WO2017167911A1 - Verfahren zum erzeugen eines mikroskopbildes - Google Patents

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WO2017167911A1
WO2017167911A1 PCT/EP2017/057594 EP2017057594W WO2017167911A1 WO 2017167911 A1 WO2017167911 A1 WO 2017167911A1 EP 2017057594 W EP2017057594 W EP 2017057594W WO 2017167911 A1 WO2017167911 A1 WO 2017167911A1
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polarization
electromagnetic
illumination
illumination radiation
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Fred S. Wouters-Bunt
Robert Ventzki
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Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin
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Definitions

  • the invention relates to a method for generating a microscope image of at least a part of an object, wherein in the method electromagnetic illumination radiation is directed onto the object along an illumination direction and electromagnetic emission radiation is detected from the object along an observation direction, the illumination direction and the observation direction being one of 0 ° different angles and wherein the electromagnetic illumination radiation is passed in the form of a light sheet on the object.
  • the invention also relates to a method for generating a three-dimensional microscope image, in which a corresponding method for generating a microscope image is used.
  • the invention also relates to a device for carrying out such methods.
  • the light sheet does not have to be radiated into the object in the form of a plane or at least a nearly two-dimensional object. It is also possible to illuminate the electromagnetic illumination along a Illuminating beam, so an at least almost one-dimensional object, in the object from the part of which a microscope image is to be generated, and to vary the position of this irradiated illumination radiation in the plane to be spanned by the light sheet, and so for example, the position scanning change. In this case, the light sheet would consequently consist of a plurality of successively irradiated rays. The microscope images recorded separately for each of these individual beams are then combined to form a microscope image, for example, by image processing software.
  • This screening and the assembly of the light sheet of several or many individual rays or partial surfaces can be done so quickly that only a single microscope image must be taken and in this time the entire light sheet is scanned.
  • polarization microscopy Another method known from the prior art is so-called polarization microscopy.
  • the almost transparent object to be observed is irradiated by polarized illumination radiation.
  • the observation takes place in the beam direction.
  • the light that has passed through the object is filtered by a polarizing filter, which serves as an analyzer, before it is observed.
  • optically active substances which modulate the polarization direction of the illumination radiation for example rotate by a certain amount per irradiated length, can be observed in the object.
  • the analyzer By rotating the analyzer, the polarization direction of the observed electromagnetic emission radiation can be varied and thus information about the strength of the modulation of the polarization direction can be determined.
  • a resolution along the direction of observation is not possible.
  • biological tissue usually contains optically active ingredients, such as collagen in connective tissue and myelin sheaths of nerve cells.
  • optically active ingredients such as collagen in connective tissue and myelin sheaths of nerve cells.
  • polarization microscopy is generally used.
  • the disadvantage is that especially in thin samples in which the irradiated electromagnetic illumination radiation and / or the outgoing electromagnetic emission radiation can travel only a short distance, a contrast of the images obtained by the polarization microscopy is very low.
  • a resolution along the beam direction is not possible.
  • the invention is therefore based on the object to improve a method for generating a microscope image so that a greater contrast is achieved.
  • the invention solves this problem by a method according to the preamble of claim 1, characterized in that the electromagnetic illumination radiation in a polarization direction is linearly polarized and that successively electromagnetic illumination radiation which is linearly polarized in different polarization direction, is used.
  • illumination radiation polarized in different polarization directions can be achieved in different ways.
  • a radiation source that emits the electromagnetic illumination radiation and for example, a laser may be, and the object to be imaged
  • a rotator which may be formed, for example, as ⁇ / 2-plate or as Pokels cell arranged be, by which the polarization direction of the emitted electromagnetic illumination radiation is rotated.
  • By adjusting the rotator can be achieved in this way that electromagnetic illumination radiation that is polarized in different polarization directions, along the direction of illumination is directed to the object.
  • the invention is based on the finding that the scattering of polarized electromagnetic radiation in an almost transparent and optically isotropic medium is not uniform in all directions, but according to a radiation characteristic of a Hertzian dipole. It is therefore strongly angle-dependent. If the polarization of the electromagnetic illumination radiation, that is to say the direction of the E-field vector of the electromagnetic radiation, runs parallel to the observation direction, a minimum of the scattered light intensity is present. However, if the polarization extends perpendicular to the direction of observation, the intensity of the scattered light is maximal.
  • the method according to the invention for example, to produce a microscope image that is at least virtually free of scattered radiation, which arises in particular by elastic scattering of particles or bodies present in the object.
  • the polarization of the illumination radiation must be adjusted so that it is at least almost, but advantageously exactly parallel to the direction of observation.
  • emission radiation mainly caused by effects other than elastic scattering would be mainly observed.
  • Mechanisms could be, for example, fluorescence or autofluorescence of corresponding dyes or markers in the object to be observed.
  • electromagnetic illumination radiation of a second polarization direction which is preferably perpendicular to the first polarization direction, is used.
  • the influence of the scattered radiation which is caused by elastic scattering, can be increased and in particular maximized.
  • the polarization of the illumination radiation is modulated, for example rotated, local intensity changes of the emission radiation emitted in the observation direction, that is to say advantageously perpendicular to the illumination direction, occur.
  • the polarization-dependent intensity changes caused in this way by optical properties and mechanisms can then be quantitatively evaluated.
  • the contrast can be enhanced by mathematical superimposition of the microscope individual images recorded in this way with different polarization directions. In this way, structures in otherwise almost transparent objects can be made visible.
  • the electromagnetic illumination radiation is polarized once perpendicular to the viewing direction and / or parallel to the viewing direction.
  • the angle enclosed between the direction of illumination and the direction of observation is 90 °.
  • the electromagnetic illumination radiation in the form of a light sheet is directed onto the object.
  • a light sheet or a lens is extended in a lighting plane and has only a small thickness.
  • the light sheet or the light disk can be irradiated into the object in a single step as illumination radiation flared in the illumination plane, or, as already described, in the form of a plurality of non-expanded illumination beams irradiated successively into the object.
  • intermediate stages of these two methods are possible in which, for example, only a slight widening in the illumination plane is achieved and several such partial light sheets are irradiated side by side in the object that a complete microscope image by a combination of multiple microscope images that are taken in this way can be generated.
  • the object to be observed can be moved stepwise by motor through the observation plane, ie the illuminated by the light sheet level.
  • the observation plane ie the illuminated by the light sheet level.
  • at least two images are recorded with different polarization directions of the irradiated illumination radiation. From this series of photographs, a three-dimensional image can be reconstructed.
  • the electromagnetic emission radiation to be detected is passed through a polarization filter, so that the detected emission radiation is linearly polarized along a detection polarization direction. This is particularly advantageous if there are optically active elements or substances in the object to be observed. These ensure that the polarization direction of the irradiated electromagnetic illumination radiation is modulated, in particular rotated.
  • the strength of this rotation depends on the strength of the optical activity of the particular substance as well as the distance that the illumination radiation has covered within the object.
  • the polarization of the outgoing emission radiation to be detected can also be modulated in this way.
  • the emission radiation for different polarizations can be detected separately from each other, so that images of the object can be generated, from which, for example, the strength of the optical activity at different positions or areas of the object can be determined.
  • the emission radiation which is linearly polarized along different detection polarization directions, is detected separately from one another.
  • a polarization filter in which the corresponding images are successively recorded for different settings of the polarization filter in different polarization directions.
  • the outgoing emission radiation for example, by a beam splitter or other optical object, such as an optically active crystal, are conducted, which splits the incident light as a function of the polarization and thus allows a spatially separated but simultaneous detection of emission radiation of different polarization directions.
  • emission radiation guided by a polarization filter and emission radiation not guided by a polarization filter are detected separately from one another.
  • the outgoing emission radiation can be conducted through a beam splitter, which splits the emission radiation into two partial beams.
  • One of these two partial beams, for example, by one polarization filter is passed while the other is passed directly to a detector.
  • polarization-selective images can be created simultaneously with images integrated via the polarization.
  • a nematic liquid is introduced into the object before the electromagnetic illumination radiation is directed onto the object.
  • a nematic fluid is a fluid that contains optically active ingredients. They conventionally have a similar index of refraction as the liquids commonly used to render thick sections of tissue transparent. As a result, the optical activity of the object to be observed can be increased.
