiving the biological samples.
  • the receiving cavity may contain a cryopreserved sample.
  • Cryogenic tubes are also referred to as biobank or cryobank tubes.
  • Cryotubes have a receiving space that forms an internal cavity for receiving a biological sample.
  • the cryovial usually also has a lid for closing the receiving space.
  • the lid may have an engagement over which the lid can be rotated with a tool.
  • the cryotube may also include a bottom member having an identifier, e.g. B. in the form of a machine-readable code.
  • the solidified indicator substance When the melting temperature is exceeded, the solidified indicator substance becomes liquid. Thereupon, a configuration state of the indicator substance on the outer surface of the sample container, z. B. due to gravity and / or the surface tension. For example, if its melting point is exceeded, the indicator substance can change its position on the sample container and / or its surface shape, which can be determined visually or by a measuring device. The change in the configuration state is retained even when the indicator substance is re-frozen.
  • the indicator substance frozen to a region of the outer surface of the sample container thus preferably has a configuration whose shape and / or arrangement changes when a melting temperature of the indicator substance is exceeded.
  • a sample container carrying a frozen indicator substance at a region of its outer surface whose melting temperature is in a range from -20 ° C. to -140 ° C. can thus be advantageously used for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample.
  • the sample container according to the invention is Furthermore, inexpensive to produce and claimed in comparison to a conventional sample container little additional space.
  • the indicator substance can thus be applied directly to an outer surface of a sample container.
  • the indicator substance may be fixed to an outer surface of the sample container exclusively by freezing, i. h., the indicator substance is not supported by other fasteners, such as an additional vessel, etc. on the sample container.
  • the indicator substance can be frozen frozen on the container.
  • the indicator substance may contain an indicator additive which increases a detectability of a physical property of the indicator substance.
  • the indicator additive can be, for example, a dye, so that the indicator substance colored or colored, d. H. is not transparent, and so their shape and / or location is better visually recognizable.
  • any dye which satisfies at least the following conditions is suitable as the dye:
  • the dye is selected from the group consisting of triphenylmethane dyes, rhodamine dyes, especially xanthenes, azo dyes and phenazine and phenothiazine dyes.
  • the dye is selected from the group comprising Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green, Rhodamine B, Neutral Red, Methylene Blue, or other dyes used to stain cells in cytology.
  • the indicator additive may be particles, in particular nanoparticles, which increase a scattering effect and / or polarization effect of the indicator substance for electromagnetic radiation impinging on the indicator substance.
  • the indicator additive may be conductive particles. By adding conductive particles, the conductivity or impedance of the indicator substance can be influenced. In this way, a configuration change of the indicator substance can be detected by means of a conductivity measurement or impedance measurement.
  • a substance can be selected whose melting temperature corresponds to a predetermined limit temperature whose exceeding is to be monitored.
  • the indicator substance is a liquid or a mixture of different liquids whose melting point corresponds to the desired limit temperature.
  • a mixture of water (H 2 O) and ethanol (C 2 H 6 O), a mixture of water (H 2 O) and potassium hydroxide (KOH) or a mixture of water and an antifreeze can be selected as the indicator substance.
  • the mixing ratio is adjusted according to the respective melting diagram, which indicates the course of the melting point as a function of the mixing ratio, so that the melting point of the liquid mixture has the desired value, namely the limit temperature to be monitored.
  • the indicator substance comprises at least one alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propane-1,3-diol, butane-1,2 -diol, butane-l, 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-l-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol.
  • the at least one alcohol is particularly preferably selected from propan-1, 3-diol, propan-1, 2-diol and butan-2-ol.
  • the indicator substance comprises at least two different alcohol components:
  • an alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propan-1, 3-diol, butane-l, 2-diol, butane-l 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-1-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol;
  • an alcohol selected from the group consisting of octan-1-ol, nonan-1-ol, propan-1, 2-diol, propane-1,3-diol, butane-1,2-diol, butane-1 3-diol, butan-2-ol, pentane-l, 5-diol, pentan-1-ol, cyclopentanol, benzyl alcohol, having a lower melting point than the alcohol of component a);
  • the mixing ratio of the components a) and b) is set so that the melting temperature of the mixture within a temperature range of -20 ° C to -160 ° C, especially from -25 ° C to -160 ° C or -50 ° C to -150 ° C, lies.
  • the indicator substance comprises one of the following combinations of components a) and b):
  • this indicator mixture comprises, for example, propane-1,2-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 40 to 60% by volume (gives a melting temperature of about -90 ° C.), propane-1,2 -diol and propane-1,3-diol in a mixing ratio of 30 to 70 vol .-%, or propane-l, 3-diol and butan-2-ol in a mixing ratio of 30 to 70 vol .-%.
  • the indicator substance preferably also comprises at least one dye as described above. Most preferably, this dye is selected from the group comprising Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green and Rhodamine B.
  • an even more specific embodiment is characterized in that the indicator substance two alcohols a) and b), which are selected from propan-l, 3-diol, propane-l, 2-diol and butan-2-ol, preferably in a mixing ratio as above, and a dye selected from the group consisting of Oil Red, Methyl Red, Brilliant Green and Rhodamine B.
  • the concentration of the dye in the alcohol component can vary widely depending on the dye and alcohol. As a rule, the concentration should be kept as low as possible during intensive staining, so that the color molecules do not change or increase the viscosity of the freezing and melting behavior of the alcohols in which they are dissolved.
  • the dye concentration is typically in a range of ⁇ 10% by volume, in particular ⁇ 1% or ⁇ 0.1%, ie in the percent or per thousand or subpromute range.
  • the limit temperature to be monitored does not correspond directly to the melting temperature of the indicator substance, but rather to the temperature above the melting temperature at which the viscosity of the molten substance has decreased so much that the required liquid transport can take place.
  • This temperature is also referred to herein as a threshold temperature and is typically in a temperature range of 3-30 ° C or 5-30 ° C, for example 3-10 ° C, 3-20 ° C, 5-10 ° C or 5-20 ° C, above the nominal melting temperature.
  • the indicator substance is therefore characterized in that the liquid mixture in a temperature range of 3-30 ° C or 5-30 ° C above the melting temperature has a viscosity in a range of 10 to 10 6 mPa * s, preferably 10 to 10 4 mPa * s.
  • the area carrying the frozen indicator substance has a coating, roughening and / or structuring.
  • the area bearing the solidified indicator substance may have an adhesion-promoting texture coating. This improves the adhesion of the frozen indicator substance.
  • the area bearing the frozen indicator substance may have a mirror coating. According to this variant, the indicator substance is thus frozen on a mirrored area of the outer wall of the sample container. In this embodiment, a configuration change of the indicator substance by means of a measuring device or purely visually to detect particularly reliable.
  • the region bearing the frozen indicator substance may comprise an electrode assembly.
  • the electrode arrangement can be designed, for example, as gold or platinum electrodes.
  • the indicator substance is thus frozen onto the electrode arrangement, in particular in such a way that a resistance measurable via the electrode arrangement or an impedance depends on whether or not the indicator substance is located on the electrode arrangement.
  • it can be determined on the basis of the measured resistance whether the indica- The substance of the substance is still present in the initially attached frozen state on the electrode arrangement, whether the indicator substance has flowed out of the region of the electrode arrangement when its melting point has been exceeded due to the liquid becoming liquid.
  • a measuring device can also be provided, which is designed to detect the resistance or the impedance of the electrode arrangement.
  • the indicator substance is applied to the outer surface of the sample container in a predetermined arrangement.
  • the indicator substance firmly frozen on a region of the outer surface of the sample container can thus have a specific arrangement which changes when a melting temperature of the indicator substance is exceeded, for example. B. under the influence of gravity.
  • the arrangement may represent a number, a letter, a symbol, an identifier and / or another structure that is visually easily recognizable to a user. If the arrangement after a cryogenic storage is still recognizable, the melting temperature of the indicator substance was not exceeded during the cryogenic storage. If the arrangement has changed or has disappeared, it can be determined that the melting temperature and thus a critical limit temperature has been exceeded. A user can thus easily determine by a visual visual inspection, whether an undesirable increase in temperature has occurred above the melting temperature or above the limit temperature to be monitored.
  • the indicator substance applied on the outer surface can be obtained by firmly frozen drops of the indicator substance. This allows accurate metering of the applied indicator substance and a precise arrangement of the indicator substance, for. B. using a drop-shot device.
  • a plurality of different indicator substances whose different melting temperatures are each in a range of -20 ° C to -140 ° C, at different areas of the outer surface be applied to the sample container. This offers the advantage that several temperature limits can be monitored during the cryogenic storage or that the achieved temperature intervals, in which the sample has arrived, can be narrowed down more precisely.
  • the sample container is a cryotube, and a plurality of different indicator substances, which differ in their melting temperatures, are each applied in the form of tightly packed fixed drops on a receiving cylinder of the cryotube.
  • the various indicator substances can each be arranged in the form of band-shaped, for example ring-shaped, frozen drops fixed to one another on the outer surface of the receiving cylinder of the cryotube, wherein the various indicator substances are arranged offset to one another in the axial direction of the cryotube. This arrangement is visually easy to check for changes.
  • the axial direction corresponds to the longitudinal direction of the cryotube.
  • the various indicator substances may be sorted by their melting temperatures in descending or ascending order in the axial direction. This allows a visually particularly simple to be carried out limitation of the temperature intervals in which the sample container stored in the sample has arrived.