  • nematic liquids may also be electro-optically active. This means that their optical activity changes when an electric field is applied, which is advantageously perpendicular to the beam direction of the electromagnetic radiation. This effect is known as the "electro-optic Kerr effect.”
  • the electric field is perpendicular to the direction of illumination.
  • the optical activity of different structures within the object to be observed generally changes. How quickly this change occurs depends on how fast the objects absorb the liquid. If the object is already polarization-sensitively imaged during this time by a method according to the invention, the time course of the diffusion of the nematic liquid into the object can be imaged. From this, information about the permeability of different areas can be obtained and thus structures in the object can be better imaged and identified.
  • the degree of optical activity of the nematic liquid can also be changed by applying an adjustable electric field. It is thus possible, without the change of a rotator, not only to specify the polarization of the illumination radiation introduced into the object at a certain position within the object, but if necessary to modulate it continuously, for example to rotate it. It is thus no longer necessary to provide a rotator between the radiation source of the illumination radiation and the object to be observed in order to adjust the polarization direction of the illumination radiation.
  • the strength of the electric field can be modulated and adjusted so as to be able to adjust the optical activity of the nematic liquid and thus the degree of modulation of the polarization direction of the irradiated electromagnetic illumination radiation.
  • An apparatus for carrying out such a method thus requires no mechanical rotator to rotate the direction of polarization and also has the advantage that an electric field can be modulated much faster than a mechanical polarization rotator.
  • the polarization of the irradiated illumination radiation would have to be set for each pixel in such a way that it is perpendicular to the observation direction at the observed location.
  • the object contains no optically active materials, this is simply possible because the polarization direction of the Illuminating radiation on the way through the object is not changed.
  • the polarization direction can be set to the optimum value.
  • the object contains optically active materials, it is not that easy anymore.
  • the polarization direction of the illumination radiation changes on the way through the object, so that the polarization direction is different for each of the observed pixels, although the polarization direction of the irradiated radiation does not change. It is therefore necessary to record different images with different polarization direction and to determine for each pixel at which direction of polarization the intensity of the emission radiation becomes maximum. This corresponds to the moment in which the polarization direction is perpendicular to the observation direction at the observed location.
  • a rotator it is for example possible with a rotator to change the direction of polarization of the incident illumination radiation at fixed angular intervals, for example 5 ° or 10 °, and to record a separate image for each position of the rotator, ie for each irradiated polarization direction. For each individual pixel, it is then possible, for example via image processing software, to determine at which irradiated polarization direction the intensity of the emission radiation is maximal.
  • this maximum intensity is used to generate the final microscope image, which then receives information about each pixel, which correspond to the maximum amount of scattered light.
  • the object contains optically active materials.
  • the polarization direction of the irradiated illumination radiation is changed at fixed angular intervals.
  • a separate image is recorded for each of these polarization directions.
  • this polarization direction indirectly, for example by determining another polarization direction whose relationship to the desired polarization direction is known.
  • the angular distance is less than 2 °, preferably less than 1 °, more preferably less than 0.5 °, most preferably less than 0.3 °.
  • the actually selected size of the angular distance can advantageously be made dependent on the strength of the optical activity of the optically active material.
  • an applied electric field can also be changed and adjusted if, for example, nematic liquids are used whose optical activity depends on the strength of an electric field.
  • microscope images can be recorded for different electric field strengths, wherein it must again be determined for each pixel at which electric field strength the intensity of the emission radiation becomes maximum, since this corresponds to a field strength which ensures that the polarization direction of the illumination radiation at the observed point is perpendicular to the observation direction.
  • an alternating field is used as the electric field, this can be modulated at high frequency with little effort.
  • an "inertia" of the optical activity of the object structures can be mapped, which describes how quickly a change in the optical activity of different object areas follows a change in the electric field.
  • different microscope images with illumination radiation of different wavelengths are obtained. testifies.
  • a so-called laser combiner can be used, which can emit laser radiation as illumination radiation of different wavelengths.
  • a laser light source with a freely tunable wavelength is used. Since the optical activity is usually wavelength-dependent, additional information can be obtained in this way.
  • the invention also achieves the stated object by a method for producing a three-dimensional microscope image of at least one part of an object, wherein the method generates a plurality of microscope images according to a method described here, which differ in that the electromagnetic illumination radiation is at different positions, especially at different positions along the observation direction, is directed to the object.
  • the three-dimensional microscope image is subsequently determined from the majority of the microscope images thus generated.
  • Such objects may be, for example, tissue sections rendered transparent by different methods. Since these usually have optically active regions or are completely optically active, the polarization direction is modulated as already explained. However, since different structures within the object are optically different, the polarization direction of passing light is more or less affected. Consequently, discontinuities of the optical activity occur at the interfaces between individual structures.
  • Jumps in the optical activity can be visualized by recording several images of different illumination areas, in particular lighting levels, in which the polarization direction of the illumination radiation varies.
  • the direction of polarization of the incident illumination radiation changes with the position of the radiation within the sample, since the direction of polarization on the path of the illumination Radiation is rotated through the object.
  • the polarization direction of the irradiated illumination radiation must be determined for which the polarization direction is perpendicular to the viewing direction at the observed location. Since the polarization direction is rotated by the optically active medium, this can be defined as a phase shift that depends on the location within the sample along the direction of illumination.
  • Constant optical activity is a linear relationship because the rotation of the direction of polarization results from the distance traveled by the illumination radiation within the object and a specific rotation describing the magnitude of the optical activity.
  • the phase shift between a polarization direction of the illumination radiation and a dependent scattered light intensity can be determined for each pixel.
  • This phase shift increases along the optical axis of the illumination direction as the polarization increases the farther the electromagnetic illumination radiation expands within the object.
  • the first derivative of the course of such a phase shift corresponds for example to a specific rotation. If the optical activity changes along the illumination direction, the second derivative of the phase shift is nonzero. Jumps and discontinuities of the specific rotation can be recognized by the third derivative of the phase shift, which is nonzero.
  • the differentiations of the images can be calculated by means of image processing, wherein in particular these derivatives can be determined.
  • illumination light source advantageously serves a laser.
  • the laser light is well collimated, which facilitates the generation of a thin light sheet.
  • the polarization of the illumination radiation is to be modulated, this is advantageously done by an optical element in the illumination beam path, for example a lambda / 2 plate. This can be gradually rotated, for example by means of a motor, about the optical axis.
  • a so-called Pockels cell can be modulated, whereby no more mechanically moving parts are needed.
  • the change in the polarization can be done very quickly, for example in the nanosecond range.
  • the device has a light-sheet-forming optical arrangement which is known in principle from the prior art.
  • an optical system for imaging the observed plane of the object Conventional corresponding optical systems can be used.
  • NA magnification and numerical aperture
  • a preferably motorized filter change may be applied to make an optical (bandpass) filter for the illumination light and different fluorescent emission filters usable.
  • a rotatable polarizing filter can be used.
  • the recording of the images and the processing can also be done in a conventional manner.
  • the object to be observed is located in a glass cuvette, which can be moved by motor in individual steps perpendicular to the light sheet, ie to the observation plane.
  • the arrangement is also advantageous if the electromagnetic illumination radiation is not used in the form of a light sheet.
  • the determined images which can be taken for example with a digital camera or a CCD chip, are stored on a computer and can then be charged with conventional image processing software and assembled into a three-dimensional image.
  • three-dimensionally resolved, imaging measurements of optical activity and fluorescence polarization can be determined.
  • the intensity measurement is determined for each pixel of the microscope image, regardless of whether a two-dimensional or a three-dimensional microscope image is to be created, for at least two different, advantageous tgue perpendicular polarization directions of the illumination radiation performed. From the normalized difference of the intensity values, an angle can then be determined by which the polarization of the emission radiation was rotated relative to the polarization of the illumination radiation. Of course, other modulations of the polarization are conceivable. In this way, the optical activity and the fluorescence polarization can be determined quantitatively.
  • the intensity ratio of scattered radiation to fluorescence radiation can be changed by rotation of the polarization direction of the illumination radiation. If the polarization direction of the E-field vector of the electromagnetic radiation is selected parallel to the direction of observation, unwanted scattered light can be minimized and thus the contrast for fluorescence radiation can be increased. If the object to be observed has areas of optical activity or is completely optically active, the preferred direction of polarization of the illumination radiation deviates from the parallel direction relative to the direction of observation. The optimum polarization direction for minimum scattered light component can be easily found during a rotation of the polarization direction of the illumination radiation, for example by visual observation taking place.
  • object structures are imaged by scattered light, which is caused, for example, by Rayleigh scattering
  • scattered light which is caused, for example, by Rayleigh scattering
  • the scattered light intensity is maximized and the contrast of the scattered light imaging is increased.
  • the preferred polarization direction of the illumination radiation may deviate from the perpendicular direction, but the optimum direction can again be found by visual observation.
  • the spatial homogeneity of the illumination by the illumination radiation is affected by mainly two effects. On the one hand, the intensity of the illumination radiation decreases, the farther the illumination radiation has to pass through the object.
  • the object to be observed is not optically homogeneous, so that the illumination radiation is also absorbed or scattered by optically denser structures within the object to be observed.
  • this problem can be solved by a method according to an embodiment of the present invention, especially when taking pictures of externally incorporated into the observation object fluorescent labels, such as those often used in biology, medicine and biotechnology. Assuming a homogeneous scattering density or scattering efficiency, the scattered light intensity is proportional to the illumination intensity, so that a pure scattered light image of the object to be observed serves as a calibration difference.
  • the polarization direction of the illumination radiation is thus selected perpendicular to the observation direction and in this way an image is taken.
  • This scattered light intensity is normalized by assigning to each pixel a normalization factor corresponding to the ratio of its respective brightness value to the highest occurring brightness value of the image. For calibration, the brightness value of each individual pixel is then divided by this corresponding normalization factor.
  • the methods described here thus provide an increased contrast of the microscope images produced and also the possibility of producing optically resolved polarization-dependent microscope images along the viewing direction.
  • FIG. 1 the schematic representation of an apparatus for carrying out a method according to an exemplary embodiment of the present invention
  • FIG. 3 shows a flow chart for a method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows the schematic representation of an apparatus for performing a method according to an embodiment of the present invention.
  • Illumination radiation 2 which is linearly polarized, is emitted from a laser 4 and passed through a rotator 6. This rotates the polarization of the illumination radiation 2 in the desired direction.
  • the illumination radiation 2 then impinges on an object 8, from which a microscope image is to be recorded.
  • emission radiation 10 is released, which is collected in an observation direction by an objective 12.
  • the object 8 is arranged on a slide 14, which is designed to be adjustable in height, so that the object 8 can be moved relative to the laser 4.
  • the optical components and / or their position may need to be adapted to the then changed position of the object.
  • a multiplicity of images are recorded via the objective 12, which are produced with differently polarized illumination radiation 2.
  • the rotator 6 is used in different positions in order to set the polarization direction of the illumination radiation 2. From the images thus generated, it is possible to establish a relationship between the position of a pixel or a point within the object 8 and a polarization direction with which the illumination radiation 2 was irradiated into the object 8. In this case, the polarization direction is selected, which at the respective location within of the object 8 is perpendicular to the observation direction. This relationship is shown by way of example in FIG. One sees an angle ⁇ which corresponds to an angle of the polarization direction of the illumination radiation 2, which is plotted over a position x which corresponds to the position within the object 8 along the direction of illumination.
  • the angle ⁇ is the angle at which the intensity of a pixel at the point x becomes maximum.
  • this phase relationship 16 is shown. Up to a first position xi, the object 8 is an optically active, homogeneous material. It can be seen that the phase relationship 16 shows a linear increase in this area. Between the position xi and the position X2, the phase relationship 16 is also linear, but has a greater slope than the first region. Beyond the point X2, the phase relationship 16 is still a linear relationship, but with a very small slope. These slopes are defined by a specific rotation which forms a proportionality factor between a distance traveled within the object and the occurring rotation of the polarization direction. Already from the phase relationship 16 can be read kinks that correspond to interfaces between optically different active substances.
  • the derivative 18 of the phase relationship 16 is shown schematically by broken lines with the location x. It is constant in all three areas, but at a different level. Jumps occur at the interfaces.
  • FIG. 3 schematically shows the sequence of a corresponding method.
  • a first parameter set is set, which includes, for example, the position and widening of the light sheet and in particular a starting angle of the polarization direction.
  • the emission radiation 10 is received via the objective 12.
  • a rotation step 24 in particular the polarization of the illumination radiation is rotated by a predetermined angle.
  • the comparison 26 between the now set new Angle of polarization direction and a critical angle to which the method is to be performed.
  • a further image acquisition step 22 is performed. This loop of image acquisition step 22, rotation step 24 and comparison 26 is traversed so many times until the set polarization direction corresponds to the set limit direction. As a result, in comparison 26, the result is achieved that no further image has to be taken in a further image acquisition step 22.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes wenigstens eines Teils eines Objektes, wobei bei dem Verfahren elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung entlang einer Beleuchtungsrichtung auf das Objekt geleitet wird und von dem Objekt ausgehende elektromagnetische Emissionsstrahlung entlang einer Beobachtungsrichtung detektiert wird, wobei die Beleuchtungsrichtung und die Beobachtungsrichtung einen von 0° verschiedenen Winkel einschließen und wobei die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in Form eines Lichtblattes auf das Objekt geleitet wird, welches sich dadurch auszeichnet, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in einer Polarisationsrichtung linear polarisiert ist und dass nacheinander elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung, die in unterschiedlichen Polarisationsrichtungen linear polarisiert ist, verwendet wird.

Description

Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes wenigstens eines Teils eines Objektes, wobei bei dem Verfahren elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung entlang einer Beleuchtungsrichtung auf das Objekt geleitet wird und von dem Objekt ausgehend elektromagnetische Emissionsstrahlung entlang einer Beobachtungsrichtung detektiert wird, wobei die Beleuchtungsrichtung und die Beobachtungsrichtung einen von 0° verschiedenen Winkel einschließen und wobei die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in Form eines Lichtblattes auf das Objekt geleitet wird. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zum Erzeugen eines dreidimensionalen Mikroskopbildes, bei dem ein entsprechendes Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes zum Einsatz kommt. Die Erfindung betrifft zudem eine Vorrichtung zum Durchführen derartiger Verfahren.
Entsprechende Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes sind aus dem Stand der Technik seit langem bekannt. So wird beispielsweise bei der sogenannten Lichtscheiben-Mikroskopie ein nahezu transparentes dreidimensionales Objekt von einem möglichst dünnen Lichtblatt durchstrahlt. Dazu wird beispielsweise ein Laserstrahl innerhalb einer Ebene aufgeweitet, so dass ein möglichst zweidimensionales Objekt, eine sogenannte Lichtscheibe oder Lichtblatt, entsteht. Diese hat in der Regel innerhalb der Ebene eine deutlich größere Ausdehnung als senkrecht dazu. Sie verfügt folglich über eine sehr geringe Dicke. Wird eine derartige Lichtscheibe oder ein derartiges Lichtblatt in das Objekt, das es zu beobachten gilt, eingestrahlt oder eingeleitet, entsteht innerhalb des Objektes eine dünne beleuchtete Beobachtungsebene. Die Beobachtung erfolgt in der Regel senkrecht dazu durch ein Objektiv, das fest auf diese Beobachtungsebene fokussiert ist. Indem das Objekt relativ zu der Beobachtungsebene bewegt wird, kann ein Bilderstapel gewonnen werden, der durch einen Computer zu einem dreidimensionalen Bild zusammengesetzt wird.
Selbstverständlich muss das Lichtblatt nicht in Form einer Ebene oder eines zumindest nahezu zweidimensionalen Objektes in das Objekt eingestrahlt werden. Es ist auch möglich, die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung entlang eines Beleuchtungsstrahles, also eines zumindest nahezu eindimensionalen Objektes, in das Objekt, von dessen Teil ein Mikroskopbild erzeugt werden soll, einzustrahlen und die Position dieser eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung in der Ebene, die durch das Lichtblatt aufgespannt werden soll, zu variieren und so beispielsweise die Position rasternd zu verändern. In diesem Fall würde das Lichtblatt folglich aus einer Vielzahl nacheinander eingestrahlter Strahlen bestehen. Die für jeden einzelnen dieser Strahlen separat aufgenommenen Mikroskopbilder werden dann beispielsweise durch eine Bildbearbeitungssoftware zu einem Mikroskopbild zusammengesetzt.