  • the frozen-in indicator substance may have a pattern and / or a surface structure, for example a molded or embossed pattern, at least on a partial area of its surface.
  • a pattern or a surface structure disappears or at least changes when the indicator substance becomes liquid, so that it can be checked on the basis of the presence or absence of the pattern whether the melting temperature has been exceeded at least temporarily.
  • this embodiment may be on the pattern and / or the surface structure of a transparent or semi-transparent
  • Be arranged protective cover This protects the pattern from external mechanical damage.
  • the pattern or surface texture may be an embossed pattern.
  • An embossed pattern may be obtained, for example, by shaping the indicator substance in a liquid state in a mold and then freezing the molded indicator substance.
  • a device for monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample comprising a sample container according to the invention, as described in this document, and a measuring device that is configured, a configuration change, in particular a change of shape, arrangement and / or position to detect the frozen indicator substance.
  • the measuring device can be designed appropriately depending on the embodiment.
  • the measuring device can be designed to measure a resistance or an impedance of the electrode arrangement, as already described above.
  • the measuring device can be designed, for example, to generate a measuring beam, eg a measuring beam.
  • a measuring beam eg a measuring beam.
  • the indicator substance When the indicator substance is exceeded, it will flow down the sample container in the liquid state of aggregation, so that the measuring beam now directly strikes the mirrored surface, which was previously covered by the solidified indicator substance.
  • the measuring beam is now reflected on the mirrored surface, which can be detected by the measuring device.
  • the trade fair tion thus detects a reflected measuring beam, it can be concluded that the melting temperature has been exceeded at least for a short time.
  • the measuring device may be configured to optically detect whether the pattern or the surface pattern is still present or not.
  • the measuring device can be designed, for example, to detect whether the arrangement of the indicator substance is still present or not, etc.
  • sample container refers in particular to a container designed for cryopreservation.
  • the sample container is preferably produced using low-temperature-compatible plastic material for temperatures below -140.degree.
  • the plastic material can tolerate repeated temperature changes without change and without damage.
  • a plastic material is preferably used whose water absorption capacity is ⁇ 1% of the intrinsic mass, in particular ⁇ 0.1% of the intrinsic mass.
  • Cryogenic storage elements according to the invention are based, for example, on polyurethane or polyethylene.
  • biological sample refers to biological material such as cells, tissue, cell constituents, biological macromolecules, etc. which is subjected to cryopreservation in the sample container, possibly in a suspension and / or composite with a substrate material
  • a method of making a sample container designed for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample comprises the provision of a sample container designed to receive a biological sample
  • the sample container is preferably a cryoprobe container.
  • the method further comprises applying an indicator substance whose melting temperature is in a range of -20 ° C to -140 ° C to an area of the outside Surface of the sample container in liquid state and the freezing of the applied indicator substance.
  • the sample container is cooled to a temperature below the melting temperature of the indicator substance prior to application of the indicator substance in the liquid state of aggregation. As a result, a rapid freezing of the applied indicator substance can be achieved.
  • the indicator substance in the liquid state of aggregation drop-shaped by means of a drop deposition device for.
  • a drop-shot device are applied to the outer surface of the frozen sample container.
  • Drop guns, z. B. executed as a piezo-pressure nozzle or piezo-printhead are known per se from the prior art and not described in detail here.
  • the application of the liquid indicator substance and the subsequent freezing take place according to the following steps:
  • the sample container is partially immersed in a container filled with an indicator substance in the liquid state of aggregation, so that at one point the indicator substance adheres to an outside of the sample container.
  • the sample container is positioned on a hollow mold, such that the indicator substance adhering to the sample container fills an embossing in the interior of the hollow mold.
  • the mold is removed from the indicator substance solidified on the sample container. As a result, the introduced through the mold into a surface of the indicator substance imprinting is exposed.
  • a method of monitoring the temperature of a cryopreserved biological sample comprises providing a sample container designed to receive a cryopreserved biological sample and carrying at a portion of its outer surface a solid frozen indicator substance whose melting temperature is within a range from -20 ° C to -140 ° C.
  • the sample container may also be designed according to the embodiments and variants described in this document. To avoid repetition, features disclosed purely in accordance with the device should also be disclosed as being in accordance with the method and be able to be claimed.
  • the sample container may include a cryopreserved biological sample in its receiving space.
  • the sample container can be stored at storage temperature below the melting temperature of the indicator substance for cryopreserved storage of the biological sample.
  • the method further comprises determining whether a configuration change of the indicator substance has taken place due to a temporary exceeding of the melting temperature of the indicator substance, in particular whether a change of shape or arrangement, in particular position, of the indicator substance has taken place. This change can be detected immediately by looking or technically automated, whether the limit temperature to be monitored has been exceeded.
  • FIG. 1-4 are schematic views of various embodiments of a sample container designed for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample
  • FIG. 5A, 5B, 6A are each a melting diagram of a liquid mixture
  • FIG. 6B is a table with melting points of some pure liquids.
  • FIG. 7 shows a miscibility matrix of solvents. Identical or functionally equivalent elements are denoted by the same reference numerals in all figures and are in part not described separately.
  • FIG. 1A shows a first exemplary embodiment of a sample container 10, which is designed for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample.
  • FIG. 1A further illustrates in a highly schematic manner the production of such a sample container 10.
  • the sample container 10 is a cryotube, which is shown in Figure 1A in the fully screwed state.
  • the cryotube comprises a cylindrical receiving part 1, which forms a receiving space 2 in which a biological sample (bioprobe) 6 is stored.
  • the biological sample may be a cell suspension.
  • the cylindrical receiving part 1 is closed with a lid 3.
  • the cryovial also has a bottom part 4.
  • the sample container 10 is already in Figure 1A on the storage temperature, z. B. at -140 ° C, but at least below the melting point of the indicator substance 8.
  • the cryotube carries at a portion 11 of its outer surface a frozen indicator substance 12 whose melting temperature is in a range of -20 ° C to -140 ° C.
  • a suitable liquid or a liquid mixture is selected as the indicator substance 12.
  • melting point can be set to a desired value, in particular in a range from -20 ° C to -140 ° C.
  • FIG. 5A shows the course of the melting point as a function of the mixing ratio of an alcohol and water, with which a temperature range between 0 ° C. and -118 ° C. can be covered with a moderate increase in viscosity with decreasing temperature. Should z. B. a temperature limit of -118 ° C are monitored, the ethanol content can be set to 93.5%. Melting points up to a value of just below -60 ° C can also be adjusted by admixing potassium hydroxide (KOH) to water, which is shown in FIG. 5B by means of a melting diagram is shown. A mixture of water and cryoprotectant may also be used as the indicator substance, as illustrated by the melt diagram of Figure 6A. The table of FIG.
  • KOH potassium hydroxide
  • 6B lists freezing points / melting points of further pure liquids which can be used alone or as a mixture with another liquid as an indicator substance.
  • Other suitable as indicator substance liquid mixtures are chloroform-cyclohexane mixtures or other miscible liquids, the z. B. from the miscibility matrix of solvents of Figure 7 can be removed. If several temperature limit values are to be monitored in the case of cryogenic storage or if the temperature intervals reached by the sample are to be narrowed down more precisely, a plurality of different indicator substances with different melting points can be used accordingly, which will be described below with reference to FIG.
  • the region 11 of the cryovial shown in FIG. 1A carries the indicator substance 12 in the form of frozen drops 13 arranged in rows in the axial direction A (represented by the vertical arrow in FIG. 1).
  • the drops 13 of the indicator substance 12 are applied to the Cryotubes applied:
  • On the cold surface of the region 11 of the cryotube, the warm or pre-cooled indicator substance 8 is dropped dropwise in the liquid state of aggregation via a dropping device 7, z. B. via piezo-pressure nozzles.
  • the drops 8 freeze on the cryogenic surface, as shown by the reference numeral 13 in Figure 1A.
  • the surface area 11, which is provided for holding the indicator substance be changed in its properties so that a good wetting and adhesion of the drops takes place, for.
  • the indicator substance 12 is no longer in the state shown in FIG. 1A after a cryogenic storage, but in a state in which the drops have at least partially fused together, as illustrated schematically in FIG. 1B, then it can be concluded that the melting temperature and so that a critical temperature limit has been exceeded. If, on the other hand, an unchanged arrangement of the indicator substance is found after cryopreservation, the sample 6 has been properly stored continuously below the melting temperature. A user can thus easily determine by a visual visual inspection, whether an undesirable increase in temperature has occurred above the melting temperature or above the limit temperature to be monitored.
  • FIG. 1C shows a sample container 10a which carries at a region 11 of its outer surface a frozen indicator substance 12a, which is formed from a larger drop area and / or a plurality of indicator substances which are arranged regularly one above the other and next to each other.
  • FIG. 1D shows a sample container 10a, which carries at a region 11 of its outer surface a frozen indicator substance 12b, which is applied in the form of a letter. Does the arrangement Loss of indicator substance 12a or 12b lost in the cryogenic storage, in turn, can be closed to an at least temporary exceeding of the melting temperature.
  • FIG. 2A again shows a cryotube 20, which is at the storage temperature, and a droplet gun 7.
  • annular in this example as shown in Figure 1A, a series of indicator substance drops 8 are banded onto an area 21 of the outer cryogenic surface of the cryotube 1 where they freeze.
  • various indicator substances 23a, 23b and 23c whose melting temperatures are different are used.
  • the indicator substance 23a may have a melting temperature of -60 ° C
  • the indicator substance 23b may have a melting temperature of -70 ° C
  • the indicator substance 23c may have a melting temperature of -80 ° C. If the various indicator substances are applied to the cryotube as shown in FIG. 2A, their melting temperatures decreasing from top to bottom, it is likewise possible to detect when one or more melting temperatures on the structure have been exceeded that an inadmissible temperature increase has taken place.
  • FIG. 2B shows by way of example the case that only the melting temperature of the indicator substance 23a (upper droplet ring in FIG. 2A) has been exceeded, so that only the upper droplet ring has flowed downwards in FIG. 2B, which in turn can be easily detected from the outside and The bioprobe inside is not contaminated.
  • FIG. 3A shows in the left part of the figure a cryotube analogous to FIGS. 1 and 2, in which there is still an electrode arrangement 33, 34 at the region 31 of the outer surface, on which the indicator substance 32 is applied, e.g. B. in the form of miniaturized gold or platinum electro-den.
  • FIG. 3A shows an embodiment of the cryotube 30a in which there is a mirrored surface 35a, 35b on two regions 31 of the outer surface of the cryotube, to which the indicator substance 32a, 32b is applied. It can be determined optically, visually or via a measuring beam 100 whether the indicator substance 32a, 32b is still located on these original position fields on the mirrored surface 35a, 35b.
  • different indicator substances may be selected so that the indicator substance 32a on the first mirrored surface 35a has a melting temperature corresponding to a first temperature limit to be monitored and that the indicator substance 32b on the second mirrored surface 35b has a melting temperature corresponding to a second temperature limit to be monitored equivalent.
  • FIG. 4 schematically illustrates in the time sequence of FIGS. 4A, 4B, 4C and 4D the production of a further cryotube 40, which is designed for temperature monitoring of a cryopreserved biological sample.
  • a sample container in the form of a typical sealed cryovial (tube) 1, as used in cryobiobanks, is shown in a sectional view. It usually includes a recording volume 2 for the bioprobe in which the biomaterials are located. The bioprobe is z.
  • the cryotube further comprises a lid 3, which closes the vessel and has an engagement 4 above, over which the lid 3 can be rotated with a tool (not shown) in the case of automation.
  • These cryotubes 1 can also contain a bottom 4 in the optional a barcode rectangle or other identifier is inserted. In this form, usually standing vertically in recordings, the cryovials 1 are stored in the cryogenic containers.
  • the cryotube may be at a temperature between room temperature and just above the melting point of the indicator substance 42. This is in liquid form in a container 46, in which the bottom 4 of the cryotube, as shown in Figure 4B, is immersed. As a result, a part 42a of the indicator substance 42 adheres to the bottom 4 in liquid form.
  • the cryotube with the indicator substance amount 42a is now pressed into a structured mold 44 and brought to storage temperature.
  • the indicator substance 42b inversely takes the surface structure and embossment 45 of the interior of the mold 44 in an inverse manner.
  • the cryotube 40 shown in FIG. 4C thus carries on its underside a frozen indicator substance which has an embossed pattern 43 or a surface structure at a portion of its surface.
  • this solidified structure is covered with a cap 47, the z. B. optically transparent, so that an automatic identification of the structure via a camera system or an optical measuring beam 101 can be controlled.
  • the cryotube 40 is thus designed to monitor the temperature of a cryopreserved biological sample. Subsequently, it can be checked by means of the frozen indicator substance 42b at any time during the storage process whether undesired, if only temporary heating of the cryoprobe has taken place. For this purpose, it is checked whether the pattern 43 embossed in the indicator substance 42b has been lost or changed. If this is the case, it can be concluded that the limit temperature (s) to be monitored have been exceeded.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Probenbehälter, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, und ein Verfahren zur Herstellung des Probenbehälters. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe. Der Probenbehälter, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, trägt an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt.

Description

PROBENBEHÄLTER FÜR EINE KRYOKONSERVIERTE BIOLOGISCHE PROBE, VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DES PROBENBEHÄLTERS, VERFAHREN ZUR TE PERATURÜBERWA- CHUNG EINER KRYOKONSERVIERTEN PROBE
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft einen Probenbehälter, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist und ein Verfahren zur Herstellung des Probenbehälters. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe.
Die Tieftemperaturkonservierung (Kryokonservierung) von Zellen ist bisher die einzige Möglichkeit, Lebensprozesse auf zellulärer Ebene reversibel (vitalitätserhaltend) so anzuhalten, dass sie nach einer Erwärmung auf physiologische Temperaturen wieder anlaufen können. Die Kryokonservierung hat sich über große Biobanken in den letzten Jahrzehnten zu einem unverzichtbaren Element für Kliniken, Pharmaunternehmen, die Arterhaltung, den Umweltschutz und die Gesundheitsvorsorge entwickelt. Gelagert wird biologisches Material in tieftemperaturverträglichen Probenbehältern (Kryobehältern), z. B. Röhrchen, Straws und Beuteln, unterschiedlicher Größe. Bei der Kryokonservierung sind die gelagerten Biomaterialien unter Aufrechterhaltung der Vitalität des Probenmaterials gefroren, zumeist bei Temperaturen unterhalb -80 °C, für Lebendsammlungen unter -140 °C bis zur Temperatur des flüssigen Stickstoffs. Für eine kryo konservierte Probe oder eine für die Kryokonservierung vorgesehene Probe wird nachfolgend auch der Begriff„Kryoprobe" verwendet.
Für makroskopische Proben, wie z. B. Blut oder Gewebe, sind zahlreiche Techniken zur Probenlagerung bei tiefen Temperaturen entwickelt worden. In der modernen Medizin, Gentechnik und Biologie besteht die Tendenz, zunehmend kleine Proben einer Kryokonservierung zu unterziehen. Es werden beispielsweise kleine Suspensionsvolumina (Milliliter oder darunter) mit suspendierten Zellen oder Zellgruppen eingefroren. Die Kryokon- servierung von Zellen aus In-vitro-Kulturen erfolgt in überwiegendem Maße in einer Suspension. Die meisten der biomedizinisch relevanten Zellen benötigen jedoch zu ihrer Vermehrung und geordneten Entwicklung einen Substratkontakt. Daher werden Proben ggf. nach einer Kultivierung im substratgebundenen Zustand eingefroren.
Die Qualität der Proben ist von ausschlaggebender Bedeutung, da sie für Zelltherapien in Kliniken, die Entwicklung von Pharmaka und biotechnologischen Produkten, als nationale Ressourcen und vieles mehr Anwendung finden. Die Lagerzeit liegt bei einigen Tagen bis zu Jahrzehnten, mit einer Tendenz zur Langzeitlagerung. Die Proben werden in gekühlten Behältern gelagert, befinden sich zumeist in Metalleinschüben und Racks, mit denen sie bei neuen Einlagerungen oder Entnahmen Temperaturschwankungen unterliegen. Bei Lebendablagen (Zellen, Zellsuspensionen und Gewebeteilen) spielt nicht nur die ununterbrochene Kühlkette eine entscheidende Rolle, sondern auch die Vermeidung großer Temperatursprünge in der Tiefkühlphase. Da es bei der Entnahme gar nicht so selten vor- kommt, dass Kryobehälter sich auf Temperaturen von -80 °C bis -20 °C erwärmen, treten, obwohl sie noch gefroren sind, Qualitätsminderungen unerkannt auf, die nicht nur den Wert der Probe mindern, sondern auch bei ihrer Verwendung im klinischen Bereich zu lebensgefährlichen Situationen führen können. Selbst kurzzeitig aufgetauten Proben sieht man im wiedergefrorenen Zustand nicht an, dass sie dem Originalzustand nicht mehr ent- sprechen. Es geht aber vornehmlich nicht nur darum, ein Auftauen der Biomaterialien zu erkennen, sondern das Überschreiten einer Grenztemperatur im Bereich zwischen -140 °C und -20 °C zu dokumentieren. Eine Temperaturkontrolle und -dokumentation für jede Probe ist die Forderung und bislang nur selten - und wenn, dann mit hohem technischen Aufwand - zu erfüllen. Hinzu kommen umfangreiche Laboruntersuchungen nach dem Auf- tauen, die ebenfalls wertvolles Probenmaterial verbrauchen und selbst im Falle inzwischen wertlos gewordener Kryoproben Kosten erzeugen.
Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, einen Probenbehälter für eine kryokonservierte Probe bereitzustellen, der sich zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten bio- logischen Probe eignet. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Probenbehälters anzugeben. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden können und das sich durch eine vereinfachte Verfahrensführung auszeichnet.