Diese Rasterung und das Zusammensetzen des Lichtblattes aus mehreren oder vielen einzelnen Strahlen oder Teilflächen kann so schnell erfolgen, dass nur ein einziges Mikroskopbild aufgenommen werden muss und in dieser Zeit das gesamte Lichtblatt abgerastert wird.
Ein anderes aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren ist die sogenannte Polarisationsmikroskopie. Dabei wird das nahezu transparente zu beobachtende Objekt von polarisierter Beleuchtungsstrahlung durchstrahlt. Die Beobachtung findet dabei in Strahlrichtung statt. Dazu wird das Licht, das das Objekt durchlaufen hat, durch einen Polarisationsfilter, der als Analysator dient, gefiltert, bevor es beobachtet wird. Befinden sich im Objekt optisch aktive Substanzen, die die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung modulieren, beispielsweise um einen bestimmten Betrag pro durchstrahlter Länge drehen, lässt sich dies beobachten. Durch Drehen des Analysators kann die Polarisationsrichtung der beobachteten elektromagnetischen Emissionsstrahlung variiert und so eine Information über die Stärke der Modulation der Polarisationsrichtung ermittelt werden. Eine Auflösung entlang der Beobachtungsrichtung ist jedoch nicht möglich.
Insbesondere biologisches Gewebe enthält in der Regel optisch aktive Bestandteile, wie beispielsweise das Collagen im Bindegewebe und die Myelinscheiden von Nervenzellen. In vielen diagnostischen Verfahren ist es daher sinnvoll, diese optisch aktiven Bestandteile sichtbar zu machen, wozu in der Regel die Polarisationsmikroskopie verwendet wird. Nachteilig ist jedoch, dass insbesondere bei dünnen Proben, in denen die eingestrahlte elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung und/oder die ausgehende elektromagnetische Emissionsstrahlung nur einen kurzen Weg zurücklegen kann, ein Kontrast der durch die Polarisationsmikroskopie erhaltenen Bilder sehr gering ist. Zudem ist eine Auflösung entlang der Strahlrichtung nicht möglich.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes so zu verbessern, dass ein größerer Kontrast erreicht wird.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 , dass sich dadurch auszeichnet, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in einer Polarisationsrichtung linear polarisiert ist und dass nacheinander elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung, die in unterschiedlichen Polarisationsrichtung linear polarisiert ist, verwendet wird.
Die Verwendung von Beleuchtungsstrahlung, die in unterschiedlichen Polarisationsrichtungen polarisiert ist, kann auf unterschiedliche Weisen erreicht werden. So kann beispielsweise zwischen einer Strahlungsquelle, die die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung aussendet, und beispielsweise ein Laser sein kann, und dem Objekt, das es abzubilden gilt, ein Rotator, der beispielsweise als λ/2- Plättchen oder als Pokels-Zelle ausgebildet sein kann, angeordnet sein, durch den die Polarisationsrichtung der ausgesandten elektromagnetischen Beleuchtungsstrahlung gedreht wird. Durch eine Einstellung des Rotators kann auf diese Weise erreicht werden, dass elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung, die in unterschiedlichen Polarisationsrichtungen polarisiert ist, entlang der Beleuchtungsrichtung auf das Objekt geleitet wird. Alternativ oder zusätzlich dazu ist es jedoch auch möglich, die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung erst im Objekt, dessen Teil abgebildet werden soll, zu drehen. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung nematischer Flüssigkeiten geschehen, die eine optische Aktivität aufweisen, deren Stärke durch ein elektrisches Feld eingestellt werden kann. Dies wird im Folgenden näher beschrieben werden. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die Streuung von polarisierter elektromagnetischer Strahlung in einem nahezu transparenten und optisch isotropen Medium nicht gleichmäßig in alle Raumrichtung erfolgt, sondern gemäß einer Abstrahlcharakteristik eines Hertz'schen Dipols. Sie ist folglich stark winkelabhängig. Verläuft die Polarisation der elektromagnetischen Beleuchtungsstrahlung, also die Richtung des E-Feldvektors der elektromagnetischen Strahlung, parallel zur Beobachtungsrichtung, so liegt ein Minimum der Streulicht-Intensität vor. Erstreckt sich die Polarisation jedoch senkrecht zur Beobachtungsrichtung, ist die Intensität des Streulichtes maximal. Auf diese Weise ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise möglich ein Mikroskopbild zu erzeugen, dass zumindest nahezu frei von Streustrahlung ist, die durch insbesondere elastische Streuung an im Objekt vorhandenen Teilchen oder Körpern entsteht. Dazu muss lediglich die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung so eingestellt werden, dass sie zumindest nahezu, vorteilhafterweise jedoch genau parallel zur Beobachtungsrichtung ist. In diesem Fall würde hauptsächlich Emissionsstrahlung beobachtet werden, die hauptsächlich durch andere Effekte als elastische Streuung hervorgerufen wird. Mechanismen könnten beispielsweise Fluoreszenz oder Eigenfluoreszenz von entsprechenden Farbstoffen oder Markern im zu beobachtenden Objekt sein.
In einem zweiten Teilschritt des Verfahrens wird elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung einer zweiten Polarisationsrichtung, die vorzugsweise senkrecht auf die erste Polarisationsrichtung steht, verwendet. Auf diese Weise kann der Einfluss der Streustrahlung, die durch elastische Streuung hervorgerufen wird, verstärkt und insbesondere maximiert werden. Durch Kombination, beispielweise Addition oder Subtraktion der beiden Bilder voneinander lassen sich zusätzliche Informationen über das Objekt gewinnen.
Wird also die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung moduliert, beispielsweise gedreht, treten lokale Intensitätsänderungen der in Beobachtungsrichtung, also vorteilhafterweise senkrecht zur Beleuchtungsrichtung, ausgesandten Emissionsstrahlung auf. Die auf diese Weise durch optische Eigenschaften und Mechanismen verursachten polarisationsabhängigen Intensitätsänderungen können anschließend quantitativ ausgewertet werden. Zudem können durch rechnerische Überlagerung der auf diese Weise mit unterschiedlichen Polarisationsrichtungen aufgenommenen Mikroskop-Einzelbilder der Kontrast verstärkt werden. Auf diese Weise können Strukturen in ansonsten nahezu transparenten Objekten sichtbar gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens ist die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung einmal senkrecht zu der Beobachtungsrichtung und/oder einem parallel zu der Beobachtungsrichtung polarisiert. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der zwischen der Beleuchtungsrichtung und der Beobachtungsrichtung eingeschlossene Winkel 90°.
Erfindungsgemäß wird die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in Form eines Lichtblattes auf das Objekt geleitet. Ein derartiges Lichtblatt oder eine Lichtscheibe ist in einer Beleuchtungsebene ausgedehnt und weist eine nur geringe Dicke auf. Das Lichtblatt oder die Lichtscheibe kann in einem einzigen Schritt als in der Beleuchtungsebene aufgeweitete Beleuchtungsstrahlung in das Objekt eingestrahlt werden, oder, wie bereits beschrieben, in Form mehrerer, nacheinander in das Objekt eingestrahlter nicht aufgeweiteter Beleuchtungsstrahlen. Selbstverständlich sind auch Zwischenstufen dieser beiden Verfahren möglich, bei denen beispielsweise nur eine geringe Aufweitung in der Beleuchtungsebene erreicht wird und mehrere derartiger Teillichtblätter so nebeneinander in das Objekt eingestrahlt werden, dass durch eine Kombination mehrerer Mikroskopbilder, die auf diese Weise aufgenommen werden, ein vollständiges Mikroskopbild erzeugt werden kann.