Eine weitere Aufgabe ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, um an einem möglichst ein- fachen Marker oder Kennzeichen erkennen zu können, ob eine Kryoprobe sich über eine definierbare Grenztemperatur, und wenn auch nur kurzzeitig, erwärmt hat. Die Grenztemperatur muss im Bereich zwischen -20 °C und -140 °C vor dem Einfrieren festlegbar sein. Dies sollte an jeder einzelnen Kryoprobe und an damit Millionen von Proben rasch und leicht erkennbar möglich sein, darf die Biomaterialien nicht verändern und sollte be- reits im tiefgefrorenen Zustand erfolgen. Wenn möglich, sollte der Zustand der Probe auch im Lagerbehälter erfassbar sein, da jede Aus- und Einlagerung die Gefahr der Probenveränderung einer Vielzahl von Proben im Lagergut mit sich bringt, da in der Regel ganze Racks aufgezogen werden. Die Vorrichtung bzw. das Verfahren sollte leicht handhabbar, tieftemperaturtolerant und einstellbar sein. Es darf nur wenig oder keine Energie verbrauchen und möglichst nur geringste Kosten verursachen, da die Lagerung einer Bioprobe im gekühlten Zustand in ihren Gesamtaufwendungen nur wenige Euros kosten sollte. Diesem Anspruch müssen auch die einsetzbaren Materialien gerecht werden.
Diese Aufgaben werden durch Vorrichtungen und Verfahren mit den Merkmalen der un- abhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung werden die genannten Aufgaben durch einen Probenbehälter gelöst, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist und der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur bei Normaldruck, also bei 1013,25 hPa, in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. Die Schmelztemperatur kann auch in einem Bereich von -20 °C bis -100 °C liegen. Dadurch wird ein Probenbehälter bereitgestellt, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist. Der Probenbehälter ist ein für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter, beispielsweise ein Röhrchen, ein Straw (auch als Samenröhrchen bezeichnet), ein Beutel zur Blut- oder Stammzellenlagerung, eine Box oder ein anderer für eine Kryokonservierung geeigneter Behälter. Derartige Behälter werden entsprechend auch als Kryoröhrchen, Kryostraw, Kryobeutel, Kryobox oder allgemein als Kryobehälter bezeichnet. Der Probenbehälter hat einen Aufnahmeraum zur Aufnahme der biologischen Proben. Der Aufnahmehohlraum kann eine kryokonservierte Probe enthalten.
Kryoröhrchen (engl, cryogenic tubes) werden auch als Biobank- oder Kryobankröhrchen bezeichnet. Kryoröhrchen weisen einen Aufnahmeraum auf, der einen inneren Hohlraum zur Aufnahme einer biologischen Probe ausbildet. Das Kryoröhrchen weist ferner üblicherweise einen Deckel zum Verschließen des Aufnahmeraums auf. Der Deckel kann einen Eingriff aufweisen, über den der Deckel mit einem Werkzeug gedreht werden kann. Das Kryoröhrchen kann auch ein Bodenelement aufweisen, das eine Kennung, z. B. in Form eines maschinenlesbaren Codes, aufweist.
Bei Überschreiten der Schmelztemperatur wird die festgefrorene Indikatorsubstanz flüssig. Daraufhin verändert sich ein Konfigurationszustand der Indikatorsubstanz auf der äußeren Oberfläche des Probenbehälters, z. B. bedingt durch die Schwerkraft und/oder die Oberflächenspannung. Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz bei Überschreiten ihres Schmelzpunktes ihre Lage auf dem Probenbehälter und/oder ihre Oberflächenform ändern, was visuell oder durch eine Messeinrichtung festgestellt werden kann. Die Änderung des Konfigurationszustands bleibt auch bei einem Wiedergefrieren der Indikatorsubstanz erhalten. Die an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters festge- frorene Indikatorsubstanz weist somit vorzugsweise eine Konfiguration auf, deren Form und/oder Anordnung sich bei Überschreiten einer Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz ändert.
Ein Probenbehälter, der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt, kann somit in vorteilhafter Weise zur Temperaturüberwachung einer kryokonser- vierten biologischen Probe verwendet werden. Der erfindungsgemäße Probenbehälter ist ferner kostengünstig herstellbar und beansprucht im Vergleich zu einem herkömmlichen Probenbehälter wenig zusätzlichen Bauraum.
Die Indikatorsubstanz kann somit auf eine Außenfläche eines Probenbehälters direkt auf- gebracht werden. Die Indikatorsubstanz kann ausschließlich durch Festfrieren an einer äußeren Oberfläche des Probenbehälters befestigt sein, d. h., die Indikatorsubstanz ist nicht durch weitere Befestigungselemente, wie ein Zusatzgefäß etc. am Probenbehälter gehaltert. Die Indikatorsubstanz kann freiliegend am Behälter festgefroren sein. Zur besseren Erkennbarkeit kann die Indikatorsubstanz einen Indikatorzusatz enthalten, der eine Detektierbarkeit einer physikalischen Eigenschaft der Indikatorsubstanz erhöht. Der Indikatorzusatz kann beispielsweise ein Farbstoff sein, so dass die Indikatorsubstanz farbig oder gefärbt, d. h. nicht transparent, ist und so deren Form und/oder Lage besser optisch erkennbar ist.
Als Farbstoff kommt grundsätzlich jeder Farbstoff in Frage, welcher mindestens die folgenden Bedingungen erfüllt:
- intensives Färbevermögen auch in kleinen Mengen und Konzentrationen (z. B. ausgehend von einer gesättigten Farblösung Zugabe im Bereich < 1 Volumen-%, in der Regel im Promille- oder Subpromille-Bereich).
- frosttolerant
- lichtecht bei den Versand- als auch den relevanten tiefen Temperaturen
- löslich in allen Bestandteilen der Indikatorsubstanz
- kein Entmischen beim Einfrieren
- keine Reaktion mit Kunststoffmaterialien, welche in Kontakt mit der Indikatorsubstanz kommen.
Vorzugsweise ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Triphenylmethan- farbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, insbesondere Xanthene, Azofarbstoffe sowie Phenazin- und Phenothiazinfarbstoffe umfasst. In spezielleren Ausführungsformen ist der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün, Rhodamin B, Neutralrot, Methylenblau oder andere Farbstoffe, die zur Anfärbung von Zellen in der Zytologie verwendet werden, umfasst. Der Indikatorzusatz können Partikel, insbesondere Nanopartikel sein, die eine Streuwirkung und/oder Polarisationswirkung der Indikatorsubstanz für auf die Indikatorsubstanz auftreffende elektromagnetische Strahlung erhöhen. Dadurch kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer optischen Transmissionsmessung, Streumessung und/oder Polarisationsmessung zuverlässiger detektiert werden. Der Indikator- zusatz können leitfähige Partikel sein. Durch Beimischen von leitfähigen Partikel kann die Leitfähigkeit oder Impedanz der Indikatorsubstanz beeinflusst werden. Auf diese Weise kann eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer Leitfähigkeitsmessung oder Impendanzmessung detektiert werden. Als Indikatorsubstanz kann eine Substanz ausgewählt werden, deren Schmelztemperatur einer vorbestimmten Grenztemperatur, deren Überschreiten überwacht werden soll, entspricht. Die Indikatorsubstanz ist eine Flüssigkeit oder eine Mischung verschiedener Flüssigkeiten, deren Schmelzpunkt der gewünschten Grenztemperatur entspricht. Lediglich beispielhaft kann als Indikatorsubstanz eine Mischung aus Wasser (H20) und Ethanol (C2H6O), eine Mischung aus Wasser (H20) und Kaliumhydroxid (KOH) oder eine Mischung aus Wasser und einem Gefrierschutzmittel gewählt werden. Das Mischungsverhältnis wird dabei gemäß dem jeweiligen Schmelzdiagramm, das den Verlauf des Schmelzpunktes in Abhängigkeit vom Mischungsverhältnis angibt, so eingestellt, dass der Schmelzpunkt des Flüssigkeitsgemisches den gewünschten Wert, nämlich die zu überwachende Grenztemperatur, aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindestens einen Alkohol, welcher aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan- 1,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclo- pentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt ist. Besonders bevorzugt ist der mindestens eine Alkohol aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan-2-ol ausgewählt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Indikatorsubstanz mindestens zwei verschiedene Alkoholkomponenten:
a) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst;
b) einen Alkohol, ausgewählt aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, mit einem niedrigeren Schmelzpunkt als der Alkohol der Komponente a);
wobei das Mischungsverhältnis der Komponenten a) und b) so eingestellt ist, dass die Schmelztemperatur der Mischung innerhalb eines Temperaturbereichs von -20 °C bis -160 °C, insbesondere von -25 °C bis -160 °C oder -50 °C bis -150 °C, liegt.
Speziellere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz eine der folgenden Kombinationen der Komponenten a) und b) umfasst:
- Octan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Octan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Octan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Nonan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Nonan-l-ol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Nonan-l-ol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Propan-l,2-diol und Propan-l,3-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Propan-l,2-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Propan-l,3-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Propan-l,3-diol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Pentan-l,5-diol und' Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Benzylalkohol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Pentan-l-ol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Pentan-l-ol und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Cyclopentanol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Cyclopentanol und Propan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; - Cyclopentanol und Pentan-l-ol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%;
- Cyclopentanol und Butan-l,2-diol in einem Mischungsverhältnis von 5 bis 95 Vol.-%; wobei der angegebene Wert des Mischungsverhältnisses sich jeweils auf den Anteil der erstgenannten Komponente in der Mischung aus beiden Komponenten bezieht.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Indikatormischung beispielsweise Propan-l,2-diol und Butan-2-ol in einem Mischungsverhältnis von 40 bis 60 Vol.-% (ergibt eine Schmelztemperatur von ca. - 90 °C), Propan-l,2-diol und Propan-1,3- diol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%, oder Propan-l,3-diol und Butan- 2-ol in einem Mischungsverhältnis von 30 bis 70 Vol.-%.
Vorzugsweise umfasst die Indikatorsubstanz neben dem mindestens einen Alkohol noch mindestens einen Farbstoff wie oben beschrieben. Besonders bevorzugt ist dieser Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt, welche Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B umfasst.
Eine noch speziellere Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz zwei Alkohole a) und b), die aus Propan-l,3-diol, Propan-l,2-diol und Butan- 2-ol ausgewählt sind, vorzugsweise in einem Mischungsverhältnis wie oben angegeben, sowie einen Farbstoff, der aus Gruppe ausgewählt ist, welche aus Oil Red, Methylrot, Brillantgrün und Rhodamin B besteht, umfasst.
Die Konzentration des Farbstoffs in der Alkoholkomponente kann je nach Farbstoff und Alkohol stark variieren. In der Regel soll die Konzentration bei intensiver Färbung so niedrig wie möglich gehalten werden, damit die Farbmoleküle das Gefrier- und Schmelzverhalten der Alkohole, in denen sie gelöst werden, nicht verändern oder deren Viskosität erhöhen. Die Farbstoffkonzentration liegt dabei typischerweise in einem Bereich von < 10 Volumen-%, insbesondere < 1 % oder < 0,1 %, also im Prozent- oder Promille- bzw. Subpromillebereich.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung entspricht die zu überwachende Grenztemperatur nicht direkt der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz, sondern vielmehr der- jenigen Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur, bei der die Viskosität der geschmolzenen Substanz soweit abgenommen hat, dass der erforderliche Flüssigkeitstransport stattfinden kann. Diese Temperatur wird hier auch als Schwellentemperatur bezeichnet und liegt typischerweise in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30°C, beispielsweise 3-10 °C, 3-20 °C, 5-10 °C oder 5-20 °C, oberhalb der nominellen Schmelztemperatur.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Indikatorsubstanz daher dadurch gekenn- zeichnet, dass die flüssige Mischung in einem Temperaturbereich von 3-30 °C oder 5-30 °C oberhalb der Schmelztemperatur eine Viskosität in einem Bereich von 10 bis 106 mPa*s, vorzugsweise 10 bis 104 mPa*s, aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der die festgefrorene Indikatorsub- stanz tragende Bereich eine Beschichtung, Aufrauung und/oder eine Strukturierung auf. Beispielsweise kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine haftverstärkende Strukturbeschichtung aufweisen. Dadurch wird die Haftung der festgefrorenen Indikatorsubstanz verbessert. Gemäß einem weiteren Aspekt kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Verspiegelung aufweisen. Gemäß dieser Variante ist die Indikatorsubstanz somit auf einem verspiegelten Bereich der äußeren Wandung des Probenbehälters festgefroren. Bei dieser Ausführungsform ist eine Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz mittels einer Messeinrichtung oder rein visuell besonders zuverlässig zu erfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Elektrodenanordnung aufweisen. Die Elektrodenanordnung kann beispielsweise als Gold- oder Platinelektroden ausgeführt sein. Gemäß dieser Variante ist die Indikatorsubstanz somit auf der Elektrodenanordnung festgefroren, insbesondere derart, dass ein über die Elektrodenanordnung messbarer Widerstand oder eine Impedanz davon abhängt, ob die Indikatorsubstanz sich auf der Elektrodenanordnung befindet oder nicht. So kann anhand des gemessenen Widerstands bestimmt werden, ob sich die Indika- torsubstanz noch im ursprünglich angebrachten festgefrorenen Zustand auf der Elektrodenanordnung befindet ober ob die Indikatorsubstanz bei Überschreiten ihres Schmelzpunktes durch das Flüssigwerden aus dem Bereich der Elektrodenanordnung herausgeflossen ist.
Zusätzlich zum Probenbehälter kann ferner eine Messeinrichtung vorgesehen sein, die ausgebildet ist, den Widerstand bzw. die Impedanz der Elektrodenanordnung zu erfassen.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Indikatorsubstanz in einer vorbestimmten Anord- nung auf die äußere Oberfläche des Probenbehälters aufgebracht ist. Die an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters festgefrorene Indikatorsubstanz kann somit eine bestimmte Anordnung aufweisen, die sich bei Überschreiten einer Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz ändert, z. B. unter dem Einfluss der Schwerkraft. Die Anordnung kann eine Zahl, ein Buchstabe, ein Symbol, eine Kennung und/oder eine ande- re Struktur darstellen, die für einen Nutzer visuell leicht erkennbar ist. Ist die Anordnung nach einer Kryolagerung noch unverändert erkennbar, wurde die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz bei der Kryolagerung nicht überschritten. Hat sich die Anordnung verändert oder ist verschwunden, kann daran festgestellt werden, dass die Schmelztemperatur und damit eine kritische Grenztemperatur überschritten wurde. Ein Nutzer kann somit auf einfache Weise durch eine visuelle Sichtprüfung feststellen, ob ein unerwünschter Temperaturanstieg über die Schmelztemperatur bzw. über die zu überwachende Grenztemperatur stattgefunden hat.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann die auf der äußeren Oberfläche aufgebrachte Indika- torsubstanz durch festgefrorene Tropfen der Indikatorsubstanz erhalten sein. Dies ermöglicht eine genaue Dosierbarkeit der aufzubringenden Indikatorsubstanz und eine präzise Anordnung der Indikatorsubstanz, z. B. unter Verwendung einer Tropfenschussvorrichtung. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können mehrere unterschiedliche Indikatorsubstanzen, deren unterschiedliche Schmelztemperaturen jeweils in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegen, an verschiedenen Bereichen der äußeren Oberfläche des Probenbehälters aufgebracht sein. Dies bietet den Vorteil, dass mehrere Temperaturgrenzwerte bei der Kryolagerung überwacht werden können bzw. dass die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingegrenzt werden können. Bei einer vorteilhaften Variante dieser Ausgestaltungsform ist der Probenbehälter ein Kryoröhrchen, und mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen, die sich in ihren Schmelztemperaturen unterscheiden, sind jeweils in Form von aneinander gereihten festgefrorenen Tropfen auf einen Aufnahmezylinder des Kryoröhrchens aufgebracht. Die verschiedenen Indikatorsubstanzen können insbesondere jeweils in Form von bandförmig, bei- spielsweise ringförmig, aneinander gereihten festgefrorenen Tropfen auf der Außenfläche des Aufnahmezylinders des Kryoröhrchens angeordnet sein, wobei die verschiedenen Indikatorsubstanzen in Axialrichtung des Kryoröhrchens versetzt zueinander angeordnet sind. Diese Anordnung ist visuell einfach auf Änderungen zu überprüfen. Die Axialrichtung entspricht der Längsrichtung des Kryoröhrchens.
Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz in Axialrichtung umso tiefer oder höher angeordnet sein, je niedriger ihr Schmelzpunkt im Vergleich zu den Schmelzpunkten der anderen Indikatorsubstanzen ist. Mit anderen Worten können die verschiedenen Indikatorsubstanzen nach ihren Schmelztemperaturen in absteigender oder aufsteigender Reihenfolge sortiert in Axialrichtung angeordnet sein. Dies ermöglicht eine visuell besonders einfach durchzuführende Eingrenzung der Temperaturintervalle, in die die im Probenbehälter gelagerter Probe gelangt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die festgefrorene Indika- torsubstanz zumindest an einem Teilbereich ihrer Oberfläche ein Muster und/oder eine Oberflächenstruktur aufweisen, beispielsweise ein eingeformtes oder eingeprägtes Muster. Ein Muster oder eine Oberflächenstruktur verschwindet oder verändert sich zumindest beim Flüssigwerden der Indikatorsubstanz, so dass anhand des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins des Musters überprüft werden kann, ob die Schmelztemperatur zumindest zeitweise überschritten wurde. Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser Ausführungsform kann auf dem Muster und/oder der Oberflächenstruktur eine transparente oder semi-transparente
Schutzabdeckung angeordnet sein. Dadurch kann das Muster vor externer mechanischer Beschädigung geschützt werden.
Beispielsweise kann das Muster oder die Oberflächenstruktur ein eingeprägtes Muster sein. Ein eingeprägtes Muster kann beispielsweise erhalten sein durch eine Formgebung der Indikatorsubstanz in flüssigem Aggregatszustand in einer Form und durch nachfolgendes Gefrieren der geformten Indikatorsubstanz.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitgestellt, umfassend einen erfindungsgemäßen Probenbehälter, wie in diesem Dokument beschrieben, sowie eine Messeinrichtung, die ausgebildet ist, eine Konfigurationsänderung, insbesondere eine Änderung der Form, Anordnung und/oder Lage, der festgefrorenen Indikatorsubstanz zu erfassen.
Die Messeinrichtung kann je nach Ausführungsform zweckmäßig ausgeführt sein. Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Elektrodenanordnung aufweist, kann die Messeinrichtung ausgebildet sein, einen Widerstand oder eine Impedanz der Elektrodenanordnung zu messen, wie vorstehend bereits beschrieben wurde.
Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Be- reich eine Verspiegelung aufweist, kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, einen Messstrahl, z. B. einen elektromagnetischen Strahl, auf die auf der Verspiegelung festgefrorene Indikatorsubstanz zu richten und einen reflektierten Messstrahl zu erfassen, falls dieser reflektiert wird. Bei Überschreiten der Indikatorsubstanz wird diese im flüssigen Aggregatszustand am Probenbehälter herunterfließen, so dass der Mess- strahl jetzt direkt auf die verspiegelte Fläche trifft, die zuvor noch von der festgefrorenen Indikatorsubstanz verdeckt war. Der Messstrahl wird nun an der verspiegelten Fläche reflektiert, was von der Messeinrichtung detektiert werden kann. Sobald die Messeinrich- tung somit einen reflektierten Messstrahl detektiert, kann auf eine zumindest kurzzeitige Überschreitung der Schmelztemperatur geschlossen werden. Bei der Ausführungsform, bei der der die festgefrorene Indikatorsubstanz ein Muster oder eine Oberflächenstruktur aufweist, kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, optisch zu erfassen, ob das Muster oder die Oberflächenstruktur noch vorhanden ist oder nicht. In analoger Weise kann die Messeinrichtung beispielsweise ausgebildet sein, zu erfassen, ob die Anordnung der Indikatorsubstanz noch vorhanden ist oder nicht, etc.
Mit dem Begriff Probenbehälter wird insbesondere ein für eine Kryokonservierung ausge- legter Behälter bezeichnet. Der Probenbehälter ist vorzugsweise unter Verwendung tief- temperaturverträglichen Kunststoffmaterials für Temperaturen unter -140 °C hergestellt. Das Kunststoffmaterial kann ohne Veränderung und ohne Schaden wiederholte Temperaturwechsel tolerieren. Es wird vorzugsweise ein Kunststoffmaterial verwendet, dessen Wasseraufnahmefähigkeit < 1 % der Eigenmasse, insbesondere < 0.1 % der Eigenmasse beträgt. Erfindungsgemäße Kryospeicherelemente basieren beispielsweise auf Polyurethan oder Polyethylen.
Mit dem Begriff„biologische Probe" wird biologisches Material wie Zellen, Gewebe, Zellbestandteile, biologische Makromoleküle etc. bezeichnet, welches im Probenbehälter der Kryokonservierung unterzogen wird - ggf. in einer Suspension und/oder im Verbund mit einem Substratmaterial. Im Aufnahmeraum kann somit ein Substrat angeordnet sein, das zur adhärenten Aufnahme biologischer Zellen, die Teil der biologischen Probe sind, eingerichtet ist. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Probenbehälters, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines Probenbehälters, der zur Aufnahme einer biologischen Probe ausgelegt ist. Der Probenbehälter ist vorzugsweise ein Kryoprobenbehälter.
Das Verfahren umfasst ferner das Aufbringen einer Indikatorsubstanz, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt, an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters im flüssigen Aggregatszustand sowie das Gefrieren der aufgebrachten Indikatorsubstanz.
Gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel des Verfahrens wird vor dem Aufbringen der Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand der Probenbehälter auf eine Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz gekühlt. Dadurch kann ein schnelles Festfrieren der ausgebrachten Indikatorsubstanz erzielt werden.
Beispielsweise kann die Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand tropfenförmig mittels einer Tropfendepositionsvorrichtung, z. B. einer Tropfenschussvorrichtung, auf die äußere Oberfläche des tiefgekühlten Probenbehälters aufgebracht werden. Tropfenschussvorrichtungen, z. B. ausgeführt als Piezo-Druckdüse oder Piezo-Druckkopf, sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und hier nicht näher beschrieben. Gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel des Verfahrens erfolgen das Aufbringen der flüssigen Indikatorsubstanz und das anschließende Gefrieren gemäß der folgenden Schritte:
Zunächst erfolgt ein teilweises Eintauchen des Probenbehälters in einen mit einer Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand gefüllten Behälter, so dass an einer Stelle die Indikatorsubstanz an einer Außenseite des Probenbehälters anhaftet. Anschließend erfolgt ein Positionieren des Probenbehälters an einer Hohlform, derart, dass die am Probenbehälter anhaftende Indikatorsubstanz eine Prägung im Innenraum der Hohlform ausfüllt. Nachdem die Indikatorsubstanz in der Hohlform gefroren wurde, wird die Hohlform von der am Probenbehälter festgefrorenen Indikatorsubstanz entfernt. Hierdurch wird die durch die Hohlform in eine Oberfläche der Indikatorsubstanz eingebrachte Prägung freigelegt.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines Probenbehälters, der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologische Probe ausgelegt ist und der an einem Bereich seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz trägt, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt. Der Probenbehälter kann ferner gemäß den in diesem Dokument beschriebenen Ausführungsformen und Varianten ausgeführt sein. Zur Vermeidung von Wiederholungen sollen rein vorrichtungsgemäß offenbarte Merkmale auch als verfahrensgemäß offenbart gelten und beanspruchbar sein. Der Probenbehälter kann eine kryokonservierte biologische Probe in seinem Aufnahmeraum aufweisen. Der Probenbehälter kann bei Lagertemperatur unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz gelagert werden, zur kryokonservierten Lagerung der biologischen Probe.
Das Verfahren umfasst ferner das Feststellen, ob eine durch ein zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz erfolgte Konfigurationsänderung der Indikatorsubstanz stattgefunden hat, insbesondere ob eine Änderung der Form oder Anordnung, insbesondere Lage, der Indikatorsubstanz stattgefunden hat. An dieser Veränderung kann sofort durch Anschauen oder auch technisch automatisiert festgestellt werden, ob die zu überwachende Grenztemperatur überschritten wurde.
Die zuvor beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung sind miteinander kombinierbar. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen: FIG. 1-4 schematische Ansichten verschiedener Ausführungsbeispiele eines Probenbehälters, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist;
FIG. 5A, 5B, 6A jeweils ein Schmelzdiagramm eines Flüssigkeitsgemisches;
FIG. 6B eine Tabelle mit Schmelzpunkten einiger reiner Flüssigkeiten; und
FIG. 7 eine Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln. Gleiche oder funktional äquivalente Elemente sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet und werden zum Teil nicht gesondert beschrieben. Die Figur 1A zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel eines Probenbehälters 10, der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist. Die Figur 1A illustriert ferner stark schematisiert die Herstellung eines solchen Probenbehälters 10.
Der Probenbehälter 10 ist ein Kryoröhrchen, das in Figur 1A im komplett zugeschraubten Zustand dargestellt ist. Das Kryoröhrchen umfasst ein zylindrisches Aufnahmeteil 1, das einen Aufnahmeraum 2 ausbildet, in dem eine biologische Probe (Bioprobe) 6 gelagert ist Die biologische Probe kann eine Zellsuspension sein. Das zylindrische Aufnahmeteil 1 ist mit einem Deckel 3 verschlossen. Das Kryoröhrchen weist ferner ein Bodenteil 4 auf.
Der Probenbehälter 10 befindet sich in Figur 1A bereits auf der Lagertemperatur, z. B. bei -140 °C, mindestens aber unterhalb des Schmelzpunktes der Indikatorsubstanz 8. Das Kryoröhrchen trägt an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt.
Hierbei ist je nach Temperaturgrenzwert, der bei der Kryolagerung überwacht werden soll, eine geeignete Flüssigkeit oder ein Flüssigkeitsgemisch als Indikatorsubstanz 12 aus- zuwählen.
Über die Auswahl geeigneter Flüssigkeiten und das Mischungsverhältnis von Flüssigkeiten kann deren Schmelzpunkt auf einen gewünschten Wert, insbesondere in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C, festgelegt werden.
Beispielhaft ist in Figur 5A der Verlauf des Schmelzpunktes als Funktion des Mischungsverhältnisses aus einem Alkohol und Wasser angegeben, mit dem bei moderater Viskositätserhöhung mit abfallender Temperatur ein Temperaturbereich zwischen 0 °C und -118 °C abgedeckt werden kann. Soll z. B. ein Temperaturgrenzwert von -118 °C überwacht werden, kann der Ethanolanteil auf 93,5 % festgelegt werden. Schmelzpunkte bis zu einem Wert von knapp unter -60 °C können auch durch Zumischung von Kaliumhydroxid (KOH) zu Wasser eingestellt werden, was in Figur 5B anhand eines Schmelzdiagramms gezeigt ist. Auch eine Mischung aus Wasser und Gefrierschutzmittel kann als Indikatorsubstanz verwendet werden, was durch das Schmelzdiagramm der Figur 6A illustriert ist. Die Tabelle der Figur 6B führt Gefrierpunkte/Schmelzpunkte weiterer reiner Flüssigkeiten auf, die alleine oder als Mischung mit einer anderen Flüssigkeit als Indikatorsub- stanz verwendet werden können. Weitere als Indikatorsubstanz geeignete Flüssigkeitsgemische sind Chloroform-Zyklohexan-Gemische oder andere mischbare Flüssigkeiten, die z. B. aus der Mischbarkeitsmatrix von Lösemitteln der Figur 7 entnommen werden können. Falls mehrere Temperaturgrenzwerte bei der Kryolagerung überwacht werden sollen bzw. falls die erreichten Temperaturintervalle, in die die Probe gelangt ist, genauer eingegrenzt werden sollen, können entsprechend mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen mit verschiedenen Schmelzpunkten verwendet werden, was nachfolgend noch anhand von Figur 2 beschrieben wird.