Wie in der Lichtblatt-Mikroskopie kann auch in diesem Fall das zu beobachtende Objekt schrittweise motorisch durch die Beobachtungsebene, also die durch das Lichtblatt beleuchtete Ebene, bewegt werden. Für jeden Schritt, also jede Position des Lichtblattes relativ zum Objekt, werden wenigstens zwei Aufnahmen mit unterschiedlichen Polarisationsrichtungen der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung aufgenommen. Aus dieser Aufnahmenserie kann eine dreidimensionale Abbildung rekonstruiert werden. Vorteilhafterweise wird die zu detektierende elektromagnetische Emissionsstrahlung durch einen Polarisationsfilter geleitet, so dass die detektierte Emissionsstrahlung entlang einer Detektionspolarisationsrichtung linear polarisiert ist. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn sich in dem zu beobachtenden Objekt optisch aktive Elemente oder Substanzen befinden. Diese sorgen dafür, dass die Polarisationsrichtung der eingestrahlten elektromagnetischen Beleuchtungsstrahlung moduliert, insbesondere gedreht wird. Die Stärke dieser Drehung hängt von der Stärke der optischen Aktivität der jeweiligen Substanz sowie der Strecke ab, die die Beleuchtungsstrahlung innerhalb des Objektes zurückgelegt hat. Selbstverständlich kann auch die Polarisation der zu detektierenden ausgehenden Emissionsstrahlung auf diese Weise moduliert sein. Durch die Verwendung eines Polarisationsfilters als Analysator kann die Emissionsstrahlung für unterschiedliche Polarisationen getrennt voneinander detektiert werden, so dass Abbildungen des Objektes erzeugt werden können, aus denen beispielsweise die Stärke der optischen Aktivität an unterschiedlichen Positionen oder Bereichen des Objektes ermittelt werden kann.
Vorteilhafterweise wird die Emissionsstrahlung, die entlang unterschiedlicher De- tektionspolarisationsrichtungen linear polarisiert ist, getrennt voneinander detektiert. Dies ist selbstverständlich durch einen Polarisationsfilter möglich, in dem für unterschiedliche Einstellungen des Polarisationsfilters auf unterschiedliche Polarisationsrichtungen nacheinander die entsprechenden Abbildungen aufgenommen werden. Alternativ dazu kann die ausgehende Emissionsstrahlung beispielsweise auch durch einen Strahlteiler oder ein anders optisches Objekt, beispielsweise einen optisch aktiven Kristall, geleitet werden, der das einfallende Licht in Abhängigkeit von der Polarisation aufspaltet und so eine räumlich getrennte aber gleichzeitige Detektion von Emissionsstrahlung unterschiedlicher Polarisationsrichtungen ermöglicht.
Vorteilhafterweise wird durch einen Polarisationsfilter geleitete Emissionsstrahlung und nicht durch einen Polarisationsfilter geleitete Emissionsstrahlung getrennt voneinander detektiert. So kann beispielsweise die ausgehende Emissionsstrahlung durch einen Strahlteiler geleitet werden, der die Emissionsstrahlung in zwei Teilstrahlen aufspaltet. Einer dieser beiden Teilstrahlen kann beispielsweise durch eine Polarisationsfilter geleitet werden, während der andere direkt auf einen Detektor geleitet wird. Auf diese Weise lassen sich polarisationsselektive Aufnahmen gleichzeitig mit über die Polarisation integrierten Aufnahmen erstellen.
Vorzugsweise wird in das Objekt eine nematische Flüssigkeit eingebracht, bevor die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung auf das Objekt geleitet wird. Bei einer nematischen Flüssigkeit handelt es sich um eine Flüssigkeit, die optisch aktive Inhaltsstoffe beinhaltet. Sie haben herkömmlicherweise einen ähnlichen Brechungsindex, wie die Flüssigkeiten die üblicherweise benutzt werden, um dicke Gewebeschnitte transparent zu machen. Dadurch kann die optische Aktivität des zu beobachtenden Objektes verstärkt werden.
Nematische Flüssigkeiten können zusätzlich jedoch auch elektrooptisch aktiv sein. Dies bedeutet, dass sich ihre optische Aktivität verändert, wenn man ein elektrisches Feld anlegt, das vorteilhafterweise senkrecht zur Strahlrichtung der elektromagnetischen Strahlung verläuft. Dieser Effekt ist unter der Bezeichnung„elek- trooptischer Kerr-Effekt" bekannt. Vorteilhafterweise wird daher zumindest ein Teil des Objektes mit einem elektrischen Feld beaufschlagt. Vorteilhafterweise verläuft das elektrische Feld senkrecht zur Beleuchtungsrichtung.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn nacheinander unterschiedliche elektrische Felder verwendet werden. Auf diese Weise lässt sich die Stärke der optischen Aktivität der nematischen Flüssigkeit verändern, so dass beispielsweise durch einmalige Veränderung der elektrischen Feldstärke nahezu alle Stellen innerhalb des Objektes mit unterschiedlich polarisiertes Licht bestrahlt werden können. Durch mehrfache Änderung können alle Positionen innerhalb des Objektes mit unterschiedlich polarisierter Beleuchtungsstrahlung beaufschlagt werden. Dabei ist zu beachten, dass die Polarisationsrichtung des Lichtes in Beleuchtungsrichtung auch bei konstantem elektrischen Feld nicht konstant ist, da die nematische Flüssigkeit optisch aktiv ist und daher die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung auf dem Weg entlang der Beleuchtungsrichtung eine Drehung ihrer Polarisationsrichtung erfährt. Daher ist es für die unterschiedlichen Teilbilder, die aufgenommen werden können, von Vorteil, unterschiedliche, für jedes Bild jedoch konstante elektrische Felder zu verwenden. Während des Eindringens der nematischen Flüssigkeit ändert sich in der Regel die optische Aktivität unterschiedlicher Strukturen innerhalb des zu beobachtenden Objektes. Wie schnell diese Änderung eintritt, hängt davon ob, wie schnell die Objekte die Flüssigkeit absorbieren. Wird während dieser Zeit bereits mit einem erfindungsgemäßen Verfahren polarisationssensitiv das Objekt abgebildet, kann der zeitliche Verlauf der Diffusion der nematischen Flüssigkeit in das Objekt abgebildet werden. Daraus können Informationen über die Permeabilität unterschiedlicher Bereiche erhalten und somit Strukturen im Objekt besser abgebildet und identifiziert werden.
Alternativ oder zusätzlich zur Drehung der Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung kann auch durch Anlegen eines einstellbaren elektrischen Feldes der Grad der optischen Aktivität der nematischen Flüssigkeit verändert werden. Es ist damit möglich, ohne die Veränderung eines Rotators die Polarisation der in das Objekt eingeleiteten Beleuchtungsstrahlung an einer bestimmten Stelle innerhalb des Objektes nicht nur vorzugeben, sondern gegebenenfalls stufenlos zu modulieren, beispielsweise zu drehen. Es ist somit nicht mehr notwendig, einen Rotator zwischen der Strahlungsquelle der Beleuchtungsstrahlung und dem zu beobachtenden Objekt vorzusehen, um die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung einzustellen. Stattdessen kann die Stärke des elektrischen Feldes moduliert und eingestellt werden, um so die optische Aktivität der nematischen Flüssigkeit und damit den Grad der Modulation der Polarisationsrichtung der eingestrahlten elektromagnetischen Beleuchtungsstrahlung einstellen zu können. Eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen Verfahrens kommt folglich ohne mechanischen Rotator zur Drehung der Polarisationsrichtung aus und hat zudem den Vorteil, dass ein elektrisches Feld deutlich schneller moduliert werden kann, als ein mechanischer Polarisationsrotator.
Soll beispielsweise ein Mikroskopbild mit maximalem Streulichtanteil aufgenommen werden, müsste die Polarisation der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung für jeden Bildpunkt so eingestellt werden, dass sie an der beobachteten Stelle senkrecht auf der Beobachtungsrichtung steht. Solange das Objekt keinerlei optisch aktive Materialien enthält, ist dies einfach möglich, da die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung auf dem Weg durch das Objekt nicht geändert wird. Durch geeignete Wahl und Stellung eines Rotators, der zwischen Strahlungsquelle und Objekt angeordnet wird, lässt sich daher die Polarisationsrichtung auf den optimalen Wert einstellen. Sobald das Objekt jedoch optisch aktive Materialien enthält, ist dies nicht mehr so einfach möglich. Die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung ändert sich auf dem Weg durch das Objekt, so dass die Polarisationsrichtung für jeden der beobachteten Bildpunkte unterschiedlich ist, obwohl die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Strahlung sich nicht ändert. Es ist daher notwendig, verschiedene Bilder mit unterschiedlicher Polarisationsrichtung aufzunehmen und für jeden Bildpunkt zu ermitteln, bei welcher Polarisationsrichtung die Intensität der Emissionsstrahlung maximal wird. Dies entspricht dem Moment, in dem die Polarisationsrichtung an der beobachteten Stelle senkrecht auf der Beobachtungsrichtung steht.
Es ist beispielsweise möglich mit einem Rotator die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung in festen Winkelabständen, beispielsweise 5° oder 10°, zu ändern und für jede Stellung des Rotators, also für jede eingestrahlte Polarisationsrichtung ein separates Bild aufzunehmen. Für jeden einzelnen Bildpunkt kann dann beispielsweise über eine Bildbearbeitungssoftware, ermittelt werden, bei welcher eingestrahlten Polarisationsrichtung die Intensität der Emissionsstrahlung maximal ist.
Für jeden Bildpunkt wird dann diese maximale Intensität verwendet um das fertige Mikroskopbild zu erzeugen, das dann Informationen über jeden Bildpunkt erhält, die dem maximalen Streulichtanteil entsprechen.
Vorzugsweise enthält das Objekt optisch aktive Materialien. Dabei kommt es zu den bereits beschriebenen Effekten. Vorteilhafterweise wird, wie bereits dargelegt, die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung in festen Winkelabständen geändert. Vorzugsweise wird dabei für jede diese Polarisationsrichtungen ein separates Bild aufgenommen. ln einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden dann für verschiedene Bildpunkte, vorteilhafterweise für jeden Bildpunkt, des Mikroskopbildes ermittelt, bei welcher eingestrahlten Polarisationsrichtung die Intensität der Emissionsstrahlung maximal wird. Damit ist auch bestimmt, bei welcher Polarisationsrichtung sie minimal wird. Selbstverständlich ist es möglich, diese Polarisationsrichtung auch indirekt, beispielsweise durch Bestimmung einer anderen Polarisationsrichtung zu ermitteln, deren Beziehung zur gewünschten Polarisationsrichtung bekannt ist.
Vorzugsweise ist der Winkelabstand dabei kleiner als 2°, vorzugsweise kleiner als 1 °, besonders vorzugsweise kleiner als 0,5°, höchst vorzugsweise kleiner als 0,3°. Die tatsächlich gewählte Größe des Winkelabstandes kann dabei vorteilhafterweise von der Stärke der optischen Aktivität des optisch aktiven Materials abhängig gemacht werden.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann anstelle eines Rotators auch ein angelegtes elektrisches Feld verändert und eingestellt werden, wenn beispielsweise nemati- sche Flüssigkeiten verwendet werden, deren optische Aktivität von der Stärke eines elektrischen Feldes abhängt. Auch in diesem Fall können für unterschiedliche elektrische Feldstärken Mikroskopbilder aufgenommen werden, wobei wieder für jeden Bildpunkt ermittelt werden muss, bei welcher elektrischen Feldstärke die Intensität der Emissionsstrahlung maximal wird, da dies einer Feldstärke entspricht, die dafür sorgt, dass die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung an der beobachteten Stelle senkrecht auf der Beobachtungsrichtung steht.
Wird als elektrisches Feld ein Wechselfeld verwendet, lässt sich dieses mit wenig Aufwand hochfrequent modulieren. Auf diese Weise lässt sich beispielsweise eine „Trägheit" der optischen Aktivität der Objektstrukturen abbilden. Diese beschreibt, wie schnell eine Änderung der optischen Aktivität unterschiedlicher Objektbereiche einer Änderung des elektrischen Feldes folgt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens werden unterschiedliche Mikroskopbilder mit Beleuchtungsstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge er- zeugt. Dazu kann beispielsweise ein sogenannter Laser-Combiner verwendet werden, der Laserstrahlung als Beleuchtungsstrahlung unterschiedlicher Wellenlänge aussenden kann. Vorzugsweise wird eine Laserlichtquelle mit frei durchstimmba- rer Wellenlänge eingesetzt. Da die optische Aktivität in aller Regel wellenlängenabhängig ist, lassen sich auf diese Weise Zusatzinformationen gewinnen.
Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch ein Verfahren zum Erzeugen eines dreidimensionalen Mikroskopbildes wenigstens eines Teil eines Objektes, wobei bei dem Verfahren eine Mehrzahl von Mikroskopbildern gemäß einem hier beschriebenen Verfahren erzeugt werden, die sich dadurch unterscheiden, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung an unterschiedlichen Positionen, insbesondere an unterschiedlichen Positionen entlang der Beobachtungsrichtung, auf das Objekt geleitet wird. Bei diesem Verfahren wird das dreidimensionale Mikroskopbild anschließend aus der Mehrzahl der so erzeugten Mikroskopbilder ermittelt.
Mit einem derartigen Verfahren lassen sich feine Strukturen in nahezu transparenten dreidimensionalen Beobachtungsobjekten sichtbar machen. Derartige Objekte können beispielsweise durch unterschiedliche Methoden transparent gemachte Gewebeschnitte sein. Da diese in aller Regel optisch aktive Bereiche aufweisen oder vollständig optisch aktiv sind, wird die Polarisationsrichtung wie bereits dargelegt moduliert. Da jedoch unterschiedliche Strukturen innerhalb des Objektes unterschiedlich optisch aktiv sind, wird die Polarisationsrichtung durchtretenden Lichtes mehr oder weniger beeinflusst. An den Grenzflächen zwischen einzelnen Strukturen treten folglich Diskontinuitäten der optischen Aktivität auf. Diese
Sprünge der optischen Aktivität lassen sich sichtbar machen, indem von unterschiedlichen Beleuchtungsbereichen, insbesondere Beleuchtungsebenen mehrere Bilder aufgenommen werden, bei denen die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung variiert.
Wie bereits dargelegt ändert sich bei optisch aktiven Medien die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung mit der Position der Strahlung innerhalb der Probe, da die Polarisationsrichtung auf dem Weg der Beleuchtungs- Strahlung durch das Objekt gedreht wird. Für jeden Bildpunkt, der einer beobachteten Stelle innerhalb des Objektes entspricht, muss somit die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung bestimmt werden, für die die Polarisationsrichtung an der beobachteten Stelle senkrecht auf der Beobachtungsrichtung steht. Da durch das optische aktive Medium die Polarisationsrichtung gedreht wird, lässt sich dies als eine Phasenverschiebung definieren, die vom Ort innerhalb der Probe entlang der Beleuchtungsrichtung abhängt. Bei konstanter optischer Aktivität handelt es sich um einen linearen Zusammenhang, da die Drehung der Polarisationsrichtung sich aus der von der Beleuchtungsstrahlung innerhalb des Objektes zurückgelegten Strecke und einer spezifischen Drehung, die die Stärke der optischen Aktivität beschreibt, ergibt.
Dadurch kann für jeden Bildpunkt die Phasenverschiebung zwischen einer Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung und einer davon abhängigen Streulichtintensität bestimmt werden. Diese Phasenverschiebung nimmt entlang der optischen Achse der Beleuchtungsrichtung zu, da die Polarisation zunimmt, je weiter sich die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung innerhalb des Objektes ausdehnt. Die erste Ableitung des Verlaufs einer derartigen Phasenverschiebung entspricht beispielsweise einer spezifischen Drehung. Ändert sich die optische Aktivität entlang der Beleuchtungsrichtung ist die zweite Ableitung der Phasenverschiebung ungleich null. Sprünge und Diskontinuitäten der spezifischen Drehung können anhand der dritten Ableitung der Phasenverschiebung erkannt werden, die ungleich null ist. In einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung, beispielsweise einem Computer, können rechnerisch die Differenzierungen der Aufnahmen mittels Bildverarbeitung vorgenommen werden, wobei insbesondere diese Ableitungen bestimmt werden können.
Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Vorrichtung zur Durchführung eines hier beschriebenen Verfahrens. Als Beleuchtungslichtquelle dient dabei vorteilhafterweise ein Laser. Neben dem hohen Polarisationsgrad des ausgesandten Laserlichtes ist das Laserlicht gut kollimiert, was die Erzeugung eines dünnen Lichtblattes erleichtert. Soll die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung moduliert werden, erfolgt dies vorteilhafterweise durch ein optisches Element im Beleuchtungsstrahlengang, beispielsweise ein Lambda/2-Plättchen. Dieses kann schrittweise, beispielsweise mittels eines Motors, um die optische Achse gedreht werden. Alternativ kann auch eine sogenannte Pockels-Zelle moduliert werden, wodurch keine mechanisch bewegten Teile mehr benötigt werden. Zudem kann die Änderung der Polarisation sehr schnell, beispielsweise im Nanosekundenbe- reich, erfolgen. Vorteilhafterweise verfügt die Vorrichtung über eine lichtblatt- formende optische Anordnung, die aus dem Stand der Technik prinzipiell bekannt. Gleiches gilt für ein optisches System zur Abbildung der beobachteten Ebene des Objektes. Herkömmliche entsprechende optische Systeme können verwendet werden. Als optisches System zur Abbildung der Beobachtungsebene kann beispielsweise ein sogenanntes mesoskopisches Objektiv mit relativ geringer Vergrößerung und nummerischer Apertur (NA = 0,5 bei 2-facher Vergrößerung) verwendet werden. Im Strahlengang kann ein vorzugsweise motorisierter Filterwechsel angebracht sein, um einen optischen (Bandpass)-Filter für das Beleuchtungslicht und unterschiedliche Fluoreszenzemissionsfilter verwendbar zu machen. Zusätzlich kann ein drehbarer Polarisationsfilter verwendet werden.