Der Bereich 11 des in Figur 1A gezeigten Kryoröhrchens trägt die Indikatorsubstanz 12 in Form von in der Axialrichtung A (dargestellt durch den vertikalen Pfeil in Figur 1) reihen- förmig angeordneten festgefrorenen Tropfen 13. Die Tropfen 13 der Indikatorsubstanz 12 werden dabei wie folgt auf das Kryoröhrchen aufgebracht: Auf die kalte Oberfläche des Bereichs 11 des Kryoröhrchens wird über eine Tropfenschussvorrichtung 7 die warme oder vorgekühlte Indikatorsubstanz 8 im flüssigen Aggregatszustand tropfenweise aufgeschossen, z. B. über Piezo-Druckdüsen. Die Tropfen 8 gefrieren auf der tiefkalten Oberfläche, wie in Figur 1A durch die Bezugszeichen 13 dar- gestellt.
Zur Verbesserung der Haftung kann der Oberflächenbereich 11, der zur Halterung der Indikatorsubstanz vorgesehen ist, in seinen Eigenschaften so verändert werden, dass eine gute Benetzung und Haftung der Tropfen erfolgt, z. B. durch Aufrauen des Bereichs 11 und/oder durch Aufbringen einer Struktur oder chemischen Beschichtung auf den Bereich
11. Die Tropfen 13 erstarren auf der Oberfläche, wie in Figur 1A gezeigt. Überschreitet die Kryoprobe bei der Lagerung zu irgendeinem Zeitpunkt die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 8, dann verflüssigen sich die gefrorenen Tropfen 13 und fließen vollständig oder partiell zusammen. Es ergibt sich dann ein Bild, das in etwa so aussieht wie in Figur 1B dargestellt.
Befindet sich die Indikatorsubstanz 12 nach einer Kryolagerung nicht mehr in dem in Figur 1A gezeigten Zustand, sondern in einem Zustand, bei dem die Tropfen zumindest teilweise zusammengeflossen sind wie in Figur 1B schematisch illustriert, dann kann daraus ge- schlössen werden, dass die Schmelztemperatur und damit eine kritische Grenztemperatur überschritten wurde. Wird dagegen nach einer Kryolagerung eine unveränderte Anordnung der Indikatorsubstanz vorgefunden, ist die Probe 6 ordnungsgemäß durchgehend unterhalb der Schmelztemperatur gelagert worden. Ein Nutzer kann somit auf einfache Weise durch eine visuelle Sichtprüfung feststellen, ob ein unerwünschter Temperaturanstieg über die Schmelztemperatur bzw. über die zu überwachende Grenztemperatur stattgefunden hat.
Über die Möglichkeit, mit Piezo-Systemen sehr feine Tropfensysteme zu verschießen, las- sen sich auf der Oberfläche des Probenbehälters auch größere Tropfenareale oder auch
Buchstaben, Muster und rasch erkennbare Strukturen bis hin zu Barcodes und anderen Kennungen erzeugen. Diese Strukturen gehen verloren, wenn die kritische Temperatur der Indikatorsubstanz überschritten wird. Beispielhafte Anordnungen sind in Figur IC und Figur 1D dargestellt.
Figur IC zeigt einen Probenbehälter 10a, der an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12a trägt, die aus einem größeren Tropfenareal und/oder mehreren regelmäßig übereinander und nebeneinander angeordneten gefrorenen Tropfen 13a aus Indikatorsubstanz gebildet ist. Figur 1D zeigt einen Proben- behälter 10a, der an einem Bereich 11 seiner äußeren Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz 12b trägt, die in Form eines Buchstabens aufgebracht ist. Geht die Anord- nung der Indikatorsubstanz 12a oder 12b bei der Kryolagerung verloren, kann wiederum auf ein zumindest zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur geschlossen werden.
Die Figur 2A zeigt erneut ein auf der Lagertemperatur befindliches Kryoröhrchen 20 und eine Tröpfchenschussvorrichtung 7.
Ringförmig werden in diesem Beispiel, wie in Figur 1A gezeigt, eine Reihe von Indikatorsubstanztropfen 8 bandförmig auf einen Bereich 21 der äußeren tiefkalten Oberfläche des Kryoröhrchens 1 gebracht, wo sie festfrieren.
In dem Ausführungsbeispiel der Figur 2 werden verschiedene Indikatorsubstanzen 23a, 23b und 23c, deren Schmelztemperaturen unterschiedlich sind, verwendet. Lediglich beispielhaft kann die Indikatorsubstanz 23a eine Schmelztemperatur von -60 °C, die Indikatorsubstanz 23b eine Schmelztemperatur von -70 °C und die Indikatorsubstanz 23c eine Schmelztemperatur von -80 °C aufweisen. Bringt man die verschiedenen Indikatorsubstanzen so wie in Figur 2A gezeigt auf das Kryoröhrchen auf, wobei ihre Schmelztemperaturen von oben nach unten abnehmen, so lässt sich ebenfalls bei Überschreiten einer oder mehrerer Schmelztemperaturen an der Struktur erkennen, dass eine unstatthafte Temperaturerhöhung stattgefunden hat.
In Figur 2B ist beispielhaft der Fall dargestellt, dass lediglich die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 23a (oberer Tropfenring in Figur 2A) überschritten wurde, so dass nur der obere Tropfenring in Figur 2B nach unten geflossen ist, was wiederum sehr leicht von außen detektiert werden kann und die Bioprobe im Inneren nicht kontaminiert.
Figur 3A zeigt in der linken Teilfigur ein Kryoröhrchen analog zu den Figuren 1 und 2, bei dem sich an dem Bereich 31 der äußeren Oberfläche, auf den die Indikatorsubstanz 32 aufgebracht wird, noch eine Elektrodenanordnung 33, 34 befindet, z. B. in Form miniaturisierter Gold- oder Platinelektro-den.
Wird die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 32 überschritten, fließt diese aus dem Elektrodenbereich heraus, wodurch sich der Widerstand bzw. die Impedanz ändert, was durch Abtasten der Elektroden 33, 34 detektiert werden kann. Ein Zustand des Kryoröhrchens 30, bei dem die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 32 überschritten wurde, ist in der rechten Teilfigur in Figur 3A gezeigt. In der Darstellung 3B ist eine Ausführung des Kryoröhrchens 30a gezeigt, bei der auf sich auf zwei Bereichen 31 der äußeren Oberfläche des Kryoröhrchens jeweils eine verspiegelte Fläche 35a, 35b befindet, auf die die Indikatorsubstanz 32a, 32b aufgebracht wird. Optisch, visuell oder über einen Messstrahl 100 kann festgestellt werden, ob sich die Indikatorsubstanz 32a, 32b noch auf diesen ursprünglichen Positionsfeldern auf der verspiegel- ten Fläche 35a, 35b befindet. Ist dies der Fall, ist die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz nicht überschritten worden. In der rechten Teilfigur der Figur 3B ist dagegen ein Zustand gezeigt, bei dem die Indikatorsubstanz 32a, 32b durch Schmelzen und Abfließen diesen Bereich verlassen hat. Hier kann somit auf eine zwischenzeitlich erfolgte Überschreitung der Schmelztemperatur und damit der zu überwachenden Grenztemperatur geschlossen werden.
Ferner können unterschiedliche Indikatorsubstanzen gewählt werden, so dass die Indikatorsubstanz 32a auf der ersten verspiegelten Fläche 35a eine Schmelztemperatur aufweist, die einem ersten zu überwachenden Temperaturgrenzwert entspricht und dass die Indikatorsubstanz 32b auf der zweiten verspiegelten Fläche 35b eine Schmelztemperatur aufweist, die einem zweiten zu überwachenden Temperaturgrenzwert entspricht.
Figur 4 illustriert schematisch in der zeitlichen Abfolge der Figuren 4A, 4B, 4C, und 4D die Herstellung eines weiteren Kryoröhrchens 40, das für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist.
In Figur 4A ist ein Probenbehälter in Form eines typischen verschlossenen Kryoröhrchens (Tube) 1, wie es in Kryobiobanken verwendet wird, in einer Schnittansicht gezeigt. Es um- fasst in der Regel ein Aufnahmevolumen 2 für die Bioprobe, in dem sich die Biomaterialien befinden. Die Bioprobe ist z. B. hier eine Zellsuspension 6. Das Kryoröhrchen umfasst ferner einen Deckel 3, der das Gefäß verschließt und oben einen Eingriff 4 besitzt, über den der Deckel 3 mit einem Werkzeug (nicht gezeigt) im Fall der Automatisierung gedreht werden kann. Diese Kryoröhrchen 1 können auch einen Boden 4 enthalten, in den optio- nal ein Barcodeviereck oder eine andere Kennung eingefügt ist. In dieser Form, zumeist senkrecht in Aufnahmen stehend, werden die Kryoröhrchen 1 in den Tieftemperaturbehältern gelagert. Das Kryoröhrchen kann sich bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und kurz oberhalb des Schmelzpunktes der Indikatorsubstanz 42 befinden. Diese liegt in flüssiger Form in einem Behälter 46 vor, in den der Boden 4 des Kryoröhrchens, wie in Figur 4B gezeigt, getaucht wird. Dadurch haftet ein Teil 42a der Indikatorsubstanz 42 in flüssiger Form am Boden 4 an. Das Kryoröhrchen mit der Indikatorsubstanzmenge 42a wird nun in eine strukturierte Form 44 gedrückt und auf Lagertemperatur gebracht. Dadurch nimmt die Indikatorsubstanz 42b die Oberflächenstruktur und Prägung 45 des Innenraums der Form 44 in inverser Weise an.