Die Aufnahme der Bilder und die Verarbeitung können ebenfalls in herkömmlicher Weise erfolgen. Vorzugsweise befindet sich das zu beobachtende Objekt in einer Glasküvette, die motorisch in einzelnen Schritten senkrecht zum Lichtblatt, also zur Beobachtungsebene, bewegt werden kann. Selbstverständlich ist die Anordnung auch dann von Vorteil, wenn die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung nicht in Form eines Lichtblattes verwendet wird. Die ermittelten Bilder, die beispielsweise mit einer Digitalkamera oder einem CCD-Chip aufgenommen werden können, werden auf einem Computer gespeichert und können anschließend mit einer herkömmlichen Bildverarbeitungs-Software verrechnet und zu einer dreidimensionalen Abbildung zusammengesetzt werden.
Durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, insbesondere in der Kombination von Lichtscheibenmikroskopie und Polarisationsmikroskopie können dreidimensional aufgelöste, bildgebende Messungen von optischer Aktivität und Fluoreszenzpolarisation ermittelt werden. Die Intensitätsmessung wird für jeden Bildpunkt des Mikroskopbildes, unabhängig ob ein zweidimensionales oder ein dreidimensionales Mikroskopbild erstellt werden soll, für wenigstens zwei unterschiedliche, vorteilhaf- terweise aufeinander senkrecht stehende Polarisationsrichtungen der Beleuchtungsstrahlung durchgeführt. Aus der normierten Differenz der Intensitätswerte kann anschließend ein Winkel bestimmt werden, um den die Polarisation der Emissionsstrahlung relativ zur Polarisation der Beleuchtungsstrahlung gedreht wurde. Selbstverständlich sind auch andere Modulationen der Polarisation denkbar. Auf diese Weise kann die optische Aktivität und die Fluoreszenzpolarisation quantitativ ermittelt werden. Insbesondere für den Fall, dass die Polarisation der Emissionsstrahlung nicht gemessen wird, ist die Beeinflussung und Modulation dieser Polarisation auf dem Weg ins Objektiv unerheblich. Durch die Wahl der Polarisationsrichtung und der Beleuchtungsstrahlung kann das Intensitätsverhältnis von Streustrahlung zur Fluoreszenzstrahlung durch Drehung der Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung verändert werden. Wird die Polarisationsrichtung des E-Feld-Vektors der elektromagnetischen Strahlung parallel zur Beobachtungs richtung gewählt, kann unerwünschtes Streulicht minimiert und somit der Kontrast für Fluoreszenzstrahlung vergrößert werden. Verfügt das zu beobachtende Objekt über Bereiche optischer Aktivität oder ist vollständig optisch aktiv weicht die bevor zugte Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung von der parallelen Richtung relativ zur Beobachtungsrichtung ab. Die optimale Polarisationsrichtung für minimalen Streulichtanteil kann einfach während einer Drehung der Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung gefunden werden, indem beispielsweise eine visuelle Beobachtung stattfindet.
Sollten hingegen Objektstrukturen durch Streulicht abgebildet werden, das beispielsweise durch die Rayleigh-Streuung hervorgerufen wird, so ist es nützlich, zu sätzlich zum Einsatz eines schmalbandigen optischen Bandpass-Filters im Beobachtungsstrahlengang die Polarisationsrichtung des Beleuchtungslichtes senkrecht zur Beobachtungsrichtung zu wählen. Auf diese Weise wird die Streulichtintensität maximiert und der Kontrast der Streulicht-Abbildung erhöht. Auch hier kann bei Objekten mit optischer Aktivität die bevorzugte Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung von der senkrechten Richtung abweichen, die optimale Richtung kann jedoch wieder durch visuelle Beobachtung gefunden werden. Bei der Lichtscheibenmikroskopie wird die räumliche Homogenität der Beleuchtung durch die Beleuchtungsstrahlung durch hauptsächlich zwei Effekte beeinträchtigt. Zum einen nimmt die Intensität der Beleuchtungsstrahlung ab, je weiter die Beleuchtungsstrahlung durch das Objekt hindurchgeführt werden muss. Dies entspricht zumindest näherungsweise dem Lambert-Beer-Gesetz. Diese bekannt exponentielle Abnahme der Intensität kann zur quantitativen Bildauswertung rechnerisch herangezogen werden. Oftmals ist das zu beobachtende Objekt jedoch optisch nicht homogen, so dass die Beleuchtungsstrahlung zudem durch optisch dichtere Strukturen innerhalb des zu beobachtenden Objektes absorbiert oder gestreut wird. Dieses Problem kann insbesondere bei Aufnahmen von extern in das Beobachtungsobjekt eingebrachten Fluoreszenz-Markierungen, wie sie in der Biologie, der Medizin und der Biotechnologie oftmals verwendet werden, durch ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Geht man von einer homogenen Streuerdichte oder Streueffizienz aus, ist die Streulichtintensität proportional zur Beleuchtungsintensität, so dass eine reine Streulichtaufnahme des zu beobachtenden Objektes als Kalibrierungsdifferenz dient. Dazu wird die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung folglich senkrecht zur Beobachtungsrichtung gewählt und auf diese Weise eine Abbildung vorgenommen. Diese Streulichtintensität wird normiert, indem jedem Bildpunkt ein Normierungsfaktor zugewiesen wird, der dem Verhältnis seines jeweiligen Helligkeitswertes zum höchsten auftretenden Helligkeitswert der Aufnahme entspricht. Zur Kalibrierung wird nun der Helligkeitswert jedes einzelnen Bildpunktes durch diesen entsprechenden Normierungsfaktor dividiert.
Die hier beschriebenen Verfahren bieten folglich einen erhöhten Kontrast der erzeugten Mikroskopbilder und zudem die Möglichkeit, auch entlang der Beobachtungsrichtung optisch aufgelöste polarisationsabhängige Mikroskopbilder zu erzeugen.
Mit Hilfe der beiliegenden Figuren wird nachfolgend ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung näher erläutert. Es zeigt: Figur 1 - die schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,
Figur 2 - den schematischen Verlauf der Phasenverschiebung sowie deren Ableitung und
Figur 3 - ein Flussdiagramm für ein Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
Figur 1 zeigt die schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Beleuchtungsstrahlung 2, die linear polarisiert ist, wird aus einem Laser 4 ausgesandt und durch einen Rotator 6 geleitet. Dieser dreht die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung 2 in die gewünschte Richtung. Die Beleuchtungsstrahlung 2 trifft dann auf ein Objekt 8, von dem ein Mikroskopbild aufgenommen werden soll. Innerhalb des Objektes 8 wird Emissionsstrahlung 10 freigesetzt, die in einer Beobachtungsrichtung durch ein Objektiv 12 aufgefangen wird.
Das Objekt 8 ist auf einem Objektträger 14 angeordnet, der höhenverstellbar ausgebildet ist, so dass das Objekt 8 relativ zum Laser 4 bewegt werden kann. Die optischen Bauteile und/oder deren Position müssen gegebenenfalls an die dann geänderte Position des Objektes angepasst werden.
Bei einem Verfahren gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden eine Vielzahl von Bildern über das Objektiv 12 aufgenommen, die bei unterschiedlich polarisierter Beleuchtungsstrahlung 2 erzeugt werden.
Dazu wird der Rotator 6 in unterschiedlichen Positionen verwendet, um die Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung 2 einzustellen. Aus den so erzeugten Bildern lässt sich eine Beziehung zwischen der Position eines Bildpunktes bzw. einer Stelle innerhalb des Objektes 8 sowie einer Polarisationsrichtung herstellen, mit der die Beleuchtungsstrahlung 2 in das Objekt 8 eingestrahlt wurde. Dabei wird die Polarisationsrichtung ausgewählt, die an der jeweiligen Stelle innerhalb des Objektes 8 senkrecht auf der Beobachtungsrichtung steht. Dieser Zusammenhang ist beispielhaft in Figur 2 dargestellt. Man erkennt einen Winkel φ, der einem Winkel der Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung 2 entspricht, der über einer Position x aufgetragen ist, die der Position innerhalb des Objektes 8 entlang der Beleuchtungsrichtung entspricht. Der Winkel φ ist dabei der Winkel, bei dem die Intensität eines Bildpunktes an der Stelle x maximal wird. In einer durchgezogen Linie ist diese Phasenbeziehung 16 dargestellt. Bis zu einer ersten Position xi handelt es sich bei dem Objekt 8 um ein optisch aktives, homogenes Material. Man erkennt, dass die Phasenbeziehung 16 in diesem Bereich einen linearen Anstieg zeigt. Zwischen der Position xi und der Position X2 verläuft die Phasenbeziehung 16 ebenfalls linear, weist jedoch eine im Vergleich zum ersten Bereich größere Steigung. Jenseits des Punktes X2 ist die Phasenbeziehung 16 weiterhin eine lineare Beziehung, jedoch mit einer sehr geringen Steigung. Diese Steigungen werden durch eine spezifische Rotation definiert, die einen Proportionalitätsfaktor zwischen einer innerhalb des Objektes zurückgelegten Strecke und der auftretenden Rotation der Polarisationsrichtung bildet. Bereits aus der Phasenbeziehung 16 lassen sich Knicke ablesen, die Grenzflächen zwischen optisch unterschiedlich aktiven Substanzen entsprechen.
Mit gestrichelten Linien ist die Ableitung 18 der Phasenbeziehung 16 nach dem Ort x schematisch dargestellt. Sie ist in allen drei Bereichen konstant allerdings auf unterschiedlichem Niveau. An den Grenzflächen treten Sprünge auf. Durch nummerisches Ableiten der experimentell aufgenommen Phasenbeziehung 16 lassen sich auf diese Weise Grenzflächen innerhalb des betrachteten Objektes leicht ermitteln.
Figur 3 zeigt schematisch den Ablauf eines entsprechenden Verfahrens. Zunächst wird in einer Grundeinstellung 20 ein erster Parametersatz eingestellt, der beispielsweise die Position und Aufweitung des Lichtblattes und insbesondere einen Startwinkel der Polarisationsrichtung beinhaltet. Anschließend wird in einem Bildaufnahmeschritt 22 die Emissionsstrahlung 10 über das Objektiv 12 aufgenommen. Anschließend wird in einem Rotationsschritt 24 insbesondere die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung um einen vorbestimmten Winkel verdreht. Anschließend kommt es zum Vergleich 26 zwischen dem nun eingestellten neuen Winkel der Polarisationsrichtung und einem Grenzwinkel, bis zu dem das Verfahren durchgeführt werden soll. So ist es beispielsweise oftmals ausreichend, die Polarisation insgesamt nur um 180° zu verdrehen, während bei anderen vorbestimmten Schritten auch eine Rotation bis 360° in Frage kommt. Sofern beim Vergleich 26 das Ergebnis erzielt wird, dass die nun eingestellte Polarisationsrichtung nicht oder noch nicht der finalen Richtung entspricht oder diesen noch nicht überschritten hat, wird ein weiterer Bildaufnahmeschritt 22 durchgeführt. Dieser Schlaufe aus Bildaufnahmeschritt 22, Rotationsschritt 24 und Vergleich 26 wird so oft durchlaufen, bis die eingestellte Polarisationsrichtung der eingestellten Grenzrichtung entspricht. Dies hat zur Folge, dass beim Vergleich 26 das Ergebnis erzielt wird, dass kein weiteres Bild in einem weiteren Bildaufnahmeschritt 22 aufgenommen werden muss.
Anschließend wird dann in einem ersten Auswerteschritt 28 für jeden Bildpunkt überprüft, in welchem der aufgenommenen Bilder, die in den jeweiligen Bildaufnahmeschritten 22 aufgenommen wurden, die Intensität der aufgefangenen Emissionsstrahlung maximal ist. Diese Winkel sowie die jeweilige maximale Intensität werden gespeichert und in einem Konstruktionsschritt 30 zu einem Bild zusammengesetzt.
Alternativ zu der in der Figur 3 gezeigten Ausführungsform ist es jedoch auch möglich, beispielsweise für jeden Bildpunkt im ersten Auswerteschritt 28 zu ermitteln, bei welcher Winkelstellung der Polarisationsrichtung die minimale Intensität an Emissionsstrahlung aufgefangen wird.
Neben den Intensitäten, die für jeden einzelnen Bildpunkt gespeichert und zu einem vollständigen Mikroskopbild zusammengesetzt werden, lassen sich auch aus den so ermittelten Winkelverläufen als Funktion nun innerhalb der Probe, wie sie beispielhaft in Figur 2 dargestellt ist, Informationen gewinnen. Bezugszeichenliste
2 Beleuchtungsstrahlung
4 Laser
6 Rotator
8 Objekt
10 Emissionsstrahlung
12 Objektiv
14 Objektträger
16 Phasenbeziehung
18 Ableitung
20 Grundeinstellung
22 Bildaufnahmeschritt
24 Rotationsschritt
26 Vergleich
28 erster Auswerteschritt
30 Konstruktionsschritt

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes wenigstens eines Teils eines Objektes, wobei bei dem Verfahren
elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung entlang einer Beleuchtungsrichtung auf das Objekt geleitet wird und
von dem Objekt ausgehende elektromagnetische Emissionsstrahlung entlang einer Beobachtungsrichtung detektiert wird, wobei die Beleuchtungsrichtung und die Beobachtungsrichtung einen von 0° verschiedenen Winkel einschließen und wobei die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in Form eines Lichtblattes auf das Objekt geleitet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung in einer Polarisationsrichtung linear polarisiert ist und dass nacheinander elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung, die in unterschiedlichen Polarisationsrichtungen linear polarisiert ist, verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung einmal senkrecht zu der Beobachtungsrichtung und/oder einmal parallel zu der Beobachtungsrichtung polarisiert ist.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu detektierende elektromagnetische Emissionsstrahlung durch einen Polarisationsfilter geleitet wird, so dass die detektierte Emissionsstrahlung entlang einer Detektionspolarisationsrichtung linear polarisiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Emissionsstrahlung, die entlang unterschiedlicher Detektionspolarisationsrichtun- gen linear polarisiert ist, getrennt voneinander detektiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass
durch einen Polarisationsfilter geleitete Emissionsstrahlung und nicht durch einen Polarisationsfilter geleitete Emissionsstrahlung getrennt voneinander detektiert werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in das Objekt eine nematische Flüssigkeit eingebracht wird, bevor die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung auf das Objekt geleitet wird.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil des Objekts mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass nacheinander unterschiedliche elektrische Felder verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt optisch aktive Materialien enthält.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarisationsrichtung der eingestrahlten Beleuchtungsstrahlung in festen Winkelabständen geändert und für jede dieser Polarisationsrichtungen ein separates Bild aufgenommen wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass für verschiedene Bildpunkte, vorzugsweise jeden Bildpunkt, des Mikroskopbildes ermittelt wird, bei welcher eingestrahlten Polarisationsrichtung die Intensität der Emissionsstrahlung maximal ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Winkelabstand kleiner als 2°, vorzugsweise kleiner als 1 °, besonders vorzugsweise kleiner als 0,5°, höchst vorzugsweise kleiner als 0,3° ist.
13. Verfahren zum Erzeugen eines dreidimensionalen Mikroskopbildes wenigstens eines Teils eines Objektes, wobei bei dem Verfahren eine Mehrzahl von Mikroskopbildern gemäß einem Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche erzeugt werden, die sich dadurch unterscheiden, dass die elektromagnetische Beleuchtungsstrahlung an unterschiedlichen Positionen, insbesondere an unterschiedlichen Positionen entlang der Beobachtungsrichtung, auf das Objekt geleitet wird,
das dreidimensionale Mikroskopbild aus der Mehrzahl der erzeugten Mikroskopbilder ermittelt wird.
Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche.
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