Das in Figur 4C gezeigten Kryoröhrchen 40 trägt somit an seiner Unterseite eine festgefrorene Indikatorsubstanz, die an einem Teilbereich ihrer Oberfläche ein eingeprägtes Muster 43 oder eine Oberflächenstruktur aufweist. Zum Schutz während der weiteren Lagerung wird diese erstarrte Struktur mit einer Kappe 47 bedeckt, die z. B. optisch- transparent ausgeführt werden kann, so dass eine automatische Identifizierung der Struktur über ein Kamerasystem oder einen optischen Messstrahl 101 kontrolliert werden kann.
Gehen das in die Indikatorsubstanz 42b eingeprägte Muster 43 oder die eingebrachte Struktur verloren oder verändern sich, ist die Kryoprobe wieder zu irgendeinem Zeitpunkt über die Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz 42b gebracht worden. Das Kryoröhrchen 40 ist somit zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt. Nachfolgend kann mittels der festgefrorenen Indikatorsubstanz 42b zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Lagervorgangs überprüft werden, ob eine unerwünschte, wenn auch nur zeitweise Erwärmung der Kryoprobe stattgefunden hat. Hierzu wird geprüft, ob das in die Indikatorsubstanz 42b eingeprägte Muster 43 verloren gegangen ist oder sich verändert hat. Ist dies der Fall, kann auf ein Überschreiten der zu überwachenden Grenz- temperatur(en) geschlossen werden.
Erzeugt man eine Struktur, in der ein fließender oder gruppenweiser Übergang von sehr feinen zu gröberen Strukturelementen realisiert wird, so kann über die Veränderungen der Struktur auch ein sehr kurzzeitiges Überschreiten des Schmelzpunktes erkannt werden. Die geometrisch kleinsten und feinsten Strukturen verändern sich zuerst.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsbeispiele beschrieben worden ist, ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass verschiedene Änderungen ausgeführt werden können und Äquivalente als Ersatz verwendet werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Folglich soll die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele begrenzt sein, sondern soll alle Ausführungsbeispiele umfassen, die in den Bereich der beigefügten Patentansprüche fallen. Insbesondere beansprucht die Erfindung auch Schutz für den Gegenstand und die Merkmale der Unteransprüche unabhängig von den in Bezug genommenen Ansprüchen.

Claims

ANSPRÜCHE 1. Probenbehälter (10; 20; 30; 30a; 40) der zur Aufnahme einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, der an einem Bereich (11; 31, 41) seiner äußeren
Oberfläche eine festgefrorene Indikatorsubstanz (12; 22; 32; 42b) trägt, deren
Schmelztemperatur in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegt.
2. Probenbehälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der die
festgefrorene Indikatorsubstanz (12; 22; 32; 42b) tragende Bereich (11; 21; 31, 41) eine BeSchichtung, Aufrauung und/oder Strukturierung aufweist.
3. Probenbehälter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der die festgefrorene Indikatorsubstanz (12; 22; 32; 42b) tragende Bereich eine Verspiegelung (35) aufweist.
4. Probenbehälter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der die festgefrorene Indikatorsubstanz tragende Bereich eine Elektrodenanordnung (33; 34) aufweist.
5. Probenbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz in einer vorbestimmten Anordnung auf die äußere Oberfläche des Probenbehälters (10; 20; 30; 30a; 40) aufgebracht ist, wobei die Anordnung eine Zahl, ein Buchstabe (12b), ein Symbol, eine Kennung und/oder eine Struktur (12; 12a; 22) darstellt.
6. Probenbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die auf der äußeren Oberfläche aufgebrachte Indikatorsubstanz (12; 12a; 12b) erhalten ist durch festgefrorene Tropfen (8) der Indikatorsubstanz.
7. Probenbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere unterschiedliche Indikatorsubstanzen (23a, 23b, 23c: 32a; 32b), deren unterschiedliche Schmelztemperaturen jeweils in einem Bereich von -20 °C bis -140 °C liegen, an verschiedenen Bereichen der äußeren Oberfläche des Probenbehälters (20; 30a) aufgebracht sind.
8. Probenbehälter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Probenbehälter (10; 20; 30; 30a; 40)ein Kryoröhrchen ist.
9. Probenbehälter nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
a) dass mehrere verschiedene Indikatorsubstanzen, die sich in ihren
Schmelztemperaturen unterscheiden, jeweils in Form von aneinander gereihten
festgefrorenen Tropfen (23a, 23b, 23c) auf einen Aufnahmezylinder des Kryoröhrchens (20) aufgebracht sind, insbesondere jeweils in Form von bandförmig, beispielsweise ringförmig, aneinander gereihten Tropfen, und
b) dass die verschiedenen Indikatorsubstanzen in Axialrichtung (A) des Kryoröhrchens (20) versetzt zueinander angeordnet sind.
10. Probenbehälter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die festgefrorene Indikatorsubstanz zumindest an einem Teilbereich ihrer Oberfläche ein Muster oder eine Oberflächenstruktur aufweist.
11. Probenbehälter nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Muster oder die Oberflächenstruktur ein eingeprägtes Muster (43) ist, vorzugweise erhalten durch eine Formgebung der Indikatorsubstanz in flüssigem Aggregatszustand in einer Form (44) und durch nachfolgendes Gefrieren der geformten Indikatorsubstanz (42b).
12. Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe, umfassend
einen Probenbehälter (10; 20; 30; 30a; 40) nach einem der vorhergehenden
Ansprüche; und eine Messeinrichtung, die ausgebildet ist, eine Konfigurationsänderung, insbesondere einer Änderung der Form, Anordnung und/oder Lage, der festgefrorenen Indikatorsubstanz zu erfassen.
13. Verfahren zur Herstellung eines Probenbehälters (10; 20; 30; 30a; 40), der für eine Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe ausgelegt ist, umfassend
Bereitstellen eines Probenbehälters zur Aufnahme einer biologischen Probe; und Aufbringen einer Indikatorsubstanz, deren Schmelztemperatur in einem Bereich von - 20 °C bis -140 °C liegt, an einem Bereich der äußeren Oberfläche des Probenbehälters im flüssigen Aggregatszustand; und
Gefrieren der aufgebrachten Indikatorsubstanz.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Aufbringen der Indikatorsubstanz im flüssigen Aggregatszustand der Probenbehälter auf eine Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz gekühlt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die
Indikatorsubstanz tropfenförmig mittels einer Tropfendepositionsvorrichtung (7) auf die äußere Oberfläche des Probenbehälters aufgebracht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch
a) teilweises Eintauchen des Probenbehälters (1) in einen mit einer Indikatorsubstanz (42) im flüssigen Aggregatszustand gefüllten Behälter (46), so dass an einer Stelle die
Indikatorsubstanz (42a) an einer Außenseite des Probenbehälters (1) anhaftet;
b) Positionieren des Probenbehälters (1) an einer Hohlform (44), derart, dass die am Probenbehälter (1) anhaftende Indikatorsubstanz (42a) eine Prägung (45) im Innenraum der Hohlform (44) ausfüllt; und
c) nachdem die Indikatorsubstanz gefroren wurde, Entfernen der Hohlform (44) von der am Probenbehälter festgefrorenen Indikatorsubstanz (42b).
17. Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Probenbehälters (10; 20; 30; 30a; 40) nach einem der Ansprüche 1 bis 12;
b) Feststellen, ob eine durch ein zeitweises Überschreiten der Schmelztemperatur der Indikatorsubstanz oder der Schwellentemperatur, bei der die Viskosität der geschmolzenen Indikatorsubstanz einen bestimmten Zielwert unterschreitet, erfolgte Änderung der Form oder Anordnung, insbesondere Lage, der Indikatorsubstanz stattgefunden hat.
18. Probenbehälter, Vorrichtung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz mindestens einen Alkohol, welcher aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-l,2-diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt ist, sowie optional mindestens einen Farbstoff umfasst.
19. Probenbehälter, Vorrichtung oder Verfahren nach Anspruch 18, dadurch
gekennzeichnet, dass der Farbstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, welche
Triphenylmethanfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, insbesondere Xanthene, Azofarbstoffe sowie Phenazin- und Phenothiazinfarbstoffe umfasst.
20. Probenbehälter, Vorrichtung oder Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorsubstanz mindestens zwei Alkoholkomponenten, welche aus der Gruppe, die Octan-l-ol, Nonan-l-ol, Propan-l,2-diol, Propan-l,3-diol, Butan-1,2- diol, Butan-l,3-diol, Butan-2-ol, Pentan-l,5-diol, Pentan-l-ol, Cyclopentanol, Benzylalkohol umfasst, ausgewählt sind, umfasst und/oder die Indikatorsubstanz mindestens einen Farbstoff umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Oil Red, Methylrot,
Brillantgrün, Rhodamin B, Neutralrot, Methylenblau oder andere Farbstoffe, die zur
Anfärbung von Zellen in der Zytologie verwendet werden, umfasst.
$ $ * $ $
PCT/EP2017/000406 2016-04-27 2017-03-31 Probenbehälter für eine kryokonservierte biologische probe, verfahren zur herstellung des probenbehälters, verfahren zur temperaturüberwachung einer kryokonservierten probe WO2017186333A1 (de)

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